MX2012004594A - Deteccion de un circovirus en terneros que padecen de pancitopenia neonatal bovina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un circovirus novedoso como agente causal de aplasia de médula ósea con enfermedad hemorrágica en ganado. La presente invención proporciona secuencias novedosas de ácido nucleico y proteínicas para usos de diagnóstico y terapéuticos.

Description

DETECCION DE UN CIRCOVIRUS EN TERNEROS QUE PADECEN DE PANCITOPENIA NEONATAL BOVINA DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un circovirus (CV) novedoso como un agente causal de aplasia de médula ósea con enfermedad hemorrágica en ganado. La presente invención proporciona secuencias novedosas de ácido nucleico y proteinicas para usos de diagnóstico y terapéuticos .

INTRODUCCION Las enfermedades hemorrágicas en ganado se han asociado con una diversidad de causas que incluyen infecciones virales, enfermedades hereditarias con enfermedades mediadas por sistema inmunitario, septicemia bacteriana e intoxicaciones. La tendencia a hemorragias y la trombocitopenia se asocian con la infección por virus de diarrea viral bovina (BVDV) tipo 2 no citopático (Ellis et al., 1998, Rebhun et al., 1989). Una diátesis hemorrágica heredable se describe para ganado Simmental. Esta trombopatia hereditaria Simmental es causada por disfunción de plaquetas (Steficek, et al., 1993). La trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario se conoce como condición rara en vacas. Se puede clasificar como púrpura trombocitopénica idiopática o una entidad secundaria (Yeruham, et al., 2003). Los ejemplos de infecciones bacterianas incluyen Pasteurella multocida, una causa bien conocida de septicemia hemorrágica en terneros con hemorragias petequiales y equimóticas, hiperemia generalizada y neumonía como signos clínicos (Rhoades, et al., 1967, Rimler, 1978).

Varias toxinas pueden ser las responsables de diátesis hemorrágica fatal en ganado. Las intoxicaciones debidas a diclorovinilcisteína (DCVC) en harina de aceite de fríjol de soya extraído con tricloroetileno alimentado a terneros (Lock, et al., 1996) y también el antibiótico furazolidona (Hoffmann-Fezer, et al., 1974, Hofmann, et al., 1974) producen anemia aplásica mortal, acelularidad marcada de médula ósea y hemorragias extensas, La ingestión de bracken fern {Pteridium aquilinum) provoca envenamiento agudo en ganado con hipoplasia irreversible de médula ósea también (Maxie y Newman, 2007, Valli, 2007) . Además, las intoxicaciones con micotoxinas de Stachybotrys chartarum (atra) se han descrito en rumiantes en enfermedad pancitopénica caracterizado por hemorragia profusa y necrosis en muchos tejidos (Harrach, et al., 1983, Valli, 2007) .

La anemia infecciosa en pollos es una enfermedad que recuerda fuertemente la enfermedad hemorrágica en terneros reportados aquí. El agente causal es el virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV) . La anemia grave, aplasia grave de la médula ósea, atrofia del timo y de la bolsa de Fabricio y hemorragias son hallazgos consistentes en pollos infectados con CIAV ( uscu y Gurel, 2008, Yuasa, et al., 1979) . En pollos SPF de un día de edad, inoculados experimentalmente con CIAV, muestran una disminución en los valores de hematocrito, se vuelven emaciados y se reprimen con anemia, particularmente entre los días 12 y 20 posteriores a inoculación (Goryo, et al., 1989). CIAV se clasifica en la familia Circoviridae (Todd, et al., 2005). Únicamente infecta a pollos y es el único miembro del género Gyrovirus. No obstante, varios miembros de un segundo género Circovirus, se han detectado en especies de mamífero y aves que incluyen los circovirus porcinos PCVl y PCV2. Los miembros de la familia Circoviridae son partículas icosahédricas sin envoltura con un genoma de ADN de cadena sencilla (ADNss) circular, de un tamaño de 1759 a 2319 nucleótidos (nt) (todd, et al., 2005). Los virus en el género Circovirus poseen una organización de genoma ambisentido que codifica para la proteína de replicación-asociada (Rep) de la cadena codificante (marco de lectura abierto [0RF]-V1) y la proteína de capside de la cadena codificante complementaria (0RF-C1) . Se han reconocido ORF pequeños adicionales en algunos de los circovirus, por ejemplo el ORF3 que codifica para una proteína que induce apoptosis en células infectadas por PCV2 (Liu, et al., 2005, Timmusk, et al., 2008). En las regiones no codificantes, está presente una estructura de tallo-bucle que contiene una secuencia nonamérica conservada e involucrada en el inicio de la replicación del genoma viral (Steinfeldt, et al., 2001). Recientemente se ha revisado la biología molecular de los circovirus {Mankertz, 2008).

Con excepción de PCV1, todos los circovirus conocidos son patógenos, los cuales provocan inmunosupresión y daño de los tejidos linforeticulares (Mankerts, 2008, Segales, et al., 2005, Segales y mateu, 2006, Todd, 2000) . PCV2 es un patógeno virulento asociado con numerosos síndromes y enfermedades diferentes en cerdos tales como el síndrome de agotamiento multisistémico posterior a destete (PMWS), el complejo de enfermedad respiratoria porcina (PRDC) , fallo reproductivo asociado con PCV2 y la dermatitis porcina y el síndrome de nefropatía (PDNS) . No obstante, solo lesiones típicas de PMWS se demostraron en lechones a los que se les suprimió el calostro así como cerdos convencionales por inoculación de PCV2 (Ellis, et al., 1999, Kennedy, et al., 2000) mientras que la relación de PCV2 en enfermedades porcinas diferentes de PMWS aún no se ha investigado completamente (Alian, et al., 2003, Chae, 2005). Únicamente existen datos limitados respecto a infecciones por circovirus en ganado. La presencia de circovirus se demostró por PCR en muestras de tejido de pulmón en 6 de 100 casos de enfermedad respiratoria bovina y en 4 de 30 fetos abortados (Nayar, et al., 1999). El genoma de un agente distinto, denominado de modo tentativo circovirus bovino (BCV), es casi idéntico al de PCV2, con 99% de identidad general en la secuencia nucleotidica . La presencia de anticuerpos que reaccionan con circovirus porcino en suero de humanos, ratones y ganado se ha reportado (Tischer, et al., 1995)). No obstante, en otro estudio, no se detectaron anticuerpos para PCV2 en sueros de ganado, borregos, caballos y humanos {Alian, et al., 2000, Ellis, et al., 2001). Además, un ternero neonatal seronegativo y seis terneros de cria para carne de 6 meses de edad seronegativos que fueron infectados experimentalmente con PCV2 no desarrollaron anticuerpos contra el virus (Ellis, et al., 2001).

Desde 2007 ha habido informes de granjeros y veterinarios de una enfermedad hemorrágica inexplicable en terneros en toda Alemania. 56 terneros con hemorragias espontáneas se presentaron al Bavarian Animal Health Service para caracterizar las lesiones e investigar la etiología por investigaciones de laboratorio adicionales. La enfermedad se observó en terneros jóvenes de crianzas diferentes dentro de su primer mes de vida. Los terneros machos y hembras fueron afectados or igual. Las hemorragias, particularmente en piel, subcuticula y el tracto gastrointestinal fueron los hallazgos principales. Las lesiones inflamatorias fueron hallazgos esporádicos adicionales. La investigación histológica indicó que existía una hipo a aplacia de médula ósea grave en todos los animales y supresión linfocítica en 43% de los terneros afectados. El análisis de sangre de 5 animales mostró pancitopenia aplásica. La trombocitopenia resultante se consideró que representa el mecanismo patológico principal de este síndrome de enfermedad hemorrágica (HDS) también denominado como diátesis hemorrágica (HD) . Mientras tanto, el nombre más común y aceptado científicamente para HDS/HD es pancitopenia neonatal bovina (BNP) . Los diferentes nombres y abreviaturas se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud. Las infecciones bacterianas e infecciones con virus de diarrea viral bovina o el virus de lengua azul se descartaron como causa de la enfermedad. Las toxinas especificas las cuales se sabe que provocan aplasia de médula ósea no se detectaron. El análisis de los antecedentes no presentó indicación de herencia de la enfermedad.

Utilizando PCR de espectro amplio, los presentes inventores pudieron demostrar la presencia de un circovirus en terneros afectados. La determinación de la secuencia del genoma viral completo mostró grandes similitudes con circovirus porcino tipo 2b (PCV2b) . Las células solas de médula ósea de un ternero mostraron ligera inmunorreacción PCV2-antigeno.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico de un circovirus (CV) novedoso identificado como agente causal del síndrome de enfermedad hemorrágica (HDS) o diátesis hemorrágica (HD) , ahora denominado principalmente como pancitopenia neonatal bovina (BNP) en ganado. Además, la invención se refiere a polipéptidos novedosos codificados por el ácido nucleico viral y anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos. Los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos son adecuados para uso de diagnóstico y terapéuticos, particularmente para el desarrollo de vacunas contra HD.

En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico para circovirus (CV) que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma, y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico de circovirus (CV) que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 7 o un fragmento de la misma, y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

En otro aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico de circovirus (CV) que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 11 o un fragmento de la misma, y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o ARN la cual puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico puede estar presente como tal o unida a moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo unidas operativamente con secuencias de control de expresión heterólogas. La molécula de ácido nucleico también puede estar encapsulada en una capside viral.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede comprender la secuencia completa de la SEC ID NO: 1 y/o de su complemento o un fragmento de la misma. De igual manera, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede comprender la secuencia completa de la SEC ID NO: 7 o la SEC ID NO: 11 y/o su complemento o un fragmento de la misma. El fragmento preferiblemente comprende por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30 o por lo menos 50 nucleótidos contiguos, como se muestra en la SEC ID NO: 1, 7 ú 11 o el complemento de los mismos. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de CV de la presente invención difiere en por lo menos un nucleótido de cepas de circovirus relacionadas, por ejemplo cepas de virus de circovirus cuyos números de acceso GeneBank se indican en la figura 6.

La presente invención también se relaciona con una molécula de ácido nucleico: (a) que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 1, (b) hibridizar bajo condiciones rigurosas con la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 1, o (c) el complemento de (a) o (b) .

La presente invención también se relaciona con una molécula de ácido nucleico: (a) que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 7, (b) hibridizar bajo condiciones rigurosas con la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 7, o (c) el complemento de (a) o (b) .

La presente invención también se relaciona con una molécula de ácido nucleico: (a) que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 11, (b) hibridizar bajo condiciones rigurosas con la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 11, o (c) el complemento de (a) o (b) .

La identidad de una molécula de ácido nucleico dada con respecto a la molécula de ácido nucleico de referencia (es decir, por ejemplo, la SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma) se puede determinar como sigue: I = n/L x 100. en donde I es la identidad, en porcentaje, n es el número de nucleótidos idénticos de una molécula de ácido nucleico dada, y la referencia, y L es la longitud de la superposición de secuencia de la molécula de ácido nucleico dada y la referencia.

Preferiblemente, la hibridación bajo condiciones rigurosas significa que después de lavado durante 1 h con 1 X de amortiguador SSC y SDS 0.1% a 50 °C, de manera preferible a 55°C, de manera más preferible a 62 °C y de manera mucho más preferible a 68 °C, particularmente durante 1 hora en 0.2 X SSC y SDS 0.1% a 50 °C, de manera preferible a 55 °C, de manera más preferible a 62 °C y de manera mucho más preferible a 68 °C, se observa una señal de hibridación positiva. Los protocolos de hibridación se describen, por ejemplo en Wahl y Berger (Methods Enzymol. 152 (1987), 399-407) y Kimmel (Methods Enzymol. 152 (1987), 507-511), el contenido de los cuales se incorpora en la presente como referencia .

En un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico de CV que codifica para un polipéptido de circovirus o un fragmento del mismo, en donde la molécula de ácido nucleico comprende : (a) una región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 1 de (i) el nucleótido 51 - 995, (Rep) (ii) el nucleótido 1034 - 1735 (Cap) (iii) el nucleótido 357 - 671 (ORF3) , o (b) una secuencia nucleotidica que corresponde a la secuencia de (a) dentro del alcance de degeneración del código genético, o (c) un fragmento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) o (b) .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico de CV que codifica para un polipéptido de circovirus o un fragmento del mismo, en donde la molécula de á-cido nucleico comprende : (a) una región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 7 de (i) el nucleótido 51 - 995, (Rep) (ii) el nucleótido 1034 - 1735 (Cap) (iii) el nucleótido 357 - 671 (ORF3) , o (b) una secuencia nucleotidica que corresponde a la secuencia de (a) dentro del alcance de degeneración del código genético, o (c) un fragmento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) o (b) .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico de CV que codifica para un polipéptido de circovirus o un fragmento del mismo, en donde la molécula de ácido nucleico comprende : (a) una región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 11 de (i) el nucleótido 51 - 995, (Rep) (ii) el nucleótido 1034 - 1735 (Cap) (iii) el nucleótido 357 - 671 (0RF3) , o (b) una secuencia nucleotídica que corresponde a la secuencia de (a) dentro del alcance de degeneración del código genético, o •(c) un fragmento de la secuencia nucleotídica de acuerdo con (a) o (b) .

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido de CV que se selecciona de Rep (SEC UD NO: 2), Cap (SEC ID NO: 3) y 0RF3 (SEC ID NO: 4) o fragmentos de los mismos. La molécula de ácido nucleico también puede codificar para un polipéptido de CV que se selecciona de Rep (SEC ID NOS: 8 y 12), Cap (SEC ID NOS: 9 y 13) y ORF3 (SEC ID NOS: 10 y 14) o fragmentos de los mismos. Los fragmentos de los polipéptidos de CV indicados en lo anterior pueden comprender, por ejemplo, por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 20 o por lo menos 30 aminoácidos contiguos de las secuencias de aminoácidos como se muestran en la SEC ID NOS: 2, 3 ó 4 o de manera alternativa como se muestran en la SEC ID NOS: 8-10 o 12-14.

Además, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico la cual codifica para un polipéptido que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en la SEC ID NOS: 2, 3 ó 4.

Además, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico la cual codifica para un polipéptido que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 8, 9, 10, 12, 13 ó 14.

El grado de identidad de entre un polipéptido dado y los polipéptidos de referencia, por ejemplo, de las SEC ID NOS: 2, 3 ó 4 se puede determinar como se indica para las moléculas de ácido nucleico anteriores.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede estar en un enlace operativo con una secuencia de control de expresión heteróloga, por ejemplo una secuencia de control de expresión que permite la expresión en una célula hospedadora adecuada. Los ejemplos de secuencias de control de expresión heterólogas para expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo procariótas o eucariótas incluyen secuencias de control de expresión de mamífero conocidas por los expertos en el ámbito y como se describen, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Pres, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, el contenido de los cuales se incorpora en la presente como referencia .

La presente invención también implica una célula hospedadora no humana, por ejemplo una célula hospedadora procariótica o eucariótica, por ejemplo una célula hospedadora de levadura, insecto o de mamífero la cual se transforma o transcepta con una molécula de ácido nucleico como se indica en lo anterior. La transformación o transfección de células hospedadoras con moléculas de ácido nucleico, por ejemplo localizadas en un vector, por ejemplo un vector viral o un plásmido son bien conocidas por las personas expertas en el ámbito y descritas, por ejemplo en Sambrook et al. (supra) o Ausubel et al. (supra) .

Un aspecto adicional de la presente invención es un polipéptido de circovirus (CV) codificado por una molécula de ácido nucleico como se describe en lo anterior. Un polipéptido de CV puede comprender: (a) una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: (i) una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 (Rep), (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3 (Cap) (iii) La secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 (ORF3) o (b) un fragmento de la misma.

Un aspecto adicional de la presente invención es un polipéptido de circovirus (CV) codificado por una molécula de ácido nucleico como se describe en lo anterior. Un polipéptido de CV puede comprender: (a) una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: (i) las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NOS: 8 y 12 (Rep) , (ii) las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO: 9 y 13 (Cap) (iii) las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NOS: 10 y 14 (ORF3) o (b) un fragmento de las mismas.

La presente invención comprende polipéptidos de CV o fragmentos de los mismos los cuales comprenden por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 20 o por lo menos 30 aminoácidos contiguos de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2, 3 ó 4 o, de manera alternativa, como se muestra en las SEC ID NOS: 8-10 o 12-14. Preferiblemente, un polipéptido de CV de la presente invención difiere en por lo menos un aminoácido de las cepas de circovirus relacionadas, por ejemplo cepas de circovirus cuyos números de acceso GeneBanck se indican en la figura 6.

La invención también se relaciona con polipéptidos que tienen una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2, 3 ó 4.

La invención también se relaciona con polipéptidos que tienen una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 8, 9, 10, 12, 13 ó 14.

Un aspecto adicional de la presente invención es un anticuerpo dirigido contra un polipéptido como se describe en lo anterior o un fragmento del anticuerpo el cual une antigeno.

Los métodos de generación de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, diversos hospedadores mamíferos, por ejemplo ratones o conejos se pueden inmunizar por inyección de un polipéptido de la invención, el cual tiene propiedades inmunogénicas . Si se desea, el polipéptido de la presente invención se puede acoplar a un portador tal como hemocianina de lapa de bocallave (KLH) . A partir de anticuerpos policlonales hospedadores inmunizados o células productoras de anticuerpo se pueden obtener por métodos bien conocidos.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos de la invención se pueden preparar por técnicas conocidas, por ejemplo técnica de hibridoma de linfocitos B (Kohler et al., Nature 256; (1975) 495-497), cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia o técnicas relacionadas.

La presente invención también abarca anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos, o fragmentos de estos anticuerpos que unen antígeno los cuales se pueden obtener por técnicas conocidas.

Un aspecto adicional de la presente invención es un circovirus que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en lo anterior. El virus puede ser un virus activo. De manera alternativa, el virus puede ser un virus inactivado o un virus atenuado. La inactivación y atenuación se pueden llevar a cabo como se describe con detalle en lo siguiente.

Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, virus y anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como agentes de diagnóstico o farmacéuticos, por ejemplo, para el diagnóstico o prevención y/o tratamiento de HD en mamíferos, particular en ganado y de manera más particular en terneros.

En modalidades de diagnóstico, la molécula de ácido nucleico o el polipéptido pueden presentar un grupo indicador, por ejemplo, cualquier grupo indicador adecuado para uso y métodos de diagnóstico, por ejemplo grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, colorante, enzimas, haptenos o biotina.

Particularmente, para modalidades de diagnóstico, el término "molécula de ácido nucleico" como se utiliza en la presente solicitud también abarca análogos de ácido nucleico tales como ácido péptido nucleico (PNA), ácidos nucleicos inmovilizados (LNA) u otros tipos de análogos de ácido nucleico conocidos en el ámbito.

De esta manera, un aspecto adicional de la presente invención es una composición de diagnóstico que comprende una molécula de ácido nucleico, un polipéptido, un virus o un anticuerpo como se describe en lo anterior junto con un portador aceptable.

Se puede utilizar una composición de diagnóstico en un método para diagnosticar HD, particularmente en ganado, en donde una muestra del sujeto que va a ser diagnosticado se pone en contacto con una composición de diagnóstico como se describe en lo anterior de manera que la presencia y/o cantidad de CV, particularmente cepa PCV2-Ha08, PCV2-Ha09 o PCV2.HalO o los anticuerpos contra CV, particularmente la -cepa PCV2-Ha08, PCV2-Ha09 o PCV2-HalO en la muestra se determina. La muestra puede ser una muestra de fluido corporal, por ejemplo sangre, suero, plasma, saliva, esputo o fluido linfático o una muestra de tejido, por ejemplo, de hígado, pulmón, médula ósea o tejido linfático .

En una modalidad, el método de diagnóstico de la invención puede abarcar la determinación de moléculas de ácido nucleico de CV, por ejemplo en análisis basados en ácido nucleico los cuales pueden involucrar hibridación y técnicas de amplificación de ácido nucleico tales como PCR. Adicionalmente, el método de diagnóstico de la invención abarca la determinación de polipéptido de CV, por ejemplo en inmunoanálisis utilizando anticuerpos de la invención como reactivos de diagnóstico y determinación de la presencia de complejos inmunitarios de polipéptidos de CV y anticuerpos de detección. Por otra parte, el método de diagnóstico de la invención puede abarcar la determinación de anticuerpo anti-CV en la muestra, por ejemplo utilizando polipéptidos CV como se describe en lo anterior, como antígenos de detección.

Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de las moléculas de ácido nucleico anteriores, polipéptidos, virus y anticuerpos para aplicaciones terapéuticas, particularmente para el tratamiento y/o prevención de HD en organismos de mamífero, particularmente en ganado.

De esta manera, la presente invención también abarca una composición para uso terapéutico que comprende la molécula de ácido nucleico, el polipéptido, el anticuerpo o el virus como se describe en lo anterior junto con un portador, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, la composición es una vacuna o una composición inmunogénica, por ejemplo una vacuna o composición inmunogénica basada en ácido nucleico, una vacuna o composición inmunogénica basada en polipéptido, una vacuna o composición inmunogénica basada en virus o una vacuna basada en un anticuerpo. En una modalidad preferida especialmente la composición es una vacuna o composición inmunogénica basada en polipéptido y comprende un polipéptido de CV capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto junto con un portador, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad especialmente preferida, la composición es una vacuna basada en virus o una composición inmunogénica y comprende un circovirus capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto junto con un portador, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención también abarca un método para evitar o tratar HD, particularmente en sujetos mamíferos, tales como ganado, en donde una composición terapéutica como se describe en lo anterior se administra a un sujeto en necesidad de la misma en una cantidad eficaz.

Para aplicaciones terapéuticas, las moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar en forma de vacunas basadas en ácido nucleico o composiciones inmunogénicas o como moléculas efectoras de ácido nucleico tales como moléculas antisentido o moléculas capaces de interferencia de ARN. Los polipéptidos o virus de la presente invención se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas para la elaboración de vacunas o composiciones inmunogénicas basadas en polipéptido en virus, como se describe en lo anterior. Los anticuerpos se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones de CV ya existentes.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las siguientes definiciones se pueden aplicar a los términos utilizados en la descripción de modalidades de la invención. Las siguientes definiciones prevalecen a cualquier definición contradictoria contenida en cada referencia individual incorporada en la presente como referencia .

A menos que se define en otro sentido en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entiende habitualmente por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. Además, a menos que se requiera en otro sentido por el contexto, los términos singulares incluirán las formas plurales y los términos plurales incluirán a las formas singulares.

El término "adyuvante", como se utiliza en la presente, se relaciona con cualquier sustancia que sirve como un estimulador inespecífico de la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones aceite en agua, emulsiones agua en aceite tales como, por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero de bloques (CytRx, Atlanta Ga . ) , SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adyuvante AMPHIGENMR, polisacáridos iónicos, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, Procision- AMR (un adyuvante que comprende una mezcla de Quil A, AMPHIGENMR y colesterol) , monofosforil lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o de otro tipo) , toxina del cólera o dipéptido de muramilo, entre muchos otros conocidos por los expertos en el ámbito.

La referencia a un "polisacárido iónico" debe entenderse como una referencia a cualquier polisacárido cargado positiva o negativamente o derivado o equivalente químico del mismo. El polisacárido iónico puede estar en forma soluble o insoluble. Preferiblemente, el polisacárido iónico es un dextrano iónico. De manera incluso más preferible, el dextrano iónico es DEAE-dextrano, sulfato de dextrano o QAE-dextrano. De manera más preferible, el dextrano iónico es DEAE-dextrano. Preferiblemente, el componente dextrano del dextrano iónico presenta un peso molecular en el intervalo de 250,000 a 4,000,000 Da, incluso de manera más preferible 500,000 a 1,500,000 Da.

Las propiedades adyuvantes de la saponina se han conocido durante mucho tiempo, y tiene la capacidad de incrementar los títulos de anticuerpo a inmunógenos. De la manera en que se utiliza en la presente, el término "saponina" se refiere a un grupo de glucósidos tensioactivos de origen vegetal constituidos de una región hidrofílica (habitualmente varias cadenas azúcar) en asociación con una región hidrofóbica de estructura esteroide o triterpenoide . Aunque la saponina está disponible de numerosas fuentes diversas, las saponinas con actividad adyuvante útiles se han derivado de el árbol sudamericano Quillaja saponaria (Molina) . La saponina de esta fuente se usa para aislar una fracción "homogénea" denominada "Quil A" (Dalsgaard, 1974) .

La reactividad en el sitio de dosis es la principal preocupación de uso tanto veterinario como humano de Quil A en preparaciones de vacuna. Una manera de evitar esta toxicidad de Quil A es el uso de complejos inmunoestimulantes (conocidos como IscomsMR, una abreviatura para complejos inmunoestimulantes) . Esto se debe principalmente a que Quil A es menos reactiva cuando se incorpora en complejos inmunoestimulantes, debido a su asociación con colesterol en el complejo lo que reduce su capacidad para unirse a colesterol en membranas celulares y por lo tanto, sus efectos Uticos en la célula. Además, se requiere una menor cantidad de Quil A para generar un nivel similar de efecto adyuvante.

Las propiedades inmunomoduladoras de las saponinas Quil A y los beneficios adicionales que se derivan de estas saponinas cuando se incorporan en un complejo inmunoestimulantes se han derivado de diversas publicaciones, por ejemplo, Cox y Coulter, 1992 (Cox, J.C. y Coulter, A.R., "Advances in Adjuvant Technology and Application", en Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Capitulo 4, Ed. Yong, .K., CRC Press (1992)); Dalsgaard, 1974; Morein et al., y las especificaciones de patentes australianas Nos. 558258, 589915, 590904 y 632067.

Las cantidades y concentraciones de adyuvantes de aditivos útiles en el contexto de la presente invención se pueden determinar fácilmente por una persona experta en el ámbito. En una modalidad, la presente invención contempla composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden de aproximadamente 50 µg a aproximadamente 2000 µg de adyuvante. En otra odalidad, el adyuvante se incluye en una cantidad de aproximadamente 100 q a aproximadamente 1500 µg o de aproximadamente 250 µq a aproximadamente 1000 µg, o de aproximadamente 350 µq a aproximadamente 750 µg. En otra modalidad, se incluye adyuvante en una cantidad de aproximadamente 500 µ? ?e?e de 2 mi de la composición inmunogénica o vacuna.

El término "aminoácido", de la manera en que se utiliza en la presente, se refiere a aminoácidos como se encuentran de manera natural y sintéticos asi como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos como se presentan de manera natural. Los aminoácidos como se encuentran de manera natural son aquellos codificados por el código genético asi como aquellos aminoácidos que posteriormente son modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, carboxiglutamato y O-fsofoserina . Los estereoisómeros "por ejemplo los D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a y -disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, N, N-trimetil-lisina, e-?-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares.

Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como los aminoácidos que se encuentran de manera natural, es decir, un carbono que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R. Los análogos de aminoácidos ejemplares incluyen, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina y metionina-metilsulfonio . Estos análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas pero retienen la misma estructura química esencial que los aminoácidos que se encuentran de manera natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido como se encuentra de manera natural.

Los aminoácidos se pueden denominar en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras conocidas comúnmente o por los símbolos de una letra recomendado por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comission.

El término "anticuerpo" o "anticuerpos", de la manera en que se utilizan en la presente, se refiere a una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno por medio de reconocimiento de un epítopo. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonales . Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes o pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab ' , F(ab' >2 así como cadenas solas.

El término "antígeno", de la manera en que se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos) que cuando se exponen a un sujeto inducirán una respuesta inmunitaria que es específica para ése antígeno. De la manera en que se utiliza en la- presente, el término "antígeno" puede referirse a bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios atenuados, inactivados o modificados vivos. El término "antígeno", de la manera en que se utiliza en la presente, también se refiere a una subunidad de antígeno, la cual está separada y es definida del organismo completo con el cual se asocia el antigeno en la naturaleza. El término "antigeno" también como se utiliza en la presente también puede referirse a anticuerpos tales como anticuerpos anti-idiotipo o fragmentos de los mismos y a mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antigeno o determinante antigénico (epitopo) . El término "antigeno", como se utiliza en la presente, también puede referirse a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antigeno o un determinante antigénico in vivo tal como aplicaciones de inmunización de ADN.

Los circovirus de la presente invención pueden ser "atenuados" o "inactivados" antes de su uso en una vacuna. Los métodos de atenuación e inactivación son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito. Los métodos de atenuación incluyen, pero no se limitan a pasaje en serie, en cultivo celular sobre una linea de células adecuada, y radiación con luz ultravioleta y mutagénesis química. Los métodos de inactivación incluyen, pero no se limitan al tratamiento con formalina, betapropiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI) u otros métodos conocidos por los expertos en el ámbito.

La inactivación por formalina se puede llevar a cabo al mezclar la suspensión de virus con formaldehído 37% a una concentración final de formaldehído de 0.05%. La mezcla de virus-formaldehído se combina mediante agitación constante durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de virus inactivada después se prueba para determinar el virus vivo residual al realizar un análisis para crecimiento en una línea de células adecuada.

La inactivación por BEI se puede realizar al combinar la suspensión de virus de la presente invención con BEI 0.1 M ( 2-bromo-etilamina en NaOH 0.175 N) a una concentración final de BEI de 1 mM. La mezcla virus-BEI se combina mediante agitación constante durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguido por la adición de tiosulfato de sodio 1.0 M hasta una concentración final de 0.1 mM. El mezclado continúa durante 2 horas adicionales. La mezcla de virus inactivada se prueba para virus vivo residual al realizar un análisis para crecimiento sobre una línea de células adecuada.

El término "línea celular" o "célula hospedadora" como se utiliza en la presente significa una célula procariótica o eucariótica en la cual el virus se puede replicar y/o se puede mantener.

El término "composición inmunogénica" , como se utiliza en la presente, significa una composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria o antigénica en un sujeto.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" de la manera en que se utiliza en la presente, se refiere a sustancias las cuales están dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de humanos o animales sin toxicidad indebido, irritación, respuesta alérgica y similares, conmensurado con una relación razonable beneficio respecto a riesgo y eficacias para su uso destinado. Las vacunas de la presente invención pueden incluir uno o más portadores farmacéuticamente aceptables tales como, todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservadores, sustancias antibacterianas y agentes antimicóticos, agentes isotónicos, agentes que retrasan la absorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre otros conocidos por los expertos en el ámbito. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros conocidos por los expertos en el ámbito. Los conservadores incluyen MerthiolateMR, entre otros conocidos por los expertos en el ámbito.

El término "polinucleótido o molécula de ácido nucleico", de la manera en que se utiliza en la presente, significa una molécula de polímero orgánico constituida de monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos con función biológica distinta.

Los términos "evitar", "prevenir" o "prevención" similares, como se utilizan en la presente, significan inhibir la replicación de un microorganismo, inhibir la transmisión de un microorganismo o inhibir que un microorganismo se establezca a si mismo en su hospedador. Los términos y similares, como se utilizan en la presente, también significan inhibir o bloquear uno o más signos o síntomas de infección.

El término "agente terapéutico" de la manera en que se utiliza en la presente significa un microorganismo (o partes del mismo) o una subunidad de antígeno, o polipéptidos o moléculas polinucleotídicas o combinaciones de las mismas las cuales inducen una respuesta inmunitaria en el sujeto al cual se le administra. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitación, inducción de inmunidad celular y/o humoral.

Los términos "tratar", "tratado" o "tratamiento" y similares, como se utilizan en la presente significan reducir o eliminar la infección por un microorganismo. Los términos y similares, de la manera en que se utilizan en la presente también significan reducir la replicación de un microorganismo para reducir la transmisión de un microorganismo o reducir la capacidad de un microorganismo para establecerse a si mismo en su hospedador. Los términos y similares, de la manera en que se utilizan en la presente también significan reducir, aminorar o eliminar uno o más signos o síntomas de infección por un microorganismo o acelerar la recuperación de la infección por un microorganismo .

Los términos "vacuna" y "composición de vacuna", de la manera en que se utilizan en la presente, significan una composición la cual evita o reduce una infección, o la cual evita o reduce uno o más signos o síntomas de infección. Los efectos protectores de una composición de vacuna contra un patógeno normalmente se obtienen al inducir en el sujeto una respuesta inmunitaria, ya sea una respuesta inmunitaria mediada por células o una humoral, o una combinación de ambas. De manera general, las incidencias de infección abatidas o reducidas la disminución de los signos o síntomas o una eliminación acelerada del microorganismo por los sujetos infectados son indicativos de los efectos protectores de una composición de vacuna. Las composiciones de vacuna de la presente invención proporcionan efectos protectores contra infecciones causadas por circovirus (CV) .

Las siguientes figuras y ejemplos que se presentan se proporciona con el fin de ayudar a los expertos en el ámbito en la práctica de la presente invención. Aún asi, esta descripción no debe considerar que limita de manera indebida la presente invención dado que las modificaciones y variaciones en las modalidades que aquí se discuten se pueden realizar por aquellos habitualmente expertos en el ámbito sin apartarse del espíritu o alcance del presente descubrimiento inventivo.

FIGURAS FIGURAS 1A- 1E . Localización de hemorragias en terneros enfermos: 1A: Hemorragias agudas focales en la piel de la cabeza. Penachos pequeños de pelo adherido juntos por sangre seca. IB: Petequias y hemorragias ecquimóticas en la mucosa del labio inferior y en las encías. 1C: Con la excepción de las hemorragias asociadas con los sitios de inyección y marcado en las orejas no hay signos de daño de piel traumática. ID: Hemorragias focales moderadas en el mesenterio del intestino delgado y grueso. El cambio de coloración rojo oscuro en segmentos del intestino delgado se debe a hemorragias intraluminales graves. 1E: Subcutáneo del carpo. Las hemorragias subcutáneas se observan con mayor frecuencia sobre proyecciones óseas y partes tensionadas mecánicas del cuerpo.

FIGURA 2. Frecuencia de hallazgos adicionales en terneros con pancitopenia y enfermedad hemorrágica (BNP) . Algunos animales mostraron varias lesiones adicionales. Las inflamaciones de diferentes órganos se encontraron con frecuencia, pero 30% de los animales investigados no presentó lesiones adicionales. GIT: tracto gastrointestinal .

FIGURAS 3A y 3B : Investigación histológica de médula ósea (esternón) después de descalcificación, cepa HE, ampliación ????: 1A: Médula ósea normal de un ternero de tres semanas de edad con tejido hematopoyético que incluye varios megacariocitos (flechas) . IB: Médula ósea de ternera afectado con pérdida grave de tejido hematopoyético. Únicamente permanecen fibroblastos estromales y células grasas.

FIGURA 4. Detección de ADN de circovirus en muestras de terneros con enfermedad hemorrágica. Un PCR de espectro amplio incrustado se realiza utilizando ADN extraído de médula ósea (carriles 3, 5, 9-12) , sangre, (carriles 4 y 8), hígado (carril 6) o riñon (carril 7) de terneros con los números indicados en la parte superior de los carriles. Neg: control de aislamiento negativo; pos: control PCR positivo; M: marcadores de masa molecular, con tamaños indicados a la izquierda, en pares de bases. Los productos PCR secundarios con un tamaño de aproximadamente 350 pares de pares de bases se han separado en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.

FIGURA 5: Inmunohistoquimica para detección de antigeno especifico para PCV2, esternón, ternero número 1. Células de médula ósea solas muestran tinción citoplasmática finamente granular ligera a moderada. Barra, 100 µt?.

FIGURA 6: Relación filogenética del circovirus PCV2-Ha08 detectado en terneros Alemanes con cepas de circovirus porcino tipo 2. El árbol filogenético se establece en base en las secuencias nucleotidicas completas de las cepas de referencia PCV2a, PCV2b y PCV2c (negrillas), el circovirus bovino Canadiense (BCV) y diez circovirus los cuales se vuelven la cepa más relacionada con PCV2-Ha08 por búsqueda BLAST. PCV2a-Ha08 se marca con una flecha. Los números de acceso GenBank de las secuencias se muestran entre paréntesis. El árbol presenta escala en unidades de sustitución nucleotidica.

FIGURA 7: Secuencias nucleotidicas y de aminoácidos de PCV2 cepa Ha08 de acuerdo con la entrada de acceso GenBank no publicada número FJ804417.

FIGURA 8: Secuencias nucleotidica y de aminoácidos de PCV-2 cepa Ha09 de acuerdo con la entrada de acceso GenBank publicada número HQ231329.

FIGURA 9: Secuencias nucleotidica y de aminoácidos de PCV2 cepa HalO de acuerdo con la entrada de acceso GenBank no publicada número HQ231328.

FIGURA 10: Análisis de sueros en un prototipo independiente de especie PCV2 de análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA) . Las lineas continuas representan sueros PCV2 negativos porcinos, las lineas discontinuas representan sueros PCV2-positivos porcinos, y las lineas con puntos representan sueros BNP bovinos.

EJEMPLOS MATERIALES Y METODOS ANTECEDENTES DEL CASO Entre octubre del 2007 y mayo del 2009 56 terneros con enfermedad hemorrágica, que se originan de 45 granjas de ganado lácteo en Bavaria, Alemania, se presentaron para necropsia. Los registros médicos se revisaron para edad, sexo y crianza. Se pidió a los propietarios que informarán sobre enfermedades previas y tratamiento médico previo de terneros, la alimentación de los terneros, contaminación de forraje con moho o bracken fern y uso de rodenticidas .

Los casos HDS (BNP) y los animales del grupo control se numeraron de acuerdo con la tabla 1. Los animales del grupo control se especifican como se indica en el texto.

Ocho terneros, enviados para examen patológico por otras razones diferentes a enfermedad hemorrágica se incluyeron como controles para PCR especifico de circovirus; se enumeran en la tabla 1. El control número 1 pertenece al mismo ganado en que los dos casos con enfermedad hemorrágica (números 11 y 15) y murió poco después del nacimiento por razones desconocidas. No fue detectable agente infeccioso en este caso. Siete terneros, que incluyen al grupo control debido a su edad, padecen de poliartritis grave o enteritis grave y mueren dentro del primer mes de vida. Ninguno de los animales control, mostró signo alguno de merma en la médula ósea.

HISTOPATOLOGIA Todos los animales experimentaron examen por necropsia y la serie estándar de tejidos incluyen médula ósea del fémur y hueso esternal, pulmón, hígado, riñon, bazo y nodulos linfáticos se recolectaron para histopatología . Se recolectaron muestras adicionales dependiendo de hallazgos patológicos adicionales, según se requería. Los especímenes de tejidos de órganos se fijaron en formalina amortiguada 10%. Los especímenes de médula ósea del esternón se descalcificaron durante la noche en Ossa FixonaMR ( aldeck, Münster, Alemania) . Siguiendo el procesamiento para incrustación en parafina, se cortaron secciones de 4 ym de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) .

INMUNOHISTOQUIMICA Se realizó inmunohistoquimica (IHC) en los cortes de 4 IM montados en portaobjetos de vidrio SuperfrostMR Plus. Un anticuerpo monoclonal de ratón, 3€A9, dirigido contra la proteina VP2 (0RF2) de PCV2 (Ingenasa, Madrid, España) se aplicó a secciones de tejido de médula ósea, bazo y nodulo linfático de 2 terneros afectados. Se determinó la reactividad del anticuerpo en cada prueba en secciones de nodulo linfático y se recolectaron las placas de Peyers de un cerdo con infección confirmada por PCV2 en base en inmunohistoquimica y análisis de PCR. El tratamiento antes de la tinción incluye lavados con xileno para eliminar la parafina de los cortes y lavados con etanol graduado serial para rehidratación seguido por tratamiento con peróxido de hidrógeno 3% para eliminar la actividad de peroxidasa del tejido endógeno. La tinción se realizó utilizando el equipo HistostainMR-Plus Bulk Kit y el reactivo cromogénico AEC Single Solution ( InvitrogenMR, Camarillo, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, las secciones se someten a tinción contrastante con hematoxilina de Mayer.

Los cortes clasificados como PCV2 positivos mostraron una señal roja brillante intracitoplasmática en el patrón granular.

HEMATOLOGIA Muestras de sangre con EDTA estaban disponibles de 5 casos {número 2, 53-56) y el análisis de sangre se realizó en las siguientes 48 horas después de la recolección. Se calculó la cuenta sanguínea completa incluyendo la cuenta eritrocítica, cuenta plaquetaria, nivel de hemoglobina y parámetros de eritrocitos utilizando el equipo CELL-DYNMR 3500 (Abbott, Wiesbaden, Alemania) . Se utilizó el método microscópico para determinar el número de plaquetas en un portaobjetos de hemocitómetro .

TOXICOLOGIA Las siguientes muestras se probaron para toxinas específicas: Muestras de orina y sangre de los casos números 21 y 22 se analizaron con métodos específicos para detectar diclorovinilcisteína (DCVC) y sus metabolitos. Se utilizó el método de cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) para la detección de compuestos orgánicos volátiles, derivados de coumarina y sustancias quimioterapéuticas tales como sulfonamidas en muestras de orina de caso número 25 y tejido renal del caso número 8. Las muestras de orina e hígado de tres casos (números 23, 34 y 36) se analizaron para determinar medicamentos farmacéuticos utilizando el método de CG-EM y el método de cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) . Las muestras de forraje (guardado en silos, heno, harina de extracción de fríjol de soya y paja) se recolectaron de una granja con dos casos afectados (terneros números 1 y 2) . Una muestra de paja fue sospechosa de un cambio de coloración grisáceo y un olor o moho. Las investigaciones micotoxicológicas asi como un análisis de citotoxicidad se realizaron con respecto a aflatoxina Bl y toxina de Stachybotrys chartarum. Los intentos por demostrar la presencia de micotoxinas ( fumitremorgen C, verrucologen, aflatoxina Bl, fumagillina, gliotoxina, verrucarol, NH4+, desoxinivalenol, nivalenol, zearalenon, satratoxina G, satratoxina H, verrucarina A, roridina A, roridina L, satratoxina F y verrucarina J) se elaboraron utilizando análisis CL-EM/EM como se ha publicado recientemente (Gottschalk, et al., 2008). Los análisis de citotoxicidad (MTT) se realizaron de acuerdo con el método de Reubel et al. (1987).

CULTIVO MICROBIOLOGICO Un conjunto estándar de órganos (pulmón, hígado, bazo, riñon e intestino delgado) de todos los animales en el estudio y el grupo control así como muestras adicionales dependiendo de riesgos patológicos se examinaron para determinar la presencia de bacterias. Cada muestra se investigó al inocular agar sangre Columbia con sangre de borrego desfibrinada 5% y agar lactosa agua-azul-metacromo-amarillo. Se utilizó agar infusión cerebro-corazón y agar chocolate para la detección de gérmenes microaerofílicos en pulmones. Para examen anaeróbico, se utilizó agar Zeissler. Se aislo Salmonella en medio Rappaport-Vassilioadis después de pre-enriquecimiento en agua con peptona amortiguada y agar xilosa lisina desoxicolato.

VIROLOGIA Los tejidos renales y tiroideos de todos los animales afectados se probaron para determinar la presencia de BVDV mediante análisis de inmunofluorescencia directa utilizando un equipo de diagnóstico (Bio-X Diagnostics, Jemelle, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para aislamiento de BVDV, se inocularon con homogeneizados de órgano monocapas de células KOP-R bovinas (RIE 244, CCLV Federal Research Centre for Virus Diseases of Animáis, Isla de Riem, Alemania) . Las células se cribaron diariamente para determinar cambios citopáticos.

Después de un segundo pasaje de cultivo celular, las células se examinaron por análisis de inmunofluorescencia directa como se describe y por la prueba de ELISA indirecta por la detección de antigenos específicos para BVDV (SERELISA BVD p80 Ag Mono Indirect, Synbiotics, Lyon, Francia) . Para la demostración de secuencias nucleotídicas específicas para BVDV, se aislo ARN de muestra de tejido utilizando el equipo RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y un procedimiento de RT-PCR en tiempo real comercial (Virotype BVDV Kit; Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig Alemania) se aplicó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para detección de secuencias específicas de BTV, se llevó a cabo un procedimiento de RT-PCR en tiempo real que abarca la totalidad de los 24 serotipos BTV (Toussaint, et al., 2007) con el ARN aislado de tejido de bazo de todos los terneros afectados.

De un total de 56 terneros en el grupo de estudio, se seleccionaron aleatoriamente 25 (casos números 1, 2, 4-13, 15-22, 31, 34, 41, 42, 45) para la detección de circovirus mamífero y aviar incluyendo PCV2; todos los terneros en el grupo control (denominados con control número 1, control número 2, etc., también se investigaron. El ADN se extrajo de tejidos que incluyen sangre, médula ósea, bazo, timo, riñon e hígado utilizando el equipo High Puré PCR Témplate Preparation it (Roche, Mannheim, Alemania) y un procedimiento de PCR de amplio espectro incrustado se aplicó como se ha descrito recientemente (Halami, et al., 2008). Un protocolo de PCR adicional, aplicado habitualmente para detección específica de PCV2 se realizó de acuerdo con Bogner et al. (2005). Se tuvieron precauciones de excluir contaminación por ADN de laboratorio durante el análisis por PCR. El aislamiento de ADN, la preparación de la matriz maestra de PCR y el análisis de los productos de PCR se realizaron en habitaciones separadas con diferentes grupos de pipetas y el uso excluyente de puntas de filtro. Cada conjunto de reacciones se analizaba para contaminación utilizando un control de reactivo negativo y un control de aislamiento de 5 ADN negativo. El laboratorio nunca se utilizó para diagnósticos de PCR rutinarios para infección por PCV2 antes del inicio de investigación.

AMPLIFICACION DEL GENOMA COMPLETO DE CIRCOVIRUS El genoma completo del circovirus detectado se ]_ø amplifica por PCR utilizando un par de cebadores inversos (5'-AGC TCC ACA CTC GAT CAG TAAG-3 ' (SEC ID NO: 5) y 5 ' -CCT AGA TCT CAG GGA CAA CGG AG-31 (SEC ID NO: 6)) designado de acuerdo con la secuencia amplificada por el PCR de espectro amplio incrustado. La amplificación se realizó utilizando 5 el equipo High Fidelity PCR Enzyme MIx (Fermentas, St.

Leon-Rot, Alemania) , con las siguientes condiciones de ciclos: desnaturalización inicial a 95°C durante 5 minutos seguido por 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 70°C durante 4 minutos y una 20 extensión final a 70°C durante 10 minutos. El secuenciado de ADN y el análisis filogénetico . Los productos de PCR se clonaron utilizando GeneJET. Equipo de clonación PCR (Fermentas, St . Leon-Rot, Alemania). El inserto de los plásmidos se secuenció utilizando los cebadores pJetl 25 directo y pJetl inverso (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) o cebadores específicos en un dispositivo ABI Prism (Applied Biosystems) . La secuencia completa de genoma de los circovirus detectados se reensambló a partir de los fragmentos de secuencia utilizando el módulo EditSeq del paquete de programa Lasergene DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA) y sebsecuente se depositó en la base de datos de GenBank con el número de acceso FJ804 17. Las búsquedas de similitud de secuencia se realizaron utilizando la instalación de búsqueda BLAST 2.2.14. Las alineaciones de secuencia y la construcción de árboles filogéneticos se llevó a cabo con el método CLUSTAL (Thompson, et al., 1994) utilizando el módulo MegAlign del paquete de programa mencionado antes. Las designaciones de cepa en los números de acceso de GenBank se presentan en la figura 6.

ANALISIS DE ANTECESORES Todos los terneros y sus padres se identificaron y se realizó un seguimiento por medio de sus etiquetas en las orejas. Los antecesores de todos los casos se construyeron a partir de los antecesores que se utilizaron para la evaluación de crianza conjunta de Alemania y Austria. La presentación gráfica de los antecesores se realiza con el programa PedigraphMR y los sires que se presentan más de una vez se identificaron.

RESULTADOS Una cantidad de 86% de los terneros examinados son ganado Simmental (n = 48), 4% son ganado Holstein Friesian (n = 2) y 11% eran de raza mixta o desconocida (N = 6) . La edad al momento de la muerte varia de 7 a 32 días (17 dias en promedio). Un porcentaje de 85% de los terneros se encontraban enfermos en la segunda a tercera semana de edad. Se afectaron terneros macho y hembra en proporciones iguales. El análisis retrospectivo de los antecedentes clínicos muestra que los terneros se encontraban sanos en el momento de nacer y durante los primeros días posteriores al parto. Los propietarios y los veterinarios que atendieron reportaron hemorragias transcutáneas espontáneas sin ningún daño obvio y hemorragias en varias superficies de la mucosa así como hemorragia excesiva asociada con traumatismo o procedimientos de manejo convencionales tales como etiquetado de la oreja o inyecciones. Algunas veces se registraban signos adicionales tales como fiebre, diarrea o disnea. Las hemorragias parecían presentarse únicamente en terneros solos o en un par de terneros de una granja, a intervalos irregulares. El tratamiento médico no tuvo éxito. La mayor parte de los terneros murió en los siguiente días (n = 50) o tuvieron que ser sacrificados (n = 6) en consecuencia a la pérdida de sangre.

Todos los terneros habían recibido calostro en los primeros días de vida. Posteriormente, la mayor parte de los granjeros suministró leche entera de vacas por si mismos. En general, los terneros permanecieron sin tratar hasta que surgieron los primeros signos de hemorragias. Algunos terneros recibieron medicamento preventivo o, debido a diarrea aguda, algunos fueron tratados con halofuginona contra Criptosporidia . Dado que bracken fern en Alemania es un componente de pastura únicamente en un grado menor, cualquier problema debido a contaminación por bracken fern no ha sido reportado. Los rodenticidas utilizados en las granjas, pero los propietarios excluyeron una posible ingestión por las vacas o terneros. Únicamente uno de los granjeros mencionaba haber experimentado problemas de salud en el ganado debido a forraje con moho.

ANALISIS DE LOS ANTECESORES Se construyeron los antecesores de todos los terneros. El porcentaje de los terneros fue diverso e indica que no es una causa monogénica (recesiva o dominante) genética de enfermedad. Aunque algunos sires se representaron varias veces, el número de terneros es demasiado pequeño para obtener resultados con significado a partir de este análisis.

PATOLOGIA GENERAL En el momento de la necropsia, los cadáveres de los 56 terneros en el grupo de estudio se encontraban en buen estado nutricional con pesos corporales entre 32 y 72 kg, dependiendo de la edad (53 kg en promedio) . En la mayor parte de los animales, el abomaso contenia leche coagulada y se encontró algo de paja en el rumen. No hay indicación de ingestión de plantas tóxicas tales como bracken fern. Los hallazgos morfopatológicos predominantes en la totalidad de los 56 casos son hemorragias agudas graves en diversos órganos y tejidos. Un porcentaje de 88% de los animales mostraron hemorragias multifocales petequias a equimoticas en piel y subcuticula. Las hemorragias en la superficie serosa y mucosal del tracto grastrointestinal, en algunos casos melena grave se presentaban con mucha frecuencia (98%) . Además, las hemorragias en el corazón, las meninges y músculo esquelético fueron hallazgos comunes (hasta 84%) . Los ejemplos de hemorragias se muestran en la figura 1. La médula ósea de huesos largos de esternón es de color rojo claro. Dependiendo de la duración e intensidad de las hemorragias, los cadáveres presentaron una apariencia anémica .

Las lesiones inflamatorias fueron hallazgos esporádicos adicionales. Se observó con mayor frecuencia neumonía fibrinosa o supurativa (en total 27%) e inflamación focal ulcerativa a necrotizante en la cavidad bucal (en total, 11%) . Los hallazgos patológicos e histológicos adicionales se enumeran en la figura 2.

HISTOPATOLOGIA El hallazgo histopatológico principal es una notable hipoacelularidad a acelularidad del tejido hematopoyético en la médula ósea en cada uno de los 56 animales (figura 3) . Todas las lineas hematopoyéticas fueron afectadas de la misma manera. En algunos casos, permanecían islas pequeñas de tejido hematopoyético. Ocasionalmente, la degeneración focal y apoptosis de células precursoras estaba presente en estos lugares. Los espacios entre células estromales eran hiperémicos o se llenaban con material eosinofílico homogéneo o tejido hematopoyético que era sustituido por tejido graso. Únicamente cinco de los 56 casos (9%) presentaron pruebas de hematopoyesis extramedular. Los sitios de hemorragia no mostraron cambios adicionales que pudieran explicar la tendencia a hemorragia debido a daños previo sin tejido tales como vasculitis, reacciones inflamatorias o ruptura de tejido. En 43% de los casos (n = 24) las lesiones en tejidos linfáticos se volvieron evidentes como un número incrementado de linfocitos apoptosicos en folículos linfoides de baja celularidad del bazo y nodulos linfáticos con folículos pequeños. Estos cambios se resumieron como supresión linfocítica. Un hallazgo ocasional y poco frecuente fue la presencia de algunas células gigantes multinucleares en tejido linfático (n = 2). La reacción inflamatoria celular en algunas lesiones ulcerativas de la cavidad bucal estaba .constituida principalmente de células mononucleares con sorprendentemente pocos nutriofilos. de igual manera, en algunos casos de neumonía fibrinosa, el exudado inflamatorio consistía de grandes cantidades de fibrina con muy pocos neutrófilos. Los hallazgos histológicos adiciones también se enumeran en la figura 2. No hubo pruebas de ectiricia o hemolisis. No se reconocieron cuerpos de inclusión en tejidos hematopoyéticos o linfáticos.

HEMATOLOGIA La sangre tratada con EDTA se encontró disponible de 5 casos (Nos. 2, 53-56) . El análisis de sangre mostró trombocitopenia grave (12.5-82 x 103 células/µ?), leucopenia moderada a grave (285-1.470 células/µ?) y linfocitosis relativa moderada (€8-96%) en la totalidad de los 5 casos. Adicionalmente, 4 de estos casos mostraron una disminución marcada en granulocitos neutrófilos (granulocitopenia, 1-4%) . De los casos, 3 se encontraban anémicos. El hematocrito de 2 casos aún varió dentro de límites fisiológicos. Los resultados hematológicos detallados se presentan en la Tabla 2.

TOXICOLOGIA El análisis toxicológico de la orina y tejido renal de los casos Nos. 8 y 25 indica que no hay pruebas de captación de sustancias tales como tricloroetileno, anticoagulantes o sulfonamidas . El antibiótico furazolidona no fue detectable en muestras de orina e hígado en los casos Nos. 23, 34 y 36 utilizando el método de CLAR. No obstante, se encontró metamizol en los casos Nos. 23 y 34 y una combinación de sulfametazina y trimetropim se encontró en el caso No. 36. Estos resultados se interpreta que son el resultado de la administración terapéutica poco antes de la muerte. Además, el análisis de las muestras de orina y sangre recolectada de dos casos utilizando métodos específicos para detección de DCVC y su metabolito N-acetil-DCVC proporcionó resultados negativos.

La condición de la paja recolectada de una granja sugiere una posible contaminación con moho, no obstante, no se detectaron micotoxinas. El análisis de citotoxicidad también presentó resultados negativos.

CULTIVO MICROBIOLOGICO Todos los casos de terneros con enfermedad hemorrágica se probaron para determinar la presencia de bacterias potencialmente patogénicas. En algunos casos, se detectó más de un agente. Se detectó con mayor frecuencia E. coli (n = 29) seguido por C. perfringens (n = 14) en intestino y otros órganos. En algunos casos se encontró P. multocida (n = 3) y P. aeruginosa (n = 3) . Se encontraron únicamente en un solo animal (n = 1 de cada uno) N. haemolytica, Pseudomonas spp. , Staphylococci , Nocardia spp y Salmonella entérica. En 16 casos no se detectaron patógenos bacterianos.

Una cantidad de 26 casos de terneros con enfermedad hemorrágica mostraron lesiones inflamatorias adicionales (figura 2) . La neumonía fue observada con mayor frecuencia (n = 15) . En este caso, se aisló E. coli en tejido pulmonar de 9 casos. Se detectaron P. multocida y P. aeruginosa, S. aureus y S. uberis o Nocardia spp. en tejido de pulmón en un caso. El tejido de pulmón de otros tres casos con neumonía no se aislaron patógenos. La enteritis debida a infecciones con E. coli (n = 2) y C. perfringens (n = 1) se diagnosticó en 3 casos.

VIROLOGIA Todos los animales con enfermedad hemorrágica se probaron para BVDV y BTV. Ni los antígenos virales ni la presencia de genomas virales se pudo demostrar para cualesquiera de estos agentes virales (datos no mostrados) .

Los tejidos de órganos recolectados de 25 casos (Nos. 1, 2, 4-13, 15-22, 31, 34, 41, 42, 45) se investigaron para la presencia de ADN circoviral mediante PCR de espectro amplio incrustada, utilizando cebadores con sitios de unión en el 0RF-V1 del genoma de circovirus. En muestras que dieron como prueba positiva, la electroforesis en gel de agarosa mostró bandas con la longitud esperada de aproximadamente 350 pares de bases. La figura 4 muestra una muestra de médula ósea negativa en el caso No. 2 (carril 3) mientras que una banda fuerte con el tamaño esperado se había formado cuando se analizó la sangre (carril 4).

En el caso No. 4, la médula ósea, el hígado, el riñon y la sangre fueron positivas (carriles 5-8) . Se detectaron bandas más débiles cuando se investigaron muestras recolectadas de otros terneros (carriles 9, 10 y 12) ; otras permanecían negativas (línea 11) . En total, 5 de 25 casos del grupo de estudio (Nos. 2, 4, 5, 7 y 17) y 1 de los 8 controles representaron prueba positiva en PCR de circovirus. Los productos de PCR de tres muestras (terneros Nos. 2, 4 y 17) se secuenciaron y las identidades de 99% se ocluyeron cuando se compararon con secuencias nucleotídicas de PCV2 presente en la base de datos GenBank. De las 25 muestras bajo investigación, cinco muestras probaron ser positivas en PCR específica para circovirus más cuatro seleccionadas aleatoriamente de las muestras probaron ser negativas cuando se enviaron a otro laboratorio, un protocolo de PCR específico para PCV2 utilizado habitualmente mostró resultados negativos en todos los casos (datos no mostrados) .

ANALISIS DE SECUENCIA DE GENOMA COMPLETO DE LA CEPA PCV2- Ha08 En base en la secuencia de los productos de PCR, se generaron cebadores inversos los cuales son capaces de amplificar el genoma de circovirus completo presente en la muestra del caso No. 4 que resultó positiva con médula ósea, hígado, riñon y sangre. La cepa se designó como PCV2-Ha08 y se secuenció por completo. El genoma de PCV2-Ha08 tiene una longitud de 1768 nucleótidos. El análisis de secuencia mostró tres ORF con similitudes por PCV2 Rep y proteína de cápside y con el producto de 0RF3. La estructura de tallo-bucle, con un tamaño de 11 pares de bases y que contiene la secuencia nonámera conservada es evidente la región no codificante 1 (NCR1) .

Una búsqueda de similitud de la secuencia del genoma de PCV2-Ha08 con la secuencia de la base de datos de GenBank mostró el grado más alto de identidad (99%) con el control DK558 aislado PCV2 (EF565365) , que se originó de un cerdo en Dinamarca. La comparación de las secuencias deducidas de aminoácidos del producto Rep, Cap y 0RF3 con el de los circovirus porcino y bovino seleccionados mostró identidades entre 68.5% y 100% (Tabla 3). En todos los casos, PCV2-Ha08 se relaciona estrechamente con las cepas de PCV2b y muestra los porcentajes más grandes de identidad con el control DK558 aislado (EF565365) .

Se realizó un análisis filogenético utilizando las secuencias de genoma completo de PCV2-Ha08, el circovirus bovino (AF109397), diez circovirus que comparten la más grande similitud de secuencia (determinada por búsqueda BLAST) y tres cepas de referencia que definen los subtipos PCV2a, PCV2b y PCV2c (Segales, et al., 2008). Como se muestra en el árbol filogenético (figura 6) , PCV2-Ha08 claramente se agrupa dentro del subtipo PCV2b, no obstante, forma una rama separada dentro de este grupo. En contraste, el circovirus bovino (AF109397), el cual previamente ha sido descrito que infecta ganado en Canadá, se agrupa junto con PCV2a.

La secuencia nucleotidica y la secuencia de aminoácidos de 3 marcos de lectura abiertos de PCV2-Ha08 se muestra en la figura 7 y en el listado de secuencias (SEC ID NOS: 1, 2, 3 y 4) .

AISLAMIENTO DE PCV2-Ha09 Y PCV2-HalO Se obtuvieron dos aislados adicionales de acuerdo con el protocolo descrito antes (véase la sección "Amplificación del genoma de circovirus completo") .

Un aislado obtenido de sangre de un ternero de Bavaria que murió bajo los síntomas de pancitopenia neonatal bovina (BNP) se designó PCV2-Ha09 y se secuenció por completo. Análogos a la cepa PCV2-Ha08, el genoma de PCV2-Ha09 tiene una longitud de 1768 nucleotidos y contiene tres ORF con similitudes con el PCV2-Rep y proteína de cápside y con el producto de ORF3.

Un aislado de pulmón y cerebro de un ternero de Saxonia, el cual murió también de BNP, se designó como PCV2-HalO y se secuenció por completo. El genoma de PCV2-HalO tiene una longitud de 1767 nucleótidos y, como PCV2-Ha08 y PCV2-Ha09, contiene tres ORF con similitudes por PCV2-Rep y proteína de cápside y con el producto de 0RF3.

Las secuencias nucleotídicas de PCV2-Ha09 y PCV-HalO asi como la secuencia de aminoácidos de los tres marcos de lectura abiertos para cada uno de PCV2-Ha09 y PCV-HalO se muestran en la figura 8 y en la figura 9, y en el listado de secuencias (PCV2-Ha09: SEC ID NOS: 7, 8, 9 y 10; PCV2-HalO: SEC ID NOS: 11, 12, 13 y 14).

INMUNOHISTOQUIMICA Se realizó inmunohistoquímica (IHC) sobre secciones de tejido de médula ósea, bazo y nodulos linfáticos de 2 casos (Nos. 1 y 3) para detectar el antígeno PCV2. Unicamente las células de médula ósea solas del caso No. 1 mostraron inmunorreactividad ligera (figura 5) . Todos los tejidos del caso No. 3 y los tejidos linfáticos del caso No. 1 fueron negativos para antígeno PCV2.

DETECCION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA PCV2 EN GANADO La detección de PCV2 por reacción en cadena de polimerasa (PCR) en terneros afectados por pancitopenia neonatal bovina (BNP) hizo surgir la cuestión de su papel en la patogénesis de BNP. Si PCV2 es un elemento principal en la patogénesis de BNP, se debería poder detectar respuestas de anticuerpo específicas para PCV2 en manadas afectadas. Se intentó detectar anticuerpos específicos para PCV2 en ganado mediante un enfoque competitivo: placas de ELISA recubiertas con antígenos PCV2-ORF2 se incubaron con diluciones (1/2, 1/20, 1/200, 1/2000, 1/20000) en PBS durante 90 minutos a 37 °C en una cámara humidificada . Las placas de prueba se enjuagaron tres veces con PBS. Un anticuerpo monoclonal (mab) antiPCV2 conjugado a peroxidasa de rábano se diluyó 1/500 en PBS y se agregó a la placa de prueba. Se incubó otros 90 minutos a 37 °C en una cámara humidificada . Después de enjuagar la placa de prueba con PBS se agregó sustrato (TMB/H202) . Se detuvo el desarrollo de color por adición de H2S04 y se midieron las densidades ópticas (OD) a 450 nm. Como referencias los controles positivos de dos equipos de prueba comercializados se incluyeron (Synbiotics, Ingenasa) . Los pozos sin suero (PBS) sirvieron como referencia negativa. Dos sueros de lechones PCV2-negativos, cinco sueros de lechones PCV2 positivos y tres sueros bovinos de terneras afectadas por BNP se incluyeron. Los resultados se resumen en la Figura 10. Desde una dilución 1/20 en adelante, los sueros porcinos y PCV2-negativos y -positivos se diferenciaron claramente. Tres sueros bovinos de una ternera afectada por BNP inhibió la unión de mab específico para PCV2 de una manera dependiente de la dosis. Aunque no se observó inhibición completa respecto a los sueros porcinos, la inhibición excede a la de las referencias positivas (por ejemplo Ingenasa PC OD = 0.343). Estos datos son altamente sugerentes de una respuesta inmunitaria especifica para PCV2 en ganado.

DISCUSION Aquí se describe una diátesis hemorrágica (HD, también denominada como síndrome de enfermedad hemorrágica (HDS) y pancitopenia neonatal bovina (BNP) ) de terneros, los cuales se pueden diferenciar de otras hemorragias por los siguientes criterios clínicos, patológicos e histológicos: Los signos clínicos más prominentes sin hemorragias transcutáneas espontáneas sin daño evidente, hemorragias en superficies de mucosas y hemorragia excesiva asociada con procedimientos de manejo estándar. De modo consistente, la enfermedad hemorrágica se volvió evidente en terneros jóvenes dentro del primer mes de vida. Se encontró hipoplasia a aplasia grave de médula ósea en todos los casos. Los resultados hematológicos que indican pancitopenia aplásica en cinco de estos animales fundamenta este hallazgo. La trombocitopenia resultante que provoca la enfermedad hemorrágica se considera que representa el mecanismo patológico principal de la enfermedad. Además los resultados hematológicos mostraron leucopenia y granulocitopenia moderada a grave. Este hallazgo concuerda con la supresión grave de médula ósea observada en todos los animales y supresión de los tejidos linfáticos en 43% de los animales. La carencia de células linfáticas proliferantes -se supone que provoca inmunosupresión . Esto puede explicar la presentación frecuente de lesiones tales como neumonía y estomatitis ulcerativa así como la carencia de células inflamatorias en algunas de estas lesiones.

Después de la destrucción de médula ósea, el inicio de los signos clínicos depende en gran medida de la semivida de las células sanguíneas en la circulación, especialmente de plaquetas. La anemia es menos significativa, a menos que se complique con hemorragia debido a la prolongada duración de vida de los eritrocitos bovinos de 120 días (Loesch, et al., 2000, Valli, 2007). La duración de vida de las plaquetas es de solo 9 días y con solo 8-9 h de vida media de neutrófilos en el cálculo, es incluso más corta (Paape, et al., 2003, Valli, 2007). Tomando en consideración estos hechos, establecemos la hipótesis de que el daño destructivo puede presentarse en el ternero neonatal.

Para determinar la etiología de HD, se investigaron varias causas de hemorragias en ganado debido a trombocitopenia . La diátesis hemorrágica hereditaria se describe en ganado Simmental y se conoce como trombopatía hereditaria Simmental. Es causada por una disfunción marcada de plaquetas (Steficek, et al., 1993). En este caso, el ganado Simmental es afectado en la mayor parte de los casos pero dos terneras Holstein Friesian mostraron lesiones equivalentes. En Alemania austral, el ganado Simmental es la crianza más común y por lo tanto puede estar sobrerepresentada en este estudio. El cuadro clínico distinto de la enfermedad en las diferentes razas y los resultados del análisis de antecesores no indica enfermedad hereditaria dominante o recesiva autosómica. No obstante, el número de animales en el estudio no es suficiente para realizar una afirmación definitiva hasta ahora.

La infección con BVDV tipo 2 no citopatico puede resultar en una tendencia grave a hemorragia debido a trombocitopenia (Ellis, et al., 1998, Rebhun, et al., 1989) . El pensamiento actual es que una disminución en el acumulado de maduración de médula ósea, los números disminuidos de plaquetas circulantes y una función plaquetaria alterada contribuyen a las hemorragias (Ellis, et al., 1998, Walz, et al., 2001, ood, et al., 2004). No obstante, la celularidad de médula ósea no disminuye en infecciones por BVDV. En contraste, una supresión de médula ósea grave es un hallazgo constante en los casos reportados en este estudio. Además, no se detectó BDVD en cualquiera de los terneros bajo investigación. Tomando en consideración lo anterior, parece razonable excluir una infección por BDVD.

Se conocen varias toxinas y micotoxinas que provocan hemorragias en ganado. Los antecedentes médicos de los terneros enfermos y la información acerca de su mantenimiento animal proporciona cierta indicación para posible intoxicación en casos individuales, por ejemplo con micotoxinas o medicamentos. No obstante, no hay consistencia en la información proporcionada que pudiera aplicarse a todas las granjas afectadas y no hay motivos para sospechar de una toxina especifica. No obstante, se llevaron a cabo algunas pruebas aleatorias para toxinas y tuvieron resultados negativos. Particularmente, las intoxicaciones con S- (1, 2-diclorovinil) -L-cisteina (DCVC) o furazolidona, ambas causantes de aplasia de médula ósea y hemorragias, coinciden con las lesiones observadas. Una alimentación de aceite de frijol de soya extraído con tricloroetileno suministrado como alimento a terneros produce anemia aplásica mortal y daño renal a dosis más elevadas. DCVC, un metabolito de tricloroetileno es el factor tóxico en esta entidad. Experimentalmente, dosis bajas de DCVC (0.4 mg/kg al día, i.v.) administrado durante 10 días resulta en una acelularidad notable de médula ósea y hemorragias extensas (Lock, et al., 1996). Actualmente, el hexano en vez del tricloroetileno se utiliza para extracción de aceite de soya. Las pruebas de sangre, tejido renal y orina de un total de cuatro terneros para determinar tricloroetileno, DCVC y su metabolito, N-acetil-DCVC proporcionaron resultados negativos. El antibiótico furazolidona se utiliza para tratamiento o profilaxis de infecciones bacterianas o por protozoarios en humanos y animales. Experimentalmente, las dosificaciones diarias de 4.0 a 8.0 mg de furazolidona por kg de peso corporal administrado a terneros alimentados con leche produce diátesis hemorragia mortal debido a supresión grave de médula ósea (Hoffman-Fezer, et al., 1974, Hoffman, et al., 1974) . De acuerdo con la regulación del consejo nacional, está prohibida la administración de furazolidona a animales que producen alimento. De cualquier manera, tres terneros afectados fueron investigados y se demostró que eran negativos con respecto a furazolidona.

La ingestión de bracken fern (Pteridum aquilinum) provoca síntomas de envenenamiento en animales que pastan. El envenenamiento agudo por bracken fern en ganado produce hipoplasia irreversible en médula ósea lo que resulta en pancitopenia aplásica. La ingestión crónica lleva a hematuria enzoótica y se asocia con tumores en el tracto urinario inferior y en el tracto alimenticio (Maxie and Newman, 2007, Valli, 2007). También, las intoxicaciones con micotoxinas de Stachybotrys chartarum se describen en rumiantes y caballos como una enfermedad pancitopénica (Harrach, et al., 1983, Valli, 2007). El envenenamiento con bracken fern y la estaquibotriotoxicosis parecen ser poco probables en estos casos debido a que los síntomas deben surgir en animales de todas las edades y especialmente en aquellos alimentados con una dieta que contiene forraje. En este estudio, las muestras de forraje resultaron ser negativas para micotoxinas y no hay indicación para la captación de bracken fern por terneros o vacas.

El púrpura trombocitopénico idiopático se describe como una condición rara en vacas (Yeruham, et al., 2003) . La causa de esta enfermedad autoinmune puede ser destrucción de plaquetas mediada por el sistema inmunitario (Lunn and Butler, 1991) . Los casos reportados de púrpura trombocitopénica se asocian con una vacunación multivalente reciente de toxoide del botulismo o vacunas inactivadas contra el virus de papiloma y clostridia, respectivamente (Lunn and Butler, 1991, Yeruham, et al., 2003). Los terneros en este estudio no fueron vacunados. Además, la presentación de destrucción de médula ósea no concuerda con la trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario descrita en vacas. Las infecciones con P. multocida tipos B o E se sabe que provocan septicemia hemorrágica en terneros (Rimler, 1978). Las endotoxinas juegan un papel principal en. la patogénesis de esta infección (Horadagoda et al., 2001) . En este estudio, esta presenté P. multocida en solo tres terneros. No se llevó a cabo una tipificación. En nuestro estudio, la investigación microbiológica de las muestras de órganos mostró un espectro amplio de bacterias 5 potencialmente patogénicas en terneros enfermos. No obstante, las pruebas constantes de una bacteria patogénica especifica asociada con enfermedad hemorrágica no se pudieron encontrar. En 29% (n = 16) de todos los casos no se detectaron bacterias patogénicas. En 17 terneros las "LQ bacterias aisladas se asocian con lesiones inflamatorias adicionales tales como neumonía o enteritis. Se puede establecer la suposición de que la supresión del tejido linfático y médula ósea en estos terneros resulta en leucopenia y granulocitopenia graves asociada con 5 inmunosupresión e infección secundaria.

Utilizando PCR, se detectó un circovirus en algunos de los terneros enfermos clínicamente. La infección por circovirus en ganado no se ha descrito convincentemente hasta ahora. Las investigaciones serológicas sobre 20 anticuerpos específicos para circovirus han generado resultados poco concluyentes (Alian, et al., 2000, Ellis, et al., 2001, Tischer, et al., 1995). Solo una publicación ha demostrado que un circovirus relacionado estrechamente con PCV2 puede detectarse en tejidos de pulmón y fetos de 5 ganado (Nayar, et al., 1999). La interpretación de resultados de PCR algunas veces es difícil, especialmente con respecto a la contaminación de ADN. No obstante, en nuestro estudio, implementamos un estricto régimen para excluir contaminación por ADN en el laboratorio. La amplificación exitosa de la totalidad del genoma de PCV2 a partir de una muestra arguye contra contaminación con productos de PCR cortos. El resultado negativo del protocolo de PCR específico para PCV2 rutinariamente se puede explicar por una menor sensibilidad de este protocolo en comparación con el protocolo incrustado del PCR de espectro amplio.

El análisis de la secuencia de genoma completo del circovirus PCV2-Ha08 mostró una relación estrecha con PCV2b. La única secuencia de circovirus que se origina de tejido bovino (Nayar et al., 1999) y disponible en la base de datos GenBank también se encuentra relacionada estrechamente con PCV2. No obstante, el análisis detallado muestra que ambas cepas se agrupan en subtipos diferentes y por lo tanto se excluye la existencia de una cepa PCV2 distinta la cual sea capaz de infectar ganado. Mientras tanto, se han aislado dos cepas, PCV2-Ha09 y PCV2-HalO. Los circovirus generalmente se considera que tienen intervalos de huéspedes estrechos y en análisis filogenético detallado mostró una evolución conjunta estricta de circovirus con sus huéspedes (Johne, et al., 2006). Para PCV2, no obstante, se ha descrito un patrón evolutivo y epidemiológico ligeramente diferente, el cual concuerda con un periodo prolongado de transmisión limitada en el pasado seguido por una dispersión mundial reciente de este virus (Hughes and Piontkivska, 2008). Se puede especular que PCV2 ha tenido acceso a propiedades especificas que permiten una dispersión rápida y - en casos raros - transmisión a través de la barrera entre especies.

Además, se ha detectado PCV2 en uno de los terneros del grupo control. Los animales control han sido enviados para examen patológico por razones diferentes a la enfermedad hemorrágica. Se asocia a PCV2 con diferentes síndromes y enfermedades en cerdos. De acuerdo con esto, se puede especular que los circovirus contribuyen a varias enfermedades en terneros. También es concebible que la inmunosupresión en terneros con HD incrementa la susceptibilidad a otras infecciones. En este caso, la detección de PCV2 en terneros puede reflejar una infección oportunística . Finalmente, es bien sabido que las infecciones por circovirus pueden permanecer clínicamente no aparentes durante varios períodos de tiempo o incluso durante toda la duración de vida de un individuo infectado.

Una infección con un circovirus puede ser consistente con muchos de los signos clínicos observados dado que la mayor parte de los circovirus provocan supresión de linfocitos y el CIAV relacionado también provoca anemia aplásica y hemorragias en pollos infectados. No obstante, en nuestro estudio, no se detectó PCV2 en todos los casos clínicos utilizando los métodos de diagnóstico disponibles. Además, la detección por PCR no necesariamente significa infección con un virus replicante. La detección del antígeno PCV2 por inmunohistoquímica en algunas células de médula ósea individuales, no obstante, es indicativo de expresión y replicacion de genoma viral.

TABLAS TABLA 1 : Características de animales del caso y grupos control que incluyen detección de secuencias genómicas circovirales por PCR y diagnóstico final Grupo Número Edad Sexo Raza Peso Circovirus Diagnóstico (d) (kg) caso 1 17 M SC 56 negativo HDS caso 2 18 M SC 55 positivo HDS (b) caso 3 SC 52 no HDS determinado caso 4 positivo HDS (b, bm, 1, k) caso 5 20 F SC 42 positivo HDS (b) caso 6 15 F SC 45 negativo HDS caso 7 0 F NN 55 positivo HDS (bm) caso 8 28 M HF 48 negativo HDS caso 9 20 M HF 44 negativo HDS caso 10 19 M SC 50 negativo HDS caso 11 17 F SC 47 negativo HDS caso 12 16 F SC 55 negativo HDS caso 13 0 NN NN 60 negativo HDS caso 14 0 NN NN 52 no HDS determinado caso 15 25 F SC 41 negativo HDS caso 16 16 M SC 60 negativo HDS caso 17 17 M NN 60 positivo HDS (bm) caso 18 15 F SC 50 negativo HDS caso 19 18 F SC 52 negativo HDS caso 20 11 F SC 52 negativo HDS caso 21 17 F SC 58 negativo HDS caso 22 7 SC 46 negativo HDS caso 23 18 F SC 52 no HDS determinado •caso 24 10 M SC 58 no HDS determinado caso 25 20 F SC 51 no HDS determinado caso 26 20 M SC 61 no HDS determinado caso 27 19 F SC 42 no HDS determinado caso 28 16 M SC 51 no HDS determinado caso 29 11 M SC 50 no HDS determinado caso 30 14 M SC 62 no HDS determinado caso 31 23 M SC 63 no HDS determinado caso 32 0 M SC 46 no HDS determinado caso 33 0 M SC 72 no HDS determinado caso 34 32 M SC 57 no HDS determinado caso 35 16 F SC 58 no HDS determinado caso 36 19 F SC 66 no HDS determinado caso 37 10 F SC 53 no HDS determinado caso 38 14 M SC 51.5 no HDS determinado caso 39 16 M SC 40 no HDS determinado caso 40 18 M SC 56 no HDS determinado caso 41 14 F SC 48 no HDS determinado caso 42 25 SC 60 no HDS determinado caso 43 20 M SC 45 no HDS determinado caso 44 16 M SC 46 no HDS determinado caso 45 14 F SC 34 no HDS determinado caso 46 21 F SC 70 no HDS determinado caso 47 13 M SC 58 no HDS determinado caso 48 13 M SC 57 no HDS determinado caso 49 15 F SC €0 no HDS determinado caso 50 7 F SC 49 no HDS determinado caso 51 19 M SC 57 no HDS determinado caso 52 21 M SC 56.5 no HDS determinado caso 53 19 w SC 43 no HDS determinado caso 54 11 w mezcla 43 no HDS determinado caso 55 15 w SC 50 no HDS determinado caso 56 8 w SC 50 no HDS determinado control 1 0 F SC 42 negativo aborto control 2 n.n. F SC 46 negativo gastroenteri tis control 3 18 F SC 42 negativo poliartritis control 4 n.n. F 'SC 38 negativo enteritis control 5 9 F SC 46 negativo enteritis, deshidratad on, neumonía control 6 n.n. F SC 30 negativo enteritis, deshidrataci ón control 7 8 M SC 49 positivo abomasoenter itis, deshidrataci ón control 8 18 F SC 34 negativo enteritis, deshidrataci ón, bronquitis HDS: Síndrome de enfermedad hemorrágica; M: masculino; F: femenino; SC: ganado Simmental, neg: negativo; pos: positivo; n.n.: no mencionado: b: sangre; bm: médula ósea; 1: hígado; k: riñon.

TABLA 2 : Resultados Hematológicos de Cinco Terneros con Enfermedad Hemorrágica y Aplasia de Médula Ósea intervalo unidad No. No. No. No. No, de 2 53 54 55 56 referencia hemoglobina 5.6-8.7 mmol/1 4. 9- 1. 2 5. 3 2. 65 4. 5 hematocrito 0.22-0.44 1/1 0. 23 0. 06 0. 27 0. 313 0. 22 eritrocitos 5.0-9.7 T/l 6. 1 1. 32 6. 3 2. 94 5. 6 cuenta 4.0-12.0 G/l 0. 85 1. 47 0. 285 0. 9 1. 0 leucocitica MCV 36--50 fl 37. ,3 42. .1 43. .9 43. .2 39. ,5 MCH 13--17 pg 12. , 9 14. , 6 13. .7 14. .5 13. .0 MCHC 32--39 mmol/1 21. , 5 21. .5 19. .4 20, .9 20. ,4 granulocitos 24--45 % 1 4 28 3 4 neutrofilos granulocitos 0-14 eosinófilos granulocitos 0-1 basofilos monocitos 1-8 1 2 4 11 7 linfocitos 45-65 96 94 68 84 89 cuenta 300-800 G/l 33.7 12.5 82 60 55 plaquetaria TABLA 3 : Comparación de Similitudes de Secuencia entre PCV2-Ha08 y otros Circovirus PCV2- PCV2- PCV2- PCV2- PCV2- PCV2- Ha08/PCVl Ha08/PCV2a Ha08/PCV2b Ha08/PCV2c Ha08/BCV Ha08/PCV12 D 558 control Genoma1 78% 96.3% 98.9% 94.7% 96.1% 99% Rep2 86.5% 99.4% 99.4% 99.4% 99.4% 99.7% Cap2 68.5% 94% 97% 87.2% 91.9% 97.4% ORF-32 96.2% 99% 97.1% 96.2% 100% NCR11 84.8% 98.8% 100% 98.8% 98.8% 100% NCR21 78.9% 97.4% 97.3% 97.1% 97.4% 97.3% Los números de acceso de las secuencias utilizadas son los mismos que en la figura 6. 1 Secuencia nucleotidica 2 Secuencia de aminoácidos REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Alian G, McNeilly F, rakowa S, Ellis J (2003) : PCV-2 infection in swine; more than just postweaning multisystemic wasting syndrome. Vet J 166: 222.

Alian GM, McNeilly F, McNair I, Curran MD, Walker I, Ellis J, onoby C, Kennedy S, Meehan B (2000) : Absence of evidence for porcine circovirus type 2 in cattle and humans, and lack of seroconversion or lesions in experimentally infectad sheep. Arch Virol 145: 853.

Chae C (2005) : A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases. Vet J 169: 326.

Cox, J.C. y Coulter, A.R. (1992): "Advances in Adjuvant Technology and Application", in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Capitulo 4, Ed. Yong, W.K., CRC Press.

Dalsgaard, K. (1974) : Saponin adjuvants. 3. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Molina with adjuvant activity in food-and-mouth disease vaccines. Arch Gesamte Virusforsch 44: 243.

Ellis J, Krakowka S, Lairmore M, Haines D, Bratanich A, Clark E, Alian G, Konoby C, Hassard L, Meehan B, Martin K, Harding J, Kennedy S, McNeilly F <1999) : Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J Vet Diagn Invest 11: 3.

Ellis JAr Konoby C, West KH, Alian GM, Krakowka S, McNeilly F, Meehan B, Walker I (2001) : Lack of antibodies to porcine circovirus type 2 virus in beef and dairy cattle and horses in western Canadá. Can Vet J 42: 461.

Ellis JA, West KH, Cortase VS, Myers SL, Carman S, Martin KM, Haines DM (1998) : Lesions and distribution of viral antigen following an experimental infection of young seronegative calvas with virulent bovina virus diarrhea virus-type II. Can J Vet Res 62: 161.

Goryo M, Suwa T, Umemura T, Itakura C, Yamashiro S (1989) : Histopathology of chicks inoculated with chicken anaemia agent (MSB1-TK5803 strain). Avian Pathol 18: 73.

Gottschalk C, Bauer J, Meyer K (2008) : Detection of satratoxin g and h in indoor air from a water-damaged building. Mycopathologia 166: 103.

Halami MY, Nieper H, Muller H, Johne R (2008) : Detection of a novel circovirus in mute swans (Cygnus olor) by using nested broad-spectrum PCR. Virus Res 132: 208.

Harrach B, Bata A, Bajmocy E, Benko M (1983) : Isolation of satratoxins from the bedding straw of a sheep flock with, fatal stachybotryotoxicosis . Appl Environ Microbiol 45: 1419. 5 Hoffmann-Fezer G, Hoffmann R, Hofmann W (1974): [Chronic furazolidone poisoning in calves. II. studies of the bone marrow] . Dtsch Tierarztl ochenschr 81: 59.

Hofmann W, Hoffmann R, Hoffmann-Fezer G (1974): [Chronic furazolidone poisoning in calves. I. Clinical, -Lo hematological and morphological studies] . Dtsch Tierarztl Wochenschr 81: 53. Horadagoda NU, Hodgson JC, Moon GM, Wijewardana TG, Eckersall PO (2001) : Role of endotoxin in the pathogenesis of haemorrhagic septicaemia in the buffalo. Microb Pathog 30: 171. 15 Hughes AL, Piontkivska H (2008) : Nucleotide sequence polymorphism in circoviruses . Infect Genet Evol 8: 130.

Johne R, Fernandez-de-Luco D, Hofle U, Muller H (2006) : Genome of a novel circovirus of starlings, 20 amplified by multiply primed rolling-circle amplification .

J Gen Virol 87: 1189.

Kennedy S, offett D, McNeilly F, eehan S, Ellis J, Krakowka S, Alian GM (2000) : Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of 25 conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus. J Comp Pathol 122: 9.

Kuscu S, Gurel A (2008) : Lesions in the thymus and bone marrow in chicks with experimentally induced chicken infectious anemia disease. J Vet Sci 9: 15.

Liu J, Chen 1, wang J (2005) : Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis. J Virol 79: 8262.

Lock EA, Sani Y, Moore RB, Finkelstein MB, Anders W, Seawright AA (1996) : Bone raarrow and renal injury associated with haloalkene cysteine conjugates in calves. Arch Toxicol 70: 607.

Loesch Up Cihak J, Erhard MH, Kaspers B (2000) : Blut und Abwehr. In: von Engelhardt , Breves G (eds) Physiologie der Haustiere. Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart, Alemania p 196.

Lunn DP, Sutler DG (1991) : Idiopathic thrombocytopenic purpura in a Holstein bull. Can Vet J 32: 559.

Mankertz A (2008): Circoviruses . In: Mahy BWJ, Van Regenmortel MHV (eds) Encyclopedia of Virology, vol 1. Elsevier Books, Amsterdam p 513.

Maxie MG, Newman SJ (2007) : Urinary system. In: Maxie MG (ed) Jubb, Kennedy, and Palmer 's Pathology of domestic animáis, vol 2. Elsevier, Amsterdam p 425.

Nayar GP, Hamel AL, Lin L, Sachvie C, Grudeski E, Spearman G (1999) : Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses. Can Vet J 40: 277.

Paape MJ, Bannerman DD, Zhao X, Lee JW (2003) : The bovine neutrophil: Structure and function in blood and milk. Vet Res 34: 597.

Rebhun WC, French TW, Perdrizet JA, Dubovi EJ, Dill SG, Karcher LF (1989) : Thrombocytopenia associated with acute bovine virus diarrhea infection in cattle. J Vet Intern Med 3: 42.

Reubel GH, Gareis M, Amselgruber WM (1987) : Cytotoxicity evaluation of mycotoxins by an MTT-bioassay . Mycotoxin Res 3: 85.

Rhoades KR, Heddleston KL, Rebers PA (1967) : Experimental hemorrhagic septicemia: gross and microscopic lesions resulting from acute infections and from endotoxin administration. Can J Comp Med Vet Sci 31: 226.

Rimler RB (1978) : Coagglutination test for identification of Pasteurella multocida associated with hemorrhagic septicemia. J Clin Microbiol 8: 214.

Segales J, Alian GM, Domingo M (2005) : Porcine circovirus diseases. Anim Health Res Rev 6: 119.

Segales J, Mateu E (2006) : Immunosuppression as a feature of postweaning multisystemic wasting syndrome. Vet J 171: 396.

Segales J, Olvera A, Grau-Roma L, Charreyre C, Nauwynck H, Larsen L, Dupont K, McCullough K, Ellis J, Krakowka S, Mankertz A, Fredholm M, Fossum C, Timmusk S, Stockhofe-Zurwieden N, Beattie V, Armstrong D, Grassland B, Baekbo P, Alian G {2008) : PCV-2 genotype definition and nomenclature . Vet Rec 162: 867.

Steficek BA, Thomas JS, Baker JC, Bell TG (1993): Hemorrhagic diathesis associated with a hereditary platelet disorder in Simmental cattle. J Vet Diagn Invest 5: 202.

Steinfeldt T, Finsterbusch T, Mankertz A (2001) : Rep and Rep' protein of porcine circovirus type 1 bind to the origin of replication in vitro Virology 291: 152.

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994): CLUSTAL : improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673.

Timmusk S, allgren P, Brunborg IM, ikstrom FH, Alian G, Meehan B, McMenamy M, McNeilly F, Fuxler L, Belak K, Podersoo D, Saar T, Berg M, Fossum C (2008): Phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) pre- and postepizootic postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) . Virus Genes 36: 509.

Tischer I, Bode L, Apodaca J, Timm H, Peters D, Rasch R, Pociuli S, Gerike E (1995) : Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mica, and cattle. Aren Virol 140: 1427.

Todd D (2000): Circoviruses : immunosuppressive threats to avian species: a review. Avian Pathol29: 373.

Todd D, Bendinelli M, Biagini P, Hiño S, Mankertz A, Mishiro S, Niel C, Okamoto H, Raidal S, Ritchie BW, Teo GC (2005) : Circoviridae . In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (eds) Virus Taxonomy, Vlllth Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses. Elsevier/Academic Press, Amsterdam p 327.

Toussaint JF, Sailleau C, Breard E, Zientara S, De Clercq K (2007) : Bluetongue virus detection by two real-time RT -qPCRs targeting two different genomic segments. J Virol Methods 140: 115.

Valli VEO (2007) : Hematopoietic system. In: Maxie MG (ed) Jubb, Kennedy, and Palmer' s Pathology of domestic animáis, vol 3. Elsevier, Amsterdam p 107. alz PH, Bell TG, Grooms DL, Kaiser L, Maes RK, Baker JC (2001): Platelet aggregation responses and virus isolation from platelets in calves experimentally infectad with type I or type II bovina viral diarrhea virus. Can J Vet Res 65: 241.

Wood RD, Goens SD, Carman PS, Deregt D, Jefferson B, Jacobs RM (2004): Effect on hematopoietic tissue of experimental infection of calves with noncytopathic type 2 bovina viral diarrhea virus. Can J Vet Res 68: 42.

Yeruham I, Avidar Y, Harrus S, Fishman L, Aroch I (2003) : Immune-mediated thrombocytopenia and putativa haemolytic anaemia associated with a polyvalent botulism vaccination in a cow. Vet Rec 153: 502.

Yuasa N, Taniguchi T, Yoshida I (1979) : Isolation and soma characteristics of an agent inducing anemia in chicks. Avian Dis 23: 366.

Claims (49)

REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico de circovirus CV) que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma, y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

2. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 1, que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 7 o un fragmento de la misma; y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

3. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 1, que comprende: (a) la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 11 o un fragmento de la misma; y/o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) .

4. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fragmento comprende por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30 o por lo menos 50 nucleótidos contiguos, como se muestra en las SEC ID NOS: 1, 7 u 11 o el complemento de las mismas.

5. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, (a) que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de la secuencia nucleotidica como se muestra en las SEC ID NOS: 1, 7 u 11; (b) hibridizar bajo condiciones rigurosas con la secuencia nucleotidica como se muestra en las SEC ID NOS: 1, 7 u 11, o (c) el complemento de (a) o (b) .

6. Molécula de ácido nucleico de CV, que codifica para un polipéptido de CV o un fragmento del mismo, en donde la molécula de ácido nucleico comprende: (a) una región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 1 de (i) nucleótidos 51-995 (Rep) ; (ii) nucleótidos 1034-1735 (Cap) ; (iii) nucleótidos 357-671 (ORF3) y/o el complemento de (i) , (ii) y/o (iii) ; (b) una secuencia nucleotidica que corresponde a la secuencia de (a) dentro del alcance de degeneración del código genético, o (c) un fragmento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) o (b) .

7. Acido nucleico de CV como se describe en la reivindicación 6, en donde la molécula de ácido nucleico comprende: (a) la región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 7 de: (i) los nucleótidos 51-995 (Rep) ; (ii) los nucleótidos 1034-1735 (Cap); (iii) los nucleótidos 357-671 (ORF3) ; y/o el complemento (i), (ii) y/o (iii) ; (b) una región de la secuencia nucleotidica como se muestra en la SEC ID NO: 11 de: (i) los nucleótidos 51-995 (Rep) ; (ii) los nucleótidos 1033-1734 (Cap); (iii) los nucleótidos 357-671 (ORF3) y/o el complemento de (i), (ii) y/o (iii) ; (c) una secuencia nucleotidica que corresponde a la secuencia de (a) o (b) dentro del alcance de degeneración del código genético, o (d) un fragmento de la secuencia nucleotidica de acuerdo con (a) , (b) o (c) .

8. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el polipéptido o fragmento del mismo comprende por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 20 o por lo menos 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2-4, 8-10 ó 12-14.

9. Acido nucleico de CV como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, el cual codifica para un polipéptido que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2-4, 8-10 ó 12-14.

10. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en un enlace operativo con una secuencia de control de expresión heteróloga .

11. Célula hospedadora no humana transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso como un agente de diagnóstico.

13. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 12, la cual transporta un grupo indicador .

14. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 12 ó 13, para el diagnóstico de diátesis hemorrágica (HD) .

15. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 14, para el diagnóstico de HD en ganado .

16. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un agente terapéutico.

17. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 16, para la prevención y/o tratamiento de HD.

18. Molécula de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 16 ó 17, para la prevención y/o tratamiento de HD en ganado.

19. Molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 y una vacuna basada en ácido nucleico o para la producción de una vacuna basada en un polipéptido.

20. Polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

21. Polipéptido de circovirus (CV) que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: (i) los aminoácido de la SEC ID NO: 2 (Rep) ; (ii) los aminoácido de la SEC ID NO: 3 (Cap) ; (iii) los aminoácido de la SEC ID NO: 4 (0RF3) , o (b) un fragmento del mismo.

22. Polipéptido de circovirus (CV) como se describe en la reivindicación 21, que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos que se selecciona de (i) los aminoácidos de la SEC ID NO: 8 y 12 (Rep); (ii) los aminoácidos de la SEC ID NO: 9 y 13 (Cap) ; (iii) los aminoácidos de la SEC ID NO: 10 y 14 (ORF3) , o (b) un fragmento del mismo.

23. Polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 20 o por lo menos 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2-4, 8-10 o 12-14.

24. Polipéptido como se describe en las reivindicaciones 20 a 23, que tiene una identidad de por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 96%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID NOS: 2-4, 8-10 ó 12-14.

25. Polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 para uso como un agente de diagnóstico .

26. Polipéptido como se describe en la reivindicación 25, el cual transporta un grupo indicador.

27. Polipéptido como se describe en la reivindicación 25 ó 26 para el diagnóstico de HD, particularmente en ganado.

28. Polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, para uso como inmunógeno.

29. Polipéptido como se describe en la reivindicación 28, para la generación de anticuerpos anti-CV.

30. Polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 para la prevención y tratamiento de HD, particularmente en ganado.

31. Polipéptido como se describe en la reivindicación 30, para uso como una vacuna.

32. Anticuerpo o fragmento del mismo que une antigeno dirigido contra un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24.

33. Anticuerpo como se describe en la reivindicación 32, el cual es especifico para CV cepa PCV2-Ha08.

3 . Anticuerpo como se describe en la reivindicación 32 ó 33, para uso como un agente de diagnóstico.

35. Anticuerpo como se describe en la reivindicación 32 ó 33, para la prevención y/o tratamiento de HD, particularmente en ganado.

36. Circovirus, que comprende una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

37. Virus como se describe en la reivindicación 36, el cual es un circovirus inactivado.

38. Virus como se describe en la reivindicación 37, el cual es un circovirus atenuado.

39. Composición que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, un anticuerpo de la reivindicación 32 ó 33 o un virus de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38 junto con un portador, diluyente y/o adyuvante aceptable.

40. Composición como se describe en la reivindicación 39, la cual es una vacuna.

41. Composición como se describe en la reivindicación 40, la cual es una vacuna basada en polipéptido.

42. Composición como se describe en la reivindicación 40, la cual es una vacuna basada en virus.

43. Composición como se describe en la reivindicación 39, la cual es una composición inmunogénica .

44. Composición como se describe en la reivindicación 43, la cual es una composición inmunogénica basada en polipéptido.

45. Composición como se describe en la reivindicación 43, la cual es una composición inmunogénica basada en virus.

46. Composición de cualquiera de las reivindicaciones 39 a 45 para uso diagnóstico.

47. Composición de cualquiera de las reivindicaciones 39 a 45 para uso terapéutico.

48. Método para diagnosticar HD, particularmente en ganado, que comprende: poner en contacto una muestra de un sujeto que va a ser diagnosticado con una composición de diagnóstico de la reivindicación 46 y determinar la presencia y/o cantidad de CV o anticuerpos anti-CV en la muestra .

49. Método para evitar o tratar HD, particularmente en ganado, que comprende: administrar a un sujeto en necesidad del mismo la composición terapéutica de la reivindicación 47 en una cantidad eficaz.