TW202332684A - 具有b/c結構域交換的重組經典豬瘟病毒e2蛋白 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及動物保健領域。具體地,本發明涉及重組經典豬瘟病毒E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段。進一步地,本發明提供了包含本發明的重組E2蛋白的免疫原性組合物,以及該免疫原性組合物用於預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的用途。此外,本發明提供了用於區分感染CSFV的動物與用本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法和試劑盒。
Description
本發明涉及動物保健領域。具體地,本發明涉及重組經典豬瘟病毒(CSFV)E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段。進一步地,本發明提供了包含本發明的重組E2蛋白的免疫原性組合物,以及該免疫原性組合物用於預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的用途。進一步地,本發明提供了重組CSFV,優選減毒形式的重組CSFV,其包含本發明的重組E2蛋白。此外,本發明提供了用於區分感染CSFV的動物與用本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法和試劑盒。
經典豬瘟(CSF)是豬和野豬的一種高度接觸傳染病,其造成重大的經濟損失。該疾病的致病因子是經典豬瘟病毒(CSFV)。在中國,實施了預防性疫苗接種和撲滅策略的組合來控制CSF暴發。然而,在中國的大部分地區仍報導了散發性CSF暴發和持續性感染。
本領域仍需要一種新的CSFV疫苗,其是安全有效的,並且通過其免疫接種的動物可以與被野生型野毒株感染的動物區分開。
在一個方面,本發明提供了重組CSFV(經典豬瘟病毒)E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段。
在一個方面,本發明提供了重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列,所述胺基酸序列中包含界定6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。
在一個方面,本發明提供了重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列,所述胺基酸序列中CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,所述重組CSFV E2蛋白進一步連接到免疫球蛋白Fc片段,其中所述重組CSFV E2蛋白中CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。
在一個方面,所述重組CSFV E2蛋白(包括連接到免疫球蛋白Fc片段的重組CSFV E2蛋白)包含如說明書中進一步界定的、在CSFV E2蛋白的胺基酸位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的進一步突變,其中所述重組CSFV E2蛋白中CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。在一個方面,本發明提供了編碼本發明的重組CSFV E2蛋白的重組核酸。
在一個方面,本發明提供了包含本發明的核酸的載體。
在一個方面,本發明提供了包含本發明的核酸或本發明的載體的宿主細胞。
在一個方面,本發明提供了用於生產本發明的重組CSFV E2蛋白的方法,其包括(i)在適合於表現CSFV E2蛋白的條件下,培養本發明的宿主細胞,並且(ii)分離並視情況地純化CSFV E2蛋白。
在一個方面,本發明提供了包含本發明的重組CSFV E2蛋白的重組CSFV(經典豬瘟病毒)。
在一個方面,本發明提供了免疫原性組合物,其包含本發明的重組CSFV E2蛋白、本發明的重組核酸、本發明的載體和/或本發明的重組CSFV。
在一個方面,本發明提供了預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法,該方法包括將本發明的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。
在一個方面,本發明提供了區分感染CSFV的動物與用本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法,其包括a)獲得樣品,並且b)在免疫測試中測試所述樣品。
在一個方面,本發明提供了用於區分感染CSFV的動物與用本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的試劑盒,其包含特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體或其抗原結合片段。
在一個方面,本發明提供了用於在CHO細胞中生產如本文所述的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括a)使CHO細胞適應培養基中的高密度懸浮培養;b)用包含編碼本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的適應的CHO細胞,c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;並且d)收穫並視情況地純化重組CSFV E2蛋白。
在一個方面,本發明提供了用於在CHO細胞中生產如本文所述的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括a)使CHO細胞在培養基中生長;b)用包含編碼本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的CHO細胞,c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;並且d)收穫並視情況地純化重組CSFV E2蛋白。
在描述本發明的各方面之前,必須注意,如本文和所附申請專利範圍中使用的,單數形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括複數所指物,除非上下文另有明確說明。因此,例如,提及“一個或一種表位”包括多個/種表位元元,提及“病毒”是提及一種或多種病毒及其本領域技術人員已知的等同物,等等。術語“和/或”預期涵蓋由該術語連接的項目的任何組合,等同於個別列出所有組合。例如,“A、B和/或C”涵蓋了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。 除非另有定義,否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解相同的含義。儘管現在描述了優選的方法、裝置和材料,但在本發明的實踐或測試中可以使用與本文描述的相似或等同的任何方法和材料。本文提到的所有出版物都引入本文作為參考,目的是描述且公開如出版物中報導的可以與本發明結合使用的病毒株、細胞株、載體和方法。本文的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權因在先發明而先於此類公開內容。
動物保健領域的所需新疫苗(特別是CSFV亞單位疫苗)的核心特徵是其要具有區分受感染的動物與免疫接種的動物(DIVA)的能力。DIVA特徵將是對傳統CSFV E2亞單位疫苗的實質改善,並且具有重要的技術優點。
本發明人已開發了一種策略,其引入DIVA特徵以改變免疫顯性E2蛋白表面中的一個或多個關鍵表位,並且使用ELISA來證實作為疫苗接種指示的識別野生型表位的抗體的不存在(陰性DIVA)(WO2020211802A的整體內容引入本文作為參考)。為了實施該策略,發明人已選擇了強烈中和性小鼠單株抗體 6B8。6B8抗體識別並結合E2蛋白的B/C結構域內的6B8表位,所述表位至少包含在位置24、25、14、22、10、41和/或64處的胺基酸。
在一個方面,本發明提供了重組CSFV E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段,所述來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段不能實現結合6B8表位。
如本文使用的,術語“CSFV”指屬於黃病毒科(
Flaviviridae)內的瘟病毒屬(
Pestivirus)中的經典豬瘟病毒(CSFV)種的所有病毒。
術語“重組”指已通過遺傳改造進行改變、重排或修飾的蛋白質或核酸。然而,該術語並不指源自天然存在的事件例如自發突變的多核苷酸、胺基酸序列、核苷酸序列中的改變。術語“嵌合”指一個物種的蛋白質或核酸包含來自其它物種的蛋白質或核酸。術語“嵌合”也可以被視為“重組”的一個示例。
在一個方面,重組CSFV E2蛋白是分離的。
多肽或核酸分子被視為“分離的”,例如,當與其天然生物來源和/或它已由其獲得的反應介質或培養基相比時 - 當它已與它在所述來源或培養基中通常與之相關的至少一種其它組分,例如另一種蛋白質/多肽、另一種核酸、另一種生物組分或大分子,或者至少一種污染物、雜質或次要組分分開時。尤其是,當多肽或核酸分子已純化至少2倍,特別是至少10倍,更特別是至少100倍,且高達1000倍或更多時,它被視為“分離的”。其為“分離形式”的多肽或核酸分子優選是基本上同質的,如使用合適的技術例如合適的層析技術,例如聚丙烯醯胺凝膠電泳確定的。
術語“CSFV E2蛋白”指加工的E2蛋白,其作為最終切割產物源自CSFV的多聚蛋白(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)。本領域技術人員將認識到CSFV的任何E2蛋白都可以用於本發明中。在本發明的一個方面,重組CSFV E2蛋白源自野生型CSFV E2蛋白,其具有被6B8單株抗體特異性識別的6B8表位。例如,CSFV E2蛋白可以源自已知的CSFV毒株,例如C毒株、QZ07毒株、GD18毒株或GD191毒株。例如,野毒株QZ07的E2蛋白具有SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列,野毒株GD18的E2蛋白具有SEQ ID NO:11中所示的胺基酸序列,野毒株GD191的E2蛋白具有SEQ ID NO:12中所示的胺基酸序列,並且C毒株的E2蛋白具有SEQ ID NO:9中所示的胺基酸序列。
如本發明中使用的,胺基酸殘基的編號指加工的CSFV E2蛋白中從N末端開始的胺基酸位置,例如,如SEQ ID NO:10中提供的胺基酸位置,除非另有特別說明。
“CSFV E2蛋白的6B8表位”在本文中指如本文公開的,由6B8單株抗體特異性識別和/或結合的CSFV E2蛋白的表位。6B8表位可以是構形表位。6B8表位可以包含在CSFV E2蛋白的位置24、25、14、22、10、41和/或64處的界定胺基酸。例如,6B8表位可以至少包含在CSFV E2蛋白的位置14、22和24/25處的界定胺基酸。界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置至少包含E2蛋白的位置14、位置22、位置24、位置24/25、位置10、位置41和/或位置64。例如,6B8表位可以包含在E2蛋白的位置14處的S、在位置22處的G、在位置24處的E或G、在位置25處的G、在位置10處的Y、在位置41處的D和/或在位置64處的R。
術語“6B8單株抗體”或“mAb 6B8”指6B8單株抗體或其抗原結合片段,其中所述6B8單株抗體特異性識別6B8表位,特別是至少包含在E2蛋白的位置14處的胺基酸S、在位置22處的G、在位置24處的E或G、在位置25處的G、在位置10處的Y、在位置41處的D和/或在位置64處的R的6B8表位。優選地,術語6B8單株抗體指包含由融合瘤產生的單株抗體的CDR的單株抗體,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC。優選地,術語6B8單株抗體指包括以下的單株抗體:包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1),包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。更優選地,術語6B8單株抗體指包含以下的單株抗體:具有如SEQ ID NO:7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V
H),以及具有如SEQ ID NO:8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V
L)。更優選地,術語6B8單株抗體指由融合瘤產生的單株抗體,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC。
如本文使用的,“抗體”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段,無論是天然的還是部分或完全合成的,例如重組產生的,包括其含有免疫球蛋白分子的可變區的至少一部分的任何片段,其保留全長免疫球蛋白的結合特異性能力。因此,抗體包括具有與免疫球蛋白抗原結合結構域(抗體組合位元點)同源或基本上同源的結合結構域的任何蛋白質。抗體包括抗體片段。因此,如本文使用的,術語抗體包括合成抗體、重組產生的抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內抗體和抗體片段。本文提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(例如IgG2a和IgG2b)的成員。
如本文使用的,術語“可變區”意指基本上由四個“構架區”組成的免疫球蛋白結構域,所述四個“構架區”在本領域和下文中分別被稱為“構架區1”或“FR1”;“構架區2”或“FR2”;“構架區3”或“FR3”;以及“框架區4”或“FR4”;所述構架區被三個“互補決定區”或“CDR”中斷,所述三個互補決定區在本領域和下文中分別被稱為“互補決定區1”或“CDR1”;“互補決定區2”或“CDR2”;以及“互補決定區3”或“CDR3”。因此,免疫球蛋白可變區的一般結構或序列可以如下指示:FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。VH或V
H指重鏈可變區,而VL或V
L指輕鏈可變區。類似地,VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分別指重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3。VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分別指輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3。
如本文使用的,抗體的“抗體片段”或“抗原結合片段”指全長抗體的任何部分,其小於全長但含有抗體的可變區的至少一部分,所述至少一部分結合抗原(例如一個或多個CDR和/或一個或多個抗體組合位元點),並且因此保留結合特異性,以及全長抗體的特異性結合能力的至少一部分。因此,抗原結合片段指含有抗原結合部分的抗體片段,所述抗原結合部分結合與抗體片段由其衍生的抗體相同的抗原。抗體片段包括通過全長抗體的酶促處理產生的抗體衍生物,以及合成例如重組產生的衍生物。抗體片段包括在抗體中。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈Fv(scFv)、Fv、dsFv、雙抗體、Fd和Fd'片段以及其它片段,包括修飾的片段(參見例如,Methods in Molecular Biology,第207卷:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003);第1章;第3-25頁,Kipriyanov)。片段可以包括例如通過二硫鍵和/或通過肽連接子連接在一起的多條鏈。抗原結合片段包括這樣的任何抗體片段,當插入抗體構架(例如通過取代相應區域)內時,其導致與抗原免疫特異性結合(即,顯示出至少或至少約10
7- 10
8M
-1的Ka)的抗體。
術語“6B8單株抗體的抗原結合片段”指6B8單株抗體的片段或至少編碼特異性識別6B8表位,特別是至少包含在E2蛋白的位置14處的胺基酸S、在位置22處的G、在位置24處的E或G、在位置25處的G、在位置10處的Y、在位置41處的D和/或在位置64處的R的6B8表位的胺基酸序列。該術語進一步涵蓋了編碼以下的胺基酸片段:包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的VH CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,和/或包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。此外,該術語還涵蓋了包含以下的胺基酸片段:具有如SEQ ID NO:7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V
H),和/或具有如SEQ ID NO:8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V
L)。更優選地,該術語涵蓋了通過由融合瘤產生的單株抗體編碼的胺基酸片段,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC,所述胺基酸片段特異性結合6B8表位。
在一個方面,取代導致重組CSFV E2蛋白中的突變的6B8表位,例如,6B8單株抗體或其抗原結合片段與之的結合被特異性抑制的突變的6B8表位。在本文中,除非另有說明,否則 “取代(replacement)/取代(replaced)/取代(replacing)”的使用意指“交換(swap)/交換(swapped)/交換(swapping)”。在一個方面,此類取代導致與相應的野生型CSFV E2蛋白相比,重組CSFV E2蛋白與6B8單株抗體或其抗原結合片段的結合被特異性抑制。
術語“特異性抑制(specifically inhibited)”或“特異性抑制(specific inhibition)”意指與未修飾的6B8表位相比,特別是與具有在E2蛋白的位置14處的胺基酸S、在位置22處的G、在位置24處的E或G、在位置25處的G、在位置10處的Y、在位置41處的D、在位置64處的R或其組合的未修飾的6B8表位相比,6B8抗體以低於至少2倍、優選低於至少5倍、更優選低於至少10倍且甚至更優選低於至少50倍的親和力與突變的6B8表位結合。“親和力”是抗體分子上的單個抗原結合位點與單個表位之間的相互作用。它由結合常數KA = kass/kdiss或解離常數KD = kdiss/kass表示。更優選地,術語“特異性抑制(specifically inhibited)”或“特異性抑制(specific inhibition)”意指在免疫螢光測定、西方墨點法測定、EIA(酶免疫測定)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)測定或雙重競爭ELISA測定、或墨點法測定中,6B8單株抗體,特別是由在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC的融合瘤產生的單株抗體,並未可檢測地結合根據本發明的突變的6B8表位。
如本文使用的,術語“除CSFV外的瘟病毒”指除CSFV外的在黃病毒科內的瘟病毒屬中的所有其它病毒。
在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”的E2蛋白不能被6B8單株抗體或其抗原結合片段特異性識別和/或結合。
除CSFV外的瘟病毒包括但不限於選自牛病毒性腹瀉病毒、邊境病病毒和非典型瘟病毒的物種;優選地選自包含BVDV-2的牛病毒性腹瀉病毒;包含Switzerland、BDV-1、BDV-2、BDV-3、BDV-4、BDV-5、BDV-6、Chamois、Italy、Turkey和突尼斯綿羊病毒(TSV)的邊境病病毒;以及包含長頸鹿瘟病毒、BVDV-3、Pronghorn antelope、Bungowannah病毒和褐鼠瘟病毒的非典型瘟病毒。除CSFV外的一些特異性瘟病毒株包括但不限於長頸鹿瘟病毒PG2毒株、BDV-2 Reindeer V60、褐鼠瘟病毒分離株NrPV/NYC-D23、突尼斯綿羊病毒9552(TSV9552)、Bungowannah 6778或BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen。
在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”為長頸鹿瘟病毒PG2毒株,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列。在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”為BDV-2 Reindeer V60毒株,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列。在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”是褐鼠瘟病毒分離株NrPV/NYC-D23,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:23的胺基酸序列。在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”為Bungowannah病毒6778,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列。在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”為TSV9552毒株,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:25的胺基酸序列。在一個方面,“除CSFV外的瘟病毒”為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株,並且其示例性E2蛋白包含SEQ ID NO:26的胺基酸序列。
CSFV E2蛋白含有四個抗原結構域A、B、C、D,並且這些結構域都定位於E2蛋白的N末端處。四個結構域構成兩個獨立的抗原單元,一個是B/C結構域的單元,而另一個包含A/D結構域。B/C結構域從胺基酸位置1到位置111附近,而D/A結構域定位從胺基酸位置77到位置177附近。編號以示例性方式基於QZ07 CSFV E2蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO: 10)的位置編號進行確定。B/C結構域涵蓋了界定CSFV E2蛋白的6B8表位的大多數關鍵胺基酸。
在一個方面,包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段是CSFV E2蛋白的B/C結構域或其片段。在一個方面,CSFV E2蛋白的B/C結構域包含從CSFV E2蛋白的胺基酸位置1到胺基酸位置111附近的序列。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置110的序列被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。
“來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列”意指在序列比對中與待取代的CSFV E2蛋白中的序列比對對齊的,來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白中的序列。
用於比對兩個胺基酸或核苷酸序列的方法是本領域眾所周知的。序列分析軟體經常用於進行序列比對。例如,序列比對可以通過使用在NCBI資料庫處的BLAST程式來完成。
例如,SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置110的序列在配對序列比對中與SEQ ID NO: 24(Bungowannah E2蛋白)的胺基酸位置10至位置111的序列進行比對,那麼SEQ ID NO: 24(Bungowannah E2蛋白)的胺基酸位置10至位置111(102 個胺基酸)的序列可以用於取代SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置110(100 個胺基酸)的序列。
在本發明的一個優選方面,如本文公開的重組CSFV E2蛋白是免疫原性的,並且優選賦予針對CSFV的保護性免疫。據報導,僅僅含有上文提到的4個抗原結構域(A、B、C和D結構域)之一的CSFV E2蛋白保留免疫原性,並且可以保護豬免受傳染性CSFV攻擊。因此,在本發明的一個優選方面,如本文所述的重組CSFV E2蛋白保留至少一個,優選如上所述的抗原結構域中的至少一個。優選地,本發明的重組CSFV E2蛋白可以賦予針對CSFV的保護性免疫。在一個方面,可以引入取代而基本上不影響重組CSFV E2蛋白針對CSFV的保護性免疫原性。
在本發明的一個方面,由6B8單株抗體特異性識別的CSFV E2蛋白的6B8表位至少由在CSFV E2蛋白的位置14、位置22、位置24、位置24和25(“24/25”)、位置10、位置41和/或位置64處的胺基酸殘基界定。
在本發明的一個方面,對於例如分離株QZ07、GD18或GD191,由6B8單株抗體特異性識別的CSFV E2蛋白的6B8表位至少由CSFV E2蛋白的胺基酸殘基S14、G22、E24、E24/G25、Y10、D41和/或R64界定。在本發明的一個方面,對於例如C毒株,由6B8單株抗體特異性識別的CSFV E2蛋白的6B8表位至少由E2蛋白的胺基酸殘基S14、G22、G24、G24/G25、Y10、D41和/或R64界定。
在本發明的一個方面,與野生型CSFV E2蛋白相比,根據本發明的重組CSFV E2蛋白包含在界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置(例如,位置14、位置22、位置24、位置24和25(“24/25”)、位置10、位置41和/或位置64)處的至少一個胺基酸殘基,其特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合。
本發明的發明人驚訝地發現,通過來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段取代包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段,以及摻入在重組CSFV E2蛋白中的位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的胺基酸突變,基本上並不影響重組CSFV E2蛋白針對CSF的保護性免疫原性或功效。此外,在重組CSFV E2蛋白(其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段)的胺基酸位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的突變,進一步確保了區分能力或增加了此類重組CSFV E2蛋白關於其DIVA特徵(通常識別並結合6B8表位的6B8抗體結合的抑制)的DIVA可靠性。
在一些實施方案中,所述至少一個胺基酸殘基通過上文提到的取代引入。例如,在本發明的一個方面,“來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段”包含在界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置(例如,位置14、位置22、位置24、位置24和25(“24/25”)、位置10、位置41和/或位置64)處的至少一個胺基酸殘基,其特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合;或者當野生型序列不包括所述胺基酸時,“來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段”進行改造(突變),以包含在界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置(例如,位置14、位置22、位置24、位置24和25(“24/25”)、位置10、位置41和/或位置64)處的至少一個胺基酸殘基,其特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合。
在一些實施方案中,除用“來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段”取代之外,在重組CSFV E2蛋白中另外引入了特異性抑制6B8單株抗體的結合的至少一個胺基酸殘基。例如,特異性抑制6B8單株抗體的結合的至少一個胺基酸殘基定位於待取代的片段之外。
在本發明的一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的,在重組CSFV E2蛋白的位置24和25處的胺基酸分別為R、D或I(其中R是優選的)以及D、K、L、N、R、T、V、E或P(其中D、K、L、N、R、T和V是優選的),在重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的,在重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的,在重組CSFV E2蛋白的位置10處的胺基酸為A或P,在重組CSFV E2蛋白的位置41處的胺基酸為A、N或E,和/或在重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中A、K和W是優選的。這些胺基酸單獨地或組合在一起已被證實為特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合。在本發明的一個方面,來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段進行突變,以在相應位置處引入一個或多個所述胺基酸。
在本發明的一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的。
在本發明的一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置24和25處的胺基酸分別為R、D或I(其中R是優選的)以及D、K、L、N、R、T、V、E或P(其中D、K、L、N、R、T和V是優選的)。
在一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的。
在一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的。
在一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置10處的胺基酸為A或P。
在一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置41處的胺基酸為A、N或E。
在一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中A、K和W是優選的。
在本發明的一個方面,來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段進行突變,以在相應位置處引入一個或多個所述胺基酸。例如,在本發明的一個方面,根據本發明的重組CSFV E2蛋白包含如下表1至7中定義的在E2蛋白的胺基酸位置處的突變。例如,表1中的第二行意指根據本發明的重組CSFV E2蛋白包含在E2蛋白的胺基酸位置10(“位置10”)處的突變,並且表1中的第三行意指根據本發明的重組CSFV E2蛋白包含在E2蛋白的胺基酸位置10和14處的突變等。
表1: | |||||||
位置10 | 位置14 | 位置22 | 位置24 | 位置25 | 位置24/25 | 位置41 | 位置64 |
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在本發明的一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的,在重組CSFV E2蛋白的位置24和25處的胺基酸分別為R、D或I(其中R是優選的)以及D、K、L、N、R、T、V、E或P(其中D、K、L、N、R、T和V是優選的),在重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的,並且在重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的。
在本發明的一個方面,在重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R,在重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D,在重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K,並且在重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A(在下文中被稱為“KARD突變”)。
在本發明的一個方面,重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 27-48和71-74的胺基酸序列。
在本發明的一個方面,為了獲得可溶性重組CSFV E2蛋白,可以將根據本發明的重組CSFV E2蛋白截短,以去除跨膜結構域。例如,可以缺失根據本發明的完整CSFV E2蛋白的C末端的最後約40個胺基酸(例如,42或43個胺基酸)。
在本發明的一個方面,為了獲得根據本發明的重組E2蛋白的分泌形式,可以將信號肽加入E2蛋白的N末端。例如,來自E1蛋白的最後約20個胺基酸,特別是最後16個胺基酸(例如,對於C毒株)或21-23個胺基酸(例如,對於GD18或QZ07)可以加入根據本發明的重組E2蛋白的N末端。在一個方面,信號肽可以包含選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列。本領域技術人員將認識到,允許分泌表現的其它信號肽也可以應用於本發明中。
在本發明的一個方面,可以將重組CSFV E2蛋白截短,以去除跨膜結構域,並且可以將信號肽加入重組CSFV E2蛋白的N末端,以便獲得可溶性和分泌的重組CSFV E2,例如,可以缺失完整的重組CSFV E2蛋白的最後43個胺基酸,並且可以將來自E1蛋白的最後16個胺基酸或21-23個胺基酸加入重組CSFV E2蛋白的N末端。
在本發明的一個方面,重組E2蛋白還可以包含用於鑑定和/或純化的融合標籤。此類標籤是本領域眾所周知的,例如His標籤或FLAG標籤。
在本發明的一個方面,免疫球蛋白Fc片段可以與E2蛋白連接。如本文使用的,術語“免疫球蛋白Fc片段”指這樣的蛋白質,其含有免疫球蛋白的重鏈恒定區2(CH2)和重鏈恒定區3(CH3),並且更尤其是,不含免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區以及輕鏈恒定區1(CL1)。它可以進一步包括免疫球蛋白的鉸鏈區或鉸鏈區的一部分(即,在重鏈恒定區處的鉸鏈區)。另外,免疫球蛋白Fc片段可以含有重鏈恒定區1(CH1)的部分。應理解,如本文使用的,術語“免疫球蛋白Fc片段”等同於“Fc片段”。
本文使用的術語“連接到”特別指用於在多肽內將免疫球蛋白Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白的C末端或N末端的任何手段。連接手段的實例可以包括通過共價鍵合將免疫球蛋白Fc片段直接連接到CSFV E2蛋白。在一個方面,Fc片段可以連接到CSFV E2蛋白的C末端。
在一個方面,免疫球蛋白Fc片段可以經由肽連接子與CSFV E2蛋白連接。如本文使用的,術語“肽連接子”指包含一個或多個胺基酸殘基的肽。更尤其是,如本文使用的,術語“肽連接子”指能夠連接兩個可變蛋白質和/或結構域,例如CSFV E2蛋白和免疫球蛋白Fc片段的肽。本文提到的肽連接子優選是長度為3至20個胺基酸殘基的胺基酸序列。例如,連接子部分可以是長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的肽連接子。肽連接子的示例性序列可以是GGS、GSGGSG、GGGGS、GGGGSGGGGS。在一個方面,肽連接子的胺基酸序列是GGS(SEQ ID NO: 16)。
在一個方面,免疫球蛋白Fc片段是豬IgG Fc片段。在一個方面,Fc片段可以連接到E2蛋白的C末端或N末端。在一個方面,Fc片段可以經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。在一個方面,豬Fc片段的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 20顯示。
在本發明的一個方面,重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 49-70、75-78和96-101的胺基酸序列之一或由其組成。在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 53、68和75的胺基酸序列之一或由其組成。在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 53和75的胺基酸序列之一或由其組成。在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列或由其組成。在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列或由其組成。在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列或由其組成。
本領域技術人員應理解本文描述的任何Fc片段,特別是具有SEQ ID NO: 20的Fc片段可以連接到本文公開的任何重組CSFV E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段,包括如本文定義的具有在胺基酸位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的另外突變的那些片段。肽連接子可以是任何連接子,在一些實施方案中,連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,肽連接子包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或由其組成。
在一個方面,本發明提供了包含本發明的重組CSFV E2蛋白的重組CSFV(經典豬瘟病毒)。在本發明的一個方面,重組CSFV是減毒的。
本領域技術人員將認識到本發明的重組CSFV可以源自各種CSFV分離株,因為6B8表位在不同CSFV毒株中是進化上保守的。在本發明的一個方面,本發明的重組CSFV源自基因組2.1的分離株。在本發明的一個方面,重組CSFV源自例如野毒株GD18或QZ07。在本發明的一個方面,本發明的重組CSFV源自基因組1的分離株。在本發明的一個方面,重組CSFV源自本領域眾所周知的C毒株。
在一個方面,本發明提供了重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列,所述胺基酸序列中包含界定6B6表位的至少一個胺基酸的片段被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一個方面,CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
在一些實施方案中,與BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段相比,重組CSFV E2蛋白進一步包含在位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的至少一個胺基酸突變。在一些實施方案中,與BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段相比,重組CSFV E2蛋白進一步包含在重組CSFV E2蛋白的位置14、24、25或64處的一個單一胺基酸突變。
在一些實施方案中,與BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段相比,重組CSFV E2蛋白進一步包含如表1至7中定義的,在胺基酸位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的突變。
在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K。在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為K。在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R。在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D。在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為N。在一些實施方案中,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P;優選地,在包含BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白片段的重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為R。
在一些實施方案中,Fc片段例如豬Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白,特別是其中包含界定6B8表位的至少一個胺基酸的CSFV片段被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。在一些實施方案中,Fc片段例如豬Fc片段連接到E2蛋白的C末端。在一些實施方案中,Fc片段例如豬Fc片段經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。
在一些實施方案中,Fc片段包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,肽連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,肽連接子包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或由其組成。
在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 96-101的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含通過SEQ ID NO: 97顯示的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含通過SEQ ID NO: 98顯示的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含通過SEQ ID NO: 99顯示的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含通過SEQ ID NO: 100顯示的胺基酸序列或由其組成。在一些實施方案中,重組CSFV E2蛋白包含通過SEQ ID NO: 101顯示的胺基酸序列或由其組成。
充分理解的是,在一些實施方案中,上述重組CSFV E2蛋白的BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的各個序列可以取代為另一種非CSFV瘟病毒序列的相應序列,例如本文列出的毒株(例如長頸鹿瘟病毒PG2毒株、BDV-2 Reindeer V60、褐鼠瘟病毒分離株NrPV/NYC-D23、突尼斯綿羊病毒9552(TSV9552)、Bungowannah 6778)中的任一種。另外充分理解的是,在一些實施方案中,此類其它重組CSFV E2蛋白可以進一步包含如表1至7中定義的,在胺基酸位置10、14、22、24、24/25、41和/或64處的一個或多個突變。此外,還應理解,在一些實施方案中,任何此類重組CSFV E2蛋白可以與Fc片段連接。
在一個方面,本發明還提供了免疫原性組合物,其包含根據本發明的重組CSFV E2蛋白和/或本發明的重組CSFV。
如本文使用的,術語“免疫原性組合物”指包含至少一種抗原的組合物,其在免疫原性組合物施用於其的宿主中引發免疫反應。此類免疫反應可以是針對本發明的免疫原性組合物的細胞和/或抗體介導的免疫反應。宿主也被描述為“個體”。優選地,本文描述或提到的任何宿主或個體是動物。
通常,“免疫反應”包括但不限於下述效應中的一種或多種:特異性針對本發明的免疫原性組合物中包括的一種或多種抗原的抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞和/或細胞毒性T細胞和/或γ-δ T細胞。優選地,宿主將展示保護性免疫反應或治療反應。
“保護性免疫反應”將通過由受感染宿主通常展示的臨床徵象減輕或缺乏、更快速的恢復時間和/或縮短的感染性持續時間、或者受感染宿主的組織或體液或排泄物中降低的病原體力價來證實。
如本文使用的,“抗原”指的是但不限於在宿主中引發針對包含此類抗原或其免疫活性組分的目的免疫原性組合物或疫苗的免疫反應的組分。
在其中宿主展示保護性免疫反應使得增強對新感染的抗性和/或減輕疾病的臨床嚴重程度的情況下,免疫原性組合物被描述為“疫苗”。
在一個方面,本發明的免疫原性組合物是疫苗。
如本文理解的,術語“疫苗”是包含抗原物質的用於獸醫學用途的疫苗,並且施用用於誘導針對由CSFV感染引起的疾病的特異性和主動免疫的目的。
優選地,根據本發明的疫苗是在宿主動物中引發保護性免疫反應的亞單位CSFV疫苗,其包含優選如本文所述的重組CSFV E2蛋白。
疫苗可以另外包含藥物組合物典型的進一步組分。
增強免疫反應的另外組分是通常被稱為“佐劑”的組成成分,或者加入疫苗中或在通過此類另外組分(如但不限於幹擾素、白細胞介素或生長因子)的分別誘導後由身體生成的輔助分子。如本文使用的,“佐劑”可以包括氫氧化鋁和磷酸鋁,皂苷例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL),油包水乳劑,水包油乳劑,水包油包水乳劑。乳劑可以尤其是基於輕質液態石蠟油(歐洲藥典型);類異戊二烯油,例如角鯊烷或角鯊烯;源自烯烴,特別是異丁烯或癸烯的低聚反應的油;含有線性烷基的酸或醇的酯,更特別為植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;支鏈脂肪酸或醇的酯,特別是異硬脂酸酯。該油與乳化劑結合使用,以形成乳劑。乳化劑優選為非離子型表面活性劑,特別是脫水山梨醇、二縮甘露醇(例如脫水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、異硬脂酸,蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯,其視情況地是乙氧基化的,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,特別是Pluronic產品,尤其是L121。參見Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(編輯Stewart-Tull,D. E. S.),JohnWiley and Sons,NY,第51-94頁(1995),以及Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐劑是由M.Powell和M.Newman編輯的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”, Plenum Press,1995的第147頁上描述的SPT乳劑,以及在同一本書的第183頁上描述的乳劑MF59。
佐劑的進一步實例是選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及馬來酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐劑化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,其尤其與糖或多元醇的聚烯基醚交聯。這些化合物由術語卡波姆(Phameuropa,第8卷,第2期,1996年6月)已知。本領域技術人員還可以參考美國專利號2,909,462,其描述了與多羥基化化合物交聯的此類丙烯酸類聚合物,所述多羥基化化合物具有至少3個羥基,優選不多於8個,至少三個羥基的氫原子被取代為具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族原子團。優選的原子團是含有2至4個碳原子的原子團,例如乙烯基、烯丙基和其它烯鍵式不飽和基團。不飽和原子團本身可以含有其它取代基,例如甲基。以名稱Carbopol;(BF Goodrich,Ohio,USA)銷售的產品是特別適當的。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯。在這些之中,可以提到Carbopol 974P、934P和971P。最優選的是Carbopol 971P的使用。在馬來酸酐和烯基衍生物的共聚物中有共聚物EMA(Monsanto),其是馬來酸酐和乙烯的共聚物。這些聚合物在水中的溶解導致酸溶液,其優選被中和至生理pH,以便提供免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身將摻入其內的佐劑溶液。
進一步合適的佐劑尤其包括但不限於RIBI佐劑系統(Ribi Inc.),嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA),SAF-M(Chiron,Emeryville CA),單磷醯脂質A,阿夫立定脂質-胺佐劑,來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素(重組或其它方式),霍亂毒素,IMS 1314或胞壁醯二肽,或者天然存在的或重組的細胞因子或其類似物,或者內源性細胞因子釋放的刺激物。
在一個方面,免疫原性組合物與合適的佐劑一起配製成油包水型乳狀液。佐劑可以包含油和表面活性劑。在一個方面,佐劑是MONTANIDE
TMISA 71R VG(由Seppic Inc製造,目錄號:365187)。在一個方面,佐劑是Seppic ISA 206。佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg的量加入。甚至更優選的,佐劑以每劑量約100 μg至約10 mg的量加入。甚至更優選的,佐劑以每劑量約500 μg至約5 mg的量加入。甚至更優選的,佐劑以每劑量約750 μg至約2.5 mg的量加入。最優選的,佐劑以每劑量約1 mg的量加入。在一個實施方案中,本發明的免疫原性組合物包含每劑量約7份含有佐劑的油相和約3份含有本發明的E2蛋白的水相。
在本發明的一個方面,源自如本文公開的取代的CSFV E2蛋白的突變的6B8表位元用作標記物。
如本文使用的,術語“標記物”指根據本發明的突變的6B8表位。根據本發明的突變型6B8表位不同於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位序列(未進行遺傳修飾的6B8表位)。因此,根據本發明的突變的6B8表位允許通過示例性免疫測試和/或基因組分析測試,區分具有未突變的6B8表位的自然感染的動物與具有根據本發明的突變的6B8表位的免疫接種的動物。
在本發明的一個方面,本發明的免疫原性組合物是標記物疫苗或DIVA(受感染的動物和免疫接種的動物之間的區分)疫苗。
術語“標記物疫苗”或“DIVA(受感染的動物和免疫接種的動物之間的區分)”指具有如上所述的標記物的疫苗。因此,標記物疫苗可以用於區分免疫接種的動物與自然感染的動物。本發明的免疫原性組合物充當標記物疫苗,因為與野生型CSFV感染形成對比,在用本發明的疫苗免疫接種的動物中,可以檢測到根據本發明的突變的6B8表位。通過示例性免疫測試和/或基因組分析測試,根據本發明的突變的6B8表位可以與野生型CSFV的6B8表位序列(未進行遺傳修飾的6B8表位)區分開。最後,標記物表位元應該對於病原體是特異性的,以便避免由牲畜中可能出現的其它生物誘導的假陽性血清學結果。然而,由於6B8表位是進化上保守的(通過序列比對)並且對於CSFV特異性的(6B8 mAb並不與BVDV結合)。因此,根據本發明的突變的6B8表位元特別適合用於標記物疫苗中。
有效的標記物疫苗的一個主要優點在於,它允許在免疫接種的豬群體中檢測到急性感染的豬或在獲取樣品前的某一時間(例如至少大約3周)感染的豬,並且因此提供了監測豬群體中的CSFV傳播或重新引入的可能性。因此,使得能夠以一定的置信度水準,基於實驗室測試結果宣告免疫接種的豬群體不含CSFV。
本發明的標記物疫苗理想地適合於在豬瘟檢測或暴發的情況下的緊急疫苗接種。標記物疫苗促進快速和有效的施用,並且允許區別感染野外病毒(疾病相關)的動物和免疫接種的動物。
在本發明的一個方面,經由使用免疫測試和/或基因組分析測試分析從所述動物中獲得的樣品,用本發明的免疫原性組合物治療的動物可以與感染天然存在的豬瘟病毒的動物區分開。
術語“樣品”指體液的樣品、分離細胞的樣品或者來自組織或器官的樣品。體液的樣品可以通過眾所周知的技術獲得,並且優選地包括血液、血漿、血清或尿的樣品,更優選地包括血液、血漿或血清的樣品。組織或器官樣品可以通過例如活組織檢查從任何組織或器官中獲得。分離的細胞可以通過分離技術如離心或細胞分選從體液或組織或器官中獲得。
術語“獲得”可以包含本領域技術人員已知的分離和/或純化步驟,優選使用沉澱、管柱等。
術語“免疫測試”和“基因組分析測試”在下文具體說明。然而,所述“免疫測試”和“基因組分析測試”的分析分別是區分用根據本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物和感染天然存在的(疾病相關的)豬瘟病毒的動物的基礎。
在本發明的一個方面,所述免疫原性組合物配製用於單一劑量施用。
有利地,由本發明提供的實驗資料公開了本發明的免疫原性組合物的單一劑量施用可靠且有效地刺激了保護性免疫反應。因此,在本發明的一個方面,所述免疫原性組合物配製用於單一劑量施用並且通過單一劑量施用是有效的。
另外,本發明提供了本發明的免疫原性組合物用作藥劑的用途。
在一個方面,本發明提供了預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法,該方法包括將根據本發明的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。在一個方面,與CSFV相關的疾病是CSF。
本發明還涉及用於對動物進行免疫的方法,其包括向此類動物施用根據本發明的任何免疫原性組合物。本發明還涉及用於對動物進行免疫的方法,其包括向此類動物單次施用根據本發明的任何免疫原性組合物。優選地,用於對動物進行免疫的方法通過根據本發明的免疫原性組合物對此類動物的單次施用是有效的。
術語“免疫”涉及通過向待免疫的動物施用免疫原性組合物的主動免疫,從而引起針對此類免疫原性組合物中包括的抗原的免疫反應。
免疫導致畜群中的特定CSFV感染的發生率降低,或者由特定CSFV感染引起或與之相關的臨床徵象的嚴重程度減輕。優選地,通過根據本發明的免疫原性組合物的單次施用,免疫導致畜群中的特定CSFV感染的發生率降低,或者由特定CSFV感染引起或與之相關的臨床徵象的嚴重程度減輕。
根據本發明的一個方面,優選地通過根據本發明的免疫原性組合物的單次施用,用如隨同提供的免疫原性組合物對有需要的動物進行免疫,導致預防個體被CSFV感染的感染。甚至更優選地,免疫導致針對CSFV感染的有效、持久的免疫學反應。應理解,所述時間段將持續超過2個月,優選超過3個月,更優選超過4個月,更優選超過5個月,更優選超過6個月。應理解,免疫可能並非在所有免疫的動物中都是有效的。然而,該術語要求畜群中的相當一部分的動物得到有效地免疫。
優選地,在此上下文中設想了一群動物,其通常(即沒有免疫)將發展通常由CSFV感染引起或與CSFV感染相關的臨床徵象。通過本領域技術人員可以毫不費力地確定畜群中的動物是否得到有效地免疫。優選地,如果與未免疫或用在本發明之前可用的免疫原性組合物免疫但隨後被CSFV感染的動物相比,給定畜群的至少33%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的動物中的臨床徵象在發生率或嚴重程度方面減輕至少10%,更優選至少20%,還更優選至少30%,甚至更優選至少40%,還更優選至少50%,甚至更優選至少60%,還更優選至少70%,甚至更優選至少80%,還更優選至少90%,且最優選至少95%,則免疫應該是有效的。
在本發明的一個方面,動物是豬。在一個方面,動物是仔豬。仔豬通常小於3至4周齡。在一個方面,仔豬在1至4周齡之間進行疫苗接種。在一個方面,動物是母豬。在一個方面,動物是懷孕的母豬。
在本發明的一個方面,免疫原性組合物是真皮內、氣管內、陰道內、肌內、鼻內、靜脈內、動脈內、腹膜內、經口、鞘內、皮下、皮內、心內、葉內、髓內、肺內及其組合施用的。然而,取決於化合物的性質和作用模式,免疫原性組合物也可以通過其它途徑進行施用。
本發明還提供了減輕動物中與CSF相關的一種或多種臨床徵象的發生率或嚴重程度的方法,該方法包括將根據本發明的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟,其中一種或多種臨床徵象的發生率或嚴重程度的減輕是相對於未接受免疫原性組合物的動物。優選地,該方法包括施用單一劑量的免疫原性組合物,並且通過免疫原性組合物的此類單次施用,在一種或多種臨床徵象的發生率或嚴重程度的減輕方面是有效的。
如本文使用的,術語“臨床徵象”指由於CSFV的動物感染的徵象。臨床徵象在下文進一步定義。然而,臨床徵象還包括但不限於可從活體動物直接觀察到的臨床徵象。可從活體動物直接觀察到的臨床徵象的實例包括鼻和眼分泌物、嗜睡、咳嗽、喘息、粗重(thumping)、發燒、重量增加或減輕、脫水、腹瀉、關節腫脹、跛行、消瘦、皮膚蒼白、生長受阻(unthriftiness)等等。Mittelholzer等人(Vet.Microbiol.,2000. 74(4):第293-308頁)制定了用於確定CSF動物實驗中的臨床評分的清單。該清單含有下述參數:活潑、身體緊張、體型、呼吸、行走、皮膚、眼/結膜、食欲、排便和餵食時的剩菜。
優選地,與未治療或用在本發明之前可用的免疫原性組合物治療但隨後被CSFV感染的個體相比,臨床徵象在發生率或嚴重程度方面減輕至少10%,更優選至少20%,還更優選至少30%,甚至更優選至少40%,還更優選至少50%,甚至更優選至少60%,還更優選至少70%,甚至更優選至少80%,還更優選至少90%,且最優選至少95%。
在本發明的一個方面,免疫原性組合物施用一次並且通過此類單次施用是有效的。
然而,雖然單一劑量施用是優選的,但免疫原性組合物也可以施用兩次或數次,其中第一劑量在第二(加強)劑量施用之前施用。優選地,第二劑量在第一劑量後至少15天施用。更優選地,第二劑量在第一劑量後15至40天之間施用。甚至更優選地,第二劑量在第一劑量後至少17天施用。還更優選地,第二劑量在第一劑量後17至30天之間施用。甚至更優選地,第二劑量在第一劑量後至少19天施用。還更優選地,第二劑量在第一劑量後19至25天之間施用。最優選地,第二劑量在第一劑量後至少21天施用。在兩次施用方案的優選方面,免疫原性組合物的第一劑量和第二劑量均以相同的量施用。除第一劑量和第二劑量方案之外,替代實施方案包含進一步的後續劑量。例如,在這些方面,可以施用第三劑量、第四劑量或第五劑量。優選地,後續第三劑量、第四劑量和第五劑量方案以與第一劑量相同的量施用,其中劑量之間的時程與上文提到的第一劑量和第二劑量之間的時機一致。
在本發明的一個方面,一種或多種臨床徵象選自:呼吸窘迫、費力呼吸、咳嗽、打噴嚏、鼻炎、呼吸急促、呼吸困難、肺炎、耳和外陰的紅色/藍色變色、黃疸、淋巴細胞性浸潤、淋巴結病、肝炎、腎炎、厭食、發熱、嗜睡、無乳(agalatia)、腹瀉、鼻排出物、結膜炎、進行性重量減輕、重量增加減少、皮膚蒼白、胃潰瘍、器官和組織上的肉眼和微觀損傷、淋巴樣損傷、死亡率、病毒誘導的流產、死產、仔豬畸形、木乃伊化及其組合。
在一個方面,本發明還提供了區分感染CSFV的動物與用根據本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法,其包括
a)獲得樣品,和
b)在免疫測試中測試所述樣品。
術語“免疫測試”指包含對於CSFV的E2蛋白的6B8表位特異性的抗體的測試。抗體可以對於根據本發明的突變的6B8表位或野生型CSFV E2蛋白的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)是特異性的。然而,術語“免疫測試”也指包含根據本發明的突變的6B8表位肽或野生型CSFV E2蛋白的6B8表位肽(未進行遺傳修飾的6B8表位)的測試。免疫測試的實例包括任何酶-免疫學或免疫化學檢測方法,例如ELISA(酶聯免疫吸附測定)、雙重競爭ELISA、EIA(酶免疫測定)、RIA(放射免疫測定)、夾心酶免疫測試、螢光抗體測試(FAT)、電化學發光夾心免疫測定(ECLIA)、解離增強鑭系螢光免疫測定(DELFIA)或固相免疫測試、免疫螢光測試(IFT)、免疫組織學染色、西方墨點法分析或本領域技術人員可用的任何其它合適的方法。取決於所使用的測定,抗原或抗體可以用酶、螢光團或放射性同位素進行標記。參見例如,Coligan等人Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons Inc.,New York,N.Y.(1994);以及Frye等人,Oncogen 4: 1153-1157,1987。
優選地,對於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位特異性的抗體用於檢測來自動物(例如豬)的血清細胞(例如白細胞)或分離器官(例如扁桃體、脾、腎、淋巴結、回腸的遠端部分)的冷凍切片中的CSFV抗原,所述動物疑似感染野生型CSFV或用包含根據本發明的重組CSFV E2蛋白的疫苗進行疫苗接種。在這種情況下,僅感染野生型CSFV的動物的樣品將顯示通過所述6B8表位元特異性抗體的陽性結果。相比之下,由於根據本發明的6B8表位內的突變,用包含本發明的重組CSFV E2蛋白的疫苗進行疫苗接種的動物的樣品將不顯示通過所述6B8表位特異性抗體的結果。在替代測試中,CSFV分離自例如感染、疑似感染野生型CSFV或免疫接種的動物的器官(例如動物的扁桃體)或血清細胞(例如白細胞),並且與合適的細胞株(例如SK-6細胞或PK-15細胞)一起溫育,用於細胞由病毒的感染。隨後使用6B8表位特異性抗體在細胞中檢測複製的病毒,所述抗體區分野外(野生型、疾病相關的)CSFV和根據本發明的重組CSFV。進一步地,肽可以用於阻斷非特異性交叉反應性。此外,對於野生型CSFV的其它表位特異性的抗體可以用作陽性對照。
更優選地,使用ELISA,其中對於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)特異性的抗體與微孔測定盤交聯,用於區分受感染的豬與用根據本發明的疫苗免疫接種的豬。所述交聯優選通過錨蛋白例如聚-L-離胺酸來進行。當與採用被動包被技術的ELISA相比時,採用此類交聯的ELISA一般而言是更靈敏的。野生型(疾病相關的)CSFV結合對於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)特異性的抗體。野生型CSFV病毒與對於野生型CSFV的6B8表位特異性的抗體的結合的檢測可以通過對於CSFV特異性的進一步抗體來進行。在這種情況下,僅受感染的豬的樣品將顯示通過6B8表位元特異性抗體的陽性結果。進一步地,肽可以用於阻斷非特異性交叉反應性。此外,對於野生型CSFV的其它表位特異性的抗體可以用作陽性對照。
可替代地,微孔測定盤可以與對於CSFV特異性的抗體交聯,而不是對於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)特異性的抗體交聯。野生型(疾病相關的)CSFV與交聯的抗體結合。野生型CSFV與交聯抗體的結合的檢測可以通過對於野生型CSFV E2蛋白的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)特異性的抗體來進行。
如上文已經闡述的,6B8表位是進化上保守的並且對於野生型CSFV特異性的。
因此,更優選地,ELISA用於檢測樣品中的抗體,其針對根據本發明的突變型6B8表位或野生型CSFV的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)。此類測試包含根據本發明的突變型6B8表位肽或野生型CSFV的6B8表位肽(未進行遺傳修飾的6B8表位)。
此類測試可以例如包含與微孔測定盤交聯的具有根據本發明的突變型6B8表位或野生型CSFV的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)的孔。所述交聯優選通過錨蛋白例如聚-L-離胺酸來進行。用於獲得突變型或野生型6B8表位元的表現系統是本領域技術人員眾所周知的。可替代地,所述6B8表位元可以是化學合成的。必須理解,雖然突變型或野生型6B8表位元像這樣可以用於根據本發明的測試中,但可以方便地使用包含完整E2蛋白或包含所述6B8表位的E2蛋白的片段的蛋白質,而不是像這樣相對較短的表位。尤其是當表位例如用於標準ELISA測試中的孔包被時,使用包含表位的更大蛋白質用於包被步驟可能是更有效的。
用包含根據本發明的重組CSFV E2蛋白的疫苗進行疫苗接種的動物並未產生針對野生型6B8表位的抗體。然而,此類動物已產生了針對根據本發明的突變型6B8表位的抗體。因此,沒有抗體與用野生型6B8表位包被的孔結合。相比之下,如果孔已用根據本發明的突變型6B8表位進行包被,則抗體與所述突變型6B8表位結合。
然而,感染野生型CSFV的動物已產生了針對CSFV的野生型表位的抗體。然而,此類動物並未產生針對根據本發明的突變型6B8表位的抗體。因此,沒有抗體與用根據本發明的突變型6B8表位包被的孔結合。相比之下,如果孔已用野生型6B8表位進行包被,則抗體與野生型6B8表位結合。
抗體與根據本發明的突變型6B8表位或野生型CSFV的6B8表位(未進行遺傳修飾的6B8表位)的結合可以通過本領域技術人員眾所周知的方法來完成。
優選地,ELISA是夾心型ELISA。更優選地,ELISA是競爭ELISA。最優選地,ELISA是雙重競爭ELISA。然而,不同的ELISA技術是本領域技術人員眾所周知的。ELISA已由Wensvoort G.等人,1988(Vet. Microbiol. 17(2): 129-140),Robiolo B.等人,2010(J. Virol. Methods. 166(1 -2): 21-27),以及Colijn,E.O.等人,1997(Vet. Microbiology 59: 15-25)進行示例性描述。
在本發明的一個方面,免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的完整6B8表位的抗體是否與樣品中的CSFV E2蛋白結合。在本發明的一個方面,免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體是否存在於樣品中,和/或測試特異性識別CSFV E2蛋白的突變的6B8表位的抗體是否存在於樣品中。此類突變的6B8表位包含如本文定義的6B8表位中的突變。
在本發明的一個方面,免疫學測試是EIA(酶免疫測定)或ELISA(酶聯免疫吸附測定)。在本發明的一個方面,ELISA是間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA或雙重競爭ELISA,優選雙重競爭ELISA。
在一個方面,本發明還提供了編碼根據本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸。
術語“核酸”指多核苷酸,包括DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物。該術語涵蓋了單鏈以及雙鏈多核苷酸。本發明的核酸涵蓋了重組多核苷酸(即來自其天然背景的重組體)和遺傳修飾形式。此外,還包含的是化學修飾的多核苷酸,包括天然存在的修飾的多核苷酸例如糖基化或甲基化多核苷酸、或者人工修飾的多核苷酸例如生物素化多核苷酸。進一步地,應理解,由於簡併的遺傳密碼,本發明的重組CSFV E2蛋白可以由大量多核苷酸編碼。在本發明的一個方面,編碼根據本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸根據核酸待引入其內的宿主細胞進行密碼子優化。
在一個方面,本發明還提供了載體,其包含編碼根據本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸。在一個方面,載體是表現載體。
術語“載體”涵蓋了噬菌體、質體、病毒或逆轉錄病毒載體、以及人工染色體例如細菌或酵母人工染色體。此外,該術語還涉及允許靶向構築體隨機或定點整合到基因組DNA內的靶向構築體。此類靶構築體優選地包含足夠長度的DNA,用於如下文詳細描述的同源或異源重組。涵蓋了本發明的核酸的載體優選地進一步包含用於在宿主中的繁殖和/或選擇的可選擇標記物。載體可以通過本領域眾所周知的各種技術摻入宿主細胞內。例如,可以將質體載體引入沉澱物如磷酸鈣沉澱物或氯化銣沉澱物中,或者引入具有荷電脂質的複合物或碳基簇如富勒烯中。可替代地,可以通過熱休克或電穿孔技術引入質體載體。如果載體是病毒,則它可以在應用於宿主細胞之前使用適當的包裝細胞株在體外進行包裝。逆轉錄病毒載體可以是有複製能力或複製缺陷的。在後一種情況下,病毒繁殖一般僅在互補的宿主/細胞中發生。更優選地,多核苷酸可操作地連接到表現控制序列,允許在原核或真核細胞或其分離級分中的表現。所述多核苷酸的表現包含多核苷酸的轉錄,優選轉錄成可翻譯的mRNA。確保在真核細胞,優選哺乳動物細胞中的表現的調控元件是本領域眾所周知的。它們優選地包含確保轉錄起始的調控序列,以及視情況地確保轉錄終止和轉錄物穩定的多聚A信號。另外的調控元件可能包括轉錄以及翻譯增強子。允許在原核宿主細胞中的表現的可能調控元件包括例如大腸桿菌中的lac、trp或tac啟動子,並且允許在真核宿主細胞中的表現的調控元件的實例是酵母中的AOX1或GAL1啟動子,或者在哺乳動物和其它動物細胞中的CMV-、SV40-、RSV-啟動子(勞斯肉瘤病毒)、CMV-增強子、SV40-增強子或珠蛋白內含子。此外,誘導型表現控制序列可以用於由本發明所涵蓋的表現載體中。此類誘導型載體可以包含tet或lac操縱子序列,或者可由熱休克或其它環境因素誘導的序列。合適的表現控制序列是本領域眾所周知的。例如,技術在Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.,以及Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中進行描述。優選地,本發明的載體是桿狀病毒載體。更優選地,本發明的載體是用於在哺乳動物細胞如CHO細胞中表現的哺乳動物表現載體。
在一個方面,本發明還提供了包含本發明的核酸或載體的宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞,例如大腸桿菌(E. coli),或真核細胞,例如昆蟲細胞。優選地,宿主細胞是SF9細胞。更優選地,宿主細胞是哺乳動物細胞,例如CHO細胞。
在一個方面,本發明還提供了用於生產本發明的重組CSFV E2蛋白的方法,其包括
(i)在適合於表現CSFV E2蛋白的條件下培養宿主細胞,優選如本文定義的CHO細胞,和
(ii)分離並視情況地純化CSFV E2蛋白。
CSFV E2蛋白的純化例如可以經由連接到CSFV E2蛋白的融合標籤或融合肽,例如經由His標籤、FLAG標籤或Fc片段(如果存在的話)來完成。
在一個方面,本發明還提供了製備免疫原性組合物的方法,其包括:(i)培養含有能夠表現E2蛋白的表現載體的細胞;並且(ii)收穫E2蛋白或包含E2蛋白的全細胞培養物,其中所述E2蛋白如本文上文定義的。
在本發明的一個方面,表現載體是包含本發明的核酸分子的重組哺乳動物表現載體。在一個方面,重組哺乳動物表現載體源自商業產品。在一個方面,重組哺乳動物表現載體源自pcDNA3.4(Invitrogen)。在一個方面,細胞是哺乳動物細胞。在一個方面,哺乳動物細胞是CHO細胞。
在一個方面,根據使用者手冊(修訂版D.0,2018年5月25日,Thermo Fisher Scientific Inc),通過使用ExpiCHO™ Expression System(Gibico,目錄# A29133)進行該方法。在一個實施方案中,CHO細胞是由Gibico以目錄號# A29127出售的ExpiCHO-S™細胞。在一個實施方案中,該方法包括用本發明的重組哺乳動物表現載體感染哺乳動物細胞的步驟,例如,使用ExpiFectamine™ CHO Transfection Kit(Gibico,目錄# A29129)。
在本發明的一個方面,表現載體是包含本發明的核酸分子的重組桿狀病毒。在一個方面,重組桿狀病毒源自商業產品。在一個方面,重組桿狀病毒源自以商標SapphireTM Baculovirus(Allele Biotechnology)出售的商業產品。在一個方面,細胞是昆蟲細胞。在一個方面,昆蟲細胞是SF+細胞。在一個實施方案中,SF+細胞是由Protein Sciences Corporation(Meriden,CT)出售的商業產品。
在本發明的一個方面,該方法包括製備包含本發明的核酸分子的重組桿狀病毒的步驟。在一個方面,重組桿狀病毒源自商業產品。在一個方面,重組桿狀病毒源自以商標SapphireTM Baculovirus(Allele Biotechnology)出售的商業產品。
在本發明的一個方面,該方法包括用本發明的重組桿狀病毒感染細胞的步驟。在一個實施方案中,細胞是昆蟲細胞。在一個實施方案中,昆蟲細胞是SF+細胞。在一個實施方案中,SF+細胞是由Protein Sciences Corporation(Meriden,CT)出售的商業產品。
在本發明的一個方面,該方法包括製備包含本發明的核酸分子的重組桿狀病毒,以及用重組桿狀病毒感染昆蟲細胞。在一個實施方案中,重組桿狀病毒源自以商標SapphireTM Baculovirus(Allele Biotechnology)出售的商業產品。在一個實施方案中,昆蟲細胞是SF+細胞。在一個實施方案中,SF+細胞是由Protein Sciences Corporation(Meriden,CT)出售的商業產品。
在本發明的一個方面,該方法包括:(i)製備包含本發明的核酸分子的重組桿狀病毒;(ii)用重組桿狀病毒感染昆蟲細胞;(iii)在培養基中培養昆蟲細胞;並且(iv)收穫本發明的E2蛋白或包含本發明的E2蛋白的全細胞培養物。在一個方面,重組桿狀病毒源自以商標SapphireTM Baculovirus(Allele Biotechnology)出售的商業產品。在一個實施方案中,昆蟲細胞是SF+細胞。在一個實施方案中,SF+細胞是由Protein Sciences Corporation(Meriden,CT)出售的商業產品。
在本發明的一個方面,用於培養本發明的細胞的培養基由本領域技術人員進行確定。在一個方面,培養基是無血清昆蟲細胞培養基。在一個方面,培養基是Ex-CELL 420(用於昆蟲細胞的Ex-CELL® 420無血清培養基,Sigma-Aldrich,目錄14420C)。
在本發明的一個方面,昆蟲細胞在適合於表現E2蛋白的條件下進行培養。在一個方面,使昆蟲細胞溫育最多十天,優選約兩天至約十天,更優選約四天至約九天,且甚至更優選約五天至約八天的時期。在一個方面,適合於培養昆蟲細胞的條件包含約22 - 32°C,優選約24 - 30°C,更優選約25 - 29°C,甚至更優選約26 - 28°C,且最優選約27°C的溫度。
在本發明的一個方面,該方法進一步包括滅活本發明的細胞培養物的步驟。任何常規的滅活方法都可用於本發明的目的,包括但不限於化學和/或物理處理。
在一個方面,滅活步驟包括添加環化二乙烯亞胺(BEI),優選濃度為約1至約20 mM,優選約2至約10 mM,更優選約5 mM或10 mM。在一個實施方案中,滅活步驟包括添加在NaOH中將被環化以形成BEI的2-溴乙撐胺氫溴酸鹽的溶液。
在一個方面,滅活步驟在25 - 40℃之間,優選在28 - 39℃之間,更優選在30 - 39℃之間,更優選在35 - 39℃之間進行。在一個實施方案中,滅活步驟進行24 - 72小時,優選30 - 72小時,更優選48 - 72小時。一般而言,滅活步驟進行直到無法檢測到病毒載體的複製。
在本發明的一個方面,該方法進一步包括在滅活步驟之後的中和步驟。中和步驟包括加入中和溶液內的滅活劑的等量試劑。在一個實施方案中,滅活劑是BEI。在一個方面,中和劑是硫代硫酸鈉。在一個方面,當滅活劑為BEI時,加入等量的硫代硫酸鈉。例如,在將BEI加入至5mM的最終濃度的情況下,添加1.0M硫代硫酸鈉溶液以給出5 mM的最終最小濃度,以中和任何殘留的BEI。在一個方面,當滅活劑是BEI時,中和步驟包括添加硫代硫酸鈉溶液至最終濃度為1至20 mM,優選2至10 mM,更優選5 mM或10 mM。在一個方面,中和劑在滅活步驟完成後添加,所述完成意味著無法檢測到病毒載體複製的複製。在一個方面,中和劑在滅活步驟進行24小時後加入。在一個方面,中和劑在滅活步驟進行30小時後加入。在一個方面,中和劑在滅活步驟進行48小時後加入。在一個方面,中和劑在滅活步驟進行72小時後加入。
在本發明的一個方面,進一步純化CSFV E2蛋白。例如,根據本發明的CSFV E2蛋白可以包含融合肽,例如His標籤、FLAG標籤或Fc片段,其連接到CSFV E2蛋白。具有His標籤的CSFV E2蛋白可以例如通過Ni-NTA親和力(與次氮基三乙酸偶聯的鎳
2+離子)進行純化。具有FLAG標籤(例如DYKDDDDK)的CSFV E2蛋白可以例如通過特異性結合FLAG標籤的單株抗體進行純化(商業試劑盒例如可得自Sigma-Aldrich(Anti-FLAG® M1瓊脂糖親和凝膠))。連接到Fc片段的CSFV E2蛋白可以例如通過蛋白A或蛋白G親和力進行純化。
在一個方面,本發明還提供了用於在CHO細胞中生產本發明的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括
a)使CHO細胞在培養基中生長;
b)用包含編碼本發明的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的重組哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的細胞,
c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;
d)收穫並視情況地純化重組CSFV E2蛋白。
在一個實施方案中,CHO細胞適於在培養基中生長至高密度懸浮培養物。
在一個實施方案中,重組哺乳動物表現載體源自pcDNA3.4(Invitrogen)。
在一個實施方案中,CHO細胞是由Gibico以目錄# A29127出售的ExpiCHO-S™細胞。
在一個實施方案中,如方法中使用的培養基是由Gibico以目錄# A29100出售的ExpiCHO™ Expression Medium。
在一個實施方案中,適應的CHO細胞通過使用ExpiFectamine™ CHO Transfection Kit(Gibico,目錄# A29129)進行轉染。
在一個實施方案中,在步驟c)中,轉染的CHO細胞在約32-37℃,優選約32℃下進行培養。
在一個實施方案中,在步驟c)中,轉染的CHO細胞用約5-8% CO
2的濕潤環境進行培養。
在一個實施方案中,ExpiFectamine™ CHO Enhancer和ExpiCHO™ Feed在步驟c)中添加。
在一個實施方案中,重組CSFV E2蛋白在轉染後約2-14天,例如,轉染後約4-12天,或轉染後約8-10天進行收穫。
在一個方面,本發明提供了用於區分感染CSFV的動物與用本發明的免疫原性組合物免疫接種的動物的試劑盒。在一個方面,試劑盒包含如本文定義的抗體或其抗原結合片段、具有突變的6B8表位的本發明的重組E2蛋白、和/或包含如本文定義的6B8表位的CSFV的野生型E2蛋白。試劑盒還可能含有使用說明書。
在本發明的一個方面,進一步純化CSFV E2蛋白。例如,根據本發明的CSFV E2蛋白可以包含融合肽,例如His標籤、FLAG標籤或Fc片段,其連接到CSFV E2蛋白。具有His標籤的CSFV E2蛋白可以例如通過Ni-NTA親和力(與次氮基三乙酸偶聯的鎳
2+離子)進行純化。具有FLAG標籤(例如DYKDDDDK)的CSFV E2蛋白可以例如通過特異性結合FLAG標籤的單株抗體進行純化(商業試劑盒例如可得自Sigma-Aldrich(Anti-FLAG® M1瓊脂糖親和凝膠))。連接到Fc片段的CSFV E2蛋白可以例如通過蛋白A或蛋白G親和力進行純化。
下述技術方案也在本文中進行描述,並且是本發明的公開內容的部分:
技術方案
下述技術方案也在本文中進行描述,並且是本發明的公開內容的部分:
1. 一種重組CSFV(經典豬瘟病毒)E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段。
2. 根據技術方案1的重組CSFV E2蛋白,其中所述取代導致重組CSFV E2蛋白中的突變的6B8表位,6B8單株抗體或其抗原結合片段與所述突變的6B8表位的結合被特異性抑制。
3. 根據技術方案1或2的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白源自來自毒株的野生型CSFV E2蛋白,所述毒株選自C毒株、QZ07、GD18和GD191。
4. 根據技術方案1-3中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中所述野生型CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 9-12的胺基酸序列。
5. 根據技術方案1-4中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中所述CSFV E2蛋白的6B8表位被6B8單株抗體特異性識別和/或結合,所述6B8單株抗體
(i)由在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC的融合瘤產生,或
(ii)包含具有如SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V
H)、以及具有如SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V
L),或
(iii)包含由融合瘤產生的單株抗體的CDR,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC,或
(iv)包括包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的VH CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。
6. 根據技術方案1-5中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸至少包含在CSFV E2蛋白的位置14、位置22、位置24、位置24/25、位置10、位置41和/或位置64處的胺基酸。
7. 根據技術方案1-6中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段是CSFV E2蛋白的B/C結構域或其片段。
8. 根據技術方案1-7中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中
i)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列;
ii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列;
iii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列;
iv)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列;
v)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列;
vi)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列;或
vii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置110的序列,
被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。
9. 根據技術方案1-8中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中除CSFV外的瘟病毒選自包含BVDV-2的牛病毒性腹瀉病毒;包含Switzerland、BDV-1、BDV-2、BDV-3、BDV-4、BDV-5、BDV-6、Chamois、Italy、Turkey和突尼斯綿羊病毒(TSV)的邊境病病毒;以及包含長頸鹿瘟病毒、BVDV-3、Pronghorn antelope、Bungowannah病毒和褐鼠瘟病毒的非典型瘟病毒。
10. 根據技術方案9的重組CSFV E2蛋白,其中除CSFV外的瘟病毒選自長頸鹿瘟病毒PG2毒株、BDV-2 Reindeer V60、褐鼠瘟病毒分離株NrPV/NYC-D23、TSV9552、Bungowannah 6778和BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen。
11. 根據技術方案1-10中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 21-26的胺基酸序列。
12. 根據技術方案1-11中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其包含在界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置處的至少一個胺基酸殘基,其特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合。
13. 根據技術方案12的重組CSFV E2蛋白,
i. 其中所述重組CSFV E2蛋白包含在如表1至7中定義的胺基酸位置處的胺基酸突變,
ii. 其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的,
iii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的,以及在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D、K、L、N、R、T和V是優選的,
iv. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的,
v. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的,
vi. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置10處的胺基酸為A或P,
vii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置41處的胺基酸為A、N或E,和/或
viii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中A、K和W是優選的。
14. 根據技術方案1-13中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的;在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸分別為R、D或I,其中R是優選的,以及在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸分別為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D、K、L、N、R、T和V是優選的;在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的;並且在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的。
15. 根據技術方案14的重組CSFV E2蛋白,其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R,在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D,在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K,並且在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A。
16. 根據技術方案1至15中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 27-48和71-74的胺基酸序列。
17. 根據技術方案1至16中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中Fc片段例如豬Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白;優選地,所述Fc片段例如豬Fc片段連接到E2蛋白的C末端,優選經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。
18. 根據技術方案17的重組CSFV E2蛋白,其中所述Fc片段包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
19. 根據技術方案17或18的重組CSFV E2蛋白,其中所述肽連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列。
20. 根據技術方案17-19中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 49-70和75-78;優選地選自SEQ ID NO: 53、68和75;更優選地選自SEQ ID NO: 53和75的胺基酸序列。
21. 一種重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列,所述胺基酸序列中包含界定6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。
22. 根據技術方案21的重組CSFV E2蛋白,
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或
其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
23. 根據技術方案21或22的重組CSFV E2蛋白,其中與BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段相比,所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的至少一個胺基酸突變;優選地,所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在如表1-7中定義的胺基酸位置處的胺基酸突變;優選地,其中所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在重組CSFV E2蛋白的位置14、24、25或64處的一個單一胺基酸突變。
24. 根據技術方案23的重組CSFV E2蛋白,其中
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的;
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中K是優選的;
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的;
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D是優選的;
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中N是優選的;或
- 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中R是優選的。
25. 根據技術方案21-24中任何一個的重組CSFV E2蛋白,其中Fc片段例如豬Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白;優選地,所述Fc片段例如豬Fc片段連接到E2蛋白的C末端,優選經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。
26. 根據技術方案25的重組CSFV E2蛋白,其中所述Fc片段包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列或由其組成;和/或所述肽連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列或由其組成。
27. 根據技術方案26的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 96-101的胺基酸序列或由其組成;優選地,所述重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列或由其組成。
28. 一種重組核酸,其編碼根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白。
29. 一種載體,其包含技術方案28的核酸。
30. 一種宿主細胞,其包含技術方案28的核酸或技術方案29的載體,優選地,所述宿主細胞是哺乳動物細胞,例如CHO細胞。
31. 一種用於生產根據技術方案1-27中任何一個的重組CSFV E2蛋白的方法,其包括
(i)在適合於表現CSFV E2蛋白的條件下,培養技術方案30的宿主細胞,和
(ii)分離並視情況地純化所述CSFV E2蛋白。
32. 一種重組CSFV(經典豬瘟病毒),其包含技術方案1-27中任何一個的重組CSFV E2蛋白。
33. 技術方案32的重組CSFV,其中所述重組CSFV是減毒的。
34. 一種免疫原性組合物,其包含根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白、根據技術方案28的重組核酸、根據技術方案29的載體、和/或技術方案32或33的重組CSFV。
35. 根據技術方案34的免疫原性組合物,其中所述免疫原性組合物是疫苗,例如標記物疫苗或DIVA(受感染的動物和免疫接種的動物之間的區分)疫苗。
36. 根據技術方案34或35的免疫原性組合物,其用於預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法中,所述方法包括將根據技術方案34或35的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。
37. 一種預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法,所述方法包括將根據技術方案34或35的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。
38. 一種區分感染CSFV的動物與用技術方案34或35中任何一個的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法,其包括
a)獲得樣品,和
b)在免疫測試中測試所述樣品。
39. 根據技術方案38的方法,其中所述免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體或其抗原結合片段是否可以與樣品中的CSFV E2蛋白結合。
40. 根據技術方案38或39的方法,其中所述免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體是否存在於樣品中,和/或測試特異性識別重組CSFV E2蛋白的突變的6B8表位的抗體是否存在於樣品中。
41. 根據技術方案38-40中任何一個的方法,其中所述免疫測試是EIA(酶免疫測定)或ELISA(酶聯免疫吸附測定),優選雙重競爭ELISA。
42. 根據技術方案39-41中任何一個的方法,其中所述特異性識別6B8表位的抗體
(i)由在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC的融合瘤產生,或
(ii)包含具有如SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V
H)、以及具有如SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V
L),或
(iii)包含由融合瘤產生的單株抗體的CDR,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC,或
(iv)包括包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的VH CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。
43. 一種用於區分感染CSFV的動物與用技術方案34或35中任何一個的免疫原性組合物免疫接種的動物的試劑盒,其包含特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體或其抗原結合片段。
44. 一種用於在CHO細胞中生產根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括
a)使CHO細胞適應培養基中的高密度懸浮培養;
b)用包含編碼根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的適應的CHO細胞,
c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;和
d)收穫並視情況地純化所述重組CSFV E2蛋白。
45. 一種用於在CHO細胞中生產根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括
a)使CHO細胞在培養基中生長至高密度懸浮培養物;
b)用包含編碼根據技術方案1至27中任何一個的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的CHO細胞,
c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;和
d)收穫並視情況地純化所述重組CSFV E2蛋白。
46. 技術方案44或45的方法,其中在步驟c)中,所述轉染的CHO細胞在約32-37°C,優選約32°C下進行培養。
47. 技術方案44-46中任何一個的方法,其中在步驟c)中,所述轉染的CHO細胞用約5-8% CO
2的濕潤環境進行培養。
48. 技術方案44-47中任何一個的方法,其中所述重組CSFV E2蛋白在轉染後約2-14天,例如,轉染後約4-12天,或轉染後約8-10天進行收穫。
49. 技術方案44-48中任何一個的方法,其中進一步純化所述CSFV E2蛋白。
50. 技術方案44-49中任何一個的方法,其中所述CSFV E2蛋白包含融合肽,並且所述CSFV E2蛋白的純化通過與特異性結合融合肽的基質的親和力來完成。
51. 技術方案44-50中任何一個的方法,其中所述CSFV E2蛋白包含作為融合肽的His標籤,並且其中通過CSFV E2蛋白經由His標籤與Ni-NTA結合,並且從Ni-NTA中釋放CSFV E2蛋白,來純化所述CSFV E2蛋白。
52. 技術方案44-50中任何一個的方法,其中所述CSFV E2蛋白包含作為融合肽的FLAG標籤,並且其中通過CSFV E2蛋白經由FLAG標籤與特異性結合FLAG標籤的單株抗體結合,並且從此類單株抗體中釋放CSFV E2蛋白,來純化所述CSFV E2蛋白。
53. 技術方案44-50中任何一個的方法,其中所述CSFV E2蛋白與Fc片段連接,並且通過CSFV E2蛋白經由Fc片段與蛋白A或蛋白G結合,並且從蛋白A或蛋白G中釋放CSFV E2蛋白,來純化所述CSFV E2蛋白。
實施例
後續實施例以舉例的方式進一步說明本發明。應理解,本發明並不限於如下所述的那些實施例中的任一個。本領域技術人員應理解,鑒於本發明的一般描述,這些實施例的表現、結果和發現可以在更廣泛的意義上進行適應且應用。
實施例
1
:用於表現具有基於
6B8
表位元的
B/C
結構域交換的重組
CSFV E2
蛋白的構築體的構建
1.1 用於交換的 E2 蛋白的 B/C 結構域或 B/C 結構域的片段為了製備用於表現具有基於6B8表位元的B/C結構域交換的重組CSFV E2蛋白的構築體,基於Ernst Peterhans的出版物(圖1,編輯自Peterhans等人,Cytopathic bovine viral diarrhea viruses(BVDV): emerging pestiviruses doomed to extinction.
Vet. Res.第41卷(6).),選擇了除CSFV外的七種瘟病毒株,用於提供用於交換的E2蛋白的B/C結構域或B/C結構域的片段的胺基酸序列,並且七種瘟病毒株是:
- Reindeer V60(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為AAF02524.2;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 22顯示),
- 突尼斯綿羊病毒9552(Tunisian sheep virus 9552,TSV9552)(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為AAR24375.1;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 25顯示),
- PG2(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為AHW57610.1;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 21顯示),
- Hobi樣Th/04 KhonKaen(下文命名為“Hobi樣”)(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為ACM79934.1;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 26顯示),
- Bungowannah 6778(下文命名為“Bungowannah”)(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為ABK58639.1;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 24顯示);和
- 褐鼠NrPV/NYC-D23(Norway rat NrPV/NYC-D23,下文命名為“褐鼠”)(病毒株的多蛋白序列的GenBank登錄號為YP_009109567;病毒株的E2蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 23顯示)。
1.2 用於表現具有基於 6B8 表位元的 B/C 結構域交換的重組 CSFV E2 蛋白的構築體的構建具有基於6B8表位元的B/C結構域交換的重組CSFV E2蛋白包含用於交換的來自CSFV QZ07毒株的E2蛋白(SEQ ID NO: 10),以及來自實施例1.1中公開的瘟病毒株的E2蛋白的B/C結構域的片段。重組CSFV E2蛋白還視情況地包含在重組CSFV E2蛋白的C末端處的Fc片段(SEQ ID NO: 20),以及在Fc片段和E2蛋白之間的肽連接子(SEQ ID NO: 16)。重組CSFV E2蛋白還視情況地包含KARD突變。重組CSFV E2蛋白的結構在圖2中示意性地顯示。
重組CSFV E2蛋白的胺基酸序列各自用於設計作為構築體(每種構築體名稱在表8中列出)的相應核苷酸序列,然後,根據CHO表現系統(ExpiCHO™ Expression System,Thermo Fisher)的說明書,對設計的核苷酸序列進行密碼子優化且合成。為了獲得可溶性和分泌形式的E2蛋白,在最終優化序列中缺失了E2的最後43個胺基酸,同時添加了來自E1蛋白的最後21胺基酸作為信號肽(SEQ ID NO: 14)。將合成的序列各自克隆到pCDNA3.4質體。還構建了用於表現具有QZ07E2毒株的330個胺基酸長度的野生型E2蛋白的構築體(QZ07E2-WT 330 FC)。
表8列出了用於交換的胺基酸序列所源自的病毒株名稱、用於交換的胺基酸序列、病毒株的原始6B8表位、構築體名稱以及用於設計構築體的重組CSFV E2蛋白的胺基酸序列。
關於用於交換的胺基酸序列,表8中列出的其位置編號如“11-39、11-56等”基於QZ07 CSFV E2蛋白(SEQ ID NO: 10)的胺基酸序列的位置編號進行確定。例如,“PG2 11-39”指在配對序列比對中,將SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置39的胺基酸序列與PG2毒株的E2蛋白的胺基酸序列進行比對,然後使用PG2毒株的E2蛋白的相應對齊序列,來交換SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置39的序列。
關於構築體名稱(關於構築體的相似命名法具有相似的含義),例如,
- “QZ07E2-PG2 11-110嵌合FC”意指構築體通過以下進行設計:在配對序列比對中,將SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置110的胺基酸序列與PG2毒株的E2蛋白的胺基酸序列進行比對,然後使用PG2毒株的E2蛋白的相應對齊序列,來交換SEQ ID NO: 10的胺基酸位置11至位置110的序列(即,“QZ07E2-PG2 11-110嵌合”),並且使用所獲得的序列用於設計構築體的相應核苷酸序列。該構築體還包含編碼在重組CSFV E2蛋白的C末端處的Fc片段(SEQ ID NO: 20)的核苷酸序列(即“FC”)。編碼肽連接子的核苷酸序列和編碼信號肽的核苷酸序列也存在於構築體中。
- “QZ07E2-PG2 11-39嵌合”意指構築體通過以下進行設計:在配對序列比對中,將SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置39的胺基酸序列與PG2毒株的E2蛋白的胺基酸序列進行比對,然後使用PG2毒株的E2蛋白的相應對齊序列,來交換SEQ ID NO: 10的胺基酸位置11至位置39的序列(即,“QZ07E2-PG2 11-39嵌合”),並且使用所獲得的序列用於設計構築體的相應核苷酸序列。編碼信號肽的核苷酸序列也存在於構築體中。然而,該構築體不包含編碼Fc片段的核苷酸序列和編碼肽連接子的核苷酸序列。
- “QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC”意指構築體通過以下進行設計:在配對序列比對中,將SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置56的胺基酸序列與Reindeer V60毒株的E2蛋白的胺基酸序列進行比對,然後使用Reindeer V60毒株的E2蛋白的相應對齊序列,來交換SEQ ID NO: 10的胺基酸位置11至位置56的序列(即,“QZ07E2-Reindeer V60 11-56嵌合”),並且使用所獲得的序列用於設計構築體的相應核苷酸序列。該構築體還包含導致KARD突變(即“KARD”)的核苷酸突變。該構築體還包含編碼在重組CSFV E2蛋白的C末端處的Fc片段(SEQ ID NO: 20)的核苷酸序列(即“FC”)。編碼肽連接子的核苷酸序列和編碼信號肽的核苷酸序列也存在於構築體中。
表8
瘟病毒株 | 用於交換的序列 | 毒株的原始 6B8 表位 | 構築體名稱 | 用於設計構築體的重組 CSFV E2 蛋白的胺基酸序列 |
PG2 | 11-39、11-56、11-80和11-110 | KGES | QZ07E2-PG2 11-110嵌合FC | SEQ ID NO: 58 |
QZ07E2-PG2 11-80嵌合FC | SEQ ID NO: 59 | |||
QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC | SEQ ID NO: 60 | |||
QZ07E2-PG2 11-39嵌合 | SEQ ID NO: 27 | |||
Reindeer V60 | 11-38、11-56、11-80和11-110 | KGES | QZ07E2-Reindeer V60 11-38嵌合 | SEQ ID NO: 31 |
QZ07E2-Reindeer V60 11-56嵌合FC | SEQ ID NO: 63 | |||
QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC | SEQ ID NO: 64 | |||
QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC | SEQ ID NO: 65 | |||
QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC | SEQ ID NO: 78 | |||
褐鼠 | 11-39 | GRNK | QZ07E2-褐鼠 11-39嵌合FC | SEQ ID NO: 49 |
Bungowannah | 11-38、11-56和11-110 | KGES | QZ07E2-Bonguwannah 11-110嵌合FC | SEQ ID NO: 50 |
QZ07E2-Bonguwannah 11-56嵌合FC | SEQ ID NO: 51 | |||
QZ07E2-Bonguwannah 11-38嵌合FC | SEQ ID NO: 52 | |||
TSV9552 | 11-38、11-56、11-80、11-90和11-109 | SGED | QZ07E2-TSV9552 11-90嵌合FC | SEQ ID NO: 66 |
QZ07E2-TSV9552 11-80嵌合FC | SEQ ID NO: 67 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC | SEQ ID NO: 68 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-56嵌合FC | SEQ ID NO: 69 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-38嵌合FC | SEQ ID NO: 70 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC | SEQ ID NO: 75 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-56 KARD嵌合FC | SEQ ID NO: 77 | |||
QZ07E2-TSV9552 11-109 KARD-嵌合FC | SEQ ID NO: 76 | |||
Hobi樣 | 11-39、11-56、11-80、11-90和11-109 | EGTG | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | SEQ ID NO: 53 |
QZ07E2-Hobi樣11-90嵌合FC | SEQ ID NO: 54 | |||
QZ07E2-Hobi樣11-80嵌合FC | SEQ ID NO: 55 | |||
QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC | SEQ ID NO: 56 | |||
QZ07E2-Hobi樣11-39嵌合FC | SEQ ID NO: 57 |
實施例 2 :關於重組 CSFV E2 蛋白的構築體在 CHO 細胞中的表現將表8中列出的構築體轉染到CHO細胞內,用於表現重組CSFV E2蛋白。轉染和培養遵循來自Thermo Fisher的ExpiCHO™ Expression System指南的說明書進行。最後,通過在4°C下以4000 rpm離心15分鐘收集細胞培養基,並且收集上清液。
通過使用SDS-PAGE和西方墨點法來檢測上清液中包含的重組CSFV E2蛋白的產量。來自每種上清液的90μl樣品與30μl裝載緩衝液混合,並且在95°C下煮沸10分鐘,在離心後,將10μl每種樣品連同分子量標記物一起裝載到SDS-PAGE凝膠的孔內。隨後,進行下述步驟:在150 V下運行凝膠,直到染料前沿到達凝膠的底部(~90分鐘),從儀器中取出運行凝膠,並且將一塊凝膠放入小託盤內,添加~20 ml染色溶液,並且伴隨輕輕振盪染色> 60分鐘,通過H
2O伴隨輕輕振盪脫色,直到凝膠明顯脫色(> 2小時)。對於西方墨點法凝膠,在將蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜後,使用封閉緩衝液(5%脫脂乳的PBST溶液)使膜在室溫下封閉1小時或在4°C下封閉過夜,然後使膜與一抗WH303(同樣能夠與CSFV E2蛋白結合的一種抗體)和6B8在封閉緩衝液中的適當稀釋物一起溫育,在PBST的3次洗滌中將膜洗滌,各5分鐘,使膜與綴合的二抗在封閉液中的建議稀釋物一起在室溫下溫育1小時,然後在PBST的3次洗滌中將膜洗滌,各5分鐘,並且經受信號發展。
隨機選擇重組CSFV E2蛋白的17份上清液作為用於進一步西方墨點法實驗或DIVA和功效評估的候選物。所選上清液是由下述構築體的表現製備的那些上清液:QZ07E2-PG2 11-39嵌合FC、QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-38嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-56嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC、QZ07E2-TSV 11-38嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-56嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-56 KARD嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-80嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-39嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC和QZ07E2-Bungowannah 11-38嵌合FC。還製備了由構築體QZ07E2-WT 330 FC的表現製備的上清液並用於進一步測試。
實施例 3 :關於 6B8 抗體結合的抑制的測試該實施例的目的是在體外評估重組CSFV E2蛋白的B/C結構域的交換或重組CSFV E2蛋白的B/C結構域的交換連同KARD突變一起是否可以阻斷6B8抗體與重組CSFV E2蛋白的結合。
使實施例2中列出的上述17種候選物經受西方墨點法實驗,以確定6B8抗體結合的抑制,其是DIVA的關鍵特徵。關於西方墨點法實驗的詳細步驟可以參考實施例2。
所有上清液均未顯示與6B8抗體的抗體結合,同時顯示了與WH303抗體的結合。圖3A和圖3B顯示了QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC、QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC和QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC的西方墨點法結果。從圖3A和3B可以看出,圖3A的泳道1-3和圖3B的泳道2-6並未顯示6B8抗體結合;在圖3B的泳道1中,添加了來自QZ07E2毒株的野生型E2蛋白的上清液,並且顯示了6B8抗體結合;並且泳道中的所有條帶都可以與WH303抗體結合,這意味著所有蛋白質都良好地表現且存在。證實了這些蛋白質與6B8抗體的反應性失效直接由具有或不具有KARD突變的B/C結構域交換引起。
實施例 4 :功效評估該實施例的目的是以示例性方式,通過使用由實施例2的上清液製備的組合物來評估重組E2蛋白的功效。隨機選擇實施例3的八份上清液作為候選物。
簡言之,以21±7日齡的仔豬(3周齡)的總共60頭商業混種仔豬被分配到11個組內:
- 組1:含有5頭仔豬,充當不含DIVA特徵的E2對照;
- 組2-9:每組含有5頭仔豬,用於功效評估;
- 組10:含有5頭仔豬,充當攻擊對照;和
- 組11:含有5頭仔豬,充當嚴格(陰性)對照。
重組E2蛋白各組的名稱和功效評估在表9中列出。由實施例2製備的上清液各自與Seppic ISA 206佐劑混合,以便製備免疫原性組合物。55至65 μg的未純化的重組E2蛋白包含在組合物的一個劑量(2ml)中用於施用,並且用於此類實驗中。在組合物中,上清液中包含的重組E2蛋白與Seppic ISA 206佐劑的重量比為約1:1。
表9
在第0天時,組1-9中的仔豬分別用2 mL Seppic ISA 206佐劑化的組合物/仔豬進行接種(IM)。組10在第0天時用2mL PBS + 佐劑(Seppic ISA 206)進行接種(IM),充當攻擊對照。在第21天時以≥ 10
5MLD/mL的劑量,用傳染性CSFV Shimen毒株(由軍事獸醫研究所,軍事醫學科學院提供),對組1-10中的仔豬進行接種(IM)。所有仔豬在第0天時都是臨床健康的,並且不含CSFV和PRRSV抗體,以及不含包括BVDV、PRV的抗原。所有仔豬在免疫時都是健康的。
從第0天開始每7天收集血清樣品。在第21、24、28、31和37天時(攻擊後天數(DPC)0、3、7、10、16),收集所有仔豬的全血樣品。用於確定疫苗功效的主要參數是死亡率,而死亡率與嚴重經典豬瘟(CSF)感染相關。
如下表10中所示,攻擊對照組(組10)中的仔豬全部死亡。關於組4、5和8,它們都顯示了20%的死亡率,比攻擊組好得多;而其它組都賦予了針對Shimen毒株攻擊的100%的死亡率保護。結果顯示了,用來自其它瘟病毒的相應片段的取代和在重組E2蛋白中摻入胺基酸突變並不影響疫苗功效。因此,所有候選疫苗都顯示了疫苗功效。
下表10中概括了關於所有候選物的功效評估結果。
表10
組 | ug/ 劑量 | |
1 | QZ07E2-WT 330 FC | 64.62 |
2 | QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC | 55.43 |
3 | QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC | 62.52 |
4 | QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC | 50.94 |
5 | QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC | 51.15 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC | 61.99 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 62.57 |
8 | QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC | 63.22 |
9 | QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC | 61.59 |
10 | 2mL PBS + 佐劑(Seppic ISA 206) | 不適用 |
11 | 嚴格對照 | 不適用 |
組 | 死亡率( % ) | |
1 | QZ07E2-WT 330 FC | 0 |
2 | QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC | 0 |
3 | QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC | 0 |
4 | QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC | 20 |
5 | QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC | 20 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC | 0 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 0 |
8 | QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC | 20 |
9 | QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC | 0 |
10 | 攻擊對照 | 100 |
11 | 嚴格對照 | 0 |
實施例 5 :免疫反應評估在該實施例中,使由表9的構築體(組2-9)製備的重組E2蛋白經受免疫反應評估。這些重組E2蛋白的免疫原性組合物的製備方法以及後續的實驗設計,包括仔豬的分組和免疫的劑量等,與實施例4中所述的方法相同。通過在第21天時以≥ 10
5MLD/mL的劑量,用傳染性CSFV Shimen毒株(由軍事獸醫研究所,軍事醫學科學院提供)接種(IM),來攻擊組1-10中的仔豬。
從第0天開始到攻擊後第16天(DPC16),每7天收集血清樣品。用於評估疫苗接種後的抗體反應的主要參數是抗體阻斷率,其反映了免疫接種的仔豬的抗體水準。抗體阻斷率的值通過遵循IDEXX CSFV Ab ELISA測定試劑盒(IDEXX Laboratories. Inc)的方案進行確定。
表11顯示了在不同天時,每組中的免疫接種的仔豬的平均抗體阻斷率(%)。
表11
如表11中所示,除了兩個對照組10-11之外,疫苗接種組1-9的抗體阻斷率在D14時變成陽性(阻斷率> 40%,其意味著大量抗體存在於血清樣品中),然後快速上升直到D21,並且在DPC7時,疫苗接種組1-9的抗體阻斷率達到峰值。此外,從DPC7到DPC16,疫苗接種組2-9的抗體阻斷率與疫苗接種組1可匹配。這些結果顯示了,由表9中列出的構築體製備的重組E2蛋白在免疫接種的仔豬中均成功地引發了抗體反應,用來自其它瘟病毒的相應片段的取代和胺基酸突變的摻入並不影響疫苗的免疫原性。
組 | 不同天的平均抗體阻斷率( % ) | ||||||||
D0 | D7 | D14 | D21 | DPC3 | DPC7 | DPC10 | DPC16 | ||
1 | QZ07E2-WT 330 FC | 12.72 | 3.32 | 46.85 | 79.87 | 83.98 | 89.30 | 89.63 | 86.94 |
2 | QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC | 15.41 | 19.05 | 57.94 | 82.62 | 87.48 | 93.12 | 93.46 | 91.18 |
3 | QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC | 18.72 | 13.92 | 58.78 | 75.65 | 81.22 | 91.31 | 92.13 | 89.31 |
4 | QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC | 13.93 | 4.38 | 41.56 | 65.70 | 71.36 | 89.41 | 89.80 | 86.41 |
5 | QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC | 16.44 | 26.87 | 61.41 | 82.01 | 85.68 | 93.50 | 93.19 | 92.19 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC | 14.90 | 8.16 | 63.18 | 79.03 | 83.63 | 93.22 | 92.00 | 92.16 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 12.88 | 2.15 | 49.90 | 68.99 | 74.88 | 88.33 | 87.50 | 87.21 |
8 | QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC | -9.05 | -3.85 | 42.02 | 53.27 | 54.14 | 83.48 | 81.62 | 86.90 |
9 | QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC | 10.10 | 7.46 | 67.07 | 77.04 | 77.46 | 92.89 | 91.68 | 92.15 |
10 | 攻擊對照 | -10.19 | -5.55 | -0.12 | 3.01 | -6.82 | -1.68 | 21.76 | 死亡 |
11 | 嚴格對照 | -13.10 | -9.30 | -2.53 | -1.23 | -2.05 | -4.64 | -2.72 | 4.13 |
實施例 6 :體內 DIVA 測試在該實施例中,使由表9的構築體(組2-9)製備的重組E2蛋白經受體內DIVA測試。這些重組E2蛋白的免疫原性組合物的製備方法以及後續的實驗設計,包括仔豬的分組和免疫的劑量等,與實施例4中所述的方法相同。通過在第21天時以≥ 10
5MLD/mL的劑量,用傳染性CSFV Shimen毒株(由軍事獸醫研究所,軍事醫學科學院提供)接種(IM),來攻擊組1-10中的仔豬。在第21天(D21)和攻擊後16天(DPC16)時收集血清樣品用於DIVA測試。
使血清樣品經受雙重競爭ELISA(dcELISA)方法,以檢測用作DIVA標記物的針對6B8抗體的抗體反應。dcELISA方法根據Bruderer U,.
J Immunol Methods.2015年5月;420:18-23進行,並且6B8單株抗體用作dcELISA方法中的競爭性抗體。用於評估免疫接種的仔豬的抗體水準的值是抗體阻斷率,其通過測量關於每組的血清樣品和嚴格對照在OD450處的平均吸光度值,然後通過將嚴格對照的OD450值與血清樣品的OD450值之間的差異值除以嚴格對照的OD450值,來計算抗體阻斷率。如果測試血清樣品顯示了阻斷率>30%,則它是陽性的(存在6B8抗體)。如果測試血清樣品顯示了阻斷百分比≤ 30%,則它是陰性的(不存在6B8抗體)。
表12顯示了在D21和DPC16時,每組中的免疫接種的仔豬的平均抗體阻斷率(%)。
表12
如表12中所示,除了組1之外,疫苗接種組2-9的6B8抗體阻斷率在疫苗接種後的D21時為陰性,而所有組1-9的6B8抗體阻斷率在DPC16時均變成陽性。這些結果顯示了,包含來自其它瘟病毒的嵌合E2片段的重組E2蛋白具有DIVA能力,並且胺基酸突變的進一步摻入可確保DIVA能力。因此,由表9中列出的構築體製備的重組E2蛋白具有DIVA能力。
組 | 在D21時的平均抗體阻斷率% | 在DPC16時的平均抗體阻斷率% | |
1 | QZ07E2-WT 330 FC | 65.04 | 92.48 |
2 | QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC | 25.186 | 55.31 |
3 | QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC | 24.758 | 79.386 |
4 | QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC | 17.048 | 84.0675 |
5 | QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC | 27.796 | 62.1 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC | 16.774 | 78.03 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 9.788 | 61.654 |
8 | QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC | 2.596 | 66.8525 |
9 | QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC | 7.915 | 74.67 |
10 | 攻擊對照 | -4.674 | 不適用 |
11 | 嚴格對照 | 3.243 | 3.656 |
實施例 7 :關於 E2 蛋白中的 6B8 結合的關鍵胺基酸位置的鑑定在WO2020211802A(WO2020211802A的整體內容引入本文作為參考)中,CSFV E2蛋白中的胺基酸位置14、22、24和24/25已經被鑑定為對於6B8單株抗體結合關鍵的。具體地,在E2蛋白的胺基酸位置24處的E或G至R或K的取代,在E2蛋白的胺基酸位置24處的E或G至R或K的取代以及在胺基酸位置25處的G至D的取代,在E2蛋白的胺基酸位置14處的S至K、Q或R的取代,和/或在E2蛋白的胺基酸位置22處的G至A、R、Q或E的取代,證實為特異性抑制6B8抗體與CSFV E2蛋白的結合。
下述實施例是鑑定關於E2蛋白中的6B8結合的另外關鍵的胺基酸位置。
在該實施例中,E2中的胺基酸位置10、41和64被進一步鑑定為關於6B8 mAb結合的另外關鍵位置。
突變型QZ07-E2蛋白含有Y10A、Y10P、D41A、D41N、D41E、R64A、R64S或R64E(胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO: 79-86中;並且密碼子優化的編碼序列分別顯示於SEQ ID NO: 87-94中)。不含突變的QZ07-E2蛋白的密碼子優化的編碼序列顯示於SEQ ID NO: 95中。合成每個密碼子優化的序列,然後通過BamH I和EcoR I克隆到pVL1393穿梭質體,以完成pVL1393-穿梭質體用於進一步共轉染。為了獲得可溶性和分泌形式的E2蛋白,在最終序列中缺失了E2的最後42個胺基酸,同時添加了來自E1蛋白的最後16個胺基酸作為信號肽。CHO表現系統(ExpiCHO™ Expression System,Thermo Fisher)用於蛋白質的進一步表現。免疫螢光測定(IFA)用於確定6B8 mAb與具有突變的6B8表位的突變型QZ07-E2蛋白的結合。構建且表現突變型QZ07-E2蛋白的詳細方法,連同IFA測試一起可以參考WO2020211802A。
結果顯示於圖4中,結果證實取代Y10A、Y10P、D41A、D41N、D41E、R64A、R64S和R64E均可單獨抑制6B8 mAb結合。通過西方墨點法檢測含有Y10A、Y10P、D41A、D41N、D41E、R64A、R64S或R64E的突變型QZ07-E2蛋白的表現。結果顯示於圖5中,並且結果證實突變R64A和R64S僅很輕微影響CHO細胞株統中的蛋白質表現分泌。
實施例 8 : E2 蛋白中的用於抑制 6B8 結合的另外胺基酸突變的鑑定在該實施例中,在E2中的胺基酸位置14、22、24、25和64處的更多突變被鑑定為對於抑制6B8 mAb結合也是關鍵的。
設計了分別含有在位置14、22、24、25和64處的各種突變的突變型QZ07-E2蛋白,並且根據CHO表現系統(ExpiCHO™ Expression System,Thermo Fisher)的說明書,對突變型QZ07-E2蛋白的相應編碼序列進行密碼子優化且合成。為了獲得可溶性和分泌形式的E2蛋白,在最終優化序列中缺失了E2的最後43個胺基酸,同時添加了來自E1蛋白的最後21個胺基酸作為信號肽。CHO表現系統(ExpiCHO™ Expression System,Thermo Fisher)用於突變型QZ07-E2蛋白的進一步表現。構建且表現突變型QZ07-E2蛋白的詳細方法遵循上文的實施例1和WO2020211802A的實施例1-3。
通過將突變體E2的C末端進一步連接到Fc片段用於增強蛋白質表現,製備了一些突變體,包括突變體QZ07-E2-Fc-R64D、突變體QZ07-E2-Fc-R64H、突變體QZ07-E2-Fc-R64T、突變體QZ07-E2-Fc-R64G和突變體QZ07-E2-Fc-R64K。還在E2蛋白和Fc片段之間添加肽連接子。將突變型QZ07-E2-Fc蛋白的密碼子優化序列克隆到pCDNA3.4質體。
還通過遵循來自Thermo Fisher的ExpiCHO™ Expression System指南的說明書,來完成重組pCDNA3.4質體的轉染和培養。
在轉染前一天(第–1天)時,將ExpiCHO-S™培養物拆分至3 × 10
6–4 × 10
6個活細胞/mL的最終密度,並且允許細胞生長過夜。在轉染當天(第0天)時,確定活細胞密度和百分比活力。當細胞達到大約7 × 10
6–10 × 10
6個活細胞/mL的密度伴隨95-99%的活力時,細胞用新鮮的ExpiCHO™ Expression Medium稀釋至6 × 10
6個活細胞/mL的最終密度。使燒瓶輕輕旋轉,以混合細胞。使用冷試劑(4°C)製備ExpiFectamine™ CHO/質體DNA複合物。簡單地取出冷藏的試劑,並且開始DNA複合。下述步驟包括:a)將ExpiFectamine™ CHO Reagent瓶輕輕倒置4-5次以混合,b)用冷的OptiPRO™培養基稀釋質體DNA,並且通過使管旋轉和/或通過倒置來混合,c)用OptiPRO™培養基稀釋ExpiFectamine™ CHO Reagent,通過使管旋轉和/或通過倒置或輕輕吸取2-3次來混合,通過使管旋轉或通過倒置來混合,使ExpiFectamine™ CHO/質體DNA複合物(來自步驟d)在室溫下溫育1-5分鐘,然後將溶液緩慢轉移到搖瓶中,在添加過程中使燒瓶輕輕旋轉。第1天,在轉染後的當天(第1天,轉染後18–22小時),將ExpiFectamine™ CHO Enhancer和ExpiCHO™ Feed加入燒瓶中(根據指南添加體積),隨後為在添加過程中使燒瓶輕輕旋轉。將燒瓶轉移到具有在空氣中的5% CO
2的濕潤環境的32℃培養箱,伴隨振盪,並且培養6-10天。通過在4°C下以4000 rpm離心15分鐘收集細胞培養基,並且收集上清液。
突變型QZ07-E2-Fc蛋白的純化分別通過使用來自Thermo的蛋白A瓊脂糖進行。純化溶液包含1 M Tris緩衝液(pH 9.0)。純化過程包括以下步驟:將蛋白瓊脂糖和所有緩衝液平衡至室溫;遵循與柱一起提供的說明書,用0.5 ml(對於QZ07-E2-Fc突變,例如在位置64處的突變)樹脂漿料小心地填充柱;通過加入5 ml結合緩衝液,並且允許溶液流過柱,來使柱平衡;在應用於蛋白A柱之前,用結合緩衝液以1:2稀釋樣品,以維持適當的離子強度和pH用於最佳結合;將稀釋的樣品應用於柱,並且允許其完全流入樹脂內;用10 ml結合緩衝液洗滌蛋白A柱;用5 ml洗脫緩衝液洗脫抗體並收集級分;通過在1ml洗脫物中加入100 ul中和緩衝液,將洗脫級分立即調整至生理pH;將洗脫物轉移到離心濾器內,並且加入6 ml PBS;將管置於離心機中,4000 rpm共15分鐘;使用10 ml PBS洗滌管;重複離心步驟,以將樣品濃縮成1-2 ml;使用Qubit Kit來測量純化的緩衝液交換的樣品;並且通過SDS-PAGE和西方墨點法分析來確認產物。
突變型QZ07-E2蛋白和突變型QZ07-E2-Fc蛋白的純化產物通過SDS-PAGE和西方墨點法分析來確認。結果顯示於圖6-10中。
對於胺基酸位置22,G22A、G22Q、G22D、G22E、G22N和G22S在產量以及與mAb 6B8的反應性的兩個方面可以是候選取代。
對於胺基酸位置24,G24R與mAb 6B8具有微弱反應性。G24D和G24I突變體不能與mAb 6B8反應,儘管產量很低。
對於胺基酸位置25,G25D、G25K、G25L、G25N、G25R、G25T和G25V在產量以及與mAb 6B8的反應性的兩個方面可以是候選取代。
對於胺基酸位置64,R64A、R64K和R64W在產量以及與mAb 6B8的反應性方面可以是候選突變體。
對於胺基酸位置14,S14A、S14Q、S14R、S14E顯示了與mAb 6B8的極弱反應性,並且突變在產量以及與mAb 6B8的反應性的兩個方面是合適的候選取代。與mAb 6B8的極弱反應性允許界定截斷值,使得其具有在mAb 6B8陽性和mAb 6B8陰性反應性之間的明確區別。
實施例 9 :用於表現具有 B/C 結構域交換和一個單一突變的重組 CSFV E2 蛋白的另外構築體的構建和表現在該實施例中,另外製備了另外6種構築體,然後根據如實施例1和2中描述的方法,在CHO細胞中進行表現。構築體命名為QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC和QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC。
構築體QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC通過以下進行製備:在配對序列比對中,將SEQ ID NO: 10(QZ07 CSFV E2蛋白)的胺基酸位置11至位置109的胺基酸序列與Hobi樣毒株的E2蛋白的胺基酸序列進行比對,然後使用Hobi樣毒株的E2蛋白的相應對齊序列,來交換SEQ ID NO: 10的胺基酸位置11至位置109的序列,並且使用所獲得的胺基酸序列來設計構築體的相應核苷酸序列。導致E14K突變的核苷酸突變也被引入構築體的相應核苷酸序列內。編碼Fc片段的核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)、以及編碼肽連接子的核苷酸序列(SEQ ID NO: 16)和編碼信號肽的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)也被加入構築體中。其它構築體以相同方式進行製備。
由這些構築體表現的重組CSFV E2蛋白具有B/C結構域交換以及在一個位置中的一個單個胺基酸突變,所述位置已在實施例7-8中鑑定為對於抑制6B8 mAb結合關鍵的。根據如實施例2中所述的方法,獲得並收集含有重組CSFV E2蛋白的上清液。
在圖11中示意了由這些構築體表現的重組CSFV E2蛋白的結構。在表13中列出了用於表現重組CSFV E2蛋白的這些構築體的核苷酸序列,以及由構築體表現的重組CSFV E2蛋白的胺基酸序列(信號肽在表現後去除)。
表13
構築體名稱 | 由構築體表現的重組 CSFV E2 蛋白的胺基酸序列 | 用於表現重組 CSFV E2 蛋白的這些構築體的核苷酸序列 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC | SEQ ID NO: 96 | SEQ ID NO: 102 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC | SEQ ID NO: 97 | SEQ ID NO: 103 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC | SEQ ID NO: 98 | SEQ ID NO: 104 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC | SEQ ID NO: 99 | SEQ ID NO: 105 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC | SEQ ID NO: 100 | SEQ ID NO: 106 |
QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC | SEQ ID NO: 101 | SEQ ID NO: 107 |
實施例 10 :用於 6B8 抗體結合的抑制的體外測試在該實施例中,使由實施例9的6種構築體連同QZ07E2-WT 330 FC和QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC一起的表現製備的上清液經受西方墨點法實驗,以便確定6B8抗體結合的抑制。西方墨點法實驗根據如實施例2-3中所述的方法進行。
圖12顯示了由這些構築體的表現製備的上清液的西方墨點法結果。結合印跡存在於圖12的泳道1-8中(左圖),其指示了由所有構築體製備的上清液都可以與WH303單株抗體反應。結合印跡不存在於圖12的泳道1-7中(右圖),其指示了由相應構築體製備的上清液不能與6B8單株抗體反應。這些結果證明,這些蛋白質與6B8單株抗體的反應性喪失直接由B/C結構域的交換和單一突變引起,其表明由這些構築體表現的重組E2蛋白可以用於免疫接種的動物與被野生型野毒株感染的那些動物的區別。
實施例 11 :免疫反應評估在該實施例中,使由表13的構築體製備的重組E2蛋白經受免疫反應評估。以21±7日齡的仔豬(3周齡)的總共39頭商業混種仔豬(來自Rugao Boyi Animal Husbandry Co.,Ltd.,NanTong,中國)被分配到9個組內:
- 組1-7:每組含有5頭仔豬,用於免疫反應評估;
- 組8:含有2頭仔豬,充當不含DIVA特徵的E2對照;
- 組9:含有2頭仔豬,充當嚴格(陰性)對照。
由實施例8的六種構築體連同QZ07E2-WT 330 FC和QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC一起的表現製備的上清液各自與Seppic ISA 206佐劑混合,以便製備免疫原性組合物。在每種免疫原性組合物中,上清液中包含的重組E2蛋白與Seppic ISA 206佐劑的重量比為約1:1。每頭仔豬被施用免疫原性組合物的一個劑量(2ml)。免疫原性組合物的一個劑量中包含的重組E2蛋白的量在表14中列出。
表14
在第0天時,組1-8中的每頭仔豬用2 mL組合物進行接種(IM)。組9在第0天時用2mL PBS + 佐劑(Seppic ISA 206)進行接種(IM),充當嚴格對照。在第21天時,組1-9中的仔豬用與第0天時使用相同的抗原進行加強。所有仔豬在第0天時都是臨床健康的,並且不含CSFV和PRRSV抗體,以及不含包括BVDV、PRV的抗原。所有仔豬在免疫時都是健康的。
從第0天開始到第56天每7天收集血清樣品。用於評估疫苗接種後的抗體反應的主要參數稱為抗體阻斷率,其反映了免疫接種的仔豬的抗體水準。抗體阻斷率的值通過遵循IDEXX CSFV Ab ELISA測定試劑盒(IDEXX Laboratories. Inc)的方案進行確定。
表15顯示了在不同天時,每組中的免疫接種的仔豬的平均抗體阻斷率(%)。如表15中所示,除了對照組9之外,疫苗接種組1-8的抗體阻斷率在D21時變成陽性(阻斷率>40%),並且在加強免疫後,疫苗接種組1-8的抗體阻斷率不斷增加,然後達到峰值。此外,從D21到D56,疫苗接種組1-7的抗體阻斷率與疫苗接種組8可匹配。這些結果證明,用來自其它瘟病毒的相應片段的取代和胺基酸突變的摻入並不影響疫苗的免疫原性,並且由構築體製備的重組E2蛋白在免疫接種的仔豬中成功地引發良好的抗體反應。
表15
組 | μg/ 劑量 | |
1 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC | 55.26 |
2 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC | 58.41 |
3 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC | 54.77 |
4 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC | 49.39 |
5 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC | 63.29 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC | 54.99 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 49.39 |
8 | QZ07E2-WT 330 FC | 53.03 |
9 | 2mL PBS + 佐劑(Seppic ISA 206) | 不適用 |
組 | 在疫苗接種後的不同天的平均抗體阻斷率( % ) | |||||||||
D0 | D7 | D14 | D21 | D28 | D35 | D42 | D49 | D56 | ||
1 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC | 8.56 | 5.57 | 51.19 | 66.42 | 77.56 | 81.46 | 85.95 | 79.42 | 84.70 |
2 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC | 5.34 | 4.94 | 43.55 | 61.68 | 80.40 | 73.45 | 85.11 | 79.23 | 86.47 |
3 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC | 4.01 | 3.11 | 24.40 | 49.09 | 72.94 | 74.62 | 80.85 | 76.17 | 83.19 |
4 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC | 5.65 | 9.90 | 39.31 | 46.65 | 70.79 | 72.13 | 78.22 | 76.70 | 81.93 |
5 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC | 7.17 | 7.24 | 43.33 | 52.25 | 77.73 | 81.29 | 85.10 | 79.70 | 84.37 |
6 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC | 3.37 | 12.03 | 53.72 | 59.60 | 79.07 | 82.67 | 85.81 | 79.82 | 84.72 |
7 | QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC | 2.44 | 0.71 | 54.87 | 62.76 | 84.63 | 85.81 | 89.38 | 87.01 | 87.02 |
8 | QZ07E2-WT 330 FC | 5.70 | 7.75 | 32.26 | 42.09 | 74.49 | 78.60 | 83.83 | 84.45 | 85.46 |
9 | 嚴格對照 | 1.06 | 5.32 | 2.07 | 16.34 | 16.14 | 13.38 | 7.07 | 5.41 | 13.19 |
圖1:瘟病毒的系統發育分析和分類(編輯自Peterhans等人,
Vet. Res.第41卷(6).)。
圖2:重組CSFV E2蛋白的結構。
圖3:QZ07E2-Reindeer V60 11-110嵌合FC、QZ07E2-Reindeer V60 11-56 KARD嵌合FC、QZ07E2-PG2 11-56嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-38 KARD嵌合FC、QZ07E2-TSV9552 11-109嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC、QZ07E2-Hobi樣11-56嵌合FC和QZ07E2-Reindeer V60 11-80嵌合FC的西方墨點法結果。
圖4:關於E2中的6B8結合的額外關鍵殘基的鑑定。CHO細胞表現系統中的E2蛋白的突變形式的IFA檢測顯示在位置10、41或64處的胺基酸殘基對於mAb 6B8結合是關鍵的。
圖5:CHO細胞表現系統中的E2蛋白的突變形式的西方墨點法檢測。
圖6:用於抑制E2中的6B8結合的在位置22處的額外胺基酸的鑑定。
圖7:用於抑制E2中的6B8結合的在位置24處的額外胺基酸的鑑定。
圖8:用於抑制E2中的6B8結合的在位置25處的額外胺基酸的鑑定。
圖9:用於抑制E2中的6B8結合的在位置64處的額外胺基酸的鑑定。
圖10:用於抑制E2中的6B8結合的在位置14處的額外胺基酸的鑑定。
圖11:由QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC和QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC的構築體表現的重組CSFV E2蛋白的結構。
圖12:由QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合E14K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合T24R FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合R64K FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25D FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25N FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合G25R FC、QZ07E2-Hobi樣11-109嵌合FC和QZ07E2-WT 330 FC的構築體的表現製備的上清液的西方墨點法結果。
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Claims (48)
- 一種重組CSFV(經典豬瘟病毒)E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應片段。
- 如請求項1的重組CSFV E2蛋白,其中所述取代導致重組CSFV E2蛋白中的突變的6B8表位,6B8單株抗體或其抗原結合片段與所述突變的6B8表位的結合被特異性抑制。
- 如請求項1或2的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白源自來自毒株的野生型CSFV E2蛋白,所述毒株選自C毒株、QZ07、GD18和GD191。
- 如請求項1-3中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述野生型CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 9-12的胺基酸序列。
- 如請求項1-4中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述CSFV E2蛋白的6B8表位被6B8單株抗體特異性識別和/或結合,所述6B8單株抗體 (i)由在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC的融合瘤產生,或 (ii)包含具有如SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V H)、以及具有如SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V L),或 (iii)包含由融合瘤產生的單株抗體的CDR,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC,或 (iv)包括包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的VH CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。
- 如請求項1-5中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸至少包含在CSFV E2蛋白的位置14、位置22、位置24、位置24/25、位置10、位置41和/或位置64處的胺基酸。
- 如請求項1-6中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中包含界定CSFV E2蛋白的6B8表位的至少一個胺基酸的片段是CSFV E2蛋白的B/C結構域或其片段。
- 如請求項1-7中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中 i)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列; ii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列; iii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列; iv)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列; v)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列; vi)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列;或 vii)CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置110的序列 被取代為來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白的相應序列。
- 如請求項1-8中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述除CSFV外的瘟病毒選自包含BVDV-2的牛病毒性腹瀉病毒;包含Switzerland、BDV-1、BDV-2、BDV-3、BDV-4、BDV-5、BDV-6、Chamois、Italy、Turkey和突尼斯綿羊病毒(TSV)的邊境病病毒;以及包含長頸鹿瘟病毒、BVDV-3、Pronghorn antelope、Bungowannah病毒和褐鼠瘟病毒的非典型瘟病毒。
- 如請求項9的重組CSFV E2蛋白,其中所述除CSFV外的瘟病毒選自長頸鹿瘟病毒PG2毒株、BDV-2 Reindeer V60、褐鼠瘟病毒分離株NrPV/NYC-D23、TSV9552、Bungowannah 6778和BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen。
- 如請求項1-10中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述來自除CSFV外的瘟病毒的E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 21-27的胺基酸序列。
- 如請求項1-11中任一項的重組CSFV E2蛋白,其包含在界定CSFV E2蛋白的6B8表位的胺基酸位置處的至少一個胺基酸殘基,其特異性抑制6B8單株抗體與CSFV E2蛋白的結合。
- 如請求項1-12中任一項的重組CSFV E2蛋白, i. 其中所述重組CSFV E2蛋白包含在如表1至7中定義的胺基酸位置處的胺基酸突變, ii. 其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的, iii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的,以及在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D、K、L、N、R、T和V是優選的, iv. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的, v. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的, vi. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置10處的胺基酸為A或P, vii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置41處的胺基酸為A、N或E,和/或 viii. 在所述重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中A、K和W是優選的。
- 如請求項1-13中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的;在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸分別為R、D或I,其中R是優選的,以及在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸分別為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D、K、L、N、R、T和V是優選的;在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的;並且在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A、R、Q、E、D、N、K、L、P、T、V或S,其中A、Q、D、E、N和S是優選的。
- 如請求項14的重組CSFV E2蛋白,其中在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R,在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D,在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K,並且在所述重組CSFV E2蛋白的位置22處的胺基酸為A。
- 如請求項1至15中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 27-48和71-74的胺基酸序列。
- 如請求項1至16中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中Fc片段例如豬Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白;優選地,所述Fc片段例如豬Fc片段連接到E2蛋白的C末端,優選經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。
- 如請求項17的重組CSFV E2蛋白,其中所述Fc片段包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。
- 如請求項17或18的重組CSFV E2蛋白,其中所述肽連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列。
- 如請求項17-19中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 49-70和75-78;優選地選自SEQ ID NO: 53、68和75;更優選地選自SEQ ID NO: 53和75的胺基酸序列。
- 一種重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列,所述胺基酸序列中包含界定6B8表位的至少一個胺基酸的片段被取代為BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段。
- 如請求項21的重組CSFV E2蛋白, 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置38的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置39的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置56的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置80的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置90的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定;或 其中所述CSFV E2蛋白的胺基酸位置11至胺基酸位置109的序列被取代為來自BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應序列,並且胺基酸位置的編號基於通過SEQ ID NO: 10顯示的CSFV野毒株QZ07的E2蛋白的胺基酸序列的位置編號進行確定。
- 如請求項22的重組CSFV E2蛋白,其中與BVDV3 Hobi樣Th/04 KhonKaen毒株的E2蛋白的相應片段相比,所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在位置10、14、22、24、25、24/25、41和/或64處的至少一個胺基酸突變;優選地,所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在如表1-7中定義的胺基酸位置處的胺基酸突變;優選地,其中所述重組CSFV E2蛋白進一步包含在重組CSFV E2蛋白的位置14、24、25或64處的一個單一胺基酸突變。
- 如請求項23的重組CSFV E2蛋白,其中 - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置14處的胺基酸為K、A、E、Q或R,其中K是優選的; - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置64處的胺基酸為A、S、E、D、G、H、T、L、P、K或W,其中K是優選的; - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置24處的胺基酸為R、D或I,其中R是優選的; - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中D是優選的; - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中N是優選的;或 - 在所述重組CSFV E2蛋白的位置25處的胺基酸為D、K、L、N、R、T、V、E或P,其中R是優選的。
- 如請求項21-24中任一項的重組CSFV E2蛋白,其中Fc片段例如豬Fc片段連接到重組CSFV E2蛋白;優選地,所述Fc片段例如豬Fc片段連接到E2蛋白的C末端,優選經由肽連接子連接到E2蛋白的C末端。
- 如請求項25的重組CSFV E2蛋白,其中所述Fc片段包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列;和/或所述肽連接子包含選自SEQ ID NO: 16-19的胺基酸序列。
- 如請求項26的重組CSFV E2蛋白,其中所述重組CSFV E2蛋白包含選自SEQ ID NO: 96-101的胺基酸序列或由其組成;優選地,所述重組CSFV E2蛋白包含SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列或由其組成。
- 一種重組核酸,其編碼如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白。
- 一種載體,其包含如請求項28的核酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項28的核酸或如請求項29的載體,優選地,所述宿主細胞是哺乳動物細胞,例如CHO細胞。
- 一種用於生產如請求項1-27中任一項的重組CSFV E2蛋白的方法,其包括 (i)在適合於表現CSFV E2蛋白的條件下,培養如請求項30的宿主細胞,和 (ii)分離並視情況地純化所述CSFV E2蛋白。
- 一種重組CSFV(經典豬瘟病毒),其包含如請求項1-27中任一項的重組CSFV E2蛋白。
- 如請求項32的重組CSFV,其中所述重組CSFV是減毒的。
- 一種免疫原性組合物,其包含如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白、如請求項28的重組核酸、如請求項29的載體、和/或如請求項32或33的重組CSFV。
- 如請求項34的免疫原性組合物,其中所述免疫原性組合物是疫苗,例如標記物疫苗或DIVA(受感染的動物和免疫接種的動物之間的區分)疫苗。
- 如請求項34或35的免疫原性組合物,其用於預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法中,所述方法包括將如請求項34或35的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。
- 一種預防和/或治療動物中與CSFV相關的疾病的方法,所述方法包括將如請求項34或35的免疫原性組合物施用於有此需要的動物的步驟。
- 一種區分感染CSFV的動物與用如請求項34或35中任一項的免疫原性組合物免疫接種的動物的方法,其包括 a)獲得樣品,和 b)在免疫測試中測試所述樣品。
- 如請求項38的方法,其中所述免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體或其抗原結合片段是否可以與樣品中的CSFV E2蛋白結合。
- 如請求項38或39的方法,其中所述免疫測試包括測試特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體是否存在於樣品中,和/或測試特異性識別重組CSFV E2蛋白的突變的6B8表位的抗體是否存在於樣品中。
- 如請求項38-40中任一項的方法,其中所述免疫測試是EIA(酶免疫測定)或ELISA(酶聯免疫吸附測定),優選雙重競爭ELISA。
- 如請求項39-41中任一項的方法,其中所述特異性識別6B8表位的抗體 (i)由在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC的融合瘤產生,或 (ii)包含具有如SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的重鏈可變區(V H)、以及具有如SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(V L),或 (iii)包含由融合瘤產生的單株抗體的CDR,所述融合瘤在登錄號CCTCC C2018120下保藏於CCTCC,或 (iv)包括包含SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的VH CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列的VH CDR2,包含SEQ ID NO:3中所示的胺基酸序列的VH CDR3,包含SEQ ID NO:4中所示的胺基酸序列的VL CDR1,包含SEQ ID NO:5中所示的胺基酸序列的VL CDR2,以及包含SEQ ID NO:6中所示的胺基酸序列的VL CDR3。
- 一種用於區分感染CSFV的動物與用如請求項34或35中任一項的免疫原性組合物免疫接種的動物的試劑盒,其包含特異性識別CSFV E2蛋白的6B8表位的抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於在CHO細胞中生產如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括 a)使CHO細胞適應培養基中的高密度懸浮培養; b)用包含編碼如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的適應的CHO細胞, c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞; d)收穫並視情況地純化所述重組CSFV E2蛋白。
- 一種用於在CHO細胞中生產如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白的方法,所述方法包括 a)使CHO細胞在培養基中生長至高密度懸浮培養物; b)用包含編碼如請求項1至27中任一項的重組CSFV E2蛋白的核酸分子的哺乳動物表現載體,轉染來自步驟a)的CHO細胞, c)在適合於表現重組CSFV E2蛋白的條件下,培養來自步驟b)的轉染的CHO細胞;和 d)收穫並視情況地純化所述重組CSFV E2蛋白。
- 如請求項44或45的方法,其中在步驟c)中,所述轉染的CHO細胞在約32-37°C,優選約32°C下進行培養。
- 如請求項44-46中任一項的方法,其中在步驟c)中,所述轉染的CHO細胞用約5-8% CO 2的濕潤環境進行培養。
- 如請求項44-47中任一項的方法,其中所述重組CSFV E2蛋白在轉染後約2-14天,例如,轉染後約4-12天,或轉染後約8-10天進行收穫。
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