CN103436622B - 鉴定水稻雄性不育类型及三系杂交稻类型的方法及分子标记和引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴定水稻雄性不育类型及三系杂交稻类型的方法及分子标记和引物，属于分子标记检测领域。鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的分子标记及引物的序列如SEQIDNO.1～36所示。本发明的鉴定方法包括如下步骤：提取水稻材料的总DNA；以提取的总DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；分析PCR扩增结果，若两个材料的扩增带型完全一致，则其具有相同的细胞质组型，即具有相同的母本来源，否则，其具有不同的细胞质组型，即具有不同的母本来源。本发明操作简便、稳定可靠，可用于细胞质雄性不育系和三系杂交水稻品种的鉴定，具有准确、高效、快速的特点，提高了不育系和新品种鉴定的效率。

Description

鉴定水稻雄性不育类型及三系杂交稻类型的方法及分子标记和引物

技术领域

本发明属于分子标记检测技术领域，具体涉及鉴定水稻雄性不育类型及三系杂交稻类型的方法及分子标记和引物。

背景技术

水稻线粒体属于母系遗传，因而通过线粒体标记可以追踪水稻细胞质的来源。线粒体虽然被认为突变速率慢于细胞核，但由于线粒体基因间区域容易发生重组或者发生细胞内基因组间的交流，因而产生非常丰富的遗传变异。这种变异在遗传水平可作为线粒体基因组的特异分子标签。利用线粒体分子标签可以标记细胞质组型，因而能有效区分不同的水稻细胞质雄性不育系或杂交稻品种。由于分子标记具有唯一性，可以通过简单的PCR扩增来跟踪特定的基因组型。具有操作简单、结果可靠、效率高、不依赖表型等优点，在遗传育种上已被广泛应用，具有非常广阔的应用前景。

在农作物杂种优势利用中，细胞质雄性不育系是最常用的不育类型。水稻中细胞质雄性不育根据败育组织特征可以区分为孢子体类型和配子体类型两大类，彼此间既有共性也有特性，其差异决定于线粒体基因组的变化。发掘其基因组水平的差异并开发成特异的分子标记可有效区分不同的细胞质雄性不育类型及其杂交稻品种。盖树鹏等曾试图发展洋葱细胞质雄性不育系线粒体基因组的特异性SCAR分子标记。

何光华等利用RAPD技术曾在水稻野败型珍汕97A和珍汕97B叶绿体基因组之间筛选到一条特异性的稳定扩增条带，测序发现该序列位于叶绿体tRNA-Leu gene的上游，其中97A较97B中多了一段包含AGAAAA六碱基的重复片段单元，据此序列将其转换成SCAR标记后，该片段在5个野败不育系中可以稳定扩增，而保持系中没有。因此，他们认为该片段可以作为筛选野败型不育系的特异性分子标记（He et al.Euphytica,2003,131:269-274）。而日本的Ichii等在野败型不育系珍汕97A中发现一条1.6Kb的差异性扩增带。进一步提取不育系、保持系和恢复系的线粒体基因组DNA进行PCR验证，发现该片段为不育系线粒体所特有，而保持系和恢复系线粒体均不含此片段。对杂种F1和F2的验证表明该片段与不育株共分离，说明该标记的确为野败型不育系所特有。但若以该标记引物对DA型不育系线粒体DNA进行扩增，其扩增带为两条，一条为0.7Kb，一条为1Kb，与野败型的不同（Ichii et al.Euphytica,2003,129:249-252）。以上两种方法均建立在野败型不育系珍汕97A中特异性扩增的DNA片段基础之上，只能跟踪具有与珍汕97A完全相同的细胞质，因而主要适用于野败型杂种及其细胞质细胞质组型的鉴定。

在配子体型细胞质雄性不育系中，包台型细胞质雄性不育的相关基因orf79和红莲型细胞质雄性不育相关基因atp6-orfH79，属于等位基因变异(Kadowaki et al.Mol Gen Genet,1990,224:10-16；Yi et al.Chinese Science Bulletin,2002,47:744-747）。而且以orf(H)79作为PCR分子标记在水稻中筛选到一系列携带该基因的种质资源，说明该基因分布广阔，不为包台和红莲所特有。因此，利用不育基因orf(H)79作为分子标记不足以有效区分某一类型的细胞质，需要有更多其他分子标记的参与。

随着水稻细胞质雄性不育线粒体基因组测序的增多，通过生物信息学分析，可以发现发现线粒体基因组中积累的大量特异DNA序列，这些特定的DNA序列在某一类型或者某一种水稻细胞质雄性不育中具有唯一性。因此，这些特定的DNA可以作为某一个或某一类水稻细胞质雄性不育的标记。而杂交稻源于不育系与恢复系的杂交，因此，母性遗传的细胞质雄性标记也可稳定地鉴定杂交水稻的类型。

发明内容

本发明的首要目的在于提供鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的分子标记。根据多个细胞质雄性不育水稻线粒体基因组序列的差异，通过大量筛选，寻找分子特征序列，开发出并建立了一套多态性丰富、稳定可靠的线粒体单倍型特异（Mitotype-specificsequence,MSS）分子标记。

本发明的另一目的在于提供鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的引物，这些引物根据上述分子标记所设计。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的方法，该方法操作简便、稳定可靠，可用于不同（孢子体、配子体）细胞质雄性不育系鉴定和水稻品种的鉴定，具有准确、高效、快速的特点，提高了不育系和新品种鉴定的效率。

本发明的目的还在于提供上述分子标记、引物或方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一套鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的分子标记为MSS01、MSS02、MSS03、MSS04、MSS05、MSS06、MSS07、MSS08、MSS09、MSS10g、MSS11a和MSS12s，其序列如SEQ ID NO.1～12所示。所述的水稻细胞质雄性不育类型包括水稻孢子体细胞质雄性不育、水稻配子体细胞质雄性不育。

鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的引物，其能够扩增上述分子标记序列或分子标记序列的一部分。

优选的，所述的引物如下表所示：

一种鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的方法，包括如下步骤：提取水稻材料的总DNA；以提取的总DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；分析PCR扩增结果，若两个材料的扩增带型完全一致，则其具有相同的细胞质组型，即具有相同的母本来源，否则，其具有不同的细胞质组型，即具有不同的母本来源。

所述的提取水稻材料的总DNA优选为当水稻生长至两叶一心时，取幼苗提取的总DNA。

所述的PCR扩增的体系优选为：50ng/μL总DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mMMgCl₂ 1μL，25μM dNTPs 1μL，1U/μL Taq酶1μL，5pM的引物F 1μL，5pM的引物R 1μL，去离子无菌水16.5μL。反应混合物用矿物油（Sigma M5904，分子生物学专用）覆盖。

所述的PCR扩增的程序优选为：94℃ 5min；94℃ 1min，52～56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。

上述分子标记、引物或方法在水稻不同细胞质雄性不育系和三系杂交水稻品种的鉴定中的应用。

本发明具有如下优点和效果：

（1）本发明引物和方法开创了检测不同类型细胞质雄性不育系的新技术，具有快速准确、稳定可靠的特点。

（2）应用范围广，可用于不同细胞质雄性不育系和三系杂交水稻组合的鉴定；结合细胞核分子标记，即可用于杂交水稻品种的检测鉴定。如图2中，珍汕97A和II-32A同属于孢子体类型不育系，则被聚类在一起；而粤泰A和包原A同属于配子体类型不育系，则被聚类在一起；它们的MSS分子标记引物扩增图谱不同，代表不同细胞质类型。

（3）可进行高通量的样品检测：一次PCR反应可以检测96个材料，提高了不育系和新品种鉴定的效率。

附图说明

图1是部分MSS分子标记引物扩增不同不育系总DNA的电泳图。

图2是14个不育系和保持系根据12个MSS分子标记引物扩增的指纹图谱应用平均距离法得到的聚类分析图；14个不育系和保持系被划分成3个亚类，其中孢子体和配子体细胞质雄性不育系被明显区分为两大类。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 MSS分子标记及引物

根据不同细胞质雄性不育水稻线粒体基因组序列的差异，开发出鉴定水稻细胞质雄性不育类型及三系杂交水稻类型的MSS分子标记，分别为MSS01、MSS02、MSS03、MSS04、MSS05、MSS06、MSS07、MSS08、MSS09、MSS10g、MSS11a和MSS12s，其序列如SEQ IDNO.1～12所示。

根据上述MSS分子标记所设计的引物及参数如表1所示。

表1 线粒体MSS分子标记引物

实施例2 检测水稻细胞质雄性不育系细胞质组型

（1）DNA提取

选择不同类型水稻细胞质雄性不育系材料10份：即Y4A、冈46A（G46A）、Ⅱ-32A、协青早A（XQZA）、马协A（MXA）、K17A、楚粳23A（CJ23A）、包原A（BYA）、珍汕97A（ZS97A）和粤泰A（YTA），以及保持系包原B（BYB）、Ⅱ-32B、冈46B（G46B）、Y4B。当其生长至两叶一心时，每个材料取幼苗叶片0.5克至2mL离心管中，高速震荡仪研磨破碎细胞，参照冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》一书提取水稻材料的总DNA。

（2）PCR扩增体系的建立

标准的PCR扩增反应体系为25μL，组成如下：

50ng/μL总DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 1μL，25μM dNTPs 1μL，1U/μL Taq酶1μL，5pM的引物F 1μL，5pM的引物R 1μL，去离子无菌水16.5μL。反应混合物用矿物油（Sigma M5904，分子生物学专用）覆盖。

PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 1min，52～56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。

（3）DNA扩增带型统计分析

1）扩增均以无菌水为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果可靠（图1）；

2）统计被检测材料的扩增带，阴性计为0，阳性计为1，然后统计、聚类分析，结果如表2和图2所示。

表2 MSS分子标记引物扩增10个不育系和4个保持系的指纹图谱统计

3）细胞质组型的确定：当两个材料的扩增带型完全一致时，则认为两个材料具有相同的细胞质组型，它们具有相同的母本来源；否则，就认为这两个材料属于不同细胞质组型，具有不同的细胞质来源。聚类分析显示，本实施中的10种细胞质雄性不育系扩增带型均不相同，属于不同的细胞质雄性不育类型（图2）。

实施例2 检测杂交水稻品种的细胞质组型

（1）DNA提取

选择三系杂交水稻品种9个，即：汕优63、马协63、红莲优6、珞优8号、冈优22、II优838、K优818、金优38和协优218。当其生长至两叶一心时，每个材料取幼苗叶片0.5克至2mL离心管中，参照冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）出版、NinaIrwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》一书提取水稻材料的总DNA。

（2）PCR扩增体系的建立

标准的PCR扩增反应体系为25μL，组成如下：

50ng/μL总DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 1μL，25μM dNTPs 1μL，1U/μL Taq酶1μL，5pM的引物F 1μL，5pM的引物R 1μL，去离子无菌水16.5μL。反应混合物用矿物油（Sigma M5904，分子生物学专用）覆盖。

PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 1min，52～56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。

（3）DNA扩增带型统计分析

1）扩增均以无菌水为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果可靠；

2）统计被检测材料的扩增带，阴性计为0，阳性计为1，然后统计，结果如表3所示；

3）杂交稻品种细胞质组型的确定：当两个材料的扩增带型完全一致时，则认为两个材料具有相同的细胞质组型，它们具有相同的母本来源；否则，就认为这两个材料具有不同的细胞质组型，具有不同的母本起源。本实施中的指纹图谱显示，珞优8号和红莲优6、汕优63和金优38具有相同的指纹图谱，说明它们的细胞质组型相同，分别属于同一类型的杂交稻；而其他品种的指纹不一样，说明属于不同的类型。本实施例检测的结果与它们的不育系的细胞质类型相一致。

表3 MSS分子标记引物扩增9个三系杂交水稻组合的指纹图谱统计

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  鉴定水稻雄性不育类型及三系杂交稻类型的方法及分子标记和引物

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<213>  Oryza sativa

 

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tgctttgtgt ttcccatctg ttcaagtgga taatcccgat tcggttttcg agggttcgct      240

cgtcatttat tcgtagtaac gtcgtattgc ctatgcagct aaatcgatag gaataggatt      300

tatcaaagga aagggcgggt ggacatacgt tgcgggtgtc cagttggcat gggtctgggt      360

tccgctcatc aactcgaacg gtcaatgctg gccagatacc tgcatcgtta tacgtcacaa      420

gttggggtgg ttgaacagga aaaacaacaa ggcaggcgat aggcacacac acctatgaga      480

aacaattcca caggaattgg gcagaactat tagttcaata taaggaattt catatcacca      540

tgggacttac tagtaaaaag cgaatatcaa ttcatgacag cgatggccgc ttagttggta      600

ctaaacccca tcatattggg ggagatgagt tcaaaaactt tggccatacg gcccatcgag      660

ctttaagcag tgttttagat gaaaacgagg tactattgag agaattgtcg agct            714

 

 

<210>  6

<211>  1471

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  6

gaagagtggg aatgtgggct tctttcattt gatttttggt tggtgacgac tgagttaggg       60

ttctaggact gttttatggg aaggggggtt acggattcca gggcgtagta gacaaccccg      120

gatgtagcca caaacgtggt gaaccgggtc aacaaaagga atgcctggtt agtgagggga      180

cgcacgagct actgctcttt tcccctatcc gcttcgatcc gtttacccca gctcgatatc      240

ctttctggat gtgttcccgc tctcaagact acctcctatt tgccaataga agtgttggcc      300

tacttcaaca ccttggaaag aatcgggggg ttattccttt agctagaacc cgagcatcag      360

cctagcccct tgacttgcta tacaggtaag tgctagttcc ggctttccct atcttccgag      420

cgagggtgtc atctttcctt tcaaacagat caataaaaat aaagtaatca accagatttg      480

cctagtgacg gaaggcccct atcttccgat ccggcttgct aactatcttg ctttcctgcc      540

tcctgcttgc taacctgctt tctttccttc tggtcttcct cgtaaccaat ataaccctag      600

ctcgaaccca gatatttacc taaccctgga gtacctcctt ccctactgta cttgtctatt      660

cccttcaagg tttcgataac cattgctagt gacggatatg tctttattcc gagatccgct      720

ccttggcccg gcatcgcggt aatagtcctt ggcaaagaag caggagcctt cctaccgttc      780

atatgcctac tttccccatc tcttgactag gaacgaagat gcgagatcta cttatcgttc      840

tgagagtgac tccttatccc tcacttctga cttgaatctc tgattctttc aagttcttct      900

tttctttgag atcgatacct catctttctt ccgcctcgat gatctctttc ttgctgtaaa      960

ggacggacca acagaagtgg ctagtggatc tggataacct tccattccag ttcgtagcta     1020

tccggggccc cccgggggta gttccttttc ttcaaccaga ttgtgtttct attcaccctg     1080

ctccttcgtc atccgcctat cttgccattc ttcctcggac gaggcatatt cctttattaa     1140

gagaatcgct atcaatccta gtcagagggt tatccttttt gccaccagct cgtggtccat     1200

ctcaggaggg atgagtgatt gaagggttcg gcgaacccaa tgtgtcctta cttttttcta     1260

atcacccagt tagcatatct ttccgagttc agggtttctt ccggtaacca taccgtacct     1320

gcttttggtg actaacgtag gcatgttacg aacgataact tacgctcgag catcttcttt     1380

tcgaaggacg gactcctatc tattcgtgag cgccatttca ttgattgtaa aaaggtagca     1440

tggtagcagc cgagaaccag tagccgattg a                                    1471

 

 

<210>  7

<211>  3600

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  7

ggggaaatgc tatggttaca ggatgaaatt tcatcctcga ataaacctcg taatcgtaag       60

aaagttggtt ttttagcact gggcctagca aaagagaaat cgccatatac taggccctcc      120

aatttcttaa ggggtttatc taaaagattc gcgatataac taggaagacc tttcaaatac      180

cacacatgag tcacgggaca tgcgagtttg atgtatccca tttgatatct tcgtatccga      240

gaatcaacaa attctactcc gcatttttgg caaaatcttt cgtcttcgtt ttcagctccg      300

ctcgctcgag aatttccaca agcacaaatt ctgcttttta tgggtccaaa gattctttcg      360

caaaacaatc catctttttc tggtttatcg gttttataat gaaaagtaga gggccttgtg      420

acttcgccaa cgacttaccc attaggtagt gttttgttag cccaagcctt tatttgttga      480

ggggaaacga gtccaatttg aagttgttga tgtttatatt ggtcaatcat aaaatagaaa      540

taagaaaaga atttatattt attccgatca aacttcttcc ctattaacct ggaagttctt      600

ctgagataca aggaaatggt tcagttctag agccaaagat cgtagttctc gaacaagcac      660

tcgaaaagat tctggaggat cctcgtgatt aggtactcgt tttccccaga tcgtagcgtt      720

aagtatttct tggcgagcta taagatgatc agatttataa gtaagtatct cttgtaaaat      780

atgagcaaca ccaaatcctt ctaaagccca aacttccatt tctcctattc gttgtccccc      840

ttgcttggct cttcctctaa cgggttgttg tgtaacaagt gaatagggcc cagtagagcg      900

tccgtggatt ttctcatcaa cttgatgaat taattttaag atataggact tccctattag      960

aacaggctgt tcgaaggggt ctcctgttct tccatcaaat attctgcttt ttcccgggta     1020

ctcgggttca aatacccacg gattttttgt ttgtttactg gcttcatata attctgaaaa     1080

cacaagtttt cttgaagcct cttgctcata tctctcatca aagggtgcta ttctataatg     1140

tttctttagc agatcccctg ctaatccgag cgagctttca aatatttgtc ccacattcat     1200

tcgggagggt actcctaagg gattgaaaac catatcaaca ggcgttccat cttgcaaata     1260

gggcatatct tgcctaggca aaatttttga aatgatcccc ttattcccgt gtcttccggc     1320

tactttatcc ccaactttga tttcgcgttt ttgtaaaata tatacacgaa ccattatgcc     1380

gaggggatcc ctctggatcc atttcacatc gataacgcgc cctcttccac ctatcggtag     1440

tttgagagaa gtttcttttg aagtggatac ctcaagacca aatatggccc gtaataatcc     1500

agcttccgcg atataggacg attcgctcgc tatctgaggc gttaatttac ctactaaaat     1560

atcgcctgtt tctacccagg accccaactt cacaactcca tttctgtcca aattgcggag     1620

taaatgttct tctagatgtg gtatttcttt agtgattttt tcagcggagc cttggcttgt     1680

ygtatccgtc tgaatttcat attttcggat gtgaaaagaa gtataaatat cctcatatac     1740

caaacgttcg ctaattaata ctgcgtcttc caaattgtaa ccttcccatg gcatataagc     1800

tactaatacg ttttttccta aagcaagttc cccaccaacc gtagcagccc cctccgctaa     1860

aatttctcct tttttaatgg atttaccccg cggaacccga ggtttttggt gcatacaagt     1920

atttttgtta gagcgccgat gggtaactaa aggaatactt atagtcttcc cactacttga     1980

taaaaggatc ttgtgactat tagtagaaat gatctttccc tcgcgttcgg ctataacaga     2040

aaccctcgaa tctagagctg tttggcgttc caatccagtt ccaacaatgc acttctcgga     2100

ccgagaaagc ggaactgctt ggcgctgcat attagaactc attaaagctc gattcgcatc     2160

attatgctca ataaaaggaa tgagagaacc cccaatagaa aaatattgga aaggaaaaat     2220

acttctaaca tgaatctgtt cccatgcaat agtcaggaat tcttgacggt atctagctgg     2280

aacaacctgt tcttcctgaa tacaccgatt caaggacaaa gaatttcctg ctgctatcat     2340

ataatactca tctctatttg gtgataaata aaccacctgt ctctcttttt ttttctttgc     2400

tttctcagat atttcataaa atggactctc tacggatccc caccaatgat caattctcgc     2460

atgaatagct aaagatccag taagtccaac gttgattcct tcggacgtgt caattggaca     2520

aatacgccca tagtgactcg gatggatatc tcggctccga aaacttgcag ttctccccgt     2580

caatcctcca ggacccaaac aactcacttt tcgcccatga accgtttgtg tcaatggatt     2640

ggtttgatca aaaacttgag ataagggata tgtaccaaag aaggtctcgt aagtagttat     2700

taataaaatc gaggttgaag ttggagttac caaagtttgt ggagtcggtt ttgattgacg     2760

tatcaatact ctacggatag ttttttgaac cgcatgttgt aaacgaccaa gagccagtcc     2820

gaattgatct tgtaacagat ccgcaaccga acgaatacgt ttatttttca agtgattcat     2880

atcgtcatcg tcaagtatac ccgtttcaaa tttcattcca atcaaatgat ccgtagcggc     2940

caatacatct cgcggtaaca agaaggtgct gttctgaggt atatcaagat tcagtcttcg     3000

attcatattt cgtcgaccaa tccttcctaa ttcacatttt tgttgaaaaa atttcttttg     3060

taattcctca cataaggatt ccgaaaatac caggtccccg cctacacaag caaattgttg     3120

ataaaactcc aaaatagctt tttcttttga ctcaatcctc ttcttctcct tagcattagg     3180

gaaagacaag aaaatttcag ggtaggaaac attatctaga atttctttta gatttgaacc     3240

catagctgat gatagaacta gaacagatat cttttgtttt ctactcacgc gagcccatat     3300

cctttctttt ttatcaattg ctaattccga tcttcctccc caatctgata ttatagtccc     3360

ggtgtagata gaaattcctt tatggtctaa ttccgagcgg tagtaaatac caggacttag     3420

caatatttga ttgatcacaa ttcggtatat tccatttatt ataaaggttc ctaaggaatt     3480

cattatagga atgtttccaa tataaatggt ttgcttttgc acatcgaaac caaaaattaa     3540

tcgcgcggat acgtataatt cggaagaata ggtgagtgat tcatacacag catccctttc     3600

 

 

<210>  8

<211>  1564

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  8

aagtggcgag ggtagaaaaa aggtttgaaa ttccaggtta ccgcagtatt aaacaaagga       60

catagtggat taggtaacac ctcttttgag aggaaagatc tatgaaagct gaaagcccat      120

 

tctcattcta ttctcaattt catctacttt cttggctcag gtgactatct atcgcccggt      180

gagtatcgcg agtgagagcc ttaggcacaa gttccgagaa caacaagacc aataatcaaa      240

taaggaagct aagtatagga cttgtctgta ggcggaatag agtacgccgt taagcaatac      300

ggcaagcgta gtcgataggc aaagagctcg cctgaaaatg aaatgaatat gattatgccc      360

atcttcctgg ggggaagaag aggctctttc gtaatagaat accgatcgac gctagcgagg      420

agagtggaat cacccgttgg ccttctgata acatcaaaag cggatctcgt tgagaagatg      480

tcatggttgt cggggatcct aagtagttta tctttctcac cagcaaagca tggaatatgg      540

actgtcacaa tatgatgtat cacctcctct agaagaaggg acaataataa atcacttaat      600

ctgctgccca tgttgaatgc atcttgaata gagaggtgct tataagaaaa tgaacgccat      660

ctatcaggct ggaagtaatt aagtcaagca cctatcccag accaattaga tgtgaagaaa      720

gggccatact acaagcgcca gaaaggtcct tcttcttgct tctttagttt ccttcaaatg      780

ccggctgtat gctctgtata gtgttggttg tttttaacca agcaactatt caatatcggg      840

ctaacttttc tgacaactct tttttagaag ctttcctcct gggctacttg ctttctagct      900

tattacctgg catgcccttt gaaagatagg tgaagcatac ttattctttt cccccgggat      960

atttctgtac actagctttc atgcgtaatt ataaatactt gctcgtcaca tccaagctgg     1020

ctcgtcgcta catctctagt tacataaaga aaaagattac tcttttttat agaggaatcc     1080

ctaggtggaa tttgtgatgt aattaatgct ctctaactaa ctcaatttca agtcatgcgc     1140

cagtgatttg ccgttatagg ccagggccag ttggaaagta tgcattagat agctagggct     1200

actagggcta agaggaatag cttttgatca gttgcctgct aaaaggcctt tctttcatta     1260

tcggaagttc tttcttctca cctgatccgc acaatgccac caaaggtaag gatcatccca     1320

tacagagtaa tgggcttcac cgctgcgcgc cttttccctt ttagcctttg acaaacctgc     1380

aggtagctca ttagtgacca aataatggaa aatatccgca taccatgggg ggcctcagcg     1440

gataacagtt gctcataaac caaaagtaag tgttctgcac aaccccttca aaaggactct     1500

ttgacttcgc cgacttacat atttcgaata gccttgtcct tcgtaagtgt agcgtggaac     1560

cttc                                                                  1564

 

 

<210>  9

<211>  1779

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  9

aactggtagg gattggggcg gatatcgcaa gacaacgttg atggaatgtc gggaactgaa       60

cagaccacaa ccctatcttc agaaaagcgt acggcggtcg tctccctggt gaccttttcg      120

gggtgtgcac tttatttttt ccggcctccc tgtctttact gcatttcgaa actctagccc      180

agaacttgtt tgttcataag cctttttcat tcaaccagtg tagagtgctc cattggtagt      240

ggtggattgg ttaaccaagc agatagtcta gtctagtaaa gtccataaag aaaagtatag      300

taaagaaagt ctcgtgtaga acgatctgat gagatatttg atattgtgcg ttcctctttg      360

tcacagtgat aaacttgtaa gtcaatatca tccgaaactt tttatttttt aattagagaa      420

ttgtctgtcg gaaataggat ttctcctatg tgaataggtc ttacgtcaat aatcaagtgc      480

ttgcttgtaa ataggaagaa gaattaattc cctaaatcct tttgtcgtgt agtaattctc      540

tatggctctg cccgtctagt tcattgagct ggaaatagag tacgcgcatt tctctttatc      600

gctctgcctt cttcctccga gcacatttaa gtagggtgct ccttctgagt ggttggacta      660

ctgcatttag tgtttttggt tgagcccggt acccacaaga caagtgaagc atttcttctc      720

ttctgggaag ggttcggcaa gtgagtatgg tgattgaaat gtggggttct tgccttctat      780

ttgtttactc tcatctattt atttcattat tttgggcttt tttactactt gattgaacac      840

ttcgtgccgg aattccactt gttgaaaaaa gaggtttcca ctgaatagga agctaatgct      900

cttcgggtag gaggactgga atatagagtt attacggaaa gagtattttc agtacctaca      960

tgataaagag agactacctt cccaaaataa taatccggag agaagatgct tctcggaaga     1020

cgatggaaat gaggaacgaa gttatccttc cccttttata aggcacgggc tcaggttacg     1080

tacggatttt atgcaacaaa tacgatacat acggtgtaga atactttatt gctactggct     1140

tttgccttta acggatctcg ctgcgcgcct caatcgtatc ttctcttgcg cggaggttca     1200

cctagaagat catcgactct ttctttcgcg tatgaatact gggccgggtc tacgtaccat     1260

accaatgaaa cacacagaca ccaattgcct atctgagttt atgcttaacg aaagagcaag     1320

cacttggaaa ggagagaaaa ggtcgtccct ttactctatt cctgacgtta ggacggatac     1380

ttaactagtg ggaggcctta cgagggctaa tctactactt gactcacgag ttgctcaaat     1440

catctcttga ttcggaatca cgggatcggt agatgtcaca taacttgatt agttagaaaa     1500

tgattatgct atcggcttga tagaatcaaa aatatgaata atacaagtgc cggtcagcta     1560

gcacctttgg tgacatgctg ttccccacta gtcttcttcg tacatgccca tggggttatc     1620

cctaaggcct attcagcact gcacactggg tagcacgtaa ctagtggtca tgcttacttc     1680

agatgttctc agcccagctc agtctatcac ttagacttca gatttcgtgc agtgttcaac     1740

aagctaggaa cacaaaagaa cgcttttcct cttaggggc                            1779

 

 

<210>  10

<211>  1193

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  10

gagagagaat gagttaggga catatccgct attactctag cgctgtgtgc cccgagggaa       60

tgagaacgga gtccaatact gcctcccgaa gggcctagtc caatactgca ctgcgatccc      120

gaagggcctg gtaaaatctt cctgtctttt ccgttaaggg aagcacttac tacttcaaaa      180

tggaagacct atctatagat aactatagga ttctcacgag aaggcttcaa atcaagcaat      240

ccacaagaca agcgagttca ctatcatagt tgatccttga ctgcttcctt cacggtaatg      300

gtcctcctag gataggatat gagcgaacat agtcaattac agatatgcga actgttggaa      360

agcactagtt tcgaagaaaa agagtagcaa gggattcgaa acagacaaag cctatgaaca      420

agagtaagga ctgcaacgat tagagagagt agggagtacc gttcattacc gattagagag      480

agtagggagt accgaacagc ctctagtact gcttgctatc atagagaagg gagtaccgaa      540

cagcctctag tactgctatc tacacaccct ctagtaccgc tatcgtagag aatctagtac      600

agctatctac gagacgagaa aaggaaacga tttgattttt cacacaagac ctagccattg      660

cattggttta gttaagtaat tgcatttccg cttcagctgc ccttgctttt ccttcaccca      720

aaaggctctc tttcggctgt acccatcccg gagggatgcc aggtactgct cttcaggtta      780

agagaaacag tcattgcatt gttgaataag ggaaagtgga attgttgaat cagccctcgc      840

ctggtgccta ccaataatac ttcataattg cgtatataga agggagggga gaggtactct      900

atcttgttaa cttactgttt ttttctccta gctgggtttt tcattttatt ctcttagaga      960

taatgctctc cagaagagct cgtaatgaat tggattcgaa ccaatatctc aatgcgactt     1020

atccattagt cgatcattgc gacttatcca ttagtcgatc atcacgggag gaaccgccac     1080

cacgggttcc cggccgccct cccaccttgt aggggtggga tatttgcctg gtccaccaga     1140

attccatagt atggttttgt aatgaaagta tgagcaaacc accactgtcc tgt            1193

 

 

<210>  11

<211>  917

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  11

ctgctttctt tccttctggt cttcctcgta accaatataa ccctagctcg aacccagata       60

tttacctaac cctggagtac ctccttccct actgtacttg tctattccct tcaaggtttc      120

gataaccatt gctagtgacg gatatgtctt tattccgaga tccgctcctt ggcccggcat      180

cgcggtaata gtccttggca aagaagcagg agccttccta ccgttcatat gcctactttc      240

cccatctctt gactaggaac gaagatgcga gatctactta tcgttctgag agtgactcct      300

tatccctcac ttctgacttg aatctctgat tctttcaagt tcttcttttc tttgagatcg      360

atacctcatc tttcttccgc ctcgatgatc tctttcttgc tgtaaaggac ggaccaacag      420

aagtggctag tggatctgga taaccttcca ttccagttcg tagctatccg gggccccccg      480

ggggtagttc cttttcttca accagattgt gtttctattc accctgctcc ttcgtcatcc      540

gcctatcttg ccattcttcc tcggacgagg catattcctt tattaagaga atcgctatca      600

atcctagtca gagggttatc ctttttgcca ccagctcgtg gtccatctca ggagggatga      660

gtgattgaag ggttcggcga acccaatgtg tccttacttt tttctaatca cccagttagc      720

atatctttcc gagttcaggg tttcttccgg taaccatacc gtacctgctt ttggtgacta      780

acgtaggcat gttacgaacg ataacttacg ctcgagcatc ttcttttcga aggacggact      840

cctatctatt cgtgagcgcc atttcattga ttgtaaaaag gtagcatggt agcagccgag      900

aaccagtagc cgattga                                                     917

 

 

<210>  12

<211>  377

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  12

caaccatcca tctcaatcca aaatctccga tcgtctgtga tccaaaccct cctccggttt       60

tggatatata gacagtgcct gctctcaaac caaccaagac agcagcaagt tcctatcgag      120

aacaagacga cagatcaata tgaccaattt ctctaatatc tcgggtgaat acgtgaaaaa      180

gtgttgctta gctcagtgaa atggaataag gaagagaaag tgtagtgtga taagggggga      240

tgcaagtcaa tttttaggtt ttcaagcaag ggctgagata gatatacaaa caataagaat      300

tcacatcaga accctttcct gcttcccttt tttacccatc ggactcacat tttgatctcc      360

tacgcttgct ttcacag                                                     377

 

 

<210>  13

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS01上游引物

 

<400>  13

ccttccactt ccaaataca                                                    19

 

 

<210>  14

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS01下游引物

 

<400>  14

tctactgcca acacaact                                                     18

 

 

<210>  15

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS02上游引物

 

<400>  15

ccttccactt ccaaataca                                                    19

 

 

<210>  16

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS02下游引物

 

<400>  16

agctcgacaa ttctctca                                                     18

 

 

<210>  17

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS03上游引物

 

<400>  17

cccatccatc tttcccctt                                                    19

 

 

<210>  18

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS03下游引物

 

<400>  18

cccatccatc tttcccctt                                                    19

 

 

<210>  19

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS04上游引物

 

<400>  19

ctttgctctt ttctttcttt                                                   20

 

 

<210>  20

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS04下游引物

 

<400>  20

cccatccatc tttcccctt                                                    19

 

 

<210>  21

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS05上游引物

 

<400>  21

cccatccatc tttcccctt                                                    19

 

 

<210>  22

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS05下游引物

 

<400>  22

agctcgacaa ttctctca                                                     18

 

 

<210>  23

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS06上游引物

 

<400>  23

gaagagtggg aatgtggg                                                     18

 

 

<210>  24

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS06下游引物

 

<400>  24

tcaatcggct actggttct                                                    19

 

 

<210>  25

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS07上游引物

 

<400>  25

ggggaaatgc tatggtta                                                     18

 

 

<210>  26

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS07下游引物

 

<400>  26

ggggaaatgc tatggtta                                                     18

 

 

<210>  27

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS08上游引物

 

<400>  27

aagtggcgag ggtagaaa                                                     18

 

 

<210>  28

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS08下游引物

 

<400>  28

gaaggttcca cgctacact                                                    19

 

 

<210>  29

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS09上游引物

 

<400>  29

aactggtagg gattgggg                                                     18

 

 

<210>  30

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS09下游引物

 

<400>  30

aactggtagg gattgggg                                                     18

 

 

<210>  31

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS10g上游引物

 

<400>  31

gagagagaat gagttaggg                                                    19

 

 

<210>  32

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS10g下游引物

 

<400>  32

acaggacagt ggtggtttg                                                    19

 

 

<210>  33

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS11a上游引物

 

<400>  33

ctgctttctt tccttctgg                                                    19

 

 

<210>  34

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS11a下游引物

 

<400>  34

tcaatcggct actggttct                                                    19

 

 

<210>  35

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS12s上游引物

 

<400>  35

caaccatcca tctcaatcc                                                    19

 

 

<210>  36

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MSS12s下游引物

 

<400>  36

ctgtgaaagc aagcgtagg                                                    19

Claims (7)

1.一套鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的分子标记，其特征在于：所述分子标记为MSS01、MSS02、MSS03、MSS04、MSS05、MSS06、MSS07、MSS08、MSS09、MSS10g、MSS11a和MSS12s，其序列如SEQ ID NO.1～12所示。

2.鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的引物，其特征在于：所述引物能够扩增权利要求1所述的分子标记序列，引物序列如下：

MSS01上游引物：CCTTCCACTTCCAAATACA，

MSS01下游引物：TCTACTGCCAACACAACT；

MSS02上游引物：CCTTCCACTTCCAAATACA，

MSS02下游引物：AGCTCGACAATTCTCTCA；

MSS03上游引物：CCCATCCATCTTTCCCCTT，

MSS03下游引物：TCTACTGCCAACACAACT；

MSS04上游引物：CTTTGCTCTTTTCTTTCTTT，

MSS04下游引物：TCTACTGCCAACACAACT；

MSS05上游引物：CCCATCCATCTTTCCCCTT，

MSS05下游引物：AGCTCGACAATTCTCTCA；

MSS06上游引物：GAAGAGTGGGAATGTGGG，

MSS06下游引物：TCAATCGGCTACTGGTTCT；

MSS07上游引物：GGGGAAATGCTATGGTTA，

MSS07下游引物：GAAAGGGATGCTGTGTATG；

MSS08上游引物：AAGTGGCGAGGGTAGAAA，

MSS08下游引物：GAAGGTTCCACGCTACACT；

MSS09上游引物：AACTGGTAGGGATTGGGG，

MSS09下游引物：GCCCCTAAGAGGAAAAGC；

MSS10g上游引物：GAGAGAGAATGAGTTAGGG，

MSS10g下游引物：ACAGGACAGTGGTGGTTTG；

MSS11a上游引物：CTGCTTTCTTTCCTTCTGG，

MSS11a下游引物：TCAATCGGCTACTGGTTCT；

MSS12s上游引物：CAACCATCCATCTCAATCC，

MSS12s下游引物：CTGTGAAAGCAAGCGTAGG。

3.一种鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的方法，其特征在于包括如下步骤：提取水稻材料的总DNA；以提取的总DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增；分析PCR扩增结果，若两个材料的扩增带型完全一致，则其具有相同的细胞质组型，即具有相同的母本来源，否则，其具有不同的细胞质组型，即具有不同的母本来源。

4.根据权利要求3所述的鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的方法，其特征在于：所述的提取水稻材料的总DNA为当水稻生长至两叶一心时，取幼苗提取的总DNA。

5.根据权利要求3所述的鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的方法，其特征在于：所述的PCR扩增的体系为：50ng/μL总DNA1μL，10×PCR buffer2.5μL，25mM MgCl₂1μL，25μM dNTPs1μL，1U/μL Taq酶1μL，5pM的上游引物1μL，5pM的下游引物1μL，去离子无菌水16.5μL；反应混合物用矿物油覆盖。

6.根据权利要求3所述的鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同的方法，其特征在于：所述的PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃1min，52～56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存。

7.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的引物或权利要求3～6任一项所述的方法在鉴定细胞质雄性不育水稻及三系杂交水稻的细胞质组型是否相同中的应用。