KR101076095B1

KR101076095B1 - 대두 계통 ｍｏｎ89788 및 이들의 검출방법들

Info

Publication number: KR101076095B1
Application number: KR1020077030277A
Authority: KR
Inventors: 마리안느 말벤; 제니퍼 리네하트; 낸시 테일러; 엘렌 디킨슨
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2011-10-21
Also published as: KR20080050548A; US20210017535A1; EP1885176A2; US20230159947A1; AU2006252680A2; EP2275561A1; US20120070839A1; NZ563718A; HK1153232A1; US8754289B2; US20190185876A1; WO2006128095A2; RU2007149328A; PH12007502677B1; US20060282915A1; US11390881B2; US7632985B2; US20150113686A1; RU2411720C2; US9944945B2

Abstract

본 발명은 형질전환 계통 MON89788을 포함하는 대두 식물 및 종자, 그리고 이들 계통들에 대해 독특한 DNA 분자에 대해서 제공한다. 본 발명은 또한 시료 내에서 이들 DNA 분자들의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

형질전환 계통 MON89788, 식물, 종자, 검출

Description

대두 계통 ＭＯＮ89788 및 이들의 검출방법들{SOYBEAN EVENT MON89788 AND METHODS FOR DETECTION THEREOF}

발명의 배경

본 출원은 2005년 5월 27일자로 제출된 미국가출원 NO.60/685,584호로부터 우선권을 청구하고, 상기 전체 내용은 참고문헌으로서 본 명세서에 통합되어 있다.

1. 발명의 분야

본 발명은 분명한 MON89788로 지칭된, 새롭고, 특색있는 이식 유전자(transgenic)의 대두 형질전환 계통, 그들로부터 유래된 대두 품종과 식물부분, 종자와 이들의 생산물들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식물부분 추출물 또는 종자추출물에서 MON89788에 대해 특이적인 DNA분자의 존재를 검출하기 위한 평가방법들에 관한 것이다.

2. 관련된 기술의 설명

대두(글리신맥스)는 세계의 수많은 지역들의 중요한 작물이다. 생명공학방법들이 작물의 특성들의 개선과 생산물의 품질개선을 위하여 대두에 적용되어 왔다. 대두 생산에서 중요한 이와 같은 한 가지의 작물특성은 제초제 저항성, 특히, 글리포세이트 제초제에 대한 저항성이다. 제초제 저항성이 있는 대두 계통은 잡초들 관 리를 위하여 유용한 특성일 수 있다.

또한 글리포세이트로서 공지되어 있는 N-포스포노메틸글리신은 식물품종들의 넓은 스펙트럼에 대해 활성도를 갖는 잘 알려진 제초제이다. 글리포세이트는 라운드업^®(MO, St. Louis, 몬산토사)의 활성성분이고, 환경에서는 바람직하게 짧은 반감기를 갖는 안전한 제초제이다. 식물표면에 적용시에는, 글리포세이트는 식물을 통해서 계통적으로 이동한다. 글리포세이트는 방향족 아미노산들의 합성에 있어서 선구물질을 제공하는, 시키믹산 경로의 그것의 억제로 인한 식물독성이 있다. 글리포세이트는 식물들에서 발견된 효소 5-에놀피루빌-3-포스포노시키메이트 신타아제(EPSPS)를 억제시킨다.

글리포세이트 저항성은 글리포세이트에 대해 보다 낮은 친화력을 갖는 EPSPS 변종들의 발현에 의해 이루어 질 수 있으므로, 글리포세이트의 존재하에서는 그들의 촉매활성도를 유지할 수 있다(미국특허 제5,633,435호; 제5,094,945호; 제4,535,060호 및 제6,040,497호). 식물조직에서 글리포세이트를 분해시키는 효소들(미국특허 제5,463,175)은, 또한 글리포세이트에 대한 세포 저항성을 제공할 수 있다. 이러한 유전자들은 글리포세이트에 대해 저항성이 있는 이식 유전자의 작물들의 생산을 위해 사용되고, 이에 의해 글리포세이트는 작물손상을 최소한으로 하는 효과적인 잡초관리를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 글리포세이트 저항성은 옥수수(미국특허 제5,554,798호), 밀(미국특허 제6,689,880호), 목화(미국특허 제6,740,488호), 대두(WO 9200377)과 캐놀라(미국특허출원 제20040018518호)에 유전 학상으로 능숙하게 처리되었다. 상기 글리포세이트 저항성에 대한 형질전환유전자들과 다른 제초제들에 있어서, 저항성에 대한 형질전환유전자들, 예를 들면, 저항성 유전자(bar gene)(Toki 등, 1998; Thompson 등, 1987; 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(DeBlock 등., 1987), 글리포시네이트 제초제에 대한 저항성)는 선택가능한 마커(markers) 또는 스코러블(scorable) 마커로서 또한 유용성이 있고, 다른 생물공학적으로 유용한 특성들과 연관된 식물들의 선택을 위하여 유용한 유전표현형을 제공할 수 있다.

식물들에서 외래유전자들의 발현은 그들의 염색체 위치에 의해 영향을 받거나, 상황에 따라서는 염색질 구조(예를 들면, 이질 염색질), 또는 통합 부위에 인접한 전사조절요소들(예를 들면, 인핸서들)의 근접에 기인하는 것(Weising 등, 1988)으로 알려져 있다. 상기 이유 때문에, 관심있는 도입된 유전자의 적절한 발현에 의해 특징지워지는 계통을 확인하기 위하여 다수의 계통들을 스크리닝할 필요가 종종 있다. 예를 들면, 계통들 중에서 도입된 유전자의 발현수준 내에서 광범위한 변화가 있을 수도 있다는 것이 식물들 및 다른 생물들 내에서 관찰되었다. 발현의 공간적인 패턴 또는 시간적 패턴의 차이들이 또한 있을 수가 있는데, 예를 들면, 도입된 도입 유전자(gene construct) 내에 존재하는 전사조절요소들로부터 기대했던 패턴들에 상응할 수 없는 여러 가지의 식물조직들 내의 형질전환유전자들의 상대적 발현에서 차이가 있다. 상기와 같은 이유 때문에, 수백~수천의 상이한 계통들을 생성하고, 상업적인 목적들을 위한 원하는 형질전환유전자 발현수준들과 패턴들을 갖는 단일계통을 위하여 이들 계통들을 스크리닝처리하는 것이 통상적이다. 원 하는 수준 또는 패턴의 형질전환유전자 발현을 갖는 계통은 종래의 육종법을 사용하는 성적 이계교배에 의해 다른 유전학적 배경들로 형질전환유전자를 유전자이입시키는데 유용하다. 이러한 교배들의 후대 개체는 원래의 형질전환체의 형질전환유전자 발현특성들을 유지시킨다. 상기 전략은 국부적인 재배환경에 잘 적응하는 다수의 변수들의 확실한 유전자 발현을 확인하기 위해 사용된다.

이성 교배의 후대 개체가 관심있는 형질전환유전자들을 포함하는가를 결정짓기 위하여 특별한 계통의 존재를 검출하는 것이 유리할 수 있다. 더구나, 특별한 계통을 검출하기 위한 방법은, 예를 들면, 판매전 승인(pre-market approval)을 필요로 하고, 재조합 작물 식물들로부터 유래된 음식물들을 라벨링하는 규정들을 따르는 데에 유용할 수 있다. 폴리핵산프로브들을 사용하는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 또는 DNA 혼성화와 같은 어떠한 잘 알려진 폴리핵산검출법에 의해 형질전환유전자들의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 검출법들은 주로 프로모터들, 터미네이터들, 마커유전자들 등과 같은, 자주 사용되는 유전학적 요소들에 초점을 맞춘다. 결과적으로, 특히 삽입된 형질전환유전자 DNA에 붙어 있는 염색체 DNA("플랭킹(flanking)" DNA)의 서열이 공지되지 않은 경우에는, 이러한 방법들은 상이한 계통들 사이에서의, 특히 동일한 DNA 구성체를 사용해 생산된 것들을 구별하는 데에는 유용할 수 없다. 계통-중심(event-specific) PCR분석방법이, 예를 들면, Windels 등(1999)에 의해 논의가 되었는데, 이들은 삽입 형질전환유전자와 플랭킹 DNA(flanking DNA) 사이에서 연접(junction)하여 스패닝(spanning)하는 프라이머 셋트를 사용하여, 특히 삽입된 것으로부터 서열을 포함하는 하나의 프라이머와 플 랭킹 DNA로부터 서열을 포함하는 또 하나의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 글리포세이트 저항성 대두 계통 40-3-2를 확인하였다. 이식 유전자의 식물 계통-중심 DNA 검출법들은 미국특허 제6,893,826호; 제6,825,400호; 제6,740,488호; 제6,733,974호 및 제6,689,880호; 제6,900,014호 및 제6,818,807호에 또한 서술되어 있고, 전체로서 본 명세서에서 참고문헌으로서 통합되어 있다.

본 발명은 글리포세이트 저항성 대두 계통 MON89788(또한 MON19788 또는 GM_A19788로 지칭됨)에 관한 것이고, MON89788로부터 유래된 식물과 이들의 후대 개체와 식물조직들에 대한 검출법들에 유용한 이들 대두 식물들에 포함된 DNA 분자들에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 MON89788(또한 MON19788로 지칭된)이라 지칭된 대두 이식 유전자의 계통 및 취득 NO.PTA-6708로서 ATCC(America Type Culture Collection)에 기탁된 대표적인 종자를 갖는 이들의 후대 개체를 제공한다. 본 발명의 다른 관점은 대두 계통 MON89788의 식물세포들 또는 식물의 재생시킬 수 있는 부분들과 종자들이다. 본 발명은, 대두 계통 MON89788의 식물 부분들, 즉 세포, 꽃가루, 배주, 꽃, 발아, 뿌리들, 잎들과 MON89788로부터 유래된 생산물들, 예를 들면, 대두 굵은 가루, 대두 고운 가루와 대두기름을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 한 가지 관점은 대두 계통 MON89788식물 또는 종자 또는 식물 부분 또는 종자로부터 유래된 생산물들로부터 DNA 형질전환유전자/게놈 연접 영역의 존재를 검출하기 위한 방법들과 조성물들을 제공한다. DNA 분자는 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 형질전환유전자/게놈 연접 DNA 분자를 포함하여 제공되고, 여기에서, 상기 연접 분자는 삽입부위 대두 계통 MON89788을 플랭킹하는 대두세포로부터의 게놈DNA와 대두세포의 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA를 포함하는 삽입부위를 스팬(span)한다. 발명의 하나의 관점에서, 이러한 연접 서열들은 각각 SEQ ID NO:9의 누클레오티드인 1093-1113 또는 5396-5416을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다. 본 발명의 다른 관점에서, 상기 연접은 플랭킹 게놈과 형질전환유전자의 추가적인 부분들을 포함하는 것으로 정의될 수 있고, 예를 들면, SEQ ID NO:9의 누클레오티드인 1073-1113, 1043-1113, 1093-1133, 1093-1163, 1043-1163, 5376-5416, 5346-5416, 5396-5436, 5396-5416, 5396-5466, 또는 5346-5466에 의해 제공된 것으로 하나 또는 그 이상의 서열을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다. 따라서 이들 서열들을 포함하는 이러한 서열들과 식물들과 종자들은 본 발명의 하나의 관점을 형성한다.

신규의 DNA 분자는 대두 계통 MON89788로부터 DNA 형질전환유전자/게놈 영역 SEQ ID NO:3 또는 이들의 상보체인 것으로 제공된다. 그것의 게놈 내에서 SEQ ID NO:3을 포함하는 대두 식물과 종자는 본 발명의 하나의 관점이다. SEQ ID NO:3은 전체로서 SEQ ID NO:1을 더 포함한다.

본 발명의 다른 관점에 따라, DNA 분자는 DNA 형질전환유전자/게놈 영역 SEQ ID NO:4, 또는 이들의 상보체인 것으로서 제공되고, 여기에서 상기 DNA 분자는 대두 계통 MON89788에서 신규이다. 그것의 게놈 내에 SEQ ID NO:4를 포함하는 대두 식물과 종자는 본 발명의 하나의 관점이다. SEQ ID NO:4는 전체로서 SEQ ID NO:2를 더 포함한다.

본 발명의 다른 관점에 따라, 두 개의 핵산분자들이 DNA 검출법에 사용하기 위해 제공되고, 여기에서 제1 핵산분자는 SEQ ID NO:3의 DNA 분자의 형질전환유전자 영역의 어떤 부분의 적어도 11 또는 그 이상의 연속 폴리누클레오티드들을 포함하고, 그리고 제2 핵산은 SEQ ID NO:3의 5'플랭킹 대두 게놈 DNA 영역의 어떤 부분의 유사한 길이의 분자이고, 여기에서, 이러한 핵산분자들은 함께 사용시에는 증폭산물을 생성하는 DNA 증폭법에서 프라이머로서 유용하다. DNA 증폭법에서 이들 프라이머들을 사용해 생성된 증폭산물은 대두 계통 MON89788 DNA를 위한 진단용이다. SEQ ID NO:1을 포함하는 SEQ ID NO:3의 일부분에 대해 상동이거나 또는 상보되는 상술한 프라이머들에 의해 생성된 증폭산물은 본 발명의 하나의 관점이다.

본 발명의 다른 관점에 따라, 두 개의 핵산분자들은 DNA 검출법에 사용하기 위해 제공되고, 여기에서 제1 핵산분자는 SEQ ID NO:4의 DNA 분자의 형질전환유전자들 영역의 어떤 부분의 적어도 11 또는 그 이상의 연속 폴리누클레오티드들을 포함하고, 그리고 제2 핵산은 SEQ ID NO:4의 3'-플랭킹 대두 게놈 DNA의 어떤 부분의 유사한 길이의 분자이고, 여기에서 이들 핵산분자들은 함께 사용시에는 증폭산물을 생성하는 DNA 증폭법에서 프라이머로 유용하다. DNA 증폭법에서 이들 프라이머들을 사용해 생성된 증폭산물은 대두 계통 MON89788 DNA를 위한 진단용이다. SEQ ID NO:2를 포함하는 SEQ ID NO:4의 일부분에 대해 상동이거나 또는 상보적인 상술한 프라이머들에 의해 생성된 증폭산물은 본 발명의 하나의 관점이다.

SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4, 또는 SEQ ID NO:9 또는 이들의 상보체들로부터 유래된 어떤 핵산프라이머 쌍은, DNA 증폭반응에 사용시에 각각 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:9의 어떤 부분을 포함하는 증폭산물과 같은, 대두 계통 MON89788-유래된 조직에 대한 진단용 증폭산물을 생성하고, 이는 본 발명의 다른 구체예이다. 특별한 구체예에서, 상기 프라이머 쌍은 프라이머A(SEQ ID NO:5)와 프라이머D(SEQ ID NO:8)로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 계통 MON89788을 포함하는 식물 또는 종자로부터 유래된 대두 식물, 또는 종자 또는 생산물이고, 여기에서 대두 식물, 또는 종자 또는 생산물로부터 분리시, 게놈DNA는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함하는 DNA 증폭법으로 증폭산물을 생성한다.

본 발명의 여전히 다른 관점은, MON89788을 포함하는 식물 또는 종자로부터 유래된 대두 식물, 또는 종자 또는 생산물이고, 여기에서 대두 식물 또는 종자 또는 생산물로부터 분리시, 게놈DNA는 DNA 증폭법으로 증폭산물을 생성하고, 여기에서 DNA 프라이머 분자들인, SEQ ID NO:5와 SEQ ID NO:6는 DNA증폭법에서 사용된다.

본 발명의 또 다른 관점은 MON89788을 포함하는 식물 또는 종자로부터 유래된 대두식물, 종자, 생산물 또는 상품들이고, 여기에서 대두식물, 또는 종자 또는 생산물로부터 분리시, 게놈DNA는 DNA 증폭법으로 증폭산물을 생성하고, 여기에서 DNA프라이머 분자들인 SEQ ID NO:7과 SEQ ID NO:8은 DNA 증폭법에서 사용된다. 생산물 또는 상품은 계통 MON89788을 포함하는 대두식물의 다음의 생산물들 중의 하나 또는 그 이상으로부터 유래되거나 또는 포함하는 식품 또는 사료제품을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 레시틴, 지방산들, 글리세롤, 스테롤, 식용기름, 탈지소이플레이크, 탈지 및 구어낸 대두 굵은 가루를 포함하는 대두 굵은 가루, 두유액 커드(curd), 두부, 대두 고운 가루, 대두단백 농축물, 분리된 대두 단백, 가수분해된 식물성 단백, 인조대두단백과 대두단백화이버.

본 발명의 다른 관점에 따라, 시료 내에서 대두 계통 MON89788 DNA에 대해 특별히 대응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 다음의 내용을 포함한다: (a) DNA를 포함하는 시료를 DNA프라이머 쌍과 접촉시키고; (b) 핵산증폭반응을 수행하고, 이에 따라서 증폭산물을 생성하고; 그리고 (c) 증폭산물을 검출하고, 여기에서 상기 증폭산물은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함한다. DNA 증폭법에 사용시에, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함하는 증폭산물을 생성하는 DNA 프라이머 분자를 포함하는 키트는 본 발명의 다른 관점이다.

본 발명의 다른 관점에 따라서, 시료 내에서 대두 계통 MON89788 DNA에 대해 특별히 상응하는 DNA의 존재의 검출법이 제공된다. 이러한 방법은 다음의 내용을 포함한다: (a) DNA를 포함하는 시료를, 대두 계통 MON89788로부터의 게놈DNA와 함께 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화하는 프로브와 접촉시키고, 대조군인 대두 식물 DNA와 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화하지 않는 프로브와 접속시키고; (b) 엄격한 혼성화 조건에서 시료와 프로브를 처리하고; 그리고, (c) 대두 계통 MON89788 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하고, 여기에서 상기 프로브는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함한다. 상기 시료는 대두 계통 MON89788을 포함하는 후대 개체종자, 식물 또는 식물의 일부분을 포함할 수 있거나 또는 MON89788을 포함하는 식물로부터 유래된 다음 생산물들 중의 어떤 것을 포함할 수 있다: 레시틴, 지방산들, 글리세롤, 스테롤, 식용기름, 탈지대두 플레이크, 탈지 및 구어낸 대두 굵은 가루를 포함하는 대두 굵은 가루, 두유액 커드, 두부, 대두 고운 가루, 대두단백 농축물, 분리된 대두단백, 가수분해된 식물성 단백, 인조대두단백과 대두단백 화이버. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 대해 상동이거나 또는 상보적인 DNA 분자를 포함하는 DNA 프로브를 포함하는 키트(kit)는 본 발명의 하나의 관점이다. SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, 또는 SEQ ID NO:20 또는 이들의 상보체들을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 키트, 또한 본 발명의 하나의 관점이다.

본 발명의 다른 관점에 따라, 글리포세이트의 적용에 대해 저항성이 있는 대두식물 생산법이 다음의 (a)(b) 단계를 포함하여 제공된다; (a) 계통 MON89788을 포함하는 제1 어버이 글리포세이트 저항성이 있는 대두식물과 글리포세이트 저항성이 결핍된 제2 어버이 대두식물을 이성 교배시켜, 이에 따라 다수의 후대 개체 식물들을 생산하고; 그리고 (b) 글리포세이트의 적용에 대해 저항성이 있는 후대 개체식물을 선택한다. 육종법들은 대두 계통 MON89788을 포함하는 어버이 식물을 글리포세이트에 대해 또한 저항성이 있는 제2 어버이 대두식물에 교배시키고, 그리고 각각의 어버이에서 발견된 글리포세이트 저항성 표현형과 유전학적으로 연관된 분자마커 DNA에 의해 글리포세이트 저항성이 있는 후대 개체를 선택하는 단계들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 MON89788을 포함하는 대두식물들의 경작지의 잡초를 제어하기 위한 제초법이고, 여기에서 상기 방법은 ATCC 취득 NO.PTA-6708로 기탁된 상기 대표적인 종자인 계통 MON89788을 포함하는 대두 종자로 경작지를 경작하는 것을 포함하고, 상기 종자를 발아시키고, 상기 식물들을 글리포세이트의 효과적인 사용량으로 처리함으로써 상기 경작지에서 잡초성장의 제어를 가능하게 한다.

본 발명의 전술한 내용들과 다른 관점들은 다음의 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 더 명백하게 될 것이다.

도 1. 계통 MON89788을 포함하는 대두식물의 게놈 내에 형질전환유전자의 삽입의 구조를 나타내는 도면이다.

도 2A-2B. 대두로부터의 상업적 제품들의 공정도면이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 글리포세이트 저항성을 제공하는 MON89788로 지칭된 신규한 대두 형질전환 계통에 관한 것이고, 상기 계통을 포함하는 식물들, 식물 일부분들, 종자와 생산물들로부터 생산된 식물 일부와 종자와 생산물들에 관한 것이다. 본 발명은 시료 내에서 MON89788 DNA를 확인하기 위해 여러 가지의 DNA검출법들에 사용될 수 있는 MON89788과 DNA 분자들을 포함하는 대두 세포들의 게놈 내의 신규한 DNA 분자들을 제공한다. 본 발명은 계통 MON89788을 포함하는 식물들을 포함하는 경작지에서 글리포세이트 제초제로 잡초들을 처리함으로써 MON89788을 포함하는 식물들의 경작지에서 잡초들을 제어하는 방법들을 제공한다.

다음의 정의들과 방법들은 본 발명을 보다 잘 정의하기 위해 제공되고, 본 발명의 실시예는 당분야의 당업자들을 안내하기 위해 제공된다. 다른 지시가 없다 면, 용어들은 관련된 기술에서 당업자들에 의해 종래의 관용어법에 따르는 것으로 이해될 수 있다. 분자생물학에서 통상적인 용어들의 정의는 Rieger 등(1991)과 Lewin(1994)에서 또한 발견될 수 있다. 37CFR§1.822에서 설명된 바와 같은 DNA 염기들을 위한 명명법이 사용된다.

여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "대두"는 대두(Glycine max)를 의미하고, 대두와 함께 번식될 수 있는 모든 식물변종들을 포함한다.

여기에서 사용된 용어 "포함하는"은 "포함하나, 이에 제한을 두지는 않는"을 의미한다.

"글리포세이트"는 N-포스포노메틸글리신과 그의 염들을 의미하고, 글리포세이트는 라운드업^®제초제(몬산토사)의 활성성분이다. "글리포세이트 제초제"로 처리는 라운드업^®, 라운드업울트라^®, 라운드업 프로^®제초제 또는 글리포세이트를 포함하는 어떤 다른 제초제 제제로서 처리하는 것을 의미한다. 글리포세이트의 상업적 제제들의 예들은, 글리포세이트의 이소프로필암모늄염으로서 글리포세이트를 포함하는 모든 것인 라운드업^®, 라운드업^®울트라, 라운드업^®울트라맥스, 라운드업^®CT, 라운드업^®엑스트라, 라운드업^®바이액티브, 라운드업^®바이오포스, 로데오^®, 폴라리스^®, 스파크^® 및 아코드^®제초제들로서 몬산토사에 의해 판매된 것들을 포함하고; 라운드업^®웨더맥스(글리포세이트 포타슘염)와 같은 몬산토사에 의해 판매되 는 것들, 글리포세이트의 암모늄으로서 글리포세이트를 포함하는, 라운드업^®드라이와 라이벌^®제초제들과 같은 몬산토사에 의해 판매되는 것들; 글리포세이트의 소듐염으로서 글리포세이트를 포함하는, 라운드업^®지오퍼스와 같은 몬산토사에 의해 판매되는 것;과 글리포세이트의 트리메틸설포니움염으로서 글리포세이트를 포함하는, 터치다운^®제초제와 같은 신젠타 크롭 프로텍션 (Syngenta Crop Protection)에 의해 판매되는 것들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 글리포세이트 제초제 제제들 중의 어떤 것과 계통 MON89788을 포함하는 글리포세이트 저항성의 대두식물들을 포함하는 경작지의 처리는 경작지에서 잡초 성장을 제어할 것이고, MON89788을 포함하는 대두식물들의 성장 또는 수율에는 영향을 미치지 않을 것이다.

형질전환유전자 "계통"은 이종성 DNA로 식물세포들의 형질전환에 의해 생성되고, 예를 들면, 관심있는 형질전환유전자를 포함하는 핵산구성체, 식물의 게놈 내로 형질전환유전자의 삽입의 결과인 식물들의 개체군의 재생과 특별한 게놈 위치 내로의 삽입에 의해 특징지워지는 특정한 식물의 선택이다. 용어 "계통"은 원래의 형질전환체와 이종성 DNA를 포함하는 형질전환체의 후대 개체를 뜻한다. 상기 용어 "계통"은 또한 형질전환체와 이종성 형질전환유전자 DNA와 플랭킹 게놈 DNA를 포함하는 다른 변종 사이의 성적 이계교배에 의해 생성된 후대 개체를 뜻한다. 용어 "계통"은 삽입된 DNA(예를 들면, 원래의 형질전환 및 자가수정으로부터 결과로 얻은 후대 개체)를 포함하는 하나의 양친라인과 삽입된 DNA를 포함하지 않는 하나의 양 친라인의 이성 교배의 결과로서 흥미있는 형질전환유전자를 포함하는 삽입된 DNA를 받는 후대 개체에게 핵이식될 수 있는 삽입된 DNA에 상당히 근접한 플랭킹 게놈 서열과 삽입된 DNA를 포함하는 원래의 형질전환으로부터의 DNA를 의미한다.

글리포세이트 저항성의 대두식물은 MON89788을 포함하는 형질전환유전자 글리포세이트 저항성의 대두식물로부터 성장된 대두식물 또는 글리포세이트 저항성의 유전표현성을 발현하는 그러한 식물의 교배에 의한 후대 개체인 대두식물로 이루어진 제1 양친 대두식물과, 글리포세이트에 대한 저항성이 결핍한 제2 양친 대두식물을 처음에 성적 교배시켜 번식시킬 수 있고, 이에 따라서 다수의 제1후대 개체식물들을 생성시키고; 그 다음에 글리포세이트 제초제의 적용에 저항성이 있는 후대 개체식물을 선택한다. 이 단계들은 제2 양친 대두식물 또는 제3 양친 대두식물에 대한 글리포세이트 저항성의 후대 개체식물의 여교배(back-crossing)를 더 포함할 수 있고; 그 다음에 글리포세이트로 적용에 의해 또는 특성과 연관된 분자마커(molecular makers)들로 동정확인에 의해 후대 개체를 선택하고, 이에 따라, 글리포세이트 제초제의 적용에 저항성이 있는 대두식물을 생산한다. 계통 MON89788에서 형질전환유전자의 삽입의 5'와 3' 부위들에서 동정확인된 연접 DNA 분자들을 포함하는 분자마커들이 사용될 수 있다.

두 가지의 상이한 형질전환유전자 식물들은, 두 개의 독립적으로 격리된, 외생의 형질전환유전자들을 포함하는 후대 개체를 생산하기 위해 교배될 수 있다고 이해되어진다. 상술한 바와 같이, 양친식물에 대한 여교배와 비-형질전환유전자식물로의 이계교배(out-crossing) 또한 영양번식으로서 고찰된다. 상이한 특성들과 작물들에 대해 통상적으로 사용되는 다른 번식방법들의 설명이 몇 가지 참고들 중의 하나에서, 예를 들면, Fehr(1987)에서 찾아볼 수 있다.

"프로브(probe)"는 종래의 검출가능한 라벨 또는 보고 분자(reporter molecule), 예를 들면, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제, 또는 효소가 부착되어 있는 분리된 핵산이다. 이러한 프로브는 표적핵산의 가닥(strand)에 대해 상보적이고, 본 발명의 경우에는, 대두식물 또는 종자로부터이던지 또는 상기 계통으로부터 DNA를 포함하고 있는 식물 또는 종자의 시료 또는 추출물로부터이던지간에 계통 MON89788을 포함하는 대두식물로부터의 게놈 DNA의 가닥에 대해 상보적이다. 본 발명에 따르는 프로브들은 데옥시리보핵산들(deoxyribonucleic acids) 또는 리보핵산들(ribonucleic acids) 뿐만 아니라, 표적 DNA서열에 특별히 결합하는 폴리아미드들과 다른 프로브 물질들을 또한 포함하고, 상기 표적 DNA서열의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.

"프라이머"들은 프라이머와 표적 폴리핵산 가닥 사이에서 혼성체 형성을 위한 핵산 혼성화에 의해 상보적인 표적 폴리핵산 가닥에 어닐링된(annealed) 분리된 폴리핵산들이고, 그 다음에 중합효소, 예를 들면, DNA 중합효소에 의해 표적폴리핵산 가닥을 따라서 연장되었다. 본 발명의 프라이머 쌍들은 표적폴리핵산 분자의 증폭을 위한 이들의 사용, 예를 들면, PCR(중합효소 연쇄반응) 또는 다른 종래의 핵산증폭법들의 사용을 의미한다.

프로브들과 프라이머들은, 대개 길이가 11 폴리누클레오티드 또는 그 이상이고, 바람직하게는 18 폴리누클레오티드 또는 그 이상, 더 바람직하게는 24 폴리누 클레오티드 또는 30폴리누클레오티드 또는 그 이상이다. 이러한 프로브들과 프라이머들은 고도로 엄격한 혼성화 조건하에서 표적분자에 대해 특별히 혼성화 된다. 바람직하게는, 비록 프로브들이 표적서열과는 상이하고, 고도로 엄격한 조건하에서 표적서열에 대해 혼성화 하려는 능력을 보유하고 있지만, 본 발명에 따른 프로브들과 프라이머들은 표적 분자와는 완전한 서열 동일성을 갖고, 종래의 방법들에 의해 디자인될 수 있다.

프로브들과 프라이머들을 제조 및 사용방법들은, 예를 들면, Sambrook 등(1989); Ausubel 등(1992);과 Innis 등(1990)에 서술되어 있다. PCR-프라이머 쌍들(프라이머 셋트)은 프라이머와 같은 바로 그 목적을 위하여 의도된 컴퓨터 프로그램들을 사용해, 공지된 서열로부터 유래될 수 있다(Version 0.5, ⓒ1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

여기에서 개시된 플랭킹 게놈 DNA와 삽입서열들에 기초를 둔 프라이머들과 프로브들은 (SEQ ID NOs:1-4와 9) 확실히 하기 위해 사용될 수 있고, 만일에 필요하다면, 종래의 방법들, 예를 들면, MON89788을 포함하는 종자기탁으로부터 상응하는 DNA분자를 분리시키고, 그러한 분자의 핵산서열을 결정함으로써 개시된 서열들을 교정하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 연관된 DNA분자들은 형질전환유전자 삽입과 게놈 플랭킹 영역을 포함하는 MON89788을 포함하는 세포의 게놈으로부터 분리될 수 있고, 이 분자들의 단편들은 프라이머들 또는 프로브들로써 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 프로브들과 프라이머들은 엄격한 조건하에서 표적 DNA서열로 혼성화된다. 어떤 종래의 핵산 혼성화 또는 증폭방법이 시료 내에서 MON89788계통 으로부터 DNA의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 핵산분자들 또는 이들의 단편들은 어떠한 환경하에서도 다른 핵산분자들로 특별히 혼성화 될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 만일에 두 개의 분자들이 역-평형의, 이중가닥으로 된 핵산구조를 형성할 수 있고, 고도로 엄격한 조건하에서 상기 구조를 유지하기 위한 길이가 충분하다면, 두개의 핵산 분자들은 다른 하나에 특별히 혼성화될 수 있다고 한다. 핵산분자는, 만일 그들이 완전한 상보성을 나타낸다면, 다른 핵산분자의 "상보체"일 수 있다고 한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 분자들은 분자들 중의 하나의 누클레오티드가 다른 누클레오티드에 대해 상보성이 있으면 "완전한 상보성"을 나타낸다고 한다. 두 개 분자들은, 그들이 적어도 종래의 "낮은-엄격도" 조건하에서 다른 하나에 그들이 어닐링하도록 허용하는 충분한 안정성을 갖고 다른 하나에 혼성화될 수 있다면 "최소한도로 상보적인 것" 것이라 한다. 이와 유사하게, 상기 분자들은, 그들이 종래의 "고도로 엄격한" 조건하에서 다른 하나에 그들이 어닐링하도록 허용하는 충분한 안전성을 갖고 다른 하나에 혼성화될 수 있다면 "상보적인 것"이라 한다. 종래의 엄격한 조건들은 Sambrook 등(1989)와 Haymes 등(1985)에 의해 설명되어 있다. 이같은 일탈이 이중가닥으로 된 구조를 형성하기 위한 분자들의 가능성을 완전히 배제하지 않는 한은, 완전한 상보성 일탈이 허용될 수 있다. 프라이머 또는 프로브로서 역할을 하는 핵산분자를 위해, 적용된 특정한 용매와 염농도하에서 안정한 이중가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열에서 오직 충분하게 상보적일 필요가 있다.

여기에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동 서열은 고도의 엄격한 조건하 에서 비교되는 핵산서열의 상보체로 특별히 혼성화 될 수 있는 핵산서열이다. DNA 혼성화를 증진시키는 적절히 엄격한 조건들은, 예를 들면, 약 45℃에서 6.0×염화나트륨/구연산나트륨(SSC), 이어서 50℃에서 2.0×SSC로 세척은 당분야에서 당업자들에게는 공지이거나, 또는 John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6. Current Protocols in Molecular Biology에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 세척단계에서 염농도는 50℃에서 약 2.0×SSC의 낮은 엄격도에서 50℃에서 약 2.0×SSC의 높은 엄격도로부터 선택가능하다. 더욱이 세척단계에서 온도는 실온인 약 22℃에서의 낮은 엄격도에서, 약 65℃에서의 높은 엄격도까지 증가가능하다. 온도와 염농도 양쪽 모두는 가변성이 있을 수 있거나, 또는 나머지 변수를 변경시키면서, 온도 또는 상기 염농도는 항상성이 유지될 수 있다. 바람직한 구체예로, 본 발명의 핵산은 적절히 엄격한 조건하에서, 예를 들면, 약 2.0×SSC 및 65℃에서 SEQ ID NOs:1-4로 나타내는 하나 이상의 핵산분자들, 및 이들의 9 상보체 또는 단편들로 특별히 혼성화 될 것이다. 특별히 바람직한 구체예로, 본 발명의 핵산은 고도로 엄격한 조건하에서 SEQ ID NOs:1-4로 나타내는 하나 이상의 핵산분자들, 및 이들의 9 상보체들 또는 이들의 단편들로 특별히 혼성화 될 것이다. 본 발명의 하나의 관점에서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산분자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2로 나타내는 핵산서열 또는 이들의 상보체들 또는 이들의 단편들을 포함한다. 본 발명의 다른 관점에서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산분자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2로 나타내는 핵산 또는 이들의 상보체들 또는 이들의 단편들에서 80% 및 100%, 또는 90% 및 100% 사이의 서열 유사성을 서로 공유한다. SEQ ID NO:1, 또는 SEQ ID NO:2, 또는 이들의 상보체들 또는 이들의 단편들을 포함하는 분자마커 DNA 분자들은 Cregan 등(1997)에서, 단일서열반복 DNA마커분석을 위해 설명된 상기 방법들과 유사한 유전학적 교배의 후대 개체를 확인하기 위한 식물번식방법들에서 마커들로서 사용될 수 있고; 상기 모든 것이 전체로서, 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다. 표적 DNA분자에 대한 프로브의 혼성화는 당분야에서 당업자들에게 공지된 방법들 중의 어떤 것에 의해 검출가능하고, 형광 택(tags), 방사성 택들, 항체를 기초로 한 택들 및 화학발광성 택들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

특정한 증폭프라이머 쌍을 사용하는 표적핵산서열의 증폭(예를 들면, PCR에 의해)에 있어서, "엄격한 조건들"은 DNA 열증폭반응에서, 증폭산물인 유일한 증폭산물을 바람직하게 생산하고, 상응하는 야생형 서열(또는 그것의 상보체)을 갖는 프라이머가 표적 핵산서열에만 결합되도록 혼성화하기 위한 프라이머 쌍을 허용하는 조건들이다.

용어 "(표적서열)에 대해 특이적"은 표적서열을 포함하는 시료에서, 엄격한 혼성화 조건하에서, 프로브 또는 프라이머가 표적서열에만 혼성화 하는 것을 의미한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "증폭된 DNA" 또는 "증폭산물"은 핵산 주형의 일부분인 표적핵산서열의 핵산증폭의 생산물을 의미한다. 예를 들면, 이성 교배로부터 결과로 얻은 대두식물이 형질전환유전자 계통 MON89788을 포함하는지 또는 경작지로부터 모은 대두샘플이 MON89788을 함유하는지, 또는 대두 굵은 가루, 대두 고운 가루 또는 대두기름과 같은 대두추출물이 MON89788을 포함하는지를 결정하는 것이다. 대두식물 조직샘플로부터 추출된 DNA 또는 추출물은 삽입된 이종성 형질전환유전자 DNA의 삽입부위에 인접한 게놈영역으로부터 유래된 프라이머와 계통 DNA의 존재에 대해 진단용인 증폭산물을 생산하기 위해 삽입된 이종성 형질전환유전자 DNA로부터 유래된 제2의 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하는 핵산증폭법으로 처리될 수 있다. 상기 증폭산물은 일정한 길이를 갖고, 또한 계통에 대한 진단용 서열을 갖는다. 상기 증폭산물은 프라이머 쌍들의 조합된 길이 + 하나의 누클레오티드 염기 쌍, 또는 + 약 50개의 누클레오티드 염기쌍들, 또는 + 약 250개의 누클레오티드 염기쌍들 또는 + 약 350개의 누클레오티드 염기쌍 또는 그 이상의 길이인 범위일 수 있다.

임의적으로, 프라이머 쌍은 완전한 삽입 누클레오티드 서열을 포함하는 증폭산물을 생성하기 위하여 삽입된 DNA의 양측면상에서 플랭킹 게놈서열로부터 유래될 수 있다. 식물게놈서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성(member)은 삽입된 형질전환유전자 DNA분자로부터 일정거리에 위치될 수 있고, 상기 거리는 하나의 누클레오티드 염기쌍으로부터 약 20,000 누클레오티드 염기쌍에 이르는 범위 내일 수 있다. 용어 "증폭산물"의 사용은 DNA 열증폭반응에서 생성될 수 있는 프라이머 이합체들은 특별히 제외한다.

핵산증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 포함하는 당분야에 공지된 여러 가지의 핵산증폭반응법들 중의 어떤 것에 의해 이룰 수 있다. 다양한 증폭법들이 당분야에서 공지이고, interalia, 미국특허 제4,683,195호와 4,683,202와 Innis 등(1990)에 설명되어 있다. PCR 증폭법은 게놈DNA를 최대 22kb로 증폭시키게 개발 되었고, 박테리오파아지 DNA를 최대 42Kb로 증폭시키게 개발되었다(Cheng 등, 1994). DNA 증폭의 당분야에서 공지된 다른 방법들뿐만 아니라 이들 방법들도 본 발명의 실시예에 사용될 수 있다. 이종성 DNA 삽입의 서열 또는 대두 계통 MON89788로부터의 플랭킹 서열은 입증될 수 있고, 필요하다면, 여기에서 제공된 서열들로부터 유래된 프라이머들을 사용하여 계통 게놈으로부터 이러한 분자들을 증폭시키고 이어서 PCR 증폭산물 또는 분리되고 클로닝된 형질전환유전자/게놈 DNA에 표준 DNA 서열방법을 적용시킴으로써 교정될 수 있다.

이들 방법들에 의해 생성된 상기 증폭산물은 다수의 기술들에 의해 검출될 수 있다. 그러한 방법 중 한 가지는 Genetic Bit Analysis(Nikiforov, 등, 1994)이고, 여기에서 DNA 올리고누클레오티드는 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 형질전환유전자 서열 양쪽 모두를 겹치도록 디자인된다. 상기 올리고누클레오티드는 마이크로 웰 플레이트의 웰(well)들 내에서 고정화된다. 다음에 관심 있는 영역의 PCR(삽입된 서열에서 하나의 프라이머 사용과 인접한 플랭킹 게놈서열에서 하나의 프라이머 사용)은, 단일-가닥 PCR 생산물이 고정화된 올리고 누클레오티드로 혼성화될 수 있고, DNA 폴리머라제를 사용하여 단일염기확장반응에 대한 템플레이트로서 역할을 하고, 기대되는 다음 염기에 대해 특이적인 ddNTPs로 라벨링될 수 있다. 정보판독은 형광성 또는 ELISA-based로 가능하다. 시그널은 성공적인 증폭, 혼성화와 단일 염기확장으로 인해 삽입/플랭킹 게놈 서열의 존재를 나타낸다.

다른 방법은, Winge(2000)에 의해 설명된 바와 같이, 파이로씨퀀씽(Pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서, 올리고누클레오티드는 인접한 게놈 DNA와 삽입 DNA 연접을 겹치도록 디자인된다. 상기 올리고누클레오티드는 관심 있는 영역으로부터 단일-가닥 PCR 생산물로 혼성화되고(삽입된 서열에서 하나의 프라이머, 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나의 프라이머), DNA 폴리머라제, ATP, 설퍼릴라제, 루씨페라제, 아피라제, 아데노신 5', 포스포설페이트와 루씨페린의 존재 하에서 배양된다. DNTPs들은 개별적으로 첨가되고, 측정된 광시그널에서 도입된 결과이다. 광시그널은 성공적인 증폭, 혼성화와 단일 또는 다-염기 확장으로 인해 형질전환유전자 삽입/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.

Chen 등(1999)에 의해 설명된 바와 같이, 형광분극은 본 발명의 증폭산물을 검출하는데에 사용될 수 있는 방법이다. 상기 방법을 사용하여, 올리고누클레오티드는 게놈 플랭킹과 삽입된 DNA 연접이 겹쳐지도록 디자인된다. 상기 올리고누클레오티드는 관심 있는 영역으로부터 단일 가닥으로 된 PCR 생산물로 혼성화되고(삽입된 DNA 내에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서의 하나의 프라이머), DNA 폴리머라제와 형광-라벨링된 ddNTP의 존재 하에서 배양되었다. 단일 염기 확장은 ddNTP의 도입의 결과를 가져온다. 도입은 형광계를 사용하여 분극의 변화로서 측정가능하다. 분극의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화와 단일 염기 확장으로 인해 형질전환유전자 삽입/플랭킹 게놈서열의 존재를 나타낸다.

Tagman®(PE Applied Biosystem, Foster City, CA)은 DNA서열의 존재를 검출하고 정량하는 방법에 대해 설명하였고, 이는 제조자에 의해 제공된 사용설명서에서 완전히 이해되었다. 간단하게, FRET 올리고누클레오티드 프로브는 게놈 플랭킹과 삽입 DNA 연접을 오버랩하도록 디자인된다. 상기 FRET 프로브와 PCR 프라이 머들은(삽입 DNA 서열 내에서 하나의 프라이머와 플랭킹 게놈 서열 내에서 하나의 프라이머) 열 안정성 폴리미라제와 dNTPs의 존재 하에서 순환된다. 상기 FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브상에서 퀀칭 부분(quenching moiety)으로부터 멀리 떨어진 형광부분의 분해와 방출의 결과를 나타낸다. 형광 시그널은 성공적인 증폭과 혼성화로 인해 플랭킹 게놈/형질전환유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.

분자표지체(molecular Beacons)는 Tyangi 등(1996)에 설명된 바와 같이 서열검출에 사용에 대해서 서술되어 있다. 간단히, FRET 올리고누클레오티드 프로브는 플랭킹 게놈과 삽입 DNA 연접을 오버랩하도록 디자인되어 있다. 상기 FRET 프로브의 유일한 구조는 그것이 매우 근접하게 형광성 부분과 퀀칭 부분을 유지시키는 2차 구조를 포함하는 결과를 나타낸다. 상기 FRET 프로브와 PCR 프라이머(삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머와 플랭킹 게놈서열에서 하나의 프라이머)는 열안정성 폴리머라제와 dNTPs의 존재 하에서 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 다음에, 표적서열에 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거와 형광 및 냉각 부분들의 공간적 분리의 결과를 나타낸다. 형광성 시그널은 성공적인 증폭과 혼성화로 인해 플랭킹 게놈/형질전환유전자 삽입서열의 존재를 나타낸다.

microfluidics(미국특허공보 2006068398, 미국특허 제6,544,734호)와 같은 다른 서술된 방법들은, DNA 시료들을 분리하고 증폭시키기 위한 방법들과 장치들을 제공한다. 광학 염료들은 특이적 DNA 분자들을 검출하고 정량하는데 사용되었다(WO/05017181). DNA 분자들의 검출을 위한 전자센서 또는 특이적인 DNA 분자들을 결합하고, 그런 다음, 검출될 수 있는 나노비드들(nanobeads)을 포함하는 나노튜브 장치들(WO/06024023)은 본 발명의 DNA 분자들을 검출하는데에 유용하다.

DNA 검출키트들은, 여기에서 개시된 조성물들과 DNA 검출의 당분야에서 설명되거나 또는 공지된 방법들을 사용하여 개발될 수 있다. 상기 키트들은 시료에서 대두 계통 DNA를 확인하는데 유용하고, DNA를 포함하는 대두 식물들을 육종법에 적용할 수 있다. 상기 키트들은, SEQ ID NOS:1-4 및 9에 대해 상동이거나 또는 상보적인 DNA 프라이머들 또는 프로브들, 또는 DNA의 형질전환유전자의 유전학적 요소에 포함되는 DNA에 대해 상동이거나 또는 상보적인 DNA 프라이머들 또는 프로브들을 포함할 수 있고, 이러한 DNA 서열은, DNA 증폭 반응에서 사용될 수 있거나, 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 대두 게놈에 포함되고, 도면 1에 예시된 형질전환유전자의 유전학적 요소의 상기 DNA의 상기 구조는, 상기 형질전환유전자 삽입을 플랭킹하는 상기 대두 A3244 게놈의 5'게놈의 영역을 포함하고, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터 RB(right border)영역의 일부분, 상기 키메릭(Chimeric) 프로모터 FMV/Tsf1 및 관련된 연결된 요소들(US 특허 6,660,911:또한 FMV/E1F1α로 지칭됨)을 포함하는 상기 삽입은 아라비돕시스(Arabidopsis) EPSPS 클로로플라스트 수송 펩티드 코딩서열에 사용가능하게 연결되어 있고(여기에서는, CTP2 또는 TS-AtEPSPS CTP2로 지칭됨, 미국특허 제5,633,435호), 글리포세이트 저항성 EPSPS에 사용가능하게 연결되어 있고(여기에서는 CP4 EPSPS 또는 aroA:CP4로 지칭됨, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 CP4와 식물세포들 내에서 향상된 발현에 대하여 변경된 코딩서열로부터 분리됨, 미국특허 제5,633,435호), 완두 리블로오스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제로부터 3' 발단 영역(여기에서 E9 3' 또는 T-Ps.RbcS:E9, Coruzzi 등(1984)), 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 LB(left border) 영역의 부분과 형질전환유전자 삽입을 플랭킹하는 대두 A3244 게놈의 3'-게놈영역에 사용가능하게 연결되어 있다. DNA 증폭법들에서 프라이머들로서 유용한 DNA 분자들은 대두 계통 MON89788에 포함된 형질전환유전자 삽입의 유전학적 요소들의 서열로부터 유래될 수 있다. 이들 프라이머 분자들은 형질전환유전자 삽입을 플랭킹하는 대두의 게놈으로부터 유래된 DNA 프라이머 분자를 또한 포함하는 프라이머 셋트의 일부로서 사용가능하다. 대두 계통 MOV89788은 아그로박테리움 매개된 방법, 예를 들면, 미국특허 6,384,301과 7,002,058(여기에서 전체로서 참고문헌에 의해 통합됨)에 서술된 방법들에 의해 대두 라인 A3244(미국특허 5,659,114)의 형질전환에 의해 생성되었다.

본 발명의 발명자들은, 대두 라인의 게놈 내에 MON89788 T-타입 게놈영역(T-타입은 형질전환유전자와 식물게놈의 연관된 단형영역의 컴비네이숀이다)을 포함하는 대두 라인은 이전의 40-3-2 T-타입 게놈영역을 포함하는 라인에 비하여 개선된 수율을 갖는다는 것을 발견하였다. 이는 미국 내에서 다수의 장소들로부터 수집된 수확데이타를 포함하는 반복된 현장 실험들로 예시된다(미국특허 출원 60/685584).

다음의 실시예들은 본 발명의 특정한 바람직한 구체예들의 실시예를 예시하기 위해 포함된다. 실시예들에 개시된 기술들은, 발명자들이 발명의 실시에 있어서 기능을 잘하고 있는 것으로 알고 있는 접근방법들에 따르고, 이를 나타내고 그리고, 따라서 발명의 실시를 위하여 바람직한 방법들의 실시예들을 구성할 것으로 고려될 수 있음을 당업자들은 이해해야만 한다. 그러나, 개시된 것에서, 당분야의 당 업자들은, 개시되고 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고도 비슷하거나 또는 유사한 결과를 여전히 얻는 특별한 구체예들에서 수많은 변화들이 이루어질 수 있다는 사실을 알아야만 한다.

실시예 1

MON89788 게놈 DNA 에 대한 진단용 증폭산물의 제조

형질전환유전자 대두 계통 MON89788로부터의 DNA는 대두종자들, 영양 조직, 또는 대두 굵은 가루를 포함하는 조직으로부터 추출된다. 상기 DNA는 제조자의 지시서에 따라서 Qiagen's DNeasy Plant Miniprep 키트를 사용하여 조직으로부터 분리된다(CA, Valencia, Qiagun Corp.).

PCR 생산물은 MON89788을 포함하는 식물의 게놈 내에서 T-DNA(형질전환유전자를 포함하는 전이 DNA)삽입의 5' 말단을 플랭킹하는 게놈 DNA의 일부분을 포함하는 것으로 생산된다. 상기 DNA 생산물은 SEQ ID NO:3을 포함한다. 상기 PCR은 형질전환유전자 프로모터 영역 내에(여기에서 참고문헌으로 통합된 미국특허 6,660,911, SEQ ID NO:28과 SEQ ID NO:9에서 발견됨) 위치하는 제2의 프라이머(DNA 프라이머 B, SEQ ID NO:6)로서 한쌍을 이룬 형질전환유전자 삽입의 5' 말단(DNA 프라이머A, SEQ ID NO:5, 도면1 참조)을 플랭킹하는 게놈 DNA 서열들에 혼성화시키기 위해 디자인된 하나의 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.

PCR 생산물은 MON89788을 포함하는 식물의 게놈 내에서 T-DNA 삽입의 3' 말단을 플랭킹하는 게놈 DNA의 일부분을 포함하는 형질전환유전자 삽입의 3' 말단으 로부터 생산된다. 상기 DNA 생산물은 SEQ ID NO:4를 포함한다. PCR은 각각 계통(DNA 프라이머 D, SEQ ID NO:8)의 삽입의 3'말단을 플랭킹하는 게놈 DNA 서열들에 혼성화시키기 위해 디자인된 하나의 프라이머를 사용해 수행될 수 있고, 삽입의 3' 말단에서 T-Ps.RbcS:E9 3' 전사 종결서열 내에 위치한 제2의 프라이머(DNA 프라이머C, SEQ ID NO:7)로 한쌍이 이루어질 수 있다.

상기 PCR 주형(template)은 ~50ng의 게놈 DNA를 포함한다. 음성대조군으로서 비-형질전환유전자 대두 품종으로부터의 ~50ng의 게놈 DNA가 사용된다. 각각의 PCR 반응은 50㎕의 전체 부피반응에서, REDAccuTag^TM LA DNA 폴리머라제 믹스(Polymerase Mix)(MO, St Louis, 시그마알드리치)용 5㎕ 10×버퍼, 200μM 각각의 dNTP(시그마-알드리치), 0.4μM 각각의 프라이머, 그리고 2.5 Units jumpStart^TM RED Tag^TM DNA 폴리머라제(시그마알드리치)를 포함한다. 상기 PCR 반응들은 다음의 사이클링 조건 하에서 수행된다: 94℃에서 3분 동안 1 싸이클; 94℃에서 30초 동안, 58℃에서 30초 동안, 72℃에서 30초 또는 1분 동안 32 또는 35 사이클; 72℃에서 10분 동안 1 싸이클.

DNA 계통 프라이머 쌍들은 MON89788 게놈 DNA에 대한 진단용 증폭산물을 생산하기 위해 사용된다. 이들 계통 프라이머 쌍들은, 프라이머들 A와 B(SEQ ID NO:5와 6)와 계통 프라이머쌍들 C와 D(SEQ ID NO:7과 8)를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 상술된 DNA 증폭법에 사용된다. 각각 대두 MON89788 계통-유래된 조직에 대한 진단용 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함하는 증폭산물을 생성하는 DNA 증폭산 물 반응에 사용될 때, 이들 프라이머 쌍들 이외에도, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4, 또는 이들의 상보체로부터 유래된 어떤 프라이머 쌍이, 사용될 수 있다. 표 1과 표 2에 예시된 DNA 증폭조건들은 적절한 계통 프라이머 쌍들을 사용하여 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하는데 사용될 수 있다. MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하기 위해 사용된 이들의 방법들 중의 어떤 개선법들도 당분야에서 통상의 기술범위 내에 속한다. MON89788을 포함하는 대두식물 또는 종자의 DNA를 포함하는 것으로 추정되는 추출물 또는 MON89788을 포함하는 식물로부터 유래된 제품은, DNA 증폭법으로 테스트 시에, MON89788의 존재 여부를 결정하기 위한 증폭용 템플레이트로서 이용될 수 있는 대두 계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산한다.

계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하는 PCR법에 사용시에, 상기 증폭산물은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4로부터 유래된 적어도 하나의 프라이머 서열의 사용에 의해 생산된다. 예를 들면, MON89788 증폭산물들의 생산은 표 2에 나타낸 바와 같이, Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, 또는 Eppendort Mastercycler Gradient thesmocycler를 사용해 수행될 수 있거나 또는 당분야에서 당업자들에 공지된 방법들과 장치들에 의해 수행될 수 있다.

표 1. 대두 MON89788 5' 형질전환유전자 삽입/게놈연접영역의 확인을 위한 PCR 공정과 반응혼합 조건들

적당히 혼합하고, 만일에 필요하면(유전자증폭장치 상에서 핫탑(hot top)이 없음), 각각 반응액의 상부에 미네랄오일 1~2 방울을 첨가한다. 다음의 사이클링 파라미터들(표 2)을 사용하여 Stratagene Robocycler(CA, La Jolla, Stratagene), MJ Engine(CA, Hercules, MJR-Biorad), Perkin-Elmer 9700(MA, Boston, Perkin Elmer), 또는 Eppendorf Mastercycler Gradient(Germany, Hamburg, Eppendort) 유전자증폭장치 내에서 PCR을 계속 진행한다. MJ Engine 또는 Eppendort Mastercycler Gradient 유전자증폭장치는 계산된 방법에 따라서 진행되어야만 한 다. 최대로 고정된 램프속도로 Perkin Elmer 9700 유전자증폭장치를 진행시켰다.

표 2. 유전자증폭장치 조건들

실시예 2

형질전환유전자/게놈영역의 서열결정과 서던( southern ) 분석

PCR 생산물들의 DNA 서열화는 MON89788을 포함하는 대두 식물들 또는 종자를 확인하기 위한 프라이머들과 프로브들로서 추가의 DNA 분자들을 디자인하기 위해 사용될 수 있는 DNA에 대해서 제공된다. 5'와 3' 형질전환유전자/게놈서열들을 나타내는 예상되는 크기의 PCR 생산물들을 전기영동(법)에 의해 2.0% 아가로즈겔 상에서 PCR 생산물들의 분리에 의해 분리하였다. PCR 생산물들은 대두 게놈 내로 형질전환유전자 삽입 사이에서 삽입 연접을 스판(span)하는 5'와 3' DNA 영역들을 포함하고 분리되었다. MON89788에 대한 5'과 3' PCR 생산물들을 아가로즈겔 전기영동에 의해 정제하였고, 그 다음에 QIAquick Gel 추출키트(CA, Valencia, Qiagen Inc, 카탈로그 #28704)를 사용하여 아가로즈 매트릭스로부터 분리하였다. 그 다음에 정 제된 PCR 생산물들을 서열화하였고(예를 들면, CA, Foster City, PE 바이오시스템스, ABI 프리즘^TM 377), 분석하였다(예를 들면, WI, Madison, DNASTAR, Inc, DNASTAR 서열분석 소프트웨어)

DNA 서열은, 도면 1에 예시된 바와 같이, 계통 MON89788의 형질전환유전자/게놈영역을 나타내는 뉴클레오티디 염기쌍 세그멘트에 대해서 결정되었고, SEQ ID NO:9로 확인되었다. SEQ ID NO:9에 포함된 상기 게놈 및 형질전환유전자 요소들은 표3에 설명되어 있다. 상기 5'와 3' 플랭킹 영역들은 SEQ ID NO:9에 포함되어 있고, SEQ ID NOs:21 및 22에 제공되어 있다.

상기 연접 서열은, 새로운 DNA 서열이고, 폴리핵산 검출 분석에서 검출시 MON89788 DNA에 대해 진단용인 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드분자이다. SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2내의 연접 서열들은 MON89788 내에서 형질전환유전자 단편과 대두 게놈 DNA의 삽입부위의 각각의 측면상에 10 폴리누클레오티드를 나타낸다. 더 길거나 또는 더 짧은 폴리 누클레오티드 연접 서열들은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4로부터 선택가능하다. 상기 연접 분자들(5' 연접영역 SEQ ID NO:1과 3' 연접영역 SEQ ID NO:2)은 DNA 검출에 대한 방법들에서 DNA 프로브 또는 DNA 프라이머 분자들로서 유용하다.

계통 특이적인 DNA 분자들의 검출용 Taqman^®법에 사용된 프라이머들과 프로브들(CA, Pleasanton, Roche Molecular Systems, Inc)은 계통 MON89788에 대하여 개발되었다. 상기 프라이머 분자들은 SQ2824(SEQ ID NO:10), SQ2826(SEQ ID NO:11), SQ1141(SEQ ID NO:12), SQ1142(SEQ ID NO:13), SQ5543(SEQ ID NO:14)로 지칭되고, 프로브분자들은 PB871-6FAM(SEQ ID NO:15), PB2191-VIC(SEQ ID NO:16)과 PB57-VIC(SEQ ID NO:17)로 지칭된다. 상기 프라이머들과 프로브들은 MON89788을 포함하는 DNA에 대한 진단용 증폭산물을 제공하기 위해 제조자 지침서에 따르는 Taqman®법을 사용하였다. 가공처리된 제품들, 예를 들면, 굵은 가루들을 포함하는 대두 조직들은 상기 방법에 있어서 DNA의 유용한 소스들(sources)이다. 대두 굵은 가루로부터 증폭산물을 생산하기 위해 사용되는 추가의 프라이머들은 SEQ ID NOs:18-20을 포함한다.

표 3. MON89788을 포함하는 대두의 게놈에서 포함되는 형질전환유전자/게놈 DNA 단편(SEQ ID NO:9)의 게놈 및 유전학적 요소 주석

서던 블롯 분석( southern Blot Analysis )

MON89788을 포함하는 식물로부터의 게놈 DNA와 대조군인 대두 게놈 DNA(각각 ~ 15㎍)를 상응하는 15㎕의 제조자의 완충액(MA, Beverly, NEB)을 포함하는 150㎕의 전체 부피 내에서 여러가지의 제한효소(140U)로 소화(digest)시켰다. 제한 엔도뉴클레아제들, 예를 들면, Bg111, BamH1, NCo1, Hind111 및 Bc11를 MON89788의 서던 분석에 사용하였다. 엔도뉴클레아제 소화를 적어도 6시간 동안 적절한 온도에서 수행하였다. 배양 후에, 상기 DNA를 3M 소듐아세테이트(sodium acetate) 및 에탄올 2.5 부피로 침전시켰다. 이어서, 상기 DNA를 70% 에탄올로 씻고, 건조시키고, 40㎕의 TBE 내에서 재현탁시켰다. 시료들에 로딩된 완충액(0.2×)을 더 추가하고, 그 다음에 30볼트에서 16~18시간 동안 아가로즈겔 상에서(0.8%) 전기영동으로 처리하였다. 상기 겔들을 에티디움-브로마이드로 염색시킨 다음에, 10분 동안 depurination 용액(0.125N HCL)으로 처리하고, 30분간 변성액(0.5M 수산화나트륨, 1.5M 염화나트륨)으로 처리하고, 30분간 중성용액(0.5M 트리즈마 염기, 1.5M 염화나트륨)으로 처리하였다. 상기 DNA는 4~6시간 동안 터보블롯터(Turboblotter)(Germany, Dassel, Schleicher and Schuell)를 사용하여 Hyboard-N 멤브레인(England, Buckingamshire, Amersham Pharmacia Biotech)으로 전이시키고, 그 다음에 UV 광선을 사용하여 멤브레인에 고정시켰다.

멤브레인들을 45℃에서 2~4시간 동안 DIG Easy Hyb 용액(IN, IndianaPolis, Roche Molecular Biochemicals:Cat. #1603558) 20㎖로 사전혼성화시켰다. SEQ ID NO:1, 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4, 또는 이들의 일부분에 대해 상동이거나 또는 상보적인, 방사능이 있는 DNA 프로브들(³²P dcTP)을 Radprime DNA 라벨링 키트(CA, Corlsbad, 인비트로겐: cat. #18428-011)를 사용하여 만들었다. 혼합되지 않은 누클레오티드들을 세파덱스 G-50 컬럼(인비트로겐)을 사용하여 제거하였다. 사전 혼성화용액을 ㎖당 1 밀리온 카운트의 최종 농도로 변성된 프로브를 포함하는 사전에 예열된 DICT EASY Hyb 용액 10㎖로 대체하였다. 상 기 블롯은 45℃에서 16~18 시간 동안 혼성화시켰다.

블롯(blots)을 45℃에서 저엄(low stringency) 용액(5×SSC, 0.1×SDS)으로 세척하고, 그 다음에 65℃에서 고엄(higher stringency)용액(0.1×SSC, 0.1% SDS)로 반복세척했다. 블롯을 >2시간 동안 포스포르 스크린(NJ, Piscataway, Amersham Bioscienses)에 노출시키고, 노출을 Data Strom 860 기계(Amersham Biosciences)을 사용해 읽었다. 예시된 이들 방법들과 조건들은 시료에서 DNA를 검출하는 당분야에서 당업자들에 의해 변경될 수 있다.

실시예 3

잡초제초

MON89788을 포함하는 대두의 경작지에서 잡초들의 성장 제어하기. 경작지를 MON89788을 포함하는 대두 종자들로서 파종하였고, 상기 종자들은 묘목들로 발아시키고, 묘목들의 경작지는 글리포세이트를 포함하는 제초제 제제들로 제초처리하였다. 약 0.25 lb ae/A~3 또는 그 이상의 lb ae/A(글리포세이트산 당량의 파운드/에이커) 처리비율로 글리포세이트 형성의 유효량을 경작지에 적용시켰다. 자주 적용되는 비율은, 경작지내에서 잡초들의 성장을 조절하기 위해 필요에 따라서 성장계적 동안에 한번 또는 그 이상의 처리를 1회당 약 0.75lb ae/A~1.5 lbae/A에 이르는 범위 내로 한다.

MON89788을 포함하는 식물들로부터의 종자들을 상기 처리된 식물들로부터 수확하였다.

상기에서 개시되고, 특허 청구항들에서 언급된 계통 MON89788을 대표로 하는 대두 종자인 몬산토 기술 LLC의 기탁은 ATTC(American Type Culture Collection), 20110, Va, Mauassas, 10801 Boulevard 대학교와 함께 부다페스트 조약에 따라서 만들어졌다. 계통 MON89788(또한 MON 19788 또는 GM_A19788로 공지된)을 포함하는 기탁을 위한 상기 ATCC 취득번호는 PTA-6708이고, 2005년 5월 11일자로 기탁되었다. 상기 기탁은 30년 기간 동안 또는 마지막 요구 후에는 5년 동안 기탁이 유지될 것이거나, 또는 본 특허의 효과적인 수명에 있어서 더 길어질 수 있고, 그 기간 동안 필요에 따라서 대체될 수 있다.

본 발명의 원리들을 예시하였고 설명하였으므로, 그러한 원리들을 벗어나지 않고 배치와 상세내용에 있어서 본 발명이 변경될 수 있음을 당업자들에게는 분명히 해야 한다. 따라서 우리는 첨부된 특허 청구범위들의 정신과 범위 내에 속하는 모든 변형들 모두를 특허청구한다.

각각의 개별적인 간행물 또는 특허출원이 참고문헌으로 통합되도록 상세하고, 개별적으로 나타낸다면, 상기 명세서에서 인용된 모든 간행물들과 공고된 특허문서들은 동일한 범위내에서 참고문헌으로 여기에서 통합되어 있다.

참고문헌

다음의 참고문헌은 본 명세서에 개시된 과정 또는 기타 상세 보충사항에 대하여 표본적 예제를 제공하는 점에서 참고문헌으로서 여기에 상세하게 통합되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Malven, Marianne Rinehart, Jennifer Taylor, Nancy Dickinson, Ellen <120> SOYBEAN EVENT MON89788 AND METHODS FOR DETECTION THEREOF <130> MONS:113WO <140> UNKNOWN <141> 2006-05-26 <150> 60/685,584 <150> 2005-05-27 <160> 22 <170> 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> chimeric molecule of soybean genome and transgene <400> 1 tatcaagctc caaacactga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> chimeric molecule of soybean genomic sequence and transgene <400> 2 taataacgct cagactctag 20 <210> 3 <211> 1222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1222) <223> chimeric molecule of soybean genomic DNA and transgene insert <400> 3 cctgtacttc ccaaaacttc gcttccctga cccatcatat ccaggactgg acgattggct 60 tgattgatac cagatgggtg agtcgagtcc acctcggtag cggcatttat ggcaacgatt 120 gcagccacgt tgacctccat cattttttct catgctcatc atggcctcca 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caatttttgt ggtagaaatc ggtttgactc cgatagcggc tttttactat 2820 gattgttttg tgttaaagat gattttcata atggttatat atgtctactg tttttattga 2880 ttcaatattt gattgttctt ttttttgcag atttgttgac cagagatcta ccatggcgca 2940 agttagcaga atctgcaatg gtgtgcagaa cccatctctt atctccaatc tctcgaaatc 3000 cagtcaacgc aaatctccct tatcggtttc tctgaagacg cagcagcatc cacgagctta 3060 tccgatttcg tcgtcgtggg gattgaagaa gagtgggatg acgttaattg gctctgagct 3120 tcgtcctctt aaggtcatgt cttctgtttc cacggcgtgc atgcttcacg gtgcaagcag 3180 ccgtccagca actgctcgta agtcctctgg tctttctgga accgtccgta ttccaggtga 3240 caagtctatc tcccacaggt ccttcatgtt tggaggtctc gctagcggtg aaactcgtat 3300 caccggtctt ttggaaggtg aagatgttat caacactggt aaggctatgc aagctatggg 3360 tgccagaatc cgtaaggaag gtgatacttg gatcattgat ggtgttggta acggtggact 3420 ccttgctcct gaggctcctc tcgatttcgg taacgctgca actggttgcc gtttgactat 3480 gggtcttgtt ggtgtttacg atttcgatag cactttcatt ggtgacgctt ctctcactaa 3540 gcgtccaatg ggtcgtgtgt tgaacccact tcgcgaaatg ggtgtgcagg tgaagtctga 3600 agacggtgat cgtcttccag ttaccttgcg tggaccaaag actccaacgc caatcaccta 3660 cagggtacct atggcttccg ctcaagtgaa gtccgctgtt ctgcttgctg gtctcaacac 3720 cccaggtatc accactgtta tcgagccaat catgactcgt gaccacactg aaaagatgct 3780 tcaaggtttt ggtgctaacc ttaccgttga gactgatgct gacggtgtgc gtaccatccg 3840 tcttgaaggt cgtggtaagc tcaccggtca agtgattgat gttccaggtg atccatcctc 3900 tactgctttc ccattggttg ctgccttgct tgttccaggt tccgacgtca ccatccttaa 3960 cgttttgatg aacccaaccc gtactggtct catcttgact ctgcaggaaa tgggtgccga 4020 catcgaagtg atcaacccac gtcttgctgg tggagaagac gtggctgact tgcgtgttcg 4080 ttcttctact ttgaagggtg ttactgttcc agaagaccgt gctccttcta tgatcgacga 4140 gtatccaatt ctcgctgttg cagctgcatt cgctgaaggt gctaccgtta tgaacggttt 4200 ggaagaactc cgtgttaagg aaagcgaccg tctttctgct gtcgcaaacg gtctcaagct 4260 caacggtgtt gattgcgatg aaggtgagac ttctctcgtc gtgcgtggtc gtcctgacgg 4320 taagggtctc ggtaacgctt ctggagcagc tgtcgctacc cacctcgatc accgtatcgc 4380 tatgagcttc ctcgttatgg gtctcgtttc tgaaaaccct gttactgttg atgatgctac 4440 tatgatcgct actagcttcc cagagttcat ggatttgatg gctggtcttg gagctaagat 4500 cgaactctcc gacactaagg ctgcttgatg agctcaagaa ttcgagctcg gtaccggatc 4560 ctctagctag agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca 4620 tcagtttcat tgcgcacaca ccagaatcct actgagtttg agtattatgg cattgggaaa 4680 actgtttttc ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc 4740 gctatcgaac tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt 4800 gttcattctc aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa 4860 attataagag atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta 4920 atgaccgaag ttaatatgag gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact 4980 aggcaacaaa tatattttca gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt 5040 cctcttgtgt tttagacatt tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca 5100 gattctaatc attgctttat aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa 5160 atatttttta atgcatttta tgacttgcca attgattgac aacatgcatc aatcgacctg 5220 cagccactcg aagcggccgc atcgatcgtg aagtttctca tctaagcccc catttggacg 5280 tgaatgtaga cacgtcgaaa taaagatttc cgaattagaa taatttgttt attgctttcg 5340 cctataaata cgacggatcg taatttgtcg ttttatcaaa atgtactttc attttataat 5400 aacgctcaga ctctagtgac taccaccttc actctcctca agcatttcag cctcttcccc 5460 gctcagactc cttagctttg ggagccaaat tatcccttac gttctcgact tcaaccatat 5520 gtgatagctg cctatgatac catggctact tccccttagt tctttatctt tcctttccgc 5580 tttattccat gccttaccga tcctctgaag tgtctttgca ttagcttcat tgaaacctca 5640 cgcgatgaaa ggtgtgatgg tctcctccga tggcgcactt ctcatagggt aacctaattg 5700 tcttacgacc aacataggat tataattaat acaacccctc gtccctataa aagggacatt 5760 tggaaatcct tcacataagc ataacactcc tacccctctt tctttccact gtgggaacca 5820 actaatggac gctcctatca tgcctgccaa gagttcttcc caatttgcct cgtcctttcc 5880 tgagcacatg cgatgacctt gtatggggta gacagatcta ctttcatgat tgaagacgtg 5940 ggataccaac cacacataaa gagcaggcgc acaacagaaa atcctcgtag tgctcttctt 6000 gcatcttaag tcaaatgtat catacactta tgctaaaaca acaatgatcg ggctttcctt 6060 gctatggtga taagcaagaa aagcatcgat tgctactaga tccaccaact cgtctacatt 6120 cgaaaatagt actatcccaa acactagcag tgctaatacg tcgatgaatg atgcccactc 6180 tccttggctg gccagagttt ccgccttctc ctccaatcac ttccttggta ttccccctac 6240 cctattccta ctttgcttca ctcagtctaa ttctcatttc gagatcttga caactcctgc 6300 tattctcgcc atagaaggat agtacccaga aaaaaggtat ggcttccttc ctcctatcgg 6360 gcatcctaag atcccttcga actcctctat ggttggtgct aactgaaagt ccccaaaagt 6420 gaagcatctg agtgattggt catagtattg ggtgagagat gcgatg 6466 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> synthetic primer molecule <400> 10 ccttttgggc ttttttgttt cc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> synthetic primer molecule <400> 11 cgtttcccgc cttcagttta 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> synthetic primer molecule <400> 12 tgtgtggtgt gacccattgg 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> synthetic primer molecule <400> 13 cctcaattgg gagatactgc actta 25 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> synthetic primer molecule <400> 14 gtagtcacta gggtcagtaa agaatgtga 29 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> synthetic primer molecule <400> 15 ttatcaagct ccaaacac 18 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> synthetic primer molecule <400> 16 tgagctcaaa gatatcaaca tg 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> synthetic primer moleucle <400> 17 agttaaatca tagttaataa tc 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> synthetic primer molecule <400> 18 tcccgctcta gcgcttcaat 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> synthetic primer molecule <400> 19 tcgagcagga cctgcagaa 19 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> synthetic primer molecule <400> 20 ctgaaggcgg gaaacgacaa tctg 24 <210> 21 <211> 1103 <212> DNA <213> Glycine max <400> 21 tgggggctgc ctgtacttcc caaaacttcg cttccctgac ccatcatatc caggactgga 60 cgattggctt gattgatacc agatgggtga gtcgagtcca cctcggtagc ggcatttatg 120 gcaacgattg cagccacgtt gacctccatc attttttctc atgctcatca tggcctccat 180 catggtggtc atttggtctt tcatggcctc catgtcggcc ttcatctgct cttgaacttc 240 atctatctca ctcatgattc tagccttggc acgtgtttgg taagggtacc gtaaagcgcg 300 ttcgttcttt tttattacta tgattacatt ttgacgatga tgatgattgt aggaaagaat 360 gaaatgagta atgaaacaac taaataaacg tgaatgcatg acaatgataa gttgctgaag 420 tattataaat ttacatagga cattcagtgg aacgtagggt cgaatcaaat cctatttcat 480 taaaaacaat attgttcatc ttgacagagc caaagcataa ctagaaatac aacatggaca 540 catcagcgat tcctaattat gtgggtcatt agttcgacca tgtgttggca gtaacttgaa 600 agactatgaa cttcatcggg agcagagtat gtgtcagtca ccgccttggc tctggctaac 660 aaccttggga tctcttggct ctcatttaga gtaagagcaa atttgtccat ccatttcatg 720 gcttctttat gcaataactc tatcacccct tctcttgctt ccctttcaac ctgcaaggtc 780 gacacttttg cctgttcgtc ttctagcctt cgcccatgac tagcagctag gttcaccttc 840 tcttcatatt ggtcaatgat tatcaacata ttttcttttg ttttgctcaa ctgttctctc 900 aaacttctct tcgatctctg acaactcttt aacttatcct ctaacatcag gttttccata 960 cttgatttgt ccctcttggc ttttctaagt ttgagctcgt tactgctgcc ccacaaagcc 1020 cctcgaaact tgttcctgct ccactcttcc ttttgggctt ttttgtttcc cgctctagcg 1080 cttcaatcgt ggttatcaag ctc 1103 <210> 22 <211> 1060 <212> DNA <213> Glycine max <400> 22 cagactctag tgactaccac cttcactctc ctcaagcatt tcagcctctt ccccgctcag 60 actccttagc tttgggagcc aaattatccc ttacgttctc gacttcaacc atatgtgata 120 gctgcctatg ataccatggc tacttcccct tagttcttta tctttccttt ccgctttatt 180 ccatgcctta ccgatcctct gaagtgtctt tgcattagct tcattgaaac ctcacgcgat 240 gaaaggtgtg atggtctcct ccgatggcgc acttctcata gggtaaccta attgtcttac 300 gaccaacata ggattataat taatacaacc cctcgtccct ataaaaggga catttggaaa 360 tccttcacat aagcataaca ctcctacccc tctttctttc cactgtggga accaactaat 420 ggacgctcct atcatgcctg ccaagagttc ttcccaattt gcctcgtcct ttcctgagca 480 catgcgatga ccttgtatgg ggtagacaga tctactttca tgattgaaga cgtgggatac 540 caaccacaca taaagagcag gcgcacaaca gaaaatcctc gtagtgctct tcttgcatct 600 taagtcaaat gtatcataca cttatgctaa aacaacaatg atcgggcttt ccttgctatg 660 gtgataagca agaaaagcat cgattgctac tagatccacc aactcgtcta cattcgaaaa 720 tagtactatc ccaaacacta gcagtgctaa tacgtcgatg aatgatgccc actctccttg 780 gctggccaga gtttccgcct tctcctccaa tcacttcctt ggtattcccc ctaccctatt 840 cctactttgc ttcactcagt ctaattctca tttcgagatc ttgacaactc ctgctattct 900 cgccatagaa ggatagtacc cagaaaaaag gtatggcttc cttcctccta tcgggcatcc 960 taagatccct tcgaactcct ctatggttgg tgctaactga aagtccccaa aagtgaagca 1020 tctgagtgat tggtcatagt attgggtgag agatgcgatg 1060

Claims

SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 서열과, 5-에놀피루빌-3-포스포노시키메이트 신타아제(EPSPS)를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
그 대표 샘플이 ATCC 수탁번호 PTA-6708로 기탁된, 계통 MON89788을 포함하는 대두 식물 또는 그것의 일부분.
계통 MON89788을 포함하는, 제2항의 식물의 종자.
제3항의 종자로부터 생산된 대두 생산품.
제 4항에 있어서, 상기 대두 생산품은 굵은 가루(meal), 고운 가루(flour), 플레이크, 또는 오일인 대두 생산품.
제2항에 있어서, 상기 대두 식물의 일부분은 세포, 꽃가루, 배주, 꽃, 발아, 뿌리, 또는 잎인 대두 식물의 일부분.
제2항에 있어서, 상기 대두 식물은 상기 계통 MON89788을 포함하는 대두 식물의 어떤 세대의 후대 개체 식물인 대두 식물.
제2항에 있어서, 상기 식물의 게놈은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 대두 식물.
제2항에 있어서, 상기 식물의 게놈은, DNA 증폭법으로 테스트시에 계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하고, 상기 증폭산물은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 대두 식물.
제3항에 있어서, 상기 종자의 DNA는, DNA 증폭법으로 테스트시에 계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하고, 상기 증폭산물은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 종자.
제 5항에 있어서, DNA 증폭법으로 테스트시에, 계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하는 핵산을 포함하고, 상기 증폭산물은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는, 굵은 가루, 고운 가루, 플레이크 또는 오일인 대두 생산품.
계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하기 위한 DNA 증폭법에 유용한, SEQ ID NO:3의 적어도 11개의 연속 뉴클레오티드들 또는 그것의 상보체를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자.
계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하기 위한 DNA 증폭법에 유용한, SEQ ID NO:4의 적어도 11개의 연속 뉴클레오티드들 또는 그것의 상보체를 포함하는 분리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자.
SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4에 대해서 상동이거나 또는 상보적인 11개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 핵산을 필수적으로 포함하는, 계통 MON89788에 대한 특이적 DNA 검출키트.
식물의 게놈 내로 계통 MON89788을 도입시키는 것을 포함하는, 글리포세이트 제초제에 대해 저항성인 대두 식물의 생산 방법.
제15항에 있어서, 다음의 단계들을 포함하는 방법:

(a) 후대 개체식물들을 생산하기 위하여 계통 MON89788을 포함하는 제1의 대두 식물을 계통 MON89788이 결핍된 제2의 대두 식물과 교배시키는 단계; 및

(b) 상기 계통 MON89788을 포함하고, 글리포세이트에 저항성이 있는 제1의 후대 개체 식물을 선택하는 단계.
제16항에 있어서, 제2세대 후대 개체 식물들을 생산하기 위하여, 상기 제1의 후대 개체식물을 자가수정시키고, 상기 계통 MON89788에 대해 동형접합성인 제1의 식물을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
다음의 단계들을 포함하는, 시료에서 대두 계통 MON89788에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법:

(a) 대두 DNA를 포함하는 시료를, 대두 계통 MON89788로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭반응에 사용시에 대두 계통 MON89788에 대한 진단용 증폭산물을 생산하는 프라이머 셋트와 접촉시키는 단계; 및

(b) 핵산 증폭반응을 수행하여 진단용 증폭산물을 생산하는 단계; 및

(c) 상기 진단용 증폭산물을 검출하는 단계.
다음의 단계를 포함하는, 시료에서 계통 MON89788에 상응하는 핵산의 존재를 검출하는 방법:

(a) 대두 DNA의 시료를 얻는 단계; 및

(b) 계통 MON89788로부터의 DNA 서열의 존재에 대해서 시료를 분석하는 단계.
제19항에 있어서, 상기 DNA 시료를 분석하는 단계는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 또는 이들의 상보체들 중의 적어도 하나의 핵산서열의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 핵산분자에 유전학적으로 연결된 글리포세이트 저항성 형질을 포함하는 대두 식물.
다음의 단계들을 포함하는, 대두 생산품의 생산 방법:

(a) 제2항의 대두 식물 또는 그것의 일부분을 얻는 단계; 및

(b) 상기 대두 식물 또는 그것의 일부분으로부터 대두 생산품을 생산하는 단계.
제22항에 있어서, 상기 대두 생산품은 굵은 가루, 고운 가루, 플레이크, 단백 분리물, 또는 오일인 방법.
계통 MON89788을 포함하는, 제초제에 저항성을 나타내는 대두 식물들을 포함하는 경작지에서, 잡초들의 성장을 제어하기에 효과적인 양의 글리포세이트로 경작지를 처리하는 것을 포함하는 잡초들의 성장을 제어하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 경작지의 처리는 성장의 V1 단계로부터 R4 단계까지 수행하는 방법.