CN107419021A - 一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法 - Google Patents

一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，属于转基因作物鉴定技术领域。本发明提供的鉴定方法包括以下步骤：1)提取小麦基因组；2)设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。本发明提供的鉴定方法假阳性出现概率低，能够精确地定位外源基因的插入位置，对于后期转基因植株功能的研究具有深远的意义，为创育小麦新种质资源奠定了基础。

Description

一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法
技术领域
本发明涉及转基因作物鉴定技术领域，具体涉及一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，为全球人口提供了丰富的蛋白质和能量，也是我国第二大粮食作物。随着人口的增加，未来全球对小麦的需求将呈大幅度增长的趋势。因为基因的限制，小麦产量的增长是有限制的，不能通过传统的栽培技术来满足需求。转基因技术可能成为缓解粮食安全问题的重要手段。为了满足需求，需要通过基因工程的手段培育转基因植物。转基因技术是一种发展蓬勃的手段，能够帮助培养出具有理想性状的植株，具有巨大潜力。由于转基因技术中目的基因插入的随机性和插入位点基因表达的盲目性，转基因作物的安全性引起了公众的广泛关注；且小麦等禾谷类作物基因转化效率极低，而寻找一种有效的鉴别转基因小麦的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。本发明提供的鉴定方法假阳性出现概率低，且能够精确地定位外源基因的插入位置，本发明提供的方法对于后期转基因植株功能的研究具有深远的意义，为创育小麦新种质资源奠定了基础。
本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，包括以下步骤：
1)以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组；
2)依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；
3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；
4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。
优选的是，采用小麦叶片进行基因组的提取。
优选的是，所述染色体步移试剂盒为宝生物公司出售的染色体步移试剂盒；
所述染色体步移试剂盒包括以下组分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、对照模板、TaKaRa LATaq、10×LAPCR Buffer II(Mg2+plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。
优选的是，所述步骤2)中3条特异性引物的Tm值独立地为50～60℃。
优选的是，所述转化用载体为pDTAAS。
优选的是，当转化用载体为pDTAAS时，所述步骤2)设计得到的引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是，所述步骤4)中进行数据比对前还包括：将所述扩增片段中与转化用载体互补的基因片断去除。
本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。采用染色体步移技术，同时与生物信息学分析相结合，能够在小麦基因组测序序列中精确地定位外源基因的插入位置，将插入位点精确到某个染色体的某个位点，筛选出外源基因插入小麦基因间或着丝粒区域的转基因材料，可防止外源基因对小麦基因组的干扰，且本发明鉴定方法假阳性出现概率低，对于后期转基因植株功能的研究具有深远的意义，为创育小麦新种质资源奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中pDTAAS表达载体图谱以及特异引物设计位置；
图2为本发明实施例1提供的结合染色体步移试剂盒进行热不对称交错PCR得到的扩增序列条带；
图3为本发明实施例1提供的样品15外源基因插入位点鉴定结果图；
图4为本发明实施例1提供的样品21外源基因插入位点鉴定结果图；
图5为本发明实施例1提供的样品29外源基因插入位点鉴定结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，包括以下步骤：
1)以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组；
2)依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；
3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；
4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。
本发明以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组。在本发明中，优选采用小麦叶片进行基因组的提取。本发明优选选取幼苗时期的小麦叶片，更优选选取嫩绿舒展的小麦叶片作为提取材料。具体的，本发明优选实验时剪取2cm长度的叶片，剪碎后放入2mL离心管中进行冻存，所述冻存温度优选为-80℃。
本发明对所述小麦叶片基因组的提取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的植物基因组DNA提取试剂盒进行提取即可，如生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式植物基因组提取试剂盒。具体的，在基因组提取过程中，本发明优选将上述冻存的小麦叶片研磨成粉末，按照试剂盒的说明进行基因组的提取，得到的基因组优选在-20℃进行保存。
本发明对所述农杆菌介导法转化小麦的操作方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的农杆菌介导转化法即可，如利用表达载体，通过农杆菌介导法进行外源基因的转化即可。本发明对所述转化用表达载体的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的农杆菌介导法常用表达载体进行转化即可。在本发明中，所述转化用表达载体优选为pDTAAS。
得到小麦基因组后，本发明依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3。本发明优选使用染色体步移试剂盒并按照其说明书中记载的步骤进行操作。在本发明中，所述染色体步移试剂盒为宝生物公司的染色体步移试剂盒(Takara Genome Walking Kit，CodeNo.6108)，所述染色体步移试剂盒包括以下组分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、对照模板、TaKaRa LATaq、10×LAPCRBuffer II(Mg2+plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。本发明对特异引物的设计原理优选参照试剂盒中的说明。具体操作详见TaKaRa Genome Walking Kit说明书，在此不进行赘述。具体的，在本发明中，当表达载体选为pDTAAS时，本发明优选依据pDTAAS的T-DNA序列进行引物的设计，在本发明具体实施例中，选择SsNHX1为目的基因，目的基因的插入位置以及引物的设计位置如图1所示。根据已知序列的T-DNA序列区(最好不少于500bp)设计三个特异性引物：设计方向为需要扩增的外源基因方向，SP2的位置应设计在SP1的3’端，SP3位于SP2的3’端。每两个引物之间的距离没有严格规定，优选为60～100bp。图1显示了引物SP1、SP2和SP3在载体T-DNA区域上的结合位点，从LB到RB为理论上插入植物基因组的序列。
在本发明中，所述步骤2)中3条特异性引物的Tm值独立地为50～60℃。在本发明中，基于步骤1)转化用载体的LB边界至目的基因之间序列设计得到的引物为SP1、SP2和SP3；设计方向为需要扩增的外源基因的表达方向，SP2的位置设计在SP1的3'端，SP3设计在SP2的3'端。在本发明中，当转化用载体为pDTAAS时，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列设计引物SP1、SP2和SP3，引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。
得到特异引物后，本发明以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段。在本发明中，所述染色体步移试剂盒为宝生物公司出售的染色体步移试剂盒，具体操作步骤详见宝生物染色体步移试剂盒(TaKaRa Genome Walking Kit)说明书。
利用上述方法获得扩增片段后，本发明将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。在本发明中，比对前，优选将扩增片段中与载体互补的基因片断去除后再与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组进行比对。即本发明扩增得到的片段分为两部分，一部分与表达载体的部分序列互补，另一部分与表达载体插入的小麦基因组处的基因的序列互补，通过对将扩增片段中与载体互补的基因片断剪切后再与小麦基因组进行比对，能够实现外源基因在小麦基因组中的具体插入位点的鉴定。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一、转基因小麦基因组DNA的提取
1)转基因小麦的取材：农杆菌介导法获得转基因小麦植株后，在幼苗时期，挑选嫩绿舒展的叶片，使用灭菌后的剪刀和镊子，剪下2cm左右的叶片，剪碎后放入2mL灭菌离心管中，-80℃低温保存。
2)基因组DNA的提取：使用无菌的研磨棒，在液氮中研磨叶片，直至研磨成发白的粉末，采用试剂盒生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒型号：B518261-0100，操作步骤如试剂盒说明所示，提取小麦叶片基因组DNA。得到DNA溶液，轻轻混匀，短暂离心收集至管底后，取1μL提取液用微量紫外分光光度计测量浓度后，将DNA放-20℃保存。
二、转基因小麦的鉴定
1.设计引物
根据pDTAAS表达载体的T-DNA序列设计三个特异性引物，SP2的位置设计在SP1的3'端，SP3在SP2的3'端。设计方向为需要扩增的未知区域方向。
SEQ ID NO.1 GENE-LBfor-SP1 TGGTCATAGCTGTTTCCTGTGT
SEQ ID NO.2 GENE-LBfor-SP2 GTAAAGCCTGGGGTGCCTAA
SEQ ID NO.3 GENE-LBfor-SP3 TTCCAGTCGGGAAACCTGTC
2.第一轮PCR扩增
1)将转基因小麦DNA溶液混匀后，根据测量浓度结果，将DNA稀释至浓度100ng/μL左右，进行第一轮扩增。
试验采用Takara公司提供的Genome Walking Kit试剂盒。
试剂盒中提供了四种退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4，本试验设计了三条同向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2、SP3。
2)取4支200μLPCR管进行PCR反应。将试剂盒中的试剂放在冰上缓慢融化后，轻轻混匀，短暂离心。
PCR扩增体系为：反应总体系25μL，DNA模板0.5μL、10×PCRbuffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTPs 4μL，SP10.5μL，APPrimers Template0.5μL，LATaq DNApolymerase 0.25μL，ddH2O16.75μL。其中，各PCR管中所加的兼并引物不同，顺序为AP1、AP2、AP3、AP4。
PCR反应程序为：94℃1min，98℃1min，5个循环的程序为94℃30s，65℃1min，72℃2min，然后94℃30s，25℃3min，72℃2min，接下来15个循环的程序为94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，最后72℃10min。PCR产物将作为下一轮PCR扩增的模板。
3.第二轮PCR扩增
将第一轮扩增产物置于冰上降温后，轻轻混匀，短暂离心。第二轮扩增的体系与第一轮相似，但是需要使用与第一轮相同的兼并引物进行扩增，即各PCR管中加入AP引物的顺序为AP1、AP2、AP3、AP4，使用的特异性引物为SP2。第一轮中使用相同AP引物扩增的PCR液作为第二轮PCR反应的模板。
PCR扩增体系为：10×PCRbuffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTPs4μL，SP20.5μL，APPrimers Template 0.5μL，LATaq DNApolymerase0.25μL，ddH2O16.75μL。
PCR反应程序为：15个循环的程序为：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，最后72℃10min。PCR产物将作为第三轮PCR扩增的模板。
4.第三轮PCR扩增
将第二轮扩增产物置于冰上降温后，轻轻混匀，短暂离心。作为该轮PCR的模板。为方面电泳检测及测序，第三轮扩增体系加倍，扩增的反应程序与第二轮相似。本次反应使用与第二轮相同的兼并引物进行扩增，即各PCR管中加入AP引物的顺序为AP1、AP2、AP3、AP4，使用的特异性引物为SP3。第二轮中使用相同AP引物扩增的PCR液作为第三轮PCR反应的模板。
PCR扩增体系为：10×PCRbuffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs8μL，SP31μL，AP PrimersTemplate 1μL，LATaq DNApolymerase0.5μL，ddH2O33.5μL。
PCR反应程序与第二轮程序相同：15个循环的程序为：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，最后72℃10min。
5.电泳检测
将PCR液轻轻混匀，短暂离心。取10μL，加入2μL 6×Buffer混匀作为电泳样品，使用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。将能检测出清晰、明亮的条带的第三轮产物的PCR液送至北京奥科鼎盛公司进行测序，引物使用SP3。
6.测序序列去除载体序列后的T-DNA侧翼序列，与国际小麦基因组测序联合会(International wheat genome sequencing consortium)小麦基因组数据比对。
7.所有的转基因小麦植株均采用上述方法进行鉴定，在三种转基因小麦植株均鉴定出三株阳性植株后统计，使用TAIL-PCR方法鉴定了254株小麦，凝胶电泳结果显示有46个样品扩增出现了清晰明亮的条带，测序结果显示共有9株转基因小麦，外源基因成功地插入到了其基因组中。
以SsNHX1为目的基因的转化事件中的样品采用此法进行鉴定为例进行具体说明。提取植株DNA进行扩增得到的片段在1.2％琼脂糖凝胶电泳下检测，第三轮PCR扩增目的片段切胶回收后送测序，电泳结果如图2所示，箭头所指即为测序片段，为第三轮PCR扩增产物。利用生物分析学软件geneious将测序结果与载体pDTAAS-SsNHX1序列进行比对，比对结果显示：15、21、29样品测序所得结果可与载体T-DNA左边界200bp左右的碱基序列一致。方框中的为测序序列中的基因组部分序列，与国际小麦基因组测序序列比对一致。箭头所指即为T-DNA在小麦基因组上插入位点，进一步Blastn研究分析结果显示，样品15插入到B组小麦第六条染色体长臂的147705-148494位置(图3)，同样的分析方法得出：样品21插入到B组小麦第三条染色体的7134-7511位置(图4)，样品29插入到B组小麦第三条染色体的7135-7512位置(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津农学院
<120> 一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggtcatagc tgtttcctgt gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaaagcctg gggtgcctaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttccagtcgg gaaacctgtc 20

Claims (7)

1.一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，包括以下步骤：
1)以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组；
2)依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；
3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；
4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，采用小麦叶片进行基因组的提取。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述染色体步移试剂盒为宝生物公司出售的染色体步移试剂盒；
所述染色体步移试剂盒包括以下组分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、对照模板、TaKaRaLA Taq、10×LAPCR Buffer II(Mg2+plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中3条特异性引物的Tm值独立地为50～60℃。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述转化用载体为pDTAAS。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当转化用载体为pDTAAS时，所述步骤2)设计得到的引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中进行数据比对前还包括：将所述扩增片段中与转化用载体互补的基因片断去除。
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