KR100817264B1 - 구제역 바이러스 3ａｂ 비구조단백질과 이에 특이적으로반응하는 단일클론 항체 및 이들의 조합을 이용한 구제역바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단방법 - Google Patents
구제역 바이러스 3ａｂ 비구조단백질과 이에 특이적으로반응하는 단일클론 항체 및 이들의 조합을 이용한 구제역바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스 비구조단백질 3AB을 코딩하는 유전자를 대장균을 이용하여 발현한 재조합단백질과 구제역 바이러스의 비구조 단백질 3B의 특정 항원 결정부위(epitope)에 특이적인 반응성을 가지는 단일클론 항체를 생산하는 방법과 이를 통하여 생산된 단클론항체를 이용하여 구제역 바이러스 비구조단백질에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로, 구제역 바이러스의 단백질 중 동일성이 가장 높은 부위인 비구조단백질에 대한 항체 검출 방법으로 특히 항원결정부위 타겟팅(epitope targeting)을 통하여 구제역 바이러스의 모든 혈청형에 대해 검출이 가능하여 혈청형별 항체 검사를 수행하는 하는 번거로움을 해소할 수 있는 장점을 제공한다.
본 발명에 의한 진단방법은 구제역 바이러스 비구조단백질의 일부인 3AB 펩타이드 또는 재조합단백질과 3B의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 조합을 이용하여 동물의 구제역바이러스의 비구조 단백질에 대한 항체 존재여부를 정량적으로 검출하여 구제역 바이러스 감염을 진단할 수 있는 방법이다. 또한 이 기술은 구제역바이러스에 감염되는 대부분의 유제류에 대해서 각 축종별 이차항체를 따로 사용하는 번거로움 없이 항체 검출이 가능하며 이 기술을 이용하여 차단효소면역검사법 (Blocking ELISA), 경쟁효소면역검사법(Competitive ELISA) 등 다양한 검사기술에 사용하여 구제역 바이러스에 대한 감염항체를 검사할 수 있다.
구제역, 구제역 바이러스, 비구조단백질, 3AB, 단일클론 항체, 차단 효소면역검사법
Description
도 1은 항 히스티틴 항체(1 래인)와 본 발명에서 선발한 단일클론 항체(2 래인)의 재조합 단백질 3AB의 반응성을 웨스턴 블랏(Western blotting)을 이용하여 확인한 도면이고,
도 2는 본 발명에서 단일클론항체와 구제역 바이러스에 감염된 IB-RS 세포(A), 돼지수포병 바이러스에 감염된 IB-RS 세포(B), 수포성 구내염 바이러스에 감염된 IB-RS 세포(C) 및 감염되지 않은 IB-RS 세포(D)와의 반응성을 간접 형광항체법을 이용하여 확인한 도면이고,
도 3은 본 발명의 단일클론 항체를 이용한 구제역 바이러스의 진단방법을 간략하게 나타낸 흐름도이다.
본 발명은 구제역바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 한국분리주O/SKR/2002유래의 대장균 발현 재조합 3AB 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP) 및 3B단백질에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역(Foot and Mouth Disease; FMD) 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대장균에서 발현한 구제역바이러스 3AB 재조합 단백질과 3B에 대한 단일클론 항체를 이용하여 차단 효소결합면역측정법(Blocking Enzyme Linked Immunosorbent Assay; Blocking-ELISA)으로 바이러스 혈청형과 감염동물 종에 관계없이 구제역 항체 수준을 평가 할 수 있고, FMDV의 NSP에 대한 항체 검출법으로 구조단백질(Structural Protein, SP)이 제거된 백신을 사용할 경우 야외 감염에 의한 특이 3B항체를 신속하고 정확하게 감별 검사 방법에 관한 것이다.
구제역은 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 유제류에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병으로 아프리카, 아시아, 중동아시아, 남미를 포함한 세계적으로 발병하고 있다. 최근 키칭(Kitching) 등에 의하면 현재 아시아에서 유행하고 있는 구제역 바이러스는 혈청형 O의 남 아시아(South Asia topotype)에 속하며 국내에서도 2000년, 2002년에 발병하여 축산 농가에 심각한 경제적 피해를 유발하였다. 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 상이에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승하여 식욕이 저하되다가 결국 급성폐사 한다. FMD는 치사율이 55%에 달하고 전파율이 90%로 우리나라에서는 제1종 법정 가축 전염병으로 국제수역사무국(OIE)은 목록 A(list A) 질병으로 분류하고 있다.
구제역 바이러스는 피코르나비르내 아흐토바이러스(Picornavirnae, Aphtovirus)에 속하는 단일가닥의 양성 센스 RNA 바이러스(Single Strand Positive Sense RNA virus)로 8,500염기쌍를 가지고 있으며, 게놈(genome)은 1개의 단백질을 발현하고 바이러스 단백질분해효소(viral proteinase)에 의해서 바이러스 단백질은 절단되어 성숙 단백질로 되는 특징이 있다. 바이러스 외피는 VP1, VP2, VP3, VP4 단백질로 구성되며, 바이러스 복제 및 단백질 성숙에 관여하는 비구조단백질은 L, 3A, 3B, 3C, 3D, 2A, 2B, 2C등이 있다. 외피 단백질(Capsid protein 또는 SP)은 중화항체를 유도하지만 바이러스 혈청형에 따라 생성되는 항체의 특성이 상이하여 다른 바이러스형에 대한 교차 방어력이 생성되지 않는 특징이 있고, 비구조단백질(NSP)은 바이러스 복제 및 감염에 가장 중요한 역할을 하는 단백질로써 중화항체를 유도하지는 않지만 7종의 혈청형 바이러스에 대해서는 교차 반응성이 있는 것으로 알려져 있다. 이는 바이러스 외피를 둘러싼 외피 단백질보다 비구조단백질의 동일성이 높기 때문인 것으로 A. 칼비요(A.Calvijo) 등이 발표하였다.
구제역을 통제하기 위해서 구제역 비 발생지역 및 청정국에서는 비 백신 정책을 실시하고 구제역 발병 시 ring vaccination 같은 긴급백신정책과 살처분 정책을 실시하며, 구제역 발생국은 구제역 백신을 접종하여 예방하고 있다. 구제역 백신은 7종의 혈청형 ( O, A, Asia, C, SAT1, SAT2, SAT3 serotype)간에 각각 교차 방어력이 없어 국가별로 발병 가능성이 높은 바이러스 형을 선택한 후 세포배양을 통해 구조단백질를 바이러스 배양 상층액에서 정제 후 농축한 사독백신을 사용한다. 하지만, 영국에서 발병한 것 같이 교통수단의 발단, 수출입 교역의 증가, 불법적인 밀수입 등으로 인해 예측하지 못한 바이러스형에 의해서 발병의 가능성이 높 아지고 있고 또한, 소각 및 매몰에 의한 환경문제가 크게 대두되고 있다.
이에 유럽 구제역(EU-FMD) 과학 기술위원회에서는 구제역 예방을 위하여 백신을 사용하는 것을 권장하였고 백신 사용으로 인한 비 백신 국가와의 국제 무역관계에 대한 규정 개선과 백신 접종으로 인한 무증상 감염 축과 백신 접종 후 바이러스 존재 유무를 구별할 수 있는 방법 개발에 대해서도 권고하고 있다(F. Brown., Virus Res, 91, 3-7, 2003).
구제역 바이러스가 감염된 동물을 검출하는 방법은 프로방 검사를 이용하여 항원을 세포배양법 또는 RT-PCR을 이용하여 확인하고 있지만, 보균축에서는 샘플안에 존재하는 바이러스양이 적고, 감염 후 배출되는 바이러스 양은 점차적으로 감소하여 효율적으로 검출하지 못하는 단점이 있다고 S. 알렉산더센(S Alenxandersen) 등이 보고하고 있다. 하지만, 현재 사용 중인 구제역 백신의 제조 특성상 감염 세포내에서 발현되는 비구조단백질은 세포막에 포함되기 때문에 백신에 함유되지 않아 백신을 접종한 동물에서는 비구조단백질에 대한 항체는 생성되지 않는 특징을 이용하여 비구조단백질에 대한 항체 유무를 검사하면 백신 접종축과 야외 감염축을 감별할 수 있고 감염 후 7∼10일 사이에 비구조단백질에 대한 항체를 진단할 수 있다고 발표되었다(Bergmann et al., Am J Vet Res, 54, 825-831, 1993). 이러한 점 이외에도 비구조단백질은 구조단백질에 비해 훨씬 변이가 적어 여러 바이러스 혈청형에서 동일한 항원 결정기를 가지고 있어 모든 혈청형 바이러스 감염을 진단할 수 있는 장점도 있다.
구제역 바이러스의 비구조단백질을 이용한 진단법은 외국에서는 1997년 R.F.Meyer등은 FMDV A12바이러스의 2C,3D유전자를 곤충세포에서 발현하여 간접(Indirect) ELISA를 이용하여 평가하였고, FMDV O1/Kaufbeuren주의 2C, 3A, 3B, 3ABC유전자를 대장균에서 발현하여 I-ELISA를 통하여 백신축과 야외접종축을 구분할 수 있다고 발표하였다(D.K.J. Mackay et al., Vaccine, 16(5) 446-459,1997). 또한, K.J.Sorensen 등은 1998년, 2002년에 FMDV type C의 3AB유전자를 곤충세포를 이용하여 발현 후 정제한 기니아픽 구제역 항혈청을 이용하여 Blocking-ELISA를 이용하여 평가하였고, I.E.Bergmann등은 대장균에 발현한 3ABC단백질 항원을 이용한 I-ELISA사용하였고, 2004년도에는 A.Clavijo등은 FMDV O1/Campos/Brazil/58의 재조합 3ABC단백질과 정제한 기니아픽 항혈청을 이용하여 백신 접종 축과 야외 감염축을 구분할 수 있다는 것을 발표하였다. 또한, FMDV A12의 3AB단백질 서열을 합성한 펩타이드를 이용하여 감별하는 방법도 발표되었다(F.Shen et al., 17 ,3039 -3049, 1999).
국내에서는 구제역 비구조단백질을 이용한 구제역 진단방법은 구제역 바이러스 A24 크루이제이오 주(FMDV A24 Cruizeio)의 3D 재조합 단백질을 이용한 방법이 최 등(출원번호 10-2000-0017594)에 의해서 특허 출원되었으며, 2004년 권 등은 국내분리주 O/SKR/2000를 이용하여 3ABC유전자를 대장균과 곤충세포에서 발현 후 3A에 대한 단일클론항체를 이용하여 항원 트래핑 I-엘라이자(Antigen trapping I-ELISA)를 개발하여 발표하였다(C.H.Kweon et al., Vaccine 25,1123-1136, 2004).
또한, 조 등에 의한 3ABC단백질과 금 표지 단백질 (Gold mark Protein G)를 이용한 면역크로마토그래피(Immunochromatography)방법이 특허출원되었다(특허출원 번호 KR-2004-0095824). 엄 등은 재조합 2C단백질과 단일클론 항체를 이용한 Antigen trapping I-ELISA방법(특허출원번호 10-449906)과 국내분리주 O/SKR/2000과 O/SKR/2002바이러스를 이용하여 비구조단백질 중 2C, 3B의 특정 항원 결정부위를 분석하여 구제역 바이러스 진단에 사용될 수 있다고 특허출원하였다(특허출원번호 10-2004-10973).
이에, 본 발명자는 상기와 같이 구제역바이러스 비구조단백질에 대한 항체 검출방법을 개발하고자, 기존에 특허 출원되거나 보고된 여러 가지 구제역 단백질 중 구제역 바이러스 혈청형에 따라 항원결정기의 변이가 심한 구조단백질 대신 동질성이 높아 일정한 항원 결정기를 갖는 비구조단백질을 선택하였다. 또한 비구조 단백질 중에서도 비특이반응을 가장 적게 유래하면서 감염동물에서 재현성 있게 항체를 생성하는 단백질을 검토한 결과 3ABC, 2C, 3D 등을 배제하고 구제역바이러스 증식과정에서 안정적으로 코딩되면서 감염동물에 많은 항체반응을 유발하는 3AB를 코딩하는 유전자를 대장균 발현 시스템에서 발현시켜 제작한 재조합 3AB단백질을 개발하였다. 또한 이를 이용하여 면역한 마우스에 유래한 단클론 항체 중 3B의 특정 항원 결정기에 반응성이 있는 단일클론 항체를 개발하였다. 이들 3AB 유전자재조합 항원과 3B에 대한 특이 단일클론항체의 유효성을 확인하기 위하여 검사방법으로 Blocking-ELISA를 선택하였는데 이를 사용하면 여러 구제역 바이러스 혈청형에 의한 감염을 진단할 수 있고, 백신축과 야외 감염축을 기존에 보고되거나 출원된 기술에 비하여 현저하게 성능이 개선됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
또한, 종래의 기술에서 보고된 백신접종된 동물에서의 비특이 반응(Non-Specific Binding, Singletone Reactor)을 해결하고 높은 수준의 검출감도를 유지하는 검사법을 개발하고자 하였다. 엄 등에 의한 보고에 의하면 3B 항원결정기 부위가 백신 접종 동물과 야외 감염동물을 감별할 수 있는 것을 착안하여 이 부위에 반응하는 특이적인 단일클론 항체를 작성하고 이를 이용한 Blocking-ELISA를 개발함으로 비특이 반응을 획기적으로 개선시키고 진단효율이 높은 것을 입증하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스의 비구조단백질에 대한 감염동물의 항체를 진단하는데 효과적인 생물학적 마커와 단일클론항체 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 10848BP인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 구제역 바이러스의 서열번호 2와 3으로 표시된 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프와 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 제공한다.
또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구제역 바이러스의 단백질에서 서열번호 2와 서열번호 3으로 표시된 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프가 포함된 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 사용하여 구제역 바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단 방법을 제공한다.
또한, 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구제역 바이러스의 단백 질에서 서열번호 2와 서열번호 3으로 표시된 에피토프이거나 실질적으로 동일한 에피토프가 포함된 항원 또는 상기 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체가 포함되어 이루어지는 구제역 진단 시약을 제공한다.
나아가, 본 발명은 가검 시료와 구제역 바이러스의 단백질에서 서열번호 2와 서열번호 3으로 표시된 에피토프이거나 실질적으로 동일한 에피토프가 포함된 항원 또는 상기 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 반응시켜 항원-항체 반응을 사용한 구제역 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 구제역 바이러스에 대하여 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 개발하여 종래 항체의 비특이적인 반응으로 인한 비효율적인 점을 개선하고, 이의 개선된 단일클론 항체를 구제역 진단방법에 적용하여 구제역 바이러스에 대한 질병의 발병 유무에 대한 진단 효율을 향상시킨 것이다.
이때, 본 발명에서는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)를 항원으로서 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 생산하기 위해, 국내에서 분리한 O/SKR/2002(Gene Bank Access number AY312589)유래의 3AB 유전자를 대장균 발현 시스템을 이용하여 제작한 재조합 FMDV 3AB단백질을 사용한다.
또한, 본 발명은 구제역 바이러스 비구조단백질 3B에 특이적인 면역 반응성을 소유하고 있고 면역 클로블린 아형 IgG1인 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선발하여 사용하는 데, 선발된 세포주는 2005년 10월 5일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호를 KCTC 10848BP를 부여 받았다.
그리고, 본 발명에서 상기 단일클론 항체를 사용하여 구제역 바이러스의 감염 여부를 정량적으로 측정하여 진단할 수 있는 검출방법으로, 효소면역항체분석법 또는 방사선면역 분석법을 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 효소 면역항체분석법을 사용한다.
그리고, 상기 효소면역분석법을 보다 구체적으로 설명하자면, 하기의 단계를 포함하여 이루어진 경쟁적 효소결합면역분석법을 사용하는 것이 바람직하다.
(a) 구제역 바이러스 3AB 항원 단백질을 코팅 완충액에 희석하고 플레이트에 분주한 후 흡착하는 단계;
(b) 상기 (a)의 플레이트에 흡착되지 않은 재조합 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계 후, 상기 플레이트에 가검 시료를 첨가하여 반응시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 재조합 3AB 항원 단백질의 에피토프와 특이적으로 결합하지 않은 가검 시료를 제거하는 세척단계;
(e) 상기 (d) 단계 후, 상기 플레이트에 검출수단이 포함된 효소와 결합되어 있으며, 상기 에피토프에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 첨가하여 반응시키는 단계;
(f) 상기 (e) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 재조합 3AB 항원 단백질과 결합하지 않은 단일클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및
(g) 상기(f) 단계 후, 플레이트에 상기 (e)의 효소와 검출 반응을 하는 기질을 첨가하여 가검 시료의 구제역 바이러스 감염 여부를 평가하는 단계.
이때, 상기 가검 시료는 피검체로부터 채취한 생물학적인 시료를 말하는 데, 바람직하게는 세포간 체액이나 혈청을 사용하는 것이 바람직하고 구제역 바이러스의 항원 또는 상기 구제역 바이러스에 대한 자가 항체가 정제되도록 처리한 시료를 채취하여 사용한다.
하지만, 구제역 바이러스의 감염 여부를 검출하는 방법이 상술한 방법에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 본 발명에서 서열목록2와 3으로 표시되는 에피토프를 포함하는 항원과 피검체로부터 채취한 시료를 반응시켜 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 방법이라면 어느 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 단일클론 항체와 서열목록2와 3으로 표시되는 에피토프를 포함하는 항원을 이용하여 상기 방법으로부터 항원-항체 반응을 검출하여 구제역 감염여부를 진단할 수 있는 진단 키트를 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로는 상술한 경쟁적 효소결합면역분석법에 필요한 서열목록2와 3으로 표시되는 에피토프를 포함하는 구제역 바이러스 항원, 이와 반응하는 단일클론 항체 및 이들의 반응액과 상기 단일클론 항체와 연결된 효소와 반응하여 정량적으로 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
[실시예 1] FMDV O/SKR/2002유래의 유전자 재조합 3AB비구조단백질 작성
제 1 단계: 대장균 발현 재조합 벡터 작성
본 발명에서는 국내분리 구제역 바이러스 FMDV O/SKR/2002의 유전자(Gene Bank Access number AY312589)으로부터 3AB를 코딩하는 유전자를 획득하였다. 즉, 국내분리 구제역 바이러스 FMDV O/SKR/2002의 유전자에 3AB유전자 증폭을 위하여 한쌍의 프라이머(Jeno 103 : 5'-CACCATCTCAATTCCTTCCCAAAAGGC-3'; Jeno 104 :5'-CTCAGTGACAA TCAAATTCTTAGC-3')를 사용하고 역전사 중합효소연쇄반응( Reverse Transcription Polymerse Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하여 증폭한 후, 증폭된 DNA를 pBAD102/Direction TOPO(Invitrogen USA)와 라이게이션하여 재조합 벡터 p-BT 3AB를 작성하였고 E.coli DH5-α 세포에 도입하여 형질전환한 다음 아가플레이트에서 배양하고 형성된 콜로니에서 플라스미드를 분리한 다음 3AB유전자를 전기영동을 통해 확인하였다.
제 2 단계: 구제역 바이러스 3AB 단백질의 생산
pBT 3AB를 생산하는 대장균 세포는 LB 액상배지에서 진탕배양하면서 대량 증 식하였으며 260nm에서 0.5∼1.0의 흡광도를 보일 때, 아라비노스(Sigma, USA)를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 그 후 대장균을 수확하여 라이소자임(lysozyme)을 처리하고 수초간 초음파 처리하여 재조합 단백질을 용출시키고 고속으로 원심(10,000g 10분)분리 후 대장균 세포 부산물을 제거하여 재조합 단백질을 추출하였다. 그런다음, 발현된 단백질은 Ni-NAT 아가로즈(Qiagen, USA)와 결합 후 이미다졸(imidazole, Qiagen, USA)농도를 조절하여 재조합 단백질을 정제하였다.
[실시예 2] 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 작성
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주은 코헬 G와 밀스테인 C( Kohler G and Milstein C., Nature 256, 495-497, 1975)의 방법에 의하여 획득하였으며, 이하 그 과정을 간략히 기술하면 다음과 같다.
종양세포주(Myeloma cell line)인 SP2/O-Ag14(한국생명공학연구원 생물자원 센타, KCTC : Korea Collection for Type Culture, Korea)에서 구입 후 10% 우태아 혈청이 첨가된 DMEM (GibcoBRL, USA)배지를 이용하여 5% 탄산가스가 공급되는 배양기에서 37℃로 배양하였다. 상기 실시예 1의 재조합 3AB 비구조단백질 항원을 0.01M의 인산완충액에 희석(200ug/ml)하여 인컴프리트 프로이드 에주벤트(Incompleted Freund's Adjuvant, Sigma, USA)와 동량으로 균질하게 혼합하여 6주령의 BALB/C 마우스(오리엔트, 한국)의 근육에 접종하였다.
면역 후 2주, 4주 후에 동량의 항원을 추가 면역 후 마우스의 비장을 무균적으로 채취하여 마쇄한 후 림프구만을 회수하였다. 분리한 림파구와 종양세포를 PEG 1500(Sigma, USA)를 사용하여 림파세포가 종양세포가 융합되도록 유도하였다. 그리 고, 융합이 완료된 세포는 HAT(Hypoxanthin Aminopterin Thymidine, GibcoBRL, USA)를 우태아 혈청에 10% 첨가된 DMEM 선택배지에 적당히 희석한 후 96웰(Well) 조직배양 플레이트에 융합된 세포를 분주하여 배양하였고 2주후 상층액을 검사하고 양성반응이 있는 세포주를 희석하여 96웰의 조직 배양플레이트에서 클로닝하였고 선발과정을 간략히 기술하면 다음과 같다.
실시예 1에서 제작한 pBT3AB를 카르보네이트 비카보네이트 완충액(Carbonate bicaonate buffer, Sigma USA 적확한 명칭을 확인해 주시기 바랍니다)에 적당량 희석하여 엘라이자 플레이트(Greiner, Germany)에 흡착시켜 고정시킨 후, 상기에서 제작한 잡종세포 상층액을 각각 1시간 동안 반응을 시켰다. 그런 다음, 인산완충액으로 4회 세척하고, 항 마우스 HRP 콘주게이트(KPL,Germany)을 1시간동안 반응하였다. 인산 완충액으로 4회 세척하고 TMB(3',3',5',5',- Tetramethyl benzidine, Moss Inc, USA) 발색제를 첨가하여 10분간 발색반응을 시키고 반응정지액(0.5M H2SO4, Sigma, USA)를 첨가하여 발색반응을 정지시킨 후, 판독기(ELISA Reader, EMAX, Molecular device, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 단백질과 대장균 대조항원간의 흡광도 비율이 2.0 이상인 잡종세포주를 선정하여 클로닝하였다.
그런 다음, 상기의 선정방법을 3회 반복하여, 구제역바이러스 비구조단백질 3AB에 특이적이고 항체-항원 반응성이 우수한 세포주를 선정하였고, 실시예 1의 재조합 단백질을 전기영동하여 분리 한 후 웨스턴 블랏(Western Blot)을 실시한 결과, 도1에 나타난 바와 같이, pBT3AB 단백질에 특이적으로 반응하는 것을 알 수가 있었다.
[실시예 3] 간접 형광항체법을 이용한 구제역바이러스(O/SKR/2002)에서의 반응성 확인
구제역 바이러스에 대한 단일클론항체의 특이성을 확인하기 위하여 간접 면역 형광항체 기술(Indirect immunofluorescent antibody technique :IFA)을 이용하였다. 구제역바이러스 O/SKR/2002를 IBRS 세포에 접종하고 3∼4일간 배양한 후, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 1회 세척하고 아세톤/증류수(80:20)로 5분간 실온에서 고정하였다. 그리고, 고정된 세포는 상기 실시예 2에서 제작된 세포상층액을 실온에서 1시간 반응시킨 후 항-마우스 IgG FITC(플루오로세인 이소티오시아네이트; KPL사)와 반응하여 형광현미경으로 관찰하여 구제역 바이러스와 반응성을 확인하였다.
또한, 교차반응성을 확인하기 위해 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Somatitis Virus,VSV)의 뉴저지주(New Jersey Strain) 및 인디아나주(Indiana strain)와 돼지수포병 바이러스(Swine Vesicular Disease Virus, SVDV) 표준주를 감염시킨 세포를 동일한 방법으로 특이 반응성을 확인하였다.
이의 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 단일클론 항체는 구제역바이러스가 감염된 세포(도2,A)에서는 반응성이 있고, VSV(도2 B), SVDV(도2,C)하고는 교차 반응성이 없는 것으로 확인되어 단일클론 항체 5B27는 구제역 바이러스와 특이적으로 반응을 하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4 : 단일클론 항체의 특이 항원 결정부위 분석 및 확인
본 발명의 단일클론항체의 항원결정부위를 확인하기 위하여 엄 등에 의한 3B항원 결정 부위를 오브알부민이 결합된 합성펩타이드를 제작(페트론, 한국)하여 반응성을 확인하고자 하였다.
먼저, 합성 펩타이드를 적당량을 Carbonate bicaonate buffer(Sigma USA)에 희석하여 엘라이자 플레이트(Greiner, Germany)에 흡착시켜 고정시킨 후, 상기에서 제작한 잡종세포 상층액을 각각 1시간 동안 반응을 시켰다. 그런 다음, 인산완충액으로 4회 세척하고, 항 마우스 HRP 콘주게이트(KPL,Germany)을 1시간동안 반응하였다. 인산 완충액으로 4회 세척하고 TMB(3',3',5',5',- Tetramethyl benzidine, Moss Inc, USA) 발색제를 첨가하여 10분간 발색반응을 시키고 반응정지액(0.5M H2SO4, Sigma, USA)를 첨가하여 발색반응을 정지시킨 후 판독기(ELISA Reader, EMAX, Molecular device, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 항원 결정부위를 분석하였다.
이의 결과, 하기 표1과 같이, 본 발명의 단일클론 항체는 FMDV NSP 3AB중 3B02의 특정 항원결정기에 반응하는것을 알 수 있다.
[실시예 5] 재조합 pBT3AB 단백질과 3B에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 Blocking-ELISA
단계 1: 단일클론 항체 정제 및 HRPO 콘주게이션
상기 실시예 4에서 선발된 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(5B27)를 1X106세포/ml 배양하여 프리스텐(Pristrain, Sigma, USA)으로 감작(Priming)한 BABL/c 마우스 복강내에 주입 한 후 복수(Ascite)가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수는 10,000xg로 10분감 원심하여 수확한 후 상층액을 정제에 사용하였다. 복수에서 단일클론항체의 정제는 면역친화 크로마토그라피(Immunoaffinity chromatography)를 사용하였다. 이때, 사용된 친화컬럼에는 프로테인 A가 결합된 아가로즈 겔(Affiprep Protein A agarose, BioRad, Germany)이 충진된 것을 사용하였다. 그리고, 프로테인 A 아가로스 겔에 부착된 단일클론 항체는 용출 완충액(0.1M Citric acid, pH3.0)을 이용하여 순수한 단일클론 항체를 분리하고 이를 다시 증류수에 투석하였다. 그런 다음, 투석된 단일클론 항체는 동결건조기를 이용하여 농축한 다음, 퍼옥시다제 콘쥬게이션 키트(Roche, Germany)의 사용매뉴얼에 따라 단일클론항체와 결합하여 콘주게이션을 완성하였다.
단계 2: Blocking ELISA를 이용한 구제역 바이러스 항체 검사
실시예 1에서 제작한 재조합 pBT3AB단백질을 Carbonate bicarbonate buffer(Sigma USA)에 희석하여 엘라이자 플레이트(Greiner, Germany)에 100ul씩 분주한 다음 16시간 동안 4℃에서 흡착하였다. 흡착이 끝난 후 흡착되지 않는 재조합 단백질을 버린 후 트윈 20(Tween 20, BioRad, Germany)이 첨가된 세척액(0.05% PBST, pH 7.4)으로 3회 세척하고, 3% 소혈청 알부민(BSA, Moregate, Australia)을 첨가한 PBST를 재조합 단백질이 흡착된 플레이트에 200ul씩 분주하고 실온에서 2시간동안 반응하였다. 그런 다음, 검체시료의 혈청과 1% BSA 첨가된 10 mM의 인산완충액을 1:5의 비율로 혼합하여 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척액으로 3회 세척하고 상기 단계1에서 제작한 HRPO(horse radish peroxidase)가 결합된 단일클론항체를 적당량 희석하여 플레이트에 100ul씩 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 그런 다음, 세척액으로 4회 세척하고, TMB발색제를 첨가하여 15분간 발색반응을 시키고 반응정지액를 첨가하여 발색반응을 정지시킨 후 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과의 판정은 가검혈청의 흡광도와 음성대조 흡광도비율 값(SN Ratio Value)를 구하여 SN값이 0.60 이하일 때 양성으로, 0.60보다 크면 음성으로 판정하였으며, 검체 혈청의 SN값은 하기 식 1로 산출하였다.
[식 1]
SN ratio Value(SN)= [ 가검 시료의 평균 흡광도 / 음성대조의 평균 흡광도]
이의 결과, 하기 표 2에 구제역바이러스 혈청형에 대한 양성시료 검사결과를 나타내었다.
그리고, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 양성혈청, 백신혈청 및 야외 혈청 시료를 검사한 결과, 백신접종에 의한 항체와 야외 감염에 의한 항체를 축종별에 관계없이 유의성 있게 감별하는 것을 알 수 있었다.
또한, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 구제역 백신 접종에 의한 비특이반응에 대한 평가 결과에 따르면, 본 발명의 단일클론 항체의 특이반응성이 향상되었음을 알 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명에서 개발한 구제역 바이러스 O/SKR/2002 유래의 대장균 발현 재조합 pBT3AB 단백질 및 3B의 특정 항원결정기에 특이적인 단일클론 항체를 이용하여 차단 ELISA를 사용하여 확인한 결과 구제역바이러스 백신접종동물과 야외감염 동물을 매우 효과적으로 감별할 수 있으며, 동물종에 관계없이 검사가 가능한 방법으로 신속하고 간편하게 이용할 수 있는 효과가 있다. 또한, 구제역바이러스 백신접종에 의한 비특이 반응이 지금까지의 특허기술이나 보고에 비하여 현저하게 개선됨을 확인하였다.
따라서 본 발명에서 개발한 구제역바이러스 3AB 유전자재조합 항원과 3B 특이 단일클론항체와 이들의 조합을 이용하여 구제역 바이러스의 비구조 단백질에 대한 항체를 비특이 반응이나 백신항체에 의한 간섭 없이 정량적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하여 구제역 바이러스 3AB 유전자에 의하여 코딩되는 펩타이드는 비구조단백질에 대한 항체검사에 사용할 수 있는 결정적인 마커단백질이며 3B에 특이적인 단일클론항체를 사용하면 기술적으로 완전한 감별검사가 가능함을 최초로 확인하였다. 이들을 이용하면 본 발명에서 기술한 ELISA를 사용한 검사법 뿐만 아니라 향후 개발될 수 있는 여러 형태의 진보된 모든 검사기술에서 이 기술이 사용될 수 있다.
이 진단기술은 구제역이 발생하거나 백신을 실시하고 있는 지역 및 국가에서 가축의 예찰검사 등 광범위한 감염동물의 조사나 백신동물의 사후관리에 효과적이며 또한, 비발생지역이나 발생위험지역에서의 상시 예찰에서도 적합한 방법으로 구제역 예방 및 확산 억제에 기여하고 산업적으로 동물용 진단의약품으로 매우 유용한 기술을 제공한다. 현재 구제역 바이러스의 비구조단백질에 대한 항체를 신속하게 검사할 수 있는 진단의약품이 개발되지 않아 국내 및 구제역이 발생하고 있는 유럽, 중남미, 아시아, 러시아 등 세계시장에 수출을 추진할 수 있어 우리나라의 동물 질병 진단시약에 대한 기술력을 선양하고 외화를 획득하는데 일조할 수 있는 효과가 있다.
한편, 전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항들이 넓게 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 기탁번호 KCTC 10848BP인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 구제역 바이러스의 서열번호 2로 표시된 에피토프와 특이적으로 반응하는 단일클론 항체.
- 구제역 바이러스 3AB 단백질의 항원을 특이적으로 인식하는 제 1항 기재의 단일클론 항체를 사용하여 구제역 바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 구제역 바이러스는 구제역 바이러스 분리주 O/SKR/2002(AY312589)인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단 방법.
- 삭제
- 구제역 바이러스의 3AB 단백질과 제 1 항 기재의 단일클론 항체의 조합으로 구제역 바이러스의 비구조단백질 항체 검사 방법.
- 피검체로부터 채취한 생물학적 시료와 구제역 바이러스의 3AB 단백질 및 제 1 항 기재의 단일클론 항체를 반응시켜 항원-항체 반응을 검출하는 구제역 진단 키트.
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| 대한민국 공개특허 제10-2005-0082512호(2005.08.24.) |
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