CN110150138B - 一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用 - Google Patents

一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用，本发明的培育方法通过遗传杂交的方式将xpo1a突变体和xpo1b突变体进行杂交，筛选后代获得拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体。通过本发明方法获得的T3代拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体植物能够显著阻碍芜菁花叶病毒(TuMV)的侵染。

Description

一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用
技术领域
本发明涉及拟南芥培育技术领域，特别是涉及一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法。
背景技术
芜菁花叶病毒(TuMV)是我国十字花科蔬菜和油菜病毒病害的主要病原，在我国绝大部分地区均有发生，危害严重时可造成50％～100％的减产，是农业生产上最重要的植物病毒之一。目前防治TuMV主要依赖于抗病品种，但是依赖于寻找自然界中的抗性品种具有以下问题：(1)周期长，通过田间发现抗TuMV的品种通常需要很长时间；(2)效率低，自然界中存在有限的抗病品种，严重限制了抗TuMV品种的使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用。
本发明通过生物信息学和植物病毒学的知识，筛选出可能参与TuMV复制的寄主基因XPO1a和XPO1b，然后获得该寄主基因的突变体xpo1a和xpo1b。在实验室中，通过接种TuMV确定xpo1a和xpo1b对TuMV存在抗性(包含病毒症状减轻、病毒RNA积累量降低)。进一步通过遗传杂交获得xpo1a/xpo1b±双突变体，并接种TuMV于xpo1a/xpo1b±双突变体植物上分析病毒症状、病毒积累量和进行原生质体实验分析病毒复制情况，明确xpo1a/xpo1b±双突变体能够显著抑制TuMV的侵染。这种通过遗传杂交获得xpo1a/xpo1b±双突变能够稳定地传递对TuMV的抗性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法，是通过遗传杂交的方式将xpo1a突变体和xpo1b突变体进行杂交，筛选后代获得拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体(其中xpo1a为纯合突变，xpo1b为杂合突变，见附图)。
具体包括以下步骤：
(1)获得拟南芥xpo1a突变体(通过拟南芥突变体库订购，为美国Ohio stateuniversity成立的一所科研机构)；所述拟南芥xpo1a突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_078639C；
(2)播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1a突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
(3)利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1a突变体纯合情况；
LBb1.3-F：tcgcttgtgaatattgtgcag；m-xpo1a-LP：atcaaggcagggaaacaaaac；m-xpo1a-RP：tgggcagaaatcataggacag；如SEQ ID：No.3-5所示；
然后利用以下引物对XPO1a-F与XPO1a-R，以反转录RNA获得的cDNA为模板，进行RT-PCR的方法验证xpo1a纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1a转录本；所述XPO1a转录本的序列如SEQ ID：No.1所示；
XPO1a-F：atggcggctgagaagttaagggac；XPO1a-R：tgagtccaccatctcgtcttg；如SEQID：No.6-7所示；
确定xpo1a纯合子植株后，对xpo1a纯合子突变体进行留种；
(4)获得拟南芥xpo1b突变体(通过拟南芥突变体库订购，为美国Ohio stateuniversity成立的一所科研机构)；所述拟南芥xpo1b突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_088267C；
(5)播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1b突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
(6)利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1b突变体纯合情况；
m-xpo1b-LP：tgttcaacgggtaatgcattc；m-xpo1b-RP：cctcaaaaagtgttggaaatttg；如SEQ ID：No.8-9所示；
利用以下引物对XPO1b-F与XPO1b-R，通过反转录RNA获得的cDNA进行RT-PCR的方法验证xpo1b纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1b转录本；所述XPO1b转录本的序列如SEQ ID：No.2所示；
XPO1b-F：atggctgccgagaagttaagagac；XPO1b-R：agaatcggccatgtcgtcttg；如SEQID：No.10-11所示；
留种xpo1b纯合子突变体；
(7)同时播种xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体；
(8)播种40天后，在xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体开花期，进行正向遗传杂交和反向遗传杂交；
正向遗传杂交：以xpo1a突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1b突变体的花粉将其沾到xpo1a雌蕊的柱头上；
反向遗传杂交：以xpo1b突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1a突变体的花粉将其沾到xpo1b雌蕊的柱头上。
(9)待杂交的角果成熟后，收种；
(10)播种F1代植物20天后，用CTAB法抽取杂交植物的DNA；
(11)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的杂合体；对含有xpo1a和xpo1bT-DNA插入的突变体(由于是F1代，所以为杂合子，即四对引物LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP，LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP均能扩增到特异长度的DNA片段)，留种；
(12)播种F2代植物，用CTAB法抽取杂交植物的DNA，
(13)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±，对PCR检测阳性的植株，留种；
(14)播种F2代植物，用CTAB法和Trizol法分别抽取杂xpo1a/xpo1b±植物的DNA；
(15)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±，确定F2后代的留种的xpo1a/xpo1b±双突变体。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明是鉴于信息和功能已知的拟南芥数据库，通过生物信息学分析可能参与病毒侵染的基因，然后获得该目标基因的突变体。通过实验筛选对TuMV存在抗性的突变体。确定突变体的抗性后，再进一步通过杂交的方式获得抗TuMV的双突变体植物，从而获得更稳定的抗病毒植株。本发明具有以下优势：(1)获得双突变体植株xpo1a/xpo1b±具有稳定的抗病毒特性，(2)该方法获得的双突变体xpo1a/xpo1b±植株遗传背景清晰，利于后续科学研究和田间应用。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法及应用作进一步说明。
附图说明
图1为xpo1a、xpo1b和xpo1a/xpo1b±拟南芥突变体植株的确证；
(A)野生型(Col-0)、xpo1a(SALK_078639C)突变体、xpo1b(SALK_088267C)突变体和xpo1a/xpo1b±双突变拟南芥的表型(其中xpo1a为纯合突变，xpo1b为杂合突变，见附图)，播种20天拍摄。
(B，C)xpo1a、xpo1b和xpo1a/xpo1b±的T-DNA插入缺失的证明。LP：对应基因的左侧引物，RP：对应基因的右侧引物，LBb 1.3：T-DNA插入子上的左侧引物。
(D，E)RT-PCR分析Col-0、xpo1a和xpo1a/xpo1b±突变拟南芥植株中XPO1a的表达情况(D)，或Col-0、xpo1b和xpo1a/xpo1b±突变拟南芥植株中XPO1b的表达情况(E)。采用AtActin II基因作为内参对照。
图2中，(A)芜菁花叶病毒(TuMV)接种拟南芥野生型Col-0,xpo1a突变体、xpo1b突变体和xpo1a/xpo1b±双突变体14天后(14dpi)的症状图。接种缓冲液(Buffer)作为对照。(B)用qRT-PCR定量检测TuMV系统侵染拟南芥14天后的病毒RNA的积累水平。(C)qRT-PCR定量检测TuMV在原生质体中病毒RNA复制水平。
具体实施方式
一种拟南芥xpo1a/xpo1b双突变体的培育方法，具体包括以下步骤：
(1)获得拟南芥xpo1a突变体(拟南芥突变体库编号：SALK_078639C)；
(2)播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1a突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
(3)利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1a突变体纯合情况(由于T-DNA的插入，LBb1.3-F与m-xpo1a-RP能够扩增到特异长度的DNA片段，m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP无法扩增到特异长度的DNA片段)。所使用的引物序列为：
LBb1.3-F(tcgcttgtgaatattgtgcag)
m-xpo1a-LP(atcaaggcagggaaacaaaac)
m-xpo1a-RP(tgggcagaaatcataggacag)；如SEQ ID：No.3-5所示；
随后利用以下引物对XPO1a-F与XPO1a-R，以反转录RNA获得的cDNA为模板，进行RT-PCR的方法验证xpo1a纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1a转录本；所述XPO1a转录本的序列如SEQ ID：No.1所示；
所使用的引物序列为：
XPO1a-F(atggcggctgagaagttaagggac)
XPO1a-R(tgagtccaccatctcgtcttg)；如SEQ ID：No.6-7所示；
确定xpo1a纯合子植株后，对xpo1a纯合子突变体进行留种；
(4)获得拟南芥xpo1b突变体(拟南芥突变体库编号：SALK_088267C)；
(5)播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1b突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
(6)利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1b突变体纯合情况(由于T-DNA的插入，LBb1.3-F与m-xpo1b-RP能够扩增到特异长度的DNA片段，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP无法扩增到特异长度的DNA片段)。所使用的引物序列为：
m-xpo1b-LP(tgttcaacgggtaatgcattc)
m-xpo1b-RP(cctcaaaaagtgttggaaatttg)；如SEQ ID：No.8-9所示；
利用以下引物对XPO1b-F与XPO1b-R，通过反转录RNA获得的cDNA进行RT-PCR的方法验证xpo1b纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1b转录本。所述XPO1b转录本的序列如SEQ ID：No.2所示；
所使用的引物序列为：
XPO1b-F(atggctgccgagaagttaagagac)
XPO1b-R(agaatcggccatgtcgtcttg)；如SEQ ID：No.10-11所示；留种xpo1b纯合子突变体；
(7)同时播种xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体；
(8)播种40天后，在xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体开花期，进行正向遗传杂交和反向遗传杂交。正向遗传杂交：以xpo1a突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1b突变体的花粉将其沾到xpo1a雌蕊的柱头上。反向遗传杂交：以xpo1b突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1a突变体的花粉将其沾到xpo1b雌蕊的柱头上；
(9)待杂交的角果成熟后，收种；
(10)播种F1代植物20天后，用CTAB法抽取杂交植物的DNA；
(11)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的杂合体；对含有xpo1a和xpo1bT-DNA插入的突变体(由杂交产生的后代，四对引物都能检测到特性条带)，留种；
(12)播种F2代植物，用CTAB法抽取杂交植物的DNA，
(13)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±(由于T-DNA的插入，LBb1.3-F与m-xpo1a-RP能够扩增到特异长度的DNA片段，m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP无法扩增到特异长度的DNA片段；LBb1.3-F与m-xpo1b-RP能够扩增到特异长度的DNA片段，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP也能够扩增到特异长度的DNA片段)，对PCR检测为xpo1a/xpo1b±的植株进行留种；
(14)播种F2代植物，用CTAB法和Trizol法分别抽取杂xpo1a/xpo1b±植物的DNA；
(15)用步骤(3)和步骤(6)中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±，确定F2后代的具有xpo1a/xpo1b±双突变体(其中xpo1a为纯合突变，xpo1b为杂合突变。因此通过PCR，利用以下引物对：LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP与m-xpo1b-RP均能检测到特异的DNA条带，而利用m-xpo1a-LP与m-xpo1a-RP无法检测到特异的DNA条带)的植株。
如图1(A-C)所示，采取Col-0、xpo1a和xpo1a/xpo1b±，或Col-0、xpo1b和xpo1a/xpo1b±拟南芥植株基因组DNA进行PCR。采用两种基因特异性引物(LP+RP)证明该基因存在于Col-0植物中。采用T-DNA特异性引物和基因特异性引物(LBb 1.3+RP)证实T-DNA插入的存在。
如图1(D-E)所示，相对于拟南芥野生型Col-0，在xpo1a和xpo1a/xpo1b±植株中，无法检测到XPO1a的转录本存在，说明XPO1a基因的表达受到了抑制(D)。类似的，相对于拟南芥野生型Col-0，在xpo1b和xpo1a/xpo1b±植株中，也没有检测到XPO1b的转录本存在(由于XPO1b在植物体内的表达丰度较低，在使用25个循环进行PCR扩增时，也无法在xpo1a/xpo1b±突变拟南芥植株中检测到XPO1b的转录本)，说明XPO1b基因在xpo1b和xpo1a/xpo1b±植株中的表达也受到了抑制(E)。
(16)播种拟南芥野生型Col-0、xpo1a纯合子突变体、xpo1b纯合子突变体、xpo1a/xpo1b±双突变体，播种20天后，接种对照(Buffer)和TuMV。接种14天后，观察病毒症状和分析病毒积累量。
如图2(A)中明显看出突变xpo1a、xpo1b和xpo1a/xpo1b±能够显著抑制TuMV的症状(接种TuMV的表型)。
如图2(B)，从TuMV系统感染叶片中提取RNA(14dpi)。分析病毒RNA的积累水平，AtActin II作为内参。该接种测试至少进行三次独立的重复实验。数据分析使用Student’st检验，星号表示显著差异(**P<0.01)。
如图2(C)，转染TuMV侵染性克隆质粒到拟南芥野生型Col-0、xpo1a突变体、xpo1b突变体和xpo1a/xpo1b±双突变体原生质体中，转染48小时后从以上原生质体中提取RNA。分析病毒RNA在原生质体中的复制水平。图中明显看出突变xpo1a、xpo1b和xpo1a/xpo1b±能够显著抑制TuMV的复制，说明xpo1a/xpo1b±抑制病毒的侵染可能是通过抑制病毒的复制实现的。对拟南芥原生质体转化实验进行了至少三次独立的重复实验。数据分析使用Student’s t检验，星号表示显著差异(**P<0.01)。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种拟南芥xpo1a/xpo1b双突变体的培育方法及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcggctg agaagttaag ggacttgagc cagccgattg acgtcggtgt gctcgatgcc 60
actgttgcgg ccttctttgt taccggatct aaagaagaga gagctgctgc ggaccagatt 120
ttgcgggatt tgcaggctaa tccagatatg tggcttcaag ttgtccacat tctacaaaat 180
acaaacagct tggataccaa gttctttgct ctgcaggttc tagaaggtgt tataaagtat 240
agatggaatg cactgcctgt tgaacaacga gatggaatga aaaattacat ctcagaggtt 300
attgtacagc tctcgagtaa tgaagcatct ttcagatcag aaaggctcta tgtcaacaag 360
ctaaatgtca ttttggtcca gatcgtgaaa catgattggc cggcaaagtg gacaagcttc 420
attcctgatc tagttgcagc tgctaaaact agcgaaacta tctgcgaaaa ttgcatggcc 480
attttgaaac tcctaagtga agaggttttt gatttctcaa gaggagaaat gactcagcag 540
aagattaaag agctgaaaca atctctaaac agtgagttta aactcattca tgagttatgc 600
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ctccttaaat tttttcctgt gccagcatat aggaacctca ctattcaatg tctgaccgag 780
gtcgcagctc ttaatttcgg ggacttctac aatgttcaat atgtcaaaat gtataccata 840
tttatagggc agctgcggat aattctccca ccgagtacaa agatccctga ggcatattcc 900
agtggaagtg gtgaagaaca agcatttatc cagaacctgg cactattttt cacttccttt 960
ttcaagtttc atattcgagt cctagaatca acgccagaag ttgtctcttt gttactcgct 1020
ggtctagaat atctcattaa tatatcttat gttgacgaca ctgaagtatt taaggtttgt 1080
ttggactatt ggaactcgtt ggtgttggag ctatttgatg cgcatcataa ttctgataac 1140
cctgcagtaa gtgcaagcct gatgggtttg cagcctttcc ttcctggtat ggttgatggc 1200
cttggttctc aagtcatgca gcggcgtcaa ctttattctc acccaatgtc caaattaaga 1260
gggttaatga ttaaccgcat ggcgaagcct gaagaagtgc ttattgttga agatgaaaat 1320
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tgctgggcta ttgggtctat ttccggatct atggcagaag atcaggaaaa caggtttttg 1560
gtgatggtca ttcgtgattt gttgaattta tgtgaaatta ccaagggaaa agacaataaa 1620
gccgttattg caagcaacat catgtatgtc gttggccagt atccaagatt cttaagggcc 1680
cattggaagt ttttgaagac agttgtgaac aagttgtttg aattcatgca tgaaacacat 1740
cctggtgttc aggacatggc ctgtgataca ttcttgaaaa tagttcaaaa gtgcaagcga 1800
aaattcgtta ttgtacaggt tggagagaat gaaccatttg tatctgaact tctaacaggc 1860
cttgcaacaa ctgttcaaga tcttgagcct catcaaatac actcatttta tgaatcagtt 1920
ggtaatatga tccaagcaga atcagatcct cagaagagag atgaatatct ccagaggttg 1980
atggcactcc ccaaccagaa atgggcagaa atcataggac aggcacgcca cagtgtagaa 2040
ttcctcaagg atcaagttgt gatacgtaca gtgctaaaca tcctacagac taatactagt 2100
gctgctactt cactgggaac atacttctta tcccaaattt ccttgatttt cttggatatg 2160
ttgaatgtat acagaatgta cagtgagctt gtgtcaacca acattactga gggaggacca 2220
tatgcttcca agacatcttt tgtaaaactc ttaagatcgg ttaagaggga aacacttaag 2280
ctgatagaaa cctttttaga caaagctgaa gaccagccac acatagggaa acaatttgtg 2340
ccgccaatga tggaatcagt acttggtgac tatgcgagga atgtgcctga tgctagggaa 2400
tccgaagttc tttcactctt tgcaacgatt ataaacaagt acaaggcaac aatgttagac 2460
gacgtgcctc acatatttga agctgtattc cagtgtacat tggagatgat aactaagaac 2520
tttgaagatt atccagaaca ccgcctcaag tttttctcat tactccgtgc tattgctacg 2580
ttttgtttcc ctgccttgat aaagttatca agtccgcaac tgaagctagt gatggattca 2640
attatctggg catttagaca tactgagaga aatattgctg aaaccgggct taatcttttg 2700
cttgagatgc tgaaaaactt tcagcaatct gaattttgta atcaattcta ccggtcatac 2760
tttatgcaaa tcgagcaaga aatatttgcc gttttgaccg ataccttcca taagcctggc 2820
ttcaagctac atgtgttggt gctgcagcaa ctgttttgcc tgcctgagag cggtgctttg 2880
acagaaccct tgtgggatgc tacaaccgtt ccttacccgt atccggacaa cgttgcattt 2940
gttcgcgaat acaccattaa gctactgagc tcttcattcc caaacatgac tgcagcagag 3000
gtcacacaat ttgtgaatgg actatacgag tctagaaatg acccgtctgg atttaagaat 3060
aacattcgtg acttccttgt acagtctaag gagttttccg ctcaggataa caaagatctc 3120
tatgctgagg aagcagctgc acagagagag agagaacgtc aaagaatgct ttcaattcct 3180
gggcttattg ctcctaatga gattcaagac gagatggtgg actcataa 3228
<210> 2
<211> 3231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctgccg agaagttaag agacttgagt cagccgattg acgtcgtttt actcgatgcc 60
actgttgagg ccttttactc taccggatct aaggaagaaa gagcttctgc ggataatatc 120
ttgcgggatt tgaaagctaa tcctgatact tggcttcaag ttgttcacat tctacagaac 180
accagtagta cgcataccaa attttttgcc cttcaggtgc tggaaggtgt tataaaatat 240
aggtggaatg cattacccgt tgaacaacgt gatggaatga aaaattacat ctctgatgtc 300
attgtgcagc tgtcaaggga tgaagcatct ttcagaacgg aaaggcttta tgtcaacaag 360
ttaaatatca tcctggttca gatcgtgaaa caggagtggc cggcaaagtg gaaaagcttt 420
attcctgatt tagttatagc tgctaagact agtgaaacta tctgtgagaa ttgcatggct 480
attttgaaac tcctaagtga agaggtcttt gatttctcaa aaggagagat gactcagcaa 540
aagataaaag aactgaaaca gtctctaaac agcgagtttc aactcattca cgagttatgc 600
ctatatgtcc tctcagcttc ccaaagacaa gagcttatac gtgctacact ctctgcattg 660
catgcctatc tttcttggat tccgttggga tacatatttg agtccccttt gctggagatc 720
ctacttaaat tcttccctgt tccagcatat aggaatctca cacttcaatg tttgtcagag 780
gttgcatctc ttaattttgg ggacttctac gatatgcaat atgtcaagat gtacagcatt 840
ttcatgaatc agttgcaggc aattctccct ttaaatttaa atatccctga ggcatattca 900
actggaagta gtgaagaaca ggcttttatc cagaacttgg cactgttttt cacttcgttt 960
ttcaagttac atataaaaat cctagaatct gcacccgaaa atatttctct attacttgcg 1020
ggtctgggat atctcattag catatcgtat gttgatgaca ctgaagtatt caaggtttgt 1080
ttggactatt ggaattcatt agtgttggag ttgtttggga cgcgacatca tgcgtgtcac 1140
cctgcactaa ctccaagtct gtttggattg caaatggctt tccttcctag tacagttgat 1200
ggtgttaaat ctgaagtcac tgagcggcaa aaactttatt cagatccaat gtcaaaatta 1260
aggggactca tgattagtcg cacggctaag cctgaagaag tgttaattgt tgaggacgaa 1320
aatgggaaca ttgttcgtga aactatgaag gataatgatg ttcttgtcca gtataagata 1380
atgcgggaga cattaatcta cctctcacac cttgatcatg aagataccga aaaacagatg 1440
ttgagtaagc taagcaaaca gttgagcggg gaggaatggg catggaacaa tctaaacact 1500
ttatgctggg ctattgggtc tatttctggg tccatggtag tagaacagga aaacagattt 1560
ctcgtgatgg ttatccgtga tttgttaagt ttatgtgaag tcgtcaaggg aaaagacaat 1620
aaagctgtta ttgcgagcaa catcatgtac gttgttggac aatattcaag attcttaaga 1680
gcccattgga agtttttgaa gacagttgtc cataagctgt ttgaatttat gcatgagacg 1740
catcctggtg ttcaggacat ggcttgcgac acattcttaa aaattgttca gaagtgtaag 1800
cgaaaatttg ttattgttca ggttggagaa agtgagccat ttgtgtctga acttctatca 1860
ggccttgcta caatcgtcgg agatcttcaa cctcatcaga ttcatacatt ttatgaatct 1920
gttggtagta tgatccaggc agaatcagat cctcagaaga ggggggaata cctccagagg 1980
ttgatggctc tcccgaatca gaaatgggca gaaattatag gacaagcacg tcaaagtgca 2040
gatatcctca aggaaccaga tgtgatacgt actgtgctta atatcctcca gacaaatacg 2100
cgcgttgcaa cttcactagg aacattcttc ctgtctcaaa tttcgttgat cttcttggat 2160
atgctgaatg tttacagaat gtatagtgaa ctcgtttcaa gcagcattgc taatggtggc 2220
ccatacgctt cgagaacatc tcttgttaaa cttttaaggt ctgttaagag ggaaattctt 2280
aagctgatag agacgttttt agataaagct gaaaaccagc cacacattgg aaaacagttt 2340
gttccaccaa tgatggatca agtacttggc gactatgcaa gaaatgttcc tgatgcaaga 2400
gaatcagaag tcttgtcact ctttgcgaca ataatcaaca aatacaaggt tgtaatgcga 2460
gatgaagttc ccctcatatt tgaagctgtt ttccagtgca cattggagat gattactaag 2520
aattttgaag attacccaga gcaccgtctc aagtttttct cgttacttcg tgctattgct 2580
acattttgtt tccgtgcgtt gatacagttg tcaagtgagc aactgaagct agtgatggat 2640
tcagttatct gggcatttag gcatactgaa agaaatatcg ctgaaactgg gctcaatctc 2700
ttgctcgaga tgctgaaaaa ctttcagaaa tctgactttt gtaacaaatt ctaccaaaca 2760
tactttctgc aaattgagca agaagtattt gctgtcttga ccgatacctt ccacaagcct 2820
gggttcaagt tgcatgtgtt ggtgttgcag cacttattta gcctggttga gagcggatca 2880
ttggcagaac cattgtggga tgctgcaacg gtaccgcatc cttattcaaa taatgtcgcc 2940
tttgtgcttg agtacaccac caagcttcta agctcatcat tccccaacat gactacaaca 3000
gaggtgacac agtttgtgaa tggactttac gagtcgagaa acgatgttgg cagatttaag 3060
gataacatac gcgacttcct tatacagtcc aaggaatttt ctgctcagga taacaaagat 3120
ttatatgctg aggaagctgc tgcccaaatg gagagagaga gacaaagaat gctttcgatt 3180
cctggactta tagctcccag cgaaattcaa gacgacatgg ccgattctta a 3231
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgcttgtga atattgtgca g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcaaggcag ggaaacaaaa c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgggcagaaa tcataggaca g 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggctgccg agaagttaag agac 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaatcggcc atgtcgtctt g 21

Claims (4)

1.拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法在阻碍芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法包括以下步骤：
（1）获得拟南芥xpo1a突变体；
（2）播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1a突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
（3）利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，m-xpo1a-LP 与m-xpo1a-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1a突变体纯合情况；
LBb1.3-F：tcgcttgtgaatattgtgcag；m-xpo1a-LP：atcaaggcagggaaacaaaac；m-xpo1a-RP：tgggcagaaatcataggacag；如SEQ ID：No.3-5所示；
然后利用以下引物对XPO1a-F与XPO1a-R，以反转录RNA获得的cDNA为模板，进行RT-PCR的方法验证xpo1a纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1a转录本；所述XPO1a转录本的序列如SEQ ID：No.1所示；
XPO1a-F：atggcggctgagaagttaagggac；XPO1a-R：tgagtccaccatctcgtcttg；如SEQ ID：No.6-7所示；
确定xpo1a纯合子植株后，对xpo1a纯合子突变体进行留种；
（4）获得拟南芥xpo1b突变体；
（5）播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从xpo1b突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；
（6）利用引物对LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP 与m-xpo1b-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定xpo1b突变体纯合情况；
m-xpo1b-LP：tgttcaacgggtaatgcattc；m-xpo1b-RP：cctcaaaaagtgttggaaatttg；如SEQID：No.8-9所示；
利用以下引物对XPO1b-F与XPO1b-R，通过反转录RNA获得的cDNA进行RT-PCR的方法验证xpo1b纯合子突变体中确实不存在完整的XPO1b转录本；所述XPO1b转录本的序列如SEQID：No.2所示；
XPO1b-F：atggctgccgagaagttaagagac；XPO1b-R：agaatcggccatgtcgtcttg；如SEQ ID：No.10-11所示；
留种xpo1b纯合子突变体；
（7）同时播种xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体；
（8）播种40天后，在xpo1a纯合子突变体和xpo1b纯合子突变体开花期，进行正向遗传杂交和反向遗传杂交；
（9）待杂交的角果成熟后，收种；
（10）播种F1代植物20天后，用CTAB法抽取杂交植物的DNA；
（11）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的杂合体，由于是F1代，所以为杂合子，即四对引物LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，m-xpo1a-LP 与m-xpo1a-RP，LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP 与m-xpo1b-RP均能扩增到特异长度的DNA片段；对同时含有xpo1a和xpo1b T-DNA插入的突变体，留种；
（12）播种F2代植物，用CTAB法抽取杂交植物的DNA；
（13）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±的植株，留种；其中xpo1a为纯合突变，xpo1b为杂合突变；通过PCR，利用以下引物对：LBb1.3-F与m-xpo1a-RP，LBb1.3-F与m-xpo1b-RP，m-xpo1b-LP 与m-xpo1b-RP均能检测到特异的DNA条带，而利用m-xpo1a-LP 与m-xpo1a-RP无法检测到特异的DNA条带；
（14）播种F2代植物，用CTAB法和Trizol法分别抽取杂xpo1a/xpo1b±植物的DNA；
（15）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的xpo1a/xpo1b±，确定F2后代的留种的xpo1a/xpo1b±双突变体，其中xpo1a为纯合突变，xpo1b为杂合突变。
2.根据权利要求1所述的拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法在阻碍芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥xpo1a突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_078639C。
3.根据权利要求1所述的拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法在阻碍芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥xpo1b突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_088267C。
4.根据权利要求1所述的拟南芥xpo1a/xpo1b±双突变体的培育方法在阻碍芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述步骤（8）中，正向遗传杂交：以xpo1a突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1b突变体的花粉将其沾到xpo1a雌蕊的柱头上；
反向遗传杂交：以xpo1b突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集xpo1a突变体的花粉将其沾到xpo1b雌蕊的柱头上。
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