KR20010074013A

KR20010074013A - 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규전사 조절 인자

Info

Publication number: KR20010074013A
Application number: KR1020000072720A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 박해란
Original assignee: 남홍길; (주)제노마인
Priority date: 2000-12-02
Filing date: 2000-12-02
Publication date: 2001-08-04
Also published as: CN1478148A; US20040072289A1; KR100350215B1; WO2002044389A1; CN1246464C; AU2001241233A1; US7141720B2

Abstract

본 발명은 삼투 스트레스에 의해 유도되는 식물의 전사 조절 인자 AtSIZ, 상기 전사 인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 상기 AtSIZ는 C₃H형 징크 핑거 모티프를 갖는 폴리펩타이드로서 식물의 스트레스 반응에 관련된 유전자들의 전사를 활성화하는 전사 조절 인자로 작용하므로,AtSIZ유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 식물체를 형질전환하여 상기 유전자를 과발현시킴으로써 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물체를 생산할 수 있으며, 이를 통해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사 조절 인자 {Novel transcriptional factor enhancing the resistance of plants to osmotic stress}

본 발명은 삼투-스트레스에 의해 유도되는 식물의 전사 조절 인자 AtSIZ, 상기 전사 인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

높은 염농도나 가뭄, 추위 등에 의한 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소 중 하나로 작용한다. 이와 같이 식물의 성장을 저해하는 환경 스트레스 있어서 가장 가혹한 스트레스는 탈수, 고염 및 추위 등 다양한 외부 조건에 의해서 야기되는 삼투 스트레스 (osmotic stress)이다.

삼투 스트레스에 대한 저항성이 약간만 증가하여도 농업 생산성과 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 삼투 스트레스에 대한 조절 기작과 이에 관련된 조절 인자에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다. 최근 연구들은 식물이 삼투 스트레스에 대한 적응 반응의 일부로 정밀한 기작을 가지고 있으며, 이러한 스트레스 적응 반응의 중요한 기작 중 하나는 적응 반응에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 활성화라는 사실을 밝히고 있다 (Janget al.,Plant Mol. Biol.37:839-847, 1998; Liuet al., Science280:1943-1945, 1998; Pardoet al.,Proc. Acad. Natl. Sci. USA95:9681-9686, 1998; Liuet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:3730-3734, 2000).

또한 이러한 삼투 스트레스에 적응하기 위한 기작을 이해하기 위해 특정한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 다수의 유전자들이 분리되었고, 그 특성이 광범위하게 연구되었다. 그 결과, 삼투 스트레스 반응 유전자의 발현을 유도하는 다양한 신호전달 체계가 존재하며 (Jonaket al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11274-11279, 1996; Ishitaniet al., Plant Cell9:1935-1949, 1997), 이러한 신호전달 체계는 ABA-의존성 또는 ABA-비의존성 경로를 포함하고 (LaRosaet al.,Plant Physiol.85:174-181, 1987; Savoureet al., Mol. Gen. Genet.254:104-109 1997), 어떤 신호전달 경로는 추위, 고염 및 탈수와 같은 모든 삼투 스트레스 조건에서 공통적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다 (Janget al.,Plant Mol. Biol.37:839-847, 1998; Liuet al., Science280:1943-1945, 1998; Pardoet al.,Proc. Acad. Natl. Sci. USA95:9681-9686, 1998; Liuet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:3730-3734, 2000).

이와 같이 스트레스 적응 반응에서 스트레스 반응 유전자들에 대한 전사조절이 중요한 역할을 하므로, 이러한 조절 반응에 관여하는 특정한 전사 조절 요소를 탐색하기 위해 삼투 스트레스에 의해 발현이 유도되는 유전자들이 분리되었고, 이들 중 전사 조절 요소 또는 이들의 유사체를 암호화하는 유전자에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔다 (Tagueet al., Plant Mol. Biol. 28:267-279, 1995; Bastolaet al., Plant Mol. Biol. 24:701-713, 1998; Kasugaet al., Nat. Biotechnol.17:287-291, 1999; van Der Krolet al., Plant Physiol.121:1153-1162, 1999; Nakashimaet al., Plant Mol. Biol.42:657-665, 2000). 이러한 연구들에 의해 상기 유전자들 중 일부에 의해 암호화되는 전자 조절 인자들이 징크 핑거 모티프를 가지고 있음이 밝혀졌고, 이러한 전사 조절 인자의 예로는 Atmyb2, ATHB-7, mlip15 (Kusanoet al., Mol. Gen. Genet. 248:507-517, 1995; Sodermanet al., Plant J.10:375-381, 1996), Alfin1 (Bastolaet al., Plant Mol. Biol. 24:701-713, 1998) 및 AZF1∼3 (Sakamotoet al., Gene248:23-32, 2000)이 알려져 있다.

구체적으로, 상기 애기장대의 Atmyb2는 탈수 스트레스에 의해 유도된 후 MYB인식 보존 서열 (conserved sequence)과 결합하고, 또다른 애기장대 호메오박스 (homeobox) 유전자인 ATHB-2는 탈수 및 ABA (abscisic acid) 처리에 의해 유도되며, 옥수수에서 bZIP 모티프를 가지고 있는 전사요소 유사체인 mlip15는 낮은 온도에서 유도된다. 다른 징크 핑거 단백질인 Alfin1은 염 스트레스에 의해 유도되는데, MsPRP2의 프로모터 결합 자리를 가지고 있으며, 자주개자리 (alfalfa) 뿌리에서 MsPRP2 발현을 조절하는데 중요한 역할을 하여 이 식물의 염 내성에 기여할 것으로 알려져 있다. 또한 최근 DRE/CRT 결합 단백질을 코딩하고 있는 유전자 가족을 분리하고 특성을 연구한 결과에 따르면 (Liuet al. Plant Cell10:1391-1406, 1998) 이들 유전자들은 RD29A, Cor6.6 및 RD17과 같은 다양한 탈수 또는 저온 유도 유전자의 프로모터 위치에서 발견되는 보존된 9개의 염기서열과 결합하는 DREB1 (dehydration-responsive element binding protein) 및 DREB2를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 그러나, 상기에서 언급한 것들은 단지 삼투 스트레스 반응과 관련된 거대한 그룹을 이루는 전사 조절 요소의 일부분의 예를 나타낼 뿐이다.

상기와 같은 전사 조절 인자들은 스트레스에 대한 반응 유전자들의 전사를 활성화하는 역할을 하므로, 이들을 식물체에서 과발현 또는 억제함으로써 스트레스 저항성 식물을 제조하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 식물체에 대한 환경 스트레스, 그 중에서도 특히 삼투 스트레스에 대한 저항성과 관련된 새로운 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행하였으며, 그 결과 애기장대로부터 분리한 신규 AtSIZ가 징크 핑거 모티프를 가지며, 스트레스 반응 유전자들의 전사를 조절하는 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 이들의 과발현에 의해 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 삼투 스트레스에 의해 발현이 유도되는 각종 스트레스 반응 유전자들의 발현을 유도하는 활성을 가진 새로운 식물 전사 조절 인자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 전사 조절 인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 진핵세포 발현벡터를 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 목적은 상기 전사 조절 인자 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은AtSIZ유전자 염기서열로부터 추정되는 AtSIZ의 아미노산 서열을 징크 핑거 모티프를 갖는 다른 단백질들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 꽃 (F), 잎 (L), 뿌리 (R) 및 장각 (silique; S)과 같은 다양한 식물 조직에서AtSIZ유전자의 발현양상을 노던 블럿 (northern blot)으로 분석한 결과이고,

도 3은 다양한 삼투 스트레스 유도에 의한AtSIZ유전자의 발현양상을 노던 블럿으로 분석한 결과 (숫자는 각각의 삼투 스트레스 처리 시간을 의미)이고,

도 4는AtSIZ유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 변이체를 PCR 선별 (PCR screening) 및 서던 블럿 (southern blot)으로 선별 및 확인하고, PCR 산물을 염기서열 분석하여 T-DNA의 삽입 위치를 확인한 것이고,

A : 첫 번째 PCR 선별 산물을 아가로즈 겔 전기영동한 결과

LB : T-DNA의 좌측 경계 (left border) 프라이머

B : 세 번째 PCR 선별 산물을 아가로즈 겔 전기영동한 결과

C : T-DNA 삽입 변이체에서 T-DNA의 삽입 위치를 나타낸 것

도 5는 T-DNA 삽입 변이체의 표현 형질을 조사한 것으로,

A : T-DNA 삽입 변이체 (mt)와 야생형 (WT)에서AtSIZ유전자의 발현양상을 노던 블럿으로 분석한 결과

B : T-DNA 삽입 변이체 (mt) 및 야생형 식물 (WT)에 각각 25 (b), 50 (c) 및 100 (d) mM의 NaCl을 처리한 후 일반적인 생장조건에서 재배한 식물체 (a)와 비교하여 잎에 나타나는 표현형질의 변화를 조사한 결과

2, 4, 6, 8의 숫자는 각각 두 번째, 네 번째, 여섯 번째 및 여덟 번째 잎을 나타냄 (이하 동일)

도 6은 T-DNA 삽입 변이체에AtSIZcDNA 유전자를 보완 (complementation)하여 NaCl 스트레스에 대한 민감도 변화를 조사한 결과이고,

A : 변이체/AtSIZ식물체가AtSIZ유전자를 발현하는지 여부를 확인한 노던 블럿 분석 결과

B : 변이체/AtSIZ식물체에서AtSIZ유전자에 의한 보완의 정도를 NaCl 스트레스에 대한 민감도로 조사한 것

a, b, c, d는 각각 0, 25, 50 및 100 mM의 NaCl을 처리한 것

도 7은 T-DNA 삽입 변이체 및 변이체/AtSIZ식물체에서AtSIZ와 삼투 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자COR5a및RD29A의 발현양상을 노던 블럿으로 분석한 결과이고,

NaCl : 150 mM NaCl을 6시간 처리

cold : 4℃ 저온에서 6시간 처리

2-2, 5-4 : 두 개의 독립된 변이체/AtSIZ식물체 계열

도 8은 야생형 및AtSIZ유전자 과발현 형질전환체에서AtSIZ의 발현여부를 노던 블럿으로 분석하고 (A), 이들 식물체의 NaCl에 대한 민감성을 조사한 결과이고 (B),

도 9a는AtSIZ유전자에 결실 (deletion)을 일으켜 C-말단 부위가 변화된 다양한 길이의 AtSIZ가 GAL4 DNA 결합부위 (GAL4 BD)와 융합 단백질 형태로 발현되도록 제작한 GAL4-AtSIZ 융합 제조체의 구조를 개략적으로 도식화한 것이고,

Rich-E : AtSIZ 내부에 글루탐산 (glutamic acid)이 풍부한 부위

도 9b는 상기 9a에서 제조된 다양한 길이의AtSIZ유전자로 형질전환된 효모에서 β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 활성을 측정하여 전사 활성화 부위를 조사한 결과를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 596개의 아미노산 서열을 갖는 식물 전사 조절 인자, AtSIZ를 제공한다.

상기 전사 조절 인자 AtSIZ는 애기장대로부터 분리된 것으로 211부터 325 번째 아미노산 위치 사이에 3개의 C₃H 징크 핑거 모티프를 가지며, C-말단 영역에 전사 활성 도메인을 갖고 있다. AtSIZ에 의해 전사가 활성화되는 유전자는 삼투 스트레스에 의해 유도되는 일련의 유전자로서, 예를 들어 추위에 대한 저항성을 부여하는COR15a(cold-regulated protein) 유전자 또는 탈수, 추위, 고농도의 염 스트레스에 대한 저항성을 부여하는RD29유전자 등이 이에 해당한다.

상기 AtSIZ는 C-말단 부위에서 약 206개의 아미노산 잔기를 제거하여도 스트레스에 의해 유도되는 유전자들의 전사 촉진 활성에는 변화가 없지만, 상기 206개의 아미노산에서 추가적으로 45개의 아미노산 잔기를 결실시킨 경우에는 AtSIZ의 전사 촉진 활성이 현저히 감소하는 것으로 보아 상기 345번째 아미노산 잔기부터 390번째 아미노산 잔기 사이의 부위가 AtSIZ의 활성에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 AtSIZ 단백질 C-말단 부위의 391∼596번째 아미노산이 결실되어 1∼390번째 아미노산 잔기만으로 구성된 AtSIZ 단백질의 일부분도 본 발명에서 목적하는 삼투 스트레스 저항성 식물체의 제조에 이용될 수 있으며, 본 발명은 이를 위해 서열번호 2의 아미노산 서열 중 1∼390번째 아미노산으로 이루어진 AtSIZ 단백질 일부를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사 조절 인자 AtSIZ를 암호화하는AtSIZ유전자를 제공한다. 상기 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며, 삼투 스트레스, 특히 고농도의 NaCl 처리에 의해 유도되는 유전자이다.

상기AtSIZ유전자에 변이가 생긴 경우, 식물체는 삼투 스트레스에 대해 민감성을 나타내게 되어 잎에 안토시아닌 (anthocyanin)이 축적되고, 잎의 가장자리에 손상이 나타나며, 크기가 작고 황화 현상을 나타낸다. 반면에AtSIZ유전자를 과발현하는 식물체는 고농도의 NaCl 처리에 의한 삼투 스트레스로 야생형 식물체가생존하지 못하는 조건 하에서도 높은 생존율을 보인다.

따라서 본 발명은 상기AtSIZ유전자를 식물체에 도입하여 형질전환체를 제조하고AtSIZ유전자를 과발현시킴으로써 식물체의 삼투 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법을 통해 식물체의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다. 이때 식물체를 형질전환시키기 위한AtSIZ유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는AtSIZ전장 cDNA 유전자일 수도 있으며, 스트레스 관련 유전자들의 전사 촉진 활성을 갖는 부위만을 포함하는 AtSIZ의 일부분 (1∼390번째 아미노산)을 암호화하는 유전자일 수도 있다.

본 발명에서 "삼투 스트레스 유도 유전자" 또는 "삼투 스트레스 반응 유전자"라 함은 식물체에 가해지는 고농도의 염, 저온, 탈수, 외부 ABA 처리 등에 의해 야기되는 삼투 스트레스에 의해 식물체로부터 유전자 발현이 유도되며, 삼투 스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 나타내는데 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다. 또한, "AtSIZ보완체"라 함은 활성AtSIZ유전자를 포함하고 변이체에서 AtSIZ 전사 인자를 발현할 수 있는 재조합벡터를 의미하며, "변이체/AtSIZ"는 상기AtSIZ보완체로 형질 전환된 변이 식물체를 의미한다.

본 발명의 기재에 있어, 전사 조절 인자 AtSIZ를 암호화하는 유전자는 이탤릭체를 이용하여 "AtSIZ유전자" 또는 "AtSIZ"로 나타내었으며, 이에 의해 암호화되는 단백질은 "AtSIZ 단백질" 또는 "AtSIZ"로 나타내었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 삼투 스트레스에 의해 발현되는 새로운 유전자를 탐색하기 위해, 고농도의 염 스트레스에 의해 유도된 cDNA 라이브러리와 스트레스를 처리하지 않은 상태에서 항상적으로 발현되는 대조군 cDNA 라이브러리로부터 각각 단일 가닥 DNA를 분리하여 이들을 혼성화함으로써 항상적으로 발현되는 cDNA을 제거한 감산 라이브러리 (subtraction library)를 제작하였다.

구체적으로 항상적으로 발현되는 cDNA의 제거는 대조군 cDNA 라이브러리에서 얻은 단일 가닥 DNA를 바이오틴 (biotin)으로 표지하고, 염 스트레스에 의해 유도된 cDNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA와 혼성화시킨 다음, 바이오틴이 스트렙타비딘 (streptavidin)과 결합하는 성질을 이용하여 스트렙타비딘으로 코팅된 막으로 혼성화된 DNA를 제거함으로써 수행하였다. 이러한 과정을 거쳐 남아 있는 단일 가닥 DNA는 고농도의 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현되는 유전자에 해당하는 것으로, 이들에 대해 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 삼투 스트레스에 의해 발현 유도되는 총 15개의 cDNA 클론을 찾아내었고, 이들 중 염기서열이 알려져 있지 않은 새로운 클론 OS183을 탐침으로 하여 약 66 kDa의 분자량을 갖는 596개의 아미노산을 암호화하는 전사해독틀 (open reading frame)을 포함하는 2267bp 크기의 전장 (full-length) cDNA 클론을 분리하였으며, 이를AtSIZ(Arabidopsis Stress-Induced Zinc Finger)로 재명명하였다.

상기AtSIZ유전자의 염기서열은서열번호 1에 나타나 있으며, 이로부터 추정되는 AtSIZ 단백질의 아미노산 서열은서열번호 2에 나타나 있다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 AtSIZ 단백질은 징크 핑거 모티프를 갖는 다른 단백질들과 높은 상동성을 나타내며 (도 1참조), CX₇CX₅CX₃H [C는 시스테인, H는 히스티딘, X는 임의의 아미노산을 의미] 보존 서열을 포함하는 C₃H형 징크 핑거 모티프를 중앙에 갖고 있고, 상기 징크 핑거 부위 앞에 6개의 클루탐산 잔기가 연속된 산성 부위를 갖고 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기AtSIZ유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 애기장대의 꽃, 잎, 뿌리 및 장각으로부터 전체 RNA를 분리하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과,AtSIZ는 조직별로 다른 발현 양상을 나타내었는데, 가장 높은 발현은 뿌리 조직에서 나타났으며, 그 다음으로 꽃, 잎의 순서였으나, 장각에서는 거의 발현되지 않았다 (도 2참조). 한편,AtSIZ는 원래 높은 NaCl 농도 조건에서 유도되는 유전자로서 분리된 것이므로, 다양한 삼투 스트레스 조건 하에서의 발현 양상을 조사하기 위해 식물에 고농도의 NaCl, 추위, 탈수 또는 외부적으로 ABA를 각각 처리한 후AtSIZ의 발현 정도를 노던 블럿으로 분석하였다. 그 결과AtSIZ의 발현 유도 정도에는 차이가 있지만, 고농도의 염 이외에도 추위, 탈수, ABA 처리에 의해 모두 그 발현이 유도되는 것으로 보아 일반적인 삼투 스트레스 반응에 관여함을 확인하였다.

상기 스트레스 반응에 대한AtSIZ유전자의 발현 유도 양상은 사용된 특정 조건에 따라 다르게 나타났는데, 이는AtSIZ의 발현이 특정한 스트레스 조건에 따라 다양한 수준으로 조절받는다는 것을 보여주는 것이다 (도 3참조).

아울러 본 발명의 또다른 실시예에서는,AtSIZ유전자에 변이가 일어난 경우변이 식물체는 NaCl 스트레스에 민감한 반면에AtSIZ과발현은 NaCl 스트레스에 대한 저항력을 증가시킨다는 것을 보였다.

구체적으로, 상기AtSIZ유전자에 T-DNA가 삽입된 변이 식물체는 T-DNA 삽입체를 가지고 있는 형질 전환체들 (ABRC, USA)로부터AtSIZcDNA에 특이적인 프라이머와 T-DNA에 특이적인 프라이머를 조합하여 PCR을 수행하고 표지된AtSIZcDNA를 혼성화 탐침으로 이용하여 서던 블럿 함으로써 선별하였다. 그 결과,도 4a에 나타난 바와 같이, T-DNA의 좌측 경계 (left border; LB)에 특이적인 프라이머와AtSIZcDNA의 3' 말단에 특이적인 프라이머를 이용하여 얻어진 PCR 산물이AtSIZ유전자와 혼성화 되었으며, 이는AtSIZ유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 변이체가 존재함을 의미하는 것이다. 상기에서 얻어진 PCR 산물이AtSIZ유전자와 동일성을 갖는지 여부와 T-DNA의 삽입 위치를 확인하기 위하여 PCR로 선별된 T-DNA 삽입 변이체의 PCR 산물에 대해 염기 서열을 분석한 결과, T-DNA는AtSIZcDNA의 615번째 뉴클레오티드 위치에 삽입되어 있음을 확인하였다.

상기 T-DNA 삽입에 의해AtSIZ유전자에 변이가 일어난 식물체를 통해AtSIZ유전자의 생리적 역할을 조사하기 위하여, 변이체에 다양한 조건의 스트레스를 주고 변이체의 표현형을 조사한 결과, 변이체 식물들은 잎에 안토시아닌이 축적되었고, 야생형 식물체들이 어떠한 증상도 보이지 않는 NaCl 농도인 25 mM에서 잎의 가장자리에 손상이 나타났다. 또한, 보다 고농도의 NaCl을 처리한 경우, 변이체 식물의 잎은 야생형 식물의 잎보다 작은 크기로 자랐으며, 노란 표현형을 보였다. 이러한 결과들은AtSIZ유전자에 변이가 일어난 식물들이 야생형 식물보다 NaCl 스트레스에 훨씬 민감하게 됨을 보여주는 것으로,AtSIZ유전자가 NaCl 스트레스에 대한 저항성에 관여함을 나타내는 것이다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기와 같은 AtSIZ의 생리 활성을 보다 확실히 확인하기 위해 보완 실험 (complementation test)을 수행하였다. 즉, 변이체에 대해AtSIZ유전자가 보완 능력을 가졌는지를 확인함으로써, 상기 변이체들의 나타내는 삼투 스트레스에 의한 표현형 변화가AtSIZ유전자 내부에 T-DNA가 삽입되어 일어났음을 증명하고자 하였다.

AtSIZcDNA를 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 유전자를 표지 유전자로 가지고 있는 pBIB-HYG 바이너리 벡터에 삽입하여AtSIZ보완체를 제조하고, 이를 아그로박테리움-매개 진공침투법으로 T-DNA 삽입에 의한AtSIZ유전자 변이를 갖고 있는 변이 식물체에 도입하였다. 상기에서 얻어진 변이체/AtSIZ, 변이체 및 야생형 식물에 대해 노던 블럿 분석 및 NaCl 스트레스에 대한 민감도를 조사하였다. 상기와 같은AtSIZ보완 실험 결과, 변이체의 경우와는 달리 변이체/AtSIZ에서AtSIZ가 높은 수준으로 발현되었으며, 변이체/AtSIZ는 야생형과 마찬가지로 NaCl에 대한 저항성을 나타내었다 (도 6참조). 이러한 결과로부터 변이체에서 나타나는 삼투 스트레스 민감성 형질이AtSIZ유전자의 변이에 의한 것임을 확인할 수 있다.

한편, 전사 조절 인자 AtSIZ가 NaCl 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자들의 전사에 영향을 미치는지, 즉 다른 스트레스 반응 유전자들의 전사 조절에 관여하는지 조사하였는데, 대상이 되는 스트레스 반응 유전자로는 외부 ABA 처리뿐만 아니라 다양한 형태의 삼투 스트레스에 의해 발현이 유도되는COR15a및RD29A의발현에 초점을 맞추었다.

COR15a는 추위 순응을 겪는 식물체에서 발현되는 COR (cold-regulated) 유전자 중의 하나인데 이들 유전자의 산물은 냉동 (freezing) 내성에 관여할 것이라 생각되어 왔으며 (Artuset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA93(23):13404-13409, 1996), 최근 보고에 의하면COR15a의 항시 발현은 추위에서 아라비돕시스가 생존할 확률을 높이는 것으로 알려져 있다. 온도가 내려가면 삼투 반응성에 필요한 세포막 (plasma membrane)의 물리적인 연속성과 반투막 특징이 파괴되기 때문에 세포질과 기관 내에 있는 물질의 누수가 일어나고 세포막이 엽록체의 외막과 같은 세포 내부의 막 (endomembrane)과 융합되어 냉동 저항성이 떨어지게 된다.COR15a는 냉동-유도에 의한 이러한 세포막과 엽록체막 사이의 변화를 감소시켜 식물의 생존률을 높이는 역할을 하는 스트레스 반응 유전자이다.

한편RD29는 탈수, 추위, 고농도의 염 조건에서 발현이 유도되는 애기장대의 유전자로,RD29A와RD29B두 종류의 유전자가 있으며RD29A프로모터는 수분 결핍이 있을 때 성장하는 식물체의 대부분의 기관과 조직에서 작동하여 탈수 스트레스에 대한 저항성을 높이는 것으로 알려져 있다 (Yamaguchiet al., Mol. Gen. Genet.236:331-340, 1993).

변이체, 변이체/AtSIZ및 야생형 식물체에 고농도의 NaCl, 추위, 그리고 외부 ABA 처리로 스트레스를 가한 다음, 상기 NaCl 스트레스 반응 유전자의 발현 정도를 조사한 결과에 따르면,AtSIZ유전자의 변이가 NaCl 스트레스로 인한COR15a의 유도는 특이적으로 억제하지만, 저온에 의한COR15a유도는 억제하지 않는 것으로 나타났다 (도 7참조). 이와 반대로, 변이체에서 NaCl과 추위 스트레스로 인한RD29A유도는 정상적이었으며, 이는AtSIZ유전자의 변이가 NaCl 및 추위 스트레스에 의한RD29A유전자 발현 유도에는 영향을 미치지 않음을 보여주는 것이다. 이러한 결과들은AtSIZ유전자가 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자들의 NaCl 스트레스 특이적인 발현 유도에 관여한다는 것을 강력히 암시한다.

한편AtSIZ의 NaCl 반응 관여는 AtSIZ 생산물 과발현 결과로 더 지지되었는데,AtSIZ가 야생형에 비해 10∼20배 과발현되는 형질전환 식물은 고농도의 NaCl 스트레스에 대해 저항성이 증가하였다 (도 8참조).

또한, 본 발명의 또다른 실시예에서는 AtSIZ의 전사 조절 인자로서의 활성과 그 활성 부위를 조사하고자 유전자 결실 및 효모 단일 하이브리드 실험을 수행하였다. AtSIZ가 전사 조절 활성을 가지고 있다면AtSIZ유전자를 GAL4 DNA 결합 부분과 결합단백질로서 발현시켰을 때, 리포터 유전자인 gal1-LacZ의 전사를 활성화를 시킬 것이다. 효모 단일 하이브리드 실험 결과 AtSIZ는 효모에서 리포터 유전자 (reporter gene)인 gal1-LacZ의 전사를 활성화시켰으며 이로써 AtSIZ가 전사 촉진 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 결실 실험 (deletion test) 결과는 서열 번호 2의 AtSIZ 아미노산 서열의 C-말단의 206개 아미노산이 결실된 경우에는 리포터 유전자에 대한 전사 촉진 활성을 유지하였으나, 추가적으로 45개의 아미노산을 결실시킨 경우에는 전사 촉진 활성이 현저히 감소하여 345∼390번째 아미노산 부위에 전사 촉진 활성 부위가 존재함을 예측할 수 있었다 (도 9a및9b참조). 따라서 서열번호 1∼390번째의 아미노산만으로 구성된 AtSIZ의 일부분도식물의 삼투 스트레스 저항성을 높이기 위한 목적으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료 애기장대의 재배

본 발명의 실험에서 사용한 모든 애기장대는 22℃ 배양실 (culture room) 안에서 MS 플레이트 (plate) 또는 70% 상대습도와 16시간 명조건/8시간 암조건의 주기로 조절되는 온실에서 재배하였다. 한편 화학 처리를 하기 위해서는 어린 애기장대를 MS 배양액이 들어있는 250 ml 플라스크에서 22℃, 16/8시간 명암 주기의 조건하에 1000 rpm으로 교반하면서 재배하였다. 식물의 다양한 조직 부분은 채취한 뒤 액화 질소에서 급격히 얼렸다.

<실시예 2> 삼투 스트레스 유도 유전자 분리

삼투 스트레스, 그 중에서도 염 (salt) 스트레스에 의해서 발현이 유도되는 유전자들을 분리하기 위하여 감산 라이브러리 (subtraction library)를 제작하고 무작위로 선택된 cDNA을 염기서열 분석하여 스크리닝하였다. 상기 감산 라이브러리는 염 스트레스에 의해 유도된 식물체에서 cDNA을 추출하고 상기 cDNA을 스트레스-유도되지 않은 과량의 대조군 (control) cDNA와 혼성화하여 항시적으로 발현되는 cDNA을 제거하는 과정을 거쳐 제작하였다.

2-1) 식물체의 배양

스트레스 유도된 cDNA을 얻기 위해 실시예 1의 조건으로 애기장대를 배양하고 일주일이 지난 후 염 스트레스를 주기 위해서 0.15 M NaCl을 포함한 MS 배지로 교체한 다음, 교반을 하면서 1시간 내지 6시간 동안 더 키웠다. 모든 식물 묘목 (seedling)은 즉시 얼리고 -80 ℃에 보관하였다.

2-2) RNA 추출과 cDNA 라이브러리의 제조

삼투 스트레스 유도된 cDNA 라이브러리를 만들기 위해서 0.15 M NaCl로 6시간동안 처리하고 얼린 애기장대 묘목으로부터 염화리튬/페놀 (LiCl/ phenol) 방법으로 RNA을 추출하였고, 추출된 전체 RNA로부터 mRNA 분리 키트 (Pharmacia, USA)의 프로토콜에 따라 poly(A)⁺RNA을 분리하였으며, 삼투 스트레스를 처리하지 않은 대조군 cDNA의 경우 스트레스 처리하지 않은 식물 표본으로부터 poly(A)⁺RNA를 분리하였다. poly(A)⁺RNA과 cDNA 합성 키트 (Stratagens, USA)를 이용하여 이중 가닥의 cDNA를 제조하고 이를 λZAPⅡ (Stratagene, Inc)에 연결하여 λZAPⅡ cDNA 라이브러리를 제조하였다.

2-3) 감산 라이브러리의 제조

λZAPⅡ cDNA 라이브러리로부터 단일 가닥의 파아지 (filamentous phage)를 얻은 다음, 이로부터 단일 가닥의 DNA를 순수 분리하였다. λZAPⅡ cDNA 라이브러리로부터 항시적으로 발현되는 cDNA을 제거하기 위해 스트레스 처리하지 않은 과량의 대조군 cDNA로 감산 (subtraction)을 수행하였다.

감산을 하기 위한 과량의 대조군 cDNA를 바이오틴으로 표지하기 위해 바이오틴과 결합한 (biotinylated) dUTP 존재 하에 상기에서 얻어진 이중 가닥 대조군 cDNA을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로 이중 가닥의 대조군 cDNA 100 ng을 주형으로 사용하였고, 프라이머로는서열번호 3및4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 각각 50 ng씩 이용하였으며, 94℃에서 30초, 38℃에서 30초, 72℃에서 30초로 50회 증폭하였다. 상기 반응 혼합물 안에는 바이오틴-16-dUTP 50 μM을 첨가하여 PCR 산물이 바이오틴과 결합된 형태로 제조되도록 하였다.

염에 의해 유도된 라이브러리에서 항상적으로 발현되는 cDNA을 제거하기 위해 65℃ 혼성화 반응용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.25M NaCl, 1.0mM EDTA) 100μl에서 λZAPⅡ cDNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA 0.1 μg를 상기 바이오틴과 결합한 대조군 cDNA 1.0 μg와 밤새 혼성화 (hybridize)하였다. 혼성화된 DNA을 스트렙타비딘으로 코팅된 여러개의 막과 혼합하여 얼음 위에서 2시간 동안 때때로 교반하면서 배양한 다음, 막 조각들을 제거하였다. 스트렙타비딘은 바이오틴과 결합하는 성질을 가지므로 바이오틴과 결합되어 있는 대조군 cDNA와 혼성화된 시료cDNA는 상기 스트렙타비딘이 코팅된 막을 반응 후 제거함으로써 제거될 수 있다. 즉, 혼성화 결과 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현된 cDNA들만이 혼성화 반응에 참여하지 않고 용액 안에 남게 되므로, 이 cDNA를 페놀/클로로포름 (phenol/CHCl₃)과 CHCl₃로 추출하였다. 최종적으로 상기 cDNA을 운반체 (carrier) tRNA 2μg과 차가운 에탄올로 -20 ℃에서 침전시켰다. 상기에서 얻어진 cDNA을 전기천공법으로 숙주인 대장균에 도입한 다음, 무작위로 추출된 cDNA 클론의 염기서열을 자동 염기서열 분석기기 (automatic sequencer)로 분석하였다.

상기 염기서열 분석 결과, 애기장대에서 총 15개의 삼투 스트레스 유도 EST (expressed sequence tag) cDNA 클론을 찾아냈고, 이들 중 4개의 cDNA가 새로운 유전자였으며, 이들 중 0.8 kb 크기의 클론에 대해 이후의 실험을 진행하였다.

<실시예 3> AtSIZ cDNA 분리

삼투 스트레스에 대한 식물 반응의 기작을 이해하기 위해, 상기 클론의 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열을 NCBI의 Blast 프로그램을 이용해 데이터베이스와 비교한 결과 상기 아미노산 서열은 징크 핑거 모티프를 가지고 있는 다른 단백질들과 매우 높은 정도로 서열 상동성을 나타내었다. 구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이 C₃H-유사체 (isolog)와 55.7%, C₃H-Zfp2와 23.7%, PEI1과 19.1% 정도의 높은 상동성을 가지고 있었으며, 따라서 본 발명자들은 상기에서 분리된 유전자로부터 발현되는 단백질을 AtSIZ (Arabidopsis Stress-Induced Zinc Finger)로 재명명하였다. 상기AtSIZcDNA 클론은 부분 클론이기 때문에 전장 (full-length) cDNA를 얻기 위해서AtSIZ삽입체를 탐침으로 하여 실시예 2에서 제조한 애기장대 λZAPⅡ cDNA 라이브러리를 검색하였다. 상기 스크리닝으로부터 약 66 kDa의 추정 분자량을 갖는 596개의 아미노산을 암호화하는 전사해독틀 (open reading frame)을 포함하며 2267 bp 크기 (서열번호 1)를 갖는 전장 cDNA 클론을 분리하였다. 분리된 전장 cDNA를 pBluescript에 서브클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하고 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된 대장균 (E. coli)을 2000년 11월 3일 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (기탁 번호 : KCTC 0886BP).

상기 전장 cDNA의 염기서열로부터 추정되는 AtSIZ 아미노산 서열을 BlastX 서열비교 프로그램을 이용하여 C₃H 유사체 (Protein Accession Number : g1871192), C₃H-Znfp2 (g3643609) 및 PEIl (g2961542)의 아미노산 서열과 비교한 결과, 상기 cDNA로부터 추정되는 아미노산 서열 (서열번호 2)에서 징크 핑거 모티프를 포함한 다른 단백질과 가장 높은 상동성을 갖는 부분은 징크 핑거 부분이 위치하고 있는 단백질의 중앙 부분인 것으로 나타났다 (도 1참조).도 1에서 AtSIZ의 아미노산과 동일한 아미노산 위치는 검은 색으로 표시하였다. 한편, AtSIZ의 징크 핑거 부분은 CX₇CX₅CX₃H의 보존 서열을 가지고 있어, C₃H형임을 알 수 있었다. 또한, AtSIZ는 징크 핑거 앞부분에 6개의 글루탐산 잔기가 연속된 산성 부위를 가지고 있다.

<실시예 4> 다양한 삼투 스트레스에 의한 AtSIZ 발현 유도

AtSIZ의 기능을 결정하기 위하여 다양한 조직과 다양한 삼투 스트레스에 대한AtSIZ의 발현양상을 조사하였다.

4-1) 조직별 발현양상

먼저, 꽃, 잎, 뿌리 및 장각 조직으로부터 염화리튬/페놀 (LiCl/ phenol) 방법으로 전체 RNA를 분리하고AtSIZcDNA를 탐침으로 한 노던 블롯으로 전사량을 조사하였다. 15 μg의 전체 RNA를 65℃에서 15분간 열처리하여 2차 구조를 풀어준 다음, 포름알데히드 겔 로딩 완충용액 (50% glycerol, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF)과 섞어 2.2 M의 포름알데히드를 포함한 1% 아가로스 겔에 4 V/cm으로 천천히 전기영동하였다. 전개된 RNA를 1시간 정도 DEPC 처리한 물에 담궈 포름알데히드를 제거한 뒤, 모세관 이동 방법 (capillary transfer)을 이용하여 약 16시간 동안 나일론 막으로 옮긴 다음 80℃, 1시간 열처리로 RNA를 고정화시켰다. 한편,AtSIZcDNA는 랜덤 프라이머 표지 키트 (random primer labeling kit, Boeringer Manheim)를 사용하여 [α-³²P] dCTP로 표지하여 혼성화 반응의 탐침으로 이용하였다. RNA 겔을 EtBr로 염색하여 각 레인별로 총 RNA 로딩양이 동일함을 확인하였으며, 최종적인 혼성화 반응 정도는 X-선 필름을 얹은 후 -70℃에서 감광시켜 확인하였다. 그 결과,도 2에 나타난 바와 같이,AtSIZ는 조직별로 다른 발현 양상을 나타내었는데, 가장 높은 발현은 뿌리 조직에서 나타났으며, 그 다음으로 꽃, 잎의 순서였으나, 장각에서는 거의 발현되지않았다.

4-2) 삼투 스트레스의 종류에 따른 발현양상

한편,AtSIZ는 원래 고농도의 NaCl 조건에서 유도되는 유전자로서 분리되었으므로, NaCl 이외의 다양한 삼투 스트레스 조건이AtSIZ발현양상에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해, 150 mM NaCl의 고염 처리, 탈수, 4℃ 저온처리 또는 외부에서 ABA를 처리한 어린 애기장대로부터 전체 RNA를 분리한 다음 상기 4-1)과 동일한 방법으로 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과,도 3에 나타난 바와 같이,AtSIZ의 발현은 상기 모든 처리에 의해 유도되었으며, 이는AtSIZ가 일반적인 삼투 스트레스 반응에 관련되어 있음을 의미한다. 그러나 유도양상은 사용된 특정 조건에 따라 달랐다. 외부 ABA 또는 NaCl의 경우 처리한지 한 시간 후에 발현 유도 정도가 최고치에 달했으며, 그 이후로 전사량이 감소하였다. 저온 처리를 한 경우,AtSIZ의 발현은 처음에는 낮은 수준으로 유도되었으나, 처리 후 6시간 뒤에는 훨씬 높은 정도로 증가하였다. 이는 저온 스트레스에 대한AtSIZ의 발현 유도에 2단계의 유도 기작이 관여함을 의미한다. 그러나, 탈수 처리의 경우에는, 처리 후 30 분 이내에 최고 수준의 발현 유도를 나타내었으며, 처리 후 6 시간 이상 상기 발현 수준이 비슷하게 유지되었다. 따라서, 이러한 결과로부터AtSIZ의 발현이 특정한 스트레스 조건에 따라 다양한 수준으로 조절받는다는 것을 알 수 있다.

<실시예 5> AtSIZ 유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 변이 식물체의 분리

AtSIZ의 생리적 역할을 조사하기 위해 T-DNA로 표지된 형질전환 식물체들의 게놈 DNA (ABRC, 미국)에 대한 PCR 선별 방법 (PCR screening method; McKinneyet al., Plant J. 4:613-622, 1995)을 이용하여 T-DNA 삽입 변이체를 분리하였다. 세 차례 PCR 선별은 서열 번호 1의AtSIZ유전자의 3' 및 5' 각각의 말단에 특이적인서열번호 5및6의 두 종류의 프라이머와 T-DNA 삽입체의 오른쪽 경계 (RB) 및 왼쪽 경계 (LB)에 특이적인 프라이머 (각각서열번호 7및8)의 조합과, T-DNA 삽입체를 가지고 있는 형질전환 집단으로부터 획득한 게놈 DNA (ABRC, USA) 주형을 이용하여 실시하였다.

상기 PCR 산물은³²P로 표지된AtSIZcDNA를 혼성화 탐침으로 사용하여 서던 블럿으로 분석하였다. 그 결과,도 4a에서 보듯이 왼쪽 경계 (LB)와 3' 말단 프라이머를 이용한 PCR에서 증폭된 산물이 나타났으며, 이는 상기 집단 속에AtSIZ유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 형질전환체가 존재함을 의미한다. 세 번의 PCR 선별을 통해,AtSIZ유전자 위치에 T-DNA가 삽입된 형질전환체를 선별할 수 있었다.

AtSIZ유전자 붕괴는 변이 식물체로부터 얻은 게놈 DNA를 서던 블럿함으로써 보다 확실히 확인할 수 있었다 (결과는 보이지 않음). 또한,nptⅡ유전자를 혼성화 탐침으로 한 서던 블럿을 통하여 게놈 속에 T-DNA는 오직 하나의 사본 (copy)으로 존재함을 확인하였다 (결과는 보이지 않음).

한편, 비활성 동형접합 (homozygous)식물은 연속된 카나마이신 (kanamycin) 선택으로 분리하고 PCR 증폭으로 T-DNA 삽입을 확인하였다. 상기 PCR 산물의AtSIZ유전자와의 동일성 및 T-DNA 삽입위치를 확인하기 위해 PCR 산물을 pBluescript 벡터에 서브크로닝하고 염기서열을 분석한 결과, T-DNA는AtSIZcDNA의 615번 째 뉴클레오티드 위치에 삽입되어 있었다 (도 4c참조).

<실시예 6> T-DNA 삽입 변이체의 표현형 조사

AtSIZ의 생리적 역할을 알기 위해 변이체의 표현형을 조사하였다.

우선, 변이체에서AtSIZ유전자가 발현되지 않음을 확인하기 위해 야생형 (WT) 및 변이체 (mt) 동형접합 변이 식물로부터 총 RNA를 얻어 T-DNA 삽입 변이체를 노던 블럿 분석하였고, 변이 식물체의 표현형질을 조사하기 위해 토양에서 3주간 재배한 야생형 및 변이체 식물에 10일 동안 다양한 농도의 NaCl을 처리한 후 표현 형질의 변화를 관찰하였다.

변이체는 노던 블럿 조사에서는AtSIZ발현이 되지 않았음에도 불구하고 일반적인 성장 조건의 토양에서는 표현형의 변화도 찾을 수 없었으나 (도 5a) NaCl 스트레스에 대해 훨씬 민감해졌다. 구체적으로 변이 식물체들은 잎에 안토시아닌이 축적되었고, 25 mM NaCl 농도에서 야생형 식물체는 어떠한 증상도 보이지 않는 반면 변이체는 잎의 가장자리에 손상을 입었다 (도 5b, 패널 b,아랫줄). 또한, 50 mM NaCl에서 야생형은 아무런 스트레스 증상을 보이지 않는데 비해 (도 5b, 패널 b, 윗줄), 변이체 식물의 잎은 야생형 식물의 잎보다 작은 크기로 자랐고 노란 표현형을 보였다 (도 5b, 패널 c, 아랫줄). 100 mM NaCl을 처리한 경우에는 야생형 잎이 경계 부분에만 황화 현상을 보이는데 비해 변이체 잎은 작고 황화 현상이 훨씬 심하게 나타났다. 이러한 결과들은 변이체 식물들이 야생형 식물보다 NaCl 스트레스에 훨씬 민감하다는 것을 보여준다.

<실시예 7> 변이체 보완 (complementation test)

상기 변이체들은 T-DNA가 삽입된 형질전환계통 집단에서 분리하였으므로, 변이체에 대해AtSIZ유전자가 보완 능력을 가졌는지를 확인함으로써, 상기 변이체들의 삼투 스트레스 표현형이AtSIZ위치에 T-DNA가 삽입되어 일어났음을 증명하고자 하였다.

7-1) AtSIZ 보완체 및 이를 이용한 변이체/ AtSIZ 보완 식물의 제조

AtSIZ보완체를 제조하기 위해AtSIZcDNA를 하이그로마이신 저항 표시 유전자를 가지고 있는 pBIB-HYG 바이너리 벡터 (Becker D., Institut fur Genetic der Universitat zu Koln, FRG;Nucleic Acid Res.180(1):203, 1990)에 삽입하였다. pBluescript에 서브클로닝되어있는AtSIZ를XhoI로 절단한 후 Klenow 효소와 dNTP 혼합물로 처리하여 절단 부분을 채워 넣어 둔단 말단 (blunt end)을 만든 다음 다시XbaI로 절단하여 얻은 유전자 부분을 포함한 삽입체 (insert)를 pBIB-HYG 벡터의XbaI/Ecl136II 위치에 연결 (ligation)하여 CaMV 35S 프로모터 와 Nos 터미네이터 (terminator) 사이에 삽입되도록 함으로써 AtSIZ 전사인자를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터를 비활성AtSIZ유전자를 가지고 있는 변이 식물세포에 아그로박테리움에 의해 매개되는 진공침투법(Agrobacterium-mediated vacuum infiltration: Cloughet al., Plant J. 16:735-743, 1998)으로 형질전환시켜서 재조합 벡터에 의해 AtSIZ 전사 인자의 보완이 일어나도록 하였다. 형질전환체는 50 ㎎/㎖ 하이그로마이신이 포함된 MS 플레이트에서 선별하였다. 선별된 기초 형질전환체를 토양으로 옮겨 종자를 얻고, 상기 종자를 다시 하이그로마이신이 들어있는 MS 플레이트에서 선별한 다음, 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIZ식물로부터 총 RNA를 얻어³²P로 표지된AtSIZcDNA를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석하였다. 그 결과,도 6a에서 보듯이 변이체는AtSIZ전사체 양이 거의 없는 것으로 나타난 반면에AtSIZ보안체가 삽입된 변이체/AtSIZ계통 2-2 및 5-4은 많은AtSIZ전사체 양을 보였다.

7-2) 변이체/ AtSIZ 식물의 NaCl 스트레스 민감도 측정

다양한 NaCl 농도에서 NaCl 스트레스 민감도를 측정하여 동형접합 T2 변이체/AtSIZ식물체에서AtSIZ보완체에 의한 보완이 일어나는지 조사하였다. 먼저, NaCl 스트레스를 주기 위하여 토양에서 3주간 재배한 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIZ식물 (형질전환계열 2-2)을 0, 25, 50, 100 mM NaCl 용액에 매 3일 마다 침지시킨 후 다시 건조시키는 과정을 반복하며 10일 동안 재배하였다.

상기와 같이 다양한 농도의 NaCl 스트레스에 대한 변이체/AtSIZ보완 식물의 민감도 측정 결과, 도 6b에서 보듯 변이체/AtSIZ는AtSIZcDNA를 보완 삽입하여 발현시킴으로써 NaCl에 대한 민감도 증가가 회복되어 야생형 수준의 저항성을 나타내는데, 이는 변이체의 NaCl 민감 표현형이 T-DNA의 삽입에 의한AtSIZ유전자의 변이에 의해 유발된 것임을 보여주는 것이다.

<실시예 8> 스트레스 반응 유전자에 대한 AtSIZ 의 전사 촉진 활성 조사

상기 실험 결과들로부터 변이체 식물의 NaCl 스트레스에 대한 민감도가 증가하는 것으로 조사되었으므로,AtSIZ가 NaCl 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자들의 전사 조절에 관여하는지 확인하기 위해 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIZ로부터 총 RNA를 추출하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 먼저 스트레스를 유도하기 위하여 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIZ식물을 액체 MS 배양액에서 1주일 동안 재배한 후 150 mM NaCl 및 4℃ 저온에서 6시간 처리하였고, 리포터 유전자로 사용될 스트레스 유도 유전자로는 외부 ABA 처리뿐만 아니라 다양한 형태의 삼투 스트레스에 의해 유전자의 발현이 조절되는COR15a및RD29A의 발현에 초점을 맞추었다. 노던 블럿 분석은³²P로 표지된AtSIZ,COR15a(Thomashow M.F., GenBank accession number U01377) 및RD29A(Yamaguchi-Shinozaki, GenBank accession number D13044) cDNA를 사용하였다.

변이체 및 변이체/AtSIZ식물에서 두 종류의 삼투 유도 유전자인COR15a및RD29A(Uraoet al., Plant Cell5:1529-1539, 1993; Bakeret al., Plant Mol. Biol.24:701-713, 1994)의 발현 양상을 조사한 결과, 변이체에서는 NaCl 스트레스에 의한COR15a의 발현이 유도되지 않았다. 그러나, 변이체/AtSIZ식물에서는COR15a의 발현 유도가 최고 수준으로 회복되었다. 한편, 추위 스트레스를 가한 경우 변이 식물에서COR15a의 발현이 최고로 유도되어,AtSIZ에 일어난 돌연변이가 추위로 인한COR15a의 발현 유도에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또다른 삼투 스트레스 반응 유전자인RD29A는 변이 식물에서 NaCl 및 추위 스트레스에 의해 최고로 유도되어AtSIZ는RD29A의 발현과는 관련되어 있지 않음을 보여주었다.

이러한 결과는 AtSIZ가 일련의 삼투 스트레스 유도 유전자의 발현에 대해 NaCl 스트레스에 특이적인 전사 유도 활성을 가지고 있음을 의미하는 것이다.

<실시예 9> AtSIZ 과발현과 이에 따른 식물의 스트레스 저항성 증가

상기에서 언급된 결과들로부터AtSIZ가 NaCl 스트레스 반응에 관여함을 알 수 있으므로, 본 발명자들은AtSIZ유전자를 과발현하는 형질전환 식물체를 제조하고 이들 식물체가 NaCl 스트레스에 대해 저항성을 갖는지 조사하였다. 먼저,AtSIZ를 과발현하는 식물을 제조하기 위해 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터를 가진 pBIl21 바이너리 벡터 (Dr. Goodman, Harvard Medical School, Genetics Department)에서 GUS 코딩 부분을 대체하여AtSIZcDNA를 연결한 후, 제조된 재조합 벡터를 야생형 애기장대에 진공침투법으로 삽입하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 우선, pBluescript 벡터 안에 서브크로닝되어 있는AtSIZ유전자를SpeI 제한효소로 절단하고 클레노우 (Klenow) 효소와 dNTPs로 절단 끝부분을 채워 넣어 무딘 끝을 만든 다음, 다시SmaI 제한효소로 절단하여AtSIZ유전자를포함한 삽입체를 얻었다. 상기 삽입체를SmaI과Ecl136II 제한효소로 절단한 pBI121 벡터에 연결함으로서 CaMV 35S 프로모터와 Nos 전사종결부위 사이에AtSIZ유전자가 삽입되도록 하여 AtSIZ 전사인자가 과발현되는 재조합 바이너리 플라스미드 pBI121-AtSIZ를 얻었다. 상기 재조합 플라스미드로 애기장대를 형질전환하기 위하여 진공 침투법을 실시하였다. 22℃에서 4주 정도 배양한 애기장대 야생형 식물의 첫 번째 볼트 (bolts)가 나오면 이것을 잘라내고 두 번째 볼트가 2-10cm 될 때 형질전환을 실시하였다. 첫 번째 볼트를 잘라내고 3일 후에 pBI121-AtSIZ바이너리 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리아를 5 ㎖ LB 배지에서 밤새 종균 배양한 후 상기 종균 배양액을 500 ㎖ LB 배지에서 OD₆₀₀값이 2.0 될 때까지 배양하였다. 배양이 끝나면 5500 ×g에서 원심분리한 후 5% 자당 (sucrose) 수용액에 현탁하여 0.8 OD₆₀₀값이 되도록 하였다. 상기 현탁액에 계면활성제 Silwet L-77를 최종 농도 0.05%이 되도록 첨가하고, 상기 아그로박테리아 현탁액을 비커에 부었다. 아그로박테리아 재배 화분을 뒤집어서 화분의 지상부 식물체 부분만 아그로박테리아 현탁액에 잠기도록 30초 정도 담갔다가 꺼내서 화분을 수평으로 눕혀 암상태로 24시간 방치한 후, 다시 22℃ 온실에서 싹이 맺힐 때까지 배양하였다. 상기 형질전환체를 선별하기 위해 50 mg/L 카나마이신을 포함하는 MS 플레이트에서 배양하여 형질전환된 식물체를 선별한 다음, 동형접합 T2 식물에서 총 RNA를 얻어 표지된AtSIZcDNA를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과,도 8a에 나타난 바와 같이 형질전환 계통인 1-6, 2-4 및 19-4는 야생형 식물에 비해 강한AtSIZ발현을 보였고 이는 삽입된AtSIZ가 실제 높은 정도로 발현된다는 것을 의미한다.

다음, 고농도의 NaCl 스트레스에서AtSIZ과발현 식물체의 표현형을 조사하였다. 먼저 NaCl 스트레스를 유도하기 위해, 2주 동안 재배한 식물에 매 3일마다 200 mM NaCl을 처리하였으며, NaCl 처리 후 10일 후에 표현형을 조사하였다.도 8b에 나타난 것은 각각 야생형 (WT)과 형질전환계열 (transgenic line) 19-4을 나타내는데, 다른 형질전환체도 19-4와 동일한 결과를 나타냈으므로 도면에는 나타내지 않았다. NaCl 저항성을 정량하기 위해,AtSIZ과발현 형질전환체와 야생형 각각 20개의 식물체를 3회의 별개 실험에서 조사하였고, 그림에 표시된 저항성 데이터는 그 평균값을 나타낸다.도 8b에서 보듯이AtSIZ과발현 형질전환 식물체는 고농도의 NaCl에 대하여 증가된 저항성을 보여 300mM NaCl을 10일 정도 처리하고 파종하였을 때, 야생형 식물은 살아남지 못했지만AtSIZ과발현 3주령 식물체는 약 70%가 생존하였다 (저항성 70 ±5). 상기 결과는 AtSIZ가 고농도의 NaCl 스트레스에 대한 적응 반응에 관여함을 보여주는 것이다.

<실시예 9> 전사 인자 AtSIZ의 기능적 도메인 분석

서열분석 결과AtSIZ가 C₃H형 징크 핑거 폴리 펩티드를 암호화하는 것으로 나타났으므로, AtSIZ 단백질이 다른 징크 핑거 단백질들과 마찬가지로 전사 조절 요소로 작용하는지 여부 및 전사 활성 부위를 확인하기 위하여 AtSIZ 단백질의 C-말단에 순차적인 결실 (deletion)이 발생할 수 있도록AtSIZcDNA의 전장 유전자와 다양한 길이의 염기서열을 결실시킨 변이 유전자들을 pAS2-1의 Gal4 DNA 결합 부위의 하류에 삽입하여 효모 1-하이브리드 시스템 (Clonetech, 미국)으로 분석하였다. 상기 결실체들을 제작하기 위해 AtSIZ의 전체 서열 (아미노산 1-596), C-말단 부위가 절단된 변이체들 (아미노산 1-470, 1-390, 1-345, 1-201, 1-133)을 암호화하는 유전자들을 각각 pAS2-1 (Clonetech)의BamHI 제한효소 절단위치에 삽입함으로써, GAL4 DNA 결합 도메인의 3' 말단과 융합 단백질 형태로 발현되도록 하였다. 상기 재조합 벡터들과 대조군으로 pAS2-1을 각각 Y190 효모 균주 (Clontech, 미국)에 도입하고 Trp 양성 반응을 나타내는 형질전환체를 선별한 다음, 발색조사 방법 (Liet al.,Science262:1870-1874, 1993)으로 β-갈락토시다제 유전자의 전사활성을 조사하였다. 구체적으로는 효모 세포들을 3MM 와트만지 (Whatman paper)에 옮기고 X-gal 용액으로 적신 후 상온에서 3시간 동안 발색반응을 일으켰다.

그 결과,도 9b에 나타난 바와 같이, 완전한 길이의 AtSIZ 단백질은 GAL4 DNA 결합 부분과 융합하여 β-갈락토시다제 발현을 강력하게 유도하였고 이는 AtSIZ가 강력한 전사 조절 인자임을 의미한다. 한편, C-말단으로부터 206개까지의 아미노산을 결실시킨 경우 전사 촉진 활성에 아무런 영향을 주지 않았다. 그러나, C 말단으로부터 추가적으로 45개 아미노산이 제거된 del3 (서열번호 2의 염기서열에서 1-345번째의 아미노산에 해당) 절단체는 훨씬 낮은 β-갈락토시다제 유도활성을 보였고, 징크 핑거 부분이 제거된 del4 (1-201번째 아미노산)는 β-갈락토시다제 활성을 보이지 않았다. 그러므로 이러한 결과는 AtSIZ가 식물세포에서 전사 조절 요소로 작용하고서열 번호 2의 AtSIZ 아미노산 서열에서 C-말단 206 개의 아미노산은 전사 활성에 필요하지 않음을 나타낸다.

상기에서 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 삼투-스트레스에 의해 유도되는 신규한 전사 조절 인자로서 징크 핑거 모티프를 가진 AtSIZ 및 이의 유전자를 찾아내고, 상기 유전자가 식물체의 삼투 스트레스 저항성에 관여함을 보였다. 즉, 상기 유전자에 변이가 일어난 변이 식물체가 삼투 스트레스에 민감성을 보이고, 과발현시 삼투 스트레스에 대한 저항성을 부여함을 확인하였으며, 또한 다양한 삼투 스트레스 반응 유전자들에 대한 전사 조절 인자로서의 AtSIZ의 활성 및 그 활성 부위를 밝혔다. 따라서, 상기AtSIZ유전자를 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜AtSIZ의 과발현을 유도함으로써 삼투 스트레스에 대한 저항성을 가진 식물체를 제조할 수 있으며, 이를 통해 식물의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열 중 1∼390번째 아미노산을 포함하는 전사 활성 인자.
제 1항에 있어서, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 전사 활성 인자.
제 1항에 있어서, C₃H형 징크 핑거 모티프를 가지며, C-말단 영역에 전사 촉진 활성 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 전사 활성 인자.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 전사 활성 인자 AtSIZ.
제 1항의 전사 활성 인자를 암호화하는 유전자.
제 5항에 있어서,서열번호 1의 염기서열을 갖는AtSIZ유전자.
제 5항의 유전자를 포함하는 진핵세포 발현벡터.
제 7항에 있어서,서열번호 1의 염기서열을 갖는AtSIZ유전자를 포함하는 진핵세포 발현벡터 (기탁번호 : KCTC 0886BP).
제 7항의 발현벡터로 식물체를 형질전환하여 제 1항의 단백질을 과발현시킴으로써 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
제 9항에 있어서, 삼투 스트레스는 고농도의 염, 저온, 탈수 또는 ABA 처리 등에 의해 유발되는 스트레스인 것을 특징으로 하는, 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
제 9항 또는 제 10항의 방법에 의해 삼투 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.