CN106191235A - 检测外源基因插入位点的方法 - Google Patents

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Abstract

检测外源基因插入位点的方法。目前对外源基因的检测方法主要有PCR法、Southern Blot印迹法和DNA斑点杂交法。PCR法容易出现假阳性和重复性差，Southern Blot法操作十分复杂，而且费用高昂，DNA斑点杂交法无法达到对外源基因的准确定位。本发明的方法包括如下步骤：（一）转MC4R基因细胞系的获得；（二）接头引物及特异性引物序列设计；（三）基因组的酶切与纯化；（四）纯化后的基因组DNA连接接头；（五）两轮PCR扩增检测；（六）克隆测序与序列比对。本发明公开了一种检测外源基因插入位点的方法。

Description

检测外源基因插入位点的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测外源基因插入位点的方法。
背景技术：
动物转基因技术目前主要应用于生产珍贵蛋白，基因治疗，器官移植，动物品种改良和建立疾病模型等方面，已经获得了羊，牛，小鼠，猪等多种转基因动物。成功构建转基因动物模型之后，确定外源基因的整合位点是对后续外源基因功能探讨和表型研究的重要前提条件之一。目前对外源基因的检测方法主要有PCR法、Southern Blot印迹法和DNA斑点杂交法。PCR法是通过在体外扩增外源基因DNA片段，从而对外源基因的整合位点进行检测。这种方法需要的样本少，操作简单并且灵敏度高，所以是最常用的检测手段。但这种方法容易出现假阳性和重复性差。Southern Blot法是通过外源基因特异性探针与附着在固相支持物上的经酶切、电泳分离的变性DNA链杂交，从而检测出样品中是否含有外源基因目的DNA片段。这种方法灵敏准确但是操作十分复杂，而且费用高昂。DNA斑点杂交法是将外源基因特异性探针与固相支持物上的待测DNA样品杂交，从而在样品中检测外源基因的有无。为避免假阳性，外源基因的探针应与宿主基因组DNA无同源性。该方法简便快捷，对样品的要求纯度低，尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性。但该种方法无法达到对外源基因的准确定位。
发明内容：
本发明的目的是提供一种检测外源基因插入位点的方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种检测外源基因插入位点的方法，该方法包括如下步骤：
（一）转MC4R基因细胞系的获得；
将猪的黑素皮质素受体4基因作为外源基因，猪的肾源PK15细胞系作为宿主细胞，利用脂质体转染的方法，将连入到pcDNA3.1（+）真核表达载体上的pcDNA（+）-MC4R真核表达质粒转入到PK15细胞系中，瞬时转染后，进行单克隆细胞株的筛选，最后富集单克隆细胞，提取RNA后，将其反转录成cDNA；
（二）接头引物及特异性引物序列设计；
①设计并合成接头JTf和JTr，接头序列为：
JTf：5'- GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCC
CGGGCTGGT- 3'，
JTr：5'-PO4 –ACCAGCCC –NH2-3'；
②根据接头序列设计并合成接头引物AP1和AP2，引物序列为：
AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，
AP2：5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT -3'；
③根据插入基因片段启动子区序列pcDNA3.1（+）PCMV区，设计并合成特异性引物GSP1和GSP2，引物序列为：
GSP1:5'-TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG-3，
GSP2: 5'- GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG -3；
被检测的转基因样品，不是通过pcDNA3.1（+）表达载体实现基因转入的，GSP1和GSP2根据载体的启动子区序列设计；
（三）基因组的酶切与纯化；
随机选取1个阳性转MC4R基因细胞，采用苯酚-氯仿方法提取基因组DNA，将基因组DNA浓度校正到100ng/μL，取100μL基因组DNA，加入限制性内切酶Dra I，在37 ℃的条件下进行过夜酶切；
（四）纯化后的基因组DNA连接接头；
将酶切后的基因组DNA进行纯化后取4μL，加入25μM接头JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的条件下进行过夜连接；
（五）两轮PCR扩增检测；
将上一步所得的连接产物内加入72 μLTE进行稀释，并在70 ℃的条件下反应5min，以此作为PCR模板，以AP1和SP1为引物进行第1轮PCR扩增；对扩增出条带的产物，用去离子水50倍稀释作为第2轮PCR扩增模板，以AP2和SP2为引物做第2轮PCR扩增；
（六）克隆测序与序列比对；
将第2轮PCR扩增产物的目的条带回收并纯化，连入pMD18-T载体，转化入大肠杆菌后，摇菌，测序，将测得的结果采用BLAST方法与已提交的猪基因组序列进行比对，经DraI处理过的DNA片段与pcDNA3.1（+）-MC4R序列完全一致。
本发明的有益效果：
本发明提供一种转基因动物外源基因整合位点的检测方法，该方法通过特异性的设置6条特异性引物进行连接介导PCR，通过对PCR产物序列的测定，以判断外源基因在宿主基因组上的整合位点。
具体实施方式：
实施例1：
一种检测外源基因插入位点的方法，该方法包括如下步骤：
（一）转MC4R基因细胞系的获得；
将猪的黑素皮质素受体4基因作为外源基因，猪的肾源PK15细胞系作为宿主细胞，利用脂质体转染的方法，将连入到pcDNA3.1（+）真核表达载体上的pcDNA（+）-MC4R真核表达质粒转入到PK15细胞系中，瞬时转染后，进行单克隆细胞株的筛选，最后富集单克隆细胞，提取RNA后，将其反转录成cDNA；
（二）接头引物及特异性引物序列设计；
①设计并合成接头JTf和JTr，接头序列为：
JTf：5'- GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCC
CGGGCTGGT- 3'，
JTr：5'-PO4 –ACCAGCCC –NH2-3'；
②根据接头序列设计并合成接头引物AP1和AP2，引物序列为：
AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，
AP2：5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT -3'；
③根据插入基因片段启动子区序列pcDNA3.1（+）PCMV区，设计并合成特异性引物GSP1和GSP2，引物序列为：
GSP1:5'-TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG-3，
GSP2: 5'- GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG -3；
被检测的转基因样品，不是通过pcDNA3.1（+）表达载体实现基因转入的，GSP1和GSP2根据载体的启动子区序列设计；
（三）基因组的酶切与纯化；
随机选取1个阳性转MC4R基因细胞，采用苯酚-氯仿方法提取基因组DNA，将基因组DNA浓度校正到100ng/μL，取100μL基因组DNA，加入限制性内切酶Dra I，在37 ℃的条件下进行过夜酶切；
（四）纯化后的基因组DNA连接接头；
将酶切后的基因组DNA进行纯化后取4μL，加入25μM接头JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的条件下进行过夜连接；
（五）两轮PCR扩增检测；
将上一步所得的连接产物内加入72 μLTE（Tris:EDTA=10:1, pH7.5）进行稀释，并在70℃的条件下反应5min，以此作为PCR模板，以AP1和SP1为引物进行第1轮PCR扩增；
第一轮PCR反应体系为：连接产物取1μL，AP1取1μL，SP1取1μL，LA Taq酶取1μL，Buffer取5μL，dNTP取1μL；
反应条件为：7个循环：94 ℃，25秒；72 ℃，3 分钟；32 个循环：94 ℃，25秒；67℃，10分钟；
对扩增出条带的产物，用去离子水50倍稀释作为第2轮PCR扩增模板，以AP2和SP2为引物做第2轮PCR扩增；
第二轮PCR反应体系为：稀释后的1次PCR产物1μL，AP2取1μL，SP2取1μL，LA Taq酶取1μL，Buffer取5μL，dNTP取1μL；
反应条件为：5个循环：94 ℃， 25秒；72 ℃，3分钟；20个循环：94 ℃，25秒；67 ℃，10分钟；
（六）克隆测序与序列比对；
将第2轮PCR扩增产物的目的条带回收并纯化，连入pMD18-T载体，转化入大肠杆菌后，摇菌，测序，将测得的结果采用BLAST方法与已提交的猪基因组序列进行比对，经DraI处理过的DNA片段与pcDNA3.1（+）-MC4R序列完全一致。

Claims (1)

1.一种检测外源基因插入位点的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
（一）转MC4R基因细胞系的获得；
将猪的黑素皮质素受体4基因作为外源基因，猪的肾源PK15细胞系作为宿主细胞，利用脂质体转染的方法，将连入到pcDNA3.1（+）真核表达载体上的pcDNA（+）-MC4R真核表达质粒转入到PK15细胞系中，瞬时转染后，进行单克隆细胞株的筛选，最后富集单克隆细胞，提取RNA后，将其反转录成cDNA；
（二）接头引物及特异性引物序列设计；
①设计并合成接头JTf和JTr，接头序列为：
JTf：5'- GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCC
CGGGCTGGT- 3'，
JTr：5'-PO4 –ACCAGCCC –NH2-3'；
②根据接头序列设计并合成接头引物AP1和AP2，引物序列为：
AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，
AP2：5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT -3'；
③根据插入基因片段启动子区序列pcDNA3.1（+）PCMV区，设计并合成特异性引物GSP1和GSP2，引物序列为：
GSP1:5'-TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG-3，
GSP2: 5'- GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG -3；
被检测的转基因样品，不是通过pcDNA3.1（+）表达载体实现基因转入的，GSP1和GSP2根据载体的启动子区序列设计；
（三）基因组的酶切与纯化；
随机选取1个阳性转MC4R基因细胞，采用苯酚-氯仿方法提取基因组DNA，将基因组DNA浓度校正到100ng/μL，取100μL基因组DNA，加入限制性内切酶Dra I，在37 ℃的条件下进行过夜酶切；
（四）纯化后的基因组DNA连接接头；
将酶切后的基因组DNA进行纯化后取4μL，加入25μM接头JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的条件下进行过夜连接；
（五）两轮PCR扩增检测；
将上一步所得的连接产物内加入72 μLTE进行稀释，并在70 ℃的条件下反应5min，以此作为PCR模板，以AP1和SP1为引物进行第1轮PCR扩增；对扩增出条带的产物，用去离子水50倍稀释作为第2轮PCR扩增模板，以AP2和SP2为引物做第2轮PCR扩增；
（六）克隆测序与序列比对；
将第2轮PCR扩增产物的目的条带回收并纯化，连入pMD18-T载体，转化入大肠杆菌后，摇菌，测序，将测得的结果采用BLAST方法与已提交的猪基因组序列进行比对，经DraI处理过的DNA片段与pcDNA3.1（+）-MC4R序列完全一致。
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