JP2024508289A - ウェルシュ菌に対する特異的死滅能を有する新規なバクテリオファージ、およびこれを含む抗菌組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウェルシュ菌に対する特異的死滅能を有する新規なバクテリオファージ、およびこれを含む抗菌組成物に関し、新規なバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、ウェルシュ菌を特異的に死滅させる効果を有し、耐酸性および耐熱性に優れ、ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用途として抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤または洗浄剤などに幅広く活用することができる。

Description

本発明は、ウェルシュ菌に対する特異的死滅能を有する新規なバクテリオファージ、およびこれを含む抗菌組成物に関する。

ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、グラム陽性の大型偏性嫌気性桿菌であって、鞭毛がなく、芽胞を形成する菌として知られている。ウェルシュ菌は、動物、特に鶏、豚などをはじめとする家畜において下痢などを引き起こす菌であって、サルモネラによる家禽チフスに劣らず、畜産業において重要かつ致命的な病原菌の一つとして認識されている。

現在、養鶏および養豚産業において最も頻繁に発病する疾病の一つであるウェルシュ菌感染による壊死性腸炎（Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）は、鶏や豚などの小腸の下部に激しい壊死性病変を引き起こし、血液の混じった下痢が排出される症状などを主な症状として引き起こす疾患である。このような壊死性腸炎は、その発病程度に応じて感染動物に脱水症状、間欠的下痢症状などを引き起こし、徐々に動物の身体を衰弱させ、成長障害を誘発するなど、畜産業において非常に問題となっている疾病である。さらに、壊死性腸炎の原因となるウェルシュ菌は、動物の糞便を通じて容易に伝播するため、土壌や汚染された飼料を通じた経口感染などによって共同飼育空間内の動物間で容易に感染し、特に、幼い家畜の発病率が高いので、さらに問題となっている。

畜産業などの分野では、家畜の細菌感染による疾患を予防および治療するために、様々な抗生剤が使用されてきたが、抗生剤の誤用および乱用または耐性問題や、動物の体内に残留する可能性などの問題が浮上しながら現在は世界的に抗生剤の投与に多くの制限が設けられている。

それにより、最近では特定の細菌に感染して細菌の成長を抑制する細菌特異的ウイルスであるバクテリオファージが抗生剤に比べて宿主特異性が強いことから、新たな抗生剤の代替剤として研究されているが、未だにその数が絶対的に不足しているのが実情である。

したがって、養豚および養鶏をはじめとする畜産業において重要な問題となっているウェルシュ菌による感染性疾患を予防および治療するために、広範な溶菌スペクトルを有し、耐酸性および耐熱性に優れ、産業的に活用の可能性が高い新たなバクテリオファージの開発が持続的に求められている。

ＵＳ６，９４２，８５８ Ｂ１

本発明の目的は、ウェルシュ菌に特異的死滅能を有し、寄託番号ＫＣＣＭ１２９３３Ｐとして寄託されたバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、これを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤、または洗浄剤、または、前記飼料添加剤を含む飼料、または前記飲用水添加剤を含む飲用水を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物を利用したウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、またはこれを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物のウェルシュ菌による感染性疾患の予防剤または治療剤の製造のための用途を提供することにある。

本発明で開示されるそれぞれの説明および実施形態はそれぞれの他の説明および実施形態にも適用することができる。即ち、本発明で開示された様々な要素のすべての組み合わせは本発明の範疇に属する。また、後述する具体的な記述によって本発明の範疇が制限されるものではない。また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用して本発明に記載された本発明の特定の様態に対する多数の等価物を認識または確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれることが意図されている。

一態様は、ウェルシュ菌に特異的死滅能を有し、寄託番号ＫＣＣＭ１２９３３Ｐとして寄託されたバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を提供する。

本明細書で使用される用語「ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：ＣＰ）」は、グラム陽性の嫌気性桿菌であって、鶏、豚などの動物で感染性疾患を引き起こす原因菌に相当する。

本明細書で使用される用語「バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」は、特定の細菌に感染して当該細菌の成長を抑制する細菌特異的ウイルスであって、単鎖あるいは二重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを遺伝物質として含むウイルスを意味する。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は上述した通りである。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、ウェルシュ菌に特異的死滅能を有するため、個体にウェルシュ菌による感染性疾患の発病前に投与した場合に、個体に流入するウェルシュ菌を死滅させ、これによる感染を抑制してウェルシュ菌による感染性疾患を予防することができる。また、ウェルシュ菌による感染性疾患が発病した個体に前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を投与すれば、個体に存在するウェルシュ菌を死滅させることで、これによって引き起こされる症状が緩和または消滅し、ウェルシュ菌による感染性疾患を治療することができる。

本明細書で使用される用語「予防」は、バクテリオファージまたは組成物の投与によって個体で疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味し、用語「治療」は、バクテリオファージまたは組成物の投与によって個体で疾患の症状が好転、緩和、または消滅するあらゆる行為を意味する。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患は、例えば壊死性腸炎であるが、これに制限されない。

本明細書で使用される用語「壊死性腸炎（Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）」は、ウェルシュ菌によって引き起こされる感染性疾患の一つであって、養豚（離乳豚）、養鶏などの家畜の疾病を誘発し、特に肉鶏などで頻繁に発病し、相当な被害をもたらす細菌性疾患に相当する。壊死性腸炎の症状は、小腸でコクシジウムと共にウェルシュ菌が過剰に増殖することによって起こり、消化器粘膜の壊死、急な下痢などを引き起こす。例えば、養豚において甚急性壊死性腸炎の場合、発病後、１日～２日経過後に斃死を起こし、急性壊死性腸炎の場合、血液が混じった下痢を排出してから２日～３日経過後に斃死を引き起こす。また、亜急性壊死性腸炎の場合、下痢（血便を伴わない）が５日～７日間続いてから衰弱および脱水症状を引き起こし、慢性壊死性腸炎の場合、間欠的下痢を誘発し、成長障害を引き起こすことがある。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を１×１０^２～１×１０^１２ＰＦＵ／ｍＬまたは１×１０^５～１×１０^１０ＰＦＵ／ｇで含むものであり得る。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化され、食品、医薬品、飼料添加剤または飲用水添加剤などとして提供することができる。

本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」は、生体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤などを意味する。

前記組成物に含まれる担体の種類は特に制限されず、当該技術分野で通常使用され、薬学的に許容可能な担体ならば、どれでも使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、テキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロールなどが挙げられる。これらは単独で使用または２種以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、経口投与または非経口投与により投与することができ、疾患部位への塗布または噴霧する方法を利用することもできる。非経口投与の場合、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与を利用して投与してもよい。前記組成物の適した塗布、噴霧および投与量は、製剤化方法、投与方式、対象となる動物および患者の年齢、体重、性別、疾患症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感受性などの要因によって多様であり、通常熟練した医師や獣医師は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤で製剤化することができる。錠剤およびカプセルなどの剤形で製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、とうもろこしデンプンまたはさつまいもデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑剤を含むことができ、カプセル剤形の場合、上記で言及した物質以外にも脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、座薬注入方式または呼吸器を通じて吸入を可能にするエアロゾル剤などのスプレー用で製剤化することができる。注射用剤形で製剤化するためには、本発明の組成物を安定化剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液を製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用で製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合されてもよい。

前記ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、または賦形剤などを含むことができる。

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物の品質低下（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を減らすのに十分な有効量で組成物に含まれるものであり得る。

本明細書で使用される用語「品質低下」は、組成物などに含まれるバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の菌数の減少、活性の低下、またはこれらの組み合わせを含むものであり得る。

例えば、前記組成物は、組成物の品質低下を減らすのに十分な有効量の保存剤、安定化剤、または賦形剤を含むことで、自然環境などに存在するバクテリオファージとは異なり、組成物内でバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５がより長い期間生存するか、または活性が維持されるものであり得る。

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物の品質低下を減らすことができるものであれば、当業界で通常用いられるものを制限なく使用することができる。例えば、前記安定化剤は、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）、カゼイン、カゼインナトリウム、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ペクチン、ゼラチン、アラビアガム、キサンタンガム、デキストラン、シクロデキストリンおよびデンプンで構成される群より選択されるいずれか一つ以上であり得る。

前記凍結保護剤は、前記組成物が凍結乾燥された状態である時、組成物の品質低下を減らすのに十分な有効量で組成物に含まれるものであり得る。例えば、凍結乾燥された組成物内で活性が低下するか、または生存できない自然環境などに存在するバクテリオファージとは異なり、前記組成物は、凍結乾燥された状態で組成物の品質低下を減らすのに十分な有効量の凍結保護剤を含むことで、凍結乾燥された組成物内でもバクテリオファージ活性を維持するか、またはバクテリオファージが生存できるものであり得る。

前記凍結保護剤は、凍結乾燥された状態の組成物の品質低下を減らすためなら、当業界で通常使用されるものが制限なく用いられる。例えば、前記凍結保護剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）、グルコース、トレハロース、マルトデキストリン、デキストリン、スキムミルクおよびデンプンで構成される群より選択されるいずれか一つ以上であり得る。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む抗生剤を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は上述した通りである。

本明細書で使用される用語「抗生剤」は、菌を殺したり菌の成長を抑制できる製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤および抗菌剤を総称する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べてウェルシュ菌に対する特異性が非常に高く、有益菌は殺さずに特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、従来の抗生剤に比べて製品寿命を延ばす効果を示すことができる。

前記抗生剤は、当業界で通常使用される製造方法によって製造することができる。

前記抗生剤は、抗生剤の品質低下を減らすのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記抗生剤は、前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、抗生剤内でバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５がより長い期間生存するか、または活性が維持されるものであり得る。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、抗生剤の品質低下を減らすことができるものであれば、当業界で通常用いられるものを制限なく使用することができる。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む飼料添加剤を提供する。さらに他の態様は、前記飼料添加剤を含む飼料を提供する。さらに他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む飲用水添加剤を提供する。さらに他の態様は、前記飲用水添加剤を含む飲用水を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は上述した通りである。

前記飼料添加剤または飲用水添加剤は、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を含む組成物の形態で製造され、飼料または飲用水に混合するか、または前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を飼料または飲用水の製造時に直接添加する方式で使用するものであり得る。

前記飼料添加剤または飲用水添加剤内に含まれるバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、液体状態または乾燥された固体状態であってもよく、具体的には、乾燥された粉末形態であり得る。前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥方法であってもよいが、これらに制限されない。前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、乾燥された粉末形態で飼料添加剤または飲用水添加剤の重量に対して０．０５～１０重量％、具体的には０．１～２重量％で混合されるものであり得る。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む飼料添加剤または飲用水添加剤は、必要に応じてその他の添加剤をさらに含むことができる。前記使用可能な添加剤の非制限的な例としては、飼料または飲用水の品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤、保存剤など、飼料または飲用水の効用増大のために添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質窒素化合物（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ：ＮＰＮ）、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤またはオリゴ糖などがあり、これらは単独で添加または２種以上を一緒に添加することができる。

前記飼料または飲用水に含まれるバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５以外の原料は、当業界で通常用いられるものを制限なく使用することができる。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根菜類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、瓜類または穀物副産物類などの植物性飼料、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または飲食物などの動物性飼料が挙げられる。これらは単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。

前記飼料添加剤は、飼料１００重量部に対して０．０５～１０重量部、例えば、０．１～２重量部で含まれるものであり得る。前記飲用水添加剤は、飲用水１００重量部に対して０．０００１～０．０１重量部、例えば、０．００１～０．００５重量部で含まれる。

前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は、当業界で通常用いられる製造方法によって製造することができる。

前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は、これらの品質低下を減らすのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は、保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水内でバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５がより長い期間生存するかまたは活性が維持する。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水の品質低下を減らすことができるものであれば、当業界で通常用いられるものを制限なく使用することができる。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む消毒剤を提供する。さらに他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む洗浄剤を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は上述した通りである。

前記消毒剤または洗浄剤の剤形は特に制限されず、当業界で公知の剤形で製造されて用いられる。前記消毒剤または洗浄剤は、当業界で通常用いられる製造方法によって製造することができる。

前記消毒剤は、ウェルシュ菌を除去するために散布され、動物の活動領域、屠殺場、斃死地域、調理場または調理設備などに散布されるが、これらに制限されない。

前記洗浄剤は、ウェルシュ菌に暴露されたまたは暴露される可能性がある動物の皮膚表面または身体の各部位などを洗浄する用途に使用することができるが、これに制限されない。

前記消毒剤または洗浄剤は、これらの品質低下を減らすのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は、保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記消毒剤または洗浄剤は前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、消毒剤または洗浄剤内でバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５がより長い期間生存するかまたは活性が維持する。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、消毒剤または洗浄剤の品質低下を減らすことができるものであれば、当業界で通常用いられるものを制限なく使用することができる。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、またはこれを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療方法を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、これを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、およびウェルシュ菌による感染性疾患は上述した通りである。具体的には、前記ウェルシュ菌による感染性疾患は、例えば壊死性腸炎であり得る。

前記予防または治療方法は具体的には、ウェルシュ菌に感染するか、または感染するおそれがある、ヒトを除いた動物に前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、またはこれを有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態で動物に投与するか、または飼料添加剤または飲用水添加剤の形態で動物の飼料または飲用水に混合してこれを摂食させる方法により投与することができる。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含む組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り経口または非経口の様々な経路により投与することができ、具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入などにより通常の方式で投与することができる。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含む組成物の適した１日総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定することができ、これは当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明な事項である。

特定動物に対する前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、当該個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別または食餌はもちろん、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５またはこれを有効成分として含む組成物の投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定され、同時または異時に共に使用される薬物その他の組成物の成分などをはじめとする様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子により多様化することができる。

前記ヒトを除いた動物は、ウェルシュ菌に感染する動物なら特に制限されない。例えば、前記動物は、鳥類および哺乳類であってもよく、具体的には、鶏、鴨、豚などを含んでもよいが、これらに制限されない。

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、またはこれを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物のウェルシュ菌による感染性疾患の予防剤または治療剤の製造のための用途を提供する。

前記バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５、これを有効成分として含むウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、およびウェルシュ菌による感染性疾患は上述した通りである。具体的には、前記ウェルシュ菌による感染性疾患は、例えば壊死性腸炎であり得る。

新規なバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、ウェルシュ菌を特異的に死滅させる効果を有し、耐酸性および耐熱性に優れ、ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用途として、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤または洗浄剤などに幅広く活用することができる。

新規なバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の電子顕微鏡写真である。 新規なバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５のｐＨ安定性を確認した結果グラフである。 新規なバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の６０℃での安定性を確認した結果グラフである。

以下、本発明につき実施例を通じてより詳細に説明する。但し、これらの実施例は一つ以上の具体的な例を例示的に説明するものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１．ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：ＣＰ）に対する死滅能を有するバクテリオファージの分離

実施例１－１．糞便試料前処理液の製造
韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の農場から養豚、養鶏および畜牛の糞便試料を採取して、各試料２０ｇを８０ｍＬのＰＢＳに希釈して１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を０．２μｍのフィルターでろ過した後、濾液に１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を加え、４℃で１２時間保存した。その後、そこに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２１３９）を添加して４℃で１２時間保存した後、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去した。沈殿物を１０ｍＬのＳＭバッファー（５．８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５））に溶かした後、０．２μｍのフィルターでろ過してその濾液を４℃で保存した。

実施例１－２．バクテリオファージ濃縮液の作製
韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の家畜農家から収集した糞便試料から分離したＣＰ菌株および国立獣医科学検疫院から分譲を受けたＣＰ菌株を２ｍＬのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地に接種して、４２℃および嫌気条件で１８時間静置培養後、５０ｍＬのＢＨＩ培地に前記ＣＰ菌株培養液１ｍＬおよび前記実施例１－１で得られた糞便試料前処理液１ｍＬを接種して、４２℃で１８時間混合静置培養した。混合培養液を６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、上澄み液を０．２μｍのフィルターでろ過し、そこに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００を添加して４℃で１２時間保存した。その後、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去し、沈殿物を１ｍＬのＳＭバッファーに溶かし、０．２μｍのフィルターでろ過してその濾液を４℃で保存した。

実施例１－３．バクテリオファージのスクリーニングおよび分離
前記実施例１－２で作製したバクテリオファージ濃縮液５０μＬを０．７％（ｗ／ｖ）寒天（ＢＤ ＤＩＦＣＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４４１６４）５ｍＬ、および前記実施例１－２で使用したものと同じＣＰ菌株を６００ｎｍで吸光度（Ｏ．Ｄ．）が２になるように振とう培養した培養液５０μＬと混合し、直径１５０ｍｍのＢＨＩ平板培地を利用して二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行った。軟寒天に形成された溶菌斑を２００μＬチップでパンチングして、０．５ｍＬのＳＭバッファーに入れて溶出した。溶出されたバクテリオファージ含有溶液は、同じ形態の単一溶菌斑が形成されるまで二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を繰り返し純粋なバクテリオファージを含む溶液を分離した。得られたバクテリオファージ含有溶液を０．２μｍのフィルターでろ過し、そこに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００を添加し、４℃で１２時間保存した。その後、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去し、沈殿物を１ｍＬのＳＭバッファーに溶かし、０．２μｍのフィルターでろ過してその濾液を４℃で保存した。

実施例２．分離したバクテリオファージの全ゲノム（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＷＧＳ）解析

ＣｓＣｌグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）法およびファージＤＮＡ分離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ－Ｃｏｒｐ．Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４６８００）を用いて前記実施例１－３で純粋分離したバクテリオファージ濃縮液１ｍＬからＤＮＡを抽出した。（株）マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に依頼して全ゲノム解析を行い、Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙするソフトウェア（ＳＰＡｄｅｓ ３．１３．０）を用いて遺伝子を組み合わせ、オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）はＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍとＮＣＢＩ ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒを用いて行った。ＢＬＡＳＴＰ（Ｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ＜０．１）とＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（Ｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ＜０．００５）プログラムを用いて各ＯＲＦの機能を命名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。

その結果、分離したバクテリオファージは、５１，６５０ｂｐ、７３ ＯＲＦ、Ｇ＋Ｃの含有量３４．１％である配列番号１の塩基配列を有することを確認し、これは従来に報告されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈａｇｅ ＣＰ３（ＭＦ００１３５７．１）と９６％の配列同一性を示したが、すべての断片が１００％一致するバクテリオファージはないことを確認して、前記バクテリオファージは新たに分離されたバクテリオファージであることが分かった。したがって、前記新規なバクテリオファージをバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５と命名し、２０２１年１月１８日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２９３３Ｐが付与されている。

実施例３．バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の形態分析

高純度のバクテリオファージ溶液を得るために、ＣｓＣｌグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）法を行った。具体的には、密度が１．７、１．５、１．４５または１．３であるＳＭバッファーに溶解したＣｓＣｌ溶液を用意し、１５ｍＬ超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）用チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｚ００９０１ＳＣＡ）に前記ＣｓＣｌ溶液を高密度から低密度に層をなすように２ｍＬずつ分注して、最上端に実施例１－３で得られたバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５濃縮液２ｍＬを分注した。これを４℃および２５，０００ｒｐｍで２時間遠心分離した後、チューブに形成された白色のバクテリオファージ層のみをシリンジ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７８２２－Ｋ）で採取した。採取したバクテリオファージ溶液１μＬをｃａｒｂｏｎ－ｃｏａｔｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄの上に点滴後、２％ウラニルアセテートで１５秒間染色して電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１０１，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で形態を観察した。

その結果、図１に示すように、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は形態学的に二十面体の頭部と約１００ｎｍの長さの収縮性ある尾部（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）を持つことが観察され、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）に属することが分かった。

実施例４．バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５のｐＨ安定性の評価

バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５が広いｐＨの範囲で安定性があるかどうかを確認するために、ｐＨ４、７、７．５または１０の溶液（ｐＨ４：０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）溶液；ｐＨ７、７．５：０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液；およびｐＨ１０：０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液）を用意した。各ｐＨ別溶液４５０μＬと２×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬのバクテリオファージ溶液５０μＬを混合して４℃で２時間静置後、二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行って力価（ｔｉｔｅｒ）の増減を評価した。

その結果、図２に示すように、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、ｐＨ７～１０で活性を失わず安定的であり、ｐＨ４でもｐＨ７．５である群に比べて約１．７ログ程度だけ活性が減少したので、優れた耐酸性を有するバクテリオファージであることが分かった。

実施例５．バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の熱安定性の評価

バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５が高温で安定性があるかどうかを確認するために、２×１０^８ＰＦＵ／ｍＬのバクテリオファージ溶液５００μＬを６０℃で０、３、６または２４時間静置後、二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行って力価（ｔｉｔｅｒ）の増減を評価した。

その結果、図３に示すように、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、６０℃で３時間暴露した時、０時間暴露した対照群に比べて約１．０ログの活性減少を示し、６時間暴露時、対照群に比べて約２．１ログの活性減少を示し、２４時間暴露時にも対照群に比べて約５．１ログの活性減少があるが、依然として活性を示した。したがって、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、優れた耐熱性を有するバクテリオファージであることが分かった。

実施例６．バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の溶菌スペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の評価

バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の溶菌スペクトルを評価するために、韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の家畜農家から収集した糞便試料から分離したＣＰ菌株および国立獣医科学検疫院から分譲を受けたＣＰ菌株総４５種をそれぞれＢＨＩ液体培地で培養後、０．７％軟寒天５ｍＬに前記菌株培養物各５０μＬを接種して、ペトリ皿に注ぎプレーティング後、５分間静置した。その後、軟寒天の上に前記実施例１－３で得られたバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５濃縮液１０μＬを滴下（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、４２℃で１８時間静置培養した。培養終了後、軟寒天の上に形成された溶菌斑形成の有無によりバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５の溶菌スペクトルを評価した。

その結果、表１に示すように、試験した４５種のＣＰ菌株全部において溶菌斑が形成され、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５は、広スペクトルなＣＰ菌株に死滅能を有することを確認した。

以上の説明から、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施することができることを理解できるであろう。これに関連して、上述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、発明の詳細な説明より後述する特許請求の範囲の意味および範囲、およびその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。

Claims (12)

1. ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：ＣＰ）に特異的死滅能を有し、寄託番号ＫＣＣＭ１２９３３Ｐとして寄託された、バクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５。
2. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療用組成物。
3. 前記ウェルシュ菌による感染性疾患は壊死性腸炎である、請求項２に記載の組成物。
4. 請求項１記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、抗生剤。
5. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、飼料添加剤。
6. 請求項５に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
7. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、飲用水添加剤。
8. 請求項７に記載の飲用水添加剤を含む、飲用水。
9. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、消毒剤。
10. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５を有効成分として含む、洗浄剤。
11. 請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_ＣＰ_２０－１５または請求項２に記載の組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、ウェルシュ菌による感染性疾患の予防または治療方法。
12. 前記ウェルシュ菌による感染性疾患は壊死性腸炎である、請求項１１に記載の方法。

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