CN110095425A - 口蹄疫146s的定量检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品质检技术领域，具体而言，提供了一种口蹄疫146S的定量检测方法及应用。本发明提供了的口蹄疫146S的定量检测方法，将待测样品先利用蔗糖密度梯度离心法检测，得到口蹄疫146S的初始含量A，再检测对应样品中粒径为28‑32nm的颗粒分布率B％，得到口蹄疫146S的最终含量为A×B％，对应样品为蔗糖密度梯度离心法中含有口蹄疫146S的蔗糖密度梯度层。该方法有效规避了细胞碎片、核酸、不完整的病毒颗粒、杂蛋白等对检测结果的干扰，真实反映完整病毒颗粒的含量并且更客观公正的反映完整病毒颗粒和免疫原性之间的关联性。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品质检技术领域，具体而言，涉及一种口蹄疫146S的定量检测方法及应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起偶蹄动物高度感染和造成严重经济损失的传染病,影响着全世界的畜牧业和国际贸易。世界范围内预防口蹄疫发生的有效方法是疫苗免疫，疫苗的生产过程中，各环节过程的控制都至关重要，其中准确定量完整的口蹄疫病毒离子(146S)尤为关键，146S抗原的含量直接决定了口蹄疫灭活疫苗的质量，因此准确，快速地检测出146S的含量具有重要的意义。
现有阶段针对口蹄疫完整病毒颗粒(146S)抗原的检测方法以蔗糖密度梯度离心法为主，该方法是将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内，经紫外分光光度计259nm检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰，根据仪器绘制的吸收峰图谱，通过计算吸收峰的面积得到146S抗原的含量。
该方法在实际检测过程存在一些不足，具体例如：
1检测结果不准，易受到干扰。抗原中可能含有的细胞碎片、核酸、不完整的病毒颗粒等均可对紫外分光吸收值产生影响，使得检测结果存在误差。
2检测结果与完整性、免疫原性相关性不佳。
鉴于上述两个存在偏差的因素，导致疫苗含量存在一定的出入，在分析疫苗产品质量与免疫效果上则会出现关联性不佳的可能。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种口蹄疫146S的定量检测方法，以缓解现有技术中口蹄疫146S含量检测不准确或操作繁琐并且成本高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述口蹄疫146S的定量检测方法在评估口蹄疫疫苗的抗原含量中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述口蹄疫146S的定量检测方法在制备口蹄疫疫苗中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种口蹄疫146S的定量检测方法，待测样品先利用蔗糖密度梯度离心法检测，得到口蹄疫146S的初始含量A，再检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％，得到口蹄疫146S的最终含量为A×B％；
所述对应样品为蔗糖密度梯度离心法中含有口蹄疫146S的蔗糖密度梯度层。
进一步地，所述对应样品通过如下方法得到：紫外分光光度计OD259检测，根据出峰时间确定蔗糖浓度并且根据出峰位置收集样品，得到所述对应样品。
进一步地，所述蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤：将待测样品进行蔗糖密度梯度离心，对沉降到相应密度梯度层的样品进行紫外分光光度计OD259检测，计算吸收峰面积，得到口蹄疫146S的初始含量A。
进一步地，所述颗粒分布率B％通过纳米粒径分布仪检测得到。
进一步地，检测对应样品的粘度和折光率后再进行纳米粒径分析仪检测。
进一步地，所述纳米粒径分析仪检测包括如下步骤：设定对应样品的粘度和折光率后，待检测基线稳定，检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％。
进一步地，所述纳米粒径分析仪为贝克曼库尔特DelsaMax PRO多角度Zeta电位及纳米粒径同步分析仪。
上述定量检测方法在评估口蹄疫疫苗的抗原含量中的应用。
上述定量检测方法在制备口蹄疫疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种口蹄疫146S的定量检测方法，该方法将待测样品先利用蔗糖密度梯度离心法检测，得到口蹄疫146S的初始含量A，再检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％，得到口蹄疫146S的最终含量为A×B％。该方法在蔗糖密度梯度离心法检测的基础上结合了颗粒分布率的检测，通过28-32nm粒径的颗粒分布率校正了蔗糖密度梯度离心法检测的含量，提高了检测的准确性，有效规避了细胞碎片、核酸、不完整的病毒颗粒、杂蛋白等等对检测结果的干扰，真实反映了完整病毒颗粒的含量并且更客观公正的反映了完整病毒颗粒和免疫原性之间的关联性。该方法显著提高了口蹄疫146S的定量检测准确性，简单易操作，成本低，大幅度提高了应用口蹄疫146S制备口蹄疫疫苗的质量，重复性更好，降低了生产过程中的批间差并且提高了免疫后抗体合格率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中01样品的紫外分光光度计检测结果；
图2为实施例2中02样品的紫外分光光度计检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种口蹄疫146S的定量检测方法，待测样品先利用蔗糖密度梯度离心法检测，得到口蹄疫146S的初始含量A，再检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％，得到口蹄疫146S的最终含量为A×B％；
对应样品为蔗糖密度梯度离心法中含有口蹄疫146S的蔗糖密度梯度层。
本发明中，先通过蔗糖密度梯度离心法对待测样品进行检测，得到一个初始含量值A，此步的意义在于确认该吸收峰的含量，但是由于该值的准确性不高，所以从颗粒分布率进行分析。由于口蹄疫完整病毒颗粒的大小在28-32nm的范围内，所以通过检测这一范围内粒径的分布率，得到一个校正系数B％，对初始含量A作进一步的校正，得到最终含量A×B％。
该方法在蔗糖密度梯度离心法检测的基础上结合了颗粒分布率的检测，通过28-32nm粒径的颗粒分布率校正了蔗糖密度梯度离心法检测的含量，提高了检测的准确性，有效规避了细胞碎片、核酸、不完整的病毒颗粒、杂蛋白等等对检测结果的干扰，真实反映了完整病毒颗粒的含量并且更客观公正的反映了完整病毒颗粒和免疫原性之间的关联性。该方法显著提高了口蹄疫146S的定量检测准确性，简单易操作，成本低，大幅度提高了应用口蹄疫146S制备口蹄疫疫苗的质量，重复性更好，降低了生产过程中的批间差并且提高了免疫后抗体合格率。
需要说明的是，上述对应样品指的是蔗糖密度梯度离心法中含有口蹄疫146S的蔗糖密度梯度层，也就是测得吸收峰的蔗糖密度梯度层。
在优选地实施方式中，对应样品通过如下方法得到：紫外分光光度计OD259检测，根据出峰时间确定蔗糖浓度并且根据出峰位置收集样品，得到对应样品。
在优选地实施方式中，蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤：将待测样品进行蔗糖密度梯度离心，对沉降到相应密度梯度层的样品进行紫外分光光度计OD259检测，计算吸收峰面积，得到口蹄疫146S的初始含量A。
在一个优选地实施方式中，蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤：
(1)将待测样品加至15％-45％的蔗糖梯度顶部；
(2)设置离心机参数：离心力210000g，离心时间3h，温度4℃；
(3)离心结束后，进行紫外分光光度计OD259检测；
(4)根据吸收峰面积，计算146s含量。
在优选地实施方式中，颗粒分布率B％通过纳米粒径分布仪检测得到。纳米粒径分析仪可以实现的功能为测量样品中粒径的大小、均一度以及分布情况。
在优选地实施方式中，检测对应样品的粘度和折光率后再进行纳米粒径分析仪检测。
在优选地实施方式中，纳米粒径分析仪检测包括如下步骤：设定对应样品的粘度和折光率后，待检测基线稳定，检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％。以蔗糖作为分散剂，先对对应样品的粘度和折光率进行确定，去除蔗糖的背景影响，提高纳米粒径分析仪检测的准确性。
在优选地实施方式中，纳米粒径分析仪为贝克曼库尔特DelsaMax PRO多角度Zeta电位及纳米粒径同步分析仪。纳米粒径分析仪可以测量样品中粒径的平均大小、均一度以及分布情况，得到28-32nm粒径的分布率数值。
本发明提供上述口蹄疫146S的定量检测方法在评估口蹄疫疫苗的抗原含量中的应用。
本发明又提供上述口蹄疫146S的定量检测方法在制备口蹄疫疫苗中的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种口蹄疫146S的定量检测方法，包括以下步骤：
1、蔗糖密度梯度离心法
(1)将待测样品加至15％-45％的蔗糖梯度顶部；
(2)设置离心机参数：离心力210000g，离心时间3h，温度4℃；
(3)离心结束后，进行紫外分光光度计OD259检测；
(4)根据吸收峰面积，计算146s含量。
得到口蹄疫146S的初始含量A。
2、纳米粒径分析仪
(1)记录蔗糖密度梯度离心法中吸收峰的出峰时间，得到对应的蔗糖浓度，并且将检测的出峰位置进行收集留样，该样品为含有146S的蔗糖密度梯度层。
(2)检测步骤(1)中的样品的粘度和折光率，在纳米粒径分析仪中设定分散剂(即蔗糖)的折光率和粘度值，待检测基线稳定后，测量样品中粒径的平均大小、均一度和分布情况，得到样品中28-32nm粒径范围内的颗粒分布率B％；
口蹄疫146S的最终含量为：A×B％。
实施例2
1、按照实施例1中的检测方法，检测两种口蹄疫抗原，分别标记为01和02，经过紫外分光光度计检测(如图1和图2所示)，01样品的保留时间为8.052min，响应值为23607.184；02样品的保留时间为8.424min，响应值为34108.587。分别得到146S的的含量：01的初始含量为5.076ug/mL；02的初始含量为7.333ug/mL。
2、确定出峰时间对应的蔗糖浓度为18％，检测其粘度为1.80045，折光率为1.36102，利用纳米粒径分析仪检测出粒径在28-32nm间的颗粒分布率。
按照实施例1中的检测方法，根据贝克曼库尔特DelsaMax PRO多角度Zeta电位及纳米粒径同步分析仪使用手册进行操作，对口蹄疫的样品进行粒径分析，选择对应蔗糖的折光率及粘度后，对样品(编号分别为01和02)连续进行多次重复测量，结果如下表：
通过上述5天重复性监测两批次抗原结果可见：
检测的颗粒直径均与口蹄疫病毒颗粒大小一致，且01、02样品在5天重复性检测结果数据接近。
01样品以5天监测数值的平均结果进行计算，粒径大小为29.838nm，％PD平均结果8.13＜15，说明样品颗粒单一，该颗粒所占平均百分比为77.35％，说明蔗糖检测结果中仅有77.35％的数值具有真实性，故口蹄疫146S的最终含量应该为：5.076ug/mL×77.35％＝3.92ug/mL。
02样品以5天监测数值的平均结果进行计算，粒径大小为30.306nm，％PD平均结果6.992＜15，说明样品颗粒单一，该颗粒所占平均百分比为53.53％，说明蔗糖检测结果中仅有53.53％的数值具有真实性，故口蹄疫146S的最终含量应该为：7.333ug/mL×53.53％＝3.92ug/mL。
实施例3
对上述2批次抗原分别按照蔗糖密度梯度离心法计算的146S初始含量，本发明提供的定量检测方法得到的146S最终含量，作为制备口蹄疫疫苗的依据，共制备4组疫苗，每组疫苗146S计算含量均为3ug/头份。利用制备的四批次疫苗分别进行动物(仔猪)免疫试验，测试抗体效价以评估制备疫苗免疫效果。
试验动物仔猪共计80头，每组分别免疫20头。免疫后用ELISA方法检测免疫抗体。结果如下：
注：ELISA方法采用兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测，按照1﹕64作为合格判定，试验猪在免疫前均采血检测，抗体均＜1﹕8。
由免疫后ELISA抗体结果可见，01和02以本发明提供的定量检测方法得到的146S最终含量作为制备疫苗的抗原含量值，其免疫后抗体合格率均可以达到100％；而以蔗糖密度梯度离心法计算的初始含量值作为制备疫苗的抗原含量值，其免疫后抗体合格率分别为80％和55％，合格率显著低于本发明提供的方法得到的疫苗，并且批间差异较大。说明本发明提供的定量检测方法更加准确可靠，经过纳米粒径分析仪对口蹄疫抗原进行校正得到的146S值，作为配苗抗原含量重复性更好，且免疫后抗体合格率更高。
通过上述的实验数据可以看出，本发明提供的口蹄疫146S的定量检测方法能够成为一种准确定量口蹄疫病毒146S的方式。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (9)
1.一种口蹄疫146S的定量检测方法，其特征在于，待测样品先利用蔗糖密度梯度离心法检测，得到口蹄疫146S的初始含量A，再检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％，得到口蹄疫146S的最终含量为A×B％；
所述对应样品为蔗糖密度梯度离心法中含有口蹄疫146S的蔗糖密度梯度层。
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述对应样品通过如下方法得到：紫外分光光度计OD259检测，根据出峰时间确定蔗糖浓度并且根据出峰位置收集样品，得到所述对应样品。
3.根据权利要求1或2所述的定量检测方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤：将待测样品进行蔗糖密度梯度离心，对沉降到相应密度梯度层的样品进行紫外分光光度计OD259检测，计算吸收峰面积，得到口蹄疫146S的初始含量A。
4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述颗粒分布率B％通过纳米粒径分布仪检测得到。
5.根据权利要求4所述的定量检测方法，其特征在于，检测对应样品的粘度和折光率后再进行纳米粒径分析仪检测。
6.根据权利要求5所述的定量检测方法，其特征在于，所述纳米粒径分析仪检测包括如下步骤：设定对应样品的粘度和折光率后，待检测基线稳定，检测对应样品中粒径为28-32nm的颗粒分布率B％。
7.根据权利要求4-6任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述纳米粒径分析仪为贝克曼库尔特DelsaMax PRO多角度Zeta电位及纳米粒径同步分析仪。
8.权利要求1-7任一项所述的定量检测方法在评估口蹄疫疫苗的抗原含量中的应用。
9.权利要求1-7任一项所述的定量检测方法在制备口蹄疫疫苗中的应用。
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