JP2003339399A - イチゴの品種識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条
件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に
識別することが可能な方法を提供すること。 【解決手段】 イチゴのガクを含む果実及び／又は葉よ
り抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる
塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅
し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵
素による消化で生じる多型を識別することを特徴とする
イチゴの品種識別方法

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イチゴの品種識別
方法に関し、詳しくはイチゴのガク（へた）を含む果実
及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ
各品種間で識別性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法
によってＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡの多型及び該
増幅産物を制限酵素処理して得られるＤＮＡの多型を検
出し、これを識別することによって、イチゴの品種を識
別する技術に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、イチゴの品種識別は、果実の形や
大きさ、葉の形や大きさ、草型等の比較により行われて
きた。しかし、これらは連続的な形質による違いに依存
しているため、正確に判断するのが極めて困難であっ
た。さらに、上記の方法は、苗の大きさや生育状態等を
揃えて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、
果実のない苗では品種を識別することは事実上できな
い。また、市場に流通している果実は、多様な条件の下
で栽培されているため、上記の従来方法では品種を識別
することは困難である。

【０００３】種苗法では、登録されているイチゴ品種の
育成者権を認めている。しかし、育成者権を有する者、
団体等が苗の増殖、販売に関する承諾を与えていない
者、団体等によって、当該品種を違法に増殖、販売して
いることを見つけても、従来のイチゴの品種判別方法で
は、登録されたイチゴ品種との同一性を特定することが
難しいため、育成者権の保護が有効になされていないと
いう一面があった。また、ＪＡＳ法による農産物の表示
義務が強化されると共に、消費者がイチゴの購入時に品
種を基準にして選択している等の状況からしても、イチ
ゴの品種を正確に識別することは重要なことであるにも
かかわらず、外見では一部の品種を除いて殆ど識別する
ことができず、表示の上で大きな問題である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イチ
ゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件な
どに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが
可能な方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、イチゴ品
種の識別をＤＮＡ解析によって行うべく検討し、ＰＣＲ
法により増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断
して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種
を効果的に識別できることを見出し、本発明に到達した
のである。

【０００６】すなわち、イチゴのアスコルビン酸ペルオ
キシダーゼ（以下、APX と略記することもある。）をコ
ードする遺伝子、カルコンイソメラーゼ（以下、CHI と
略記することもある。）をコードする遺伝子及びフラバ
ノン３ヒドロキシラーゼ（以下、F3H と略記することも
ある。）をコードする遺伝子のイントロンを含む塩基配
列が、イチゴの品種によって特異的に変異していること
並びにその差を制限酵素Mlu I 、Pvu II、Hpa II、Nco
I 、Acc I 、Dde I 、Rsa I 等で処理することによって
検出できることを見出し、本発明に到達した。

【０００７】請求項１記載の本発明は、イチゴのガクを
含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型とし
て、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ
法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び
増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を識
別することを特徴とするイチゴの品種識別方法である。
請求項２記載の本発明は、ＰＣＲ法におけるプライマー
対として、APXFP （配列表の配列番号１）とAPXRV （配
列表の配列番号２）、CHIFP （配列表の配列番号３）と
CHIRV （配列表の配列番号４）、又はF3HFP （配列表の
配列番号５）もしくはF3HFP2（配列表の配列番号６）と
F3HRV （配列表の配列番号７）のいずれかを用いること
を特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法であ
る。請求項３記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩
基配列として、APX 挿入配列（配列表の配列番号１
６）、APX-Mlu I（配列表の配列番号１７）、CHI-Pvu I
I（配列表の配列番号１８）、F3H-Nco I（配列表の配列
番号１９）、F3H-Hpa II（配列表の配列番号２０）、F3
H-Acc I（配列表の配列番号２１）、F3H-Dde I（配列表
の配列番号２２）及びF3H-Rsa I（配列表の配列番号２
３）の中から選ばれた少なくとも１種を識別用ＤＮＡマ
ーカーとして用いる請求項１記載のイチゴ品種識別方法
である。

【０００８】

【発明の実施の形態】イチゴの品種をＤＮＡ解析によっ
て分類する方法では、特定のマーカーが用いられるが、
本発明では新たに開発したマーカーを使用し、ＰＣＲ法
によって増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断
して多型を生じさせ、その多型のパターンによって品種
を分類する方法を確立した。すなわち、ＰＣＲ法により
増幅した部分にイチゴ品種間で異なる塩基配列が存在
し、かつその配列を認識できる制限酵素があることか
ら、これらの組み合わせによってイチゴの品種識別を行
う方法である。

【０００９】本発明では、イチゴの品種間で特異的に塩
基配列が異なる酵素遺伝子として、APX 、CHI 及び F3H
の遺伝子を選択した。APX は、植物の葉に含まれる代表
的な活性酸素消去能を有する酵素の一つで、葉緑体に局
在している。CHI は、カルコンシンターゼによって合成
されたカルコンを異性化させる酵素であり、F3Hは、さ
らに３位を水酸化するなど、植物に含まれる天然色素で
あるアントシアニンの生合成経路を触媒するものであ
る。

【００１０】ＰＣＲ法では、イチゴ試料から抽出したＤ
ＮＡを鋳型とし、上記のAPX 、CHI又は F3H遺伝子とイ
ントロン部分を含む領域を標的にして行う。ＤＮＡの増
幅に必要なプライマーについて、本発明では、既知のイ
チゴのイントロンを含むＤＮＡ配列を利用してＰＣＲ増
幅に必要な配列を設計した後、識別が求められるイチゴ
品種のＤＮＡを鋳型として、その部分をクローニングし
て塩基配列を決定し、多型が生じるようなＤＮＡ配列を
確認すると共に、その部分が確実に増幅するようにプラ
イマーの設計を修正し、最終的なものとした。これらの
プライマーが、APXFP （配列表の配列番号１）とAPXRV
（配列表の配列番号２）、CHIFP （配列表の配列番号
３）とCHIRV （配列表の配列番号４）、又はF3HFP （配
列表の配列番号５）もしくはF3HFP2（配列表の配列番号
６）とF3HRV （配列表の配列番号７）である。すなわ
ち、ＤＮＡデータベースからAPX のＤＮＡ配列（AF1586
52) を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてAPXFP
とAPXRV を設計した。また、ＤＮＡデータベースからCH
I のＤＮＡ配列（AYO17486及びAYO17478) を選択し、こ
のＤＮＡ配列情報からCHIFP と CHIRVを設計し、同様に
ＤＮＡデータベースからF3H のＤＮＡ配列（AOY17482及
びAOY17479) を選択し、このＤＮＡ配列情報から F3HF
P、F3HFP2 と F3HRV を設計した。

【００１１】試料のイチゴからのＤＮＡの抽出は、ガク
を含む果実及び／又は葉から、Laurence Marechal-Drou
rard et.al.（Plant Molecular Biology Reporter,199
5,vol.13(1),p.26-30）の方法を改変し行った。この方
法では、すりつぶした試料にＤＮＡ抽出溶液を加え、保
温・冷却処理したのち、遠心して得た上清にイソプロパ
ノールなどの溶媒を加えてＤＮＡを沈殿させ、必要に応
じて遠心してＤＮＡを分離する。次いで、ＴＥとリボヌ
クレアーゼ溶液を加えてＲＮＡを分解する。このＲＮａ
ｓｅ処理後の溶液にＤＥＡＥセファデックス混液を添加
し、再度遠心して得た固形物に溶出バッファーを加えて
ＤＮＡを溶出させ、これを常法により精製する。

【００１２】上記により抽出したＤＮＡを鋳型とし、 A
PX遺伝子、CHI 遺伝子又はF3H 遺伝子とイントロン部分
を含む領域を標的としてＰＣＲ法を行う。ＰＣＲ反応液
として、Taq ポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、反応用緩衝液、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓにプライマ
ー対を加えたものを用いる。反応工程は、常法に従い約
９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃
のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７
０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を１サイ
クルとする反応を３０〜４０サイクル行ってＤＮＡを増
幅する。

【００１３】次に、増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これ
により、増幅産物のうち品種間の識別性が現れる塩基配
列であることを示すバンドを検出する。すなわち、ＰＣ
Ｒ法により増幅された産物を特定の制限酵素で処理した
後、アガロースゲル等で分離すると、ＤＮＡがアガロー
ス等のゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮ
Ａの分子量の差により分離され、臭化エチジウムブロマ
イド等により染色されてバンドとして増幅ＤＮＡの相違
が検出されるのである。イチゴ各品種から得られたＤＮ
Ａ断片をアガロースゲルごと切り出してＤＮＡを回収
し、これをEasy T Vector システム（プロメガ社）等を
用いてクローニングを行う。まず、ＤＮＡをプラスミド
に組み込み、大腸菌に導入する。次いで、大腸菌を増殖
させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＤＮＡシー
ケンサーを用いてクローンの塩基配列を決定する。イチ
ゴ各品種からのプラスミドの解析結果や公開されている
配列情報を比較することによって、標的とした塩基配列
中に品種間で特異的に変異しており、かつその差を制限
酵素処理と電気泳動により検出できる部位が存在するか
を調べ、品種識別用マーカーとする。

【００１４】イチゴAPX のクローンとして APX6ny1（配
列表の配列番号８）、APX6ih2 （配列表の配列番号
９）、APX6ih3 （配列表の配列番号１０）、イチゴCHI
のクローンとして CHIPvuII（配列表の配列番号１
１）、CHImain（配列表の配列番号１２）、イチゴF3H
のクローンとして F3HCesena1 （配列表の配列番号１
３）、F3HCesena2 （配列表の配列番号１４）、 F3HCes
ena3 （配列表の配列番号１５）がある。これらは、挿
入配列の有無、特定の制限酵素認識部位の有無により特
徴付けられる。

【００１５】イチゴ品種は、これらの対立遺伝子の組み
合わせが異なることから、識別が可能である。イチゴAP
X のクローンは、挿入配列の有無の他に、制限酵素Mlu
I の認識部位の有無により識別され、イチゴCHI のクロ
ーンは、制限酵素Pvu IIの認識部位の有無により識別さ
れる。また、イチゴF3H のクローンの対立遺伝子間で配
列の異なる部分を認識する制限酵素としては、Nco I 、
Acc I 、Hpa II、DdeI 、Rsa I などがある。

【００１６】したがって、APX 挿入配列（配列表の配列
番号１６）、APX-Mlu I（配列表の配列番号１７）、CHI
-Pvu II（配列表の配列番号１８）、F3H-Nco I（配列表
の配列番号１９）、F3H-Hpa II（配列表の配列番号２
０）、F3H-Acc I（配列表の配列番号２１）、F3H-Dde I
（配列表の配列番号２２）及びF3H-Rsa I（配列表の配
列番号２３）の中から選ばれた少なくとも１種を識別用
ＤＮＡマーカーとして用いることによって、イチゴ品種
の識別をすることができる。

【００１７】本発明では、イチゴ品種として「とよの
か」、「女峰」、「とちおとめ」、「章姫」、「さちの
か」、「アイベリー」、「レッドパール」、「濃姫」、
「サンチーゴ」、「ピーストロ」、「アイストロ」、
「べにほっぺ」、「けいきわせ」、「セセナ」の１４種
類を供試したが、これらに限定されず、その他の品種で
あっても、本発明の方法により識別することが可能であ
る。

【００１８】

【実施例】以下に、本発明を実施例などにより詳しく説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでは
ない。 試験例１（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限酵素断片長多
型）マーカーの開発） ＤＮＡデータベースからイチゴAPX のＤＮＡ配列（AF15
8652）を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして、フ
ォワードプライマー（APXFP)（配列表の配列番号１）と
リバースプライマー（APXRV)（配列表の配列番号２）を
設計した。イチゴ「セセナ」、「女峰」、「久留米IH３
号」の２品種、１系統の新葉からＤＮＡを抽出した。す
なわち、イチゴ新葉約１００ｍｇを乳鉢ですりつぶし、
ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、０．５％ポリビニルピロリドン（Ｍ
Ｗ４００００）、１．４％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５．５）１ｍｌを加え、６５℃で１０分間保温した
後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して固形物を
分離した。上清７５０μｌを新しい遠心管に移し、５Ｍ
酢酸カリウム２５０μｌを加えて氷中で１０〜３０分
間保冷後、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。

【００１９】次に、この上清約７００μｌを新しい遠心
管に移し、同量のイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを
沈殿させた。遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、
上清を捨て、ＤＮＡを含む沈殿物をＴＥ（１０ｍＭ ト
リス塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌク
レアーゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液
２００μｌを添加し、５５℃で３０分間保温してＲＮＡ
を分解した。洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、
ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４
Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファデックス混液２００μ
ｌを上記ＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度
ゆっくり混ぜた。この溶液を遠心した後、上清を捨て、
洗浄バッファー５００μｌを添加してセファデックスを
洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。沈降後、上
清を取り除き、６０℃に保温した溶出バッファー（１０
ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩
化ナトリウム２．０Ｍ）を加え、ＤＮＡをＤＥＡＥセフ
ァデックスから溶出バッファー中に溶出させた。ＤＮＡ
を含む溶出バッファーを新しい遠心管に移し、イソプロ
パノールを添加した。１０分間保冷（−８０℃）後、遠
心してＤＮＡを集め、７０％エタノールで洗浄した。得
られたＤＮＡを乾燥して１／１０に希釈したＴＥバッフ
ァーに溶解した。

【００２０】このようにして抽出したＤＮＡ１０〜１０
０ｎｇを鋳型に、APX遺伝子及びイントロン部分を含む
領域を標的にしたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の
組成は、Taq ポリメラーゼ（５ユニット／μｌ、宝酒
造）１μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６
０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）５μｌ、２５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ ２μｌ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、ｄＮＴＰｓ
（１００μＭ）５μｌを混合し、上記のAPXFPとAPXRVを
それぞれ５０ｐｍｏｌを加え、滅菌水を加えて合計の反
応量を５０μｌとした。反応装置は、ＡＢＩ（Applied
Biosystems Instrument)社製、Gene Amp PCR System 97
00を使用し、９４℃５分後、９４℃３０秒、５５℃６０
秒、７２℃６０秒の反応を３５サイクル行い、７２℃５
分間の伸長反応を補足した。

【００２１】増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ
（株）製、ミューピッドIIを使用し、１．５％アガロー
スゲルで３０分間泳動し、臭化エチジウムブロマイド染
色後の紫外線照射によりバンドを検出した。各品種から
得たＤＮＡ断片（約０．７５ｋｂ）をアガロースゲルご
と切り出して QIAEX（キアゲン社）を用いてＤＮＡを回
収した。次に、回収したＤＮＡ断片をEasy T vector シ
ステム（プロメガ社）を用いてプラスミドに組み込み、
大腸菌に導入した。この大腸菌を増殖させた後、プラス
ミドを取り出して精製し、ＡＢＩ社製、ＤＮＡシーケン
サー PRISM377 を用いて塩基配列を決定した。各品種か
ら数個のプラスミドを解析した結果、特徴的な配列を有
するクローンAPX6nyl （配列表の配列番号８）、APX6ih
2 （配列表の配列番号９）、APX6ih3 （配列表の配列番
号１０）等の複対立遺伝子を見出した。公開されている
クローンAF158652と塩基配列を比較したところ、高い相
同性があったものの、一部に異なる配列を有していた。
APX6nyl は７６ｂｐの挿入があり（２１６番目から２９
１番目）、またAPX6ih2 は９４、９５番目の位置にＣＧ
の挿入があるため、前後の配列（９１〜９６番目）が a
cgcgt となり、制限酵素 Mlu Iの認識部位であった。AP
X6ih3 とクローンAF158652は、挿入配列もなく、 Mlu I
の認識部位も存在しなかった。これらのことから、イチ
ゴ品種は、これらの複対立遺伝子を組み合わせて持って
いることが明らかとなった（表１）。

【００２２】

【表１】表１ イチゴAPX のＰＣＲクローンの挿入配列
及び Mlu Iの認識部位の有無

【００２３】試験例２（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限
酵素断片長多型）マーカーの開発） ＤＮＡデータベースからイチゴのカルコンイソメラーゼ
（CHI)のＤＮＡ配列（AYO17486、AYO17478) を選択し、
このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプライマー
（CHIFP 、配列表の配列番号３）とリバースプライマー
（CHIRV、配列表の配列番号４）を設計した。設計した
プライマーと、各品種から試験例１と同様にして抽出し
たＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲ反応により、 CHI遺伝子
及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。得られた
ＤＮＡ断片をEasy T vector を用いてクローニングし、
２個のクローン（CHIPvu II 、CHImain1) の塩基配列
（前者が配列表の配列番号１１、後者が配列番号１２）
を決定した。この配列は、公開されているAYO17486、AY
O17478と高い相同性を有していた。しかし、複数の部位
でＤＮＡ配列の異なる断片があった。CHIPvu II は、１
１１ｂｐ付近に制限酵素Pvu II認識部位を有していた
が、CHImain1は、この付近にPvu II 認識部位を有して
いなかった。このことから、イチゴ品種の CHI 遺伝子
については、Pvu II認識部位の有無が異なる対立遺伝子
が存在することが明らかとなった。

【００２４】試験例３（イチゴ品種識別用（ＰＣＲ制限
酵素断片長多型）マーカーの開発） ＤＮＡデータベースからイチゴのフラバノン３ヒドロキ
シラーゼ（F3H)のＤＮＡ配列（AOY17482、AOY17479) を
選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にしてフォワードプ
ライマー（F3HFP、配列表の配列番号５、F3HFP2、配列
表の配列番号６）とリバースプライマー（F3HRV 、配列
表の配列番号７）を設計した。設計したプライマーと、
各品種から試験例１と同様にして抽出したＤＮＡを鋳型
に用いたＰＣＲ反応により、 F3H遺伝子及びイントロン
部分を含む領域を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をEa
sy T vector を用いてクローニングし、複数のクローン
について塩基配列を決定した。得られたクローンF3HCes
ena1、F3HCesena2、F3HCesena3は、公開されているAOY1
7482、AOY17479と高い相同性を有していたが、複数の部
位でＤＮＡ配列が異なっていた。

【００２５】AOY17482、AOY17479、F3HCesena1、F3HCes
ena2及びF3HCesena3の５個の F3Hの対立遺伝子間で配列
の異なる部分を認識する制限酵素として、Nco I 、Acc
I 、Hpa II、Dde I 、Rsa I などがあった。Cesena1
は、１個のAcc I 、Hpa II、Rsa I 、２個の Nco I、３
個のDde I の認識部位があり、Cesena2 では、Hpa IIの
認識部位はなく、１個のAcc I 、Dde I 、 Nco I、Rsa
I の認識部位があった。また、F3HCesena3は、１個のHp
a II、 Nco I、Rsa I 、２個のAcc I 、３個のDde I の
認識部位が確認された。AOY17482では、Acc I 、Rsa I
の認識部位はなく、４個のDde I 、１個のHpa II、 Nco
I の認識部位があった。AOY17479では、Rsa I の認識
部位はなく、１個のAcc I 、Hpa II、 Nco I、３個のDd
e I の認識部位があった（表２）。イチゴ品種の F3H遺
伝子については、複数の制限酵素認識部位の有無が異な
る対立遺伝子が存在することが明らかとなった（表
２）。

【００２６】

【表２】表２ F3H 遺伝子の複対立遺伝子間の制限酵素
認識部位数の違い

【００２７】実施例１（APX のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の
制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別） イチゴ１４品種のガク又は葉より試験例１と同様の方法
でＤＮＡを抽出した。すなわち、乳鉢にイチゴのガク片
約半分、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ エチレンジアミン二ナトリウム二水和物
（EDTA）、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％ポリビ
ニルピロリドン（分子量４００００）、１．４％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ５．５）２００μL
、消泡剤１滴を加えてすりつぶし、さらにＤＮＡ抽出
溶液４００μｌを添加し、遠心管に移した。６５℃で１
０分間保温した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０
分間）を行って固形物を分離した。

【００２８】この上清６００μｌを新しい遠心管に移
し、氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム２００μｌ（終濃度
１．２５Ｍ）を加え、氷中で１０分間保冷する。遠心分
離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）後、上清７５
０μｌをとり、新しい遠心管に移し、同量のイソプロパ
ノールを添加した。−８５℃で１０分間保冷後、遠心分
離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。上清を
捨て、ＤＮＡを含む沈殿物にＴＥ（１０ｍＭ トリス塩
酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋リボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液１５０
μｌを添加し、５５℃で１０分間保温しＲＮＡを分解し
た。

【００２９】洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸
ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム０．４
Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥセファッデクス混液２００μ
ｌをＲＮａｓｅ処理後の溶液に添加し、１０分程度、ゆ
っくり混ぜた。ガラスウールを詰めたピペットチップを
カラムにして混液をアプライし、排出した。（このとき
排出が悪ければ、圧をかけて押し出す。） 次いで、２００μｌの洗浄バッファーを添加し、圧をか
け排出するという操作を２回繰り返す。カラムから完全
にバッファーを排出し、カラムを新しい１．５ｍｌ遠心
管に入れ、６０℃に保温した溶出バッファー２００μｌ
を添加し、１分程度待ち、圧をかけて排出した。２００
μｌのイソプロパノールを添加し、−８５℃で１０分間
保冷後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分
間）した。上清を捨て、７０％エタノール１００μｌを
添加し、洗浄した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間）後、上清を捨て、遠心管の蓋を開けて２
０分ほど乾燥させた。滅菌水４０μｌを添加し、軽くボ
ルテックスした。５５℃で１０分間ほど保温し、スピン
ダウンして蓋についた液を集めた。得られた液１０μｌ
を泳動してＤＮＡの有無を確かめた。

【００３０】APX マーカーを用いたイチゴ品種識別のた
め、以下の操作を行った。抽出したＤＮＡ（１０〜１０
０ｎｇ）５．０μｌ、APX 増幅用プライマー対（配列番
号１及び２）それぞれ（５０ｐｍｏｌ）０．５μｌ、ｄ
ＮＴＰミックス４．０μｌ、ＰＣＲ用１０×バッファー
５．０μｌ、Taq ポリメラーゼ５．０ユニット／μｌ
（宝酒造）０．５μｌ、滅菌水３４．５μｌの合計５
０．０μｌをＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ機械（ＡＢ
Ｉ社製、Gene Amp PCR System 9700) にセットして反応
を開始した。

【００３１】ＰＣＲ条件は次の通りである。９４℃で５
分間反応後、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃６０
秒の反応を３５回繰り返し、７２℃５分で伸長反応を補
足した。ＰＣＲ反応液５０μｌから１０μｌをとり、制
限酵素１０×反応バッファー２μｌ、制限酵素Mlu I 約
１０ユニット／分の合計２０μｌとなるように滅菌水で
調整し、３７℃で２〜３時間反応させてＤＮＡを消化し
た。制限酵素処理後の反応液１０μｌに６×ローディン
グバッファー２μｌを添加し、エチジウムブロマイド入
りの１．５％アガロースゲルのウエルに入れて、電気泳
動を行った。電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミュ
ーピッドIIを使用して紫外線照射によりバンドを検出し
た。電気泳動後のアガロースゲルを紫外線下に移し、写
真をとって品種間で多型を比較した（図１）。また、検
出結果を表３にまとめた。図中の試料番号は、1:とよの
か、2:女峰、3:とちおとめ、4:章姫、5:さちのか、6:ア
イベリー、7:レッドパール、8:濃姫、9:サンチーゴ、1
0: ピーストロ、11: アイストロ、12: べにほっぺ、13:
けいきわせ、14: セセナを表す。

【００３２】

【表３】表３ APX マーカーによる品種の識別 ○はＤＮＡ断片（マーカー）を有する、×は有しないこ
とを示す。

【００３３】実施例２（CHI-Pvu IIのＰＣＲ増幅ＤＮＡ
断片の制限酵素多型を用いたイチゴ品種の識別） CHI-Pvu II マーカーを用いたこと以外は実施例１と同
様にしてイチゴ品種の識別を行った。結果を図２と表４
に示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。

【００３４】

【表４】表４ CHI-Pvu II マーカーによる品種の識別

【００３５】図２及び表４から明らかなように、供試し
た１４品種をマーカーの有無により２群に分けることが
できる。

【００３６】実施例３（F3H マーカーによるイチゴ品種
の識別） F3H の各 マーカーを用いたこと以外は実施例１と同様
にしてイチゴ品種の識別を行った。すなわち、ＰＣＲ用
プライマーとＰＣＲ反応後に使用する制限酵素の種類の
違いを除くとＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ条件及び検出
操作は実施例１の場合と同様に実施した。その結果を図
３（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び表５に
示す。なお、表中の数字や記号は表３と同じである。

【００３７】

【表５】表５ F3Hマーカーによるイチゴ品種の識別

【００３８】表及び図から明らかなように、 F3Hマーカ
ーの有無により、供試した１４種の品種は分類される。
すなわち、「とよのか」、「セセナ」の２品種が５種の
マーカーを有し、「レッドパール」は F3H-NcoI 以外の
４種、「ピーストロ」はF3H-DdeI以外の４種のマーカー
を有していた。また、「さちのか」、「べにほっぺ」は
F3H-HpaII、F3H-AccI及びF3H-DdeIの３種、「サンチー
ゴ」はF3H-AccI、F3H-DdeI及びF3H-RsaIの３種、「けい
きわせ」はF3H-NcoI、F3H-AccI及びF3H-RsaIの３種のマ
ーカーを有していた。「アイベリー」はF3H-AccI及びF3
H-RsaIの２種、「章姫」は F3H-NcoI 及び F3H-AccI の
２種、「濃姫」、「アイストロ」はF3H-AccIの１種、
「女峰」はF3H-NcoIの１種を有しており、「とちおと
め」はどのマーカーも有していなかった。

【００３９】以上の結果より、実施例１〜３において各
マーカーを組み合わせることによって、供試した１４品
種のイチゴはすべて識別することができることが分か
る。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、イチゴの種苗、果実等を
試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、
イチゴ品種を正確に識別することができる方法が提供さ
れる。そのため、本発明によれば、多様な条件の下で栽
培され、市場に流通しているイチゴ果実についても、そ
の品種を正確に識別することが可能である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>独立行政法人 農業技術研究機構 <120>イチゴの品種識別方法 <130>P141259K <160>23 <210>1 <211>22 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>1 attgttgctc tctctggtgg tc 22 <210>2 <211>18 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>２ agagggcgga agacaggg 18 <210>3 <211>21 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>3 aggagttgac agagtcggtt g 21 <210>4 <211>23 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>4 ggacctgcaa aatgatagcc aag 23 <210>5 <211>21 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>5 amcctgtgga aggacctttc g 21 <210>6 <211>18 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>6 tggattaccg ttcamcctgt gg 22 <210>7 <211>18 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>7 gagttcacta ckgcctggtg atc 23 <210>8 <211>831 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>8 attgttgctc tctctggtgg tcacaccttg gtgcattaat agtcttttta tcttcggaat 60 taatttgcta ttctgcattt aggtcaagaa atacgtgttt tttttttatt ccaatgaatg 120 gtgctgttct ctctttgatt aatggtgatg gtctggattc agggaagggc acacaaggaa 180 cggtctggat tcgagggacc ctggactccc aaccctctta tctttgacaa ctcatatttc 240 acgtgagttt tgtttctctg ttcatgttat tagcaataca tgttcttggg atcttatctt 300 tgacaactca tatttcacgt gagttttgtt tctctgttca tgttattagc aatacatgtt 360 cttgggatat gcctactggt atgtaatttg ttttgcaaac cagcttataa cgttcttggt 420 attgtcagtg tgttgttgag tggagagaag gaaggccttc tacagcttcc aactgacaag 480 gctcttctgt cagaccctgt cttccgccct cttgttgaga aatacgctgc ggtatgtatt 540 ttatttgtgg tgtgaagtct gcattctgct taaatattat actgatttat aaacctcttc 600 tcaggatgaa gatgctttct ttgctgatta tgctctagct catcagaggc tctctgagct 660 tgggtatgtt ttcattttag catactgtgt tgtattttgc tctgtatgtg tttgaacaat 720 gggtctaaat gatcactgtt atattatgca gttttgctga agcttaagca gtggaactct 780 attaaggata aaggatgatg ccaatgcctg cgtgccttgc ttctgtattt t 831 <210>9 <211>745 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>9 attgttgctc tctctggtgg tcacaccttg gtgcgttaat agtcttttta tcttcggaat 60 taatttgcta ttctgcattt aggtcaagaa atacgcgtct ttttttattc caatgaatgg 120 tgctgttctc tctttgatta atggtgatgg tctggattca gggaagggca cacaaggaac 180 ggtctggatt cgagggaccc tggactccta accctcttat ctttgacaac tcatatttca 240 cgtgagtttt gtttctctgt tcatgttatt agcaatacat gttcttggga tatgcctact 300 ggtatgtaat ttgttttgta aaccagctta taacgttctt ggtattgtca gtgtgctgtt 360 gagtggagag aaggaaggcc ttctacagct tccaactgac aaggctcttc tgtcagaccc 420 tgtcttccgc cctcttgttg agaaatacgc tgcggtatgt attttatttg tggtgtgaag 480 tctgcattct gcttaaatat tatactgatt tataaacctc ttctcaggat gaagatgctt 540 tctttgctga ttatgctcta gctcatcaga ggctctctga gcttgggtat gttttcattt 600 tagcatactg cgttgtattt tgcttttgaa caatgggtct aaatgatcac tattatatta 660 tgcagttttg ctgaagctta agcagtggaa ctctattaag gataaaggat gatgccaatg 720 cctgcgtgcc ttgcttctgt atttt 745 <210>10 <211>765 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>10 attgttgctc tctctggtgg tcacaccttg gtgtgttaat aatcttttta tcttgggaat 60 taatttgcta ttctgcattt aggtcaagaa atacgtgttt ttttattcca atgaatggtg 120 ctgttcgctc tttgattaat ggtgatggtc tggattcagg gaagggcaca caaggaacgg 180 tctggatttg agggaccatg gactcccaac cctcttatct ttgacaactc atatttcacg 240 tgtgttctgt ttctctgttc aagttattag caatacatgt tcttgggata tgcctactgg 300 tatgtaattt gttttgtaac ccagcttata atgttcttgg tattgtcagt gtgctgttga 360 gtggagagaa ggaaggcctt ctacagcttc caactgacaa ggctcttctg tcagaccctg 420 tcctccgccc tcttgttgag aaatacgctg cggtatatat tttatttgtg gtgtaaagtc 480 tgcatatctg gtctgcattc tgcgtaaata ttatactgat ttataaacct cttctcagga 540 tgaagatgct ttctttgctg attatgctct agctcatcag aggctctctg agcttgggta 600 tgttttcatt ttagcatact gtgttgtatt ttgctctgta tgcgtttgaa caatgggtct 660 aaatgatcac tgttatatta tgcagttttg ctgaggctta agcagtggaa ctctattaag 720 gataaaggat gatgccaatg cctgcgtgcc ttgcttctgt atttt 765 <210>11 <211>636 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>11 aggagttgac agagtcggtt gagttcttca gggagatcgt tacaggtaaa atgagttttt 60 tattttaatt ttttttggac gaacagctaa aatgagttgg ttttgataaa cagctgaact 120 agaaatagtt ggactttgag attccgagtg caatgtagat gcttatgatt gtcagattgt 180 gtaatgtagt tccaatcatt ggaattttag gcttgaactc ttcctagtct atttgcttgt 240 gttcgttttt ttttttttaa caaggcttgt gttcggttta agaatctgtt tttagtctta 300 gcaatggaca atgggaatga tcttcatttt agtagagtta aggtattgaa tcttatgaaa 360 gtttggaacc tttggcctat cataaaccag acgcttaacc tccatcccca attggctaat 420 tcgatatttc gatgtgctta ctaaaattgg ttcacttggt tagctgatag agattaatta 480 gtgtggtaga ttccatccag ttgtgacagc agactatcat actcacaagt cacaacagaa 540 caaataatat agacattcaa atggatgctg catttgttaa ttgctgtaaa tatgttagta 600 caatggatat aaacttggct atcattttgc aggtcc 636 <210>12 <211>611 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>12 aggagttgac agagtcggtt gagttcttca gggagatcgt tacaggtaaa atgagtttgt 60 tttttttttt ggacgaacag ctaaaatgag ttggttttga taaacggctg aactaaaaat 120 agttggactt tgagattcct tgtgcaattt agatgcttat gattgtcaga ttgtgtaatg 180 tagttccaat cattggaatt ttaggcttga actcttccta gtctatttgc ttgtgttcgg 240 tgttcggttt aagaatctgt ttttagtctt agcaatggag aatgggaatg agcttcattt 300 tagtaaaggt attgaatctt atgaaagttt ggaacctttg gcctatcaca aactagacac 360 ttaacctcca tcaccaattg gctaattcga tatttcgatg tgcttactaa aattggttgg 420 cttggttagc tgatagagat taattagtgt ggtagattcc atccagttgt gagatcagac 480 tatcatactc acaagtcaca agactcacaa gtcacaacag aacaaataca ttcaaatgga 540 tgctgcattt gtttattgct gtaaatatgt tagtacaatg gatataaact tggctatcat 600 tttgcaggtc c 611 <210>13 <211>606 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>13 aacctgtgga aggacctttc gtggtgaatc ttggagacca tggacatgtg agtatacttt 60 gcgacaattt caattaatcc gattcattat tcttgattga tacttttact attttagtgt 120 cactatctta atgtgattgt gaaataagca agataaggac acattaattg ttatttatac 180 caaactcgtt atggtcaaga tatttttgta aagaaatcgt gaataatagg gtgcaggtgg 240 atgttgaagt catgggttca atttgattta attggttaat taatttttat gtcacatata 300 atcaattata tttacccggt tagtacgacc caaaaattca tactcaatca tccatggatg 360 taattcaatg gaaatgaaga attatgttta agtgaagtta ttttattttc aacatttaga 420 tgtaaatata taataatggt tgagtatgag ttccttagtg actgagcaaa cattaacata 480 cgtataatat ataccaatac gaacgtataa tcgtatatgt attgacacat taattatttg 540 ggtgatggaa cagtttctga gcaatgggag gttcaagaat gctgatcaca aggcagtagt 600 gaactc 606 <210>14 <211>606 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>14 aacctgtgga aggacctttc gtggtgaatc ttggagacca tggacatgtg agtatacttg 60 cgacaatttc aattaatctg attcattatt cttgattgat aattttacta ttttagtgtc 120 acgtactatc ttaatgtgat tgtgaaataa gcaagatgag gacacattaa ttgttattta 180 taccaaactc gttatggtca agatattttt gtaaagaaat cgtgaataat agggtgcagg 240 tggatgttgg agtcatgggt ttaatttgat ttaattggtt aattaatttt tatgtcacgt 300 ataatcaatt atatttacca ggttaatacg acccagaaat tcatacttaa tcatctatgg 360 taattcaata gaagggaaga attatgttta agtgaagtta tcttattttc aacaatgtaa 420 atatataata gtggttgaac atgagttttt taatgagtta gtgactgaat gaacattaac 480 atatgtataa tatatactaa tatcaacgta tagtcgtata tgtgttgaca cattatttgg 540 gtgatggaac agtttctgag caatgggagg ttcaagaatg ctgatcacaa aggcagtagt 600 gaactc 606 <210>15 <211>612 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>15 aacctgtgga aggacctttc gtggtgaatc ttggagacca tggacatgtg agtatacttg 60 cgacaatttc aattaatctg attcattatt cttgattgat aattttacta ttttagtgtc 120 actatcttaa tgtgattgtg aaataagcaa gataaggaca cattaattgt tatttatacc 180 aaactcatta tggtcaagat atttttgtaa agaaatcgtg aataataggg tctaggtgcg 240 tggatgttga agtcatgggt ttaatttgat ttaattggtt aattaatttt tatgttacgt 300 atactcaatt atatttaccc ggttagtacg accaagaaac tcatactcaa tcatttatgg 360 atgtaattca atgaaaaagg agaattatgt ttaagtgaag ttattttatt ttcaacattt 420 atatgtaaat atacaaaatt gttgagtatg agtttcttag tgagttagtg actgagtgac 480 cattaacata cgtataatat ataccaatac gaacgtatag tcttatatgt attgacacat 540 tatttgggtg atggaacagt ttctgagcaa tgggaggttc aagaatgctg atcacaaggc 600 agtagtgaac tc 612 <210>16 <211>76 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>16 tcttatcttt gacaactcat atttcacgtg agttttgttt ctctgttcat gttattagca 60 atacatgttc ttggga 76 <210>17 <211>6 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>17 acgcgt 6 <210>18 <211>6 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>18 cagctg 6 <210>19 <211>6 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>19 ccatgg 6 <210>20 <211>4 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>20 ccgg 4 <210>21 <211>6 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>21 gtmkac 6 <210>22 <211>5 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>22 ctnag 5 <210>23 <211>4 <212>DNA <213>Strawberry (Fragaria ananassa) <400>23 gtac 4

【図面の簡単な説明】

【図１】 イチゴ品種間で検出されたAPX-Mlu Iマーカ
ー多型の泳動写真である。

【符号の説明】

１は「とよのか」、２は「女峰」、３は「とちおと
め」、４は「章姫」、５は「さちのか」、６は「アイベ
リー」、７は「レッドパール」、８は「濃姫」、９は
「サンチーゴ」、１０は「ピーストロ」、１１は「アイ
ストロ」、１２は「べにほっぺ」、１３は「けいきわ
せ」、１４は「セセナ」をそれぞれ示す。

【図２】 イチゴ品種間で検出されたCHI-Pvu II マー
カー多型の泳動写真である。

【符号の説明】

図１と同じである。

【図３】 （１）はイチゴ品種間で検出されたF3H-Nco
I マーカー多型、（２）はF3H-Hpa II マーカー多型、
（３）はF3H-Acc I マーカー多型、（４）はF3H-Dde I
マーカー多型、（５）はF3H-Rsa I マーカー多型のそれ
ぞれの泳動写真である。

【符号の説明】

図１と同じである。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AD20 CA24 4B024 AA11 CA04 CA05 CA06 CA09 GA17 HA14 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ04 QQ42 QR08 QR14 QR32 QR38 QR42 QR55 QR62 QR63 QR73 QR82 QS16 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イチゴのガクを含む果実及び／又は葉よ
   り抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる
   塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅
   し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵
   素による消化で生じる多型を識別することを特徴とする
   イチゴの品種識別方法。
2. 【請求項２】 ＰＣＲ法におけるプライマー対として、
   APXFP （配列表の配列番号１）とAPXRV （配列表の配列
   番号２）、CHIFP （配列表の配列番号３）とCHIRV （配
   列表の配列番号４）、又はF3HFP （配列表の配列番号
   ５）もしくはF3HFP2（配列表の配列番号６）とF3HRV
   （配列表の配列番号７）のいずれかを用いることを特徴
   とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
3. 【請求項３】 イチゴ品種間で異なる塩基配列として、
   APX 挿入配列（配列表の配列番号１６）、APX-Mlu I
   （配列表の配列番号１７）、CHI-Pvu II（配列表の配列
   番号１８）、F3H-Nco I（配列表の配列番号１９）、F3H
   -Hpa II（配列表の配列番号２０）、F3H-Acc I（配列表
   の配列番号２１）、F3H-Dde I（配列表の配列番号２
   ２）及びF3H-Rsa I（配列表の配列番号２３）の中から
   選ばれた少なくとも１種を識別用ＤＮＡマーカーとして
   用いる請求項１記載のイチゴ品種識別方法。