CN103924003B - 一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法。该方法包括：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；根据MS序列设计相应的分子标记PCR引物；提取不同品种的水稻的总DNA；以总DNA作为模板，以分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；对扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。本发明提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，操作简便，所需设备也简单，结果可靠稳定。
Description
技术领域
本发明涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法。
背景技术
由于线粒体基因组的重组，导致植物线粒体基因组的序列具有很大的差异，比较分析任何两个植物物种(甚至是同源物种)的线粒体基因组的基因间区发现，大部分基因间区都不是保守的。因此，植物线粒体基因组存在各自特异的序列(Mitochondrial-specificsequences，简称MS)。
例如，将小麦Ks3和Km3的线粒体基因组进行比较，只有85.2％的序列为保守序列，Ks3包含11.38％的Km3所没有的特异序列，与NCBI数据库比较，7.3％Ks3序列为新序列，其中大部分特异序列位于进化速率快的基因间区。再如，比较Sugar beet TK81-MS和TK81-O线粒体基因组，发现，TK81-MS存在68kb TK81-O没有的MS，类核、类叶绿体、类线粒体-episome的MSS分别占7.6％、17.9％、0.1％和4.6％，其余为未知来源。
目前，水稻已测序完成了4个线粒体基因组，分别是水稻品种Nipponbare、9311、CW和LD。其中，Nipponbare是一个典型的粳稻品种，9311为典型的籼稻品种；CW细胞质来源于中国普通野生稻W1(Oryza rufipogon)；LD细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻。水稻线粒体基因组最大的为CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，同线性分析表明，Nipponbare和9311较为保守，而CW和LD与其他两个已测序的水稻线粒体基因组在序列组成及排列上差异都很大，即水稻线粒体基因组也存在大量的特异序列(MS)。
由于不同的水稻种的线粒体基因组存在较大的差异，因此，对于其亲缘关系以及进化分析可采用相应的细胞质分子鉴定的方法。
在相关技术中，对水稻而言，一般采用RFLP分子标记研究其进化分析、亲缘关系；然而RFLP分子标记需要进行酶切、凝胶电泳、转膜以及放射性标记的探针杂交等一系列的操作，整个操作繁琐复杂、费时耗力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：
分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；
根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；
提取不同品种的水稻的总DNA；
以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；
对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。
本发明的实施例中提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其通过分析比对4个已知水稻的线粒体基因组序列，筛选出了不保守的MS序列(多个)，然后再根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物，每个MS序列对应设置一对分子标记PCR引物。然后再以不同品种的水稻的总DNA为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；将扩增产物进行电泳检测，并筛选出能够导致扩增差异的多态性引物(对于每一种引物，如果一部分水稻种类能扩增出带，而另外一部分水稻种类不能扩增出带，则该引物为多态性引物)以及该多态性引物扩增得到的目的条带；再对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析，进而获得不同种类水稻的进化关系。
与现有技术中常见的RFLP分子标记相比，本发明提供的这种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其操作简便，所需设备也简单，只需要PCR仪、台式离心机以及凝胶电泳设备以及相应的分析软件即可完成整个鉴定操作，常规的分子实验室可完成整个实验操作，因此，克服了现有技术中RFLP分子标记操作繁琐复杂、费时耗力的缺陷。
另外，由于在水稻线粒体的MS位置区序列，其不易再发生线粒体基因组重组，因此，在本发明的实施例中，在利用所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物以及后续一系列操作开发的本的分子标记，其结果可靠稳定。
可选的，在所述提取不同品种的水稻的总DNA的步骤中：所述不同品种的水稻包括11种粳稻品种和12种籼稻品种。
可选的，所述11种粳稻品种具体包括：合系41、农垦58、E5、02428、盐粳48、武育粳7号、日本晴、辽粳944、中花11、湘晴、千辛124；
所述12种籼稻品种具体包括：南京6号、矮脚南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕97B、楚粳23A、70928。
可选的，在所述分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列的步骤中，具体包括：
使用BLAST2软件分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出55个不保守的MS序列。
可选的，在所述提取不同品种的水稻的总DNA的步骤中，具体包括：
取不同品种水稻幼苗2-3克，提取其总DNA。
可选的，在所述以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增；获得扩增产物的步骤中；
所述PCR扩增的反应体系包括：50ng/μl总DNA 0.8-1.2μl、10×PCR buffer 0.8-1.2μl、25mM MgCl2 0.6-0.9μl、25μM dNTP 0.3-0.6μl、1U/μl Taq酶0.3-0.6μl、10pM的分子标记PCR引物0.8-1.2μl，去离子无菌水5.2-7.2μl。
可选的，在所述以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增；获得扩增产物的步骤中；
所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5分钟、94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，循环30次。
可选的，在所述对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得该多态性引物扩增得到的目的条带的步骤中：
所述电泳检测具体为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
可选的，在所述对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析的步骤中，具体包括：
对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，利用Numerical Taxonomyand Multivariate Analysis System Version 1.60软件分析获得不同水稻之间的相似系数，利用平均距离法以及NTSYS程序运算建立聚类图，以进行不同水稻之间的亲缘关系分析。
附图说明
图1示出了本发明实施例一提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法的流程图；
图2示出了本发明实施例二中多态性引物M12对23种水稻的PCR扩增产物的电泳图；
图3示出了本发明实施例二中多态性引物M12分别对15株si8和sj1的PCR扩增电泳图；
图4示出了本发明实施例二中24对多态性引物23个水稻品种的UPGMA法聚类图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例一
在本发明的实施例中提供了一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，包括以下步骤，请参考图1：
步骤101：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；
CW、Lead、Nipponbare和9311是目前已经完成线粒体基因组测序的4个水稻品种，9311为典型的籼稻品种，CW细胞质来源于中国普通野生稻W1(Oryza rufipogon)，LD细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻，线粒体基因组最大的为CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，同线性分析表明，Nipponbare和9311较为保守，而CW和LD与其他两个已测序的水稻基因组在序列组成及排列上差异都很大，因此，水稻也存在大量的特异序列(MS)，而通过分析比对这四种水稻的线粒体基因组则可以获得多个不保守的MS序列。
步骤102：根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；
在步骤102中，通过得到的多个MS序列，设计相应的分子标记PCR引物，每一个MS序列对应设计一对引物。
步骤103：提取不同品种的水稻的总DNA；
在该步骤中，提取需要鉴定的不同种类水稻的总DNA，备用。具体的，提取总DNA的方法采用冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、NinaIrwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》中所记载的植物核酸的提取方法。
步骤104：以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
得到不同种类水稻的总DNA之后，将其作为模板，分别用设计好的分子标记PCR引物逐个进行扩增，获得扩增产物。
步骤105：对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；
在该步骤中，较为关键的，不同的分子标记PCR引物对多个水稻品种的扩增可能会出现不同的结果，通常情况下，一对引物对所选所有水稻品种而言，可能会初选，全部扩增出条带或者全部不能扩增出条带的结果，说明该引物不能在所选水稻品种中扩增出差异，相反，如果对于一种引物而言，部分水稻能够产生扩增条带，而部分水稻不能产生扩增条带，说明该引物能在所选水稻品种中扩增出差异，因此是多态性引物。
步骤106：对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。
得到多态性引物之后，检测所有多态性引物对所有水稻品种的扩增条带，通过分析软件进行聚类分析，建立聚类图，并进行亲缘关系分析。
综上，本发明的实施例中提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其通过分析比对4个已知水稻的线粒体基因组序列，筛选出了不保守的MS序列(多个)，然后再根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物，每个MS序列对应设置一对分子标记PCR引物。然后再以不同品种的水稻的总DNA为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；将扩增产物进行电泳检测，并筛选出能够导致扩增差异的多态性引物(对于每一种引物，如果一部分水稻种类能扩增出带，而另外一部分水稻种类不能扩增出带，则该引物为多态性引物)以及该多态性引物扩增得到的目的条带；再对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析，进而获得不同种类水稻的进化关系。
与现有技术中常见的RFLP分子标记相比，本发明提供的这种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其操作简便，所需设备也简单，只需要PCR仪、台式离心机以及凝胶电泳设备以及相应的分析软件即可完成整个鉴定操作，常规的分子实验室可完成整个实验操作，因此，克服了现有技术中RFLP分子标记操作繁琐复杂、费时耗力的缺陷。
另外，由于在水稻线粒体的MS位置区序列，其不易再发生线粒体基因组重组，因此，在本发明的实施例中，在利用所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物以及后续一系列操作开发的本的分子标记，其结果可靠稳定。
接下来，为了使得本发明实施例一的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法得到更好的应用，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是实施例一的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法的进一步限定和增加，现做详细的阐述和解释，请参考图1-图4：
实施例二
本实施例的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法包括以下步骤：
1、分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；
在该步骤中，具体的，使用BLAST2软件分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出55个不保守的MS序列。
BLAST2软件对于不同品种水稻的线粒体基因组比对结果准确，并且55个不保守的MS序列可以保证相应引物的数量，进而提高了后续扩增呈现高多态性的几率。
2、根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；
上述步骤与实施例一的步骤101-102相同，在此不作赘述。
3、提取11种粳稻品种和12种籼稻品种的总DNA；
更具体的，在该步骤中，所述11种粳稻品种具体包括：合系41、农垦58、E5、02428、盐粳48、武育粳7号、日本晴、辽粳944、中花11、湘晴、千辛124；
所述12种籼稻品种具体包括：南京6号、矮脚南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕97B、楚粳23A、70928。
需要指出的是，93-11、67468、78360、76354、78267、76343和70928是指国际水稻研究所登记的不同水稻种所对应的编号。
具体的，在本实施例中，供试水稻其编号和品种名或国际水稻研究所(IRRI)编号的关系请参考下表：
表1供试水稻品种
上述水稻品种均为典型的籼稻或粳稻品种，因此在本实施例中，选取上述种类的水稻作为供试水稻。
另外，在该步骤中，优选取上述不同品种水稻幼苗2-3克，提取其总DNA，由于水稻幼苗中含有核酸的量较为丰富，且对其进行提取核酸的操作也较为容易，因此，在本实施例中，优选利用水稻幼苗。
4、以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
在该步骤中，所述PCR扩增的反应体系包括：50ng/μl总DNA 0.8-1.2μl、10×PCRbuffer 0.8-1.2μl、25mM MgCl2 0.6-0.9μl、25μM dNTP 0.3-0.6μl、1U/μl Taq酶0.3-0.6μl、10pM的分子标记PCR引物0.8-1.2μl，去离子无菌水5.2-7.2μl。
所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5分钟、94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，循环30次。
5、对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得该多态性引物扩增得到的目的条带；
具体的，电泳检测采用琼脂糖凝胶电泳。
另外，在该方法中，55对引物其通过筛选之后有24对引物能够在23个水稻品种中扩增出差异，具体的，请参考表2，24对引物(依次记为：M1-M24)及参数如下：
表2筛选中表现多态性的PCR引物及其参数
另外，由于线粒体基因组较易发生重组，为验证水稻线粒体MS标记的稳定性，请参考图2，随机挑选水稻品种si8(M12能扩增出带)15个单株和sj1(M12不能扩增出带)，其中，M为Marker DL2000；然后用多态性引物M12进行分别对si8和sj1进行PCR扩增，请参考图3，其中A为多态性引物M12进行分别对15株si8的扩增结果图，B为多态性引物M12进行分别对15株sj1的扩增结果图，通过PCR结果表明，si8的15个单株都能扩增出条带，而sj1的15个单株均未扩增出条带(图3)，因此，多态性引物在水稻品种个体间保持稳定。
6、对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，利用NumericalTaxonomy and Multivariate Analysis System Version 1.60软件分析获得不同水稻之间的相似系数，利用平均距离法以及NTSYS程序运算建立聚类图，以进行不同水稻之间的亲缘关系分析。
统计被检测材料的多态性扩增带，阴性计为0，阳性计为1，然后统计构建这23份供试水稻的线粒体组型指纹图谱(表3)，利用该指纹图谱可以很好鉴定这23个水稻品种的细胞质来源，同时也可以准确的鉴定其杂交后代的细胞质。
表3，23个水稻品种的MS标记指纹图谱
在本实施例中，具体的，对24对多态性引物产生多态性的DNA目的条带的结果进行统计，建立二元数据，有目的条带计为1，无条带记为0。根据统计结果形成一个二元数据矩阵，使用软件NTMAS(Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version1.60)进行亲缘关系分析，根据其中的Jaccard公式统计各水稻品种间的相似系数(GS)，使用平均距离法(UPGMA)，NTSYS程序运算建立聚类图，分析材料间的起源进化关系及相似度。
请参考图3，结果表明，在相似系数为0.46，可以将23水稻品种分为2大类群，其中第一大群可分为两个小类群，类群I为粳稻聚类群，类群II为籼稻聚类群，粳稻品种sj3，sj5，sj7和sj8的相似系数都为1.0，因此，这些粳稻品种间的细胞质差异较小，分化时间较短；而第二大聚类群类群III全部为籼稻品种。
Claims (1)
1.一种检测用于水稻细胞质鉴定的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对有24对，其上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:24所示；
所述上游引物对应的下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:48所示。
Priority Applications (1)
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