CN109709330A - 一种口蹄疫病毒竞争elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：单域抗体sdAb‑A；A/AKT‑Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，封闭液；金标二抗；和支持介质。通过将口蹄疫抗原与包被在支持介质上的特异性单域抗体结合，单克隆抗体9C10和待检血清中的抗体与抗原竞争性结合，通过金标的马抗小鼠IgG检测，在检测样品时只需要加入待检样品与单抗9C10孵育1h，即可加入金标二抗进行10min的显色，洗涤后即可度值，操作简单、诊断快速。本发明的竞争ELISA检测试剂盒检测灵敏度高，与病毒中和反应的符合率较其他商业检测试剂盒更高。

Description

一种口蹄疫病毒竞争ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于免疫测定法和相应的生物物质领域，具体涉及一种口蹄疫病毒抗体的检测方法及应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的一种感染偶蹄目动物的急性、热性、接触传染性动物疫病。FMD是国际兽医局规定的必报传染病，也被中国认定为一类传染病。口蹄疫致死率很低，但病毒可以在体内长期存活，患畜持续排毒，成为重要的传染源，会给畜牧业生产和进出口贸易造成巨大的经济损失，该病不仅严重影响畜牧业的发展，也对人类健康构成很大威胁。因此，开发研究更便捷、快速、敏感、快速诊断试剂盒变得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQ ID NO.1所示；A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；封闭液；金标二抗；支持介质。

本发明通过特定的单域抗体sdAb-A和单克隆抗体9C10使得检测的灵敏度高，与病毒中和反应的符合率较其他商业检测试剂盒更高。

本发明以口蹄疫的A型单域抗体作为包被抗体，建立一种检测口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒。由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记多个金颗粒，所有当待检抗体为多抗时，信号经过放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，所有无需将一抗进行标记，大大缩减了工作量。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。

A/AKT-Ⅲ株FMDV株可商业上获得，例如可自新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所商购。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单域抗体sdAb-A浓度为1.5ug/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述封闭液为5％脱脂乳。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述单克隆抗体浓度为0.375ug/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标抗体抗体浓度为0.025ug/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述支持介质为酶标板。

本发明还提供了所述口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A型口蹄疫中的应用。

口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测，具有快速、简便、准确、稳定等特点，可用于口蹄疫的快速、批量抗体检测。

本发明还提供了所述口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，通过将口蹄疫A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原与包被在支持介质上的单域抗体sdAb-A结合，单克隆抗体9C10和待检血清中的抗体与抗原竞争性结合，通过金标的马抗小鼠IgG进行检测。

优选地，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单域抗体sdAb-A浓度为1.5ug/ml。

优选地，所述抗原作用时间1h。

优选地，在所述支持介质上包被单域抗体sdAb-A后进行封闭，所述封闭液为5％脱脂乳。

优选地，所述封闭液封闭时间为37℃1h。

优选地，所述单克隆抗体浓度为0.375ug/ml。

优选地，所述单克隆抗体作用条件、时间为37℃孵育1h。

优选地，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标抗体抗体浓度为0.025ug/ml。

优选地，所述金标二抗作用时间为10min。

优选地，所述支持介质为酶标板。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

实施例1单抗的制备

1.1口蹄疫抗原(A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原)为实验室保存。

1.2免疫脾细胞的制备

取纯化好的抗原与等体积的佐剂充分混匀，注入小鼠体内，每只每次注射剂量为1ml，经过一免、二免、三免和增强免后，测小鼠血清中抗体滴度，将显示有足够抗体滴度(1:10⁸)(ELISA效价)的小鼠作为免疫脾细胞的来源。测定抗体滴度的方法为ELISA检测方法。

1.3骨髓瘤细胞的制备

骨髓瘤细胞SP2/0细胞为实验室所保存。

1.4细胞融合

1.4.1细胞融合

将1.2中足够抗体滴度的小鼠进行脾脏分离，并制备脾淋巴细胞悬液。通过细胞计数，使脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1：10的数量比进行混合，以800r/min离心5min后尽可能的弃净上清，向50mL离心管沉淀中缓慢加入37℃预温的促融剂(PEG1450)进行融合，融合后，800r/min离心5min后弃上清，向离心管中加入50mL选择培养基HAT(15％胎牛血清，1％HAT，1％双抗，1％谷氨酰胺)将融合后的细胞轻轻的重悬混匀后，铺入事先制备好的生长饲养层细胞的96孔细胞培养板内，每孔100μL，放入37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。每隔三天用选择培养液HAT进行半换液，直到孔内细胞克隆长至底面积1/4～1/3时，更换新的培养液培养2～3天后，取培养上清进行检测。

1.4.2饲养层细胞的制备：

1.4.2.1准备：在进行细胞融合前2天，挑选健康BALB/c小鼠，放入单独的鼠笼中饥饿4h。选择培养液HAT(32mL，每板10mL，3块板/只鼠)37℃预热30min。鼠架、剪刀、镊子紫外照射消毒30min。

1.4.2.2暴露腹膜：饥饿4h后的BALB/c小鼠被脱颈处死后，用75％酒精浸泡5min，对小鼠体表进行消毒。将小鼠固定在鼠架上，用镊子和剪刀将小鼠的皮肤和腹膜分离，腹膜完全暴露。

1.4.2.3腹腔内细胞采集：将预热的32mL选择培养液HAT放入灭菌的平皿中，10mL注射器中吸入8mL培养液，用镊子夹起腹膜，针头刺入腹膜，镊子夹住针头，伸入腹腔，注射器缓慢的抽吸数次，待注射器中的液体呈微黄色后，注射器针头退出腹腔，摘下针头后将液体缓慢注入平皿中。处理小鼠，消毒操作台。

1.4.2.4铺板：取3块96孔细胞培养板，用8道移液器将1.4.2.3制备的细胞悬液加入细胞培养板中，100μL/孔。

1.4.3SP2/0骨髓瘤细胞的制备：

1.4.3.1融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。

1.4.3.2融合当天，选取浑圆透亮、大小均一、排列整齐的细胞。用DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，置于50mL无菌离心管内，800r/min离心10min。用DMEM基础培养液将细胞沉淀重悬，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，进行台盼兰染色计数，备用等待下一步细胞融合实验。

1.4.4免疫BALB/c小鼠脾细胞的制备：

1.4.4.1融合前，用弯头镊子摘除经加强免疫后3天的BALB/c小鼠眼球，收集血液经低速离心分离血清，该血清即为间接ELISA中的阳性对照。将小鼠颈部脱臼致死，并浸泡于75％酒精中对小鼠体表进行灭菌，5min后放于超净台内，将小鼠夹在鼠架上。

1.4.4.2无菌打开腹腔，取出脾脏去除结缔组织，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用尖头镊子夹起脾脏，10mL注射器换上1mL注射器的针头吸取10mL DMEM基础培养液，针头经镊子中间刺入脾脏，缓慢的将培养液注入脾脏，使脾细胞随培养液流出，全部通过网孔进入平皿中，可反复几次直到脾脏成空囊且没有红色区域。

1.4.4.3将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀。800r/min离心8min，弃上清。用DMEM基础培养液将细胞沉淀轻柔重悬并混匀。取细胞悬液，进行台盼蓝染色计数，备用等待下一步细胞融合实验。

将融合细胞按100ul/孔加入到96孔培养板中，每孔中再加入100ul用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。将上述培养孔置于浓度为5％的CO₂培养箱中，培养温度为37℃。第三天开始，每隔2-3天用每孔原培养液一半的量的HAT培养液换液一次。

当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，先取培养上清液，然后再在每孔加入半量HAT培养液。再用间接ELISA检测抗A型口蹄疫抗体及滴度。当检测表明其与对照相比有明显的升高时即视为合格。

将上述已测定的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株。通过经有限稀释该杂交瘤细胞使每一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，挑取单一杂交瘤细胞。选择单一杂交瘤细胞命名为分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17081，保藏日期为2018年12月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

1.5单克隆抗体的制备

用常规培养液培养1.4中得到的杂交瘤细胞株9C10。大量生产单克隆抗体，可采用体外(细胞培养)或体内(小鼠腹腔注射)培养法。当注射到腹腔内，2-3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液中含有口蹄疫病毒单克隆抗体。采用辛酸-硫酸铵法进一步纯化单克隆抗体9C10。

实施例2特异性单域抗体的制备

A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原免疫双峰驼，分离外周血淋巴细胞后提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA,再用单域抗体特异性引物(上游引物：CTTGGTCTCTGATGTGCAGCTGGTGGAGTC下游引物：CTCGGATCCTCATGAGGAGACGGTGACCTGG)进行三次扩增得到VHH基因。构建了抗A型口蹄疫病毒的单域抗体噬菌体展示免疫文库。经测定，文库容量为1.2×10⁸。经过四轮淘选，测序得到A型FMDV单域抗体序列，命名为sdAb-A。目的片段扩增后经过酶切与pSMK载体连接，构建pSMK-sdAb-A原核表达载体，转化大肠杆菌BL21。经SDS-PAGE检测,重组sd Ab-A得到了表达。重组蛋白使用树脂亲和层析方法进行纯化。酶联免疫吸附实验结果显示这株抗体对A型口蹄疫病毒具有特异性结合的能力，由此获得了口蹄疫病毒A型特异性单域抗体。

将抗A型口蹄疫灭活病毒抗原包被于酶标板上，用单域抗体与A型口蹄疫病毒抗体进行竞争ELISA试验，结果显示具有高度的血清型特异性，不与其他血清型发生交叉反应，可用于制备检测A型口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒。

实施例3二抗的制备与标记

3.1多抗的制备

选取健康、营养良好的小鼠为免疫对象进行免疫，首先进行基础免疫，将病毒液注入小鼠体内待痊愈后进行高免，经过高免后的小鼠经心脏采血，分离血清，灭活后进行纯化；将纯化后的血清对马进行免疫，采集血清，纯化二抗IgG。

3.2标记制备好的马抗鼠IgG

3.2.1将1g氯金酸配制成1％的氯金酸溶液，4℃避光保存，用0.22um滤器过滤。

3.2.2将1g柠檬酸三钠配制成1％的柠檬酸三钠溶液，4℃保存。

3.2.3取100ml蒸馏水加热至100℃，沸腾，加入1ml 1％氯金酸大约1min，快速加入1ml 1％柠檬酸三钠，计时3min，并将温度调低，计时12min。室温冷却约30min，不可剧烈晃动。

3.2.4将配制好的金溶液取20ml放入烧杯中，加入96ul 0.1M的K₂CO₃溶液在恒温磁力搅拌器上搅拌，计时3min，再加入纯化好的二抗IgG 200ul，计时15min，再加入10％的BSA200ul，4℃12000rmp离心30min，收集沉淀，即为标记好的二抗。

3.2.5利用分光光度计测其OD₅₄₀的吸光度值，选择金标二抗最佳工作OD₅₄₀值，计算二抗的相对浓度。

实施例4ELISA操作流程

ELISA基本操作流程：单域抗体(1.5mg/ml)100μL包被酶标板，4℃过夜包被；用PBST洗板3次，封闭液37℃孵育封闭1h；用PBST洗板3次，吸取100μL抗原(本实验室保存的A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原)(300ug/ml)加入到96孔酶标板中，37℃孵育1h，用PBST洗板3次；加入l00μL待检血清和l00μL实施例1制备的单抗(1.2mg/ml)，37℃孵育1h，用PBST洗板3次；金颗粒标记的马抗鼠IgG，室温孵育10min，用PBST洗板3次；加入50μLPBS缓冲液，用酶标仪在波长540nm处读数，判定结果：抑制百分率(PI)＝(1－被检血清或对照血清OD值/病毒抗原对照平均OD值)×100％。

4.1最佳单域抗体和抗原包被浓度的确定

为研究单域抗体和抗原包被浓度对检测灵敏度的影响，调整单域抗体和抗原包被浓度，进行下列实验：由表1可知，当抗原稀释度为1:200(1.5ug/ml)，单域抗体稀释度为1:800(1.5ug/ml)时，此时阳性血清OD₅₄₀可达0.074，而阴性血清OD₅₄₀值为0.957，阳性血清和阴性血清的OD₅₄₀值相差最大(N/P＝12.93)。因此，抗原最佳包被浓度为1:200(1.5ug/ml)，单域抗体最佳稀释度为1:800(1.5ug/ml)。

表1 最佳单域抗体与抗原包被浓度的确定结果

4.2最佳封闭液的确定

为选择最适抗原包被浓度和最佳抗体稀释度，封闭液分别选择1％鱼明胶、2％鱼明胶、5％鱼明胶、1％脱脂乳、2％脱脂乳、5％脱脂乳，37℃孵育1h其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD₅₄₀值并计算N/P值。

由表2可知，当采用5％脱脂乳进行封闭时，N/P值最大，效果最好，选择5％脱脂乳进行封闭。

表2 最佳封闭液的确定结果

4.3最佳抗原作用时间的确定

为研究抗原作用时间对检测灵敏度的影响，调整抗原作用时间，进行下列实验：由表3可知，当抗原作用1h时，N/P值最大，效果最好。

表3 抗原最佳作用时间的确定

4.4最佳一抗(单抗9C10)检测浓度的确定结果

为研究一抗浓度对检测灵敏度的影响，调整一抗浓度，进行下列实验：由表4可知，当一抗稀释度为1:3200(0.375ug/ml)时，N/P值最大，效果最好。

表4 最佳一抗包被浓度的确定结果

4.5一抗作用条件、时间的确定

为研究一抗作用条件、时间对检测灵敏度的影响，调整一抗条件、作用时间，进行下列实验：由表5可知，一抗作用条件为37℃孵育1h时阳性血清和阴性血清OD₅₄₀值的比值最大，试验效果最佳。

表5 一抗作用时间的优化结果

4.6金标抗体(二抗)稀释浓度的确定

按照上述优化好的包被条件、封闭条件、一抗作用时间，在ELISA反应过程中，将金标抗体分别稀释成5OD，10OD，20OD，40OD，60OD，80OD，100OD其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD₅₄₀值并计算N/P值。

由表6可知，当金标抗体(马抗鼠IgG)稀释后，OD₅₄₀值等于5时，称为5OD(此时抗体浓度为0.025ug/ml)浓度稀释时，阳性血清OD₅₄₀值在接近1的情况下N/P值最大，因此金标抗体的最佳工作浓度为5OD浓度，抗体浓度为0.025ug/ml。

表6 金标二抗稀释浓度的优化结果

4.7金标抗体作用时间的确定

按照上述优化好的包被条件、封闭条件、一抗作用时间、金标抗体浓度，在ELISA反应过程中，将金标抗体作用时间分别设置为室温10min、室温20min、室温30min、室温40min，其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD₅₄₀值并计算N/P值。

由表7可知，当金标二抗作用时间为10min时效果最佳。

表7 金标抗体作用时间的优化结果

4.8封闭时间的确定

按照上述优化好的包被条件、封闭条件、一抗作用时间、金标抗体浓度、金标抗体作用时间在ELISA反应过程中，将封闭时间分别设置为37℃1h、37℃2h、37℃3h，37℃4h，其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD₅₄₀值并计算N/P值。

由表8可知，封闭时间为37℃1h时，此时N/P最大，因此最佳的封闭条件为37℃1h。

表8 封闭时间的确定结果

4.9最佳包被条件的确定

在ELISA操作过程中将抗原分别在4℃过夜、37℃2h、37℃分别孵育1、2、3h后再4℃过夜，其余按照优化好的最佳条件操作，测定OD₅₄₀值并计算N/P值。

由表9可知，4℃过夜包被较佳，此时阳性血清和阴性血清的OD₅₄₀值比值较大且考虑时间成本，因此最佳的包被条件是4℃过夜包被。

表9 单域抗体最佳包被条件的确定结果

4.10竞争ELISA阴阳性竞争率的确定

用优化好的竞争ELISA方法检测92份(阳性46份，阴性46份)已知口蹄疫抗体效价的血清，确定竞争率，判断阴阳性。

PI值＝(1-待检样品OD_540nm值/阴性对照血清平均OD_540nm值)×100

由表10可知，试验成立条件为：阴性对照OD值≥0.6，阳性对照OD值≤0.4。判定方法为：若被检血清PI≥35％，阳性血清最高稀释度为该血清的抗体滴度，即效价，则为阳性；若被检血清<35％，则判为阴性。结果见表10。

表10 92份血清ELISA检测结果

92份血清PI值见表11。

表11 92份已知抗体效价血清PI值

从表11可见，92份已知抗体效价血清PI值与其已知的效价是相互对应的。这说明本发明试剂盒和ELISA检测结果一致。

实施例5

5.1重复性试验与特异性试验

通过对已知样品的批内批间重复性检测，观察其变异系数；通过对其他血清型口蹄疫病毒抗体以及相似病病原抗体的检测以确定该方法的特异性。

5.1.2特异性试验结果

由表12可知，用建立好的方法去检测小鼠水疱疹病毒阳性血清和小鼠水疱性口炎病毒阳性血清，同时设立阴阳性对照，在阴阳性对照都成立条件下，这两种阳性血清的竞争率PI<35％，检测结果为阴性。试验结果表明建立的ELISA检测方法其特异性良好(该方法与小鼠水疱疹病毒阳性血清和小鼠水疱性口炎病毒阳性血清的ELISA结果应为阴性，说明该方法与这两种病毒的阳性血清不反应，说明方法特异。这两种病毒与口蹄疫病毒的临床症状相似)。

表12 特异性试验结果

5.1.3重复性试验结果

使用3个不同批次的酶标板，在一块板上进行批内重复实验，在不同板上进行批间重复试验，测定值,计算变异系数。变异系数<10％，说明试剂盒重复性和稳定性好。3个不同批次的酶标板，批内和批间检测结果一致，变异系数均<6％，说明试剂盒重复性很好。

5.2敏感性试验

5.2.1用不同浓度抗原包被检测，由表13可知，在抗原包被量为0.125ug/ml时仍有很高的OD值，说明即使低浓度包被，该方法仍有很高的灵敏性。

表13 不同抗原浓度包被及不同血清稀释度检测敏感性比较

5.2.2将阳性样品进行系列稀释(1:128、1:256、1:512、1:1024)，并设阴性对照，使用3批不同试剂盒进行检测。由表14可知：在血清1:1024稀释时仍能检出，且不同批次试剂盒之间具有良好的重复性，敏感性和稳定性。

表14 不同批次试剂盒的敏感性比较

5.3符合率试验

60份经病毒中和试验检测的猪血清，其中O、A型阳性血清均为38份，阴性血清均为22份。以病毒中和试验检测的结果为标准，将此血清用建立的检测方法，北京金诺百科科技有限公司的口蹄疫病毒抗体检测试剂盒以及兰州兽医研究所的口蹄疫病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒检测，统计符合率。

符合率试验结果

根据统计结果，建立的口蹄疫病毒抗体检测方法与病毒中和试验符合率为100％，兰兽研液相阻断ELISA检测方法与病毒中和试验符合率为98％，金诺阻断ELISA检测方法与病毒中和试验符合率为95％。

表15 符合率试验结果总汇

注：表15中“+”表示呈阳性结果，“－”表示呈阴性结果

表16 符合率试验结果统计

检测方法	阳性	阴性	符合率
				病毒中和	38	22
竞争ELISA	38	22	100％
				兰兽研ELISA	37	23	98％
金诺ELISA	35	25	95％

上述结果显示：阴阳性对照成立，针对口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测方法具有很高的特异性和敏感性；具有很好的重复性，与口蹄疫病毒其他血清型以及其他相似病病毒均不发生交叉反应；具有很高的符合率，其较现有的商业上的检测试剂盒均更符合中和实验结果，同时具有可以作为检测口蹄疫病毒抗体ELISA方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古必威安泰生物科技有限公司

<120> 一种口蹄疫病毒竞争ELISA检测试剂盒

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 双峰驼（bactrian camel ）

<400> 1

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Leu Ile Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Pro Gly Arg Pro Ser Leu Gln Val Asp Phe Arg Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ser Ser

115 120

Claims (7)

1.一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQ ID NO.1所示；

A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原；

单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；

封闭液；

金标二抗；

支持介质。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单域抗体sdAb-A浓度为1.5ug/ml。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂乳。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体浓度为0.375ug/ml。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标抗体抗体浓度为0.025ug/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述支持介质为酶标板。

7.根据权利要求1～6所述口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A型口蹄疫中的应用。