WO2003104491A1 - イネの品種鑑別法 - Google Patents

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WO2003104491A1
WO2003104491A1 PCT/JP2003/007332 JP0307332W WO03104491A1 WO 2003104491 A1 WO2003104491 A1 WO 2003104491A1 JP 0307332 W JP0307332 W JP 0307332W WO 03104491 A1 WO03104491 A1 WO 03104491A1
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base
site
seq
dna
nucleotide sequence
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PCT/JP2003/007332
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English (en)
French (fr)
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侑三 美濃部
理佐 門奈
淳子 鈴木
理恵子 太田
根本　博
収 出田
Original Assignee
株式会社植物ゲノムセンター
独立行政法人農業技術研究機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a rice cultivar discrimination method.
  • Cultivation characteristics such as plant height, tillering number, heading time, brown rice and milled rice characteristics such as grain shape, grain weight and whiteness, and rice cooking characteristics such as taste have been used for rice or rice varieties identification.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • CAPS CAPS
  • SNPs Single nucleotide polymorphisms
  • SSR immediately le sequence repeat
  • insertion / deletion mutations In many cases, it is no exaggeration to say that all genetic differences that can be detected with molecular markers such as RFLP and CAPS, and genetic differences that are reflected in morphology, etc., are derived from SNPs.
  • SNPs research and SNPs determination systems have made remarkable progress in the last few years.
  • electrophoresis is not required at all, and a determination system that can perform PCR to determination on a 96-well plate has been developed. Genotyping is much more efficient than molecular markers.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a new method capable of quickly and easily distinguishing rice varieties. More specifically, an object of the present invention is to provide an efficient rice variety discrimination method using a polymorphic marker.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems.
  • the rice genome sequence is used.
  • the chromosome region where the rice genome base sequence information is released mainly the region where the gene is not predicted is used, and for the other regions, the sequence of the RFLP marker / probe is used.
  • primers were designed to amplify 800 bp to lkbp from genomic DNA. Using the designed primers, Nipponbare Koshihikari, Kazaras, Hiroriku Dwarf 4 (G4), Kitake, and wild rice
  • PCR amplification was performed using the easily extracted DNA of Oryza ruf ipogon (1943) as type I, and the result was used as type II for the sequence reaction.
  • a cycle sequence was performed on this type II to prepare a sequence sample.
  • the obtained sequence data was compared for each variety, and single nucleotide substitution polymorphisms were searched. Sequences were performed at least twice for the same cultivar and the same primer, and only those that were reliable were judged to be polymorphisms.
  • Nipponbare / Koshihikari and Nipponbare / Kitatake polymorphisms are found in Nipponbare.Hatsusimo / Mutsuhorare / Yukinosei 'Kirara 397 ⁇ Tsugaru Roman ⁇ 5 million stones ⁇ Mori no Kuma ⁇ Yumeakari ⁇ Hanaetizen ⁇ Koshihikari 'Moonlight' Aki Takomachi ⁇ Morning light ⁇ Aichi no Kaori ⁇ Festival fine ⁇ Hinohikari ⁇ Yume Tsukushi ⁇ Hitomebore ⁇ Manamusume. Using genomic DNA as type II, PCR reaction and sequencing were similarly performed, and the base at the polymorphic site was compared for each variety.
  • primers for SNPs detection were designed for SNPs useful for cultivar discrimination, and a single-base terminator reaction was performed using an AcycloPrime-FP kit (PerkinElmer) to prepare a sample for dienotyping. Dienotyping was performed by measuring the degree of fluorescence polarization with ARVO Perkin Elmer).
  • the present inventors searched for SNPs in 24 cultivars with a large cultivated area in Japan and created polymorphic markers capable of easily and quickly discriminating these cultivars.
  • a new rice cultivar discrimination method was completed using By using the method of the present invention, it is possible to identify and specify closely related varieties at the DNA level.
  • the present invention relates to a new method capable of quickly and easily distinguishing rice varieties, more specifically,
  • a method for identifying rice varieties comprising the following steps (a) and (b):
  • step (b) a step of associating the base species determined in step (a) with the variety
  • nucleotide at position 450 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is A
  • nucleotide at position 16 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is C
  • nucleotide at position 624 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is C.
  • nucleotide at position 534 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 is C
  • nucleotide at position 358 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is G
  • SEQ ID NO: 22 The base at position 48 in the base sequence described is C.
  • the nucleotide at position 92 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 26 is C
  • the base at position 743 of the base sequence described in SEQ ID NO: 27 is G
  • the base at position 552 in the base sequence described in SEQ ID NO: 28 is T
  • step (c) a step of hybridizing the DNA synthesized in step (a) with the probe synthesized in step (b)
  • step (e) a step of cleaving the DNA hybridized in step (d) with a single-stranded DNA-cleaving enzyme and releasing a part of the probe synthesized in step (b)
  • step (f) a step of hybridizing the probe released in step (e) with the detection probe
  • step (g) A step of enzymatically cleaving the DNA hybridized in step (f) and measuring the intensity of the fluorescence generated at that time
  • step (h) comparing the fluorescence intensity measured in step (g) with the control
  • step (f) comparing the fluorescence intensity measured in step (e) with a control
  • step (d) In the presence of fluorescently labeled nucleotides, the DNA amplified in step (b) is transformed into a ⁇ form, and a single-base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c). The process of measuring
  • step (f) comparing the degree of fluorescence polarization measured in step (e) with a control
  • step (d) In the presence of fluorescently labeled nucleotides, the DNA amplified in step (b) is transformed into a type, and a single-base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c).
  • step (e) Using a sequencer to determine the type of base used in the reaction in step (d)
  • step (f) comparing the base species determined in step (e) with a control
  • step (c) Step of measuring the molecular weight by applying the DNA amplified in step (b) to a mass spectrometer
  • step (d) comparing the molecular weight measured in step (c) with the control
  • step (d) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (c)
  • step (f) comparing the intensity detected in step (e) with a control
  • step (b) a step of extracting rice genomic DNA from the seed powdered in the step (a) (15) the method according to (14), wherein the seed is milled;
  • An oligonucleotide for amplifying the DNA region or
  • oligonucleotide for rice species identification comprising the oligonucleotide according to (16) or (17),
  • the present invention provides the rice cultivar identification kit according to [18], further comprising an alkaline aqueous solvent.
  • the present inventors have found polymorphic markers capable of accurately distinguishing between rice varieties by analyzing the genome sequence of 24 rice varieties.
  • the DNA region containing the polymorphic site in the rice genome, which was discovered by the present inventors, is described in SEQ ID NOs: 1-28.
  • the positions of the polymorphic sites are shown in FIGS. 1 to 29 and Tables 8 and 9.
  • the present invention provides a method for identifying rice varieties.
  • a base type is determined for a polymorphic site on a genome in rice 24 varieties found by the present inventors. More specifically, the base type according to any of the following (1) to (28) in the rice genome, or the base type of a site in a complementary chain forming a base pair with a base in the site is determined (step (A)).
  • nucleotide sequence, polymorphism site, etc. shown in the present specification it is easy to properly find the actual genome position corresponding to the polymorphic site from the information on the above.
  • the position on the genome of the polymorphic site of the present invention can be known by referring to a published genome database or the like.
  • the genomic sequence is determined based on the nucleotide sequence listed in the sequence listing.
  • the DNA in the genome usually has a double-stranded DNA structure complementary to each other. Therefore, in the present specification, even if a DNA sequence on one chain is shown for convenience, it is naturally understood that a sequence complementary to the sequence (base) is also disclosed. . For those skilled in the art, if one DNA sequence (base) is known, the sequence (base) complementary to the sequence (base) is obvious.
  • polymorphism in the present invention is not limited to single nucleotide polymorphisms (SNPs) consisting of single nucleotide substitutions, deletions and insertion mutations, but also includes substitutions, deletions and insertion mutations of several consecutive nucleotides.
  • the “polymorphic marker” of the present invention refers to information on a base mutation (polymorphic mutation) at a polymorphic site. More specifically, the polymorphism of the present invention refers to a mutation in a base sequence found when comparing the genome sequence of a rice cultivar “Nipponbare” with the genome sequences of other varieties. Information that can be used to identify rice varieties.
  • the polymorphic marker used for the determination of a base type preferably refers to a polymorphic marker represented by the following (1,) to (28,). That is, in a preferred embodiment of the present invention, rice varieties are distinguished by using polymorphic markers represented by the following (1) to (28,).
  • the base at position 593 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is T. More specifically, the nucleotide site at position 593 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the “Nipponbare” genome is a mutation from C to ⁇ .
  • the base at position 304 in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is ⁇ . More specifically, The nucleotide site at position 304 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to T.
  • the nucleotide at position 450 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is A. More specifically, the nucleotide at position 450 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A.
  • the base at position 377 in the base sequence of SEQ ID NO: 4 is C. More specifically, the nucleotide at position 377 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the “Nipponbare” genome is a mutation from T to C.
  • the base at position 16 in the base sequence of SEQ ID NO: 5 is C. More specifically, the base position at position 163 of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the “Nipponbare” genome is a mutation from T to C.
  • the base at position 624 of the base sequence of SEQ ID NO: 6 is (:. More specifically, “Nipponbare” The base sequence of 624 to 626 of the base sequence of SEQ ID NO: 6 in the genome The base at the position is a deletion mutation.
  • nucleotide at position 534 in the nucleotide sequence described in ⁇ is C. More specifically, the nucleotide at position 534 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to C.
  • the nucleotide at position 358 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is G. More specifically, it is a GT insertion mutation at a nucleotide site between positions 358 and 389 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 in the “Nipponbare” genome.
  • G is the base at position 475 in the base sequence of SEQ ID NO: 9. More specifically, the nucleotide at position 475 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 in the “Nipponbare” genome is a mutation from T to G.
  • the base at position 233 of the base sequence described in SEQ ID NO: 10 is A. More specifically, the nucleotide site at position 233 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A. (11 ′) The base at position 61 in the base sequence of SEQ ID NO: 11 is A. More specifically, the nucleotide positions at positions 6 12 and 6 13 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 11 in the “Nipponbare” genome are mutations from CA to AG.
  • the nucleotide at position 765 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 is T. More specifically, the nucleotide at position 765 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to ⁇ .
  • the base at position 571 in the base sequence described in SEQ ID NO: 13 is ⁇ . More specifically, the nucleotide position at position 51 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to ⁇ .
  • the base at position 600 in the base sequence of SEQ ID NO: 14 is G. More specifically, the nucleotide at position 600 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to G.
  • nucleotide at position 23 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 is A. More specifically, the nucleotide site at position 23 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A.
  • the nucleotide at position 247 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 is A. More specifically, the nucleotide site at position 247 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 16 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A.
  • the base at position 16 in the base sequence of SEQ ID NO: 17 is A. More specifically, the nucleotide at position 163 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 17 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A.
  • nucleotide at position 42 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is C. More specifically, the nucleotide site at position 421 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to C.
  • the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 is G. More specifically, the nucleotide sequence at position 178 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 in the “Nipponbare” genome The base site is a deletion mutation.
  • the base at position 141 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is G. More specifically, the nucleotide site at position 141 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 20 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to G.
  • the nucleotide at position 480 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 is C. More specifically, the nucleotide at position 480 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 in the “Nipponbare” genome is a mutation from D to C.
  • the base at position 48 1 in the base sequence of SEQ ID NO: 22 is C. More specifically, the nucleotide site at position 481 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 22 in the “Nipponbare” genome is a mutation from T to C.
  • the nucleotide at position 13 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 is C. More specifically, the nucleotide site at position 131 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 23 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to C.
  • the nucleotide at position 5110 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 is A. More specifically, the nucleotide site at position 5110 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to A.
  • the nucleotide at position 248 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 is T. More specifically, the nucleotide site at position 248 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 25 in the “Nipponbare” genome is a mutation from C to ⁇ .
  • the nucleotide at position 92 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 is C. More specifically, the nucleotide at position 92 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 in the “Nipponbare” genome is a mutation from G to C.
  • the base at position 73 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 27 is G. More specifically, the nucleotide site at position 743 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 in the “Nipponbare” genome is a mutation from A to G.
  • the nucleotide site at position 552 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 is a C to T mutation.
  • determining the base type generally means any of the above (1) to (28) on the genome of a rice plant whose rice variety is to be distinguished (hereinafter sometimes referred to as “test rice”). This refers to determining the type of base at the site described in any of them, but it is not always necessary to determine the specific type of base. Even if it is not possible to specifically determine the nucleotide type of any of the above-mentioned sites (1) to (28) in the genome of the test rice, if it is determined that it is the same as Nipponbare, the rice cultivar is identified. It is possible to do.
  • step (B) the base species and the variety determined in the above step (A) are associated (step (B)).
  • rice varieties that can be distinguished are as follows (in this specification, the names of each variety may be abbreviated as shown in parentheses). Nipponbare (nhb), Hatsimo (hts :), Mutsu Homare (mth), Yukinosei (yki), Kirara 397 (krr;), Tsugaru Roman (tgr), Five Million Stones (ghm), Forest Bear (Innk;), Yukari Akari (yma), No Naetzen (liez), Koshihikari (ksh), Moonlight (tkh), Akitakomachi (akk), Morning Light (ash), Aichi Kaori (ank), Festival Haru (mtb), Hinohikari (hnh), Dream Tsukushi (ymt), Hitomebore (hi t), Manamusume (imnm), Fussaotome (fom), Dontokoi (don), Kinu Hikari (knh), Sasanishiki (sss
  • the identification method of the present invention can be generally used to identify the name of a rice cultivar of unknown rice variety from among the above varieties, or to determine whether or not the rice is the varieties described above.
  • the present inventors determined the base species of the above rice varieties at the sites described in the above (1) to (28) in the rice genome, and created a polymorphic marker. Details of these polymorphic markers (the names of the polymorphic markers, and the
  • the nucleotide species in each rice variety shown in Table 1 are determined.
  • the rice variety can be determined based on the evening.
  • the nucleotide type is determined using the polymorphic markers described in (1 ′) to (28 ′). In this method, it is not always necessary to determine the base species for all the sites described in (1) to (28) above.
  • the varieties of the test rice are determined to be “Kirara 397”.
  • the nucleotide type was determined using the polymorphic markers “S0126” and “S0015”, and the nucleotide type at position 475 in the nucleotide sequence of the nucleotide sequence described in (9) above, SEQ ID NO: 9, was G.
  • the base type at position 593 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the above (1) is C
  • the test rice cultivar is determined to be “Yukinosei”. You.
  • judging rice varieties based on Table 1 provided by the present invention from the base species at the sites described in (1) to (28) above of the determined test rice genome can be performed by those skilled in the art. Is easy to do.
  • the site described in (1) to (28) in the test rice genome can be used.
  • the site described in (1) to (28) in the genome of the test rice using the polymorphic marker described in the above (1 ′) to (28 ′). is determined based on whether or not the base type of the rice is the same as the base type at the site in Nipponbare.
  • the present inventors investigated whether or not the base type at each site described in (1) to (28) above is the same as the base type at the site of “Nipponbare” for each of the above rice varieties.
  • Combinations of polymorphic markers capable of discriminating the above varieties were determined (Table 2 ⁇ 7).
  • the shaded portions in Tables 2 to 7 are examples of combinations of polymorphic markers that can identify each variety.
  • the present invention is not necessarily limited to the combinations of the polymorphic markers listed in Tables 2 to 7, and those skilled in the art will understand that the above-mentioned (1) to (28) of the 26 rice varieties provided by the present invention can be used. From the information on the base type at the site described, a combination of polymorphic markers that can be used for cultivar discrimination can be appropriately selected. In the table, ⁇ indicates a match with “Nipponbare”, and X indicates a mismatch with “Nipponbare”.
  • the power of the lamp is lower than the power of the lamp.
  • Yu Na is Chi Bi Gan or fu etc. key post of anaerobic
  • the marker is at the maximum level.
  • the base type at position 765 of the base sequence described in SEQ ID NO: 12 in (12) above is determined.
  • the base type at the site does not match the base type at the site in “Nipponbare”, and the base type is determined using the polymorphic marker “S0208”.
  • the test rice cultivar is determined to be “Fusaotome”.
  • the base type at each base site described in (1) to (28) above is determined, and the base type at the site is determined. However, if it is determined whether or not it is the same as the base species at the site in "Nipponbare", it is easy to determine the variety of the test rice with reference to Tables 2 to 7. .
  • the determination of the base species in the above step (A) of the present invention can be carried out by those skilled in the art by a known base sequence determination method or polymorphism mutation detection method.
  • DNA is prepared from the test rice.
  • examples of the test rice include, but are not limited to, the leaves, roots, seeds, calli, leaf sheaths, and cultured cells of the above rice.
  • those skilled in the art can prepare DNA based on the chromosomal DNA extracted from the test rice.
  • a method of pulverizing rice seeds in an aqueous solvent and then extracting rice genome DNA from the pulverized seeds can be suitably described, but the method is not particularly limited.
  • the seeds are milled.
  • a DNA containing the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site is amplified.
  • examples of a method for amplifying DNA include a PCR method.
  • the base sequence of the amplified DNA is determined.
  • the DNA base sequence can be determined by a method known to those skilled in the art.
  • the determined DNA base sequence is then compared with a control.
  • the control in this method is usually “Nipponbare” and is the sequence described in SEQ ID NOs: 1-28.
  • those skilled in the art can also obtain the nucleotide sequence information of the wild-type Nipponbare genome from various gene databases or literatures.
  • the rice variety discrimination method of the present invention can be performed according to various methods capable of detecting a polymorphism, in addition to the method of directly determining the nucleotide sequence of DNA derived from a test rice as described above.
  • the rice variety discrimination method of the present invention can be performed by the following method.
  • DNA is prepared from the test rice.
  • the prepared DNA is cut with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are separated according to their size.
  • the size of the detected DNA fragment is compared with a control.
  • DNA is prepared from a test rice.
  • a DNA containing the site according to any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site is amplified.
  • the amplified DNA is cut with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are separated according to their size. Then, the size of the detected DNA fragment is compared with a control.
  • Examples of such methods include, for example, restriction fragment length polymorphism (Restriction).
  • Fragment Length Polymorphism / RFLP PCR-RFLP method.
  • the size of the fragment generated after the restriction enzyme treatment is compared with that of the control. Change.
  • these mutations can be detected as a difference in the mobility of the band after electrophoresis.
  • chromosomal DNA is treated with these restriction enzymes, electrophoresed, and then subjected to the method of the present invention.
  • the presence or absence of a mutation can be detected by performing Southern blotting using a oligonucleotide.
  • the restriction enzyme used can be appropriately selected by those skilled in the art according to each mutation.
  • DNA is prepared from a test rice.
  • a DNA containing the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site is amplified.
  • the amplified DNA is dissociated into single strands.
  • the dissociated single-stranded DNA is separated on a nondenaturing gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is compared with that of a control.
  • PCR-SSCP single-strand conformation
  • each strand forms a unique higher-order structure depending on its base sequence.
  • the dissociated DNA strands are electrophoresed in a polyacrylamide gel containing no denaturing agent, the single-stranded DNAs with the same complementary length move to different positions according to the difference in their higher-order structures.
  • the higher order structure of this single-stranded DNA is also changed by the substitution of a single base, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting the change in the mobility, it is possible to detect the presence of a mutation due to a point mutation, deletion, insertion or the like in the DNA fragment.
  • a DNA containing a site according to any of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site is subjected to PCR or the like.
  • the amplification range is usually preferably about 200 to 400 bp.
  • PCR can be performed by those skilled in the art by appropriately selecting reaction conditions and the like.
  • the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin.
  • the amplified DNA product can be labeled by adding PCR to a PCR reaction solution and adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin, and performing PCR.
  • labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the amplified DNA fragment using Klenow enzyme or the like after the PCR reaction.
  • the labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like, and electrophoresis is performed on a polyacrylamide gel containing no denaturant such as urea.
  • the conditions for separating DNA fragments can be improved by adding an appropriate amount (about 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel.
  • electrophoresis conditions vary depending on the properties of each DNA fragment, but it is usually carried out at room temperature (20 to 25 ° C). If the desired separation is not obtained, the optimal mobility is 4 to 3 (optimal mobility at temperatures up to TC).
  • the mobility of the DNA fragments is detected by autoradiography using an X-ray film, a scanner that detects fluorescence, etc., and analyzed. If a band is detected, the band can be excised directly from the gel, amplified again by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Even when no gel is used, the band can be detected by staining the gel after electrophoresis with ethidium gel, a silver staining method.
  • the site according to any one of the above (1) to (28), or the site Two types of probes, labeled with reporter fluorescence and quencher-fluorescence, are synthesized on an oligonucleotide complementary to the base sequence near the DNA containing the base site in the complementary strand that forms a base pair with the base at the position (Step ( b)).
  • the probe synthesized in the step (b) is hybridized with the DNA prepared in the step (a) (step (c)).
  • a DNA containing the site according to any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site is amplified.
  • Step (d) Next, the emission of fluorescence from the repo is detected (step (e)). Next, the emission of the reporter fluorescence detected in step (e) is compared with the control (step (e).
  • Examples of the above method include the TaqMan PCR method (SNP polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, 94-105, Genet Anal. (1999) 14: 143-149) and the like.
  • a reporter fluorescence is labeled on the 5 'end of the probe.
  • examples of the reporter fluorescence include, but are not limited to, FAM and VIC.
  • quencher monofluorescence is labeled at the 3 'end of the probe. In the present invention, the quencher fluorescence is not particularly limited as long as it can quench the reporter fluorescence.
  • hybridization is performed under stringent conditions.
  • Stringent conditions are, for example, usually conditions of 42 ° C, 2XSS 0.1% SDS, preferably 50, 2XSSC, 0.1% SDS, more preferably 65DS ⁇ 0.1XSSC and 0.1% SDS.
  • the conditions are not particularly limited to these conditions.
  • Factors affecting the stringency of the hybridization can be considered as multiple factors such as temperature and salt concentration, and those skilled in the art can realize the optimal stringency by selecting these factors as appropriate. is there.
  • the DNA containing the site according to any one of the above (1) to (28), or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site is subjected to 5 ′ nuclease activity.
  • Amplification is carried out using a DNA polymerase having a property.
  • the portion of the probe labeled with the reporter fluorescence and quencher fluorescence is cleaved at the repo-overnight fluorescence label, and the repo-overnight fluorescence is released.
  • a preferable example of the DNA polymerase having 5 'nuclease activity is Taq DNA polymerase, but is not limited thereto.
  • the released fluorescence of the reporter is detected overnight, and the emission of the reporter fluorescence is compared with a control.
  • step (b) a probe whose 5 ′ end is complementary to the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand that forms a base pair with the base at the site is synthesized (step (c )).
  • the probe synthesized in step (c) is hybridized with the DNA prepared in step (a) (step (d)).
  • step (d) the DNA hybridized in step (d) is cleaved with a single-stranded DNA cleaving enzyme.
  • the single-stranded DNA-cleaving enzyme is not particularly limited, and examples thereof include the following c1 eavase.
  • the probe released in the step (e) is hybridized with the detection probe (step (f)).
  • the DNA hybridized in step (f) is cut enzymatically, and the intensity of the fluorescence generated at that time is measured (step (g)).
  • the fluorescence intensity measured in the step (g) is compared with a control (step (h)).
  • Examples of the method include the Invader method (SNP genetic polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, p94-105, Genome Research (2000) 10: 330-343). Specifically, first, the site according to any one of the above (1) to (28), or the 3 ′ side from the base site in the complementary strand forming a base pair with the base in the site is ⁇ -type. A probe (probe A) is synthesized that has a sequence (flap) that is complementary to the sequence and has a sequence (flap) unrelated to the type I sequence on the 5 'side.
  • a probe having a sequence complementary to the ⁇ -type on the site according to any one of the above (1) to (28) or on a 5 ′ side from a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. B) is synthesized.
  • the base corresponding to the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site corresponding to a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site may be arbitrary.
  • these probes are hybridized to the prepared type I DNA.
  • the base of the probe B corresponding to the site according to any one of the above (1) to (28), or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site enters the 5′-end. Recognizes the flap-shaped part, and cleaves the hybridized DNA using an endonuclease (cl eavase) that cleaves the 3 ′ side of the base of probe A corresponding to the flap. This releases the flap portion. Next, the released flap portion and the probe for detection are hybridized.
  • the detection probe is generally called a fluorescence resonance energy trans fer (FRET) probe.
  • FRET fluorescence resonance energy trans fer
  • the 5 'side can complementarily bind by itself.
  • the 3 ′ side has a sequence complementary to the flap.
  • a 5' end is labeled with reporter fluorescence
  • the 3 'side of the 5' end is labeled with quencher fluorescence.
  • the base at the 3 'end of the released flap hybridizes to the FRET probe.
  • the repo overnight fluorescence of the probe penetrates the labeled complementary binding site, thereby generating a structure recognized by cl eavase.
  • the fluorescence of the repo released by the cleavage of the reporter fluorescent label by cl eavase is detected, and the measured fluorescence intensity is compared with that of a control.
  • DNA is prepared from a test rice (step
  • step (a) a DNA containing the site described in any of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site is amplified (step (b)).
  • step (c) the amplified DNA is dissociated into single strands (step (c)).
  • step (d) only one strand of the dissociated single-stranded DNA is separated (step (d)).
  • an extension reaction is performed one base at a time from the site described in any of the above (1) to (28), or the vicinity of a base site in a complementary strand that forms a base pair with a base group at the site, and the elongation reaction is performed at that time.
  • the pyrophosphoric acid is enzymatically luminesced, and the luminescence intensity is measured (step (e)).
  • the fluorescence intensity measured in step (e) is compared with that of a control (step (f)).
  • Examples of such a method include the Pyrosequencing method (Anal.
  • step (a) a DNA containing the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site is amplified (step (b)).
  • step (b) a primer complementary to the site according to any one of the above (1) to (28) or a sequence up to one base adjacent to the base site in the complementary strand forming a base with the base at the site is synthesized.
  • Step (c) Next, in the presence of the fluorescently labeled nucleotide, the DNA amplified in step (b) is converted into a type III, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step (d)).
  • step (e) the degree of polarization of the fluorescence is measured (step (e)).
  • step (f) the degree of polarization of the fluorescence measured in step (e) is compared with a control (step (f)).
  • Examples of such a method include the Acyclo Prime method (Genome Research (1999) 9: 492-498).
  • the Acyclo Prime method uses one set of primers for genome amplification and one primer for SNPs detection.
  • a region containing SNPs in the genome is amplified by PCR. This step is the same as for normal genomic PCR.
  • the obtained PCR product is annealed with a primer for detecting a polymorphism, and an extension reaction is performed.
  • a primer for detecting a polymorphism is designed to anneal to a region adjacent to a polymorphism site to be detected.
  • a nucleotide derivative (Termine overnight) labeled with a fluorescent polarizing dye and blocking 3'-0H is used as a nucleotide substrate for the extension reaction.
  • step (A) in the method of the present invention can be suitably carried out using the Acyclo Prime method.
  • Primers for genome amplification and primers for polymorphism detection used in the Acyclo Prime method can be appropriately prepared by those skilled in the art based on information on the genome sequence and the polymorphic site.
  • Examples of the primer for genome amplification and the primer for polymorphism detection used in the rice cultivar differentiation method of the present invention using the Acyclo Prime method include, for example, the primers described in Tables 8 and 9. However, it is not limited to these primers.
  • DNA is prepared from a test rice (step (a)).
  • a DNA containing the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site is amplified (step (b)).
  • a primer complementary to the site according to any one of the above (1) to (28) or a sequence up to one base adjacent to a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site is synthesized. (Step (c)).
  • step (b) the DNA amplified in step (b) is converted into a type III, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step (d)).
  • step (d) the base type used in the reaction in step (d) is determined using a sequencer (step (e)).
  • step (f) the base species determined in step (e) is compared with a control (step (f)). Examples of such a method include the SNuPe method (Rapid Commun Mass Spectrom. (2000) 14: 950-959).
  • DNA is prepared from a test rice (step (a)).
  • a DNA containing the site described in any one of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site is amplified (step (b)).
  • the DNA amplified in step (b) is subjected to a mass spectrometer to measure the molecular weight (step (c)).
  • the molecular weight measured in step (c) is compared with a control (step (d)).
  • Examples of such a method include the MALDI-TOF MS method (Trends Biotechnol (2000): 18: 77-84).
  • step (a) a DNA containing the site described in any of the above (1) to (28) or a base site in a complementary strand forming a base pair with the base at the site is amplified (step (b)).
  • step (c) a substrate having the nucleotide probe immobilized thereon is provided.
  • substrate means a plate-like material to which nucleotides can be immobilized.
  • nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides. Renucleotides.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be suitably used.
  • DNA arrays are composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate.
  • the surface layer of the substrate is generally glass, but a permeable (porous) membrane, for example, a nitrocellular membrane can be used.
  • an array based on oligonucleotides developed by Affymetrix can be exemplified as a method for immobilizing (arraying) nucleotides.
  • oligonucleotide array oligonucleotides are usually synthesized in situ.
  • in situ synthesis of oligonucleotides using pho to li thographic technology (Af fymetrix) and ink jet fixing technology (Roset ta Inpharma tics) has been already known. Therefore, any of the techniques can be used for manufacturing the substrate of the present invention.
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is a nucleotide probe capable of detecting a polymorphism at a site according to any one of the above (1) to (28), or at a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. If so, there is no particular limitation. That is, the probe specifically hybridizes with DNA containing a site described in any of the above (1) to (28), or a DNA containing a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. It is a probe that redistributes.
  • the nucleotide probe may be a DNA comprising a site according to any one of the above (1) to (28), or a DNA comprising a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. Need not be completely complementary to In the present invention, the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is generally 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, and more preferably 15 to 25 bases when the oligonucleotide is immobilized. You. Next, in this method, the DNA of step (b) is brought into contact with the substrate of step (c) (step (d)). In this step, the DNA is hybridized to the nucleotide probe.
  • the hybridization reaction solution and reaction conditions can vary depending on various factors such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate, but can be generally performed by a method well known to those skilled in the art.
  • step (e) the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate is detected.
  • This detection can be performed, for example, by reading the fluorescent signal with a scanner or the like.
  • DNA arrays DNA fixed on a slide glass is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the above nucleotide immobilized on the substrate is referred to herein as a nucleotide probe.
  • the intensity detected in step (e) is then compared with a control (step (d)).
  • Examples of such a method include a DNA array method (SNP gene polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, pl28-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167) and the like.
  • SNP gene polymorphism strategy Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, pl28-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167) and the like.
  • an allele-specific 01 nucleonucleotide (ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position.
  • ASO allele-specific 01 nucleonucleotide
  • the present invention also provides a primer for discriminating rice varieties, comprising the site according to any one of the above (1) to (28), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • Oligonucleotides for amplifying the DNA region I will provide a.
  • Such an oligonucleotide was designed so as to sandwich the site according to any one of the above (1) to (28), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. Oligonucleotides.
  • the design and synthesis of PCR primers can be generally performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the length of the PCR primer is not particularly limited, but is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. Further, the present invention provides the above (1) to
  • the oligonucleotide is useful, for example, as a primer for the rice cultivar identification method of the present invention using the Acyclo Prime method.
  • Such oligonucleotides include, for example, the oligonucleotides shown in Table 8 or 9.
  • the present invention hybridizes with a region according to any one of the above (1) to (28) or a DM region including a base region in a complementary strand forming a base pair with a base at the position, and comprises at least 15 nucleotides.
  • a region according to any one of the above (1) to (28) or a DM region including a base region in a complementary strand forming a base pair with a base at the position and comprises at least 15 nucleotides.
  • an oligonucleotide having a chain length for a rice variety discrimination method.
  • the oligonucleotide is used, for example, as a probe.
  • the oligonucleotide specifically hybridizes to a site according to any one of the above (1) to (28) or a DNA region containing a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. It is.
  • the term "specifically eight hybridizations” refers to ordinary hybridization conditions, preferably to stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Emulsification).
  • the oligonucleotide may be a site according to any one of the above (1) to (28), or a site at the site. It does not need to be completely complementary to the DNA region containing the base site in the complementary strand that forms a base pair with the base.
  • the length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it is 15 nucleotides or more.
  • the oligonucleotide can be produced, for example, by using a commercially available oligonucleotide synthesizer. It can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide is appropriately labeled before use.
  • Labeling methods include, for example, a method of labeling by phosphorylating the 5 'end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, and a random hexamer using DNA polymerase such as Klenow enzyme.
  • a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin or the like using an oligonucleotide or the like as a primer (random prime method) can be mentioned.
  • the base described in the above () to (28 ′) Oligonucleotides having a chain length of at least 15 nucleotides with a polymorphic mutation of are also included in the present invention.
  • the present invention further provides a rice cultivar discrimination kit comprising the oligonucleotide of the present invention.
  • the kit of the present invention can further include an alkaline aqueous solvent.
  • a control standard rice sample and instructions describing the use of the kit can be packaged.
  • FIG. 1 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • FIG. 2 shows a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • FIG. 3 is a view showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 5 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5.
  • FIG. 6 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • FIG. 2 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the base sequence shown by SEQ ID NO: ⁇ .
  • FIG. 8 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 8.
  • FIG. 9 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 9.
  • FIG. 10 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 10.
  • FIG. 11 shows that the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 was found among 24 rice varieties.
  • FIG. 2 is a diagram showing a polymorphic site obtained and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site.
  • FIG. 12 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 12.
  • FIG. 13 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.
  • FIG. 14 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 14.
  • FIG. 15 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 16 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • FIG. 17 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 17.
  • FIG. 18 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • FIG. 19 is a view showing a polymorphic site found among 24 rice varieties in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • FIG. 20 shows the polymorphic site found among the 24 rice varieties and the primer sequence for amplifying the DNA region containing the site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • FIG. 21 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 21.
  • FIG. 22 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 22.
  • FIG. 23 is a continuation of FIG. 22.
  • FIG. 24 is a view showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 23.
  • FIG. 25 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 24.
  • FIG. 26 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 25.
  • FIG. 27 is a view showing a polymorphic site found among 24 rice varieties in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • FIG. 28 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27.
  • FIG. 29 is a diagram showing a polymorphic site found among 24 rice varieties and a primer sequence for amplifying a DNA region containing the site in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 28.
  • FIG. 30 is a photograph showing the result of PCR using DNA extracted from polished rice as type III.
  • the milled rice sample is commercial rice with the label “Akitakomachi” from Ibaraki Prefecture in 2000.
  • the PCR primer used was PGC1001 (U: 5′_accgggtagggaaacaaac-3′Z SEQ ID NO: 113, L: 5′-aataatacttcggcgcatcg-3 ′ / SEQ ID NO: 114).
  • a PCR reaction was performed using the DNA extracted by the following method as type I, and the reaction solution was separated by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • Cycle sequence was performed using TerminatorCycle Sequencing kit for MegaBACE (Amersham Biosciences) II: to prepare a sample for sequencing.
  • the sequence was performed using MegaBACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dymnamics). The obtained sequence was compared for each variety, and single nucleotide substitution polymorphism was searched. Sequences were performed at least twice for the same cultivar and the same primer, and only those that were reliable were judged to be polymorphisms.
  • ⁇ Data description format 1. Mark the part of the primer with Katsuko, and add ":” for Upper primer site and “q:” for Lower primer site.
  • aactc LQ aatcacgccc atccttgcct ''
  • SNPs sites are given a force and an identification number.
  • the identification number is attached to both the starting sword and the ending sword.
  • DNA extraction from polished rice, brown rice and cooked rice was studied. First, in a 2ml tube (Eppendorf), 1 grain of milled rice, brown rice and cooked rice, 0.4ml of extraction buffer (1M KC1, lOmM Tris-HCK ImM EDTA, 0. IN NaOH), 3mm tall zirconia pool Put it in, cover it, let it stand at 4 for 30 minutes, and then use Retch crusher mixer mill MM300. It was pulverized twice at 300 Hz x 2 min x 2 to obtain a milky liquid. This was centrifuged at lOOOOrpmXlO, and 0.3 ml of the supernatant was transferred to another tube.
  • extraction buffer (1M KC1, lOmM Tris-HCK ImM EDTA, 0. IN NaOH
  • 3mm tall zirconia pool Put it in, cover it, let it stand at 4 for 30 minutes, and then use Retch crusher mixer mill MM300. It was pulverized twice at 300 Hz x 2 min
  • the buffer used first in Methods 5 and 6 was made 1M KC1 and 10 mM Tris-HCK ImM EDTA (Methods 3 and 4 respectively).
  • extraction by the CTAB method was also performed. Specifically, put one grain of milled rice and 0.2 ml CTAB buffer (method 1) or 0.2 ml 0. IN NaOH (method 2) and a thigh-diameter zirconia pole in a 2 ml tube, and cover with the same conditions as method 5. Crush with. Add 0.7ml CTAB buffer and heat-treat with 56 for 20 minutes. 640/21 phenol / black mouth form (1: 1) was added and mixed, centrifuged at 100 rpm x 10 min, and 0.7 ml of the supernatant was transferred to another tube. Add 1.3 ml CTAB precipitation buffer,
  • the precipitate was dissolved by adding 0.5 ml IN NaCl containing RNase, and then 1 ml of ethanol was added and mixed, followed by centrifugation at 10,000 ⁇ 10 minutes. The precipitate was washed with 1 ml of 70% ethanol, dried and dissolved in 30 l of sterile water.
  • primer PGC1001 (sequence U: 3 ⁇ 4-accgggtagggaaacaaac-3 '/ arrangement (1 number: 113, L: 5-aataatacttcggcgcatcg-3' / sequence number: 1 14) 'The results are shown in Fig. 30. No PCR amplification was observed in the polished rice DNA extracted by methods 1 and 2, but the amplification was excellent in methods 3 to 6. As a result, it was necessary to perform phenol / cloth-form treatment in extracting DNA from milled rice. 7332
  • Method 5 was the simplest and most efficient.
  • PCR reaction was performed using the extracted DNA as type III.
  • an acycloprime reaction was performed using the PCR product as type III, and polymorphism (SNP) was determined.
  • Example 4 Rice varieties identification In [Example 3], it is necessary to distinguish these three varieties in order to determine which of the three varieties determined to be other than Akitakomachi is Kirara 397, Koshihikari, Yume Tsukushi, or Kinuhikari. Using sufficient primers of two markers (S001 5 and S0045), PCR was performed using the extracted DNA as type III. An acycloprime reaction was performed using the PCR product as type II to determine polymorphism (SNP).
  • the method of the present invention examines polymorphisms in the rice genome, so that it is possible to accurately identify varieties with a small amount of rice samples. In addition, the method of the present invention enables accurate varietal discrimination between closely related varieties.

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Abstract

　日本国内で作付面積の多い24品種における多型部位を探索し、品種毎に比較した。そして、これらの品種を簡単かつ迅速に鑑別するための多型マーカーを取得した。該マーカーは、品種毎に異なるパターンを示し、組み合わせることによって品種の鑑別が可能であることが示された。つまり、イネ24品種の鑑定が可能な分子マーカーを取得することに成功した。該マーカーを利用することで、DNAレベルで近縁品種の識別・特定が可能となった。

Description

イネの品種鑑別法 技術分野
本発明は、 イネの品種鑑別方法に関する。 背景技術
イネあるいは米の品種鑑別には草丈、 分げつ数、 出穂期などの栽培特性、 粒形、 粒重、 白度などの玄米 ·精米特性、 および食味等の炊飯特性が従来利用されてき た。 また近年では、 これらに加えて、 RFLP (制限酵素断片長多型） や CAPS
(c l eaved ampl i f i ed po lymorphi c sequence) などの分子遺伝学的解析による分 別も可能となっている。 しかし、 栽培特性による鑑別には熟練した育種家の目が 必要であり、 誰にでも鑑別できるというものではない。 また玄米 ·精米特性では 統計的な解析が不可欠であり、 炊飯特性ではある程度の量の米が必要であり、 一 粒一粒の米を鑑別することは不可能であつた。 分子遺伝学的解析は原理上この問 題を解決したが、 実際には、 遠縁なものの識別には有効であるものの近縁品種間 の分子マ一力一の確立が難しいため、 識別は困難である。
一塩基多型 （SNPs) とは、 定義上は DNA塩基配列上に存在する一塩基の差異で あるが、 実際には SSR (s i即 l e sequence repeat) や挿入 ·欠失変異も包含して 表すことが多く、 RFLP、 CAPS等の分子マーカ一で検出できる遺伝的差異や、 形 質等に反映される遺伝的差異は全て SNPsに由来すると言っても過言ではない。 SNPs研究と SNPs判定系はこの数年で著しく進歩し、 現在では電気泳動を全く必 要とせず、 PCRから判定まで 96ゥエルプレート上で行うことのできる判定系も 開発されており、 従来の分子マーカーに比べて格段に効率的に遺伝子型の判定が 可能になっている。 03 07332
- 2 - 一方、 食品流通過程における品質表示の信頼性が問題となっている昨今、 米に ついてもたとえばコシヒカリとして販売されている米の流通量が、 全国のコシヒ 力リ作出量を上回るなど、 米の流通過程で虚偽の表示が行われている可能性が否 定できず、 消費者あるいは小売業者の立場からも精米の正確な品種鑑別および混 合割合の検定が望まれていた。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 イネ品 種を迅速かつ簡便に鑑別可能な新しい方法を提供することにある。 より詳細には、 多型マーカ一を利用した、 効率的なイネの品種鑑別方法の提供を目的とする。 本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行つた。 まずィネゲノム シーケンスを利用し、 イネゲノム塩基配列情報が公開されている染色体領域につ いては、 遺伝子が予測されていない領域を中心に、 それ以外の領域については RFLPマーカ一プローブのシーケンス等を利用して、 ゲノム DNAから 800bp〜lkbp を増幅するプライマーを設計した。 設計したプライマーを用いてまず日本晴'コ シヒカリ ·カザラス ·廣陸矮 4号 （以下 G4) 、 キタァケ、 および野生イネ
(Oryza ruf ipogon, 1943) の簡易抽出 DNAを铸型として PCR増幅を行い、 シー クエンス反応の铸型とした。 この铸型に対してサイクルシークェンスを行い、 シ 一ケンス用サンプルを作成した。 得られたシークェンスデータを品種ごとに比較 し、 一塩基置換多型を検索した。 同一品種、 同一プライマーに対し少なくとも 2 回のシークェンスを行い、 確実であるもののみを多型と判定した。
日本晴 ·コシヒカリ間および日本晴 ·キタァケ間で多型の見られた部位につい て、 日本晴 .ハツシモ ·むつほまれ ·ゆきの精 'きらら 397 ·つがるロマン ·五 百万石 ·森のくまさん ·ゆめあかり ·ハナエチゼン ·コシヒカリ '月の光'あき たこまち ·朝の光 ·あいちのかおり ·祭り晴 ·ヒノヒカリ ·夢つくし ·ひとめぼ れ ·まなむすめ .ふさおとめ ·どんとこい ·キヌヒカリ ·ササニシキの簡易抽出 ゲノム DNAを铸型とし、 同様に PCR反応とシ一ケンシングを行い、 多型部位の塩 基を品種毎に比較した。
次いで、 品種鑑別に有用な SNPsについて、 SNPs検出用プライマーを設計し、 Acyc l oPr ime -FP キット（PerkinElmer)を用いて一塩基ターミネータ反応を行い、 ジエノタイピング用サンプルを作成した。 ジエノタイピングは ARVO Perkin Elmer)で蛍光偏光度を測定して行つた。
その結果、 シークェンスで SNPs と判定した箇所について作成したマーカーは、 それぞれ異なるパタ一ンを示し、 組み合わせによってさまざまに分類できること が示された。 つまり、 イネ 24品種の鑑定が可能な多型マーカ一を取得すること に成功した。
上記の如く本発明者らは、 日本国内で作付面積の多い 24品種における SNPs部 位を探索し、 これらの品種を簡単かつ迅速に鑑別可能な多型マーカーを作成する ことにより、 該多型マーカーを利用した新規なィネ品種鑑別方法を完成させた。 本発明の方法を利用することで、 DNAレベルで近縁品種の識別 ·特定が可能にな る。
即ち本発明は、 イネ品種を迅速かつ簡便に鑑別可能な新しい方法に関し、 より 具体的には、
〔1〕 以下の工程 （a ) および （b ) を含む、 イネ品種を鑑別する方法。
( a ) イネゲノムにおける以下の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の塩基部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の塩基種を判定す る工程、
( 1 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 5 9 3位
( 2 ) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 3 0 4位
( 3 ) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 4 5 0位
( 4 ) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 3 7 7位
( 5 ) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 1 6 3位 ( 6 ) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 624位
( 7 ) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 534位
( 8 ) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 358位
(9) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 475位
(10) 配列番号： 10に記載の塩基配列の 323位
(11) 配列番号： 11に記載の塩基配列の 612位
(12) 配列番号： 12に記載の塩基配列の 765位
(13) 配列番号： 13に記載の塩基配列の 571位
(14) 配列番号： 14に記載の塩基配列の 660位
(15) 配列番号： 15に記載の塩基配列の 223位
(16) 配列番号： 16に記載の塩基配列の 247位
(17) 配列番号： 17に記載の塩基配列の 163位
(18) 配列番号： 18に記載の塩基配列の 421位
(19) 配列番号： 19に記載の塩基配列の 178位
(20) 配列番号： 20に記載の塩基配列の 141位
(21) 配列番号： 21に記載の塩基配列の 480位
(22) 配列番号： 22に記載の塩基配列の 481位
(23) 配列番号： 23に記載の塩基配列の 131位
(24) 配列番号： 24に記載の塩基配列の 510位
(25) 配列番号： 25に記載の塩基配列の 248位
(26) 配列番号： 26に記載の塩基配列の 92位
(27) 配列番号： 27に記載の塩基配列の 743位
(28) 配列番号： 28に記載の塩基配列の 552位
(b) 上記工程 （a) により判定された塩基種と品種を関連付ける工程
〔2〕 イネゲノムにおける以下の (1) 〜 （28) のいずれかに記載の塩基変 異を特徴とする多型マーカーを用いて塩基種の判定を行う、 〔1〕 に記載の方法、 1) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 5 9 3位の塩基が T
2) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 3 04位の塩基が T
3) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 450位の塩基が A
4) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 37 7位の塩基が C
5) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 1 6 3位の塩基が C
6) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 624位の塩基が C
7) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 5 34位の塩基が C
8) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 3 5 8位の塩基が G
9) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 47 5位の塩基が G
(1 0) 配歹 1.番号： 1 0に .記載の塩基配列の 3 2 3位の塩基が A
(1 1) 配歹 1-番号： 1 1に .記載の塩基配列の 6 1 2位の塩基が A
(1 2) 配歹 t番号： 12に記載の塩基配列の 76 5位の塩基が T
(1 3) 配歹 1番号： 1 3に記載の塩基配列の 5 7 1位の塩基が T
(14) 配歹 1番号： 14に記載の塩基配列の 6 6 0位の塩基が G
(1 5) 配歹 1'番号： 1 5に .記載の塩基配列の 22 3位の塩基が A
(1 6) 配 番号： 1 6に記載の塩基配列の 247位の塩基が A
(1 7) 配歹 1番号： 1 7に記載の塩基配列の 1 6 3位の塩基が A
(1 8) 配歹 1 1番号： 1 8に ：記載の塩基配列の 42 1位の塩基が C
(1 9) 配歹 1—番号 : 1 9に ：記載の塩基配列の 1 7 8位の塩基が G
(20) 配歹 1 1番号 : 20に ：記載の塩基配列の 141位の塩基が G
(2 1) 配歹'. 1番号 : 2 1に ：記載の塩基配列の 48 0位の塩基が C
(22) 配 1番号 : 22に ：記載の塩基配列の 48 1位の塩基が C
(2 3) 配歹 1— 1番号 : 23に ：記載の塩基配列の 1 3 1位の塩基が C
(24) 配歹'. 1番号 : 24に ：記載の塩基配列の 5 1 0位の塩基が A
(2 5) 配歹 1. 1番号 : 2 5に ：記載の塩基配列の 248位の塩基が T
(2 6) 配 1番号 : 26に記載の塩基配列の 9 2位の塩基が C (27) 配列番号： 27に記載の塩基配列の 743位の塩基が G (28) 配列番号： 28に記載の塩基配列の 552位の塩基が T
〔3〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅するェ 程
(c) 増幅した DNAの塩基配列を決定する工程
[43 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の方法、 (a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 調製した DNAを制限酵素により切断する工程
(c) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(d) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程
〔5〕 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 · 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判定 方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ 程
(c) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程
〔6〕 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判定 方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ 程
(c) 増幅した DN Aを一本鎖に解離させる工程
( d ) 解離させた一本鎖 D N Aを非変性ゲル上で分離する工程
(e) 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔7〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判定 方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相 補的なオリゴヌクレオチドに、 レポーター蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2つを標識 したプローブを 2種類合成する工程
(c) 工程 （a) で調製した DNAに、 工程 （b) で合成したプローブをハイブ リダィズさせる工程
(d) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ
(e) レポ一夕一蛍光の発光を検出する工程
(f ) 工程 （e) で検出したレポ一ター蛍光の発光を対照と比較する工程 〔8〕 以下の （a) 〜 （h) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判定 方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む 3 '側塩基配列と相 補的な配列、 および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程
(c) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 0307332
- 8 - における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から 5 '末端側が相補的な プローブを合成する工程
(d) 工程 （c) で合成したプローブと工程 （a) で調製した DNAとハイプリ ダイズさせる工程
(e) 工程 （d) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程 （b) で合成したプローブの一部を遊離させる工程
(f ) 工程 （e) で遊離したプローブと、 検出用プローブとをハイブリダィズさ せる工程
(g) 工程 （f) でハイブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生 する蛍光の強度を測定する工程
(h) 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔9〕 以下の （a) 〜 （ί) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判定 方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ 程
(c) 増幅した DN Aを一本鎖に解離させる工程
(d) 解離させた一本鎖 DNAのうち、 片鎖のみを分離する工程
(e) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より 1塩基ずつ伸長 反応を行い、 その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度を 測定する工程
(f ) 工程 （e) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔10〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判 定方法、 (a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ 程
(c) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相 補的なプライマーを合成する工程
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程 (e) 蛍光の偏光度を測定する工程
(f) 工程 （e) で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
〔11〕 以下の （a) 〜 （ί) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判 定方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅するェ 程
(c) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相 補的なプライマーを合成する工程
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(e) シーケンサーを利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基種を判定する 工程
(f) 工程 （e) で判定された塩基種を対照と比較する工程
〔12〕 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判 定方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅するェ 程
(c) 工程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子量を測定する工程
(d) 工程 （c) で測定した分子量を対照と比較する工程
〔13〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の判 定方法、
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位 における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅するェ 程
( c ) ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
(d) 工程 （b) の DNAと工程 （c) の基板を接触させる工程
( e ) 該 DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイプリダイズ の強度を検出する工程
(f ) 工程 （e) で検出された強度を対照と比較する工程
〔14〕 以下の工程 （a) および （b) をさらに含む、 〔1〕 〜 〔13〕 のい ずれかに記載の方法、
(a) アルカリ性の水性溶媒中でイネの種子を粉砕する工程、 および
(b) 上記工程 （a) で粉枠した種子からイネゲノム DNAを抽出する工程 〔15〕 種子が精米されている 〔14〕 に記載の方法、
〔16〕 イネの品種を鑑別するためのプライマー （もしくはイネ品種鑑別用試 薬） であって、
(a) イネゲノムにおける 〔1〕 に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の 部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む
D N A領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、 または
( b ) イネゲノムにおける 〔1〕 に記載の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の 部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩 基隣までの配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
〔1 7〕 〔1〕 に記載の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該 部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む D N A領域とハ イブリダィズし、 少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を有する、 イネの品種を鑑 別するためのオリゴヌクレオチド （もしくはイネ品種鑑別用試薬） 、
〔1 8〕 〔1 6〕 または 〔1 7〕 に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 イネ品 種鑑別用キット、
〔1 9〕 さらに、 アルカリ性の水性溶媒を含む、 〔1 8〕 に記載のイネ品種鑑 別用キット、 を提供するものである。 本発明者らは、 イネ 2 4品種のゲノム配列を解析することにより、 これらのィ ネの品種を正確に鑑別できる多型マ一カーを見出した。 本発明者らによって見出 された、 イネゲノムにおける多型部位を含む DNA領域を配列番号： 1〜2 8に記 載する。 また、 各多型部位の位置を図 1〜2 9および表 8、 9に記載する。
本発明は、 イネの品種を鑑別する方法を提供する。 本発明の方法は、 まず、 本 発明者らによって見出されたイネ 2 4品種におけるゲノム上の多型部位について、 塩基種の判定を行う。 より具体的には、 イネゲノムにおける以下の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の塩基部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相 補鎖における部位の塩基種を判定する （工程 （A) ) 。
( 1 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 5 9 3位
( 2 ) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 3 0 4位
( 3 ) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 4 5 0位 2
2
4) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 377位
5) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 163位
6 ) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 624位
7) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 534位
8 ) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 358位
9) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 475位
10 ) 配列番号： 10に記載の塩基配列の 323位
1 1) 配列番号： 11に記載の塩基配列の 612位
12) 配列番号： 12に記載の塩基配列の 765位
(13) 配列番号： 13に記載の塩基配列の 571位
4) 配列番号： 14に記載の塩基配列の 660位
5) 配列番号： 15に記載の塩基配列の 223位
6) 配列番号： 16に記載の塩基配列の 247位
7) 配列番号： 17に記載の塩基配列の 163位
(18) 配列番号： 18に記載の塩基配列の 421位
19) 配列番号： 19に記載の塩基配列の 178位
20 ) 配列番号： 20に記載の塩基配列の 141位
21) 配列番号： 21に記載の塩基配列の 480位
22) 配列番号： 22に記載の塩基配列の 481位
(23) 配列番号： 23に記載の塩基配列の 131位
24) 配列番号： 24に記載の塩基配列の 510位
25) 配列番号： 25に記載の塩基配列の 248位
26) 配列番号： 26に記載の塩基配列の 92位
27) 配列番号： 27に記載の塩基配列の 743位
(28) 配列番号： 28に記載の塩基配列の 552位
尚、 当業者においては、 通常、 本明細書で示される塩基配列および多型部位等 に関する情報から、 適宜、 該多型部位に相当する実際のゲノム上の位置を知るこ とは容易である。 例えば、 公開されているゲノムデータベース等と照会すること により、 本発明の多型部位のゲノム上の位置を知ることができる。 即ち、 配列表 に掲げた塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違が みられた場合であっても、 配列表に掲げた塩基配列を基にゲノム配列と相同検索 等を行うことにより、 本発明の多型部位について、 実際のゲノム上の位置を正確 に知ることが可能である。
なお、 ゲノムにおける DNAは、 通常、 互いに相補的な二本鎖 D NA構造を有し ている。 従って、 本明細書においては、 便宜的に一方の鎖における D NA配列を 示した場合であっても、 当然の如く、 当該配列 （塩基） に相補的な配列も開示し たものと解釈される。 当業者にとって、 一方の D NA配列 （塩基） が判れば、 該 配列 （塩基） に相補的な配列 （塩基） は自明である。
本発明における 「多型」 は、 一塩基の置換、 欠失、 挿入変異からなる一塩基多 型 (SNPs)に限定されず、 連続する数塩基の置換、 欠失、 挿入変異も含まれる。 本 発明の 「多型マ一カー」 とは、 多型部位における塩基変異 （多型変異） について の情報を言う。 より具体的には、 本発明の多型マ一力一とは、 イネの品種である 「日本晴」 のゲノム配列と他の品種のゲノム配列とを比較した際に見出される塩 基配列変異についての情報であり、 イネ品種鑑別に利用可能なものを指す。 本発 明において塩基種の判定に使用される多型マ一カーとは、 好ましくは、 下記の ( 1， ） 〜 （2 8， ） で示す多型マーカーを指す。 即ち、 本発明の好ましい態様 においては、 下記 （1， ） 〜 （2 8， ） で示す多型マーカーを利用することによ り、 イネ品種の鑑別を行う。
( 1， ) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 5 9 3位の塩基が T。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1に記載の塩基配列の 5 9 3位の塩基部位 が、 Cから Τへの変異である。
( 2， ) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 3 0 4位の塩基が Τ。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2に記載の塩基配列の 3 0 4位の塩基部位 が、 Aから Tへの変異である。
( 3 ' ) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 4 5 0位の塩基が A。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 3に記載の塩基配列の 4 5 0位の塩基部位 が、 Gから Aへの変異である。
( 4， ） 配列番号： 4に記載の塩基配列の 3 7 7位の塩基が C。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 4に記載の塩基配列の 3 7 7位の塩基部位 が、 Tから Cへの変異である。
( 5 ' ) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 1 6 3位の塩基が C。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 5に記載の塩基配列の 1 6 3位の塩基部位 が、 Tから Cへの変異である。
( 6 ' ) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 6 2 4位の塩基が (：。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 6に記載の塩基配列の 6 2 4〜 6 2 6位の 塩基部位が、 欠失変異である。
( 7 ' ) 配列番号： Ίに記載の塩基配列の 5 3 4位の塩基が C。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 7に記載の塩基配列の 5 3 4位の塩基部位 が、 Aから Cへの変異である。
( 8， ） 配列番号： 8に記載の塩基配列の 3 5 8位の塩基が G。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 8に記載の塩基配列の 3 5 8位と 3 8 9位 の間の塩基部位への、 G Tの挿入変異である。
( 9 ' ) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 4 7 5位の塩基が G。 より詳しくは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 9に記載の塩基配列の 4 7 5位の塩基部位 が、 Tから Gへの変異である。
( 1 0， ) 配列番号： 1 0に記載の塩基配列の 3 2 3位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 0に記載の塩基配列の 3 2 3位の 塩基部位が、 Gから Aへの変異である。 ( 1 1 ' ) 配列番号： 1 1に記載の塩基配列の 6 1 2位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 1に記載の塩基配列の 6 1 2およ び 6 1 3位の塩基部位が、 C Aから A Gへの変異である。
( 1 2 ' ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列の 7 6 5位の塩基が T。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 2に記載の塩基配列の 7 6 5位の 塩基部位が、 Gから Τへの変異である。
( 1 3 ' ) 配列番号： 1 3に記載の塩基配列の 5 7 1位の塩基が Τ。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 3に記載の塩基配列の 5 1位の 塩基部位が、 Gから Τへの変異である。
( 1 4 ' ) 配列番号： 1 4に記載の塩基配列の 6 6 0位の塩基が G。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 4に記載の塩基配列の 6 6 0位の 塩基部位が、 Aから Gへの変異である。
( 1 5 ' ) 配列番号： 1 5に記載の塩基配列の 2 2 3位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 5に記載の塩基配列の 2 2 3位の 塩基部位が、 Gから Aへの変異である。
( 1 6 ' ) 配列番号： 1 6に記載の塩基配列の 2 4 7位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 6に記載の塩基配列の 2 4 7位の 塩基部位が、 Gから Aへの変異である。
( 1 7 ' ) 配列番号： 1 7に記載の塩基配列の 1 6 3位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 7に記載の塩基配列の 1 6 3位の 塩基部位が、 Gから Aへの変異である。
( 1 8 ' ) 配列番号： 1 8に記載の塩基配列の 4 2 1位の塩基が C。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 8に記載の塩基配列の 4 2 1位の 塩基部位が、 Aから Cへの変異である。
( 1 9 ' ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列の 1 7 8位の塩基が G。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 1 9に記載の塩基配列の 1 7 8位の 塩基部位が、 欠失変異である。
( 2 0 ' ) 配列番号： 2 0に記載の塩基配列の 1 4 1位の塩基が G。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 0に記載の塩基配列の 1 4 1位の 塩基部位が、 Aから Gへの変異である。
( 2 1 ' ) 配列番号： 2 1に記載の塩基配列の 4 8 0位の塩基が C。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 1に記載の塩基配列の 4 8 0位の 塩基部位が、 丁から Cへの変異である。
( 2 2 ' ) 配列番号： 2 2に記載の塩基配列の 4 8 1位の塩基が C。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 2に記載の塩基配列の 4 8 1位の 塩基部位が、 Tから Cへの変異である。
( 2 3 ' ) 配列番号： 2 3に記載の塩基配列の 1 3 1位の塩基が C。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 3に記載の塩基配列の 1 3 1位の 塩基部位が、 Gから Cへの変異である。
( 2 4 ' ) 配列番号： 2 4に記載の塩基配列の 5 1 0位の塩基が A。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 4に記載の塩基配列の 5 1 0位の 塩基部位が、 Gから Aへの変異である。
( 2 5 ' ) 配列番号： 2 5に記載の塩基配列の 2 4 8位の塩基が T。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 5に記載の塩基配列の 2 4 8位の 塩基部位が、 Cから Τへの変異である。
( 2 6 ' ) 配列番号： 2 6に記載の塩基配列の 9 2位の塩基が C。 より詳しく は、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 6に記載の塩基配列の 9 2位の塩基 部位が、 Gから Cへの変異である。
( 2 7 ' ) 配列番号： 2 7に記載の塩基配列の 7 4 3位の塩基が G。 より詳し くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 7に記載の塩基配列の 7 4 3位の 塩基部位が、 Aから Gへの変異である。
( 2 8 ' ) 配列番号： 2 8に記載の塩基配列の 5 5 2位の塩基が T。 より詳し 2
- 1 7 - くは、 「日本晴」 ゲノムにおける配列番号： 2 8に記載の塩基配列の 5 5 2位の 塩基部位が、 Cから Tへの変異である。
本発明において 「塩基種を判定する」 とは、 通常、 品種を鑑別したいイネ （以 下 「被検イネ」 と記載する場合あり） のゲノム上の上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいず れかに記載の部位における塩基の種類を決定することを指すが、 必ずしも塩基の 具体的な種類まで決定する必要はない。 被検イネのゲノムにおける上記 （1 ) 〜 ( 2 8 ) のいずれかに記載の部位の塩基種が具体的に決定できなくても、 日本晴 と同一か否かが判明すれば、 イネ品種の鑑別を行うことが可能である。
本発明の方法においては、 次いで、 上記工程 （A) により判定された塩基種と 品種を関連付ける （工程 （B) ) 。
本発明に方法において、 鑑別が可能なイネ品種は、 次の通りである （本明細書 においては各品種名をそれぞれ括弧内に示すように略記する場合あり） 。 日本晴 (nhb)、 ハツシモ（hts：)、 むつほまれ (mth)、 ゆきの精 (yki)、 きらら 3 9 7 (krr；)、 つがるロマン（tgr)、 五百万石 (ghm)、 森のくまさん (innk；)、 ゆめあかり（yma)、 ノ ナェチゼン (liez)、 コシヒカリ（ksh)、 月の光（tkh)、 あきたこまち（akk)、 朝の光 (ash) , あいちのかおり（ank)、 祭り晴 (mtb)、 ヒノヒカリ（hnh)、 夢つくし（ymt)、 ひとめぼれ (hi t)、 まなむすめ（imnm)、 ふさおとめ（fom)、 どんとこい（don)、 キヌ ヒカリ（knh)、 ササニシキ（ssk)、 ァケポノ（akb)、 ゴロピカリ（grp)。
本発明の鑑別方法は、 通常、 品種が不明なイネについて上記の品種の中から品 種名を特定する、 もしくは、 上記の品種であるか否かを判別するために利用する ことができる。
本発明者らは、 上記のイネ品種について、 イネゲノムにおける上記 （1 ) 〜 ( 2 8 ) に記載の部位の塩基種を決定し、 多型マーカ一を作成した。 これらの多 型マーカーの詳細 （多型マーカーの名称、 および、 各イネ品種における上記
( 1 ) 〜 （2 8 ) に記載の部位の塩基種） を表 1に示す。
Figure imgf000019_0001
2
- 19 - 本発明においては、 被検イネのゲノムにおける上記 （1) 〜 （28) に記載の 部位の塩基種を決定することにより、 表 1に示される各ィネ品種における塩基種 のデ一夕に基づいてイネ品種を判定することができる。 本発明の好ましい態様に おいては、 上記 （1' ) 〜 （28' ) に記載の多型マーカーを利用して塩基種の 判定を行う。 本方法においては、 必ずしも上記 （1) 〜 （28) の記載の全ての 部位について塩基種を決定する必要はない。 例えば、 多型マーカ一 「S0124」 を 利用し、 上記 （10) の配列番号： 10に記載の塩基配列の 323位の塩基種の 判定を行い、 判定された塩基が A (アデニン） である場合には、 被検イネの品種 は、 「きらら 397」 であると判定される。 また、 多型マ一カー 「S0126」 およ び 「S0015」 を用いて塩基種の判定を行い、 上記 （9) の配列番号： 9に記載の 塩基配列の 475位の塩基種が Gであり、 かつ、 上記 （1) の配列番号： 1に記 載の塩基配列の 593位の塩基種が Cである場合には、 被検イネの品種は、 「ゆ きの精」 であると判定される。 このように、 決定された被検イネゲノムの上記 (1) 〜 （28) に記載の部位の塩基種から、 本発明によって提供される表 1に 基づいてイネ品種を判定することは、 当業者においては、 容易に行い得ることで ある。
さらに本発明の方法においては、 上記 （1) 〜 （28) に記載の部位において 必ずしも塩基種を決定する必要はなく、 被検イネのゲノムにおける上記 （1) 〜 (28) に記載の部位と塩基種が、 日本晴における該部位の塩基種とが同一であ るか否かを調べることにより、 イネ品種の鑑別を行うことができる。 本発明の好 ましい態様においては、 上記 （1' ) 〜 （28' ) に記載の多型マーカ一を利用 して、 被検イネのゲノムにおける上記 （1) 〜 （28) に記載の部位の塩基種が、 日本晴における該部位の塩基種と同一か否かに基づいてイネ品種の判定を行う。 本発明者らは、 イネの上述した各品種について上記 （1) 〜 （28) に記載の 各部位の塩基種が、 「日本晴」 の該部位における塩基種と同一であるか否かを調 ベ、 上述した各品種を鑑別可能な、 多型マ一カーの組み合わせを決定した （表 2 〜7 ) 。 表 2〜 7の網掛けで示す部分が、 各品種を鑑別可能な多型マーカ一の組 み合わせの例である。 必ずしも表 2〜 7に掲げた多型マーカ一の組み合わせに限 定されるものではなく、 当業者においては、 本発明によって提供される 2 6品種 のイネゲノムの上記 （1 ) 〜 （2 8 ) に記載の部位の塩基種についての情報から、 品種鑑別に用いることが可能な多型マーカーの組み合わせを適宜選択することが 可能である。 表中〇は 「日本晴」 との一致を表し、 Xは 「日本晴」 との不一致を 表す。
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本 ン ま の 39 万 さ か ゼ 力 の ま の お レ J 力 < ぼ す と 力 ン ポ 力 マ一カー晴 モ れ Ik 7 ン 石 ん リ ン 光 ち 光 リ U し れ め め い キ ノ U
日本晴一
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ゆきの精
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本 ン ま の 39 マ 万 さ か ゼ 力 の ま の お 力 < ぼ す と 力 ン ボ 力
7—力 晴 モ れ 7 ン 石 ん ン 光 ち 光 し れ め め い U キ ノ リ
るロマン
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五百万石
C
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t>0 森のくまさん
S0178 〇 O 0 〇 X 〇 X 〇 〇 X X 〇 o 〇 〇 〇 X X X X X X 〇 〇 X
S0015 〇 〇 0 〇 X X 〇纖 X 〇 X X X 〇 0 X 〇 o X X X X 〇 X 〇 X
S0161 〇 X X 〇 〇 X 〇 X 〇 0 〇 X 〇 X 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇
S0109 〇 o X 〇 X X X X 〇 X o X 〇 X 〇 X X X X X X X 〇 〇 〇 ゆめあかり
S0126 〇 〇 〇 X ο 〇 〇 〇難 o 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇
S0109 〇 〇 X ο X X X X -. - 〇 X 〇 X 〇 X 〇 X X X X X X X 〇 〇 〇 ハナエチゼン
S0177 〇 X X X X X X X X m X 〇 X X X X X X X X X X X X X 〇
S0174 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 X X X X 〇 X 〇 o 〇 X X X X X X X 〇 〇 〇
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曰 ソ ほ P ま あ チ ヒ 月 か w、 ヒ め む お と ヒ ピ
、 さ ら 百 、 ケ 本 ン ま の 39 万 さ か ゼ 力 の ま の お y 力 < ぼ す と 力 ン ポ 力 マ—力—晴 モ れ 精 7 ン 石 ん リ ン リ 光 ち 光 り 晴 U し れ め め い キ ノ U
コシヒカリ
S0040 〇 〇 〇 X X X X X X X議 〇 X 〇 〇 〇 X 〇 X X X 〇 〇 X 〇 X
S0044 〇 〇 〇 0 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇 X X 〇 〇 〇 月の光 CO
S0279 〇 X X X X X X X X X X m X X X X X X X X X X X X X X C
S0107 〇 〇 X X X X X X X X X A X X X X X X X X X X X X 〇 X あきたこまち
S01 15 〇 X X X X 〇 〇 X 〇 X X 〇 X 〇 X 〇 X X X X X 〇 X 〇 〇 X
S0146 〇 〇 〇 〇 X X 〇 〇 X 〇 X X X o X 〇 X 〇 〇 o X X 〇 〇 〇
S0178 〇 〇 〇 〇 X 〇 X 〇 〇 〇 X X o 〇 〇 〇 〇 X X X X X X 〇 〇 X 朝の光
S0208 〇 X X X X X X X X 〇 X 〇 X 0 X X X X X X o X X X X 〇
S0 46 〇 〇 〇 〇 X X 〇 〇 X 〇 X X X X 〇 X 〇 X 〇 〇 〇 X X 〇 〇 〇
S0177 〇 X X X X X X X X 〇 X 〇 X X X X X X X X X X X X X 〇
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1ヽ ゆ b る 五 < め X ン た の ノ と な さ ん ヌ サ ァ □
曰 V ヒ つ
、 ほ さ ら □ 百 ま あ チ ヒ 月 ^ 朝 か 祭 め む お と ヒ ケ ピ
本 ン ま の 39 万 さ か ゼ 力 の ま の お 力 ぐ ぼ す と 力 ン ポ 力 マーカー晴 モ れ 7 ン 石 ん レ J ン 光 ち 光 リ 晴 U し れ め め い キ ノ U
いちのかおり
S0109 〇 〇 X 〇 X X X X X 〇 X 〇 X 〇 o X X X X X X X 0 〇 〇
S0155 〇 〇 X 〇 X X X X X 〇 〇 X X 〇漏 X X 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇 X to
S0174 〇 〇 〇 ο 〇 X 〇 X X X X 0 X 〇 m 〇 X X X X X X X 〇 o 〇 祭リ晴
S0109 〇 〇 X 〇 X X X X X 〇 X ο X 〇 X 幽 X X X X X X X 〇 〇 〇
S0208 〇 X X X X X X X X ο X ο X 〇 X X X X X 〇 X X X X 〇
S01 6 〇 〇 〇 〇 X X 〇 〇 X ο X X X X 〇 〇 X o 〇 〇 X X 〇 〇 〇 ヒノヒカリ
S0015 〇 〇 〇 〇 X X 〇 X X 〇 X X X 〇 〇 X 〇 X X X X o X 〇 X
S0155 Ο 〇 X 〇 X X X X X 〇 〇 X X 〇 o X 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 0 X
S0 74 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 X X X X 〇 X 〇 〇 o X X X X X X 〇 〇 〇
ゆ
曰 ハシモッ 祭
本 れむつほま の リ ン
一力. 晴 い キ
ひとめぼれ
¾らら 7
つがマンる口
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百五万石 まなむすめ のまんさく
S0135 〇 〇 〇 ο 〇 〇 X 〇 ゆあ力め οレ.- 0 X 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X X 纖 X X X ο 〇 ο
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S0208 〇 X X X X X X X X X X
ハナゼ 〇エチン 〇 〇 X X X X X X 〇 X X X X ο
S0252 〇 X X X X 〇 〇 〇 X X 〇 〇 ο 〇 X 〇 〇 〇 〇 X X X 〇 〇 X 〇
S0146 〇 〇 〇 〇 X X 〇 〇 X 〇 カシ Πヒリ X X X 〇 X 〇 X 〇 ¾Μ 〇 X X 〇 ο 〇
光の月
ふさおとめ
S0135 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇 X 〇 ちあたま οき 〇 〇 〇 〇 X X X 議 X X 〇 〇 〇
S0208 〇 X X X X X X X X 〇 X 〇 X 光の 〇 X X X X X X 曜 X X X X 〇
のいちかあおリ
どんとこい
S0044 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 Ο 〇 X 〇 〇 〇 〇 〇 Ο X 〇 〇 〇 X X 〇 〇 〇
S0252 〇 X X X X 〇 〇 〇 X X 〇 〇 〇 〇 X 〇 カ 〇ヒノリ 〇 〇 X X翁 〇 〇 X 〇
つしく
れめひぼと
めむすまな
ふめおさと
んどと
キカヌヒリ
ササ
ボァケノ
ゴカピロリ
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む さ が の ゆ ナ サ ゴ
、 ち ヒ ひ ま ふ ど キ
ハ ゆ ら る 五 < め ェ ン た の ノ と な さ ん ヌ サ ァ □ 曰 ソ ほ き ら □ 百 ま あ チ ヒ 月 か 祭 ヒ め む お と ヒ ケ ピ 本 ン ま の 39 マ 万 さ か ゼ 力 の ま の お 力 ぐ ぼ す と 力 シ ボ 力 マーカー晴 モ れ 不 s 7 ン 石 ん り ン U 光 ち 光 晴 リ し れ め め い リ キ ノ U 夢つくし'キヌヒカリ
S0044 Ο ο 〇 〇 〇 〇 Ο 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇
S0015 ϋ 0 ϋ ϋ X X ϋ X X 0 X X X 0 ϋ X 0 X X X X 0 X ϋ X ササニシキ
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ァケボノ
S0161 0 X X 〇 〇 X 〇 〇 X 〇 〇 〇 X 〇 X 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
S0007 〇 〇 〇 X X o X 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 ゴロピカリ
S0177 〇 X X X X X X X X 〇 X 〇 X X X X X X X X X X X X X 纖
S0155 〇 〇 X 〇 X X X X X o 〇 X X 〇 〇 X X 〇 〇 〇 〇 X 〇 〇 〇導
S01 15 〇 X X X X 〇 〇 X 〇 X X o X o X 〇 X X X X X 〇 X 〇 〇濯
JP03/07332
- 2 7 - 例えば、 被検イネについて、 多型マーカ一 「S0135」 を利用し、 上記 （1 2 ) の配列番号： 1 2に記載の塩基配列の 7 6 5位の塩基種の判定を行い、 該部位の 塩基種が 「日本晴」 における該部位の塩基種と不一致であり、 かつ、 多型マーカ 一 「S0208」 を用いて塩基種の判定を行い、 上記 （1 9 ) の配列番号： 1 9に記 載の塩基配列の 1 Ί 8位の塩基種が 「日本晴」 と一致する場合には、 被検イネの 品種は、 「ふさおとめ」 であると判定される。 上記 （1 ' ) 〜 （2 8 ' ) に記載 の各多型マーカーを用いて、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) に記載の各塩基部位における 塩基種の判定を行い、 該部位における塩基種が、 「日本晴」 における該部位の塩 基種と一致するか否かが判明すれば、 表 2〜 7を参照して、 被検イネの品種を判 定することは容易に行い得ることである。
本発明の上記工程 （A) の塩基種の判定は、 当業者においては、 公知の塩基配 列決定法もしくは多型変異検出法等により、 実施することができる。 例えば、 本 発明の好ましい態様において、 下記のような方法により行うことができる。 まず、 被検イネから DNAを調製する。 本発明において、 被検イネとしては、 例えば、 上 記イネの葉、 根、 種子、 カルス、 葉鞘、 培養細胞等を挙げることができるが、 こ れらに限定されない。 また、 当業者であれば、 DNAを上記被検イネから抽出した 染色体 DNAを基に調製することができる。 例えば、 アル力リ性の水性溶媒中でィ ネの種子を粉碎し、 次いで、 粉碎した種子からイネゲノム D NAを抽出する方法 を好適に示すことができるが、 特にこの方法に制限されない。 また上記種子は、 精米されていることが好ましい。
本方法においては、 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを 増幅する。 本発明において、 DNAの増幅方法としては、 PCR法が挙げられるが、 DNAを増幅できる方法であれば特に制限されない。
本方法においては、 次いで、 増幅した DNAの塩基配列を決定する。 DNAの塩基 配列の決定は、 当業者に公知の方法で行うことができる。 本方法においては、 次いで、 決定した DNAの塩基配列を、 対照と比較する。 本 方法における対照とは、 通常、 「日本晴」 であり、 配列番号： 1〜2 8に記載さ れた配列である。 あるいは、 当業者においては、 各種遺伝子デ一夕ベースまたは 文献等から野生型日本晴ゲノムの塩基配列情報を取得することも可能である。 本 方法においては、 対照と比較することにより、 被検イネのゲノムに多型を有する か否かの判定を行う。
本発明のィネ品種鑑別方法は、 上記の如く直接被検ィネ由来の DNAの塩基配列 を決定する方法以外に、 多型の検出が可能な種々の方法に従って行うことができ る。 例えば、 本発明のイネ品種鑑別方法は、 以下のような方法によって行うこと も可能である。
まず、 被検イネから DNAを調製する。 次いで、 調製した DNAを制限酵素により 切断する。 次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分離する。 次いで、 検出され た DNA断片の大きさを対照と比較する。 また、 他の一つの態様においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する。 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載 の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含 む DNAを増幅する。 さらに、 増幅した DNAを制限酵素により切断する。 次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分離する。 次いで、 検出された DNA断片の大きさ を対照と比較する。
このような方法としては、 例えば、 制限酵素断片長多型 （Res t r i c t i on
Fragment Length Po lymorphi sm/RFLP) を利用した方法や PCR- RFLP法等が挙げ られる。 具体的には、 制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、 あるいは制限 酵素処理によって生じる DNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、 制限酵素 処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。 この変異を含む部分を PCR法によって増幅し、 それぞれの制限酵素で処理することによって、 これらの 変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。 あるいは、 染色体 DNAをこれらの制限酵素によって処理し、 電気泳動した後、 本発明のオリ ゴヌクレオチドを用いてサザンブロッティングを行うことにより、 変異の有無を 検出することができる。 用いられる制限酵素は、 それぞれの変異に応じて当業者 においては適宜選択することができる。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する。 次いで、 上 記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基 対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する。 さらに、 増幅した DNA を一本鎖に解離させる。 次いで、 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離す る。 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
上記方法としては、 例えば PCR-SSCP(single- strand conformation
polymorphism, 一本鎖高次構造多型)法（Cloning and polymerase chain reaction - single- strand conformation polymorp ism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146. , Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8)： 1313—1318.、 Multiple fluorescence-based PCR- SSCP analysis with post label ing. 、 PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5)： 275 - 282.)が挙げられる。 この方法は操作が比較的簡便であり、 また被検試料の 量も少なくて済む等の利点を有するため、 特に多数の DNA試料をスクリーニング するのに好適である。 その原理は次の通りである。 二本鎖 DNA断片を一本鎖に解 離すると、 各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。 この解離 した DNA鎖を、 変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、 それぞれの高次構造の差に応じて、 相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置 に移動する。 一塩基の置換によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、 ポリ アクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。 従って、 この移動度 の変化を検出することにより DNA断片に点突然変異や欠失、 あるいは揷入等によ る変異が存在することを検出することができる。 PC蘭細 32
- 3 0 - 具体的には、 まず、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該 部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを PCR法等 によって増幅する。 増幅される範囲としては、 通常 200〜400bp程度の長さが好 ましい。 PCRは、 当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。 PCRの際に、 32P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識 したプライマーを用いることにより、 増幅 DNA産物を標識することができる。 あ るいは PCR反応液に32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によつ て標識された基質塩基を加えて PCRを行うことにより、 増幅 DNA産物を標識する ことも可能である。 さらに、 PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、 32P等のァ イソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識された基質塩基を、 増幅 DNA断片に付加することによつても標識を行うことができる。 こうして得られた 標識 DNA断片を、 熱を加えること等により変性させ、 尿素などの変性剤を含まな いポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。 この際、 ポリアクリルアミ ドゲルに適量 （5から 10%程度） のグリセ口一ルを添加することにより、 DNA断 片の分離の条件を改善することができる。 また、 泳動条件は各 DNA断片の性質に より変動するが、 通常、 室温 （20から 25°C) で行い、 好ましい分離が得られな いときには 4から 3(TCまでの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。 電気泳動後、 DNA断片の移動度を、 X線フィルムを用いたオートラジオグラフィ 一や、 蛍光を検出するスキャナ一等で検出し、 解析を行う。 移動度に差があるバ ンドが検出された場合、 このバンドを直接ゲルから切り出し、 PCRによって再度 増幅し、 それを直接シークェンシングすることにより、 変異の存在を確認するこ とができる。 また、 標識した DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲル をェチジゥムブ口マイドゃ銀染色法などによって染色することによって、 バンド を検出することができる。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程
( a ) ) 。 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNA近傍の塩基配 列と相補的なオリゴヌクレオチドに、 レポーター蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2つ を標識したプローブを 2種類合成する （工程 （b) ) 。 次いで、 工程 （a) で調 製した DNAに、 工程 （b) で合成したプローブをハイブリダィズさせる （工程 (c) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する
(工程 （d) ) 。 次いで、 レポ一夕一蛍光の発光を検出する （工程 （e) ) 。 次 いで、 工程 （e) で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する （工程
(f) ) 。
上記方法としては、 TaqMan PCR法 （SNP遺伝子多型の戦略、 松原謙一 ·榊佳之、 中山書店、 94-105, Genet Anal. (1999)14:143-149) 等を挙げることができる。 具体的には、 まず、 プローブの 5'末端にレポーター蛍光を標識する。 本発明に おいて、 レポーター蛍光としては、 FAMや VICなどが例示できるが、 これらに限 定されない。 さらに、 上記プローブの 3'末端にクェンチヤ一蛍光を標識する。 本発明において、 クェンチヤ一蛍光としては、 レポーター蛍光を消光できる物質 であれば特に制限されない。 次いで、 レポ一夕一蛍光とクェンチヤ一蛍光を標識 したプローブを、 調製した DNAにハイブリダィズさせる。 通常、 ハイブリダィズ はストリンジェントな条件下で行う。 ストリンジェントな条件とは、 例えば、 通 常、 42°C、 2XSS 0.1%SDSの条件であり、 好ましくは 50 、 2XSSC、 0.1% SDSの条件であり、 さらに好ましくは、 65Τλ 0.1XSSCおよび 0.1%SDSの条件 であるが、 これらの条件に特に制限されない。 ハイブリダィゼ一シヨンのストリ ンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジエンシーを実 現することが可能である。
次いで、 上記 （1) ~ (28) のいずれかに記載の部位、 または該部位におけ る塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを、 5'ヌクレア一ゼ活 性を有する DNAポリメラ一ゼを用いて増幅する。 その結果、 レポーター蛍光とク ェンチヤ一蛍光を標識したプローブのレポ一夕一蛍光標識部分が切断され、 レポ —夕一蛍光が遊離する。 本発明において、 5'ヌクレアーゼ活性を有する DNAポリ メラーゼとしては、 好適には TaqDNAポリメラ一ゼが例示できるが、 これに限定 されるものではない。 本方法においては、 次いで、 遊離したレポ一夕一蛍光を検 出し、 さらに、 該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程
(a) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む 3'側塩基配列と 相補的な配列、 および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する （工程
(b) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から 5'末端側が相補的 なプローブを合成する （工程 （c) ) 。 次いで、 工程 （c) で合成したプローブ と工程 （a) で調製した DNAとハイブリダィズさせる （工程 （d) ) 。 次いで、 工程 （d) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程
(b) で合成したプローブの一部を遊離させる （工程 （e) ) 。 本発明において、 一本鎖 DNA切断酵素としては、 特に制限はなく、 例えば下記の c 1 eavaseが例示 できる。 本方法においては、 次いで、 工程 （e) で遊離したプローブと、 検出用 プローブとをハイブリダィズさせる （工程 （f) ) 。 次いで、 工程 （f) でハイ ブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生する蛍光の強度を測定する (工程 （g) ) 。 次いで、 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較する (工程 （h) ) 。
上記方法としては、 例えば、 Invader法 （SNP遺伝子多型の戦略、 松原謙一 · 榊佳之、 中山書店、 p94- 105、 Genome Research (2000) 10:330-343) 等が挙げら れる。 具体的には、 まず、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 また は該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から 3'側が铸型 と相補的な配列であり、 5'側が铸型配列と無関係な配列 （フラップ） を有するプ ローブ （プロ一ブ A) を合成する。 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに 記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位 から 5'側が铸型と相補的な配列を有するプローブ （プローブ B) を合成する。 プ 口一ブ Bにおいては、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該 部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応する塩基は任意 でよい。 次いで、 これらプローブを調製した铸型 DNAにハイブリダィズさせる。 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位における 塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応するプローブ Bの塩基が侵入 することで、 5'末端がフラップ状になっている部分を認識して、 該部位に対応す るプローブ Aの塩基の 3'側を切断するエンドヌクレア一ゼ （c l eavase) を用い てハイブリダィズした DNAを切断する。 これにより、 フラップ部分が遊離する。 次いで、 遊離したフラップ部分と検出用プロ一ブをハイブリダィズさせる。 該検 出用プロ一ブは、 一般的に f luorescence resonance energy t rans fer (FRET) プローブとよばれる。 該プローブにおいて、 5'側は自身で相補的に結合できる。 また、 3'側はフラップと相補的な配列を有している。 また、 自身で相補的に結合 できる 5'側において、 5'末端にはレポ一ター蛍光が標識され、 該 5'末端の 3'側 にはクェンチヤ一蛍光が標識されている。 遊離したフラップの 3'末端の塩基が、 FRETプローブにハイブリダィズする結果、 該プローブのレポ一夕一蛍光が標識 された相補結合部位に侵入することで、 c l eavase が認識する構造が生成される。 本方法においては、 c l eavaseによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊 離したレポ一夕一蛍光を検出し、 さらに、 測定した蛍光の強度を対照と比較する。 さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程
( a ) ) 。 次いで、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する (工程 （b ) ) 。 次いで、 増幅した DNAを一本鎖に解離させる （工程 （c ) ) 。 次いで、 解離させた一本鎖 DNAのうち、 片鎖のみを分離する （工程 （d) ) 。 次 いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩 基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より 1塩基ずつ伸長反応を行い、 その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度を測定する （ェ 程 （e) ) 。 次いで、 工程 （e) で測定した蛍光の強度を対照と比較する （工程 (f) ) 。 このような方法としては、 例えば、 Pyrosequencing法 （Anal.
Biochem. (2000) 10:103-110) 等が挙げられる。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程
(a) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する (工程 （b) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 また は該部位における塩基と塩基对をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの 配列に相補的なプライマ一を合成する （工程 （c) ) 。 次いで、 蛍光ラベルした ヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを鎵型とし、 工程 （c) で合 成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う （工程 （d) ) 。 次いで、 蛍光 の偏光度を測定する （工程 （e) ) 。 次いで、 工程 （e) で測定した蛍光の偏光 度を対照と比較する （工程 （f) ) 。 このような方法としては、 例えば、 Acyclo Prime法 (Genome Research (1999)9:492-498) 等が挙げられる。
Acyclo Prime法では、 ゲノム増幅用のプライマー 1組と、 SNPs検出用の 1つ のプライマーを用いる。 まず、 ゲノムの SNPsを含む領域を PCRで増幅する。 こ の工程は、 通常のゲノム PCRと同じである。 次に、 得られた PCR産物に対して、 多型検出用のプライマーをァニールさせ、 伸長反応を行う。 多型検出用のプライ マーは、 検出対象となっている多型部位に隣接する領域にァニールするようにデ ザインされている。 このとき、 通常、 伸長反応のためのヌクレオチド基質として、 蛍光偏光色素でラベルし、 かつ 3'- 0Hをブロックしたヌクレオチド誘導体 （ター ミネ一夕） を用いる。 その結果、 多型部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基 が 1塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。 ヌクレオチド誘導体のプライマ 一への取りこみは、 分子量の増大による蛍光偏光（Fluorescence
polarizat ion ;FP)の増加によって検出することができる。 蛍光偏光色素に波長の 異なる 2種類のラベルを用いれば、 特定の多型が 2種類の塩基のうちのいずれで あるのかを特定することができる。 蛍光偏光のレベルは定量することができるの で、 1度の解析でアレルがホモかへテロかを判定することもできる。 本発明の方 法における上記工程 （A) は、 Acyc lo Prime法を利用して好適に実施すること ができる。
Acyc lo Prime法に使用されるゲノム増幅用プライマ一、 および多型検出用プ ライマ一は、 当業者においては、 ゲノム配列および多型部位に関する情報を基に、 適宜作製することが可能である。 Acyc lo Prime法を利用した本発明のイネ品種 鑑別方法に使用されるゲノム増幅用プライマ一、 および多型検出用プライマ一と して、 例えば、 表 8および 9に記載されたプライマ一を挙げることができるが、 これらのプライマ一に限定されるものではない。
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さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程 (a) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する (工程 （b) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 また は該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの 配列に相補的なプライマ一を合成する （工程 （c) ) 。 次いで、 蛍光ラベルした ヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸型とし、 工程 （c) で合 成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う （工程 （d) ) 。 次いで、 シ一 ケンサ一を利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基種を判定する （工程 (e) ) 。 次いで、 工程 （e) で判定された塩基種を対照と比較する （工程 (f) ) 。 このような方法として、 例えば、 SNuPe法（Rapid Commun Mass Spectrom. (2000) 14:950- 959)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程 (a) ) 。 次いで、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する (工程 （b) ) 。 次いで、 工程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子 量を測定する （工程 （c) ) 。 次いで、 工程 （c) で測定した分子量を対照と比 較する （工程 （d) ) 。 このような方法としては、 例えば、 MALDI- T0F MS法 (Trends Biotechnol (2000)： 18:77 - 84)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、 まず、 被検イネから DNAを調製する （工程
(a) ) 。 次いで、 上記 (1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する (工程 （b) ) 。 次いで、 ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する (工程 （c) ) 。
本発明において 「基板」 とは、 ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材 料を意味する。 本発明においてヌクレオチドには、 オリゴヌクレオチドおよびポ リヌクレオチドが含まれる。 本発明の基板は、 ヌクレオチドを固定することが可 能であれば特に制限はないが、 一般に DNAアレイ技術で使用される基板を好適に 用いることができる。 一般に DNAアレイは、 高密度に基板にプリントされた何千 ものヌクレオチドで構成されている。 通常これらの DNAは非透過性 (non - porous)の基板の表層にプリントされる。 基板の表層は、 一般的にはガラスであ るが、 透過性 (porous)の膜、 例えばニトロセル口一スメンプレンを使用すること ができる。
本発明において、 ヌクレオチドの固定 （アレイ） 方法として、 Af fymet r ix社 開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。 オリゴヌクレ ォチドのアレイにおいて、 オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（in s i tu)で 合成される。 例えば、 pho to l i thographi cの技術 （Af fymet r ix社） 、 および化学 物質を固定させるためのインクジエツト（Roset ta Inpharmat i cs社)技術等によ るオリゴヌクレオチドのィンサイチュ合成法が既に知られており、 いずれの技術 も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに 記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位 の多型を検出することができるものであれば、 特に制限されない。 即ち該プロ一 ブは、 例えば、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位に おける塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAと特異的にハイブ リダィズするようなプローブである。 特異的なハイブリダィズが可能であれば、 ヌクレオチドプローブは、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 また は該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAに対し、 完全に相補的である必要はない。 本発明において基板に結合させるヌクレオチド プローブの長さは、 オリゴヌクレオチドを固定する場合は、 通常 10〜100ベース であり、 好ましくは 10〜50ベースであり、 さらに好ましくは 15〜25ベ一スであ る。 本方法においては、 次いで、 工程 （b) の DNAと工程 （c) の基板を接触させ る （工程 （d) ) 。 本工程により、 上記ヌクレオチドプローブに対し、 DNAをハ イブリダィズさせる。 ハイブリダィゼーシヨンの反応液および反応条件は、 基板 に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、 一般的 に当業者に周知の方法により行うことができる。
本方法においては、 次いで、 該 DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプロ一 ブとのハイブリダィズの強度を検出する （工程 （e) ) 。 この検出は、 例えば、 蛍光シグナルをスキャナ一等によつて読み取ることによって行うことができる。 尚、 DNAアレイにおいては、 一般的にスライドガラスに固定した DNAをプロ一ブ といい、 一方溶液中のラベルした DNAをターゲットという。 従って、 基板に固定 された上記ヌクレオチドを、 本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。 本方法においては、 次いで、 工程 （e) で検出された強度を対照と比較する （ェ 程 ） ） 。
このような方法としては、 例えば、 DNAアレイ法 (SNP遺伝子多型の戦略、 松 原謙一 ·榊佳之、 中山書店、 pl28- 135、 Nature Genetics(1999) 22:164-167) 等 が挙げられる。
上記の方法以外にも、 特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的ォ リゴヌクレオチド （Allele Specific 01 igonucleotide/ASO) ハイブリダィゼー ション法が利用できる。 変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌク レオチドを作製し、 これと DNAでハイブリダィゼ一シヨンを行わせると、 変異が 存在する場合、 ハイプリッド形成の効率が低下する。 それをサザンブロット法や、 特殊な蛍光試薬がハイプリッドのギャップにインターカレ一シヨンすることによ り消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
また本発明は、 イネの品種を鑑別するためのプライマーであって、 上記 （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす 相補鎖における塩基部位を含む DN A領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド を提供する。 このようなオリゴヌクレオチドとしては、 上記の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖にお ける塩基部位を挟むように設計されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。 PCRプ ライマ一の設計および合成については、 一般的に当業者に周知の方法により行う ことができる。 また、 PCRプライマーの長さは、 特に制限はないが、 通常 15bp〜 lOObpであり、 好ましくは 17bp〜30bpである。 また本発明は、 上記 （1 ) 〜
( 2 8 ) のいずれかに記載の部位もしくは該部位における塩基と塩基対をなす相 補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的な塩基配列を有するオリゴ ヌクレオチドを提供する。 該オリゴヌクレオチドは、 例えば、 Acyc lo Pr ime法 を用いる本発明のイネ品種鑑別方法のためのプライマ一として有用である。 この ようなオリゴヌクレオチドとして、 例えば、 表 8または 9に示されるオリゴヌク レオチドを挙げることができる。
さらに本発明は、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位もしくは該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DM領域とハイブ リダィズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する、 イネ品種鑑別方法の ためのオリゴヌクレオチドを提供する。 該オリゴヌクレオチドは、 例えばプロ一 ブとして使用される。
該オリゴヌクレオチドは、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 ま たは該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNA領域 に特異的にハイブリダィズするものである。 ここで 「特異的に八イブリダィズす る」 とは、 通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、 好ましくはストリンジェント なハイブリダィゼ一シヨン条件下 （例えば、 サムブルックら， Mol ecular
Cl oning, Co l d Spr ing Harbor Laboratory Press, New York, USA，第 2版 1989に記 載の条件） において、 他の DNAとクロスハイブリダィゼーシヨンを有意に生じな いことを意味する。 特異的なハイブリダィズが可能であれば、 該オリゴヌクレオ チドは、 上記 （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位における 塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNA領域に対し、 完全に相補 的である必要はない。 該オリゴヌクレオチドの長さは、 15ヌクレオチド以上で あれば、 特に制限はない。 該オリゴヌクレオチドは、 例えば市販のオリゴヌクレ ォチド合成機により作製することができる。 また、 制限酵素処理等によって取得 される二本鎖 DNA断片として作製することもできる。
また、 該オリゴヌクレオチドは、 適宜標識して用いることが好ましい。 標識す る方法としては、 例えば、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレ ォチドの 5'端を 32Pでリン酸化することにより標識する方法、 クレノゥ酵素等の DNAポリメラ一ゼを用いてランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマ —として32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識され た基質塩基を取り込ませる方法 （ランダムプライム法） 等を挙げることができる。 さらに、 上記の （1 ) 〜 （2 8 ) のいずれかに記載の部位、 または該部位におけ る塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位において、 上記 （ ) 〜 （2 8 ' ) に記載の多型変異を伴う少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリ ゴヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
さらに本発明は、 本発明の上記オリゴヌクレオチドを含む、 イネ品種鑑別用キ ットを提供する。 本発明のキットには、 さらに、 アルカリ性の水性溶媒を含める ことができる。 また、 対照となる標準イネ試料、 キットの使用方法を記載した指 示書等をパッケージしておくこともできる。 図面の簡単な説明
図 1は、 配列番号： 1で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 2は、 配列番号： 2で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 3は、 配列番号： 3で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を示す 図である。
図 4は、 配列番号： 4で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 5は、 配列番号： 5で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を示す 図である。
図 6は、 配列番号： 6で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 Ίは、 配列番号： Ίで示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 8は、 配列番号： 8で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 9は、 配列番号： 9で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出された 多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を示す 図である。
図 1 0は、 配列番号： 1 0で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を 示す図である。
図 1 1は、 配列番号： 1 1で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 1 2は、 配列番号： 1 2で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 1 3は、 配列番号： 1 3で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位を示す図である。
図 1 4は、 配列番号： 1 4で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 1 5は、 配列番号： 1 5で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 1 6は、 配列番号： 1 6で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を 示す図である。
図 1 7は、 配列番号： 1 7で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 1 8は、 配列番号： 1 8で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を 示す図である。
図 1 9は、 配列番号： 1 9で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位を示す図である。
図 2 0は、 配列番号： 2 0で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 1は、 配列番号： 2 1で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 2は、 配列番号： 2 2で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 3は、 図 2 2の続きの図である。
図 2 4は、 配列番号： 2 3で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 5は、 配列番号： 2 4で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 6は、 配列番号： 2 5で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマ一配列を 示す図である。
図 2 7は、 配列番号： 2 6で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位を示す図である。
図 2 8は、 配列番号： 2 7で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 2 9は、 配列番号： 2 8で示す塩基配列における、 イネ 2 4品種間に見出さ れた多型部位、 および該部位を含む DNA領域を増幅するためのプライマー配列を 示す図である。
図 3 0は、 精米から抽出した DNAを铸型とした PCRの結果を示す写真である。 精米サンプルは、 平成 12年産の茨城県産あきたこまちと表示のある市販の米で ある。 使用した PCRプライマーは、 PGC1001 (U:5'_ accgggtagggaaacaaaac -3' Z配列番号： 1 13、 L:5'- aataatacttcggcgcatcg - 3' /配列番号： 1 14) で ある。 以下の方法で抽出した DNAを铸型として PCR反応を行い、 反応液を 1.5% ァガロースゲル電気泳動により分離した。
M:分子量マ一力一 （φΧ/HaeIII)
1 ：方法 1 (CTAB法）
2 ：方法 2 (アルカリ +CTAB法）
3 ：方法 3 (簡易抽出法）
4 :方法 4 (簡易抽出法 +フエノール ·クロ口ホルム処理）
5 :方法 5 (アルカリ +簡易抽出法）
6 ：方法 6 (アルカリ +簡易抽出法 +フエノール'クロ口ホルム処理）
7 ：対照 （ハバタキ緑葉より CTAB法で抽出した DNA、 40ng)
8 ：対照 （ササ二シキ緑葉より CTAB法で抽出した DNA、 40ng) 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。 [実施例 1] 多型（SNPs)の検出
Rice Genome Research Programのホームヘーン
(http://rgp.dna.affrc.go.jp/) 上で公開されているイネゲノム解析情報、 お よび DDBJ (http://ww.ddbj.nig. ac.jp/) に登録されているイネゲノムシ一ケ ンスを利用し、 イネゲノム塩基配列情報が公開されている染色体領域については、 遺伝子が予測されていない領域を中心に、 それ以外の領域については RFLPマ一 カープローブのシーケンス等を利用して、 ゲノム DNAから 800bp〜lkbpを増幅す るプライマーを設計した。 プライマ一設計には、 プライマー設計支援サイト Primer3 (http://www-genome.wi.mit. edu/cgi-bin/primer/primer3_w w. cgi) を 利用した。
設計したプライマ一をもちいてまず日本晴 ·コシヒカリ ·カサラス ·廣陸矮 4 号 （以下 G4) 、 キタァケ、 および野生イネ （Oryza rufipogon, W1943) の簡易 抽出 DNAを铸型として A即 li Taq Gold (Applied Biosystems)で PCR増幅を行つ た。 反応液の一部を用いてァガロースゲル電気泳動を行レゝ増幅断片を確認した後、 残りの反応液を ExoSAP_IT (Amersham Biosciences)処理して未反応のプライマ —と dNTPを取り除き、 シークェンス反応の铸型とした。 この铸型に対して、 最 初の増幅に用いたプライマ一の片方を再度添加し、 DYEnamic ET Dye
TerminatorCycle Sequencing kit for MegaBACE (Amersham Biosciences) ¾:用い てサイクルシークェンスを行い、 シーケンス用サンプルを作成した。 シークェン スは MegaBACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dymnamics)を用いて行 つた。 得られたシークェンスデ一夕を品種ごとに比較し、 一塩基置換多型を検索 した。 同一品種、 同一プライマーに対し少なくとも 2回のシークェンスを行い、 確実であるもののみを多型と判定した。
日本晴 ·コシヒカリ間および日本晴 ·キタァケ間で多型の見られた部位につい て、 日本晴 ·ハツシモ .むつほまれ .ゆきの精 ·きらら 397 ·つがるロマン ·五 百万石 ·森のくまさん ·ゆめあかり ·ハナエチゼン ·コシヒカリ '月の光'あき たこまち ·朝の光 ·あいちのかおり ·祭り晴 ·ヒノヒカリ ·夢つくし ·ひとめぼ れ ·まなむすめ ·ふさおとめ ·どんとこい ·キヌヒカリ ·ササニシキの簡易抽出 ゲノム DNAを铸型とし、 同様に PCR反応とシーケンシングを行い、 多型部位の塩 基を品種毎に比較した。 上記イネ 24品種間に見出された多型を図 1〜 28に示 す。 多型デ一タは以下のような規則に従って記載した。
《データ記載様式》 1. プライマ一部位にカツコで印をつけ、 Upper primer siteには" :" 、 Lower primer siteには" q:" を付け加えた。
例： ctctactta a[p:gcagagcga tgaacctgca] atattgagaa
aactc LQ:aatcacgccc atccttgcct」
2. SNPs部位には力ッコと識別番号をつけた。
例： cg[la]agag[2aa」cttc[3a[4c4]cattt gggg[5c5] acac3] c
※基本的に、 識別番号は始めの力ッコと終わりのカツコの両方につけた。
ただし、 明らかにカツコの対応がわかる場合は、 終わりカツコの識別番号は省略 する場合あり。
3. 貼り付けた配列の下に、 解析した品種コードを書き込んだ。
品種コードの区切りには、 " /" を使った。
例： nhb/ks h /ka 1 /g 1 a/pw 1 A t a
《品種コード》 上述の各イネ品種のアルファベット 3文字からなる略称にて記 載した。 例えば、 日本晴は 「nhb」 、 コシヒカリは 「ksh」 等。
4. 品種情報の下に、 SNPs情報を書き込んだ。
書き方は、 「識別番号 品種コード： SNPs」
例： 1 ksh:g
《その他の例》
5. 欠失は" - "で表した。 欠失している塩基の長さに関わらず、 " - "は 1つ とした。
例： gL5aggjggtcat ctgttacatt atag
5kal: - 6. 欠失が同じ場所にあるが、 品種によってその長さが違う場合。
： gtttg[20a:gtat[20b:t ccattatgta ttatttcatt tgct20b] t20a] ttatg 20akal:-、 20bgla:- 欠失の場所が同じなので、 同じ識別番号を使った。 ただし、 品種による欠失の長 さの違いを明確にするため、 " 20a:" ," 20b:" のようにアルファべットで区別 した。
7. 揷入の場合は、 公開シーケンスに" -" を挿入する。 " -" は 1つとした。 例： tacaca[7-]gtca attttattca
7kal： aa 次いで、 品種鑑別に有用な SNPsについて、 SNPs検出用プライマ一を設計し、 AcycloPrime-FP キット（Perkin Elmer)を用いて一塩基ターミネータ反応を行い、 ジエノタイピング用サンプルを作成した。 ジエノタイピングは ARVO (Perkin Elmer)で蛍光偏光度を測定して行つた。
その結果、 シークェンスで SNPs と判定した箇所について作成したマ一力一は、 それぞれ異なつたパターンを示し、 組み合わせによってさまざまに分類できるこ とが示された （表 2〜7) 。 作成した SNPマ一カーについて、 プライマー配列、 利用した SNP部位等の情報を表 8および 9に示す。
[実施例 2] 精米、 玄米および米飯からの DNA抽出法の検討
精米、 玄米および米飯からの DNA抽出法を検討した。 まず、 2mlチューブ （ェ ッペンドルフ） に精米、 玄米および米飯を 1粒、 抽出バッファ一 （1M KC1、 lOmM Tris-HCK ImM EDTA, 0. IN NaOH) 0.4ml、 3腿径のジルコニァ製ポ一ルを入れて ふたをし、 4 で 30分静置後、 Retch社製粉砕装置ミキサーミル MM300を用いて、 300Hz X 2分 X 2回粉砕し、 ミルク状の液体を得た。 これを lOOOOrpmXlO分遠心 分離し、 上澄み 0.3mlを別のチューブに移した。 これにイソプロパノ -ル 0.3ml を加えてよく混合し、 再度 lOOOOrpmXlO分遠心分離した。 上清を捨て、 沈殿に 70%エタノール lmlを加え、 10000ι·ριηΧ3分遠心分離した。 上清を捨て、 沈殿を 乾燥して 30 1の滅菌水に溶解した （方法 5) 。
また別法として、 方法 5で別のチューブに 0.3mlの上澄みを移した後にフエノ ール.クロ口ホルム （1:1) 0.3mlを加えてよく混合後、 ΙΟΟΟΟΙ ΠΙΧΙΟ分遠心分 離し、 上清を別のチューブに移してからイソプロパノ-ル沈殿に進む方法も行つ た （方法 6) 。
また別法として、 方法 5、 6で最初に用いるバッファーの組成を 1M KC1、 10mM Tris-HCK ImM EDTAとする方法も行った （それぞれ方法 3、 方法 4) 。 また別法として、 CTAB法による抽出も行った。 具体的には、 2mlチューブに精 米一粒と 0.2mlCTABバッファー （方法 1 ) または 0.2 ml 0. IN NaOH (方法 2) 、 3腿径ジルコニァ製ポールを入れてふたをし、 方法 5と同じ条件で粉砕する。 こ れに 0.7mlCTABバッファーを加え 56でで 20分熱処理する。 640/21のフエノー ル ·クロ口ホルム （1:1) を加えて混合し、 lOOOOrpmXlO分遠心分離し、 上清 0.7mlを別のチューブに移した。 1.3mlCTAB沈殿バッファーを加え、
10000ι·ριηΧ10分遠心分離し、 沈殿に RNaseを含む 0.5ml IN NaClを加えて溶解 後、 1mlエタノールを加えて混合し、 10000ΠΜΧ10分遠心分離した。 沈殿を lml の 70%エタノールで洗浄し、 沈殿を乾燥して 30 lの滅菌水に溶解した。
以上の方法により得られた DNAを铸型として、 プライマー PGC1001 (配列 U:¾ - accgggtagggaaacaaaac - 3'/配歹 (1番号： 1 13、 L:5 - aataatacttcggcgcatcg - 3' /配列番号： 1 14) を用いて PCR反応を行った。 ' その結果を図 30に示す。 方法 1、 2で抽出した精米の DNAでは PCR増幅が見 られなかったが、 方法 3〜 6においては良好に増幅していることが確認できた。 これにより、 精米からの DNA抽出においてはフエノール ·クロ口ホルム処理が必 7332
- 5 1 - 要ないことがわかり、 方法 3または方法 5が最も簡便な方法であることが示され た。 方法 3と方法 5の違いは、 方法 5では粉枠時に加えるバッファーがアルカリ 性である。 バッファーをアルカリ性にすることにより、 精米の組織が急速にもろ くなり、 十分な粉碎が行いやすくなる利点がある。 以上の結果から、 方法 5が最 も簡便で効率がよいと判断した。
玄米および米飯においては、 方法 1、 2で抽出した DNAでは PCR増幅が見られ ず、 方法 3〜 6において増幅が認められたが、 方法 6により抽出した DNAが最も 良好に増幅するのが確認された。 これにより、 玄米および米飯からの DNA抽出に おいては、 アルカリ性のバッファ一を用い、 フエノール 'クロ口ホルム処理を行 なう方法が最も有効であることが示された。
[実施例 3 ] 精米の品種鑑別
「平成 12年産'茨城県産 「あきたこまち」 100 %」 と表示されて市販されてい る精米を購入し、 32粒をランダムに選び、 方法 5を用いて 1粒ずつ別々に DNA を抽出した。 あきたこまちを他の 25品種と識別するのに必要十分な 3マーカ一
(S01 15, S0146、 S0178) のプライマ一を使用し、 抽出した DNAを鍀型として PCR反応を行った。 また、 PCR産物を铸型としてァシクロプライム反応を行い、 多型（SNP)を判定した。
その結果、 27粒はあきたこまちと判定されたが、 3粒はあきたこまち以外の品 種であることがわかった。 2粒については 3つのマ一カーのうち 1つでデータが 取れなかったため、 判定できなかった。 あきたこまち以外と判定された 3粒につ いては、 そのパターンから 「きらら 397」 「こしひかり」 「夢つくし」 「キヌヒ カリ」 のいずれかであると推定された。
以上の結果より、 本発明が精米の品種鑑別に利用可能であることが実証された。
[実施例 4] 精米の品種特定 [実施例 3 ]において、 あきたこまち以外と判定された 3粒について、 「きらら 397」 「こしひかり」 「夢つくし」 「キヌヒカリ」 のいずれであるかを判定する ため、 これら 3品種を判別するのに必要十分な 2マーカ一 （S001 5、 S0045) のプ ライマ一を使用し、 抽出した DNAを铸型として PCR反応を行なった。 また PCR産 物を鐯型としてァシクロプライム反応を行い、 多型 （SNP) を判定した。
その結果、 あきたこまち以外と判定された 3粒は全て 「こしひかり」 と同じパ 夕一ンを示した。 このことから、 [実施例 3 ]で使用した精米には、 あきたこまち 以外に 「こしひかり」 が含まれている可能性が高いと推定された。
[実施例 5 ] 精米のブレンド率調査
「きらら 397 3 0 % ·つがるロマン 4 0 % ·ひとめぼれ 3 0 %」 と表示 された精米について、 3品種が表示通りにブレンドされているかを調査した。 精 米から 32粒をランダムに選び、 方法 5を用いて 1粒ずつ別々に DNAを抽出した。 鑑別可能な 26品種のうち、 「きらら 397」 「つがるロマン」 「ひとめぼれ」 を それぞれ識別するのに必要十分な 7マーカ一 （S01 15， S0135, S0161 , S0252, S0310, S0336, S0375) のプライマ一を使用し、 抽出した DNAを铸型として PCR 反応を行なった。 また、 PCR産物を銬型としてァシクロプライム反応を行い、 多 型 （SNP) を判定した。
その結果、 7粒はきらら 397、 1 1粒はつがるロマン、 5粒はひとめぼれと判定 されたが、 2粒は 3品種のいずれでもないことがわかった。 7粒については 7つ のマ一力一のうちデータがとれなかったものが存在したため、 判定できなかった。 デ一夕が取れた 25 粒における 3品種の配分から、 調査した精米のブレンド率は、 きらら 397が 28 %、 つがるロマンが 44 %、 ひとめぼれが 20 %、 それ以外の品種 が 4 %であると推定された。 産業上の利用の可能性 本発明により、 イネの品種鑑別方法が提供された。 従来の栽培特性による鑑別 では、 熟練した育種家の目が必要なため、 容易に鑑別することが困難であり、 さ らに、 一粒一粒の米を鑑別することは不可能であつたのに対し、 本発明の方法は、 イネのゲノム上の多型を調べるため、 微量のイネ検体で正確な品種鑑別を行うこ とが可能である。 また、 本発明の方法は、 近縁品種間における品種鑑別も正確に 行うことができる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の工程 （a) および （b) を含む、 イネ品種を鑑別する方法。
(a) イネゲノムにおける以下の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の塩基部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の塩基種を判定す る工程、
1) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 593位
2) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 304位
3) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 450位
:4) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 377位
5) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 163位
6) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 624位
7 ) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 534位
8) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 358位
9) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 475位
10 ) 配列番号 10に記載の塩基配列の 323位
11 ) 配列番号 11に記載の塩基配列の 612位
12 ) 配列番号 12に記載の塩基配列の 765位
13 ) 配列番号 13に記載の塩基配列の 571位
14) 配列番号 14に記載の塩基配列の 660位
15) 配列番号 15に記載の塩基配列の 223位
16) 配列番号 16に記載の塩基配列の 247位
17) 配列番号 17に記載の塩基配列の 163位
18 ) 配列番号 18に記載の塩基配列の 421位
19) 配列番号 19に記載の塩基配列の 178位
20 ) 配列番号 20に記載の塩基配列の 141位 (21) 配列番号 21に記載の塩基配列の 480位
(22) 配列番号 22に記載の塩基配列の 481位
(23) 配列番号 23に記載の塩基配列の 131位
(24) 配列番号 24に記載の塩基配列の 510位
(25) 配列番号 25に記載の塩基配列の 248位
(26) 配列番号 26に記載の塩基配列の 92位
(27) 配列番号 27に記載の塩基配列の 743位
(28) 配列番号 28に記載の塩基配列の 552位
(b) 上記工程 （a) により判定された塩基種と品種を関連付ける工程
2. イネゲノムにおける以下の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の塩基変異 を特徴とする多型マ一カーを用いて塩基種の判定を行う、 請求項 1に記載の方法。
( 1 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 593位の塩基が T
(2) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 304位の塩基が T
(3) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 450位の塩基が A
(4) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 377位の塩基が C
(5) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 163位の塩基が C
(6) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 624位の塩基が C
( 7 ) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 534位の塩基が C
(8) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 358位の塩基が G
(9) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 475位の塩基が G
(10) 配列番号： 10に記載の塩基配列の 323位の塩基が A
(1 1) 配列番号： 1 1に記載の塩基配列の 612位の塩基が A
(12) 配列番号： 12に記載の塩基配列の 765位の塩基が T
(13) 配列番号： 13に記載の塩基配列の 571位の塩基が T
(14) 配列番号： 14に記載の塩基配列の 660位の塩基が G
(1 5) 配列番号： 15に記載の塩基配列の 223位の塩基が A
(16) 配列番号： 16に記載の塩基配列の 247位の塩基が A
(17) 配列番号： 17に記載の塩基配列の 163位の塩基が A
(18) 配列番号： 18に記載の塩基配列の 421位の塩基が C
(19) 配列番号： 19に記載の塩基配列の 178位の塩基が G
(20) 配列番号： 20に記載の塩基配列の 141位の塩基が G
(21) 配列番号： 21に記載の塩基配列の 480位の塩基が C
(22) 配列番号： 22に記載の塩基配列の 481位の塩基が C
(23) 配列番号： 23に記載の塩基配列の 131位の塩基が C
(24) 配列番号： 24に記載の塩基配列の 510位の塩基が A
(25) 配列番号： 25に記載の塩基配列の 248位の塩基が T
(26) 配列番号： 26に記載の塩基配列の 92位の塩基が C
(27) 配列番号： 27に記載の塩基配列の 743位の塩基が G
(28) 配列番号： 28に記載の塩基配列の 552位の塩基が T
3. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の方法。 (a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する 工程
(c) 増幅した DN Aの塩基配列を決定する工程
4. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の方法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 調製した DNAを制限酵素により切断する工程
(c) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(d) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程
5. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方法。 (a) 被検イネから： DNAを調製する工程 (b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する 工程
(c) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程
6. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する 工程
(c) 増幅した DN Aを一本鎖に解離させる工程
(d) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程
( e ) 分離した一本鎖 D N Aのゲル上での移動度を対照と比較する工程
7. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と 相補的なオリゴヌクレオチドに、 レポーター蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2っを標 識したプローブを 2種類合成する工程
(c) 工程 （a) で調製した DNAに、 工程 （b) で合成したプロ一ブをハイブ リダィズさせる工程
(d) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する 工程
(e) レポーター蛍光の発光を検出する工程 (f ) 工程 （e) で検出したレポ一夕一蛍光の発光を対照と比較する工程
8. 以下の （a) 〜 （h) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む 3 '側塩基配列と 相補的な配列、 および全く無関係な配列を合わせたプロ一ブを合成する工程
(c) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から 5 '末端側が相補的 なプロ一ブを合成する工程
(d) 工程 （c) で合成したプローブと工程 （a) で調製した DNAとハイプリ ダイズさせる工程
(e) 工程 （d) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程 （b) で合成したプローブの一部を遊離させる工程
(f ) 工程 （e) で遊離したプローブと、 検出用プローブとをハイブリダィズさ せる工程
(g) 工程 （f) でハイブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生 する蛍光の強度を測定する工程
(h) 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
9. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方法。 (a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する 工程
(c) 増幅した DNAを一本鎖に解離させる工程
(d) 解離させた一本鎖 DNAのうち、 片鎖のみを分離する工程
(e) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より 1塩基ずつ伸 長反応を行い、 その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度 を測定する工程
(f ) 工程 （e) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
10. 以下の （a) 〜 （ί) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方 法。
(a) 被検イネから DN Aを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する 工程
(c) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に 相補的なプライマーを合成する工程
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを錶 型とし、 工程 （c) で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(e) 蛍光の偏光度を測定する工程
(f) 工程 （e) で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
11. 以下の （a) 〜 （ί) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方 法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する 工程
(c) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に 相補的なプライマーを合成する工程 (d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(e) シーケンサ一を利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基種を判定する 工程
(f) 工程 （e) で判定された塩基種を対照と比較する工程
12. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方 法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する 工程
(c) 工程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子量を測定する工程
(d) 工程 （c) で測定した分子量を対照と比較する工程
13. 以下の （a) 〜 （ί) の工程を含む、 請求項 1または 2に記載の判定方 法。
(a) 被検イネから DNAを調製する工程
(b) 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該部 位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する 工程
(c) ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
(d) 工程 （b) の DNAと工程 （c) の基板を接触させる工程
( e ) 該 D N Aと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイプリダイズ の強度を検出する工程
(f ) 工程 （e) で検出された強度を対照と比較する工程
14. 以下の工程 （a) および （b) をさらに含む、 請求項 1〜13のいずれ かに記載の方法。 (a) アルカリ性の水性溶媒中でイネの種子を粉碎する工程、 および
(b) 上記工程 （a) で粉碎した種子からイネゲノム DNAを抽出する工程 15. 種子が精米されている請求項 14に記載の方法。
16. イネの品種を鑑別するためのプライマ一であって、
(a) イネゲノムにおける請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載 の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含 む DN A領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、 または
(b) イネゲノムにおける請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載 の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の 1 塩基隣までの配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
17. 請求項 1に記載の （1) 〜 （28) のいずれかに記載の部位、 または該 部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN A領域とハ イブリダィズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する、 イネの品種を鑑 別するためのオリゴヌクレオチド。
18. 請求項 16または 17に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 イネ品種鑑 別用キッ卜。
19. さらに、 アル力リ性の水性溶媒を含む、 請求項 18に記載のィネ品種鑑 別用キッ卜。
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