WO2022181892A1 - 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 Download PDF

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clostridium perfringens
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김지은
문준옥
채종표
김유진
이승은
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    • C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present application relates to a novel bacteriophage having a specific killing ability against Clostridium perfringens and an antibacterial composition comprising the same.
  • Clostridium perfringens ( Clostridium perfringens ) is a gram-positive large obligate anaerobic bacillus, known as a spore-forming bacterium without flagella. Clostridium perfringens is recognized as one of the most important and deadly pathogens in the livestock industry as well as poultry typhus caused by Salmonella as a bacterium that causes diarrhea in animals, particularly chickens, pigs, and other livestock.
  • necrotizing enteritis causes dehydration symptoms, intermittent diarrhea symptoms, etc. in infected animals depending on the severity of the onset, and gradually weakens the animal's body and causes growth disorders.
  • Clostridium perfringens the cause of necrotizing enterocolitis, is easily transmitted through animal feces, it is easily transmitted between animals in the communal breeding space due to oral infection through soil or contaminated feed, especially in young livestock. The higher it is, the more problematic it is.
  • bacteriophages which are bacteria-specific viruses that inhibit bacterial growth by infecting specific bacteria, have stronger host specificity than antibiotics, and are being studied as alternatives to new antibiotics, but the number is still absolutely insufficient. . Therefore, in order to prevent and treat infectious diseases caused by Clostridium perfringens, which is an important problem in the livestock industry, including pigs and poultry, it has a wide lysis spectrum and has excellent acid resistance and heat resistance, so it is a new technology with high industrial application potential. The development of bacteriophages is continuously required.
  • Patent Document 1 US Registered Patent US 6,942,858 B1
  • the object of the present application is to have a specific killing ability for Clostridium perfringens, and to prevent or prevent infectious diseases caused by Clostridium perfringens containing the bacteriophage CJ_CP_20-15 deposited with accession number KCCM12933P as an active ingredient.
  • an antibiotic a feed additive, a drinking water additive, a disinfectant, or a cleaning agent, or a feed including the feed additive, or drinking water including the drinking water additive.
  • Another object of the present application is to prevent or treat an infectious disease caused by Clostridium perfringens using the bacteriophage CJ_CP_20-15 or a composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens containing the same as an active ingredient to provide a way
  • Another object of the present application is the bacteriophage CJ_CP_20-15, or a composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens containing the same as an active ingredient. To provide a use for the manufacture of a therapeutic agent.
  • One aspect provides a bacteriophage CJ_CP_20-15 deposited with an accession number KCCM12933P with a specific killing ability to Clostridium perfringens.
  • Clostridium perfringens is a Gram-positive anaerobic bacillus, which corresponds to a causative organism that causes infectious diseases in animals such as chickens and pigs.
  • bacteriophage is a bacterium-specific virus that infects a specific bacterium and inhibits the growth of the bacterium, and refers to a virus containing single or double-stranded DNA or RNA as a genetic material. .
  • Another aspect provides a composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 is as described above.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 Since the bacteriophage CJ_CP_20-15 has a specific killing ability to Clostridium perfringens, when administered before the onset of an infectious disease caused by Clostridium perfringens, it kills Clostridium perfringens introduced into the subject. Infectious diseases caused by Clostridium perfringens can be prevented by inhibiting the infection caused by this. In addition, when the bacteriophage CJ_CP_20-15 is administered to an individual having an infectious disease caused by Clostridium perfringens, the symptoms caused by this can be alleviated or eliminated by killing Clostridium perfringens present in the individual. , an infectious disease caused by Clostridium perfringens.
  • prevention may refer to any action that inhibits or delays the onset of a disease in an individual by administration of a bacteriophage or a composition
  • treatment is a bacteriophage or composition in an individual by administration. It may refer to any action that causes the symptoms of a disease to improve, alleviate, or disappear.
  • the infectious disease caused by Clostridium perfringens may be, for example, necrotizing enterocolitis, but is not limited thereto.
  • necrotizing enteritis is one of the infectious diseases caused by Clostridium perfringens, and causes diseases in livestock such as pigs (weaning pigs), poultry, etc. In particular, frequent in broilers, etc. It is a bacterial disease that causes considerable damage. Symptoms of necrotizing enteritis are caused by excessive proliferation of Clostridium perfringens together with coccidium in the small intestine, causing necrosis of the digestive mucosa and sudden diarrhea. For example, in the case of acute necrotizing enteritis in pigs, death occurs 1 to 2 days after the onset, and in the case of acute necrotizing enteritis, diarrhea mixed with blood is discharged, and death occurs after 2 to 3 days. causes In addition, in the case of subacute necrotizing enteritis, diarrhea (without bloody stool) continues for 5 to 7 days, causing weakness and dehydration, and in the case of chronic necrotizing enteritis, intermittent diarrhea and growth disorders may occur.
  • composition for preventing or treating infectious diseases caused by Clostridium perfringens is the bacteriophage CJ_CP_20-15 1 X 10 2 to 1 X 10 12 PFU / mL or 1 X 10 5 to 1 X 10 10 PFU / g may include.
  • composition for preventing or treating infectious diseases caused by Clostridium perfringens may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and is formulated with the carrier and provided as a food, drug, feed additive or drinking water additive, etc. can be
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” may mean a carrier or diluent that does not stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the type of carrier that may be included in the composition is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, and the like. These may be used alone or in mixture of two or more, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents, dispersants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens may be administered through oral administration or parenteral administration, and a method of applying or spraying to a diseased site may also be used.
  • parenteral administration intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or local administration may be used.
  • Suitable application, spraying, and dosage of the composition include formulation method, administration mode, age, weight, sex, degree of disease symptoms, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity of the target animal and patient. This varies depending on factors, and an normally skilled physician or veterinarian can readily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • Formulations for oral administration of the composition for preventing or treating infectious diseases caused by Clostridium perfringens include, for example, tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, prepared powders or granules, and emulsions. , hard or soft capsules, syrups or elixirs.
  • a binder such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin, an excipient such as dicalcium phosphate, a disintegrant such as corn starch or sweet potato starch, Masene stearate Lubricating oils such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol wax may be included, and in the case of capsule formulations, a liquid carrier such as fatty oil may be further contained in addition to the above-mentioned substances.
  • Formulations for parenteral administration of the composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by Clostridium perfringens include subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, such as injection, suppository injection, or inhalation through the respiratory tract. It can be formulated for spraying, such as an aerosol to make it possible.
  • the composition of the present invention may be mixed with a stabilizer or buffer in water to prepare a solution or suspension, and it may be formulated for unit administration in ampoules or vials.
  • a propellant or the like may be blended with the additive so that the water-dispersed concentrate or wet powder is dispersed.
  • composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens may include a preservative, a stabilizer, a wetting or emulsifying agent, a cryoprotectant, or an excipient.
  • the preservative, stabilizer, or excipient may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce deterioration of the composition.
  • degradation of quality may include a decrease in the number of bacteria, a decrease in activity, or a combination thereof of the bacteriophage CJ_CP_20-15 included in the composition.
  • the composition contains an effective amount of a preservative, stabilizer, or excipient sufficient to reduce deterioration of the composition, so that, unlike bacteriophages existing in nature, the bacteriophage CJ_CP_20-15 in the composition survives for a longer period of time Or the activity may be maintained.
  • the preservative, stabilizing agent, or excipient may be used without limitation, as long as it can reduce deterioration of the composition.
  • the stabilizer is alginate, sodium alginate, casein, sodium caseinate, cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, pectin, gelatin , gum arabic, xanthan gum, dextran, cyclodextrin, and may be any one or more selected from the group consisting of starch.
  • the cryoprotectant may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce deterioration of the composition when the composition is in a lyophilized state.
  • the composition may contain a cryoprotectant in an effective amount sufficient to reduce deterioration of the composition in the lyophilized state. It may be that the bacteriophage activity is maintained or the bacteriophage can survive even in the lyophilized composition.
  • the cryoprotectant may be used without limitation, as long as it is intended to reduce the deterioration of the composition in a lyophilized state, those commonly used in the art.
  • the cryoprotectant may be any one or more selected from the group consisting of glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), glucose, trehalose, maltodextrin, dextrin, skim milk and starch. have.
  • Another aspect provides an antibiotic comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 is as described above.
  • antibiotic means an agent capable of killing or inhibiting the growth of bacteria, and may be a generic term for preservatives, bactericides and antibacterial agents.
  • the antibiotic containing the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient has a very high specificity for Clostridium perfringens compared to conventional antibiotics, so it can kill only specific pathogens without killing beneficial bacteria, and does not induce drug resistance. Compared to that, it can have the effect of extending the product lifespan.
  • the antibiotic may be prepared by a manufacturing method commonly used in the art.
  • the antibiotic may include an additive in an effective amount sufficient to reduce deterioration in the quality of the antibiotic, and the additive may be a preservative, a stabilizer, an excipient, or a cryoprotectant.
  • the antibiotic may be one in which the bacteriophage CJ_CP_20-15 survives for a longer period of time or the activity is maintained in the antibiotic, unlike the bacteriophage existing in the natural state.
  • the preservative, stabilizing agent, excipient, or cryoprotectant may be used without limitation, as long as it can reduce the deterioration of the antibiotic quality, those commonly used in the art.
  • Another aspect provides a feed additive comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient. Another aspect provides a feed comprising the feed additive. Another aspect provides a drinking water additive comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient. Another aspect provides drinking water comprising the drinking water additive.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 is as described above.
  • the feed additive or drinking water additive is prepared in the form of a composition containing the bacteriophage CJ_CP_20-15 and mixed with feed or drinking water, or the bacteriophage CJ_CP_20-15 is directly added when preparing feed or drinking water. It may be used in a way.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 included in the feed additive or drinking water additive may be in a liquid state or a dried solid state, and specifically, may be in a dried powder form.
  • the drying method of the bacteriophage CJ_CP_20-15 may be ventilation drying, natural drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 may be mixed in a dry powder form in an amount of 0.05 to 10% by weight of the feed additive or drinking water additive, specifically, 0.1 to 2% by weight.
  • the feed additive or drinking water additive containing the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient may further include other additives as needed.
  • the additives include, but are not limited to, binders, emulsifiers, preservatives, etc. added to prevent deterioration of feed or drinking water quality;
  • binders binders, emulsifiers, preservatives, etc. added to prevent deterioration of feed or drinking water quality
  • Raw materials other than the bacteriophage CJ_CP_20-15 included in the feed or drinking water may be used without limitation as commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, gourds or grain by-products; and animal feeds such as proteins, inorganic materials, oils and fats, minerals, oils and fats, single cell proteins, zooplankton, or food. These may be used alone or may be used in combination of two or more.
  • the feed additive may be included in an amount of 0.05 to 10 parts by weight, for example, 0.1 to 2 parts by weight, based on 100 parts by weight of the feed.
  • the drinking water additive may be included in an amount of 0.0001 to 0.01 parts by weight, for example, 0.001 to 0.005 parts by weight, based on 100 parts by weight of drinking water.
  • the feed additive, feed, drinking water additive or drinking water may be prepared by a manufacturing method commonly used in the art.
  • the feed additive, feed, drinking water additive or drinking water may include an additive in an effective amount sufficient to reduce deterioration thereof, and the additive may be a preservative, a stabilizer, an excipient, or a cryoprotectant.
  • the feed additive, feed, drinking water additive or drinking water contains the additive, so that the bacteriophage CJ_CP_20-15 survives or is active for a longer period of time in the feed additive, feed, drinking water additive or drinking water, unlike bacteriophages existing in nature. may be maintained.
  • the preservative, stabilizing agent, excipient, or cryoprotectant may be used without limitation as long as it can reduce the deterioration of the quality of feed additives, feed, drinking water additives or drinking water.
  • Another aspect provides a disinfectant comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient.
  • a cleaning agent comprising the bacteriophage CJ_CP_20-15 as an active ingredient.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 is as described above.
  • the formulation of the disinfectant or cleaning agent is not particularly limited, and may be prepared and used in a formulation commonly known in the art.
  • the disinfectant or cleaning agent may be prepared by a manufacturing method commonly used in the art.
  • the disinfectant may be sprayed to remove Clostridium perfringens, and may be sprayed to an animal's activity area, a slaughterhouse, a dead area, a cooking place, or a cooking facility, but is not limited thereto.
  • the cleaning agent may be used for cleaning the skin surface or body parts of animals exposed or likely to be exposed to Clostridium perfringens, but is not limited thereto.
  • the disinfectant or cleaning agent may include an additive in an effective amount sufficient to reduce deterioration thereof, and the additive may be a preservative, a stabilizer, an excipient, or a cryoprotectant.
  • the additive may be a preservative, a stabilizer, an excipient, or a cryoprotectant.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 in the disinfectant or cleaning agent may survive or remain active for a longer period of time, unlike bacteriophages existing in nature.
  • the preservative, stabilizing agent, excipient, or cryoprotectant may be used without limitation as long as it can reduce the deterioration of the quality of the disinfectant or cleaning agent.
  • Clostridium perfringens comprising administering a composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by Clostridium perfringens comprising the same as an active ingredient to animals other than humans, Clostridium perfringen A method for preventing or treating an infectious disease caused by Gens is provided.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 a composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens containing it as an active ingredient, and an infectious disease caused by Clostridium perfringens are as described above.
  • the infectious disease caused by Clostridium perfringens may be, for example, necrotizing enteritis.
  • the prevention or treatment method specifically includes the bacteriophage CJ_CP_20-15, or a composition comprising the same as an active ingredient, in an animal other than humans, infected by or at risk of infection by Clostridium perfringens in a pharmaceutically effective amount It includes the step of administering.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 or a composition comprising the same as an active ingredient is administered to an animal in the form of a pharmaceutical formulation, or mixed with animal feed or drinking water in the form of a feed additive or drinking water additive to be administered through a method of feeding it can
  • the route of administration of the bacteriophage CJ_CP_20-15 or a composition comprising the same as an active ingredient may be administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue, and specifically, oral, rectal, topical, intravenous, It can be administered in a conventional manner via intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal, inhalation and the like.
  • the suitable total daily usage of the bacteriophage CJ_CP_20-15 or a composition comprising the same as an active ingredient can be determined by the treating physician within the scope of correct medical judgment, which is obvious to those of ordinary skill in the art. .
  • the specific pharmaceutically effective amount of the bacteriophage CJ_CP_20-15 or a composition comprising the same as an active ingredient for a specific animal is the type and extent of the reaction to be achieved, the age, weight, general health status, sex or diet of the subject, as well as The bacteriophage CJ_CP_20-15 or the composition containing the same as an active ingredient may be determined in consideration of the administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, etc. It may vary depending on several factors and similar factors well known in the medical arts.
  • the animal other than humans is not particularly limited as long as it is an animal that can be infected by Clostridium perfringens.
  • the animals may be birds and mammals, and specifically, may include chickens, ducks, pigs, and the like, but is not limited thereto.
  • Clostridium perfringens of a composition for preventing or treating infectious diseases caused by Clostridium perfringens containing the same as an active ingredient for the production of a preventive or therapeutic agent for infectious diseases caused by Clostridium perfringens provide use.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 a composition for preventing or treating an infectious disease caused by Clostridium perfringens containing it as an active ingredient, and an infectious disease caused by Clostridium perfringens are as described above.
  • the infectious disease caused by Clostridium perfringens may be, for example, necrotizing enteritis.
  • the novel bacteriophage CJ_CP_20-15 has the effect of specifically killing Clostridium perfringens, and has excellent acid resistance and heat resistance. It can be widely used as a drinking water additive, feed, drinking water, disinfectant or cleaning agent.
  • Figure 2 is a graph of the results of confirming the pH stability of the novel bacteriophage CJ_CP_20-15.
  • Figure 3 is a graph of the results of confirming the stability at 60 °C of the novel bacteriophage CJ_CP_20-15.
  • Clostridium perfringens ( Clostridium perfringens : Separation of bacteriophage having apoptosis against CP)
  • Example 1-1 Preparation of fecal sample preparation solution
  • Fecal samples from pigs, poultry and cattle were collected from farms in Seoul, Gyeonggi, Chungcheong-do, and Gyeongsang-do, Korea, and 20 g of each sample was diluted in 80 mL of PBS and centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. After filtering the supernatant through a 0.2 ⁇ m filter, 10% (w/v) aqueous sodium chloride solution was added to the filtrate and stored at 4° C. for 12 hours. Thereafter, 10% (w/v) polyethylene glycol 8000 (Sigma-Aldrich, Cat. No. P2139) was added thereto, stored at 4° C. for 12 hours, and centrifuged at 15,000 rpm for 1 hour for concentration.
  • Example 1-2 Bacteriophage concentrate production
  • the CP strain isolated from fecal samples collected from livestock farms in Seoul, Gyeonggi, Chungcheong-do, and Gyeongsang-do, Korea and the CP strain distributed from the National Veterinary Science and Quarantine Service were inoculated into 2mL BHI (Brain Heart Infusion) medium, After stationary culture for 18 hours under the conditions, 1 mL of the CP strain culture solution and 1 mL of the fecal sample pretreatment solution obtained in Example 1-1 were inoculated into 50 mL of BHI medium, and mixed stationary culture was performed at 42° C. for 18 hours.
  • BHI Brain Heart Infusion
  • the supernatant was filtered with a 0.2 ⁇ m filter, 10% (w/v) polyethylene glycol 8000 was added thereto, and stored at 4° C. for 12 hours. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 1 hour for concentration, the precipitate was dissolved in 1 mL of SM buffer, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and the filtrate was stored at 4°C.
  • Example 1-2 600 50 ⁇ L of the bacteriophage concentrate prepared in Example 1-2 0.7% (w/v) agar (BD DIFCO, Cat. No. 44164) 5 mL, and the same CP strain as used in Example 1-2 600
  • the absorbance (O.D.) in nm was mixed with 50 ⁇ L of the shake culture medium to be 2, and a double-layer agar plaque assay was performed using a BHI plate medium with a diameter of 150 mm.
  • the lysate formed on soft agar was eluted by punching it with a 200 ⁇ L tip and putting it in 0.5 mL of SM buffer.
  • the solution containing the eluted bacteriophage was separated from the solution containing the pure bacteriophage by repeating the double-layer agar plaque assay until a single plaque of the same type was formed.
  • the obtained bacteriophage-containing solution was filtered with a 0.2 ⁇ m filter, 10% (w/v) polyethylene glycol 8000 was added thereto, and stored at 4° C. for 12 hours. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 1 hour for concentration, the precipitate was dissolved in 1 mL of SM buffer, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and the filtrate was stored at 4°C.
  • Example 2 Whole genome sequencing (WGS) analysis of the isolated bacteriophage
  • DNA was extracted from 1 mL of the bacteriophage concentrate purely isolated in Example 1-3 using the CsCl gradient method and the phage DNA isolation kit (Norgen Biotek-Corp. Kit, Cat. No. 46800). Whole genome analysis was performed by commissioning Macrogen Inc., and the genes were combined using De novo assembly software (SPAdes 3.13.0), and the open reading frame (ORF) was GeneMark.hmm and NCBI ORF This was done using a finder. The function of each ORF was annotated using BLASTP (E values of ⁇ 0.1) and PSI-BLAST (E value of ⁇ 0.005) programs.
  • BLASTP E values of ⁇ 0.1
  • PSI-BLAST E value of ⁇ 0.005
  • the isolated bacteriophage was confirmed to have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with 51,650 bp, 73 ORF, G + C content of 34.1%, which was previously reported Clostridium phage CP3 (MF001357.1) and 96% of the sequence Although it showed the identity, it was confirmed that there is no bacteriophage that matches 100% of all fragments, and it can be seen that the bacteriophage is a newly isolated bacteriophage.
  • the new bacteriophage was named bacteriophage CJ_CP_20-15, and was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms, an international depository under the Budapest Treaty as of January 18, 2021, and was given an accession number KCCM12933P.
  • a CsCl gradient method was performed. Specifically, prepare a CsCl solution dissolved in SM buffer having a density of 1.7, 1.5, 1.45 or 1.3, and add the CsCl solution to a 15 mL ultracentrifuge tube (Beckman Coulter, Cat. No. Z00901SCA). 2 mL of the bacteriophage CJ_CP_20-15 concentrate obtained in Example 1-3 was dispensed at the top by 2 mL to form a layer at a low density. After centrifugation at 4° C.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 is morphologically observed to have an icosahedral head and a contractile tail of about 100 nm in length, Caudovirales order, Myobiri It was found to belong to the Myoviridae family.
  • a solution of pH 4, 7, 7.5 or 10 pH 4, 7, 7.5 or 10 (pH 4: 0.2 M sodium acetate solution; pH 7, 7.5: 0.2 M sodium phosphate ( sodium phosphate) solution; and pH 10: 0.2M Tris (Tris-HCl) solution) was prepared. 450 ⁇ L of each pH solution and 50 ⁇ L of 2 X 10 10 PFU/mL of a bacteriophage solution were mixed and left at 4° C. for 2 hours, followed by double-layer agar plaque assay to evaluate titer increase or decrease.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 was stable without losing its activity at pH 7 to 10, and even at pH 4, the activity was reduced by only about 1.7 logs compared to the group with pH 7.5, having excellent acid resistance It was found that the bacteriophage.
  • bacteriophage CJ_CP_20-15 In order to check whether the bacteriophage CJ_CP_20-15 is stable at high temperature, 500 ⁇ L of a bacteriophage solution of 2 X 10 8 PFU/mL is left at 60°C for 0, 3, 6 or 24 hours, then a Double-layer agar plaque assay is performed. Thus, titer increase and decrease were evaluated.
  • the bacteriophage CJ_CP_20-15 showed a decrease in activity of about 1.0 log compared to the control exposed for 0 hours when exposed at 60 ° C. for 3 hours, and when exposed for 6 hours, compared to the control group of about 2.1 logs It showed a decrease in activity, and although there was a decrease in activity of about 5.1 logs compared to the control, even when exposed for 24 hours, the activity was still displayed. Therefore, it was found that the bacteriophage CJ_CP_20-15 is a bacteriophage having excellent heat resistance.
  • a total of 45 CP strains isolated from fecal samples collected from livestock farms in Seoul, Gyeonggi, Chungcheong, and Gyeongsang provinces in Korea and CP strains distributed from the National Veterinary Science and Quarantine Service were each BHI.
  • 50 ⁇ L of each of the strain cultures was inoculated into 5 mL of 0.7% soft agar, poured into a Petri dish, and left for 5 minutes after plating.
  • 10 ⁇ L of the bacteriophage CJ_CP_20-15 concentrate obtained in Example 1-3 was added dropwise on soft agar, followed by stationary culture at 42° C. for 18 hours.
  • the lysis range of the bacteriophage CJ_CP_20-15 was evaluated according to the presence or absence of a lys plaque formed on the soft agar after the end of the culture.
  • CP strain name Whether or not a plaque is formed CP strain name Whether or not a plaque is formed HLYS-1 ++ BCCP42-2 ++ HLYS-3 ++ BCCP43-1 ++ JSH-1 ++ BCCP47-2 ++ CP-KCCM 40947 ++ BCCP48-3 ++ KJW-2 ++ BCCP51-1-1 ++ CP-KJW-1 ++ BCCP52-2-8 ++ CP-JSH-1 ++ BCCP53-2-3 ++ CP-OYS-2 ++ BCCP54-3-8 ++ CP-BC-1 ++ BCCP55-3-1 ++ CP-BSW-4 ++ SBCCP429-2 ++ CP-HBM-2 ++ SBCCP321 ++ CP-HLYS ++ SBCCP343 ++ CP-KW-1 ++ SBCCP361 ++ CP-BS-1 ++ ELCCP6-1 ++ CP-HL-1 ++ OYS-2-1 ++ CP-LJN-1 ++ OYS-2-2

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Abstract

본 출원은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로, 신규한 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 특이적으로 사멸시키는 효과를 가지며, 내산성 및 내열성이 우수하여 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도로 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제 등에 널리 활용될 수 있다.

Description

클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
본 출원은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.
클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)는 그람 양성의 대형 편성혐기성 간균으로 편모가 없고 아포를 형성하는 균으로 알려져 있다. 클로스트리디움 퍼프린젠스는 동물, 특히 닭, 돼지 등을 비롯한 가축들에 있어서 설사 등을 유발하는 균으로서 살모넬라에 의한 가금 티푸스 못지 않게 축산업에 있어서 중요하고 치명적인 병원균의 하나로 인식되고 있다.
현재, 양계 및 양돈 산업에 있어서 가장 빈번하게 발병하는 질병의 하나인 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염에 의한 괴사성 장염(Necrotic Enteritis)은 닭이나 돼지 등의 소장 하부에 심한 괴사성 병변을 유발하여 혈액이 섞인 설사가 배출되는 증상 등을 주요 증상으로 유발하는 질환이다. 이러한 괴사성 장염은 그 발병 정도에 따라 감염 동물에 탈수 증상, 간헐적 설사 증상 등을 일으키며 점차적으로 동물의 신체를 쇠약하게 하고 성장 장애를 유발하는 등, 축산업에 있어 상당히 문제가 되고 있는 질병이다. 더욱이 괴사성 장염의 원인이 되는 클로스트리디움 퍼프린젠스는 동물의 분변을 통하여 쉽게 전파되기 때문에 토양이나 오염된 사료를 통한 경구 감염 등에 의하여 공동 사육 공간 내 동물 간에 쉽게 전염이 일어나고 특히 어린 가축의 발병률이 높아 더욱 문제가 되고 있다.
축산업 등 분야에서는, 가축의 세균 감염에 의한 질환을 예방 및 치료하기 위하여, 여러 항생제가 사용되어 왔으나, 항생제 오남용 또는 내성 문제나, 동물 체내에 잔류할 가능성 등 문제가 대두되면서 현재는 전세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다.
이에 따라, 최근에는 특정 세균에 감염하여 세균의 성장을 억제하는 세균 특이적 바이러스인 박테리오파지가 항생제에 비하여 숙주 특이성이 강한 바, 새로운 항생제의 대체제로 연구되고 있으나, 아직까지 그 수가 절대적으로 부족한 실정이다. 따라서, 양돈 및 양계를 비롯한 축산업에 있어서 중요한 문제가 되고 있는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환을 예방 및 치료하기 위하여, 광범위한 용균 스펙트럼을 가지고 내산성 및 내열성이 우수하여 산업적으로 활용 가능성이 높은 새로운 박테리오파지의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국 등록특허 US 6,942,858 B1
본 출원의 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 특이적인 사멸능을 가지고, 수탁번호 KCCM12933P로 기탁된 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 이를 유효성분으로 포함하 는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 소독제, 또는 세척제, 또는 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료, 또는 상기 음용수 첨가제를 포함하는 음용수를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방제 또는 치료제 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
일 양상은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 특이적인 사멸능을 가지고, 수탁번호 KCCM12933P로 기탁된 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens: CP)"는 그람 양성의 혐기성 간균으로, 닭, 돼지 등 동물에서 감염성 질환을 유발하는 원인균에 해당한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "박테리오파지(bacteriophage)"는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 상기한 바와 같다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 특이적인 사멸능을 가지는 것이므로, 개체에 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환 발병 전에 투여 시, 개체로 유입되는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 사멸시킴으로써 이에 의한 감염을 억제하여 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환을 예방할 수 있다. 또한, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환이 발병한 개체에 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 투여하면, 개체에 존재하는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 사멸시킴으로써 이에 의해 나타나는 증상을 완화 또는 소멸시킬 수 있으므로, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환을 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 박테리오파지 또는 조성물의 투여에 의해 개체에서 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것일 수 잇고, 용어 "치료"는 박테리오파지 또는 조성물의 투여에 의해 개체에서 질병의 증세가 호전, 완화, 또는 소멸되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것일 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 예를 들면 괴사성 장염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "괴사성 장염(Necrotic Enteritis)"은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의해 유발되는 감염성 질병의 하나로, 양돈(이유자돈), 양계 등 가축에 질병을 유발하며 특히, 육계 등에서 빈번하게 발병하여, 상당한 피해를 끼치는 세균성 질병에 해당한다. 괴사성 장염의 증상은 소장에서 콕시듐과 함께 클로스트리디움 퍼프린젠스가 과도하게 증식하면서 나타나게 되며, 소화기 점막 괴사, 갑작스러운 설사 등을 유발한다. 예를 들어, 양돈에 있어서 심급성 괴사성 장염의 경우, 발병 후 1일 내지 2일 경과 후에 폐사를 일으키며, 급성 괴사성 장염의 경우 혈액이 섞인 설사를 배출하다 2일 내지 3일 경과 후에 폐사를 일으킨다. 또한, 아급성 괴사성 장염의 경우에는 설사 (혈변은 없음)가 5일 내지 7일간 계속되다가 쇠약 및 탈수 증상을 일으키며, 만성 괴사성 장염의 경우에는 간헐적 설사를 유발하고 성장 장애를 일으킬 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 1 X 102 내지 1 X 1012 PFU/mL 또는 1 X 105 내지 1 X 1010 PFU/g으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제 등을 의미하는 것일 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용가능한 담체라면 어느 것이든 사용될 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법도 이용할 수 있다. 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 도 있다. 상기 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 민감성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정화제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제(cryoprotectant), 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "품질 저하"는 조성물 등에 포함되는 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 균 수 감소, 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 보존제, 안정화제, 또는 부형제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 조성물 내에서 박테리오파지 CJ_CP_20-15가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 안정화제는 알긴산염(alginate), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 카제인, 카제인 나트륨, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose), 카르복시메틸셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 펙틴, 젤라틴, 아라비아검, 잔탄검, 덱스트란, 사이클로덱스트린 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 동결보호제는 상기 조성물이 동결건조된 상태일 때, 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 조성물 내에서 활성이 저하되거나 생존할 수 없는 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 상기 조성물은 동결건조된 상태에서 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 동결보호제를 포함함으로써, 동결건조된 조성물 내에서도 박테리오파지 활성이 유지되거나 박테리오파지가 생존할 수 있는 것일 수 있다.
상기 동결보호제는 동결건조된 상태인 조성물의 품질 저하를 감소시키기 위한 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 동결보호제는 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 글루코스, 트레할로스, 말토덱스트린, 덱스트린, 스킴 밀크 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 상기한 바와 같다.
본 명세서 사용되는 용어, "항생제"는 균을 죽이거나 균의 성장을 억제할 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것일 수 있다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 항생제는 종래 항생제에 비하여 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장되는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 항생제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 항생제는 항생제의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 항생제는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 항생제 내에서 박테리오파지 CJ_CP_20-15가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제는 항생제의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 음용수 첨가제를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 음용수 첨가제를 포함하는 음용수를 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 상기한 바와 같다.
상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 포함하는 조성물의 형태로 제조되어 사료 또는 음용수에 혼합시키거나, 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 사료 또는 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용하는 것일 수 있다.
상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 내에 포함되는 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 액체 상태 또는 건조된 고체 상태일 수 있고, 구체적으로, 건조된 분말 형태일 수 있다. 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 건조된 분말 형태로 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 중량의 0.05 내지 10 중량%, 구체적으로, 0.1 내지 2 중량%로 혼합되는 것일 수 있다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결합제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물(non-protein nitrogen compound: NPN), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 이들은 단독으로 첨가되거나 또는 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
상기 사료 또는 음용수에 포함되는 박테리오파지 CJ_CP_20-15 이외의 원료들은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 제한없이 사용될 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 첨가제는 사료 100 중량부에 대하여, 0.05 내지 10 중량부, 예를 들어, 0.1 내지 2 중량부로 포함되는 것일 수 있다. 상기 음용수 첨가제는 음용수 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 0.01 중량부, 예를 들어, 0.001 내지 0.005 중량부로 포함되는 것일 수 있다.
상기 사료 첨가제, 사료, 음용수 첨가제 또는 음용수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 사료 첨가제, 사료, 음용수 첨가제 또는 음용수는 이들의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 사료 첨가제, 사료, 음용수 첨가제 또는 음용수는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 사료 첨가제, 사료, 음용수 첨가제 또는 음용수 내에서 박테리오파지 CJ_CP_20-15가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제는 사료 첨가제, 사료, 음용수 첨가제 또는 음용수의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 상기한 바와 같다.
상기 소독제 또는 세척제의 제형은 특별히 제한되지 아니하며, 당업계에서 통상적으로 알려진 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 소독제 또는 세척제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 소독제는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 제거하기 위하여 살포될 수 있으며 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등에 살포될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
상기 세척제는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등 을 세척하는 용도로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
상기 소독제 또는 세척제는 이들의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 소독제 또는 세척제는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 소독제 또는 세척제 내에서 박테리오파지 CJ_CP_20-15가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제는 소독제 또는 세척제의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 상기한 바와 같다. 구체적으로, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 예를 들어 괴사성 장염일 수 있다.
상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는, 인간을 제외한 동물에 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제의 형태로 동물의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여되는 것일 수 있다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며 이는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명한 사항이다.
특정 동물에 대한 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
상기 인간을 제외한 동물은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의해 감염될 수 있는 동물이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 동물은 조류 및 포유류일 수 있고, 구체적으로, 닭, 오리, 돼지 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방제 또는 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
상기 박테리오파지 CJ_CP_20-15, 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 상기한 바와 같다. 구체적으로, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 예를 들어 괴사성 장염일 수 있다.
신규한 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 특이적으로 사멸시키는 효과를 가지며, 내산성 및 내열성이 우수하여 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도로 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제 등에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 신규 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 신규 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 pH 안정성을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 신규 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 60℃에서의 안정성을 확인한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클로스트리디움 퍼프린젠스( Clostridium perfringens : CP)에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지의 분리
실시예 1-1. 분변 시료 전처리액의 제조
대한민국 서울시, 경기도, 충청도, 경상도 지역의 농장에서 양돈, 양계 및 축우의 분변 시료들을 채취하여, 각 시료 20 g을 80 mL의 PBS에 희석하여 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 0.2 μm 필터로 여과한 후, 여액에 10%(w/v) 염화나트륨 수용액을 첨가하고 4℃에서 12 시간 동안 보관하였다. 이후, 여기에 10%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000 (Sigma-Aldrich, Cat. No. P2139)을 첨가하여, 4℃에서 12 시간 동안 보관한 후, 농축을 위해 15,000 rpm에서 1 시간 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 침전물을 10 mL의 SM 버퍼(5.8 g/L 염화나트륨, 2 g/L MgSO4·7H2O, 0.05M Tris-Cl (pH 7.5))에 녹인 후, 0.2 μm 필터로 여과하여 그 여액을 4℃에서 보관하였다.
실시예 1-2. 박테리오파지 농축액 제작
대한민국 서울시, 경기도, 충청도, 경상도 지역의 가축 농가에서 수집한 분변 시료로부터 분리한 CP 균주 및 국립수의과학검역원에서 분양받은 CP 균주를 2mL의 BHI (Brain Heart Infusion) 배지에 접종하여, 42℃ 및 혐기 조건에서 18 시간 동안 정치 배양 후, 50 mL의 BHI 배지에 상기 CP 균주 배양액 1mL 및 상기 실시예 1-1에서 수득한 분변 시료 전처리액 1 mL을 접종하여 42℃에서 18 시간 동안 혼합 정치 배양하였다. 혼합 배양액을 6,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 후, 상등액을 0.2 μm 필터로 여과하고, 여기에 10%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000을 첨가하여, 4℃에서 12 시간 동안 보관하였다. 이후, 농축을 위해 15,000 rpm에서 1 시간 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물을 1 mL의 SM 버퍼에 녹이고, 0.2 μm 필터로 여과하여 그 여액을 4℃에서 보관하였다.
실시예 1-3. 박테리오파지의 스크리닝 및 분리
상기 실시예 1-2에서 제작한 박테리오파지 농축액 50 μL를 0.7%(w/v) 한천(BD DIFCO, Cat. No. 44164) 5 mL, 및 상기 실시예 1-2에서 사용한 것과 동일한 CP 균주를 600 nm에서 흡광도(O.D.)가 2가 되도록 진탕 배양한 배양액 50 μL와 혼합하고, 지름 150 mm의 BHI 평판 배지를 이용하여 Double-layer agar plaque assay를 수행하였다. 소프트 아가에 형성된 용균반을 200 μL 팁으로 펀칭하여 0.5 mL의 SM 버퍼에 넣어 용출하였다. 용출된 박테리오파지 포함 용액은 동일한 형태의 단일 용균반이 형성될 때까지 Double-layer agar plaque assay를 반복하여 순수한 박테리오파지를 포함하는 용액을 분리하였다. 수득한 박테리오파지 포함 용액을 0.2 μm 필터로 여과하고, 여기에 10%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000을 첨가하여, 4℃에서 12 시간 동안 보관하였다. 이후, 농축을 위해 15,000 rpm에서 1 시간 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물을 1 mL의 SM 버퍼에 녹이고, 0.2 μm 필터로 여과하여 그 여액을 4℃에서 보관하였다.
실시예 2. 분리한 박테리오파지의 전유전체(whole genome sequencing: WGS) 분석
CsCl gradient 법 및 파지 DNA 분리 키트(Norgen Biotek-Corp. Kit, Cat. No. 46800)를 이용하여 상기 실시예 1-3에서 순수 분리한 박테리오파지 농축액 1 mL로부터 DNA를 추출하였다. (주)마크로젠(Macrogen Inc.)에 의뢰하여 전유전체 분석을 수행하였고, De novo assembly 소프트웨어(SPAdes 3.13.0)를 사용하여 유전자를 조합하고, Open reading frame(ORF)은 GeneMark.hmm과 NCBI ORF finder를 사용하여 수행하였다. BLASTP (E values of <0.1)와 PSI-BLAST (E value of <0.005) 프로그램을 사용하여 각 ORF의 기능을 명명 (annotation)하였다.
그 결과, 분리한 박테리오파지는 51,650 bp, 73 ORF, G+C 함량 34.1%인 서열번호 1의 염기서열을 가짐을 확인하였고, 이는 기존에 보고된 Clostridium phage CP3 (MF001357.1)와 96%의 서열 동일성을 나타냈으나, 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지는 없는 것으로 확인하여, 상기 박테리오파지는 신규 분리된 박테리오파지임을 알 수 있었다. 이에, 상기 신규한 박테리오파지를 박테리오파지 CJ_CP_20-15로 명명하고, 2021년 1월 18일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12933P를 부여 받았다.
실시예 3. 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 형태 분석
고순도의 박테리오파지 용액을 얻기 위해, CsCl gradient 법을 수행하였다. 구체적으로, 밀도가 1.7, 1.5, 1.45 또는 1.3인 SM 버퍼에 용해시킨 CsCl 용액을 준비하고, 15 mL 초원심분리(ultracentrifuge)용 튜브(Beckman Coulter, Cat. No. Z00901SCA)에 상기 CsCl 용액을 높은 밀도에서 낮은 밀도로 층을 이루도록 2 mL씩 분주하여, 가장 상단에 실시예 1-3에서 수득한 박테리오파지 CJ_CP_20-15 농축액 2 mL를 분주하였다. 이를 4℃ 및 25,000 rpm에서 2 시간 동안 원심분리 후, 튜브에 형성된 흰색의 박테리오파지 층만을 시린지(Satorius, Cat. No. 17822-K)로 채취하였다. 채취한 박테리오파지 용액 1 μL를 carbon-coated copper grid 위에 점적 후, 2% 우라닐 아세테이트로 15초간 염색하여 전자현미경(TEM, JEOL JEM-101, Tokyo, Japan)으로 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 형태학상 이십면체 머리와 약 100 nm 길이의 수축성 있는 꼬리(contractile tail)를 가지는 것으로 관찰되어, 카우도비랄레스 목(Caudovirales order), 미오비리대 과(Myoviridae family)에 속함을 알 수 있었다.
실시예 4. 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 pH 안정성 평가
박테리오파지 CJ_CP_20-15가 넓은 pH 범위에서 안정성이 있는지 확인하기 위하여, pH 4, 7, 7.5 또는 10의 용액(pH 4: 0.2M 아세트산 나트륨(sodium acetate) 용액; pH 7, 7.5: 0.2M 인산 나트륨(sodium phosphate) 용액; 및 pH 10: 0.2M 트리스(Tris-HCl) 용액)을 준비하였다. 각 pH 별 용액 450 μL와 2 X 1010 PFU/mL의 박테리오파지 용액 50 μL를 혼합하여 4℃에서 2 시간 동안 정치 후, Double-layer agar plaque assay를 수행하여 titer 증감을 평가하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 pH 7 내지 10에서 활성을 잃지 않고 안정적이었으며, pH 4에서도 pH 7.5인 군에 비하여 약 1.7 로그 정도만 활성이 감소된 바, 우수한 내산성을 가지는 박테리오파지임을 알 수 있었다.
실시예 5. 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 열 안정성 평가
박테리오파지 CJ_CP_20-15가 고온에서 안정성이 있는지 확인하기 위하여, 2 X 108 PFU/mL의 박테리오파지 용액 500 μL를 60℃에서 0, 3, 6 또는 24 시간 동안 정치 후, Double-layer agar plaque assay를 수행하여 titer 증감을 평가하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 60℃에서 3 시간 동안 노출되었을 때 0 시간 노출된 대조군 대비 약 1.0 로그의 활성 감소를 보였고, 6 시간 동안 노출 시 대조군 대비 약 2.1 로그의 활성 감소를 보였으며, 24 시간 동안 노출 시에도 대조군 대비 약 5.1 로그의 활성 감소가 있으나 여전히 활성을 나타냈다. 따라서, 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 우수한 내열성을 가지는 박테리오파지임을 알 수 있었다.
실시예 6. 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 용균 범위(spectrum) 평가
박테리오파지 CJ_CP_20-15의 용균 범위를 평가하기 위하여, 대한민국 서울시, 경기도, 충청도, 경상도 지역의 가축 농가에서 수집한 분변 시료로부터 분리한 CP 균주 및 국립수의과학검역원에서 분양받은 CP 균주 총 45종을 각각 BHI 액상 배지에서 배양 후, 0.7% 소프트 아가 5 mL에 상기 균주 배양물 각 50 μL를 접종하여 페트리 디쉬에 부어 플레이팅 후 5분간 정치하였다. 이후, 소프트 아가 위에 상기 실시예 1-3에서 수득한 박테리오파지 CJ_CP_20-15 농축액 10 μL를 적가(spotting)한 다음 42℃에서 18 시간 동안 정치 배양하였다. 배양 종료 후 소프트 아가 위에 형성된 용균반 유무에 따라 박테리오파지 CJ_CP_20-15의 용균 범위를 평가하였다.
CP 균주명 용균반 형성 유무 CP 균주명 용균반 형성 유무
HLYS-1 ++ BCCP42-2 ++
HLYS-3 ++ BCCP43-1 ++
JSH-1 ++ BCCP47-2 ++
CP-KCCM 40947 ++ BCCP48-3 ++
KJW-2 ++ BCCP51-1-1 ++
CP-KJW-1 ++ BCCP52-2-8 ++
CP-JSH-1 ++ BCCP53-2-3 ++
CP-OYS-2 ++ BCCP54-3-8 ++
CP-BC-1 ++ BCCP55-3-1 ++
CP-BSW-4 ++ SBCCP429-2 ++
CP-HBM-2 ++ SBCCP321 ++
CP-HLYS ++ SBCCP343 ++
CP-KW-1 ++ SBCCP361 ++
CP-BS-1 ++ ELCCP6-1 ++
CP-HL-1 ++ OYS-2-1 ++
CP-LJN-1 ++ OYS-2-2 ++
BCCP17-1 ++ 1-1-2 +
BCCP23-4 ++ 1-1 ++
BCCP37-2 ++ C3 +
BCCP38-1 ++ CP-ATCC12921 +
BCCP39-1 ++ CP-ATCC13124 ++
BCCP40-1 ++ CP-CCARM 18020 ++
BCCP41-3 ++
(++: 깨끗한 용균반 형성; +: 탁한 용균반 형성)
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 시험한 45종 CP 균주 모두에서 용균반이 형성되어, 박테리오파지 CJ_CP_20-15는 광범위한 CP 균주들에 사멸능을 가짐을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021007482-appb-I000001

Claims (12)

  1. 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens: CP)에 특이적인 사멸능을 가지고, 수탁번호 KCCM12933P로 기탁된 박테리오파지 CJ_CP_20-15.
  2. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 괴사성 장염인 것인, 조성물.
  4. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 항생제.
  5. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제.
  6. 청구항 5의 사료 첨가제를 포함하는 사료.
  7. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 음용수 첨가제.
  8. 청구항 7의 음용수 첨가제를 포함하는 음용수.
  9. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 소독제.
  10. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15를 유효성분으로 포함하는 세척제.
  11. 청구항 1의 박테리오파지 CJ_CP_20-15 또는 청구항 2의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염성 질환은 괴사성 장염인 것인, 방법.
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