JP4171798B2 - イチゴの品種識別方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イチゴの品種識別方法に関し、詳しくはイチゴのガク（へた）を含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ各品種間で識別性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡの多型及び該増幅産物を制限酵素処理して得られるＤＮＡの多型を検出し、これを識別することによって、イチゴの品種を識別する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、イチゴの品種識別は、果実の形や大きさ、葉の形や大きさ、草型等の比較により行われてきた。しかし、これらは連続的な形質による違いに依存しているため、正確に判断するのが極めて困難であった。
さらに、上記の方法は、苗の大きさや生育状態等を揃えて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することは事実上できない。
また、市場に流通している果実は、多様な条件の下で栽培されているため、上記の従来方法では品種を識別することは困難である。
【０００３】
種苗法では、登録されているイチゴ品種の育成者権を認めている。しかし、育成者権を有する者、団体等が苗の増殖、販売に関する承諾を与えていない者、団体等によって、当該品種を違法に増殖、販売していることを見つけても、従来のイチゴの品種判別方法では、登録されたイチゴ品種との同一性を特定することが難しいため、育成者権の保護が有効になされていないという一面があった。
また、ＪＡＳ法による農産物の表示義務が強化されると共に、消費者がイチゴの購入時に品種を基準にして選択している等の状況からしても、イチゴの品種を正確に識別することは重要なことであるにもかかわらず、外見では一部の品種を除いて殆ど識別することができず、表示の上で大きな問題である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが可能な方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、イチゴ品種の識別をＤＮＡ解析によって行うべく検討し、ＰＣＲ法により増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種を効果的に識別できることを見出し、本発明に到達したのである。
【０００６】
すなわち、イチゴのアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（以下、APX と略記することもある。）をコードする遺伝子、カルコンイソメラーゼ（以下、CHI と略記することもある。）をコードする遺伝子及びフラバノン３ヒドロキシラーゼ（以下、F3H と略記することもある。）をコードする遺伝子のイントロンを含む塩基配列が、イチゴの品種によって特異的に変異していること並びにその差を制限酵素Mlu I 、Pvu II、Hpa II、Nco I 、Acc I 、Dde I 、Rsa I 等で処理することによって検出できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を、配列番号８に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の２１６番目から２９１番目に相当する挿入部位の有無、配列番号９に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の９３番目から９８番目に相当する制限酵素 Mlu I 認識部位の有無、配列番号１１に係るイチゴカルコンイソメラーゼ遺伝子断片の１１１番目から１１６番目に相当する制限酵素 Pvu II 認識部位の有無の中から選ばれた少なくとも１種の識別用ＤＮＡマーカーにより識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法である。
請求項２記載の本発明は、ＰＣＲ法において、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４として記載されたプライマーの対を用いることを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項３記載の本発明は、イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号５又は６、及び配列番号７として記載されたプライマーの対を用いたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素 Nco I 、制限酵素 Acc I 、制限酵素 Hpa II 、制限酵素 Dde I 、又は制限酵素 Rsa I のうちの少なくとも１つから選択される制限酵素によって消化させることにより生じる多型を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
イチゴの品種をＤＮＡ解析によって分類する方法では、特定のマーカーが用いられるが、本発明では新たに開発したマーカーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種を分類する方法を確立した。
すなわち、ＰＣＲ法により増幅した部分にイチゴ品種間で異なる塩基配列が存在し、かつその配列を認識できる制限酵素があることから、これらの組み合わせによってイチゴの品種識別を行う方法である。
【０００９】
本発明では、イチゴの品種間で特異的に塩基配列が異なる酵素遺伝子として、APX 、CHI 及び F3Hの遺伝子を選択した。APX は、植物の葉に含まれる代表的な活性酸素消去能を有する酵素の一つで、葉緑体に局在している。CHI は、カルコンシンターゼによって合成されたカルコンを異性化させる酵素であり、F3Hは、さらに３位を水酸化するなど、植物に含まれる天然色素であるアントシアニンの生合成経路を触媒するものである。
【００１０】
ＰＣＲ法では、イチゴ試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記のAPX 、CHI 又は F3H遺伝子とイントロン部分を含む領域を標的にして行う。ＤＮＡの増幅に必要なプライマーについて、本発明では、既知のイチゴのイントロンを含むＤＮＡ配列を利用してＰＣＲ増幅に必要な配列を設計した後、識別が求められるイチゴ品種のＤＮＡを鋳型として、その部分をクローニングして塩基配列を決定し、多型が生じるようなＤＮＡ配列を確認すると共に、その部分が確実に増幅するようにプライマーの設計を修正し、最終的なものとした。
これらのプライマーが、APXFP （配列表の配列番号１）とAPXRV （配列表の配列番号２）、CHIFP （配列表の配列番号３）とCHIRV （配列表の配列番号４）、又はF3HFP （配列表の配列番号５）もしくはF3HFP2（配列表の配列番号６）とF3HRV （配列表の配列番号７）である。
すなわち、ＤＮＡデータベースからAPX のＤＮＡ配列（AF158652) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてAPXFP とAPXRV を設計した。また、ＤＮＡデータベースからCHI のＤＮＡ配列（AYO17486及びAYO17478) を選択し、このＤＮＡ配列情報からCHIFP と CHIRVを設計し、同様にＤＮＡデータベースからF3H のＤＮＡ配列（AOY17482及びAOY17479) を選択し、このＤＮＡ配列情報から F3HFP、F3HFP2 と F3HRV を設計した。
【００１１】
試料のイチゴからのＤＮＡの抽出は、ガクを含む果実及び／又は葉から、Laurence Marechal-Drourard et.al.（Plant Molecular Biology Reporter,1995,vol.13(1),p.26-30）の方法を改変し行った。この方法では、すりつぶした試料にＤＮＡ抽出溶液を加え、保温・冷却処理したのち、遠心して得た上清にイソプロパノールなどの溶媒を加えてＤＮＡを沈殿させ、必要に応じて遠心してＤＮＡを分離する。次いで、ＴＥとリボヌクレアーゼ溶液を加えてＲＮＡを分解する。このＲＮａｓｅ処理後の溶液にＤＥＡＥセファデックス混液を添加し、再度遠心して得た固形物に溶出バッファーを加えてＤＮＡを溶出させ、これを常法により精製する。
【００１２】
上記により抽出したＤＮＡを鋳型とし、 APX遺伝子、CHI 遺伝子又はF3H 遺伝子とイントロン部分を含む領域を標的としてＰＣＲ法を行う。ＰＣＲ反応液として、Taq ポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応用緩衝液、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓにプライマー対を加えたものを用いる。
反応工程は、常法に従い約９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を１サイクルとする反応を３０〜４０サイクル行ってＤＮＡを増幅する。
【００１３】
次に、増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これにより、増幅産物のうち品種間の識別性が現れる塩基配列であることを示すバンドを検出する。すなわち、ＰＣＲ法により増幅された産物を特定の制限酵素で処理した後、アガロースゲル等で分離すると、ＤＮＡがアガロース等のゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差により分離され、臭化エチジウムブロマイド等により染色されてバンドとして増幅ＤＮＡの相違が検出されるのである。
イチゴ各品種から得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルごと切り出してＤＮＡを回収し、これをEasy T Vector システム（プロメガ社）等を用いてクローニングを行う。まず、ＤＮＡをプラスミドに組み込み、大腸菌に導入する。次いで、大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＤＮＡシーケンサーを用いてクローンの塩基配列を決定する。イチゴ各品種からのプラスミドの解析結果や公開されている配列情報を比較することによって、標的とした塩基配列中に品種間で特異的に変異しており、かつその差を制限酵素処理と電気泳動により検出できる部位が存在するかを調べ、品種識別用マーカーとする。
【００１４】
イチゴAPX のクローンとして APX6ny1（配列表の配列番号８）、APX6ih2 （配列表の配列番号９）、APX6ih3 （配列表の配列番号１０）、イチゴCHIのクローンとして CHIPvuII（配列表の配列番号１１）、CHImain（配列表の配列番号１２）、イチゴF3H のクローンとして F3HCesena1 （配列表の配列番号１３）、F3HCesena2 （配列表の配列番号１４）、 F3HCesena3 （配列表の配列番号１５）がある。これらは、挿入配列の有無、特定の制限酵素認識部位の有無により特徴付けられる。
【００１５】
イチゴ品種は、これらの対立遺伝子の組み合わせが異なることから、識別が可能である。イチゴAPX のクローンは、挿入配列の有無の他に、制限酵素Mlu I の認識部位の有無により識別され、イチゴCHI のクローンは、制限酵素Pvu IIの認識部位の有無により識別される。また、イチゴF3H のクローンの対立遺伝子間で配列の異なる部分を認識する制限酵素としては、Nco I 、Acc I 、Hpa II、Dde I 、Rsa I などがある。
【００１６】
したがって、APX 挿入配列（配列表の配列番号１６）、APX-Mlu I（配列表の配列番号１７）、CHI-Pvu II（配列表の配列番号１８）、F3H-Nco I（配列表の配列番号１９）、F3H-Hpa II（配列表の配列番号２０）、F3H-Acc I（配列表の配列番号２１）、F3H-Dde I（配列表の配列番号２２）及びF3H-Rsa I（配列表の配列番号２３）の中から選ばれた少なくとも１種を識別用ＤＮＡマーカーとして用いることによって、イチゴ品種の識別をすることができる。
【００１７】
本発明では、イチゴ品種として「とよのか」、「女峰」、「とちおとめ」、「章姫」、「さちのか」、「アイベリー」、「レッドパール」、「濃姫」、「サンチーゴ」、「ピーストロ」、「アイストロ」、「べにほっぺ」、「けいきわせ」、「セセナ」の１４種類を供試したが、これらに限定されず、その他の品種であっても、本発明の方法により識別することが可能である。
【００１８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例などにより詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
試験例１（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴAPX のＤＮＡ配列（AF158652）を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして、フォワードプライマー（APXFP)（配列表の配列番号１）とリバースプライマー（APXRV)（配列表の配列番号２）を設計した。
イチゴ「セセナ」、「女峰」、「久留米IH３号」の２品種、１系統の新葉からＤＮＡを抽出した。すなわち、イチゴ新葉約１００ｍｇを乳鉢ですりつぶし、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ４００００）、１．４％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．５）１ｍｌを加え、６５℃で１０分間保温した後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して固形物を分離した。上清７５０μｌを新しい遠心管に移し、５Ｍ 酢酸カリウム２５０μｌを加えて氷中で１０〜３０分間保冷後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
【００１９】
次に、この上清約７００μｌを新しい遠心管に移し、同量のイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上清を捨て、ＤＮＡを含む沈殿物をＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液２００μｌを添加し、５５℃で３０分間保温してＲＮＡを分解した。
洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファデックス混液２００μｌを上記ＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度ゆっくり混ぜた。この溶液を遠心した後、上清を捨て、洗浄バッファー５００μｌを添加してセファデックスを洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。
沈降後、上清を取り除き、６０℃に保温した溶出バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム２．０Ｍ）を加え、ＤＮＡをＤＥＡＥセファデックスから溶出バッファー中に溶出させた。ＤＮＡを含む溶出バッファーを新しい遠心管に移し、イソプロパノールを添加した。１０分間保冷（−８０℃）後、遠心してＤＮＡを集め、７０％エタノールで洗浄した。得られたＤＮＡを乾燥して１／１０に希釈したＴＥバッファーに溶解した。
【００２０】
このようにして抽出したＤＮＡ１０〜１００ｎｇを鋳型に、APX遺伝子及びイントロン部分を含む領域を標的にしたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、Taq ポリメラーゼ（５ユニット／μｌ、宝酒造）１μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２μｌ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）５μｌを混合し、上記のAPXFPとAPXRVをそれぞれ５０ｐｍｏｌを加え、滅菌水を加えて合計の反応量を５０μｌとした。
反応装置は、ＡＢＩ（Applied Biosystems Instrument)社製、Gene Amp PCR System 9700を使用し、９４℃５分後、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の反応を３５サイクル行い、７２℃５分間の伸長反応を補足した。
【００２１】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用し、１．５％アガロースゲルで３０分間泳動し、臭化エチジウムブロマイド染色後の紫外線照射によりバンドを検出した。
各品種から得たＤＮＡ断片（約０．７５ｋｂ）をアガロースゲルごと切り出して QIAEX（キアゲン社）を用いてＤＮＡを回収した。次に、回収したＤＮＡ断片をEasy T vector システム（プロメガ社）を用いてプラスミドに組み込み、大腸菌に導入した。
この大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＡＢＩ社製、ＤＮＡシーケンサー PRISM377 を用いて塩基配列を決定した。各品種から数個のプラスミドを解析した結果、特徴的な配列を有するクローンAPX6nyl （配列表の配列番号８）、APX6ih2 （配列表の配列番号９）、APX6ih3 （配列表の配列番号１０）等の複対立遺伝子を見出した。公開されているクローンAF158652と塩基配列を比較したところ、高い相同性があったものの、一部に異なる配列を有していた。APX6nyl は７６ｂｐの挿入があり（２１６番目から２９１番目）、またAPX6ih2 は９４、９５番目の位置にＣＧの挿入があるため、前後の配列（９３〜９８番目）が acgcgt となり、制限酵素 Mlu Iの認識部位であった。APX6ih3 とクローンAF158652は、挿入配列もなく、 Mlu Iの認識部位も存在しなかった。これらのことから、イチゴ品種は、これらの複対立遺伝子を組み合わせて持っていることが明らかとなった（表１）。
【００２２】
【表１】
【００２３】
試験例２（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴのカルコンイソメラーゼ（CHI)のＤＮＡ配列（AYO17486、AYO17478) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプライマー（CHIFP 、配列表の配列番号３）とリバースプライマー（CHIRV、配列表の配列番号４）を設計した。
設計したプライマーと、各品種から試験例１と同様にして抽出したＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲ反応により、 CHI遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をEasy T vector を用いてクローニングし、２個のクローン（CHIPvu II 、CHImain1) の塩基配列（前者が配列表の配列番号１１、後者が配列番号１２）を決定した。この配列は、公開されているAYO17486、AYO17478と高い相同性を有していた。しかし、複数の部位でＤＮＡ配列の異なる断片があった。
CHIPvu II は、１１１ｂｐ付近に制限酵素Pvu II認識部位を有していたが、CHImain1は、この付近にPvu II 認識部位を有していなかった。このことから、イチゴ品種の CHI 遺伝子については、Pvu II認識部位の有無が異なる対立遺伝子が存在することが明らかとなった。
【００２４】
試験例３（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴのフラバノン３ヒドロキシラーゼ（F3H)のＤＮＡ配列（AOY17482、AOY17479) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプライマー（F3HFP、配列表の配列番号５、F3HFP2、配列表の配列番号６）とリバースプライマー（F3HRV 、配列表の配列番号７）を設計した。
設計したプライマーと、各品種から試験例１と同様にして抽出したＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲ反応により、 F3H遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をEasy T vector を用いてクローニングし、複数のクローンについて塩基配列を決定した。
得られたクローンF3HCesena1、F3HCesena2、F3HCesena3は、公開されているAOY17482、AOY17479と高い相同性を有していたが、複数の部位でＤＮＡ配列が異なっていた。
【００２５】
AOY17482、AOY17479、F3HCesena1、F3HCesena2及びF3HCesena3の５個の F3Hの対立遺伝子間で配列の異なる部分を認識する制限酵素として、Nco I 、Acc I 、Hpa II、Dde I 、Rsa I などがあった。Cesena1 は、１個のAcc I 、Hpa II、Rsa I 、２個の Nco I、３個のDde I の認識部位があり、Cesena2 では、Hpa II の認識部位はなく、１個のAcc I 、Dde I 、 Nco I、Rsa I の認識部位があった。また、F3HCesena3は、１個のHpa II、 Nco I、Rsa I 、２個のAcc I 、３個のDde I の認識部位が確認された。AOY17482では、Acc I 、Rsa I の認識部位はなく、４個のDde I 、１個のHpa II、 Nco I の認識部位があった。AOY17479では、Rsa I の認識部位はなく、１個のAcc I 、Hpa II、 Nco I、３個のDde I の認識部位があった（表２）。イチゴ品種の F3H遺伝子については、複数の制限酵素認識部位の有無が異なる対立遺伝子が存在することが明らかとなった（表２）。
【００２６】
【表２】
【００２７】
実施例１（APX のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別）
イチゴ１４品種のガク又は葉より試験例１と同様の方法でＤＮＡを抽出した。すなわち、乳鉢にイチゴのガク片約半分、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物（EDTA）、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４００００）、１．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ５．５）２００μL 、消泡剤１滴を加えてすりつぶし、さらにＤＮＡ抽出溶液４００μｌを添加し、遠心管に移した。６５℃で１０分間保温した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行って固形物を分離した。
【００２８】
この上清６００μｌを新しい遠心管に移し、氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム２００μｌ（終濃度１．２５Ｍ）を加え、氷中で１０分間保冷する。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）後、上清７５０μｌをとり、新しい遠心管に移し、同量のイソプロパノールを添加した。−８５℃で１０分間保冷後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。上清を捨て、ＤＮＡを含む沈殿物にＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液１５０μｌを添加し、５５℃で１０分間保温しＲＮＡを分解した。
【００２９】
洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファッデクス混液２００μｌをＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度、ゆっくり混ぜた。ガラスウールを詰めたピペットチップをカラムにして混液をアプライし、排出した。（このとき排出が悪ければ、圧をかけて押し出す。）
次いで、２００μｌの洗浄バッファーを添加し、圧をかけ排出するという操作を２回繰り返す。カラムから完全にバッファーを排出し、カラムを新しい１．５ｍｌ遠心管に入れ、６０℃に保温した溶出バッファー２００μｌを添加し、１分程度待ち、圧をかけて排出した。２００μｌのイソプロパノールを添加し、−８５℃で１０分間保冷後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。上清を捨て、７０％エタノール１００μｌを添加し、洗浄した。
遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）後、上清を捨て、遠心管の蓋を開けて２０分ほど乾燥させた。滅菌水４０μｌを添加し、軽くボルテックスした。５５℃で１０分間ほど保温し、スピンダウンして蓋についた液を集めた。得られた液１０μｌを泳動してＤＮＡの有無を確かめた。
【００３０】
APX マーカーを用いたイチゴ品種識別のため、以下の操作を行った。抽出したＤＮＡ（１０〜１００ｎｇ）５．０μｌ、APX 増幅用プライマー対（配列番号１及び２）それぞれ（５０ｐｍｏｌ）０．５μｌ、ｄＮＴＰミックス４．０μｌ、ＰＣＲ用１０×バッファー５．０μｌ、Taq ポリメラーゼ５．０ユニット／μｌ（宝酒造）０．５μｌ、滅菌水３４．５μｌの合計５０．０μｌをＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ機械（ＡＢＩ社製、Gene Amp PCR System 9700) にセットして反応を開始した。
【００３１】
ＰＣＲ条件は次の通りである。
９４℃で５分間反応後、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の反応を３５回繰り返し、７２℃５分で伸長反応を補足した。ＰＣＲ反応液５０μｌから１０μｌをとり、制限酵素１０×反応バッファー２μｌ、制限酵素Mlu I 約１０ユニット／分の合計２０μｌとなるように滅菌水で調整し、３７℃で２〜３時間反応させてＤＮＡを消化した。
制限酵素処理後の反応液１０μｌに６×ローディングバッファー２μｌを添加し、エチジウムブロマイド入りの１．５％アガロースゲルのウエルに入れて、電気泳動を行った。電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用して紫外線照射によりバンドを検出した。電気泳動後のアガロースゲルを紫外線下に移し、写真をとって品種間で多型を比較した（図１）。また、検出結果を表３にまとめた。図中の試料番号は、1:とよのか、2:女峰、3:とちおとめ、4:章姫、5:さちのか、6:アイベリー、7:レッドパール、8:濃姫、9:サンチーゴ、10: ピーストロ、11: アイストロ、12: べにほっぺ、13: けいきわせ、14: セセナを表す。
【００３２】
【表３】
○はＤＮＡ断片（マーカー）を有する、×は有しないことを示す。
【００３３】
実施例２（CHI-Pvu IIのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別）
CHI-Pvu II マーカーを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイチゴ品種の識別を行った。結果を図２と表４に示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。
【００３４】
【表４】
【００３５】
図２及び表４から明らかなように、供試した１４品種をマーカーの有無により２群に分けることができる。
【００３６】
実施例３（F3H マーカーによるイチゴ品種の識別）
F3H の各 マーカーを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイチゴ品種の識別を行った。すなわち、ＰＣＲ用プライマーとＰＣＲ反応後に使用する制限酵素の種類の違いを除くとＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ条件及び検出操作は実施例１の場合と同様に実施した。その結果を図３（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び表５に示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。
【００３７】
【表５】
【００３８】
表及び図から明らかなように、 F3Hマーカーの有無により、供試した１４種の品種は分類される。すなわち、「とよのか」、「セセナ」の２品種が５種のマーカーを有し、「レッドパール」は F3H-NcoI 以外の４種、「ピーストロ」はF3H-DdeI以外の４種のマーカーを有していた。また、「さちのか」、「べにほっぺ」は F3H-HpaII、F3H-AccI及びF3H-DdeIの３種、「サンチーゴ」はF3H-AccI、F3H-DdeI及びF3H-RsaIの３種、「けいきわせ」はF3H-NcoI、F3H-AccI及びF3H-RsaIの３種のマーカーを有していた。「アイベリー」はF3H-AccI及びF3H-RsaIの２種、「章姫」は F3H-NcoI 及び F3H-AccI の２種、「濃姫」、「アイストロ」はF3H-AccIの１種、「女峰」はF3H-NcoIの１種を有しており、「とちおとめ」はどのマーカーも有していなかった。
【００３９】
以上の結果より、実施例１〜３において各マーカーを組み合わせることによって、供試した１４品種のイチゴはすべて識別することができることが分かる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することができる方法が提供される。そのため、本発明によれば、多様な条件の下で栽培され、市場に流通しているイチゴ果実についても、その品種を正確に識別することが可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 イチゴ品種間で検出されたAPX-Mlu Iマーカー多型の泳動写真である。
【符号の説明】
１は「とよのか」、２は「女峰」、３は「とちおとめ」、４は「章姫」、５は「さちのか」、６は「アイベリー」、７は「レッドパール」、８は「濃姫」、９は「サンチーゴ」、１０は「ピーストロ」、１１は「アイストロ」、１２は「べにほっぺ」、１３は「けいきわせ」、１４は「セセナ」をそれぞれ示す。
【図２】 イチゴ品種間で検出されたCHI-Pvu II マーカー多型の泳動写真である。
【符号の説明】
図１と同じである。
【図３】 （１）はイチゴ品種間で検出されたF3H-Nco I マーカー多型、（２）はF3H-Hpa II マーカー多型、（３）はF3H-Acc I マーカー多型、（４）はF3H-Dde I マーカー多型、（５）はF3H-Rsa I マーカー多型のそれぞれの泳動写真である。
【符号の説明】
図１と同じである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、イチゴの品種識別方法に関し、詳しくはイチゴのガク（へた）を含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ各品種間で識別性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡの多型及び該増幅産物を制限酵素処理して得られるＤＮＡの多型を検出し、これを識別することによって、イチゴの品種を識別する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、イチゴの品種識別は、果実の形や大きさ、葉の形や大きさ、草型等の比較により行われてきた。しかし、これらは連続的な形質による違いに依存しているため、正確に判断するのが極めて困難であった。
さらに、上記の方法は、苗の大きさや生育状態等を揃えて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することは事実上できない。
また、市場に流通している果実は、多様な条件の下で栽培されているため、上記の従来方法では品種を識別することは困難である。
【０００３】
種苗法では、登録されているイチゴ品種の育成者権を認めている。しかし、育成者権を有する者、団体等が苗の増殖、販売に関する承諾を与えていない者、団体等によって、当該品種を違法に増殖、販売していることを見つけても、従来のイチゴの品種判別方法では、登録されたイチゴ品種との同一性を特定することが難しいため、育成者権の保護が有効になされていないという一面があった。
また、ＪＡＳ法による農産物の表示義務が強化されると共に、消費者がイチゴの購入時に品種を基準にして選択している等の状況からしても、イチゴの品種を正確に識別することは重要なことであるにもかかわらず、外見では一部の品種を除いて殆ど識別することができず、表示の上で大きな問題である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが可能な方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、イチゴ品種の識別をＤＮＡ解析によって行うべく検討し、ＰＣＲ法により増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種を効果的に識別できることを見出し、本発明に到達したのである。
【０００６】
すなわち、イチゴのアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（以下、APX と略記することもある。）をコードする遺伝子、カルコンイソメラーゼ（以下、CHI と略記することもある。）をコードする遺伝子及びフラバノン３ヒドロキシラーゼ（以下、F3H と略記することもある。）をコードする遺伝子のイントロンを含む塩基配列が、イチゴの品種によって特異的に変異していること並びにその差を制限酵素Mlu I 、Pvu II、Hpa II、Nco I 、Acc I 、Dde I 、Rsa I 等で処理することによって検出できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を、配列番号８に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の２１６番目から２９１番目に相当する挿入部位の有無、配列番号９に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の９３番目から９８番目に相当する制限酵素 Mlu I 認識部位の有無、配列番号１１に係るイチゴカルコンイソメラーゼ遺伝子断片の１１１番目から１１６番目に相当する制限酵素 Pvu II 認識部位の有無の中から選ばれた少なくとも１種の識別用ＤＮＡマーカーにより識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法である。
請求項２記載の本発明は、ＰＣＲ法において、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４として記載されたプライマーの対を用いることを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項３記載の本発明は、イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号５又は６、及び配列番号７として記載されたプライマーの対を用いたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素 Nco I 、制限酵素 Acc I 、制限酵素 Hpa II 、制限酵素 Dde I 、又は制限酵素 Rsa I のうちの少なくとも１つから選択される制限酵素によって消化させることにより生じる多型を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
イチゴの品種をＤＮＡ解析によって分類する方法では、特定のマーカーが用いられるが、本発明では新たに開発したマーカーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種を分類する方法を確立した。
すなわち、ＰＣＲ法により増幅した部分にイチゴ品種間で異なる塩基配列が存在し、かつその配列を認識できる制限酵素があることから、これらの組み合わせによってイチゴの品種識別を行う方法である。
【０００９】
本発明では、イチゴの品種間で特異的に塩基配列が異なる酵素遺伝子として、APX 、CHI 及び F3Hの遺伝子を選択した。APX は、植物の葉に含まれる代表的な活性酸素消去能を有する酵素の一つで、葉緑体に局在している。CHI は、カルコンシンターゼによって合成されたカルコンを異性化させる酵素であり、F3Hは、さらに３位を水酸化するなど、植物に含まれる天然色素であるアントシアニンの生合成経路を触媒するものである。
【００１０】
ＰＣＲ法では、イチゴ試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記のAPX 、CHI 又は F3H遺伝子とイントロン部分を含む領域を標的にして行う。ＤＮＡの増幅に必要なプライマーについて、本発明では、既知のイチゴのイントロンを含むＤＮＡ配列を利用してＰＣＲ増幅に必要な配列を設計した後、識別が求められるイチゴ品種のＤＮＡを鋳型として、その部分をクローニングして塩基配列を決定し、多型が生じるようなＤＮＡ配列を確認すると共に、その部分が確実に増幅するようにプライマーの設計を修正し、最終的なものとした。
これらのプライマーが、APXFP （配列表の配列番号１）とAPXRV （配列表の配列番号２）、CHIFP （配列表の配列番号３）とCHIRV （配列表の配列番号４）、又はF3HFP （配列表の配列番号５）もしくはF3HFP2（配列表の配列番号６）とF3HRV （配列表の配列番号７）である。
すなわち、ＤＮＡデータベースからAPX のＤＮＡ配列（AF158652) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてAPXFP とAPXRV を設計した。また、ＤＮＡデータベースからCHI のＤＮＡ配列（AYO17486及びAYO17478) を選択し、このＤＮＡ配列情報からCHIFP と CHIRVを設計し、同様にＤＮＡデータベースからF3H のＤＮＡ配列（AOY17482及びAOY17479) を選択し、このＤＮＡ配列情報から F3HFP、F3HFP2 と F3HRV を設計した。
【００１１】
試料のイチゴからのＤＮＡの抽出は、ガクを含む果実及び／又は葉から、Laurence Marechal-Drourard et.al.（Plant Molecular Biology Reporter,1995,vol.13(1),p.26-30）の方法を改変し行った。この方法では、すりつぶした試料にＤＮＡ抽出溶液を加え、保温・冷却処理したのち、遠心して得た上清にイソプロパノールなどの溶媒を加えてＤＮＡを沈殿させ、必要に応じて遠心してＤＮＡを分離する。次いで、ＴＥとリボヌクレアーゼ溶液を加えてＲＮＡを分解する。このＲＮａｓｅ処理後の溶液にＤＥＡＥセファデックス混液を添加し、再度遠心して得た固形物に溶出バッファーを加えてＤＮＡを溶出させ、これを常法により精製する。
【００１２】
上記により抽出したＤＮＡを鋳型とし、 APX遺伝子、CHI 遺伝子又はF3H 遺伝子とイントロン部分を含む領域を標的としてＰＣＲ法を行う。ＰＣＲ反応液として、Taq ポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応用緩衝液、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓにプライマー対を加えたものを用いる。
反応工程は、常法に従い約９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を１サイクルとする反応を３０〜４０サイクル行ってＤＮＡを増幅する。
【００１３】
次に、増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これにより、増幅産物のうち品種間の識別性が現れる塩基配列であることを示すバンドを検出する。すなわち、ＰＣＲ法により増幅された産物を特定の制限酵素で処理した後、アガロースゲル等で分離すると、ＤＮＡがアガロース等のゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差により分離され、臭化エチジウムブロマイド等により染色されてバンドとして増幅ＤＮＡの相違が検出されるのである。
イチゴ各品種から得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルごと切り出してＤＮＡを回収し、これをEasy T Vector システム（プロメガ社）等を用いてクローニングを行う。まず、ＤＮＡをプラスミドに組み込み、大腸菌に導入する。次いで、大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＤＮＡシーケンサーを用いてクローンの塩基配列を決定する。イチゴ各品種からのプラスミドの解析結果や公開されている配列情報を比較することによって、標的とした塩基配列中に品種間で特異的に変異しており、かつその差を制限酵素処理と電気泳動により検出できる部位が存在するかを調べ、品種識別用マーカーとする。
【００１４】
イチゴAPX のクローンとして APX6ny1（配列表の配列番号８）、APX6ih2 （配列表の配列番号９）、APX6ih3 （配列表の配列番号１０）、イチゴCHIのクローンとして CHIPvuII（配列表の配列番号１１）、CHImain（配列表の配列番号１２）、イチゴF3H のクローンとして F3HCesena1 （配列表の配列番号１３）、F3HCesena2 （配列表の配列番号１４）、 F3HCesena3 （配列表の配列番号１５）がある。これらは、挿入配列の有無、特定の制限酵素認識部位の有無により特徴付けられる。
【００１５】
イチゴ品種は、これらの対立遺伝子の組み合わせが異なることから、識別が可能である。イチゴAPX のクローンは、挿入配列の有無の他に、制限酵素Mlu I の認識部位の有無により識別され、イチゴCHI のクローンは、制限酵素Pvu IIの認識部位の有無により識別される。また、イチゴF3H のクローンの対立遺伝子間で配列の異なる部分を認識する制限酵素としては、Nco I 、Acc I 、Hpa II、Dde I 、Rsa I などがある。
【００１６】
したがって、APX 挿入配列（配列表の配列番号１６）、APX-Mlu I（配列表の配列番号１７）、CHI-Pvu II（配列表の配列番号１８）、F3H-Nco I（配列表の配列番号１９）、F3H-Hpa II（配列表の配列番号２０）、F3H-Acc I（配列表の配列番号２１）、F3H-Dde I（配列表の配列番号２２）及びF3H-Rsa I（配列表の配列番号２３）の中から選ばれた少なくとも１種を識別用ＤＮＡマーカーとして用いることによって、イチゴ品種の識別をすることができる。
【００１７】
本発明では、イチゴ品種として「とよのか」、「女峰」、「とちおとめ」、「章姫」、「さちのか」、「アイベリー」、「レッドパール」、「濃姫」、「サンチーゴ」、「ピーストロ」、「アイストロ」、「べにほっぺ」、「けいきわせ」、「セセナ」の１４種類を供試したが、これらに限定されず、その他の品種であっても、本発明の方法により識別することが可能である。
【００１８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例などにより詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
試験例１（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴAPX のＤＮＡ配列（AF158652）を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして、フォワードプライマー（APXFP)（配列表の配列番号１）とリバースプライマー（APXRV)（配列表の配列番号２）を設計した。
イチゴ「セセナ」、「女峰」、「久留米IH３号」の２品種、１系統の新葉からＤＮＡを抽出した。すなわち、イチゴ新葉約１００ｍｇを乳鉢ですりつぶし、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ４００００）、１．４％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．５）１ｍｌを加え、６５℃で１０分間保温した後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して固形物を分離した。上清７５０μｌを新しい遠心管に移し、５Ｍ 酢酸カリウム２５０μｌを加えて氷中で１０〜３０分間保冷後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
【００１９】
次に、この上清約７００μｌを新しい遠心管に移し、同量のイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上清を捨て、ＤＮＡを含む沈殿物をＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液２００μｌを添加し、５５℃で３０分間保温してＲＮＡを分解した。
洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファデックス混液２００μｌを上記ＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度ゆっくり混ぜた。この溶液を遠心した後、上清を捨て、洗浄バッファー５００μｌを添加してセファデックスを洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。
沈降後、上清を取り除き、６０℃に保温した溶出バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム２．０Ｍ）を加え、ＤＮＡをＤＥＡＥセファデックスから溶出バッファー中に溶出させた。ＤＮＡを含む溶出バッファーを新しい遠心管に移し、イソプロパノールを添加した。１０分間保冷（−８０℃）後、遠心してＤＮＡを集め、７０％エタノールで洗浄した。得られたＤＮＡを乾燥して１／１０に希釈したＴＥバッファーに溶解した。
【００２０】
このようにして抽出したＤＮＡ１０〜１００ｎｇを鋳型に、APX遺伝子及びイントロン部分を含む領域を標的にしたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、Taq ポリメラーゼ（５ユニット／μｌ、宝酒造）１μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２μｌ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）５μｌを混合し、上記のAPXFPとAPXRVをそれぞれ５０ｐｍｏｌを加え、滅菌水を加えて合計の反応量を５０μｌとした。
反応装置は、ＡＢＩ（Applied Biosystems Instrument)社製、Gene Amp PCR System 9700を使用し、９４℃５分後、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の反応を３５サイクル行い、７２℃５分間の伸長反応を補足した。
【００２１】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用し、１．５％アガロースゲルで３０分間泳動し、臭化エチジウムブロマイド染色後の紫外線照射によりバンドを検出した。
各品種から得たＤＮＡ断片（約０．７５ｋｂ）をアガロースゲルごと切り出して QIAEX（キアゲン社）を用いてＤＮＡを回収した。次に、回収したＤＮＡ断片をEasy T vector システム（プロメガ社）を用いてプラスミドに組み込み、大腸菌に導入した。
この大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＡＢＩ社製、ＤＮＡシーケンサー PRISM377 を用いて塩基配列を決定した。各品種から数個のプラスミドを解析した結果、特徴的な配列を有するクローンAPX6nyl （配列表の配列番号８）、APX6ih2 （配列表の配列番号９）、APX6ih3 （配列表の配列番号１０）等の複対立遺伝子を見出した。公開されているクローンAF158652と塩基配列を比較したところ、高い相同性があったものの、一部に異なる配列を有していた。APX6nyl は７６ｂｐの挿入があり（２１６番目から２９１番目）、またAPX6ih2 は９４、９５番目の位置にＣＧの挿入があるため、前後の配列（９３〜９８番目）が acgcgt となり、制限酵素 Mlu Iの認識部位であった。APX6ih3 とクローンAF158652は、挿入配列もなく、 Mlu Iの認識部位も存在しなかった。これらのことから、イチゴ品種は、これらの複対立遺伝子を組み合わせて持っていることが明らかとなった（表１）。
【００２２】
【表１】
試験例２（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴのカルコンイソメラーゼ（CHI)のＤＮＡ配列（AYO17486、AYO17478) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプライマー（CHIFP 、配列表の配列番号３）とリバースプライマー（CHIRV、配列表の配列番号４）を設計した。
設計したプライマーと、各品種から試験例１と同様にして抽出したＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲ反応により、 CHI遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をEasy T vector を用いてクローニングし、２個のクローン（CHIPvu II 、CHImain1) の塩基配列（前者が配列表の配列番号１１、後者が配列番号１２）を決定した。この配列は、公開されているAYO17486、AYO17478と高い相同性を有していた。しかし、複数の部位でＤＮＡ配列の異なる断片があった。
CHIPvu II は、１１１ｂｐ付近に制限酵素Pvu II認識部位を有していたが、CHImain1は、この付近にPvu II 認識部位を有していなかった。このことから、イチゴ品種の CHI 遺伝子については、Pvu II認識部位の有無が異なる対立遺伝子が存在することが明らかとなった。
【００２４】
試験例３（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）マーカーの開発）
ＤＮＡデータベースからイチゴのフラバノン３ヒドロキシラーゼ（F3H)のＤＮＡ配列（AOY17482、AOY17479) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプライマー（F3HFP、配列表の配列番号５、F3HFP2、配列表の配列番号６）とリバースプライマー（F3HRV 、配列表の配列番号７）を設計した。
設計したプライマーと、各品種から試験例１と同様にして抽出したＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲ反応により、 F3H遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をEasy T vector を用いてクローニングし、複数のクローンについて塩基配列を決定した。
得られたクローンF3HCesena1、F3HCesena2、F3HCesena3は、公開されているAOY17482、AOY17479と高い相同性を有していたが、複数の部位でＤＮＡ配列が異なっていた。
【００２５】
AOY17482、AOY17479、F3HCesena1、F3HCesena2及びF3HCesena3の５個の F3Hの対立遺伝子間で配列の異なる部分を認識する制限酵素として、Nco I 、Acc I 、Hpa II、Dde I 、Rsa I などがあった。Cesena1 は、１個のAcc I 、Hpa II、Rsa I 、２個の Nco I、３個のDde I の認識部位があり、Cesena2 では、Hpa II の認識部位はなく、１個のAcc I 、Dde I 、 Nco I、Rsa I の認識部位があった。また、F3HCesena3は、１個のHpa II、 Nco I、Rsa I 、２個のAcc I 、３個のDde I の認識部位が確認された。AOY17482では、Acc I 、Rsa I の認識部位はなく、４個のDde I 、１個のHpa II、 Nco I の認識部位があった。AOY17479では、Rsa I の認識部位はなく、１個のAcc I 、Hpa II、 Nco I、３個のDde I の認識部位があった（表２）。イチゴ品種の F3H遺伝子については、複数の制限酵素認識部位の有無が異なる対立遺伝子が存在することが明らかとなった（表２）。
【００２６】
【表２】
実施例１（APX のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別）
イチゴ１４品種のガク又は葉より試験例１と同様の方法でＤＮＡを抽出した。すなわち、乳鉢にイチゴのガク片約半分、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物（EDTA）、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４００００）、１．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ５．５）２００μL 、消泡剤１滴を加えてすりつぶし、さらにＤＮＡ抽出溶液４００μｌを添加し、遠心管に移した。６５℃で１０分間保温した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行って固形物を分離した。
【００２８】
この上清６００μｌを新しい遠心管に移し、氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム２００μｌ（終濃度１．２５Ｍ）を加え、氷中で１０分間保冷する。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）後、上清７５０μｌをとり、新しい遠心管に移し、同量のイソプロパノールを添加した。−８５℃で１０分間保冷後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。上清を捨て、ＤＮＡを含む沈殿物にＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液１５０μｌを添加し、５５℃で１０分間保温しＲＮＡを分解した。
【００２９】
洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファッデクス混液２００μｌをＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度、ゆっくり混ぜた。ガラスウールを詰めたピペットチップをカラムにして混液をアプライし、排出した。（このとき排出が悪ければ、圧をかけて押し出す。）
次いで、２００μｌの洗浄バッファーを添加し、圧をかけ排出するという操作を２回繰り返す。カラムから完全にバッファーを排出し、カラムを新しい１．５ｍｌ遠心管に入れ、６０℃に保温した溶出バッファー２００μｌを添加し、１分程度待ち、圧をかけて排出した。２００μｌのイソプロパノールを添加し、−８５℃で１０分間保冷後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。上清を捨て、７０％エタノール１００μｌを添加し、洗浄した。
遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）後、上清を捨て、遠心管の蓋を開けて２０分ほど乾燥させた。滅菌水４０μｌを添加し、軽くボルテックスした。５５℃で１０分間ほど保温し、スピンダウンして蓋についた液を集めた。得られた液１０μｌを泳動してＤＮＡの有無を確かめた。
【００３０】
APX マーカーを用いたイチゴ品種識別のため、以下の操作を行った。抽出したＤＮＡ（１０〜１００ｎｇ）５．０μｌ、APX 増幅用プライマー対（配列番号１及び２）それぞれ（５０ｐｍｏｌ）０．５μｌ、ｄＮＴＰミックス４．０μｌ、ＰＣＲ用１０×バッファー５．０μｌ、Taq ポリメラーゼ５．０ユニット／μｌ（宝酒造）０．５μｌ、滅菌水３４．５μｌの合計５０．０μｌをＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ機械（ＡＢＩ社製、Gene Amp PCR System 9700) にセットして反応を開始した。
【００３１】
ＰＣＲ条件は次の通りである。
９４℃で５分間反応後、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の反応を３５回繰り返し、７２℃５分で伸長反応を補足した。ＰＣＲ反応液５０μｌから１０μｌをとり、制限酵素１０×反応バッファー２μｌ、制限酵素Mlu I 約１０ユニット／分の合計２０μｌとなるように滅菌水で調整し、３７℃で２〜３時間反応させてＤＮＡを消化した。
制限酵素処理後の反応液１０μｌに６×ローディングバッファー２μｌを添加し、エチジウムブロマイド入りの１．５％アガロースゲルのウエルに入れて、電気泳動を行った。電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用して紫外線照射によりバンドを検出した。電気泳動後のアガロースゲルを紫外線下に移し、写真をとって品種間で多型を比較した（図１）。また、検出結果を表３にまとめた。図中の試料番号は、1:とよのか、2:女峰、3:とちおとめ、4:章姫、5:さちのか、6:アイベリー、7:レッドパール、8:濃姫、9:サンチーゴ、10: ピーストロ、11: アイストロ、12: べにほっぺ、13: けいきわせ、14: セセナを表す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
実施例２（CHI-Pvu IIのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別）
CHI-Pvu II マーカーを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイチゴ品種の識別を行った。結果を図２と表４に示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。
【００３４】
【表４】
図２及び表４から明らかなように、供試した１４品種をマーカーの有無により２群に分けることができる。
【００３６】
実施例３（F3H マーカーによるイチゴ品種の識別）
F3H の各 マーカーを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイチゴ品種の識別を行った。すなわち、ＰＣＲ用プライマーとＰＣＲ反応後に使用する制限酵素の種類の違いを除くとＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ条件及び検出操作は実施例１の場合と同様に実施した。その結果を図３（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び表５に示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。
【００３７】
【表５】
表及び図から明らかなように、 F3Hマーカーの有無により、供試した１４種の品種は分類される。すなわち、「とよのか」、「セセナ」の２品種が５種のマーカーを有し、「レッドパール」は F3H-NcoI 以外の４種、「ピーストロ」はF3H-DdeI以外の４種のマーカーを有していた。また、「さちのか」、「べにほっぺ」は F3H-HpaII、F3H-AccI及びF3H-DdeIの３種、「サンチーゴ」はF3H-AccI、F3H-DdeI及びF3H-RsaIの３種、「けいきわせ」はF3H-NcoI、F3H-AccI及びF3H-RsaIの３種のマーカーを有していた。「アイベリー」はF3H-AccI及びF3H-RsaIの２種、「章姫」は F3H-NcoI 及び F3H-AccI の２種、「濃姫」、「アイストロ」はF3H-AccIの１種、「女峰」はF3H-NcoIの１種を有しており、「とちおとめ」はどのマーカーも有していなかった。
【００３９】
以上の結果より、実施例１〜３において各マーカーを組み合わせることによって、供試した１４品種のイチゴはすべて識別することができることが分かる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することができる方法が提供される。そのため、本発明によれば、多様な条件の下で栽培され、市場に流通しているイチゴ果実についても、その品種を正確に識別することが可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 イチゴ品種間で検出されたAPX-Mlu Iマーカー多型の泳動写真である。
【符号の説明】
１は「とよのか」、２は「女峰」、３は「とちおとめ」、４は「章姫」、５は「さちのか」、６は「アイベリー」、７は「レッドパール」、８は「濃姫」、９は「サンチーゴ」、１０は「ピーストロ」、１１は「アイストロ」、１２は「べにほっぺ」、１３は「けいきわせ」、１４は「セセナ」をそれぞれ示す。
【図２】 イチゴ品種間で検出されたCHI-Pvu II マーカー多型の泳動写真である。
【符号の説明】
図１と同じである。
【図３】 （１）はイチゴ品種間で検出されたF3H-Nco I マーカー多型、（２）はF3H-Hpa II マーカー多型、（３）はF3H-Acc I マーカー多型、（４）はF3H-Dde I マーカー多型、（５）はF3H-Rsa I マーカー多型のそれぞれの泳動写真である。
【符号の説明】
図１と同じである。
Claims (3)
- イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を、配列番号８に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の２１６番目から２９１番目に相当する挿入部位の有無、配列番号９に係るイチゴアスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子断片の９３番目から９８番目に相当する制限酵素 Mlu I 認識部位の有無、配列番号１１に係るイチゴカルコンイソメラーゼ遺伝子断片の１１１番目から１１６番目に相当する制限酵素 Pvu II 認識部位の有無の中から選ばれた少なくとも１種の識別用ＤＮＡマーカーにより識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
- ＰＣＲ法において、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４として記載されたプライマーの対を用いることを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
- イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号５又は６、及び配列番号７として記載されたプライマーの対を用いたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素 Nco I 、制限酵素 Acc I 、制限酵素 Hpa II 、制限酵素 Dde I 、又は制限酵素 Rsa I のうちの少なくとも１つから選択される制限酵素によって消化させることにより生じる多型を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
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