KR20040062218A - 돼지콜레라 바이러스에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는하이브리도마 세포주, 및 단일클론항체를 이용한돼지콜레라 바이러스 검출법 - Google Patents
돼지콜레라 바이러스에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는하이브리도마 세포주, 및 단일클론항체를 이용한돼지콜레라 바이러스 검출법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지콜레라바이러스( Classical Swine Fever Virus: CSFV)에 대한 단일클론항체들과 이를 생산하는 세포주들, 상기 단일클론항체들을 이용한 돼지콜레라 바이러스 검출법 및 진단 키트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 돼지콜레라 바이러스에 특이하게 반응하는 코팅용 단일클론항체를 면역플레이트에 코팅하여 부착하고 상기에서 제작한 단일클론항체에 효소를 콘쥬게이션시켜 얻은 검출용 단일클론항체와 전처리한 시료를 반응시켜 시료 내에 돼지콜레라 바이러스의 존재 유무를 신속, 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지콜레라 바이러스(Classical Swine Fever Virus; CSFV)에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 단일클론항체를 이용한 돼지콜레라 바이러스 검출법 및 진단 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 돼지콜레라 바이러스 검출법에서는 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 코팅용 단일클론항체를 면역플레이트에 부착시키고 단일클론항체에 효소를 콘쥬게이션하여 제작한 검출용 단일클론항체를 시료와 반응시키는 구성을 취함으로써 시료 내의 돼지콜레라 바이러스 존재 유무를 신속하고 정확하게 진단하고 있다.
돼지콜레라 바이러스는 돼지콜레라 질병의 원인체로서 전염성, 폐사율 및 이환률이 매우 높으며, 또한 감수성이 높아서 모든 연령의 돼지를 감염시킬 수 있다. 감염된 돼지는 일반적으로 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구마비, 유사산 등의 번식장애 등을 수반한다. 돼지콜레라 바이러스는 돼지가 유일한 자연 숙주로서 바이러스의 중요 전파원인이다. 감염된 돼지와 감수성이 있는 돼지의 직접적인 접촉이 주된 전파경로이다. 감염된 돼지는 질병 발생 전에 바이러스를 배출하기 시작하여 질병의 진행 기간동안 지속적으로 바이러스를 배출한다. 또한 바이러스는 주로 경구, 비강, 눈물, 뇨, 분변으로 배출되며, 돼지콜레라 질병에서 회복된 돼지들은 특이 항체가가 형성될 때까지 바이러스를 지속적으로 배출한다. 따라서 강독주 바이러스에 감염된 돼지는 10~20일 동안 다량의 바이러스를 배출하고 낮은 독력의 바이러스 감염은 바이러스 배출기가 매우 짧으며, 그 결과 강독주 CSFV는 한 돈군에서 급속도로 전파되고 높은 이환율을 나타낸다. 만성 감염된 돼지는 죽을 때까지 지속적으로 또는 간헐적으로 바이러스를 배출하고 낮은 독력의 바이러스에 감염된 임신 돼지는 초기에는 불현성을 나타내나, 자궁내에서 태아에게 전파되어 사산이나 허약자돈을 분만하는 등 여러 가지 증상을 보이고, 자돈은 출생 후 곧 죽게 된다. CSFV는 태아에서 지속적으로 분비되기 때문에 분만시 많은 양의 바이러스가 전파된다. 선천적으로 감염된 자돈이 건강하다면, 몇 달 동안 생존가능하다고 하지만 그 감염이 인정되기는 힘들고, 또한 지속적인 바이러스의 전파 원인으로서 CSFV는 근절되기 전까지 수개월 동안 돈군에 질병을 전파한다. 감염은 종 돈장에서부터 전염되거나 많은 돼지들이 모이는 장소에서 오염매개체를 통해 새로운 농장의 돼지에게 전파된다.
돼지콜레라는 1830년 미국에서 처음 발생된 이래 전 세계적으로 발생하였으나 최근에는 박멸정책에 의해 미국, 캐나다, 영국, 아이슬란드, 아일랜드, 스칸디나비아 3국, 뉴질랜드, 호주 등에서는 발생하지 않는 것으로 보고되고 있다. 우리나라에서는 1947년 서울 근교농장에서 발생한 것이 공식적으로 보고되었으며 이후 돼지콜레라 순화 생독 바이러스인 LOM주(株)로 제조한 생독 백신으로 예방접종을하고 있으며 최근 2년간은 돼지콜레라 질병 재발생이 없었다. 국제수역사무국(OIE) 기준에 따르면 돼지콜레라 발생국은 콜레라가 마지막으로 발생한 뒤 1년 동안 추가로 발생하지 않을 경우 예방접종 중단 6개월 이후 청정화를 선포할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같이 심각한 상황을 초래시키는 돼지콜레라 바이러스의 존재 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 방법을 제공하고자 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 돼지콜레라 바이러스에 대한 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체와 단일클론항체에 효소를 콘쥬게이션하여 제작한 검출용 단일클론항체를 이용하여 돼지콜레라 질병이 의심되는 돼지로부터 채취한 시료를 검사함으로써 바이러스 존재 여부를 3시간 이내에 진단하는 방법을 개발하였다. 즉, 기존에는 돼지콜레라 바이러스 검출방법으로 3 내지 5일이 소요되는 바이러스 세포배양법이나 숙련된 기술력이 필요한 유전자 증폭법을 사용하였는데, 본 발명에 따른 방법을 이용하면 특별한 기술이 없이도 단시간 내에 진단이 가능하고 대량의 가검물의 항원존재 여부를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 돼지콜레라 바이러스에 대한 코팅용 단일클론항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 돼지콜레라 바이러스에 대한 검출용 단일클론항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 검출용 단일클론항체에 효소를 콘쥬게이션 하여 돼지콜레라 바이러스의 존재 여부를 진단하는 방법 및 이러한 목적에 사용되는 진단키트를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 단일클론항체를 이용하여 개발된 간접효소결합 면역측정법을 이용하여 돼지콜레라 바이러스를 검출하는 방법을 도식화한 것이고;
도 2는 본 발명에 따른 단일클론항체를 이용하여 돼지콜레라 바이러스를 간접형광 항체화학법으로 검출한 결과도이며;
도 3은 단일클론항체와 돼지콜레라 바이러스주와의 반응관계를 나타내는 표이고;
도 4는 실시예 1에서 얻은 항돼지콜레라 바이러스 코팅용 단일클론항체를 이용하여 돼지콜레라 바이러스에 대한 특이도를 확인한 결과이며;
도 5는 실시예 1에서 얻은 항돼지콜레라 바이러스 코팅용 단일클론항체를 이용하여 조직 배양 바이러스의 민감도를 측정한 결과이고;
도 6은 실시예 1에서 얻은, 돼지콜레라 바이러스 항원 검출을 위한 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체의 최적흡착농도 결정표이며;
도 7은 돼지콜레라 바이러스 항원 검출을 위한 항돼지콜레라 바이러스 퍼록시데이스 콘쥬게이트의 최적 농도 결정표이고;
도 8은 돼지콜레라 바이러스 항원을 검출하기 위한 판정기준 설정표이며;
도 9는 돼지콜레라 바이러스 항원을 검출하기 위한 TG-ROC 분석표이다.
상기 본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 하기 실시예에 구체적으로 기재한 바와 같이 돼지콜레라 바이러스에 대한 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체 및 검출용 단일클론항체를 제작하고, 검출용 단일클론항체와 퍼옥시다제의 콘쥬게이트를 제조하였으며, 이들을 사용한 효소결합 면역측정법으로 시료 내의 돼지콜레라 바이러스를 검출하는 방법을 개발하였다. 이러한 방법에 따라 시료 내의 항원 존재여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
즉, 본 발명에 따라 효소결합 면역측정법을 이용한 돼지콜레라바이러스 진단방법은,
(1) 돼지콜레라 바이러스를 포획할 수 있는 코팅용 단일클론항체를 코팅완충액으로 희석하고 엘라이자 플레이트에 분주한 후 흡착시키는 단계;
(2) 플레이트에 흡착되지 않은 단일클론항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 플레이트에 검사하고자 하는 가검물을 반응시키는 단계;
(4) 코팅용 단일클론항체에 포획되지 않은 가검물을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 검출용 단일클론항체와 효소의 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;
(6) 결합하지 않은 콘쥬게이트를 세척하여 제거하는 단계; 및
(7) 기질을 첨가하여 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고 돼지콜레라 바이러스 존재여부를 확인하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 한다. 본 발명에 따른돼지콜레라 항원의 검출방법은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
또한, 상기 본 발명에 따른 검출방법에 따라 돼지콜레라 바이러스를 진단하기 위한 키트는 (ⅰ) 본 발명에 따른 코팅용 단일클론항체, (ⅱ) 본 발명에 따른 검출용 단일클론항체와 퍼록시데이스의 콘쥬게이트, 및 (ⅲ) 퍼옥시데이스 효소에 대한 기질을 포함하여 구성됨을 특징으로 하며, 본 발명은 이러한 진단 키트를 제공함을 또 다른 목적으로 한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 코팅용 단일클론항체의 제작
단계 1: 면역용 항원단백질의 제조
마우스 면역용 항원으로 돼지콜레라 바이러스 1×104TCID50/㎖(LOM Strain, 한국의 vaccine strain임)를 돼지신장세포(PK-15, ATCC CRL-1542) 4×105Cells/㎖에 접종하여 탄산까스 배양기 (37℃)에서 4일간 배양하였다. 세포와 상층액을 수확하여 동결 융해를 3회 반복한 다음 6000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 수확된 상층액을 10배씩 단계적으로 희석하여 96 Well Plate에 50㎕씩 분주하고 혈청이 첨가되지 않은 배지 50㎕씩 넣은 다음 돼지신장세포를 최종적으로 50㎕씩 첨가하여 탄산까스 배양기(37℃)에서 4일간 배양한 후 간접 면역효소화학법(Neutralizing Peroxidase Linked Assay, NPLA)으로 염색하여 바이러스 역가를 측정하였다 (역가 측정결과 : 107TCID50/㎖). 또한 수확된 상층액에 Binaryethyleneimine (BEI, sigma) 0.001%를 첨가하여 37℃에서 밤새 배양하여 바이러스를 불활화하였다. 불활화의 확인은 불활화 배양액을 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하고, 상층액을 상기 돼지콜레라 바이러스 역가측정법과 동일한 방법으로 10배씩 단계적으로 희석하여 돼지신장세포에 접종하고 탄산까스배양기에서 4일간 배양한 후, 간접 면역효소화학법(NPLA)으로 염색하여 염색이 전혀 되지 않았을 때 바이러스 증식이 전혀 되지 않는 것으로 즉, 바이러스가 불활화된 것으로 확인하였다.
단계 2 : 단일클론항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스 면역
단계 1에서 제조된 항원단백질을 incomplete adjuvant(Gibco BRL사)와 동량(부피비로 1:1)으로 혼합한 다음 BALB/C(암컷, 5~6 주령) 마우스의 뒷다리 발바닥에 100㎕씩 주사하였다. 면역후 14일째(10-15일 사이이면 된다)에 서혜임파절을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
단계 3: 골수세포주 배양
세포융합하기 4~5일 전에 질소통에서 myeloma 세포인 SP2/O-Ag14 (ACTC CRL-1581)를 꺼내 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM(Gibco BRL사) 배지에 현탁시키고 500xg에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전세포를 조심스럽게 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM에 다시 현탁시켜 5% 탄산까스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
단계 4: 세포융합
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법 (Ed Harlow, David Lane : Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 바이러스에 의해 마우스를 면역시킨 후 14일째에 마우스의 서혜임파절에서 림프절을 적출하였다. 적출한 서혜임파절에서 임파세포를 cell strainer(Falcon)를 이용하여 분리하고 108세포/㎖의 농도로 희석하였다. 107세포/㎖의 myeloma 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma)을 동량으로 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma) 배지에 희석시킨 후 96 웰 조직 배양 플레이트에 융합된 세포를 분주하였다.
단계 5: 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 생산하는 세포주의 선발
돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 단일클론항체의 선발은 간접 면역형광 항체기술(Indirect immunofluorescent antibody technique :IFA)로 확인하였다. 단계 1에서와 같이, 돼지콜레라 바이러스를 돼지신장세포에 접종하고 탄산까스 배양기(37℃)에서 4일간 배양한 후 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.2)로 세포를 1회 세척하였다. 세척한 세포를 아세톤/증류수(80:20)로 5분간 실온에서 고정시켰다. 고정된 세포에 단계 4에서 제작된 융합세포가 분비된 세포상측액을 수거하여 그 자체를 반응액으로 올린 다음 실온에서 1시간 반응시킨 후 항-마우스 IgG FITC(플루오로세인 이소티오시아네이트; KPL사)를 10㎍/㎖의 농도로 가하여 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.2)로 5분씩 3회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하여 돼지콜레라바이러스와 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 선발하였다(도 2 참조). 상기 선발방법을 3회 반복하여 돼지콜레라 바이러스에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 세포주를 선발하였으며 세포주는 2002년 10월9일자로 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁명: CSFV-LOM 1; 기탁번호 KCLRF-BP-00069).
단계 6: 단일클론항체의 복수생산
단계 5에서 선발된 단일클론항체 생산 세포주 (CSFV-LOM 1)를 배양하여 프리스텐(sigma사)으로 프라이밍(priming)한 BALB/C (암컷, 10~12 주령) 마우스의 복강내에 1x106세포/㎖의 농도로 0.5㎖ 주입하고 마우스의 복강내에 복수가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수를 10,000xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 수확하여 최적 희석농도를 check-borad titration을 이용하여 결정한 후(D.M. Kemeny and S.J. Challacomble ; ELISA and others solid phase immunoassay : Theroretical and Practical Aspects. A Wiley Medical Publication. 1988)(도 6 참조) 이를 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체로 사용하였다.
도 6에서 바이러스는 CSFV의 LOM Strain 이고, RK-15 cell은 돼지신장세포(입수처 : ATCC CRL 1542)이다.
실시예 2: 검출용 단일클론항체의 제작
단계 1: 면역용 항원단백질의 제조
마우스 면역용 항원으로 돼지콜레라 바이러스 1×104TCID50/㎖ (LOM Strain, 한국의 vaccine strain임)를 돼지신장세포(PK-15, ATCC CRL-1542) 4×105Cells/㎖에 접종하여 탄산까스 배양기 (37℃)에서 4일간 배양하였다. 세포와 상층액을 수확하여 동결 융해를 3회 반복한 다음 6000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 수확된 상층액을 10배씩 단계적으로 희석하여 상기 실시예1 단계1의 돼지콜레라 바이러스 역가측정법과 동일한 방법으로 돼지신장세포에 최종적으로 50㎕씩 첨가하여 탄산까스 배양기(37℃)에서 4일간 배양한 후 간접 면역효소화학법(Neutralizing Peroxidase Linked Assay, NPLA)으로 염색하여 바이러스 역가를 측정하였다 (역가 측정결과: 107TCID50/㎖). 또한 수확된 상층액에 Binaryethyleneimine (BEI, sigma) 0.001%를 첨가하여 37℃에서 밤새 배양하여 바이러스를 불활화하였다. 불활화의 확인은 불활화 배양액을 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하고, 상층액을 상기 실시예1 단계1의 돼지콜레라 바이러스 역가측정법과 동일한 방법으로 10배씩 단계적으로 희석하여 돼지신장세포에 접종하고 탄산까스배양기에서 4일간 배양한 후, 간접 면역효소화학법(NPLA)으로 염색하여 염색이 전혀 되지 않았을 때 바이러스 증식이 전혀 되지 않는 것으로 즉, 바이러스가 불활화된 것으로 확인하였다.
단계 2 : 단일클론항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스 면역
단계 1에서 제조된 항원단백질을 incomplete adjuvant(Gibco BRL사)와동량(1:1 Volume)으로 혼합한 다음 BALB/C(암컷, 5~6 주령) 마우스의 됫다리 발바닥에 100㎕씩 주사하였다. 면역후 14일째에 서혜임파절을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
단계 3: 골수세포주 배양
세포융합하기 4~5일 전에 질소통에서 myeloma 세포인 SP2/O-Ag14 (ATCC CRL-1581)를 꺼내 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM(Gibco BRL사) 배지에 현탁시키고 500xg에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전세포를 조심스럽게 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM에 다시 현탁시켜 5% 탄산까스가 공급되는 37?? 배양기에서 배양하였다.
단계 4: 세포융합
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법 (Ed Harlow, David Lane. : Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor Laboratory press, 1988. P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 바이러스에 의해 마우스를 면역시킨 후 14일째에 마우스의 서혜임파절에서 림프절을 적출하였다. 적출한 서혜임파절에서 임파세포를 cell strainer(Falcon)를 이용하여 분리하고 108세포/㎖의 농도로 희석하였다. 107세포/㎖의 myeloma 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma)을 동량으로 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma) 배지에 희석시킨 후 96 웰 조직배양 플레이트에 융합된 세포를 분주하였다.
단계 5: 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 생산하는 세포주의 선발
돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 단일클론항체의 선발은 간접 면역효소화학법(NPLA)로 확인하였다. 단계 1에서와 같이 돼지콜레라 바이러스를 돼지신장세포에 접종하고 탄산까스 배양기(37℃)에서 4일간 배양한 후 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.2)로 세포를 1회 세척하였다. 세척한 세포를 아세톤/증류수(80:20)로 5분간 실온에서 고정시켰다. 고정된 세포를 단계 4에서 제작된 융합세포가 분비된 세포상층액을 반응액으로 사용하여 올린 다음 실온에서 1시간 반응시킨 후 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.2 )로 3회 세척하였다. 1㎍/㎖의 농도로 희석된 항-마우스 IgG HRP(홀스래디쉬 퍼옥시다제: KPL사)를 가하여 실온에서 1시간동안 반응시키고, 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.2 )로 3회 세척하였다. 0.01M PBS(pH 7.2)에 2㎍/㎖의 농도로 용해시킨 디아미노벤지딘(DAB, Pierce)과 0.03% H2O2를 이용하여 발색시켜 돼지콜레라 바이러스와 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 선발하였다. 상기 선발방법을 3회 반복하여 돼지콜레라 바이러스에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 세포주를 선발하였으며(도 3 참조) 세포주는 2002년 10월9일자로 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁명: CSFV-LOM 2; 기탁번호 KCLRF-BP-00070)
단계 6: 단일클론항체의 복수생산, 정제 및 퍼록시다제 콘쥬게이션
단계 5에서 선발된 단일클론항체를 생산하는 세포주 (CSFV-LOM 2)를 배양하여 프리스텐(sigma사)으로 프라이밍(priming)한 BALB/C (암컷, 10~12 주령) 마우스의 복강내에 1x106세포/㎖의 농도로 0.5㎖ 주입하고 마우스의 복강내에 복수가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수를 10,000xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 수확하여 이를 검출용 단일클론항체로 사용하였다. 단일클론항체는 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 정제하였다. 즉, 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(Bio-Rad)를 칼럼에 충진한 다음 복수에서 채취된 단일클론항체를 첨가하였다. 단백질 A-아가로스 비드에 부착된 단일클론항체를 용출완충액 (100mM glycine PH 3.0)을 사용하여 용출시킴으로써 순수한 단일클론항체를 분리한 다음 증류수에 투석하였다. 투석된 단일클론항체를 동결건조기로 농축시킨 다음 퍼록시데이스 콘쥬게이션용으로 사용하였다.
콘쥬게이션 단계에서는 2mg의 퍼록시데이스(Promega 사)를 증류수에 녹인 다음 0.1M 과요오드산나트륨(sodium periodate)을 첨가하고 실온에서 20분간 반응시켰다. 이를 1mM 소듐아세테이트 완충액(pH 4.4)에 투석하였다. 정제된 단일클론항체 4mg을 탄산염 완충액(pH 9.5)에 녹인 후 동량의 아세테이트 완충액에 투석된 퍼록시데이스 용액과 1:1 당량비로 혼합한 후 실온에서 2시간 반응시켰다. 소듐보로하이드라이드(4mg/㎖)을 5㎕ 첨가한 후 4℃에서 2시간 반응시키고 인산완충액(pH)에 투석하였다. 최적 희석농도를 결정하여(도 7 참조) 사용하였다.
도 7에서 바이러스는 CSFV의 LOM Strain이고, PK-15 Cell은 돼지신장세포(입수처 ATCC CRL 1542)이다.
실시예 3: 돼지콜레라 바이러스 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체와 퍼록시다제와 콘쥬게이트된 검출용 단일클론항체를 이용한 돼지콜레라바이러스의 검출
실시예 1에서 제작된 코팅용 단일클론항체를 0.15㎍/㎖의 농도로 0.05M 카보네이트 코팅완충액으로 희석하여 녹인 후 100㎕씩 엘라이자 플레이트에 분주하고 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 흡착반응 후 흡착되지 않은 단일클론항체는 세척액(트윈20 0.05%, 10mM 인산 완충액 pH7.2)으로 3회 세척하여 제거하였다. 비특이반응을 억제하기 위해서 1% 소혈청알부민과 5% 젤라틴을 포함한 10mM 인산 완충액(pH 7.2)을 코팅용 항체가 흡착된 플레이트에 300㎕씩 분주한 후 37??에서 2시간 동안 반응시켰다.
검사할 시료를 샘플처리 희석액 5% horse serum in TBST pH 7.3과 1시간동안 반응시켜 검사용 시료를 준비하고 엘라이자 플레이트에 시료를 50㎕씩 첨가한 다음 동량의 희석액 5% horse serum in TBST pH 7.3을 첨가하였다. 시료를 첨가한 플레이트를 90분간 37℃에서 반응시키고 세척액으로 5회 세척하였다. 검출용 단일클론항체를 희석액을 사용하여 1㎍/㎖의 농도로 희석하고 100㎕씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척액으로 5회 세척하고 발색제 TMB 기질(1.2mM 3,3; 5.5'-Tetramethylbenzidin. Moss 사) 용액을 100㎕씩 첨가하여 10분간 반응시킨 후 0.5M 황산 용액을 50㎕씩 첨가하여 발색을 정지시켰다. 발색을 정지시킨 후 10분 이내에 ELISA 리더(reader)를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과 판정에서 강양성대조 흡광도는 0.8이상이어야 하며, 약양성대조 흡광도는 0.35이상이어야 하고, 음성대조 흡광도는 0.30 이하이어야 한다. 시료 흡광도와 음성대조 흡광도의 차와 강양성대조 흡광도와 음성대조 흡광도 차의 비율을 계산하여 값이 0.20이상이면 양성, 0.15미만이면 음성으로 판정하고 0.15 이상 0.20 미만의 값은 의양성으로 판정하였다(도 8 및 9 참조).
도 8과 도 9는 양음성대조의 흡광도차와 시료가검물의 흡광도 비율을 계산하여 돼지콜레라 감염 양성시료와 음성시료들을 분석한 도입니다. 먼저 S/P-CP(%)는 시료의 흡광도를 음성대조의 흡광도차를 양음성대조 흡광도차의 비율로 %로 나타낸 값으로 쉽게 설명드리면 양성대조에 대한 시료의 흡광도 비율입니다. 즉 시료가 일정한 흡광도 비율이상을 나타내면 양성으로 판정하기 위한 일종의 수식입니다.
그리고, 흡광도 비율을 계산해서 시료가 진양성(True Positive), 진음성(True negative), 의양성(False Positive), 의음성(False Negative)인지를 얼마나 정확하게 구분하는지를 분석하기 위한 방법으로 도 8과 도 9방법을 이용합니다. 도 8은 특이도와 민감도를 수치를 표로 나타낸 것이고 도9는 TG-ROC는 특이도 값과 민감도 값의 변화를 그래프로 나타낸 도입니다. 이번 발명에서 양성을 20%이상, 음성을 15%이하, 그사이 값을 의양성으로 구분지은 것은 특이도(96.5%)와 민감도(100%)를 모두 높게 만족시키는 판정값을 도출하기 도 8과 도 9에 의해서 도출된 결과입니다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 돼지콜레라바이러스에 특이하게 반응하는 포획능이 있는 코팅용 단일클론항체, 그리고 검출용 단일클론항체에 효소를 콘쥬게이션시켜 얻은 검출용 단일클론항체를 사용하면 돼지콜레라 바이러스의 존재 여부를 신속, 정확하게 검출할 수 있으므로 양돈 산업에 있어 매우 유용한 가치를 갖는다.
Claims (7)
- 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 코팅용 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 CSFV-LOM 1 (기탁번호 KCLRF-BP-00069).
- 제1항에 따른 하이브리도마 세포주 CSFV-LOM 1 (기탁번호 KCLRF-BP-00069)로부터 제조된, 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 코팅용 단일클론항체.
- 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 검출용 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 CSFV-LOM 2 (기탁번호 KCLRF-BP-00070).
- 제3항에 따른 하이브리도마 세포주 CSFV-LOM 2 (기탁번호 KCLRF-BP-00070)로부터 제조된, 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 반응하는 검출용 단일클론항체.
- 제4항에 따른 검출용 단일클론항체를 퍼록시데이스와 콘쥬게이션시켜 수득된 검출용 단일클론항체와 퍼록시데이스의 콘쥬게이트.
- (1) 돼지콜레라 바이러스를 포획할 수 있는 코팅용 단일클론항체를 코팅완충액으로 희석하고 엘라이자 플레이트에 분주한 후 흡착시키는 단계;(2) 플레이트에 흡착되지 않은 단일클론항체를 세척하여 제거하는 단계;(3) 플레이트에 검사하고자 하는 가검물을 반응시키는 단계;(4) 코팅용 단일클론항체에 포획되지 않은 가검물을 세척하여 제거하는 단계;(5) 검출용 단일클론항체와 효소의 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;(6) 결합하지 않은 콘쥬게이트를 세척하여 제거하는 단계; 및(7) 기질을 첨가하여 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고 돼지콜레라 바이러스 존재여부를 확인하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스의 진단방법.
- (ⅰ) 제2항에 따른 코팅용 단일클론항체, (ⅱ) 제5항에 따른 검출용 단일클론항체와 퍼록시데이스의 콘쥬게이트, 및 (ⅲ) 퍼옥시데이스 효소에 대한 기질을 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스 진단용 키트.
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