KR20120105677A

KR20120105677A - Ｐ34 유전자 특이적 ｄｎａ 마커를 이용한 항알러지 콩 품종의 판별방법

Info

Publication number: KR20120105677A
Application number: KR1020110023263A
Authority: KR
Inventors: 김민철; 서준수
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-09-26
Also published as: KR101304380B1

Abstract

본 발명은 P34 유전자 특이적 DNA 마커를 이용한 항알러지 콩 품종의 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 기반으로 콩의 알러지 발생 감소(hypoallergenecity)와 상업적 적용 가능한 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 항알러지 콩 품종의 식별방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트는 분자 마커로서의 사용의 수월성, 편리성, 경제성 및 정확성을 모두 갖추고 있을 뿐 아니라 간편한 게놈 PCR 방법만으로 항알러지 콩 품종을 빠르고 정확하게 선별할 수 있어 항알러지 콩 품종의 육종의 어려움과 재현성을 극복하여 작물 육종산업에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

Ｐ34 유전자 특이적 ＤＮＡ 마커를 이용한 항알러지 콩 품종의 판별방법 {Methods for identifying low allergenic soybean using P34 gene-specific DNA markers}

본 발명은 P34 유전자 특이적 DNA 마커를 이용한 항알러지 콩 품종의 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 기반으로 콩의 알러지 발생 감소(hypoallergenecity)와 상업적 적용 가능한, 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 항알러지 콩 품종의 식별방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 아동들의 6 내지 8%, 성인의 경우 1 내지 2%가 식품 알러지에 시달리고 있다. 알러지 유발 식품들 가운데에는 콩, 우유, 계란, 땅콩, 견과류, 생선, 밀 및 갑각류가 포함되어 있으며, 이들은 주로 어린이들에게서 나타나는 식품 알러지 원인에 있어 90%를 차지하고 있다.

상기 콩은 단백질과 지방을 풍부하게 함유하여 영양학적 및 상업적으로 매우 가치가 높은 작물이다. 그럼에도 불구하고 콩 단백질의 섭취 시 유발되는 알러지 반응 때문에 콩의 광범위한 이용이 제한 받고 있다. 파파인 상과(Papain superfamily)에 속하는 P34 단백질은 콩에서 알러지를 일으키는 대표적인 물질로 알려져 있으며, 상기 P34의 경우 야생종 및 재배종 콩 모두에 널리 함유되어 있다. 이전의 연구에서 콩의 유전자원 스크리닝(germplasm screening)을 통하여 P34 단백질이 현저히 낮은 두 계통(PI567476, PI603570A)이 분리되었으며, 야생형 콩과 P34 단백질이 낮은 콩 계통간의 P34 유전자의 염기서열을 비교, 분석한 결과 P34 단백질의 함량이 낮은 콩은 정상 콩과는 다르게 P34 유전자의 개시코돈인 “ATG”의 바로 앞부분에“ATGT”4개의 염기서열이 삽입되어있는 특징을 가지고 있음을 확인하였으며 “ATGT”4개 염기서열의 삽입이 P34 유전자의 발현을 억제할 것이라고 제안하였고, 이를 이용한 분자 마커는 일부 보고되고 있다(Kristin Bilyeu 등, PCT/US2009/063729).

그러나 상기 분자 마커는 콩 품종에 있어 P34 유전자형을 분석을 하기 위해서 Quantitative Real time-PCR, ABI3730 DNA analyzer 또는 Real time-PCR과 같은 고도의 기술과 고가의 장비를 필요로 하여, 작물의 육종에서 특정 기능의 선별용 분자마커에 요구되는 사용의 수월성, 편리성, 경제성 그리고 정확성의 근본적인 문제는 해결하지는 못하였다.

이에 본 발명자들은 공개된 콩 마커만으로는 항알러지 품종의 식별의 어려움과, 작물의 육종에서 특정 기능의 선별용 분자마커에서 근본적으로 요구되는 사용의 수월성, 편리성 및 경제성을 모두 갖춘 항알러지 콩 품종 식별용 마커 제작의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 야생형 콩과 P34 단백질이 낮은 콩 계통간의 P34 유전자의 염기서열 차이를 이용하여 야생형 콩과 P34 단백질이 낮은 콩을 구분할 수 있는 P34 유전자 특이적 프라이머 세트를 찾고, 상기 프라이머 세트가 경제성, 효율성 및 정확성이 뛰어난 항알러지 콩 품종의 판별에 유용한 분자마커임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 기반으로 콩의 알러지 발생 감소(hypoallergenecity)와 상업적 적용 가능한, 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 항알러지 콩 품종 식별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 기반으로 콩의 알러지 발생 감소(hypoallergenecity)와 상업적 적용 가능한, 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 항알러지 콩 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 Recessive marker 프라이머 세트; 또는 서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 Dominant marker 프라이머 세트;로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트는 콩 유래의 콩 알러지 원인 P34 유전자의 프로모터 부위 중 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 “ATGT”4개의 염기서열이 삽입되어있는 특징을 이용함으로써, P34 단백질의 함량이 낮은 콩 품종을 게놈 PCR의 간단한 방법으로도 정확한 항알러지 콩 품종의 식별이 가능할 뿐 아니라 기존에 공개된 콩 마커에 비하여 시간 및 비용을 크게 절약할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 상기 항알러지 콩 품종의 식별용 프라이머 세트(서열번호 15 내지 18); 및 PCR(Polymerase chain reaction)에 필요한 시약;을 포함하는, 항알러지 콩 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 적당량의 DNA 중합 효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물, KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유한 PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은

a) 콩으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 이용하여 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;

를 포함하는, 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 게놈 DNA는 콩의 종자, 잎 또는 이들의 혼합물로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

상기 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트는 서열번호 15와 16, 또는 서별번호 17과 18인 프라이머 세트를 포함한다.

이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동을 사용하여 유전자 증폭을 분석할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 증폭산물 즉, 동형 접합체 콩(homozygote wild type) 품종의 유전자형(genotype)에서는 상기 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트 중 Dominant marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편만 증폭되고;

P34 단백질의 함량이 낮은 항알러지 콩(homozygote low P34 genotype) 품종의 유전자형에서는 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트 중 Recessive marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편만 증폭되며;

이형접합체 콩(heterozygote genotype) 품종의 유전자형에서는 상기 제 1항의 Dominant marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편 및 Recessive marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편 모두가 증폭됨을 확인함으로써 항알러지 콩 품종을 식별할 수 있다.

보다 상세하게는 본 발명에서는 정상 콩인 Clark, 진품2 (Jinpum2), 개척1 (Gaechuck1)과 P34 단백질이 낮은 콩 계통인 PI567476의 종자에서 단백질을 분리한 후 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 통하여 P34 단백질의 발현양을 비교 분석을 통하여 결과, P34 단백질이 낮은 콩인 PI56746을 제외한 다른 정상 콩 계통에서는 다량의 P34 단백질이 확인 되었고, 상기 분석에 사용된 4개 콩 계통 간 전체 단백질의 양 차이는 없었다. 도 1을 참조한다.

상기 4개 콩 계통 간 P34 단백질의 발현 차이의 원인을 규명하기 위하여, 상기 P34 게놈 DNA를 동정하고 염기서열을 분석한 결과, PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통으로부터 분리한 P34 게놈 DNA들의 염기서열들은 모두 동일하였으며, 데이터베이스상에 보고되어져 있는 P34의 게놈 DNA (GenBank accession #, AB013289)의 염기서열과 비교해보았을 때, 동정한 P34 게놈 DNA들은 AB013289 유전자와 동일함을 확인하였다. 도 3을 참조한다.

따라서 P34 단백질 함량이 낮은 콩과 정상 콩간의 P34 단백질의 발현 차이는 P34 단백질 발현이 직접적으로 암호화되어 있는 부위의 염기서열 차이에 기인하는 것이 아니라, 각 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부분의 염기서열의 차이에 의한 것으로 예상을 하고, 상기 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통의 P34 유전자 프로모터 영역을 클로닝 하였으며, 염기서열 분석에 사용된 P34 프로모터는 P34 유전자의 개시코돈(ATG)으로부터 업스트림(upstream) -4631 bp 부위를 포함하였으며, 상기 4개 콩 계통의 P34 프로모터 염기서열을 분석한 결과, 계통 간 총 2가지의 차이점을 확인하였다.

상기 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통의 P34 프로모터 부위의 염기서열 차이점 2가지를 모식도로 나타낸 결과, PI567476은 반복되는 TA 염기의 길이가 60 bp이며, Clark은 74bp, Jinpum2는 52bp, Gaechuck1은 54 bp로 확인되었으며, 특이적으로 PI567476에서만 번역 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 특이적으로 “ATGT”4개의 염기가 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 도 6을 참조한다.

상기 결과로부터 P34 프로모터 부위의 염기서열에서 반복되는 TA 염기의 길이가 정상콩과 P34 단백질의 결핍된 콩과 서로 다르다는 점을 이용하여 P34 유전자 특이적인 DNA 마커 개발을 시도 하였으나 반복되는 TA 염기의 길이와 P34 단백질의 발현양 사이에는 상관관계가 없음을 확인하였고, 이는 TA 반복 염기의 길이 차이는 저알러지 콩 선별을 위한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커에 사용 될 수 없음을 확인 하였다. 도 7을 참조한다.

이에 상기 P34 프로모터의 염기서열 분석 결과에서, 다른 정상 콩들과는 다르게 P34 단백질 결핍 콩인 PI567476에서만 번역 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 특이적으로 “ATGT”4개의 염기가 삽입되어 있는 점을 이용하여, 각 콩 계통의 게놈 DNA를 이용한 게놈 PCR을 수행하였을 때, 특이적으로 PI567476에서만 증폭되는 단편 프라이머 쌍을 설계하여 Recessive Marker(RM)로 명명하였다. 반면에 상기와 같은 염기서열 특징을 이용하여 게놈 PCR을 수행 하였을 때, PI567476에서만 증폭되지 않고, 다른 Clark, Jinpum2, Gaechuck1의 정상 콩에서는 증폭되는 단편 프라이머 쌍을 Dominant Maker(DM) 로 명명하였다.

상기 설계된 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트가 P34 유전자 특이적인 DNA 마커로서의 가능성과 정확성을 평가하기 위해서 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1의 게놈 DNA를 이용해, 게놈 PCR를 수행하였고, 전기영동을 통해 확인 하였다. 상기 게놈 PCR 결과, RM 프라이머 세트는 P34 단백질 결핍 콩인 PI567476에서만 332 bp 크기의 DNA가 특이적으로 증폭된 것을 확인하였고, DM 프라이머 세트는 PI567476을 제외한 정상 콩인 Clark, Jinpum2, Gaechuck1에서 369 bp 크기의 DNA가 특이적으로 증폭됨을 확인하였다. 이것은 상기 4개 계통의 웨스턴 블랏(Western blot)의 결과와도 상응하였다. 도 8을 참조한다.

상기 본 발명의 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트가 P34 유전자 특이적인 DNA 마커로서 분리집단(segregating population)에서도 정확히 작용하는지 규명하기 위해서, 정상 콩인 Clark을 모본으로 하고 P34 단백질 결핍 콩인 PI567476을 부본으로 교잡을 실시하여 이형접합체(Heterozygote)인 F1 종자에서도 정확성 여부를 확인하였다. 그 결과, 부본인 PI567476에서 RM 프라이머 세트를 이용한 게놈 PCR에서만 특이적으로 증폭 되었고, 모본인 Clark에서는 DM 프라이머 세트를 이용한 게놈 PCR에서만 특이적으로 증폭됨을 확인하였으며, 이형접합체인 F1에서는 RM과 DM이 모두 증폭됨을 확인하였다. 도 9를 참조한다.

상기 본 발명의 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트가 정확히 작용하는지 다시 한 번 규명하기 위해서 Clark과 PI567476을 교잡해서 얻은 F1 콩을 자가 수분하여 얻은 F2 콩 202개를 이용하여, 상기 F2 콩의 전체 단백질과 P34 특이적 항체로 P34 단백질의 발현양상을 확인한 결과, 우성순종개체(Homozygous dominant) 콩에서는 P34 단백질이 대량으로 확인되었고, 열성호모개체(Homozygous recessive) 콩에서는 P34 단백질이 거의 없거나 아주 약하게 있는 것으로 확인되었으며, 이형접합체 콩에서는 그 중간 정도의 P34 단백질이 확인되었다. 도 10을 참조한다.

상기 실험에 사용한 F2 202개 콩에서 웨스턴 닷 블랏(Western dot blot)과 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 이용한 게놈 PCR에서 DNA 단편의 증폭 유무를 통한 P34 유전자형 및 상기 결과를 바탕으로 유전자형별로 분리 비를 관측하였다. 상기 실험을 통해 얻은 관측 값과 미리 고려한 기대 값과의 통계적 유의성을 카이스퀘어(X²)검증을 통하여 살펴보았다. 그 결과, 신뢰구간 95%에서 1:2:1 로 정확히 분리되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 우성 형태와 열성 형태가 3:1로 분리 되는 것을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 P34 특이적 항체를 이용한 알러지 콩 품종의 생물학적인 진단 방법과 함께 게놈 PCR를 이용한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커인 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 이용한 게놈 PCR을 통하여, 알러지 유발물질이 적은 콩 계통을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트는 공개된 콩 마커만으로는 항알러지 품종의 식별의 어려움과 작물의 육종에서 특정 기능의 선별용 분자마커에서 근본적으로 요구되는 사용의 수월성, 편리성, 경제성 및 정확성을 모두 갖춘 항알러지 콩 품종 식별용 마커로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 항알러지 콩 품종의 식별방법은 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 이용한 간편한 게놈 PCR을 방법으로 항알러지 콩 품종을 빠르고 정확하게 선별할 수 있어, 항알러지 콩 품종의 육종의 어려움과 재현성의 극복 뿐 아니라 나아가 작물 육종산업에 크게 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 콩 계통별 P34 단백질의 발현유도를 보여주는 결과이고,
(A: 웨스턴 블랏 이미지, B: SDS-PAGE 이미지)
도 2는 본 발명에 따른 P34 게놈 DNA 동정을 위한 게놈 PCR의 결과이며,
(A: P34 유전자 게놈 구조의 모식도, B: 전기영동 이미지)
도 3은 본 발명에 따른 P34 게놈 DNA 염기서열의 분석결과이고,
(대문자는 exon, 소문자는 intron을 나타냄.)
도 4는 본 발명에 따른 P34 프로모터 부위의 동정을 위한 게놈 PCR의 결과이며,
(A: P34 프로모터 구조의 모식도, B: 전기영동 이미지)
도 5는 본 발명에 따른 P34 프로모터 부위 염기서열의 분석결과이고,
도 6은 본 발명에 따른 계통별 P34 프로모터 부위 염기서열의 차이점을 모식도로 보여주는 그림이며,
도 7은 본 발명에 따른 계통별 P34 프로모터에 반복되는 TA 염기의 길이차이를 이용한 콩 계통별 분석결과이고,
(A: 전기영동 이미지, B: 웨스턴 블랏 이미지)
도 8은 본 발명에 따른 P34 프로모터에 “ATGT” 4개의 염기서열이 삽입되어 있는 특징을 이용한 콩 계통별 분석결과이며,
(A: Recessive Marker(RM) 및 Dominant Marker(DM)의 설계 모식도, B: 전기영동 이미지)
도 9는 본 발명에 따른 P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 잡종 1세대에 적용한 결과이고,
도 10은 본 발명에 따른 P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 잡종 2세대에 적용한 결과이며,
도 11은 본 발명에 따른 P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 전체 잡종 2세대에 적용한 결과이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통에서 P34 단백질의 발현 양상의 분석

PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통간의 P34 단백질 발현양상의 차이를 최종적 산물인 종자 단계에서 조사하기 위해 P34 항체를 이용한 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 실시하였다.

상기 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 위해서, PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통의 성숙 종자를 사용하였다. 각각 표본으로부터 전체 단백질을 추출하였으며 분광광도계를 이용하여 농도를 정량하였으며, 각 3 ㎍의 전체 단백질을 12% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 PVDF 막(membrane)으로 옮겼다. 막(Membrane)을 blocking buffer[20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% nonfat dried milk]에서 2시간 반응 시킨 후, P34 항체와 1시간 동안 반응시켰다. TTBS buffer[20 mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 5분씩 3번 씻은 후, 2차 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 다시 상기 TTBS buffer에 5분씩 3번 씻은 후, 단백질-항체 복합체는 ECL kit(Amersham)를 사용하여 확인하였다.

도 1의 A 결과에서도 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블랏(Western blot) 분석 결과, PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통간의 P34 단백질 발현양상의 차이를 살펴보면, 정상콩인 Clark, Jinpum2, Gaechuck1에서는 P34 단백질이 다량으로 발견되었으나 PI567476에서 P34 단백질의 발현이 현저하게 낮은 것을 확인 할 수 있었다.

마른 콩에서 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통간의 전체 단백질 발현 양상을 보기 위하여 15 ㎍의 전체 단백질을 12% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, Staining solution [0.025% Coomassie brilliant blue R-250, 40% Methanol, 7% Acetic acid]에 30분 동안 SDS-PAGE의 단백질 부분을 염색하고, 다시 Destaining solution I[40% Methanol, 7% Acetic acid]에 30분 동안 1차 탈색하고, 그런 다음 다시 Destaining solution II[5% Methanol, 7% Acetic acid]에 1시간 동안 2차 탈색하여 바탕의 불특정하게 염색된 부분을 제거했다. 그 결과, 도 1의 B에서도 확인할 수 있듯이, SDS-PAGE의 육안으로는 계통 간 전체 단백질의 양 차이는 없음을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통해, P34 단백질에 특이적인 P34 항체는 알러지 유발물질이 없는 콩 품종의 개발을 위해 분리집단(segregating population)의 스크리닝(screening)에 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통으로부터 P34 게놈 DNA의 동정과 염기서열분석

2-1. 실험재료

본 실험에서 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통을 사용하였다. 상기 4 계통을 온실에서 키웠으며, 개화시기의 잎을 채취하였다. 이들 재료들은 액체질소에 급 냉각시킨 상태에서 분쇄 후 -80℃에 보관하였고, 게놈 DNA를 추출하는데 사용하였다.

2-2. 게놈 DNA의 추출과 게놈 PCR

PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통의 각각의 잎으로부터 게놈 DNA를 페놀 추출 방법으로 추출 및 정제하였다. 게놈 PCR시 P34 게놈 DNA의 증폭을 용이하게 하기 위해서 게놈 DNA를 도 2의 4와 같이 세부분으로 나누었다. P34 게놈 DNA의 클로닝을 위하여 각 단편 특이적 프라이머 쌍들을 합성하였다. 합성한 프라이머들의 염기서열은 아래와 같다.

단편 Ⅰ;

센스 프라이머: 5'-TT ATG GGT TTC CTT GTG TTG CTT C-3'(서열번호 1)

안티센스 프라이머: 5'-TGC GAC ACA TCC TTG GGA GCT TGC-3'(서열번호 2)

단편 Ⅱ;

센스 프라이머: 5'-AAG TTT GCT GAC ATC ACT CCT CAA G-3'(서열번호 3)

안티센스 프라이머: 5'-TGA CAT TAT TAG AGT TTC ATA TCC G-3'(서열번호 4)

단편 Ⅲ;

센스 프라이머: 5'-CAG AGC TAA AGA GGG TAG ATG CAA AGC-3'(서열번호 5)

안티센스 프라이머: 5'-TCA AAG AGG AGA GTG ATC AAC TCT TCG-3'(서열번호 6)

PCR(Polymerase chain reaction)은 Prime Star DNA 중합효소(TAKARA), P34 유전자의 각 단편 특이적 프라이머 쌍과 2 ㎕의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 50 ㎕ 부피로 반응시켰다. 각 PCR은 94℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (94℃, 30초간 -> 60℃에서 30초간 -> 72℃, 30초), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응 조건으로 수행하였다.

50 ㎕의 PCR 산물들 중 5 ㎕를 1％ 아가로스 겔에 전기영동을 통하여 도 2의 B에서 확인할 수 있는 DNA 단편들이 증폭됨을 확인할 수 있었다.

2-3. P34 게놈 DNA 들의 클로닝

상기 2-2의 PCR 산물을 아가로스 겔로부터 회수하여, pBluescript II SK(+) 벡터(Promega)의 SmaI 에 삽입한 후, 재조합 벡터들은 CaCl₂를 처리한 컴피턴트 세포(competent cell)인 DH5α에 열 충격 방법으로 형질전환하였다.

상기 형질전환 세포는 1 ㎖의 LB 액체 배지에서 37℃에서 1시간 배양 후, 암피실린(50 ㎍/㎖)이 첨가된 고체 LB배지에서 접종하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 배지에서 자란 콜로니는 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하였고, 세포로부터 플라스미드 DNA를 추출 및 정제하였다. 상기 추출 정제된 플라스미드를 제한 효소절단 후, 전기영동을 통하여 목적하는 게놈 DNA의 존재여부를 검증하였다.

2-4. P34 게놈 DNA 들의 염기서열 분석

pBluescript II SK(+) 벡터에 클로닝된 P34 게놈 DNA 단편들은 솔젠트사 (SolGent Co., Ltd.)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.

각 염기서열을 분석한 결과, 도 3에서도 확인할 수 있듯이 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통으로부터 분리한 P34 게놈 DNA들의 염기서열들은 모두 동일하였다. 또한 데이터베이스상에 보고되어져 있는 P34의 게놈 DNA(GenBank accession AB013289)의 염기서열과 비교해보았을 때, 동정한 P34 게놈 DNA들은 AB013289 유전자와 동일함을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3] PI567476 , Clark , Jinpum2 , Gaechuck1 콩 각 계통으로부터 P34 프로모터 부위의 동정과 염기서열분석

3-1. 게놈 DNA 의 추출과 게놈 PCR

PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통의 각각의 잎으로부터 게놈 DNA를 페놀 추출 방법으로 추출 및 정제하였다. 게놈 PCR시 P34 프로모터 부위의 증폭을 용이하게 하기 위해서 프로모터 부위를 도 4의 A와 같이 네 부분으로 나누었다. P34 프로모터 부위의 클로닝을 위하여 각 단편 특이적 프라이머 쌍들을 합성하였다. 합성한 프라이머들의 염기서열은 아래와 같다.

단편 Ⅰ;

센스 프라이머: 5'-CTG GTC ATA AAG TGG GAG TAT GTG G-3'(서열번호 7)

안티센스 프라이머: 5'-TAC ATG CCT CAT GAC ACC TAA GCA C-3'(서열번호 8)

단편 Ⅱ;

센스 프라이머: 5'-TTC TTC ACT AAG TGT GCT TAG GTG T-3'(서열번호 9)

안티센스 프라이머: 5'-CTC CTT TAA TGC AAT CTT CTC AAG G-3'(서열번호 10)

단편 Ⅲ;

센스 프라이머: 5'-TGA GAA GAT TGC ATT AAA GGA GGT C-3'(서열번호 11)

안티센스 프라이머: 5'-AAT GAT GAA TCG TTG ATA AGC AGC G-3'(서열번호 12)

단편 Ⅳ;

센스 프라이머: 5'-TCT AGC AGT CTA GCT TAT GAG GCT C-3'(서열번호 13)

안티센스 프라이머: 5'-TGG AAC TAG AAG AGA GAC CTA AGA G-3'(서열번호 14)

PCR은 Prime Star DNA 중합효소(TAKARA), P34 유전자의 각 단편 특이적 프라이머 쌍과 2㎕의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 50㎕ 부피로 반응시켰다. 각 PCR은 94℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (94℃, 30초간 -> 60℃에서 30초간 -> 72℃, 30초), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응조건으로 수행하였다.

50 ㎕의 PCR 산물들을 모두 1％ 아가로스 겔에 전기영동을 한 다음, 상기 PCR 산물에서 클로닝에 필요한 특정 크기의 DNA를 아가로스 겔로부터 회수하였고, 회수한 DNA 35 ㎕에서 5 ㎕를 전기영동을 통하여 도 4의 B에서 확인할 수 있는 DNA 단편들이 증폭됨을 확인할 수 있었다.

3-2. P34 프로모터 부위들의 클로닝

상기 3-1의 PCR 산물을 아가로스 겔로부터 회수하여, pBluescript II SK(+) 벡터(Promega)의 SmaI 에 삽입한 후, 재조합 벡터들은 CaCl₂를 처리한 컴피턴트 세포(competent cell)인 DH5α에 열 충격 방법으로 형질전환하였다.

형질전환 세포는 1 ㎖의 LB 액체 배지에서 37℃에서 1시간 배양 후, 암피실린(50 ㎍/㎖)이 첨가된 고체 LB배지에서 접종하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 배지에서 자란 콜로니는 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하였고, 세포로부터 플라스미드 DNA를 추출 및 정제하였다. 상기 추출 및 정제된 플라스미드를 제한 효소절단 후, 전기영동을 통하여 목적하는 게놈 DNA의 존재여부를 검증하였다.

3-3. P34 프로모터 부위의 염기서열 분석

상기 pBluescript II SK(+) 벡터에 클로닝된 P34 프로모터 단편들은 솔젠트사(SolGent Co., Ltd.)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.

상기 염기서열 분석에 사용된 P34 프로모터는 P34 유전자의 개시코돈(ATG)으로부터 업스트림(upstream) -4631 bp 부위를 포함하였으며, 도 5에는 염기서열 차이가 없는 앞부분을 제외한 -2046 bp 부위부터 나타내었다. 상기 4개 콩 계통의 P34 프로모터 염기서열을 분석한 결과, 계통 간 총 2가지의 차이점을 확인하였다.

도 5의 도면에서도 확인할 수 있듯이, P34 프로모터 염기서열의 첫 번째 차이점은 TA 염기가 대량으로 반복되는 부위의 염기서열 길이차이로, 데이터베이스상에 보고되어져 있는 P34 프로모터 DNA (GenBank accession AB013289)의 염기서열을 기준으로 비교해보았을 때, Clark은 모두 동일하였으며, PI567476은 번역 개시코돈인 ATG로부터 -1621 bp부터 -1607 bp까지의 염기가 존재하지 않았고, Jinpum2는 ATG로부터 -1629 bp부터 -1607 bp까지의 염기가 존재하지 않았으며, Gaechuck1은 ATG로부터 -1627 bp부터 -1607 bp까지의 염기가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다.

또한, P34 프로모터 염기서열의 두 번째 차이점은 P34 단백질이 함량이 낮은 PI567476 계통에서만 존재하는 것으로써, 정상 콩인 Clark, Jinpum2, Gaechuck1과는 다르게 P34 프로모터 부위의 번역 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 특이적으로 “ATGT”4개의 염기가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다..

상기 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 계통의 P34 프로모터 부위의 염기서열 차이점 2가지를 모식도로 나타낸 결과, 도 6에서도 확인할 수 있듯이 PI567476은 반복되는 TA 염기의 길이가 60 bp이며, Clark은 74bp, Jinpum2는 52bp, Gaechuck1은 54bp로 확인되었으며, 특이적으로 PI567476에서만 번역 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 특이적으로 “ATGT” 4개의 염기가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] P34 프로모터 부위의 염기서열 차이를 이용한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커 개발 I

4-1. 실험재료

본 실험에서 PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통을 사용하였다. 상기 4 계통을 온실에서 키웠으며, 첫 번째 3엽이 자란 시기(1-Trifoliate, V1)의 잎을 채취하였다. 이들 재료들은 액체질소에 급 냉각시킨 상태에서 분쇄 후 -80℃에 보관하였고, 게놈 DNA를 추출하는데 사용하였다.

4-2. 게놈 DNA 의 추출과 게놈 PCR

PI567476, Clark, Jinpum2, Gaechuck1 콩 각 계통의 각각의 잎으로부터 게놈 DNA를 페놀 추출 방법으로 추출 및 정제하였다. P34 프로모터의 염기서열 분석 결과에서, 다른 정상 콩들과는 다르게 P34 단백질 결핍 콩인 PI567476에서만 번역 개시코돈인 ATG의 바로 앞부분에 특이적으로 “ATGT”4개의 염기가 삽입되어 있는 점을 이용하여, 각 콩 계통의 게놈 DNA를 이용한 게놈 PCR을 수행 하였을 때, 특이적으로 PI567476에서만 증폭되는 단편 프라이머 쌍을 합성해 Recessive Marker(RM)로 명명하였다. 반면에 상기와 같은 염기서열 특징을 이용하여 게놈 PCR을 수행 하였을 때, 다른 Clark, Jinpum2, Gaechuck1의 정상 콩에서는 증폭이 되고, PI567476에서만 증폭되지 않는 단편 프라이머 쌍을 합성해 Dominant Marker(DM)로 명명하였다. 합성한 프라이머들의 염기서열은 아래와 같다.

Recessive Marker(RM);

센스 프라이머: 5'-AAA GAA TAT TGG CTA GAT AGA CCG G-3'(서열번호 15)

안티센스 프라이머: 5'-AAG CAA CAC AAG GAA ACC CAT ACA T-3'(서열번호 16)

Dominant Marker(DM);

센스 프라이머: 5'-CAT AAA ATT CTT CCA CCA AGT TAT GG-3'(서열번호 17)

안티센스 프라이머: 5'-TGC GAC ACA TCC TTG GGA GCT TGC-3'(서열번호 18)

PCR은 EX-Taq DNA 중합효소(TAKARA), P34 유전자의 각 단편 특이적 프라이머 쌍과 4 ㎕의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 50 ㎕ 부피로 반응시켰다. 각 PCR은 95℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (95℃, 45초간 -> 57℃에서 30초간 -> 72℃, 25초), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응 조건으로 수행하였다, 단, DM은 상기 동일 조건에서 34회 반복을 44회 반복으로 수행한 것 이외엔 다른 반응 조건은 동일하게 실험하였다.

50 ㎕의 PCR 산물에 6× DNA loading dye 10 ㎕를 섞은 다음, 그 중 20 ㎕를 1.5％ 아가로스 겔에 전기영동을 통하여 도 8의 B에서 확인할 수 있는 DNA 단편들이 증폭됨을 확인할 수 있었다.

4-3. P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 이용한 게놈 PCR 의 결과 분석

상기 게놈 PCR 결과, RM은 P34 단백질 결핍 콩인 PI567476에서만 332 bp 크기의 DNA가 특이적으로 증폭된 것을 확인하였고, DM은 PI567476을 제외한 정상 콩인 Clark, Jinpum2, Gaechuck1에서 369 bp 크기의 DNA가 특이적으로 증폭된 것을 확인하였다. 상기의 결과는 상기 [실시예 1]에서 밝힌 4개 계통의 웨스턴 블랏(Western blot)의 결과와도 동일함을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5] P34 프로모터 부위의 염기서열 차이를 이용한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커 개발 Ⅱ

5-1. 실험재료

본 실험에서 정상 콩인 Clark을 모본으로 하고, P34 단백질 결핍 콩인 PI567476을 부본으로 교잡을 실시하여 이형접합체(Heterozygote)인 F1 종자를 만들었다. 상기 F1 콩을 온실에서 키웠으며, 첫 번째 3엽이 자란 시기(1-Trifoliate, V1)의 잎을 채취하였다. 이들 재료들은 액체질소에 급 냉각시킨 상태에서 분쇄 후 -80℃에 보관하였고, 게놈 DNA를 추출하는데 사용하였다.

5-2. 게놈 DNA 의 추출과 게놈 PCR

본 실험에서 교잡 시에 사용한 모본인 Clark과 부본인 PI567476, 그리고 여기서 얻은 이형접합체인 F1 콩 각 계통의 각각의 잎으로부터 게놈 DNA를 페놀 추출 방법으로 추출 및 정제하였다. 상기 [실시예 4]에 4-2에서 개발한 동일한 단편 프라이머 쌍 즉, RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 사용하여 게놈 PCR를 수행하였다.

PCR은 EX-Taq DNA 중합효소(TAKARA), P34 유전자의 각 단편 특이적 프라이머 쌍과 2 ㎕의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 50㎕ 부피로 반응시켰다. 각 PCR은 95℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (95℃, 45초간 -> 57℃에서 30초간 -> 72℃, 25초), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응 조건으로 수행하였다. 단, DM은 상기 동일 조건에서 34회 반복을 44회 반복으로 수행한 것 이외엔 다른 반응 조건은 동일하게 실험하였다.

50 ㎕의 PCR 산물에 6× DNA loading dye 10 ㎕를 섞은 다음, 그 중 20 ㎕를 1.5％ 아가로스 겔에 전기영동을 통하여 도 9의 도면에서 확인할 수 있는 DNA 단편들이 증폭됨을 확인할 수 있었다.

5-3. P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 이용한 게놈 PCR 의 결과 분석

상기 게놈 PCR를 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 부본인 PI567476에서 RM 프라이머 세트를 이용했을 경우 332 bp 크기의 DNA 단편이 특이적으로 증폭되었고, 모본인 Clark에서는 DM 프라이머 세트를 이용했을 경우 369 bp 크기의 DNA 단편이 특이적으로 증폭되었다. 그러나 이형접합체인 F1에서는 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트에서 모두 증폭됨을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] P34 프로모터 부위의 염기서열 차이를 이용한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커 개발 Ⅲ

6-1. 실험재료

본 실험에서 Clark과 PI567476을 교잡해서 얻은 F1 콩을 자가 수분하여 F2 콩 202개를 얻었다. 상기 F2 콩 202개에서 배가 손상되지 않게 배의 반대 부위의 일부 파편을 채취해 분쇄 후 전체 단백질을 추출하는데 사용하였다.

상기 일부 파편을 채취한 F2 콩 202개를 밭에 파종하여 첫 번째 3엽이 자란 시기(1-Trifoliate, V1)의 잎을 채취하였다. 이들 재료들은 액체질소에 급 냉각시킨 상태에서 분쇄 후 -80℃에 보관하였고, 게놈 DNA를 추출하는데 사용하였다.

6-2. 전체 단백질의 추출과 웨스턴 닷 블랏( Western dot blot )

본 실험에서 상기 F2 콩 202개의 각 파편 표본으로부터 전체 단백질을 추출하였으며 분광광도계를 이용하여 농도를 정량하였다. 정량한 F2 콩 202개의 전체 단백질 1 ㎍/㎕를 NC 막(membrane)에 일정한 간격으로 동시에 올려서 점을 찍고, 약 7분 30초 말린 후, 막(Membrane)을 blocking buffer[20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% nonfat dried milk]에서 2시간 반응 시켜, P34 항체와 1시간 동안 반응시켰다. TTBS buffer[20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 5분씩 3번 씻은 후, 2차 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 다시 상기 TTBS buffer에 5분씩 3번 씻은 후, 단백질-항체 복합체는 ECL kit(Amersham)를 사용하여 확인하였다.

6-3. 웨스턴 닷 블랏 ( Western dot blot ) 결과 분석

상기 F2 콩 202개의 전체 단백질로부터 본 발명에 따른 특이적 항체 (GST-P34의 재조합 단백질의 항체)를 이용한 웨스턴 닷 블랏(Western dot blot)을 실시하여 P34 단백질의 발현양상을 살펴본 결과, 도 10에서도 확인할 수 있듯이, 우성순종개체(Homozygous dominant) 콩에서는 P34 단백질이 대량으로 확인되었고, 열성호모개체(Homozygous recessive) 콩에서는 P34 단백질이 거의 없거나 아주 약하게 있는 것으로 확인되었으며, 이형접합체 콩에서는 그 중간 정도 양의 P34 단백질이 확인할 수 있었다(도 10B).

6-4. 게놈 DNA 의 추출과 게놈 PCR

본 실험에서 일부 파편을 채취한 상기 F2 콩 202개의 잎으로부터 게놈 DNA를 페놀 추출 방법으로 추출 및 정제하였다. 상기 [실시예 4]에 4-2에서 개발한 동일한 단편 프라이머 쌍, 즉, RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 사용하여 게놈 PCR를 수행하였다.

PCR은 EX-Taq DNA 중합효소(TAKARA), P34 유전자의 각 단편 특이적 프라이머 쌍과 2 ㎕의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 50 ㎕ 부피로 반응시켰다. 각 PCR은 95℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (95℃, 45초간 -> 57℃에서 30초간 -> 72℃, 25초), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응 조건으로 수행하였다. 단, DM은 상기 동일 조건에서 34회 반복을 44회 반복으로 수행한 것 이외엔 다른 반응 조건은 동일하게 실험하였다.

50 ㎕의 PCR 산물에 6× DNA loading dye 10 ㎕를 섞은 다음, 그 중 18 ㎕를 1.5％ 아가로스 겔에 전기영동을 통하여 확인하였다.

6-5. P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 이용한 게놈 PCR 의 결과 분석

상기 게놈 PCR를 통해 F2 분리집단(segregating population)의 유전자형을 확인한 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이 우성순종개체(Homozygous dominant) 콩에서는 DM 프라이머 세트를 이용했을 경우 369 bp 크기의 DNA 단편이 특이적으로 증폭되었고, 열성호모개체(Homozygous recessive) 콩에서는 RM 프라이머 세트를 이용했을 경우 332 bp 크기에서 DNA 단편이 특이적으로 증폭 되었다.

또한, 이형접합체 콩에서는 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 이용하였을 때 상기 DNA 단편이 모두 증폭됨을 확인할 수 있었고, 상기 게놈 PCR의 결과는 F2 콩 202개의 웨스턴 닷 블랏(Western dot blot)에서의 P34 단백질 발현양상과 정확히 동일한 결과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

상기 실험에 사용한 F2 202개 콩에서의 웨스턴 닷 블랏(Western dot blot)과 RM 프라이머 세트와 DM 프라이머 세트를 이용한 게놈 PCR의 전체 결과 도 11에서 확인할 수 있듯이 전체 F2 202개 콩의 P34 유전자형(genotyping)을 정확하면서도 편리하게 확인할 수 있었다.

[ 실시예 7] P34 유전자 특이적인 DNA 마커를 이용한 F2 분리집단 유전자형의 통계적 분석

상기 전체 F2 202개 콩에서 Recessive Marker(RM) 과 Dominant Marker(DM) 프라이머 세트를 이용해 게놈 PCR를 수행한 결과, PCR이 전혀 수행되지 않은 F2 18개 콩을 제외하고 나머지 F2 184개 콩에서 게놈 PCR이 잘 수행 되었다. 게놈 PCR이 잘 수행된 F2 184개 콩의 결과를 바탕으로 유전자형별로 분리 비를 관측하였다.

상기 실험을 통해 얻은 관측 값과 미리 고려한 기대 값과의 통계적 유의성을 카이스퀘어(X²)검증 방법으로 살펴보았다.

상기 카이스퀘어(X²)값을 계산한 결과, 상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이 신뢰구간 95%에서 1:2:1 로 정확히 분리 되는 것을 확인 할 수 있었으며, 또한 우성(Dominant) 형태와 열성(Recessive) 형태가 3:1로 분리 되는 것으로 보아 P34 단백질의 형질은 단일 유전자에 의해 결정됨을 확인할 수 있다.

따라서 상기 실시예의 결과로부터 본 발명의 P34 특이적 항체를 이용한 알러지 콩 품종의 생물학적인 진단 방법과 함께 게놈 PCR를 이용한 P34 유전자 특이적인 DNA 마커인 Recessive Marker(RM)과 Dominant Marker(DM) 프라이머 세트를 이용하면, 알러지 유발물질이 적은 콩 계통을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Industry Foundation of Gyeongsang National University <120> Methods for identifying low allergenic soybean using P34 gene-specific DNA markers <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 1 ttatgggttt ccttgtgttg cttc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 2 tgcgacacat ccttgggagc ttgc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 aagtttgctg acatcactcc tcaa 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 tgacattatt agagtttcat atccg 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 5 cagagctaaa gagggtagat gcaaagc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 6 tcaaagagga gagtgatcaa ctcttcg 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 7 ctggtcataa agtgggagta tgtgg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 8 tacatgcctc atgacaccta agcac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 9 ttcttcacta agtgtgctta ggtgt 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 10 ctcctttaat gcaatcttct caagg 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 11 tgagaagatt gcattaaagg aggtc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 12 aatgatgaat cgttgataag cagcg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 13 tctagcagtc tagcttatga ggctc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 14 tggaactaga agagagacct aagag 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 15 aaagaatatt ggctagatag accgg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 16 aagcaacaca aggaaaccca tacat 25 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 17 cataaaattc ttccaccaag ttatgg 26 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 18 tgcgacacat ccttgggagc ttgc 24

Claims

서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 Recessive marker 프라이머 세트; 또는 서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 Dominant marker 프라이머 세트;로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트.
제 1항에 따른 프라이머 세트; 및
PCR(Polymerase chain reaction)에 필요한 시약;
을 포함하는, 항알러지 콩 품종 식별용 키트.
a) 콩으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제 1항에 따른 항알러지 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 이용하여 게놈 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는, 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 게놈 DNA는 콩의 종자, 잎 또는 이들의 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 항알러지 콩 품종의 식별방법은 겔 전기영동을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법.
제 3항 내지 5항에 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 항알러지 콩 품종의 식별방법은 동형 접합체 콩(homozygote wild type) 품종의 유전자형(genotype)에서는 제 1항의 Dominant marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편만 증폭되고;
P34 단백질의 함량이 낮은 항알러지 콩(homozygote low P34 genotype) 품종의 유전자형에서는 제 1항의 Recessive marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편만 증폭되며;
이형접합체 콩(heterozygote genotype) 품종의 유전자형에서는 상기 제 1항의 Dominant marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편 및 Recessive marker 프라이머 세트에 기인한 DNA 단편 모두가 증폭되는 것을 특징으로 하는 항알러지 콩의 품종을 식별하는 방법.