CN106814152A - 一种油佐剂疫苗的破乳方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种油佐剂疫苗的破乳方法包括如下步骤：油佐剂疫苗与破乳剂混合，经分层后，得到水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。本发明提供的破乳方法破乳能力更强，能保证抗原主要分布于水相中，且水相与油相能完全分离，能真实反应出疫苗内有效抗原的含量及质量，抗原回收率可达90％以上。本发明的破乳方法破乳更完全，更迅速，破乳效率更高。

Description

一种油佐剂疫苗的破乳方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种油佐剂疫苗的破乳方法。
背景技术
现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。
当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析，然而现有的破乳方法及破乳剂并不适用于所有的油佐剂疫苗，使用传统破乳剂对油佐剂疫苗进行破乳，虽然能将疫苗破乳，但是其水相中的抗原含量极低。不同破乳剂的破乳效率与破乳效果层次不齐。
虽然业内已有破乳方法，但其效率和效果均不佳，传统的破乳方法破乳后会有种种问题，例如不同疫苗使用不同破乳剂、破乳不完全、水相和油相分界不清晰、水相中检测不到抗原等问题一直困扰着业界。如何去寻找一种通用且高效的破乳方法及如何使得疫苗内抗原进入水相成了业内亟待解决的问题。
中国专利CN 103088157B中提到在提取所述口蹄疫病毒RNA时，加入正戊醇作为破乳剂。但以正戊醇为破乳剂，其效率低，适用并不广泛，且针对合成肽疫苗时其水相中并不能检测到抗原组分，而本发明破乳时间短，在加入破乳剂后既能完成破乳，离心后取水相即可抽取水相，并能够明显提高抗原的回收。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种油佐剂疫苗的破乳方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种油佐剂疫苗的破乳方法，包括如下步骤：油佐剂疫苗与破乳剂混合，经分层后，得水相抗原样品；
所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。破乳后水相经液相色谱检测，抗原回收率可达90％以上。
优选地，破乳剂中有机溶剂选自乙腈、乙醇中的一种，酸选自三氟乙酸、盐酸中的一种。
优选地，油佐剂疫苗与破乳剂按体积比9:1～5:5进行混合。破乳剂含量过高会增加后续对水相样品冻干或浓缩的处理时间，过低则无法破乳。
优选地，所述破乳剂中酸与有机溶剂的体积比为(0.05～0.5)：100。
优选地，所述油佐剂疫苗包括口蹄疫疫苗。
优选地，所述破乳方法还包括将水相抗原样品进行冻干或浓缩处理，即得抗原样品；所述冻干的条件为：-80～-50℃温度下真空冷冻12～18h。
采用本发明的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原样品无需进一步纯化，即可直接用于抗原的定量定性检测。
在本发明中乙腈作为一种极佳的有机溶剂，对乳化膜有很强的溶解作用，能够将疫苗乳化膜溶解，从而释放出其中的抗原水相，抗原易溶于乙腈，乙腈与水互溶，能将抗原带入水相中。三氟乙酸类似催化剂，促进破乳，加速乳化膜的破解，减少乙腈的用量。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、相比于现有方法，本发明提供的破乳方法破乳能力更强，能保证抗原主要分布于水相中，且水相与油相能完全分离，能真实反应出疫苗内有效抗原的含量及质量，抗原回收率可达90％以上。
2、本发明提供的破乳方法适用性更广，可用于合成肽疫苗破乳后定性定量检测，也可用于灭活疫苗破乳后核酸检测。
3、破乳剂成分简单，破乳后水相中杂质含量较少，可直接进行检测，且对后续检测结果的干扰较低，重复性好。
4、破乳方法更简单，更易于推广，更快速、也更准确。
5、口蹄疫疫苗经过本发明破乳方法后，疫苗内抗原成分主要存在于水相中，而其他方式破乳其抗原成分主要分布于油相中。破乳更完全，更迅速，破乳效率更高。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为对比例1的方法破乳后水相中抗原浓度HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种口蹄疫疫苗的破乳方法，选用市售的猪口蹄疫疫苗与破乳剂混合，经分层后，得水相抗原样品。
所述破乳剂中有机溶剂选用乙腈，酸选用三氟乙酸，乙腈与三氟乙酸的体积比为100:0.05。取8ml待检疫苗置于离心管内，疫苗与破乳剂以体积比8:2混合，震荡混匀，在4℃条件下，以3000G离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相。经液相色谱分析后与疫苗中理论抗原浓度标准进行对比，其中，对疫苗中理论抗原浓度的HPLC检测图谱样品出峰位置进行积分，其积分信息如表1所示，样品中抗原含量以积分峰面积的形式体现，其积分峰面积为2738690。采用本实施例破乳方法破乳后得到的水相中抗原样品浓度的HPLC检测图谱样品出峰位置进行积分，其积分信息如表2所示，样品中抗原含量以积分峰面积的形式体现，其积分峰面积为1674252。经对比分析，使用本实施例方法抗原回收率为91.7％，相比于现有方法，抗原回收率大大提高。
表1
表2
注：疫苗由佐剂与抗原乳化，其佐剂与抗原的体积比为1:1，因此破乳后得到的水相为待检疫苗体积的50％，由于本实施例中破乳剂与水互溶，因此经本发明方法破乳后其水相体积较疫苗内水相多出破乳剂的体积，即稀释作用，因此本实施例中水相较理论水相(4ml)增多50％(2ml)，本实施例中破乳得到的水相检测的积分结果应计算稀释效应，即检测积分结果除以66.67％。
实施例2
本实施例涉及一种口蹄疫疫苗的破乳方法，市售的猪口蹄疫疫苗按照如实施1中的破乳方法进行处理，所不同之处在于：取5ml待检疫苗与破乳剂以体积比5:5混合。经液相色谱分析后，与疫苗中理论抗原浓度标准进行对比，使用该方法抗原回收率为90.3％。
注：疫苗由佐剂与抗原乳化，其佐剂与抗原的体积比为1:1，因此破乳后得到的水相为待检疫苗体积的50％，由于本实施例中破乳剂与水互溶，因此经本发明方法破乳后其水相体积较疫苗内水相多出破乳剂的体积，即稀释作用，因此本实施例中水相较理论水相2.5ml增多200％(5ml)，本实施例中破乳得到的水相检测的积分结果应计算稀释效应，即检测积分结果除以33.33％。
实施例3
本实施例涉及一种口蹄疫疫苗的破乳方法，将市售的猪口蹄疫疫苗按照如实施1中的破乳方法进行处理，所不同之处在于：所述破乳剂中有机溶剂选用乙醇，酸选用盐酸，乙醇与盐酸的体积比为100:0.33，取7ml待检疫苗与破乳剂以体积比7:3混合。经液相色谱分析后，与疫苗中理论抗原浓度标准进行对比，使用该方法抗原回收率为93.5％。
注：疫苗由佐剂与抗原乳化，其佐剂与抗原的体积比为1:1，因此破乳后得到的水相为待检疫苗体积的50％，由于本实施例中破乳剂与水互溶，因此经本发明方法破乳后其水相体积较疫苗内水相多出破乳剂的体积，即稀释作用，因此本实施例中水相较理论水相3.5ml增多85.7％(3ml)，本实施例中破乳得到的水相检测的积分结果应计算稀释效应，即检测积分结果除以53.85％。
对比例1
本对比例1提供了一种口蹄疫疫苗的破乳方法，将市售的猪口蹄疫疫苗按照如下方法破乳处理：
取待检疫苗置于离心管内，与正丁醇以体积比8:2混合，震荡混匀，在4℃条件下，以3000G离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，经液相色谱分析后与疫苗中理论抗原浓度标准进行对比，其回收率基本为零，如图1所示。
本对比例中使用疫苗与实施例中一致，为同一批次疫苗。仅以正丁醇破乳后，其水相中抗原含量基本为零。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种油佐剂疫苗的破乳方法，其特征在于，包括如下步骤：油佐剂疫苗与破乳剂混合，经分层后，得水相抗原样品；
所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的破乳方法，其特征在于，破乳剂中有机溶剂选自乙腈、乙醇中的一种，酸选自三氟乙酸、盐酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的破乳方法，其特征在于，油佐剂疫苗与破乳剂按体积比9:1～5:5进行混合。
4.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的破乳方法，其特征在于，所述破乳剂中酸与有机溶剂的体积比为(0.05～0.5)：100。
5.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的破乳方法，其特征在于，所述油佐剂疫苗包括口蹄疫疫苗。
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