BRPI0812742B1

BRPI0812742B1 - método de aumento da biomassa, da taxa de crescimento, da produtividade de semente, da eficiência do uso de nitrogênio, do estresse abiótico de uma planta, do comprimento de raiz, da cobertura de raiz, da taxa de crescimento da área de roseta, e da taxa de crescimento do diâmetro da roseta de uma planta

Info

Publication number: BRPI0812742B1
Application number: BRPI0812742-5A
Authority: BR
Inventors: Sharon Ayal; Hagai Karchi; Gil Ronen; Alex Diber; Basia Judith Vinocur; Eyal Emmanuel; Michael Gang; Dotan Dimat
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2007-07-24
Filing date: 2008-07-24
Publication date: 2021-04-20
Also published as: US8686227B2; US10995341B2; US20190032075A1; AU2008278654A1; EP2183371B1; EP2183371A2; CA3019282A1; US20140068819A1; US10961544B2; WO2009013750A2; EP2183371A4; BR122020022199B1; ZA201001205B; US9518267B2; CA2694481C; EP2910638A3; ES2685631T3; AU2008278654B2; CA3019282C; CN102037127A

Abstract

MÉTODO DE AUMENTO NA TOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A ESTRESSES ABIÓTICOS, MÉTODO DE O AUMENTO DA BIOMASSA, DA TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR E/OU PRODUTIVIDADE DE UMA PLANTA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTIDEO ISOLADO, CÉLULA VEGETAL, são oferecidos métodos para aumento da tolerância de uma planta ao estresse abiótico, e/ou aumento da biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou produtividacíe de uma planta; os métodos são efetivados pela expressão no interior da planta de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, 90% homóloga à seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído das sequências de números de identificação: 201, 207, 212, 202206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529 e 1660-1663; também são oferecidos polinucleotídeos, construções de ácido nucleico, polipeptídeos e plantas transgênicas expressando o mesmo, que pode ser utilizado para aumento na tolerância de uma planta ao estresse abiótico, e/ou aumento da biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou produtividade da planta.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas configurações decorrentes, se relaciona a polipeptídeos e polinucleotídeos isolados e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a métodos de uso dos mesmos para aumentar a tolerância de uma planta ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, vigor e/ou produtividade de uma planta.

[002] Condições de estresse abiótico (SAB; também referido como "estresse ambiental"), tais como salinidade, seca, enchente, temperatura anormal e poluição por químicos tóxicos causam danos substanciais à agricultura. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para proteger-se de tais condições. Entretanto, se a severidade e duração das condições. de estresse são por demasiado grandes, os efeitos no desenvolvimento da planta, seu crescimento e produtividade são aprofundados. Além disso, muitas das culturas agrícolas são grandemente suscetíveis ao SAB e, dessa forma, necessitam de condições ideais de crescimento para o rendimento comercial das culturas. A exposição contínua ao estresse causa importantes alterações no metabolismo das plantas, o que, em última instância, leva à morte das células e consequente perda de rendimento. Assim, a despeito das pesquisas extensivas e medidas intensivas de proteção das culturas, perdas devido a condições de estresse abiótico permanecem na casa dos bilhões de dólares anuais.

[003] A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de clima anormalmente seco que persiste por tempo suficiente para produzir sérios desequilíbrios hidrológicos, tais como dano às culturas e redução do suprimento de água. Em casos sérios, a seca pode durar muitos anos e resultar em efeitos devastadores na agricultura e no abastecimento de água. Com o crescimento da população e a diminuição crônica da disponibilidade de água potável, a seca não é apenas o problema número um relacionado ao clima para a agricultura, mas ela também se coloca como um dos maiores desastres de todos os tempos, causando não apenas perdas econômicas (por exemplo, as perdas com a seca norte-americana de 1988 excederam os 40 bilhões de dólares), mas também a perda de vidas humanas, como na seca de. 1984-1985 no Chifre da África, que levou a uma fome que matou 750.000 pessoas. Além disso, a seca está associada com a susceptibilidade ao aumento de diversas moléstias.

[004] O estresse combinado pode alterar o metabolismo das plantas em modos originais; assim, compreender a interação entre os diferentes estresses pode ser importante para o desenvolvimento de estratégias para incrementar a tolerância ao estresse por meio da manipulação genética.

[005] Condições de resfriamento excessivo, por exemplo, temperaturas baixas, mais acima do congelamento, afeta as colheitas de origem tropical, tais como soja, arroz, milho e algodão. Os danos típicos do resfriamento incluem murcha, necrose, clorose ou perda de íons pelas membranas celulares. Os mecanismos subjacentes da sensibilidade ao resfriamento ainda não são completamente compreendidos., mas provavelmente envolvem o nível de saturação da membrana e outras deficiências fisiológicas. Por exemplo, a foto-inibição e a fotossíntese (rompimento da fotossíntese devido a altas intensidades luminosas) frequentemente ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias nos finais do verão/outono. Além disso, o resfriamento pode levar a perdas na produtividade e queda na qualidade dos produtos por conta do amadurecimento retardado do milho.

[006] O déficit de água é um componente comum em muitos estresses vegetais. O déficit de água ocorre nas células vegetais quando a transpiração da planta como um todo excede a captação de água. Somando-se à seca, outros estresses, tais como salinidade e baixa temperatura, produz a desidratação das células.

[007] A transdução do sinal de estresse pela seca e pelo sal consiste nas vias de sinalização da homeostase iônica e osmótica. O aspecto iônico do estresse por sal é sinalizado. pelas vias de SOS em que complexos de quinase de proteínas responsivas SOS3-SOS2 como a SOS1 controlam a expressão e atividade dos transportadores de íons tais como. o SOS1. O componente osmótico do estresse por si envolve reações complexas das plantas que se sobrepõem com o estresse em resposta à seca e/ou ao frio.

[008] Aspectos comuns da resposta ao estresse salino, pela seca ou pelo frio [Revisto em Xiong e Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25: 131-139] incluem: a) mudanças transitórias nos níveis de cálcio no citoplasma logo no início do evento de sinalização [Knight, (2000) Int. Rev. Cytol., 195: 269-324; Sanders et al. (1999) Plant Cell 11: 691-706]; (b) transdução do sinal via quinases de proteínas ativadas pelo mitogênio e/ou ativadas pelo cálcio (CDPKs) e fosfatases de proteínas [Merlot et al. (2001) Plant J. 25: 295-303; Tahtiharju e Paiva (2001) Plant J. 26: 461-470], (c) aumentos nos níveis de ácido abscísico em resposta ao estresse, disparando um subconjunto de respostas; (d) fosfatos de inositol como moléculas sinalizadoras (pelo menos, um subconjunto de alterações transcripcionais responsivas ao estresse [Xiong et al. (2001) Genes Dev. 15: 1971-1984]; (e) ativação de fosfolipases que, por sua vez, geram uma formação diversa de segundas moléculas mensageiras, algumas das quais podem regular a atividade da quinase responsiva ao estresse [por exemplo, fosfolipase D; Frank et al. (2000) Plant Cell 12: 111-124]; (f) indução de genes do tipo de abundante embriogênese tardia (AET) incluindo os genes COR/RD responsivos CRT/DRE; (g) elevados níveis de antioxidantes e osmólitos compatíveis tais como açúcares solúveis e prolinas [Hasegawa et al. (2000) Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol, 51: 463-499)]; e (h) acumulação de oxigênio reativo tais como superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxílicos.

[009] A biossíntese do ácida abscísico é regulada pelo estresse osmótico em muitas etapas. Tanto o estresse osmótico dependente como o independente de ABA sinalizando primeiro, modificam constitutivamente os fatores de transcrição expressada, conduzindo à expressão de ativadores transcricionais de resposta antecipada, que então ativam genes de tolerância ao estresse mais abaixo na cadeia.

[0010] Diversos genes que aumentam a tolerância ao estresse por frio ou sal podem também aumentar a proteção ao estresse pela seca, esses incluem, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREB1, OsCDPK7 (Saijo et ai. 2000, Plant J. 23: 319-327) ou AVP1 (uma bomba vacuolar de próton-pirofosfatase, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).

[0011] Desenvolver plantas tolerantes ao estresse é uma estratégia que tem o potencial de resolver ou mediar pelo menos alguns desses problemas. Entretanto, estratégias tradicionais de reprodução vegetal usadas para desenvolver novas linhagens de plantas que apresentam tolerância ao TEA são relativamente ineficazes, uma vez que são cansativas, consomem tempo e de resultados imprevisíveis. Além disso, fontes de germoplasma limitados para a tolerância ao estresse e incompatibilidade em cruzamentos entre espécies distantes de plantas representam problemas significativos encontrados na reprodução convencional. Adicionalmente, os processos celulares que levam à tolerância ao TEA são complexos por natureza e envolvem múltiplos mecanismos de adaptação celular e numerosas vias metabólicas.

[0012] Os esforços da engenharia genética, almejando conferir tolerância ao estresse abiótico em culturas transgênicas, têm sido descritas no artigo Studies by Apse and Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmstrom et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110: 249-257, 1996), Pilon-Smits e Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995). and Tarczynski et al. (Science 259! 508-510, 1993) têm todos tentado gerar plantas tolerantes ao estresse.

[0013] Além disso, diversas patentes, nos Estados Unidos, e aplicações de patentes também descrevem polinucleotídeos associados à tolerância ao estresse e seu uso para gerar plantas tolerantes ao estresse. As Patentes americanas Números 5.296.462 e 5.356.816 descrevem a transformação de plantas com polinucleotídeos codificando proteínas envolvidas na adaptação ao frio para a Arabidopsis thaliana para promover a tolerância ao frio.

[0014] Patente americana N° 6.670.528 descreve a transformação de plantas com polinucleotídeos codificando polipeptídeos ligados a elementos responsivos ao estresse com o fim de promover a tolerância ao estresse abiótico.

[0015] A Patente americana N° 6.720,477 descreve a transformação de plantas com um polinucleotídeo codificando proteína de transdução de sinais relacionada ao estresse, capaz de aumentar a tolerância das plantas transformadas ao estresse abiótico.

[0016] Os Ser. de Aplicação americana Números 09/938842 e 10/342224 descrevem genes relacionados ao estresse abiótico e seu uso para conferir às plantas tolerância ao estresse abiótico.

[0017] O Ser. de Aplicação americana N° 10/231035 descreve a sobre-expressão de um cofator de sulfarase de molibdênio em plantas para aumentar a tolerância ao estresse abiótico.

[0018] W02004/104162 para a Evogene Ltd„ mostra sequência de polinucleotídeos e métodos de utilizá-los no aumento da tolerância de uma planta ao estresse abiótico e/ou aumento da biomassa de uma planta.

[0019] W02007/020638 para a Evogene Ltd. mostra sequências de polinucleotídeos e métodos de utilizá-los no aumento da tolerância de uma planta ao estresse abiótico e/ou aumento da biomassa, do vigor e/ou produtividade de uma planta.

[0020] W02007/049275 para a Evogene Ltd. mostra polipeptídeos isolados, polinucleotídeos codificando os mesmos para aumento da tolerância de uma planta ao estresse abiótico e/ou para aumento da biomassa, do vigor e/ou produtividade de uma planta.

[0021] Técnicas adicionais anteriores incluem as aplicações de Patentes americanas Números 20060183137A1 Al e 200300.56249A1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0022] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um método de aumentar a tolerância de uma planta ao estresse abiótico, o método compreendendo a expressão para o interior da planta de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663, disso aumentando a tolerância da planta ao estresse abiótica.

[0023] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um método de aumento da tolerância de uma planta ao estresse abiótico, o método compreendendo a expressão no interior da planta de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663, com isso aumentando a tolerância da planta ao estresse abiótico.

[0024] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um método de aumento da biomassa, da taxa de crescimento, do vigor e/ou da produtividade de uma planta, o método compreendendo a expressão no interior da planta de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663, disso aumentando a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor e/ou a produtividade da planta.

[0025] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um método de aumento da biomassa, da taxa de crescimento, do vigor e/ou da produtividade de uma planta, o método compreendendo a expressão no interior da planta de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663, disso aumentando a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor e/ou a produtividade da planta.

[0026] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntico à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números:1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0027] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números:1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0028] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico.

[0029] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números:201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0030] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído, de SEQ ID Números:201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0031] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecida uma célula vegetal compreendendo um polipeptídeo exógeno compreendendo uma sequência de aminoácidos pela menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números:201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0032] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecida uma célula vegetal compreendendo um polipeptídeo exógeno compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212-, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0033] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecida uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos, pelo menos 90% homóloga à sequência selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0034] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é fornecida uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0035] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucleicos é selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 1530, 1561, 1532, 1531, 15E2, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0036] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo é selecionado do grupo constituído de SEQ ID Números: 1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533., 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0037] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de aminoácidos é selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201,, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0038] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo é selecionado do grupo constituído de SEQ 1D Números: 201, 207, 212, 202-206, 208- 211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0039] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula vegetal forma uma parte da planta.

[0040] De acordo com algumas configurações da invenção, o estresse abiótico é selecionado' do grupo constituído de salinidade, seca, privação de água, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0041] De acordo com algumas configurações da invenção, o método ainda compreendendo o crescimento da planta por expressão de um polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.

[0042] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos usados aqui têm o mesmo significado do comumente entendido por uma pessoa com conhecimento ordinário da arte à qual a invenção se refere. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática de teste das configurações da invenção, métodos e/ou materiais são descritos abaixo a título de exemplo. Em caso de conflito, a especificação de patente, incluindo definições, vai controlar. Além disso, materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não são entendidos como necessariamente limitadores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0043] Algumas configurações da invenção são aqui descritas, como forma de exemplo apenas, com referência aos desenhos que acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que as particularidades mostradas são como forma de exemplo e para fins de discussões ilustrativas das configurações da invenção. Nesse sentido, a descrição tomada com os desenhos torna aparente para aqueles experimentados na arte como configurações dessa invenção podem ser praticadas.

[0044] Nos desenhos: A figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário usado para expressar a sequência de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; H- HindlII enzima de restrição; X - XbaI enzima de restrição; B - BamHI enzima de restrição; S - SalI enzima de restrição; Sm - SmaI enzima de restrição; EcoRI enzima de restrição; Sc - SacI/SstI/Ec1136II; (números) - Comprimento nos pares-base; NOS pro = promotor da sintase de nopalina; NPT-II = gene de fosfotransferase de neomicina; NOS ter = terminador da sintase de nopalina; sinal Poly-A (sinal de poliadenilação); GUSintron gene repórter de GUS (codificando a sequência e intron). As sequências de polinucleotídeos isolados da invenção foram clonadas para um vetor enquanto substituindo o gene relator de GUSintron; As figuras 2a-b são imagens de visualização descritiva do desenvolvimento da raiz de plantas crescendo em placas de ágar transparentes por 17 dias e as placas foram fotografadas a cada 2 dias começando no dia 7.

[0045] A Figura 2a - Uma imagem de uma fotografia das plantas obtida seguindo 12 dias das placas de ágar.

[0046] Figura 2b - Uma imagem de análise da raiz em que o comprimento medido da raiz é representado por uma seta vermelha.

DESCRIÇÕES DE CONFIGURAÇÕES ESPECIFICAS DA INVENÇÃO

[0047] A presente invenção, em algumas configurações decorrentes, se refere a polipeptídeos e polinucleotídeos isolados codificando os mesmos, e mais particularmente, mas não exclusivamente, métodos de uso dos mesmos para aumento da tolerância ao estresse abiótico, da taxa de crescimento, da produtividade, da biomassa e/ou do vigor de uma planta.

[0048] Antes de explicar ao menos uma configuração da invenção em detalhes, deve-se entender que a invenção não é necessariamente limitada a sua aplicação aos detalhes enunciados na descrição que se segue ou exemplificada nos Exemplos. A invenção é passível de outras configurações ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

[0049] Ao reduzir a invenção para a prática, os presentes inventores identificaram polipeptídeos e polinucleotídeos originais que podem ser usados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, e incrementar a taxa de crescimento, da biomassa, da produtividade e/ou do vigor da planta.

[0050] Assim, como mostrado na seção de Exemplos, que se seguem, os inventores empregaram uma abordagem bioinformática que combina o agrupamento e montagem de sequências a partir de banco de dados de genomas de Arabidopsis, arroz e de outras plantas publicamente disponíveis, identificação de sequência expressada (ESTs), banco de dados de caminhos e proteínas e informações QTL com perfil de expressão digital ("Northern Blot eletrônico") e polinucleotídeos e polipeptídeos identificados que podem aumentar a tolerância ao estresse abiótico, e incrementar o crescimento, a biomassa, a produtividade e o vigor (SEQ ID Números:1-200 e 1653 para polinucleotídeos; SEQ ID Números:201-391 e 1655 para polipeptídeos; Tabela 1, Exemplo 1). Ortólogos putativos ABST de espécies monocotiledôneas foram identificados por alinhamento de sequências ortólogas e perfis digitais de expressão (SEQ ID Números: 392-960, 1656-1659 para polinucleotídeos; SEQ ID Números:961-1529, 1660-1663 para polipeptídeos; Tabela 2, Exemplo 1). Como descrito mais adiante nas Tabelas 3 e 4 da seção de exemplo que se segue, polinucleotídeos representativos foram clonados (polinucleotídeo SEQ ID Números:1530, 1538, 1532, 1549; 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1561, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543 e 1668). Polinucleotídeos adicionais contendo sequências de ácidos nucleicos otimizados foram preparados (polinucleotídeos SEQ ID Números:1531, 1539, 1533, 1550, 1558, 1562, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551 e 1545). Como descrito mais adiante na seção de Exemplos que se segue, plantas transgênicas expressando exogenamente os polinucleotídeos clonados e/ou otimizados da invenção foram gerados. Como mostrado nas Tabelas 5-76, tais plantas exibem um aumentado peso das mudas, cobertura das raízes, comprimento das raízes e taxa relativa de crescimento quando crescem sob estresse osmótico (na presença de 25% de PEG [Polietileno glicol]), deficiência de nitrogênio (na presença de 0,75 mM de Nitrogênio) ou condições regulares. Além disso, como mostrado nas Tabelas 77-188, plantas exogeneamente expressando os polinucleotídeos da invenção exibem um aumento da área da roseta, do diâmetro da roseta, da área média da folhagem, da taxa relativa de crescimento dos acima mencionados, da biomassa das plantas, da produtividade de sementes da planta, do peso de 1.000 sementes, do índice da colheita quando crescendo sob estresse salino ou sob condições normais. Todos juntos, esses resultados sugerem o uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos originais da invenção para aumento da tolerância ao estresse, e melhorando o crescimento da taxa de biomassa, vigor e/ou produtividade de uma planta.

[0051] Dessa forma, de acordo com um aspecto da invenção, é oferecido um método de aumento da tolerância ao estresse abiótico, da taxa de crescimento, da biomassa, da produtividade e/ou do vigor de uma planta. O método é efetivado ao expressar no interior da planta um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo, uma sequência de aminoácidos pelo menos 60% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 206-211, 213-391, 1655, 961.-,1529, e 1660-1663.

[0052] A expressão "estresse abiótico" é usada aqui para se referir a qualquer efeito adverso no. metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. De acordo com isso, o estresse abiótico pode ser induzido por condições ambientais de crescimento abaixo do ideal tais como, por exemplo, salinidade, privação de água, déficit de água, seca, inundações, congelamento, temperatura baixa ou alta (por exemplo, resfriamento ou calor excessivo), poluição química tóxica, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abióticos são discutidas na seção Histórico.

[0053] A expressão "tolerância ao estresse abiótico" é usada para se referir à habilidade de uma planta para resistir a um estresse abiótico sem sofrer alterações substanciais no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[0054] Como usada aqui, a expressão "biomassa da planta" se refere ao montante (medido em gramas ar seco ou tecido seco) de um tecido produzido por uma planta em uma estação de crescimento, que pode também determinar ou afetar a produtividade da planta ou a produtividade por área de crescimento.

[0055] Como usada aqui, a expressão "produtividade da planta" se refere ao montante (como determinado pelo peso, volume ou tamanho) ou quantidade números.) de tecido produzido ou colhido por planta ou por estação de crescimento. Por isso, a produtividade aumentada pode afetar os benefícios econômicos que se pode obter de uma planta em uma determinada área de crescimento e/ou tempo de crescimento.

[0056] Como usada aqui, a expressão "vigor da planta" se refere ao montante (medido em peso) de tecido produzido pela planta em um dado período. Por isso, o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produtividade da planta por tempo de crescimento ou por área de crescimento.

[0057] Como usado aqui, o termo "aumento" se refere a, pelo menos em torno de 2%, pelo menos em torno de 3%, pelo menos em torno de 4%, pelo menos em torno de 5%, pelo menos em torno de 10%, pelo menos em torno de 15%, pelo menos em torno de 20%, pelo menos em torno de 30%, pelo menos em torno de 40%, pelo menos em torno de 50%, pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 70%, pelo menos em torno de 80%, ou aumento maior na tolerância, crescimento, biomassa, produtividade e/ou vigor comparado a uma planta nativa [ou seja, uma planta modificada com biomoléculas (polinucleotídeos ou polipeptídes) da invenção, ou seja, uma planta não transformada da mesma espécie que cresce sob as mesmas condições de crescimento).

[0058] Como usada aqui, a expressão "polinucleotídeo exógeno" se refere a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que pode não ser naturalmente expressa no interior da planta ou cuja sobre-expressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido no interior da planta de uma forma estável ou transitória, de forma a produzir uma molécula de ácido ribonucleico e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve-se notar que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácidos nueleicos endógenos à planta.

[0059] Como mencionado, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 65%, pelo menos em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em torno de 81%, pelo menos em torno de 82%, pelo menos em torno de 83%, pelo menos em torno de 84%, pelo menos em torno de 85%, pelo menos em torno de 86%, pelo menos em torno de 87%, pelo menos em torno de 88%, pelo menos em torno de 89%, pelo menos em torno de 90%, pelo menos em torno de 91%, pelo menos em torno de 92%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 94%, pelo menos em torno de 95%, pelo menos em torno de 96%, pelo menos em torno de 97%, pelo menos em torno de 98%, pelo menos em torno de 99%, ou mais, ou seja 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0060] A homologia (por exemplo, homologia percentual) pode ser determinada usando um software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o BlastP ou TBLASTIN do Centro Nacional de Informações em Biotecnologia (CNIB), assim como usando parâmetros padronizados, quando iniciando a partir de uma sequência de polipeptídeos; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via CNIB) assim como usando parâmetros padronizados, que compara os produtos de tradução conceitual de seis quadros de uma sequência de consulta de nucleotídeo (ambas as vertentes) em confronto com um banco de dados de sequência de proteínas.

[0061] Sequências homólogas incluem tanto sequências ortólogas como parálogas. O termo "paráloga" se refere à duplicação genética dentro do genoma de uma espécie levando a genes parálogos. O termo "ortóloga" se refere a genes homólogos em diferentes organismos devido a relações ancestrais.

[0062] Uma opção de identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledôneas é por meio da realização de busca recíproca através da ferramenta básica de busca local do alinhamento (blast). Isso pode ser feito com uma primeira busca com essa ferramenta, envolvendo a localização da sequência de interesse confrontando com qualquer banco de dados de sequência, tais como o publicamente disponível CNIB, que pode ser encontrado no Hypertext Transfer Protocol: //World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se ortólogos no arroz forem procurados, a sequência de interesse pode ser buscada com a dita ferramenta em confronto com, por exemplo, os clones de comprimento total de cDNA de 28.469 da Oryza sativa Nipponbare disponível no CNIB. Os resultados da ferramenta de busca podem ser filtrados. As sequências de comprimento total tanto dos resultados filtrados como não filtrados são então buscados de volta (segunda busca) confrontando com as sequências do organismo do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados da primeira e segunda busca com tal ferramenta são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior contagem (melhor acerto) na primeira busca com essa ferramenta identifica na segunda busca a sequência em questão (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Usando o mesmo raciocínio, um parálogo (homólogo de um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de famílias grandes de sequências, o programa ClustalW pode ser usado [Hypertext Transfer Protocol: //World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido de uma árvore de união de vizinhança (Hypertext Transfer Protocol://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que auxilia na visualização do agrupamento.

[0063] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo constituído da sequência de aminoácidos enunciada por SEQ ID N°: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, 1660-1662 ou 1663.

[0064] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 65%, pelo menos em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em torno de 81%, pelo menos em torno de 82%, pelo menos em torno de 83%, pelo menos em torno de 84%, pelo menos em torno de 85%, pelo menos em torno de 86%, pelo menos em torno de 87%, pelo menos em torno de 88%, pelo menos em torno de 89%, pelo menos em torno de 90%, pelo menos em torno de 91%, pelo menos em torno de 92%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 94%, pelo menos em torno de 95%, pelo menos em torno de 96%, pelo menos em torno de 97%, pelo menos em torno de 98%, pelo menos em torno de 99%, por exemplo, 100% idêntica â. sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo constituído de SEQ ID Números:1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0065] A identidade (ou seja, a homologia percentual) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o BlastN do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia (CNIB) ou mesmo usando parâmetros padronizados.

[0066] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 65%, pelo menos em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em torno de pelo menos em torno de 82%, pelo menos em torno de 83%, pelo menos em torno de 84%, pelo menos em torno de 85%, pelo menos em torno de 86%, pelo menos em torno de 87%, pelo menos em torno de 88%, pelo menos em torno de 89%, pelo menos em torno de 90%, pelo menos em torno de 91%, pelo menos em torno de 92%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 94%, pelo menos em torno de 95%, pelo menos em torno de 96%, pelo menos em torno de 97%, pelo menos em tomo de 98%, pelo menos em torno de 99%, por exemplo, ou 100 % idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo constituído de SEQ ID Números: 1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566,: 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200., 1653, 392-960, e 1656-1659.

[0067] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno de enunciado por SEQ ID N°:1530, 1561, 1532, 1531, 1562, 1533, 1538, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, ..1555i 1540, 1543, 1668, 1539, 1550, 1558, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551, 1545, 1-200, 1653, 392-960, e 1656-1658 ou 1659.

[0068] Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo" se refere a uma sequência de ácidos nucleicos arranjada de forma simples ou dupla, que é isolada e fornecida na forma de uma sequência de, RNA, uma sequência complementar de polinucleotídeo (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou uma sequência composta de polinucleotídeos (por exemplo, uma combinação dos acima mencionados).

[0069] Como usada aqui, a expressão "sequência complementar de nucleotídeos" se refere à sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro usando uma transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal sequência pode ser subsequentemente amplificada IN VIVO ou IN VITRO usando polimerase DNA dependente de DNA.

[0070] Como usada aqui, a expressão "sequência genômica de polinucleotídeo" se refere a uma sequência derivada (identificada ou isolada) de um cromossomo, assim, ela representa uma porção contínua de um cromossomo.

[0071] Como usada aqui, a expressão "sequência de nucleotídeos composta", se refere a uma sequência que é, pelo menos, parcialmente complementar e, pelo menos, parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar polipeptídeo de presente invenção, assim como algumas sequências intrônicas interpostas entre elas. As sequências intrônicas podem provir de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluem sequências de sinal divididas conservadas. Tais sequências intrônicas podem ainda incluir elementos de regulação de expressão de ação cis.

[0072] Sequências de ácidos nucleicos codificando polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizados por expressão. Um exemplo não limitativo de uma sequência de ácidos nucleicos otimizada é fornecido na SEQ ID N°:1531, que codifica o polipeptídeo contendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID N°: 201. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, nas não estão limitados a, um conteúdo G/C alterado para mais se aproximar daquele tipicamente encontrado em espécies de planta de interesse, e a remoção de códons encontrados de forma atípica em espécies de plantas comumente referida como otimização de códon.

[0073] A expressão. "otimização de códon"' se refere à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso no interior de genes ou fragmentos estruturais, daí resultando a aproximar o uso de códon no interior da planta de interesse, Assim, uma sequência de gene ou de ácidos nucleicos otimizada se refere a um gene em que a sequência de nucleotídeo de um gene nativo que ocorre naturalmente foi modificado de forma a utilizar códons estatisticamente preferidos ou favorecidos no interior da planta. A sequência de nucleotídeos é tipicamente examinada no nível do DNA e a região do códon otimizada para expressão na espécie de planta determinada usando qualquer procedimento adequado como, por exemplo, o descrito em Sardana et al. (1966, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão do uso de códon, uma medida do viés de uso do códon, pode ser calculado por primeiramente encontrar a derivação proporcional ao quadrado do uso de cada códon do gene nativo relativo àquele dos genes da planta altamente expressos, seguido pelo cálculo desse desvio médio ao quadrado. A fórmula usada é: 1 SDCU = n = 1 n [( Xn - Yn )/ Yn]2/N, onde Xn se refere à frequência de uso do códon n em genes de alta expressão na planta, onde Yn é a frequência de uso do códon n em gene de interesse e N se refere ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela do uso de códons de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é compilada usando dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[0074] Um método para otimização da sequência de ácidos nucleicos de acordo com o uso preferido de códon para um tipo particular de célula vegetal é baseado no uso direto, sem realizar nenhum cálculo estatístico adicional, das Tabelas de otimização de Códon, como aquelas fornecidas online no Banco de Dados de Uso de Códons do banco de DNA do INCA (Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) do Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) kazusa (ponto) or (ponto) jp/codon/). O Banco de Dados de Uso de Códon contém Tabelas de uso de códons para um número de diferentes espécies de plantas, onde cada Tabela de uso de códon foi estatisticamente determinado com base em dados presentes no Genbank.

[0075] Por meio do uso das tabelas acima para determinar o mais preferido ou mais favorecido dos códons para cada aminoácido em espécies em particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeos naturalmente ocorrentes codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada por códon para uma espécie particular de planta. Isso é efetuado ao substituir códons que podem ter baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com os códons correspondentes, em relação a um aminoácido que são estatisticamente mais favorecidas. Entretanto, um ou mais códons favorecidos podem ser selecionados para deletar regiões de restrição existentes, a fim de criar novos em junções potencialmente úteis (terminações 5' e 3' para adicionar peptídeos de sinal ou cassetes de terminação, porções internas que podem ser usadas para cortar e dividir juntar segmentos juntos para produzir uma sequência correta de comprimento total), ou para eliminar sequências de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou expressão do mRNA.

[0076] A sequência de nucleotídeo codificador de ocorrência natural pode já, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que correspondem ao códon estatisticamente favorecido em uma espécie particular de planta. Assim, a otimização de códon de uma sequência nativa de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, do interior da sequência de nucleotídeos nativos, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta em particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de uso de códons da planta em particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para o uso de códon de planta, considerado que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificada é produzida em um nível maior que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente. A construção de genes sintéticos por alteração do uso de códons é descrita, por exemplo, em Pedido de Patente PCT 93/07278.

[0077] Assim, a invenção engloba as sequências de ácido nucleicos descritas aqui acima; fragmentos decorrentes, sequências que com isso podem ser hibridizadas, sequências homólogas disso, sequências codificando polipeptídeos similares com uso de códon diferente, sequências alteradas caracterizadas por mutação, tais como supressão, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, tanto os que ocorrem naturalmente como os induzidos pelo homem, seja de forma aleatória ou dirigida.

[0078] A invenção fornece um polipeptídeo isolado contendo uma sequência de aminoácidos pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 65%, pelo men00 em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em torno de 81%, pelo menos em torno de 82%, pelo menos em torno de 83%, pelo menos em torno de 84%, pelo menos em torno de 85%, pelo menos em torno de 86%, pelo menos em torno de 87%, pelo menos em torno de 88%, pelo menos em torno de 89%, pelo menos em torno de 90%, pelo menos em torno de 91%, pelo menos em torno de 92%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 93%, pelo menos em torno de 94%, pelo menos em torno de 95%, pelo menos em torno de 96%, pelo menos em torno de 97%, pelo menos em torno de 98%, pelo menos em torno de 99%, ou mais, ou seja, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de SEQ ID N°: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1663.

[0079] De acordo com algumas configurações da invenção, um polipeptídeo é definido por SEQ ID N°: 201, 207, 212, 202-206, 208-211, 213-391, 1655, 961-1529, e 1660-1662 ou1663.

[0080] A invenção também compreende fragmentos dos polipeptídeos acima descritos e polipeptídeos contendo mutações, tais como supressões, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, tanto naturalmente ocorrentes como induzidos pelo homem, tanto de forma aleatória como dirigida.

[0081] O termo "planta", como usado aqui, engloba todas as plantas, antepassadas e descendentes dessas plantas ou partes delas, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), e células vegetais; tecidos e órgãos. A planta pode ser em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calos, folhas, gametófilos, esporófitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viripiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo legumes de forragem ou torradeiras, plantas ornamentais, culturas de alimentos, árvores ou arbustos selecionadas da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp,, Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea Schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemi,ngia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespedila spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex,. Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobryçhis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp.; Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus Lotara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesií, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis lapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficíllata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura., couve-flor, aipo, couve-de-folhas, linho, couve, lentilha, canola, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, Uma planta ornamental, uma erva perene e uma colheita de forragem. Como alternativa, algas e outros não Viridiplantae podem ser usados para os métodos da presente invenção.

[0082] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta usada por meio do método da invenção é uma planta de safra como arroz; milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana-de-açúcar, alfafa, milho, leguminosas (feijão, ervilha), linho, Lupinus, colza, tabaco, popular e algodão.

[0083] A expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção no interior da planta pode ser efetuada transformando-se uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguido da geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno no interior da planta madura.

[0084] De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é efetuada pela introdução na célula da planta de um ácido nucleico construído que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas configurações da invenção e, pelo menos, um promotor capaz de direcionar a transcrição do polinucleotídeo exógeno na célula da planta. Detalhes adicionais sobre abordagens de transformação adequada são fornecida mais abaixo.

[0085] Como usado aqui, o termo "promotor" se refere a uma região do DNA que se localiza anteriormente ao ponto de iniciação transcricional de um gene ao qual a polimerase de RNA se une para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (por exemplo, qual porção da planta) e/ou quando (por exemplo, em que estágio ou condição do período de vida de um organismo) o gene é expresso.

[0086] Qualquer sequência de promotor adequada pode ser usada pela construção de ácido nucleico da presente invenção. De acordo com algumas configurações, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor de tecido específico ou um promotor induzível de estresse abiótico.

[0087] Promotores construtivos adequados incluem, par exemplo, o promotor CaMV 35S (SEQ ID N°: 1546; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor de Arabidopsis At6669 (SEQ 1D N°:1652,. Veja Publicação da PCT No. W004081173A2); milho Ubi 1 (Christensen et al., Plant Sol. Biol., 18:675-689, 1992); actina do arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al., Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); Ciclofilina do arroz (Bucholz et Plant Moi Biol. 25(5):837-43, 1994); histona H3 Milho (Lepetil et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al., Plant J. 10(1);107-121, 1996), promotor CT2 de ponta de raiz constitutiva (SEQ ID N°:1535; veja também a aplicação PCT No. IL/2005/000627) e Synthetic Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes americanas Números. 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5,569,597: 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.

[0088] Promotores específicos de tecido incluem, mas não se limitam a, promotores específicos de folhas [como descrito, por exemplo, por Yamamoto et al., Plant 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol, 35:773-778, 1994; Gotor et Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores específicos de sementes [por exemplo, de genes específicos de sementes (Simon, et al., Plant Mol. Biol, 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Albumina da castanha-do-pará (Pearson] et a1-, Plant Moi. Biol. 18: 235- 245, 19921, legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Giutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen.. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987:1, Zeína (Matzke et al., Plant Mol Biol 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al., Planta 199: 515-519, 1996), Wheat SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina do girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992).], promotores específicos de endosperma [por exemplo, trigo LMW e HMW, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas “a”, “b” e “g” (EMB031409-15, 1984), promotor ltrl de cevada, hordeína BI, C, D de cevada (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), DOF de cevada (Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 625-640, 1998), Prolamina NRP33 do arroz, globulina Glb-1 do arroz (Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 do arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose PP do arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), família de genes ESR do milho (Plant J 12:235-46, 1997), gama-cafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)1, promotores específicos de embrião [por exemplo, 05H1 de arroz (Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina do arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flores [por exemplo, AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-105, 1590), LAT52 (Twell et al., Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala-3].

[0089] Promotores induzíveis de estresse abiótico adequados incluem, mas não se limitam a promotores induzíveis por sal, tal como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis de seca, tal como o promotor do gene do milho rabl7 (Pla et. al., Plant Mol, Biol. 21:259-266, 1993), promotor do gene do milho rab28 (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene do milho lvr2 (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis de calor tais como o promotor hsp80 de calor no tomate (Patente americana No. 5,187,267).

[0090] A construção de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ainda incluir um marcador adequado selecionável e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas configurações da invenção, a construção de ácido nucleico usada é um vetor “SHUTTLE”, que pode propagar tanto no E. coli (em que a construção compreende um marcador selecionável apropriado e origem de replicação) e ser compatível com a propagação nas células. A construção, de acordo com a presente invenção, pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[0091] A construção do ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar as células da planta de forma estável e transitória. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Em uma transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expressado pela célula, mas não é integrado ao genoma e, como tal, representa um traço transitório.

[0092] Há vários métodos de se introduzir genes exógenos tanto em plantas: monocotiledôneas como dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plane, Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al,, Nature (1989) 338:274-276).

[0093] O princípio dos métodos para causar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico de plantas inclui duas principais abordagens:

[0094] Transferência de genes mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plane Nuclear Genes, eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em. Biotecnologia da Planta, eds. Kung, S e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

[0095] Captação direta de DNA: Paszkowski et al, em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para captação direta de DNA para dentro dos protoplastos, Toriyama, K. et al.; (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por um breve choque elétrico nas células da planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. DNA injeção de DNA no interior de células ou tecidos da planta por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de filamentos de fibra de vidro ou carbonetos de silício de culturas de células, embriões ou tecidos de calos, Patente americana N°. 5,464,765 ou por incubação direta de DNA com pólen germinativo, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantel!, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715719.

[0096] O sistema por Agrobacterium inclui o uso de vetores plasmídeos que contêm segmentos de DNA definidos que se integram ao DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega da Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de. disco de folha que pode ser realizado com qualquer tecido explante que forneça uma boa fonte para a iniciação da diferenciação da planta como um todo. Veja, por exemplo, Horsch et al. em Plant. Molecular Siology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de transferência de Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[0097] Há vários métodos de transferência direta de DNA para o interior das células da planta. Pela eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um campo elétrico intenso. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente diretamente injetado para o interior das células, usando micropipetas muito pequenas. No bombeamento de micropartículas, o DNA é adsorvido sobre microprojéteis tais como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados para o interior das células ou dos tecidos das plantas.

[0098] Em seguida, a propagação da transformação estável na planta é executada. O método mais comum de propagação da planta é por sementes. A regeneração por meio da propagação, entretanto, tem a deficiência de que, graças à heterozigocidade, há uma perda de uniformidade na colheita, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com variações genéticas governadas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma delas irá crescer com seu traço específico próprio. Assim, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticas da planta transgênica parental. Por essa razão, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que fornece uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[0099] A micropropagação é um processo de crescimento de uma nova geração de plantas a partir de uma única porção de tecido que foi extirpado de uma planta parental ou cultivar selecionado. Esse processo: permite a reprodução em massa de plantas. que têm os tecidos preferidos expressando a proteína de fusão. As plantas da nova geração, que são produzidas, são geneticamente idênticas às plantas originais e têm todas as características delas. A micropropagação permite a produção em massa de material de qualidade da planta em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação dos cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade da multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade da planta produzida.

[00100] A micropropagação é um procedimento de multiestágios que requer alteração do meio ou das condições crescimento da cultura entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: estágio um, a cultura do tecido inicial; estágio dois, multiplicação da cultura de tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e, estágio quatro, cultura e encorpamento em estufa. Durante o estágio um, a cultura inicial de tecido é estabelecida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura do tecido inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atingir os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido que cresceram no estágio dois são divididas e fortalecidas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada de forma a poderem se desenvolver em ambiente natural.

[00101] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformações transitórias de células da folha, células meristemáticas ou da planta toda.

[00102] Transformações transitórias podem ser efetuadas por qualquer outro dos método de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção virals usando vírus de planta modificados.

[00103] Vírus que se mostraram úteis para a transformação de plantas hospedeiras incluem CaMV, Vírus Mosaico do Tabaco (VMT), Vírus Mosaico do Bromo (VMB) e o Vírus Mosaico Comum do Feijão (STF" ou VMCF)' A transformação de plantas usando vírus é descrita pela Patente americana N°. 4.855.237 (vírus mosaico do feijão dourado, BFD), EP-A 67,553 (VMT), Aplicação Publicada no Japão N°. 63-14693 (VMT), EPA 194.809 (Vã), EPA 278.667 (VB); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA: exógeno em muitos hospedeiros, incluído plantas estão descritas em WO 87/06261.

[00104] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus usado para transformações transitórias é avirulento e, assim, incapaz de causar sintomas sérios, tais como taxa reduzida de crescimento, mosaico, ring spot, queda de folhas, amarelamento, estrias, formação de varicela, formação: de tumores e formação de bexigas. Um vírus avirulento pode ser um vírus avirulento naturalmente ocorrente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação de vírus pode ser efetuada ao usar métodos bem conhecidos na arte, incluindo, mas não se limitando a, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese direta como descritas, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al, (1992), Atreya et ai. (1992) e Huet et al. (1994).

[00105] Cepas de vírus adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, por exemplo, a American Type culture Collection (ATCC) ou por isolamento em plantas infectadas. D isolamento de vírus a partir tecidos de plantas infectadas pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na arte, com descrito, por Foster and Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to. Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Brevemente, tecidos de uma planta infectada, que se acredita conter uma alta concentração de vírus adequados, preferencialmente, folhas jovens e pétalas de flores são trituradas em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva de Vírus infectados que pode ser usada em inoculações subsequentes.

[00106] A construção de vírus de RNA da planta para introdução e expressão sequências de nucleotídeos exógenos não virals em plantas é demonstrada nas referências acima, assim como por Dawson, W. O. et ai., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Patente Americana N°. 5.316.931.

[00107] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no vírus em si. Alternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilidade da construção do vetor viral desejado com DNA exógeno. O vírus pode então ser estirpado do plasmídeo. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao: DNA viral, que é então replicado pela bactéria. A transcrição e tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsular o DNA viral. Se o vírus é um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido no plasmídeo. O plasmídeo é então usado para ser fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido por transcrição da sequência viral do plasmídeo e a tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsulam o RNA viral.

[00108] Em uma configuração, um polinucleotídeo viral da planta é fornecido em que a sequência codificando a proteína de revestimento nativa foi removida de um polinucleotídeo viral, uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não-nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação da proteína de revestimento não nativo, capaz de expressão na planta hospedeira, um pacote de polinucleotídeo recombinante viral da planta, e assegurando uma infecção sistemática do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta, foi inserida. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser desativado por inserção de uma sequência de polinucleotídeos não nativa para o interior dela, de forma que uma proteína é produzida. O polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever e expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos na planta hospedeira e incapaz de se recombinarem entre eles e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeos não nativos (exógenos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou ao promotor subgenômico viral nativo e não nativo da planta se mais que uma sequência de polinucleotídeos é incluída. As sequências de polinucleotídeos não nativos são transcritas ou expressas .na planta hospedeira sob controle de promotores subgenômicos para produzir os produtos desejados.

[00109] Numa segunda configuração, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido como na primeira configuração, exceto que a sequência de codificação, de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos de proteína não nativo, ao invés de uma sequência de Codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00110] Numa terceira configuração, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido em que o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi inserido no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever Ou expressar genes adjacentes em uma planta hospedeira e são incapazes de recombinação entre eles e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeos não nativos podem ser inseridas adjacentes aos promotores virais subgenômicos não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressadas na planta hospedeira sob controle de promotores para produzir o produto desejado.

[00111] Em uma quarta configuração, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido como na terceira configuração, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00112] Os vetores virais são encapsulados por proteínas de revestimento codificadas por polinucleotídeos virais recombinantes da planta para produzir um vírus recombinante da planta. O polinucleotídeo viral recombinante da planta ou o vírus recombinante da planta é usado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, disseminação sistemática no hospedeiro e transcrição ou expressão de genes estranhos (polinucleotídeos exógenos) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00113] Técnicas para inoculação de vírus em planta podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds, "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; and Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand Reinhold, New York.

[00114] Além do descrito acima, o polinucleotídeo da presente invenção pode também ser introduzido no genoma do cloroplasto, assim possibilitando a expressão no cloroplasto.

[00115] Uma técnica para introdução de sequências de polinucleotídeos exógenos no genoma do cloroplasto é conhecida. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, células de plantas são quimicamente tratadas de forma a reduzir o número de cloroplastos por células para em torno de um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido via bombardeamento de partículas para o interior das células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotídeo exógeno no interior do cloroplasto. O polinucleotídeo exógeno é selecionado de forma que seja integrado ao genoma do cloroplasto via recombinação homóloga que é prontamente efetivada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para esse fim, o polinucleotídeo exógeno inclui, além do gene de interesse, pelo menos um alongamento dó polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Adicionalmente, um polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável que serve de procedimentos de seleção sequencial para certificar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto que seguem essa seleção vão incluir o polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica podem ser encontrados na Patente americana N°s 4.945.050; e 5.693.507 que estão aqui incorporadas como referência. Um polipeptídeo pode assim, ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se tornar integrado à membrana interna do cloroplasto.

[00116] Uma vez que a tolerância ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, produtividade e/ou vigor em plantas pode envolver múltiplos genes agindo aditivamente ou em sinergia (veja, por exemplo, em Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também visa à expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para, dessa forma, obter um efeito acentuado na tolerância ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, produtividade e/ou vigor.

[00117] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuado ao co-introduzir múltiplas construções de ácidos nucleicos, cada um incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, para o interior de uma única célula da planta. A célula transformada pode então ser regenerada no interior de uma planta madura usando os métodos descritos acima.

[00118] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada ao co-introduzir para o interior de uma única célula da planta uma única construção de ácido nucleico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Tal construção pode ser desempenhada através de uma única sequência de promotor que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as diferentes sequências de polinucleotídeos exógenos. Para possibilitar a co-tradução de diferentes polipeptídeos codificados por um RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas por meio de uma sequência de um ponto de entrada interno de ribossomo (PEIR), que facilita a tradução das sequências de polinucleotídeos posicionadas na sequência da sequência de PEIR. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrito codificando os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto da extremidade tampada 5' como das duas sequências PEIR internas da molécula de RNA policistrônico para, dessa forma, produzir na célula todos os diferentes polipeptídeos. Alternativamente, a construção pode incluir várias sequências de promotores, cada uma delas ligada a uma sequência diferente, de polinucleotídeo exógeno.

[00119] A célula transformada da planta com a construção incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos pode ser regenerada para o interior de uma planta madura, usando métodos descritos mais acima.

[00120] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos pode ser efetuada pela introdução de diferentes construções de ácidos nucleicos, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, para o interior de uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem então serem cruzadas e a descendência resultante selecionada para traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, produtividade e/ou vigor, usando técnicas convencionais de cruzamento.

[00121] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta expressada com o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) cresce sob condições normais.

[00122] De acordo com algumas. configurações da invenção, o método ainda compreende o crescimento da planta que expressa o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) sob estresse abiótico.

[00123] Assim, a invenção envolve plantas expressadas de forma exógena (como descrito acima) com 0(s) polinucleotídeo(s) e/ou polipeptídeo(s) da invenção. Uma vez expressados para o interior da célula da planta ou na planta inteira, o nível de polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecido na arte, tais como ensaios de atividade, Western blots usando anticorpos capazes do ligar especificamente o polipeptídeo, Ensaio de Imunoabsorvência por ligação enzimática (ELISA), ensaios de radioimunidade (RIA) imunohistoquímico, imunocitoquímico, imunofluorescente e outros similares.

[00124] Métodos para determinar o nível na planta de RNA transcrito de polinucleotídeo exógeno são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, análise por Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-RCP) (incluindo quantitativa, semi-quantitativa ou em tempo real RT-RCP) e hibridização de RNA in situ.

[00125] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser usados em uma vasta gama de plantas de uso econômico, de maneira segura e custo efetiva.

[00126] O efeito da transgenia (o polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo) na tolerância ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, produtividade e/ou vigor pode ser determinado por meio do uso de métodos conhecidos.

[00127] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto por expressão de um transgene) e não-transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, tais como privação de água, temperatura não ideal (baixa temperatura, alta temperatura, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, estresse por condição de salinidade, estresse osmótico, toxicidade por metal pesado, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00128] Ensaio de tolerância à salinidade - Plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal, espera-se que exibam uma germinação melhor, vigor nas mudas ou crescimento com alta concentração de sal. O estresse por sal pode ser efetuado de várias maneiras, tais como, por exemplo, irrigando-se as plantas com uma solução hiperosmótica ao cultivar as plantas por meio hidropônico em uma solução de crescimento hiperosmótica (por exemplo, solução Hoagland com adição de sal), ou cultivando-se as plantas em um meio de crescimento hiperosmótico [por exemplo, um meio 50% Murashige-Skoog (meio MS)) com adição de sal]. Uma vez que as plantas variam consideravelmente com relação à suas tolerâncias à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de crescimento, ou no meio de crescimento podem ser ajustados de acordo com as características específicas de cada cultivar ou variedade de planta específica, de modo a provocar um efeito leve a moderado, na fisiologia e/ou morfologia das plantas (para orientações com relação à concentração apropriada, veja Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress -In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editors) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e a referência ali contida.

[00129] Por exemplo, um teste de tolerância ao sal pode ser realizado irrigando-se as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto. sódio (por exemplo, 5.0mM, 100mM, 200 mM, 400 mM NaC1) aplicadas a partir de baixo e a partir de cima, a fim de garantir a eventual dispersão do sal. Em seguida à exposição à condição de estresse, as plantas são monitoradas frequentemente até que surjam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais em plantas do tipo selvagem. Desse modo, a aparência externa do fenótipo, grau de murcha, e êxito geral para atingir a maturidade e rendimento de progênie são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas. Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não se limitam a, peso médio da planta molhada e seca, taxa de crescimento, tamanho das folhas, cobertura de folhas (área geral de folhas), o peso das sementes produzidas, o tamanho médio das sementes e o número de sementes produzidas por planta. Plantas transformadas que não exibirem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou exibindo uma biomassa maior do que as plantas em estado selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00130] Teste de tolerância osmótica - Ensaios de estresse osmótico (incluindo cloreto de sódio e ensaios PEG) são conduzidos para determinar se um fenótipo com estresse osmótico foi específico de cloreto de sódio ou se foi um fenótipo relacionado a um estresse osmótico geral. Plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. para experimentos sobre estresse asmático ou por sal, o meio é suplementado, por exemplo, com 50mM, 100mM, 200mM NaC1 ou 15%, 20% ou 25% PEG, Veja também os Exemplos 6 e7 da seção Exemplos que se segue.

[00131] Ensaio de tolerância seca/Ensaio Osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem maior sobrevivência da planta após privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol não iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e crescidas em placas de ágar para plantas por 4 dias, depois dos quais elas são transferidas para placas contendo 500 mM de sorbitol. O tratamento causa retardo no crescimento, então tanto plantas controle como plantas transgênicas são comparadas, medindo-se o peso da planta (seca e molhada), a produtividade, e pela taxa de crescimento medida ao tempo da florescência.

[00132] Por outro lado, telas de seca baseadas no solo são realizadas COM plantas sobre-expressadas com polinucleotídeos como detalhado acima. As sementes das plantas Arabidopsis de controle, ou outras plantas transgênicas com sobre-expressão de polipeptídeos da invenção são germinadas e transferidas para potes. O estresse por seca é obtido depois que a irrigação é cessada e acompanhada pela colocação de papel absorvente para aumentar a taxa de secagem do solo. Plantas transgênicas e de controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas de controle, desenvolverem uma murcha séria. As plantas são molhadas novamente depois de se obter uma fração significativa das plantas de controle apresentando murcha severa. As plantas são classificadas comparando-se aos controles por cada um dos seguintes critérios: tolerância a condições de seca e recuperação (sobrevida) seguida a nova rega.

[00133] Tolerância ao estresse pelo frio - Uma maneira de se analisar o estresse ao frio é como se segue. Plantas maduras (25 dias de vida) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são movidas de volta para a estufa. Duas semanas depois, os danos advindos do período de resfriamento, resultando, em retardo no crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas, medindo-se o peso das plantas (secas e molhadas), e comparando-se as taxas de crescimento medidas no tempo da florescência, o tamanho da planta, produtividade e outros.

[00134] Tolerância ao estresse por calor - Uma maneira de medir a tolerância ao estresse por calor é expondo-se a plantas a temperaturas acima de 34°C por um certo período. A tolerância da planta é examinada depois de transferir as plantas de volta a uma temperatura de. 22°C para recuperação e avaliação depois de 5 dias com relação às plantas de controle (não transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse ao frio nem ao estresse ao calor.

[00135] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam a porcentagem de sementes de uma planta transgênica que poderia completar o processo de germinação com a porcentagem de sementes de plantas de controle que são tratadas da mesma forma. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos de 22 horas de luz e 2 horas sem luz. A avaliação da germinação e vigor das mudas é conduzida entre 4. e 14 dias, após o plantio. O meio básico é um meio 50% MS (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).

[00136] A germinação é verificada, também sobe condições não favoráveis tais como frio (incubação a temperaturas inferiores a 10°C ao invés de 22°C) ou usando-se soluções inibidoras de sementes que contêm altas concentrações de um osmólito como sorbitol (a concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou aplicando-se concentrações crescentes de sal (de 50mM, 100 mM, 200 MM, 300 mM, 500 mM NaC1),

[00137] Efeito dos transgenes 110, crescimento, biomassa produtividade e/ou vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimento tais coreto a área da folha, comprimento da fibra, diâmetro da roseta, o peso da planta fresca e outro ao longo do tempo.

[00138] A taxa de crescimento pode ser medida usando análise digital de plantas em crescimento. Por exemplo, imagens de uma planta crescendo em estufa com base em lotes podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área de roseta é calculado usando a diferença entre a área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostragens.

[00139] A medida da produtividade da semente pode ser feita coletando-se o total de sementes de 8 a 16 plantas juntas, pesando todas elas, por meio do uso de balança eletrônica e dividindo-se o peso total pelo número de plantas. As sementes por área de crescimento podem ser calculadas da mesma maneira, levando-se em conta a área para crescimento destinada a uma única planta. O aumento da produtividade de semente por área de crescimento pode ser obtido aumentando-se a produtividade por planta, e/ou aumentando-se o número de plantas capazes de crescer em uma dada área.

[00140] A avaliação da produtividade de sementes por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, o número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8 a 16 plantas e divididas pelo número de plantas.

[00141] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo-se a biomassa da planta produzida, a área da roseta, o tamanho das folhas ou o comprimento da raiz ao longo do tempo (pode ser medido em cm2 por dia ou área de folha).

[00142] O comprimento da fibra pode ser medido usando-se um fibrógrafo. O sistema do fibrógrafo foi usado para computar o comprimento em termos do comprimento. do "Modo da Metade Superior”, O modo da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimento dos vãos em um dado ponto de porcentagem (Hypertext Transfer Protocol://World Wide: Web (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00143] Assim, a presente invenção é de alto valor agrícola ao promover a produtividade de culturas comercialmente desejadas (por exemplo, a biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou órgãos reprodutivos como o: número de sementes ou a biomassa das sementes).

[00144] Como usado aqui, o termo "em torno de" se refere a ± 10%.

[00145] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e seus conjugados significam "incluindo, mas não limitado a".

[00146] O termo 'constituído de" significa "incluindo e limitado a".

[00147] O termo "constituído essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alterarem materialmente as características novas e básicas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00148] Como usada aqui, a forma singular "um (a)', e o(a) incluem as referências no plural a menos que o contexto claramente determino o contrário. Por exemplo/ o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos incluindo misturas resultantes deles.

[00149] Ao longo de toda essa aplicação, várias configurações dessa invenção podem ser apresentadas em formatos de escala. Deve-se entender que a descrição no formato de escala é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser entendida como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Da mesma forma, a descrição em escala pode ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as sub-escalas possíveis, bem como valores individuais contidos naquela escala. Por exemplo, a descrição de uma escala como sendo de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente divulgadas subescalas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc, bem como os números individuais constantes na escala, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da escala.

[00150] Quando uma faixa numérica é indicada aqui, ela deve ser entendida a incluir qualquer numeral citado (inteiro ou fracionário) que esteja dentro da dita faixa. As expressões "variando/varia entre" um primeiro número indicativo e um segundo número indicativo e "variando/varia de" um primeiro número indicativo "a" um segundo número indicativo são usadas aqui, indiferentemente, e têm o significado de incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionários ou inteiros contidos nesse intervalo.

[00151] Como usado aqui, o termo "método" se refere a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para cumprir uma determinada tarefa, mas não limitada a essas maneiras, meios, técnicas e procedimentos já conhecidos para, ou prontamente desenvolvidos de conhecidas maneiras, meios, técnicas e procedimentos por profissionais das artes da Química, Farmacologia, Biologia, Bioquímica e Medicina.

[00152] Reconhece-se que certas características da invenção, que são, por clareza, descritas no contexto de configurações em' separado, podem também ser fornecidas em combinação com uma única configuração. Inversamente, várias características da invenção que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, podem também ser fornecidas separadamente em qualquer subconfiguração adequada ou conforme adequada em qualquer outra configuração descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias configurações não devem ser consideradas características essenciais dessas configurações, a menos que a configuração seja inoperante sem esses elementos.

[00153] Várias configurações e aspectos da presente invenção como delineadas acima e como reivindicadas na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos seguintes exemplos, EXEMPLOS

[00154] A referência é, a partir de agora, feita com relação aos' exemplos, que, juntos com as descrições acima, ilustram algumas configurações da invenção de uma forma não limitativa.

[00155] Em geral, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de recombinação de DNA. Tais técnicas são cuidadosamente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes Ausubel, R. M.., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley Sons, New York. (1988); Watson et al., “Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) ''Genome Analysis, A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as sei forte in U.S. Pat. Números. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology; A Laboratory Handbook", Volumes Cellis, J. E,, ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E,, ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); ensaios de imunidade disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e em patentes, veja, por exemplo, Patentes americanas Números 3,191,9327 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3; 879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,3457 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, S. D., and Higgins S. J., Eds. (1984).; "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes'' IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "RCP Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) todas elas são incorporadas por referência como se previsto por completo nela. Outras referências gerais são fornecidas ao longo desse documento. Os procedimentos contidos aqui são tidos como bem conhecidos na arte e são fornecidos para conveniência do leitor. Todas as informações contidas aqui são incorporadas aqui por referência. EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE ESTRESSE ABIOTICO PUTATIVO - GENES DE TOLERÂNCIA E/OU PRODUTIVIDADE/BIOMASSA

[00156] Os presentes inventores identificaram genes que aumentam a tolerância ao estresse abiótico (TEAB) e/ou taxa de crescimento/ produtividade/biomassa/vigor, como segue. Os genes foram validados in vivo como, previamente descrito em W02004/104162 para o presente cessionário. Todos os conjuntos de dados de sequência de nucleotídeos usados aqui foram originados a partir de bancos de dados publicamente disponíveis. Dados de sequência de 50 diferentes espécies (principalmente espécies vegetais) foram introduzidos em um único e abrangente banco de dados. Outras informações sobre expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos foram também incorporados. Os principais bancos de dados usados incluem: • Genomas

[00157] O Genoma do Arabidopsis [TAIR genome version 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto)org/)]

[00158] Genoma do arroz [IRGSP build 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)].

[00159] Choupo [Populus trichocarpa release 1.1 from JGI (assembly release v1.0) Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]

[00160] Brachypodium [JGI 4x assembly Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) brachpodium (ponto) org)]

[00161] Soja [DOE-JGI SCP, version Glyma0 ( Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) phytozome (ponto) net/)]

[00162] Uva [CNIB WGS assembly ftp://ftp (Ponto) ncbi (ponto) nih (ponto) gov/ genbank/wgs/)]

[00163] Feijão [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly [Hypertext Transfer Protocol://msc (ponto) jcvi (ponto) org/r_communis]

[00164] Sorgo [DOE-JGI SCP, version Sbil Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) phytozome (ponto) net/)].

[00165] EST expressados e sequências de mRNA foram extraídos de:

[00166] GeneBank versões 154, 157, 160, 161, 164, e 165 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/dbEST/)

[00167] RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/).

[00168] TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (Ponto) org/).

[00169] Banco de dados de proteínas e caminhos

[00170] Uniprot (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.expasy.uniprot.org/).

[00171] AraCyc (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp).

[00172] ENZYME (Hypertext Transfer Protocol://expasy.org/enzyme/).

[00173] Conjuntos de dados de micro-ordenamento foram baixados de

[00174] GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

[00175] TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).

[00176] Dados de. Proprietário de micro-ordenamento em fibras de algodão da Evogene • Informação sobre QTL

[00177] Gramene (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web, (ponto) gramene (ponto) org/qtl/).

[00178] A montagem de um Banco de Dados foi realizada para construção de um banco de dados amplo, confiável, anotado e fácil de analisar compreendido de mRNA genômico publicamente disponível, sequências de DNA ESTs, dados de várias culturas, bem como expressão de gene, anotação de proteína e OTLs de dados de caminhos, e outras informações relacionadas.

[00179] A. montagem de um banco de dados é compreendida de uma caixa de ferramentas de refinamento, estruturação, anotação e análise de gene possibilitando permitindo construir um banco de dados personalizado para cada projeto de descobrimento de gene. O refinamento de gene e ferramentas de estruturação permitem detectar de forma confiável variantes de união e transcrições sem sentido, gerando a compreensão de vários resultados potenciais de fenótipos de um único gene. As capacidades das plataformas "LEADS" da Compugen LTD para analisar o genoma humano foram confirmadas e têm sido aceitas pelo comitê cientifico ("Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al- (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91), e se mostraram eficientes também para a genômica de plantas.

[00180] Agrupamentos EST e montagem de gene- Para agrupamento e montagem de genes de Arabidosis e arroz a versão "LEADS genômica" foi empregada. Essa ferramenta permite o mais acurado agrupamento de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prognostica a estrutura do gene, bem como eventos alternativos de encaixe e transcrição sem sentido.

[00181] Para organismos sem dados da sequência genômica completa disponível, "LEADS expressados" bem como o software TIGR de agrupamento foi aplicado (Hypertext Transfer Protocol//World Wide Web (ponto) tigr (ponto) org/). Os resultados das duas ferramentas de agrupamento foram comparados e, em casos onde os agrupamentos previstos pelas duas ferramentas foram significativamente diferentes, ambas as versões foram apresentadas e consideradas.

[00182] Anotação de gene - Genes e proteínas previstos foram anotados como se segue: Busca de blast [ferramenta básica de busca local do alinhamento] (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov (ponto) library (ponto) vu (ponto) edu (ponto) au/BLAST/) contra todas as plantas UniProt (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) expasy (ponto) uniprot (ponto) org/) as sequências foram realizadas.

[00183] Frame-Finder (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/~guy/estate/) cálculos com estatísticas padrão foram utilizadas para prognosticar sequências de proteínas para cada transcrito.

[00184] As proteínas prognosticadas foram analisadas pela InterPro (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpor/).

[00185] Ferramenta básica de busca local do alinhamento (blast) de proteínas, dos bancos de dados da AraCyc e ENZYME foi usada para mapear os transcritos prognosticados para os caminhos da AraCyc.

[00186] Cada transcrito foi comparado usando o algoritmo tblastx (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov (ponto) library (ponto) vu (ponto) edu (ponto) au/BLAST/) contra todos bancos de dados de organismos para validar a acuidade da sequência de proteínas prognosticada, e para detecção eficiente dos ortólogos.

[00187] Perfil da expressão de genes - Poucas fontes de dados foram exploradas para o perfil de expressão de gene, a saber, dados de micro-ordenamento e perfil de expressão de gene (veja abaixo). De acordo com o perfil de expressão de gene, uma análise da correlação foi realizada para identificar genes que são co-regulados sob diferentes etapas de desenvolvimento e condições ambientais.

[00188] Conjuntos de dados de microarray publicamente disponíveis foram baixados dos cites da TAIR e da CNIB GEO, renormalizados e integrados ao banco de dados. O perfil de expressão foi um dos mais importantes dados de fonte para identificar genes importantes para a TEAB. Além disso, quando genes homólogos de diferentes culturas foram responsivos à TEAB, os genes formam marcados como "altamente previsíveis para o aumento da TEAB".

[00189] Um sumário digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequência compreendida no agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot digital, é uma ferramenta que mostra o perfil virtual de expressão com base nas sequências de EST que formam o agrupamento de genes. A ferramenta pode fornecer o perfil de expressão de Um agrupamento em termos da anatomia da planta (em que tecidos/órgãos o gene está expressado), estágio de desenvolvimento (o estágio de desenvolvimento em que um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (fornece as condições fisiológicas sob as quais um gene é expressado, tais como seca, frio, infecção patógena, etc.). Dada uma distribuição aleatória de ESTs em diferentes agrupamentos, a expressão digital fornece o valor da probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento ter um total de N ESTs para conter X ESTs de uma certa coleta de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade são levados em consideração: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das. bibliotecas implicadas e relacionadas, c) o número total de ESTs disponíveis que representam as espécies. Por meio disso, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são largamente enriquecidos dom ESTs do grupo de bibliotecas de interesse que indicam uma expressão especializada.

[00190] Os conceitos de ortologia e paralogia têm, recentemente, sido aplicados, às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações do genoma completo. Ortólogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos: o primeiro evoluído de um ancestral comum por especialização, e o último relacionado à eventos de duplicação. Assume-se que os parálogos surgidos de eventos de duplicação antigos, é provável que tenham divergido em sua função, enquanto verdadeiros ortólogos são mais prováveis que retenham a função idêntica através do período de evolução.

[00191] Para investigar e identificar adicionalmente os genes ortólogos putativos da TEAB de espécies monocotiledôneas, dois métodos computacionais foram integrados:

[00192] (1) Método para alinhamento de sequências ortólogas - baseado na construção de grupos ortólogos através de múltiplos táxons eucariontes, usando modificações no algoritmo de agrupamento de Markov para agrupar ortólogos e parólogos putativos. Esses ortólogos putativos foram ainda organizados sob o Filograma um diagrama de ramificação (árvore), que se assume ser uma estimativa de uma filogenia dos genes.

[00193] (ii) Método para geração de perfil "Expressão digital" da expressão de genes - Os presentes inventores realizaram um trabalho considerável objetivando a anotação das sequências. Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas de EST foram classificadas usando: um vocabulário fixo de termos personalizados como tratamentos experimentais. As anotações de todos os ESTs agrupados a um gene foram analisadas estatisticamente comparando-se suas frequências no agrupamento versus suas abundâncias no banco de dados, permitindo construir um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é denominado “expressão digital".

[00194] A lógica de. se utilizar esses dois métodos complementares é baseado na assunção de que ortólogos verdadeiros são prováveis de reter função idêntica ao longo do período evolucionário. Esses dois métodos (padrão de expressão e sequência) fornecem dois conjuntos diferentes de indicações nas similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades no nível das sequências - aminoácidos idênticos nos domínios da proteína e similaridade no perfil de expressão.

[00195] Ao todo 110 genes foram identificados como tendo o maior impacto na TEAB. quando sobre-expressados em plantas. Os genes da TEAB identificados, suas sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos coadjutores, bem como suas sequências atualizadas de acordo com o banco de dados Genbank são sumarizados na Tabela 1, abaixo. Tabela 1 Genes ABST identificados

[00196] Polinucleotídeos e polipeptídeos com homologia significativa aos genes da TEAS identificados têm sido identificados a partir de bancos de dados usando o software BLAST [ferramenta básica de. busca local, do alinhamento] que usa o algoritmo BlastX. As sequências de nucleotídeos questionados foram SEQ ID Números: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 13-, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ,73 ,75 ,77, 79, 81, 8.2, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 138, 140, 142, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 161, 163, 165, 168, 169, 170, 171, 173, 175, 177, 179, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198 e 1653, e os homólogos identificados de TEAB foram fornecidos na Tabela 2, abaixo. Tabela 2

[00197] Tabela 2: *- A homologia foi calculada como porcentagem de identificação com relação às sequências de polinucleotídeos SEQ ID Números:1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ,73 /75 ,77, 79, 81, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 116, 118, 119 121, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 138, 140, 142, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 161, 163, 165, 168, 169, 170, 171, 173, 175, 177, 179, 180, 182; 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198 e as sequências em tese são sequências de proteínas identificadas no banco de dados com base em mais de 80% de identidade em relação às sequências previstas traduzidas da sequência de nucleotídeos em questão. Estão apresentados os polipeptídeos homólogos e os polinucleotídeos codificando as mesmas (ou os mesmos). EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE GENES PUTATIVOS DA TEAB

[00198] Diversas sequências de DNA de genes de TEAB foram sintetizadas pela GeneArt (Hypertext Transfer Protocol//World Wide Web (ponto) geneart (ponto) com/). DNA sintético é projetado em sílico, com base nas sequências de aminoácidos codificadas dos genes de TEAB e usando as Tabelas de uso de códons calculados a partir de transcriptomas da planta (exemplo de tais Tabelas podem ser encontrados no Banco de Dados de Uso de. Códons disponíveis online no Hypertext Transfer Protocol//World Wide Web (ponto) kazusa (ponto) or (ponto) jp/codon/). As sequências codificadoras otimizadas são projetadas de um modo que nenhuma alteração seja introduzida na sequência de aminoácido codificada enquanto usando os códons preferidos para expressão em plantas dicotiledôneas (principalmente tomate e Arabidopsis) e plantas monocotiledôneas, como o milho. Pelo menos uma mutação silenciosa por pares base de 20 nucleotídeos é introduzida na sequência comparada às sequências originais para se evitar o possível silenciamento ao se sobre-expressar o gene na cultura alvo. Para as sequências otimizadas, os pontos de restrição de enzimas a seguir foram adicionados - XbaI, BamHI, SmaI na extremidade 5’ e SacI na extremidade 3'. As sequências sintetizadas pelo fornecedor (GeneArt, Gmbh) são clonadas em plasmideo pCR-Script. EXEMPLO 3 DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO NA PLANTA

[00199] Para validar seus papéis no aumento da TEAB e na produtividade, genes selecionados foram sobre-expressados em plantas como a seguir. Estratégia de clonagem

[00200] Genes selecionados daqueles apresentados no Exemplo 1 foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, os quadros de leitura abertos em toda a extensão (ORFS) foram identificados. Agrupamentos de EST e, em alguns casos, sequências de mRNA foram analisadas para identificar o quadro de leitura aberto inteiro comparando-se os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de plantas.

[00201] A fim de clonar os cDNAs em seu comprimento total, transcrição reversa (TR) seguida de reação em cadeia de polimerase (RCP, TR-RCP) foi realizada no RNA total extraído das folhas, raízes e outros tecidos da planta, que cresce em condições normais ou com deficiência nutricional. A extração total do RNA, a produção do cDNA e a amplificação do RCP foi realizada usando protocolos padrão descritos em outra parte (Sambrook J., E.F. Fritsch, e T, Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos para aqueles experientes na arte. Os produtos da RCP foram purificados usando-se um kit de purificação de RCP (Qiagen).

[00202] Normalmente, 2 conjuntos de primers foram preparados para a amplificação de cada gene, via RCP aninhada (significando primeiro amplificar o gene usando primers externos e então usando os produtos de RCP produzidos como um template para uma segunda reação RCP, onde o conjunto interno de primers foi usado). Alternativamente, um ou dois dos primers internos foram usados para amplificação do gene, ambos na primeira e na segunda RCP (o que significa que 2 -3 primers foram projetados para o gene). Para facilitar a clonagem em seguida dos cDNAs, uma extensão de 8 - 12 bp é adicionada ao 5' de cada primer interno. A extensão do primer inclui um ponto de restrição à endonuclease. OS pontos de restrição são selecionados utilizando-se dois parâmetros: (a) o ponto de restrição não existe na sequência de cDNA; e (b) os pontos de restrição nos primers para diante e reversos são projetados de tal forma que o cDNA compilado é inserido em sentido e direção dentro do vetor binário utilizado para a transformação. Na Tabela 3 abaixo, os primers usados para a clonagem de genes de TEAB são fornecidos. Tabela 3 Genes clonados para TEAB a partir de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico e os primers usados para a clonagem.

[00203] Tabela 3. Presentes estão os genes TEAB clonados e o(s) gene(s) de controle pelo número de identificação do gene e o polinucleotídeo SEQ ID Números. Também estão presentes os primers e as enzimas de restrição usadas para clonagem dos genes de TEAB.

[00204] Os produtos de RCP foram compilados com endonucleases de restrição (Roche,, Suíça) de acordo com os desenhos dos pontos nos primers (Tabela 3). Cada produto de RCP foi inserido em um vetor de alta cópia originado do vetor do plasmídeo KS pBlue-script, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) stratagene (ponto) com/manuals/212205 (ponto) pdf). Nocaso de vetor de alta cópia originado de vetor de plasmídeo KS pBlue-script (pGN), o produto da RCP foi inserido no plasmídeo alta cópia anterior ao terminador NOS (SEQ ID N°:1651) originado do vetor binário pBI 101.3 (GenBank AccesSion No. U12640, nucleotídeos 4417 a 4693), na Tabela 4 abaixo. Em outros casos (pKSJ_6669a), o promotor At6669 (SEQ ID N°: 1652) é já clonado dentro do KS pBlue-script, assim, o gene é introduzido além do promotor (Tabela 4, abaixo).

[00205] O sequenciamento dos genes inseridos foi realizado usando um sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após a confirmação das sequências de genes clonados, um cDNA clonado acompanhado de um terminador NOS foi introduzido no interior dos vetores binários pGI contendo o promotor At6669 via compilação com endonucleases de restrição apropriadas. Em outros casos, o cDNA clonado acompanhado do promotor At6669 foi introduzido no vetor pGI (que ainda não continha o promotor At6669). Em qualquer dos casos, a inserção foi seguida de uma cópia única do terminador NOS (SEQ ID 1651). Os produtos compilados e o vetor plasmídeo linearizado foram ligados usando uma enzima ligase DNA T4 (Roche, Suíça). Tabela 4

Tabela 4

[00206] O vetor plasmideo pPI foi construido inserindo-se uma sequência de sinal sintética poli-(A), originária de um vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, GenBank Accession No. U47295; nucleotídeos 4658-4811) no ponto de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, GenBank Accession No. U12640). O pGI (Figura 1) é similar ao pPI, mas o gene original na espinha dorsal é o GUS-Intron, em vez de GUS.

[00207] A sequência de promotor da Arabidopsis thaliana, At6669, (descrita em SEQ ID N°: 1652) é inserido no vetor binário pPI, acima dos genes clonados usando-se enzimas de restrição HindIII e SalI ou BamHI (Roche), seguido de uma ligação de DNA e extração de plasmídeo binário de colônias positivas de E. coli, como descrito acima.

[00208] Colônias positivas foram identificadas por RCP usando primers que foram desenhados para alcançar o promotor introduzido (At6669) e o gene clonado no vetor binário. Em todos os casos, o primer RCP para adiante foi o primer definido em SEQ ID N°:1650 (do promotor At6669) e o primer reverso (derivado de um gene clonado específico) foi como segue: Para MAS1, o primer reverso foi SEQ ID NO:1570; para o MAB14, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1574; para MA310, o primer reverso foi o SEQ ID Wt1577; para o MAB25, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1581; para o MAB134, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1585; para o MAB99, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1587; para o MAB36, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1590; para o MAB7, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1594; para o MAB44, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1596; para o MAB4, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1600; para o MAB9, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1603 (MAB9); para o MAB100, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1606; para o MAB13, o primer reverso foi o SEQ ID No:1611; para o MA332, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1614; para o MAB35, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1617; para o MAB146, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1620; para o MAB2, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1622; para o MAB20, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1626; para o MAB43, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1629; para o MAB46, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1633; para o MAB50, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1637; para o MAB66, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1640; para o MAB4, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1644; para 0 gene sintético MAB15, o primer reverso foi SEQ ID Na:1645; para o gene sintético MAB17, o primer reverso foi SEQ ID N°:1646; para o gene sintético MAB18, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1647; para o gene sintético MAB137, o primer reverso foi o SEQ ID N°: 1648; e para o gene sintético MAB3, o primer reverso foi o SEQ ID N°:1649, que são projetados para span o promotor e o gene introduzido, no vetor binário.

[00209] Sequências sintéticas [tais como a da MAB14, nucleotídeo SEQ ID N°:23, que codifica a proteína SEQ ID N°:219) de alguns dos polinucleotídeos clonados foram encomendados de -um fornecedor comercial (GeneArt, GmbH). Para otimizar a sequência codificadora, as Tabelas de uso de códons calculadas a partir dos transcriptomas de planta foram usadas (exemplo de tais Tabelas podem ser encontradas no Banco de Dados de Uso de Códons - Codon Usage Database - disponível online no Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) kazusa (ponto) or (ponto) jp/codon/]. As sequências codificadoras otimizadas foram projetadas de um modo tal que nenhuma alteração fosse introduzida na sequência de aminoácido codificada, enquanto usando códons preferidos para expressão em plantas dicotiledôneas, principalmente tomate e Arabidopsis; e plantas monocotiledôneas como o milho. Essas sequências otimizadas promovem uma taxa de tradução melhor e, assim, maiores níveis de expressão de proteína. Partes das sequências foram ordenadas como as sequências originais. Para o ladeamento das sequências otimizadas/não-otimizadas pontos adicionais de enzimas de restrição únicas foram adicionados para facilitar a clonagem dos genes em vetores binários.

[00210] Promotores usados: promotor Arabidopsis At6669 (SEQ ID N°':1652; que é SEQ ID N°:61 de W004081173 para Evogene Ltd.).

[00211] As sequências de cDNA clonados são fornecidas em SEQ ID Números: 1530-1534, 1536-1545, 1547-1566, 1654, 1665, 1666, 1667 e 1668. A tradução de proteína da sequência de cDNA amplificada combina exatamente com aquela da previsão inicial bioinformática das sequências de proteínas. As sequências de polipeptídeos dos polinucleotídeos clonados são fornecidos em SEQ ID Números:201, 212, 284, 213, 217, 317, 219, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 237, 203, 247, 252, 205, 265, 267, 271, 277, 207, 208, 211, 283, 1655, 311, 334, e 254. EXEMPLO 4 TRANSFORMAÇÃO DAS CÉLULAS DA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO GENES PUTATIVOS .de TEAB

[00212] Cada um dos vetores binários descritas no Exemplo 3 acima é usado para transformar células de Agrobacterium. Duas construções binárias adicionais, tendo um gene repórter GUS/Luciferase substituindo o gene de TEAB (posicionado além do promotor At6669), são usadas como controle negativo.

[00213] Os vetores binários são introduzidos na Agrobacterium tumefaciens GV301, ou nas células LB4404 competentes (por volta de 109 Células/mL) por eletroporação. A eletroporação é realizada usando um eletroporador MicroPulser (Biorad), cuvetas de 0,2 cm (Biorad) e programa de eletroporador EC-2. As células tratadas são cultivadas em um meio liquido LB a 28°C por 3 horas, então colocadas em placas ágar LB suplementadas com gentamicina (50 mg/L; para cepas de Agrobacterium GV307.) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepa de Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28°C por 48 horas. As colônias de Agrobacterium que se desenvolveram no Meio seletivo, foram analisadas por RCP usando os primers descritos acima (Exemplo 3) com relação à identificação de colônias' positivas de vetores primários. Os produtos resultantes da RCP são: isolados e sequenciados como descrito no Exemplo 3 acima, para verificar se as sequências de TEAB corretas foram apropriadamente introduzidas nas células de Agrobacterium. EXEMPLO 5 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS THALIANA COM GENES PUTTIVOS DE TEAB

[00214] Plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (plantas T0) são transformadas usando o procedimento Floral Dip descrito por Clough e Bent (10) e por Desfeux et (11), com modificações menores.

[00215] Brevemente, as plantas T0 são semeadas em potes de 250 ml cheios com uma mistura de crescimento à base de turfa molhada. Os potes são cobertos com folha de alumínio e um domo plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24°C sob ciclos de 16/8, horas de luz/escuro. As plantas T0 estão prontas para transformação seis dias antes da antese.

[00216] Colônias únicas de Agrobacterium carregando as construções binárias são geradas como descrito no Exemplo 4 acima. As colônias são cultivadas em um meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas são incubadas a 28°C por 48 horas sob agitação intensa e então centrifugadas a 4000 RPM por 5 minutos. As bolinhas compreendendo células. de Agrobacterium são suspensas novamente em um meio de transformação contendo meia-força (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); purina benzilamino a 0,044 gM (Sigma); vitaminas B5 Gambourg a 112 μg/L; 5% de sucrose e, Silwet L-77 a '0,2 ml/L (Especialistas 021, CT) em água bidestilada; com pH de 5,7.

[00217] A transformação das plantas T0 é realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium, de forma que o tecido vegetal acima do solo é submerso por 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada é imediatamente colocada em uma bandeja plástica, então coberta com um domo plástico transparente para manter a umidade, e é mantida em sala escura à temperatura ambiente por 18 horas, para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) são então descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas T0 transgênicas crescem na estufa por 3-5 semanas até que as síliques fiquem marrons e secas. As sementes são colhidas das plantas e mantidas à temperatura ambiente até a semeadura.

[00218] Para gerar plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, sementes coletadas das plantas T0 são esterilizadas na superfície por enxágue em etanol 70% por 1 minuto; seguido de enxágue em hidrocloreto de sódio a 5% e Triton 0,05% por 5 minutos. As sementes com superfície esterilizada são meticulosamente lavadas em água destilada estéril e então colocadas em placas de cultura contendo Murashige-Sk0Og de meia-força (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar de planta; canamicina a 50mM; e carbenicilina (Duchefa) a 200 mM. As placas de cultura são incubadas a 4°C. por 48 horas e então transferidas para uma sala de crescimento a 25°C para um período adicional de incubação de uma semana. Plantas T1 Arabidopsis essenciais são transferidas para uma placa de cultura fresca para outra semana de incubação. Em seguida à incubação, as plantas T1 são removidas das placas de cultura e plantadas em uma mistura de conteúdo de crescimento em potes de 250 mL. As plantas transgênica8 são deixadas para crescer em estufa até a maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 são cultivadas e desenvolvidas até a maturidade como as plantas T2 sob as mesmas condições que as usadas para cultura e crescimento de plantas T1. EXEMPLO 6 ENSAIO DE CULTURA DE TECIDO COM TEAB AUMENTADA Ensaio 1: crescimento de planta sob estresse osmótico (PEG) em condições de cultura de Tecido

[00219] Estresse osmótico- condições reproduzindo a alta osmolaridade encontrada durante secas (por exemplo, 25% PEG8000). Uma das consequências das secas é a introdução do estresse osmótíco na área que circunda as raízes; assim, em muitos estudos científicos, PEG serve para simular a seca.

[00220] Sementes com a superfície esterilizada são semeadas em um meio basal [meio Murashige-Skoog a 50% (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente solidificador] na presença de canamicina (para selecionar apenas as plantas transgênicas). Depois da semeadura, as placas são transferidas para estratificação por 2-3 dias a 4°C e então crescidas a 25°C sob um ciclo diário de 12 horas de luz e 12 horas no escuro por 7 a 10 dias. Nesse ponto, mudas aleatoriamente escolhidas são cuidadosamente transferidas para placas com 25% PEG em meio MS 0,5 ou condições normais (meio MS 0,5). Cada placa contém 5 mudas do mesmo evento, e 3-4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos de. são analisados de cada construção. Plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção são comparadas com as medidas médias das plantas de Controle Mock - as plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS Intron - GUI) sob os mesmos promotores são usadas como controle.

[00221] Imagens Digitais - Um sistema de aquisição de imagens de laboratório, que consiste de uma câmera reflex digital (Canon EOS 300D) 10 anexada Com uma lente de distância focal de 55 mm (Canon, série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução, (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de iluminação (4 bulbos de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi usada para capturar imagens de mudas semeadas em placas quadradas de ágar.

[00222] O processo de captura de imagens foi repetido a cada 7 dias começando no dia 0 até o dia 14. A mesma câmera anexada de uma lente de 24 mm de distância focal (Canon, série EF), posicionada em uma montagem de ferro feita sob medida foi usada para capturar imagens.

[00223] Um sistema de análise de imagens foi usado, que consiste de um computador pessoal desktop (Intel P4, com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagens; baseado em Java que foi desenvolvido pelos institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos, livremente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol//rsbweb (ponto) nih (ponto) gov. As imagens foram obtidas com resolução de 6 Mega Pixels (072 x 2048 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experta Group standard) com baixa Compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00224] Análise das mudas - Usando a análise digital os dados das mudas foram calculados, incluindo área da folha cobertura de raízes e comprimento das raízes. A Taxa Relativa de Crescimento

[00225] (TRC) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula; Fórmula I: Taxa Relativa de Crescimento, = (Δ Área / Δt) *(1/ Área t0)

[00226] Δt é o dia atual da imagem analisada subtraído do dia inicial (t - t0). Assim, a taxa da área de crescimento relativo é em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento no comprimento é em unidade de 1/dia.

[00227] Ao fim do experimento, as mudas foram removidas do meio e pesadas para a determinação do peso da planta fresca. A Taxa de Crescimento Relativo é determinada pela comparação da área da folha, comprimento da raiz e cobertura de raízes entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados são usados para determinar o efeito do gene introduzido no vigor da planta, sob estresse osmótico, bem como sob condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido na acumulação de biomassa, sob estresse osmótico, bem como sob condições ideais, é determinado comparando-se o peso das plantas frescas às plantas de controle (GUI).

[00228] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e construções que se sobressaem, os resultados de eventos de transformação independentes são avaliados para a influência geral do gene (efeito do gene) e para cada um dos eventos. testados (melhor evento). T-Testes de estudantes foram aplicados, usando significância de P < 0,05 ou P 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi usado (Versão 52.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Resultados experimentais

[00229] As sequências de polinucleotídeos da invenção foram ensaiadas para um número de traços desejados.

[00230] As Tabela 5-6 descrevem análises da Área da Folha em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob regulação do promotor 6669 sob condições de 25% PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra que no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle, com A indicando uma diferença a um nível de significância P < 0,05 e, A* uma diferença a um nível de significância P < 1. Tabela 5: Genes apresentando melhoramento na Área de Folha

[00231] Tabela 5: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 6: Genes apresentando melhor Área de Folha sob 25% PEG

[00232] Tabela 6: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1, Os SEQ ID N°S dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00233] As Tabelas 7-9 descrevem análises da Cobertura de Raízes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 sob condições de 25% de PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle Tabela 7

[00234] Tabela 7: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidas na Tabela 3 acima. Tabela 8

[00235] Tabela 8: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 9

[00236] Tabela 9: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com. o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00237] As Tabelas 10-11 descrevem análises do Comprimento das Raízes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em 25% de PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 10

[00238] Tabela 10: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 11

[00239] Tabela 11: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00240] As Tabelas 12-13 descrevem análises da Área de Folha RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em 25% PEG. Cada Tabela representa um experimento diferente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 12

[00241] Tabela 12: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUT); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 13

[00242] Tabela 13: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o, controle (GUI; uma diferença significante em P < 0,05 A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00243] As Tabelas 14-18 descrevem análises da Cobertura de Raízes RGR em plantas sobre-expressando polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em 25 PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles de controle. Tabela 14

[00244] Tabela 14: LSM = Média menor de quadrado; melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A diferença significante em P. < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 15

[00245] Tabela 15: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 16

[00246] Tabela 16: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante- em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 17

[00247] Tabela 17: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 18

[00248] Tabela 18: LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com ó Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00249] As Tabelas 19-21 descrevem análises do Comprimento de Raízes RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em 25% PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 19

[00250] Tabela 19: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante. em P < 0,05 A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso ruas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 20

[00251] Tabela 20; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (.de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno. expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 21

[00252] Tabela 21; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas., são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00253] As Tabelas 22-23 descrevem análises do Peso da Planta. Fresca em plantas. sobre-expressando os polinucleotídeos,da invenção sob a regulação do promotor 6669 em 25% PEG. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 22

[00254] Tabela 22; LSM = Média menor de quadrado; melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 23

[00255] Tabela 23; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00256] As Tabelas 24-27 descrevem análises da Área de Folha em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles, do controle. Tabela 24

[00257] Tabela 24; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05. Os SEQ ID N°s dos genes clonado (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 25

[00258] Tabela 25: LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima, Tabela 26

[00259] Tabela 26: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 27

[00260] Tabela 27: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com. o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00261] As Tabelas 28-31 descrevem análises da Cobertura de Raízes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 28

[00262] Tabela 28; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 29

[00263] Tabela 29: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 30

[00264] Tabela 30.: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle '(GUI); Uma diferença significante em P < Q,05, 4* diferença significante em P < 0, 1 . Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00265] Tabela 31

[00266] Tabela 31 LSM = Média menor de quadrado, melhoria = comparar o controle {GUI); Uma diferença significante em P < A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos: dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3- acima.

[00267] As Tabelas 32-33 descrevem análises do Comprimento das Raízes em plantas sabre- expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento. independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle.

[00268] Tabela 32

[00269] Tabela 32: LSM. = Média menor de quadrado;. % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com O Id de Gene). que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 33

[00270] Tabela 33: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUIO), Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que São de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00271] As Tabelas 34-36 descrevem análises da Área das Folhas RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 34

[00272] Tabela 34 LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,0.5, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas', são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 35

[00273] Tabela 35: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 36

[00274] Tabela 36: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nós dos genes clonados acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00275] As Tabelas 37-41 descrevem análises: da Cobertura de Raízes RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 37

[00276] Tabela 37: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 38

[00277] Tabela 38: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em p < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 39

[00278] Tabela 39: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3, acima. Tabela 40

[00279] Tabela 40: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria =comparar 0: controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 41

[00280] Tabela 41: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°9 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos. na Tabela 3 acima.

[00281] As Tabelas 42-46 descrevem análises do Comprimento das Raízes RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não: conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 42

[00282] Tabela 42: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 43

[00283] Tabela 43: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são: fornecidos, na Tabela 3 acima. Tabela 44

[00284] Tabela 44: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 45

[00285] Tabela 45: LSM = Média menor de quadrado; 1 melhoria --£ comparar o controle (GUI) Urna diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene.) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 46

[00286] Tabela 46: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00287] As Tabelas 47-48 descrevem análises do: Peso das Plantas Frescas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições normais. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 47

[00288] Tabela 47: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar O controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 48

[00289] Tabela 48: LSM = Média menor de quadrado; W melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00290] Ensaio 2: plantas com crescimento com deficiência de Nitrogênio sob condições de cultura de Tecidos - Os presentes inventores perceberam que o ensaio de EUN (Eficiência na Utilização de Nitrogênio) é relevante para a avaliação dos genes candidatos à TEAB, uma vez que a deficiência de nitrogênio incentiva o alongamento das raízes, aumenta a cobertura de raízes e permite detectar o potencial das plantas para gerar um sistema de raízes melhor sob condições de seca. Além disso, há indicações na literatura (Wesley et al., 2002 Journal of Experiment Botany Vol, No. 366, pp. 13-25) de que mecanismos biológicos do EUN e a tolerância à seca estão interligados.

[00291] Sementes com superfície esterilizada são semeadas em meio basal [meio 50% MurashigeSkoog medium (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente solidificador] na presença de canamicina (para seleção somente de plantas transgênicas). Depois da semeadura, as placas são transferidas por 2-3 dias a 4°C para estratificação e então postas a crescer a 25°C sob ciclos diários de 12 horas com luz e 12 horas no escuro por 7 a 10 dias. Nesse ponto, mudas escolhidas aleatoriamente são cuidadosamente transferidas para placas com condições limitadoras de nitrogênio: meio 0,5% MS em que a concentração de nitrogênio combinado (NH4NO3 e KNO3) é de 0,75 mM (condição de deficiência de nitrogênio) ou para placas em que as condições nitrogênio são normais (NH4NO3 e KNO3) a 3 mM (concentração normal de nitrogênio). Todos os experimentos de cultura de tecidos foram levados ao mesmo tempo (UEN, PEG e Normal). Os resultados de crescimento sob condições normais de nitrogênio são os mesmos que para PEG e são apresentados no ensaio 1. Cada placa contém 5 mudas do mesmo evento, e 3-4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos de transformação independentes são analisados de cada construção. Plantas expressando os polinucleotídeos da invenção são comparadas à medição, média em plantas de controle (GUI - abrigando o gene GUS sob o mesmo promotor) usadas no mesmo experimento.

[00292] Imagens digitais e análises estatísticas - Os parâmetros foram medidos e analisados como descrito no Ensaio 1 acima.

[00293] Resultados Experimentais - sequências de polinucleotídeos da invenção foram ensaiadas para um. número desejado de traços.

[00294] As Tabelas 49-53 descrevem análises da Área das Folhas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 49

[00295] Tabela 49: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar õ controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 50

[00296] Tabela 50:. LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 51

[00297] Tabela 51: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle '(GUI)7 Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°S dos genes clonados (de acordo com. o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 52

[00298] Tabela 52: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0',2. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com a Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 53

[00299] Tabela 53: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI)7. Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de, Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00300] As Tabelas 54-57 descrevem análises da Cobertura de Raízes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 66:69 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando. 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 54

[00301] Tabela 54: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 55

[00302] Tabela 55; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 56

[00303] Tabela 56; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1.Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o 14 de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima, Tabela 57

[00304] Tabela 57; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00305] As Tabelas 58-61 descrevem análises do Comprimento das Raízes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação. do. promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 58

[00306] Tabela 58; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ. ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acim. Tabela 59

[00307] Tabela 59; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela acima. Tabela 60

[00308] Tabela 60; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria, comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 61

[00309] Tabela 61; LSM .-. Média 'menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela acima.

[00310] As Tabelas 62-64 descrevem análises da Área da Folhas RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio.

[00311] Cada Tabela representa um experimento. independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 62

[00312] Tabela 62; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle .(GUI,, Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo Coffi o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.. Tabela 63

[00313] Tabela 63; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria - comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 64

[00314] Tabela 64; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o 1d de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00315] As Tabelas 65-69 descrevem análises da Cobertura das Raízes RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeoS da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não, conectados pela mesma letra domo no controle (A, B, C) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 65

[00316] Tabela 65; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Ia de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 66

[00317] Tabela 66; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 67

[00318] Tabela 67; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 68

[00319] Tabela 68; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença signilicante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo cóm o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 69

[00320] Tabela 69; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com O Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00321] As Tabelas 70-74 descrevem análises do Comprimento das Raízes RGR em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, 8,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 70

[00322] Tabela 70; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI), Uma diferença significante em P < 0,05, A diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 71

[00323] Tabela 71; LSM. Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A.* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 72

[00324] Tabela 72; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Noss dos genes clonados (de acordo com Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na: Tabela 3 acima. Tabela 73

[00325] Tabela 73; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 74

[00326] Tabela 74; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela acima.

[00327] As Tabelas 75-76 descrevem análises do Peso das Plantas Frescas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669 em condições de deficiência de nitrogênio. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 75

[00328] Tabela 75; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id. de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 76

[00329] Tabela 76; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°8 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. EXEMPLO 7 ENSAIO DE AUMENTO DE TEAB EM ESTUFA

[00330] Tolerância ao TEA: A produtividade e a taxa de crescimento da planta sob alta concentração salina em condições de estufa.

[00331] Esse ensaio acompanha o crescimento da área de roseta de plantas crescendo em estufa, bem como a produtividade de sementes sob irrigação com alta salinidade. As sementes foram semeadas em meio de ágar suplementado apenas com um agente de seleção (Camamicina) solução Hoagland em condições de viveiro. As mudas transgênicas T2 são então transplantadas para bandejas de 1.7 cheias com turfa e perlite. As trilhas foram irrigadas com água de torneira (fornecida a partir do fundo dos potes). Metade das plantas foi irrigada com uma solução salina (NaC1 a 40-80 mM e CaC12 a 5 mM) para induzir ao estresse salino (condições de estresse). A outra metade das plantas continuaram a ser irrigadas com água de torneira (condições normais). Todas as plantas cresceram em estufa até que as plantas atingiram o estágio de maturidade, então colhidas (o tecido acima do solo) e pesadas (imediatamente ou após secagem em fornos a 50°C per 24 horas). As condições de alta salinidade são obtidas por irrigação com uma solução contendo NaC1 a 40-80 mM (condição de crescimento em "EAB") e são comparadas às condições regulares de crescimento.

[00332] As plantas foram analisadas pela sua dimensão global, taxa de crescimento, produtividade de semente e peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (IH - produtividade de semente/ matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle que cresceram paralelamente sob as mesmas condições. As plantas transgênicas Mock expressando o gene repórter uidA (GUS Intron - GUI) sob o mesmo promotor foram usadas como controle.

[00333] O experimento é planejado na distribuição de lotes aninhados aleatórios. Condições de alta salinidade contendo NaCl a 40-80 a mM (condições de crescimento de "EAB").

[00334] Imagens digitais - Um sistema de aquisição de imagens de laboratório, que consiste de uma câmera reflex digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de distância focal de 55 mm (Canon, série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de iluminação (4 bulbos de 150 Watts) foi usada para capturar imagens das plântulas.

[00335] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2-3 dias começando no dia 1 depois da semeadura até o dia 10. A mesma câmera anexada com uma lente de 24 mm de distância focal (Canon, série EF), posicionada em uma montagem de ferro feito sob medida, foi usada para capturar imagem de plantas maiores semeadas em banheiras brancas em uma estufa com condição. ambiental controlada (como visto nas Figuras 2a-b). As banheiras tinham forma quadrada incluindo bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as bandejas foram colocadas sob a montagem de ferro,, evitando a luz solar e produção de sombras. Esse processo foi repetido a cada 2-3 dias por até 10 dias.

[00336] Um sistema de análise de imagens foi usado, que consiste de um computador pessoal desktop (Intel P4, com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagens baseado em Java que foi desenvolvido pelos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos, livremente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (ponto) nih, (ponto) gov/) As imagens foram obtidas com resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Join Photographic Experts Group standard) com baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00337] Análise de parâmetros dos vegetais - usando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo a área Média da folha, o diâmetro da roseta e a área da roseta. A Taxa de Crescimento Relativo (TCR) para os parâmetros da roseta foram calculados de acordo com a Fórmula I como descrito no Exemplo. 6. No dia 80 após a semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas para secagem a 30°C em câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram separados, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção do vegetal acima do solo (excluindo raízes) depois de secagem a 30°C em câmara de secagem; Produtividade de semente por planta = peso do total de sementes por planta (g).

[00338] O peso de 1000 sementes foi determinado como segue: sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia foi tirada. Cada amostra foi pesada e então, usando análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado. O peso de 1000 sementes foi calculado segundo a fórmula II: Fórmula II Peso de 1000 sementes número de sementes em uma amostra/ peso da amostra X 1000

[00339] Índice de Colheita - índice de colheita foi calculado usando a fórmula III: Fórmula III: Índice de Colheita - Produtividade média de sementes por planta/Peso seco médio

[00340] Cada construção é validada em suas gerações T2. Plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUI) sob o mesmo promotor foram usadas como controle.

[00341] Análises Estatísticas - Para identificar os genes com tolerância significativamente aumentada ao estresse abiótico ou arquitetura de raízes aumentada, os resultados obtidos das plantas transgênicas são comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar genes e construções com desempenho maior, os resultados de eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Além disso, genes e construções foram, também analisados levando-se em consideração os resultados obtidos de todos os eventos independentes de transformação testados para a construção específica. Para gene versus análise de controle os T-testes de estudante foram aplicados, usando significância de P < 0,05 ou P 0,1. O pacote de software de estatística JMP é usado (Versão 5.2.1), SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Resultados Experimentais

[00342] As sequências de polinucleotídeo é da invenção foram ensaiadas para um número desejado de traços.

[00343] As Tabelas 77-86 descrevem análises da Área de Roseta em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle, Tabela 77

[00344] Tabela 77; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < :0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 78

[00345] Tabela 78; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 79

[00346] Tabela 79; LSM - Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P <0,05 A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 80

[00347] Tabela 80; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°5 dos genes clonados (de acordo com Id. de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 81

[00348] Tabela 78; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 82

[00349] Tabela 82; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ. ID N°5 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 83

[00350] Tabela 83; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A.* diferença significante em. P < 0,1. Os SEQ ID SI'9's dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela acima. Tabela 84

[00351] Tabela 847 LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = Comparar o 'controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P <. 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 85

[00352] Tabela 85; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o Controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima, Tabela 86

[00353] Tabela 86; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são, de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00354] As Tabelas 87-96 descrevem análises do Diâmetro de Rosetas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeo da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 87

[00355] Tabela 87; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 88

[00356] Tabela 88; LSM = Média. menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela .89

[00357] Tabela 89; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 90

[00358] Tabela 90; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em p < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 91

[00359] Tabela 91; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P 0,05, A* diferença significante em os SEQ ID N°s dos genes danados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 92

[00360] Tabela 92; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle ("GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 93

[00361] Tabela 93; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonado (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 94

[00362] Tabela 94; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 95

[00363] Tabela 95; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nas dos genes clonados acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expressos nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 96

[00364] Tabela 96; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1_ Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima

[00365] As Tabelas 97-105 descrevem análises da Área Média das Folhas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A,B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 97

[00366] Tabela 97; LSM: = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em. P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 98

[00367] Tabela 98; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 99

[00368] Tabela 99; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, São fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 100

[00369] Tabela 100; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 101

[00370] Tabela 101; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 102

[00371] Tabela 102; LSM = Média menor de quadrada; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 103

[00372] Tabela 103.; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expressos nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 104

[00373] Tabela 104; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ.ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 105

[00374] Tabela 105; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00375] As Tabelas 106-111 descrevem análises da RGR da Área da Roseta [cm2] em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,)' são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 106

[00376] Tabela 106; ISM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 107

[00377] Tabela 107; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GIM.;. Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela .108

[00378] Tabela 108; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 109

[00379] Tabela 109; LSM = Média menor de quadrado; 96 melhoria, = comparar o controle (GUI); diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 110

[00380] Tabela 110; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógena expressas nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 111

[00381] Tabela 111; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle. (GUT); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1, Os SEQ ID NoS dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são, de forma exógeno expresso nas plantas, são, fornecidos na Tabela 3 acima.

[00382] As Tabelas 112-118 descrevem análise do RGA do Diâmetro da Roseta em plantas sobre expressando os polinucleotídeos da inveção sob a regulação do promotor 6669, Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, E,) S40. significativamente diferentes daqueles do controle, Tabela 112

[00383] Tabela 112; LSM = Média menor de quadrado % melhoria = comparar o controle (GUI); uma diferença significante em P < 0,05%, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas" são, fornecidos na Tabela 3 acima, Tabela 113

[00384] Tabela 1131 LSM = Média menor de quadrado; % melhoria , comparar o controle ( GUI ): Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < O , 1 . Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acorda com o 14 de Gene) que são de; forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 114

[00385] Tabela 114; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria ,= comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id do Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 aci<ma. Tabela 115

[00386] Tabela 115; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o Controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 116

[00387] Tabela 116; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 117

[00388] Tabela 117; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar õ controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1, os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 118

[00389] Tabela 118; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); 'Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00390] As Tabelas 119-121 descrevem análises de. RGR da Área Média da Folha [cmA2] em plantas sobre-expressando 09 polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do Controle 01.0; Tabela 119

[00391] Tabela 119; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 120

[00392] Tabela 120; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos 5 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 121

[00393] Tabela 121; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00394] A Tabela 122 descreve as análises de RGR da Área Média da Folha [cm2] em plantas sobre-expressando os polinUcleotidéos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 122

[00395] Tabela 122; LSM = Média menor de, quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI);, Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00396] A Tabela 123 descreve as análises do Peso Seco de Lote (PS) em plantas sobre expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não: conectados pela mesma letra como no controle (A,B) são significativamente diferente: daqueles do controle. Tabela 123

[00397] Tabela 123; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00398] AO Tabelas 124-126 descrevem, as análises do Peso de 1000 Sementes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 124

[00399] Tabela 124; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 125

[00400] Tabela 125; LSM = Média menor de quadrado; %- melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo, com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 126

[00401] Tabela 126; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00402] As Tabelas 127-129 descrevem as análises da Produtividade de Sementes por Planta em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 127

[00403] Tabela 127; LSM = Média menor: de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 128

[00404] Tabela 128; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1, os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma-exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 129

[00405] Tabela 129; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N's dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00406] A Tabela 130 descreve o índice de Colheita em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 130

[00407] Tabela 130; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene)) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela .3 acima.

[00408] A Tabela 131-140 descreve as análises da Área de Roseta em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669, Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são signifícativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 131

[00409] Tabela 131; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 132

[00410] Tabela 132; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 133

[00411] Tabela 133; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P. < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 134

[00412] Tabela 134; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N05 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 135

[00413] Tabela 135; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle :(GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 136

[00414] Tabela 136; LSM = Média menor de quadrado % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID NOs dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 137

[00415] Tabela 137; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas planas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 138

[00416] Tabela 138; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de mordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 139

[00417] Tabela 139; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 140

[00418] Tabela 140; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00419] As Tabelas 141-148 descrevem as análises do Diâmetro das Rosetas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 141

[00420] Tabela 141; LSM =, Média menor de quadrado; % melhoria = Comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 142

[00421] Tabela 142; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 143

[00422] Tabela 143; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P. < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 144

[00423] Tabela 144; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno. expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 145

[00424] Tabela 145; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 146

[00425] Tabela 146; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 147

[00426] Tabela 147; LSM = Média menor de. quadrado; % melhoria comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordocom o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 148

[00427] Tabela 148; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID NOs dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00428] As Tabelas 149-157 descrevem as análises da Área Média de Folhas em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 149

[00429] Tabela 149; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Uma diferença significante em P < 0,05 A*diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de. Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 150

[00430] Tabela 150; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI), Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são expressos forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 151

[00431] Tabela 151; LSM = Média menor de quadrado; * melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 152

[00432] Tabela 152; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 153

[00433] Tabela 153: LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 154

[00434] Tabela 154; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma eX4igeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 155

[00435] Tabela 155; LSM = Média. Menor de Cladrad0; melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P' < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 156

[00436] Tabela 156; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nós dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 1 acima. Tabela 157

[00437] Tabela 157; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00438] As Tabelas 158-166 descrevem análises de RGR da Área da Roseta [cm2] em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 158

[00439] Tabela 158; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°3 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 159

[00440] Tabela 159; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI:); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°9 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que São de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 160

[00441] Tabela 150; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N's dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 161

[00442] Tabela 161; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar 0: controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 162

[00443] Tabela 162; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle .(GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 163

[00444] Tabela 163; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes acionados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 164

[00445] Tabela 164; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°8 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas; são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 165

[00446] Tabela 165; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°5 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 166

[00447] Tabela 166' LSM = Média menor de. Quadrado; % melhoria = comparar O controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00448] As Tabelas 167-175 descrevem as análises do RGR do Diâmetro da Roseta em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação, do promotor 6669. Cada Tabela representa. um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. OS genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, 13,) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 167

[00449] Tabela 167; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria comparar o controle .(GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P. < 0,1. OS SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 168

[00450] Tabela 168; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria =, comparar o Controle (GUI); Uma, diferença significante em P < 0,,05, A* diferença. significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 169

[00451] Tabela 169; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < O, 05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 170

[00452] Tabela 170; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. 05 SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 171

[00453] Tabela 171; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. 0.s SEQ ID NOS dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 172.

[00454] Tabela 172; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o Controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são: de forma exógeno expresso nas, plantai-, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00455] Tabela 173

[00456] Tabela 173; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID NOs dos genes clonados acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 174

[00457] Tabela 174; LSM = Média, menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença Significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima Tabela 175

[00458] Tabela 175; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00459] As Tabelas 176-178 descrevem as análises de RGR da Área Média da Folha [cm2] em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento; independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 176

[00460] Tabela 176; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 177

[00461] Tabela 177.; LSM - Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 178

[00462] Tabela 178; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI). Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00463] As Tabelas 179-180 descrevem as análises de RGR da Área Média da Folha RGR [cm2] em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação, do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 179

[00464] Tabela 179; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 180

[00465] Tabela 180; LSM Média menor de quadrado; % Melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Ns dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00466] As Tabelas 181-182 descrevem as análises do Peso Seco por Lote (PS) em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por-gene. Os genes não, conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 181

[00467] Tabela 181; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P 0,05, A* diferença significante em P 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com O Id de Gene; que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 182

[00468] Tabela 182; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00469] As Tabelas 183-185 descrevem as análises do Peso de 1000 Sementes em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. OS genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 183

[00470] Tabela 183; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso rias plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 184

[00471] Tabela 184; LSM Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°8 dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene.) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 185

[00472] Tabela 185; LSM = Média Menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI) Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na. Tabela 3 acima.

[00473] As Tabelas 186-187 descrevem as análises da Produtividade de Sementes por Planta em plantas sobre-expressando os polinucieotideos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 186

[00474] Tabela 186; LSM = Média menor de quadrado; % melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05 A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. Tabela 187

[00475] Tabela 187;. LSM = Média menor de quadrado; melhoria = comparar o controle (GUI); Uma diferença significante em P < 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID Nos dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima.

[00476] A Tabela 188 descreve as análises do índice de Colheita em plantas sobre-expressando os polinucleotídeos da invenção sob a regulação do promotor 6669. Cada Tabela representa um experimento independente, usando 4 eventos independentes por. gene. Os genes não conectados pela mesma letra como no controle (A, B) são significativamente diferentes daqueles do controle. Tabela 188

[00477] Tabela 188; LSM = Média menor de quadrado; % melYwria = comparar o controle (GUI) 1 Uma diferença significante em 0,05, A* diferença significante em P < 0,1. Os SEQ ID N°s dos genes clonados (de acordo com o Id de Gene) que são de forma exógeno expresso nas plantas, são fornecidos na Tabela 3 acima. EXEMPLO 8 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE TOMATE M82 COM GENES PUTATIVOS DE TEAB

[00478] Para a transformação do tomate, sementes de tomate M82 foram previamente esterilizadas com hipoclorito de sódio a 3% + 2-3 gotas de Tween 20 (Polisorbato 24). As sementes foram germinadas em meio Nitsch com potência total e germinadas por 8 dias em sala de Crescimento a 25°C no escuro. As plântulas foram então cortadas com 2-4 cm de caule e inseridas em placas de Petri de 10cm que foram preenchidas com 30-40 ml de meio líquido MS. Cotilédones foram cortados e utilizados como explantes e posteriormente transferidos para um meio solidificado por KCMS com acetoseringona a 100 tM em uma placa de Petri de 10 cm. Os explantes foram inoculados com A. tumefasciens e por 30-50 minutos. Os explantes foram co-cultivados por 24 horas e transferidos para um meio de regeneração incluindo Canamicina como meio de seleção. As plântulas resistentes regeneradas foram transferidas para um meio de enraizamento por 10-14 dias até o aparecimento das raízes. EXEMPLO 9 CRESCIMENTO DE PLANTAS DE TOMATE M82 TRANSFORMADAS E CARACTERIZAÇÃO DOS FENÓTIPOS Procedimentos Experimentais

[00479] Produção de plantas transgênicas de tomate. As plantas foram transformadas como descrito nó Exemplo 8, acima. Em seguida à transformação, plantas de tomate M82 T1 foram postas a crescer até a fase de frutos. Sementes T2 entraram nos experimentos para avaliar a resistência ao estresse abiótico. Resultados Experimentais

[00480] Ensaio 1 -Teste de campo do tomate sob regimes regulares e com deficiência de água. O teste de campo do tomate foi planejado como um sistema com urna fonte de irrigação por gotejamento (UFIG) semelhante ao padrão utilizado em campos agrícolas. Uma vez que a deficiência de água é aplicada de uma forma relativamente uniforme, é possível medir os efeitos da seca em populações de plantas de pequeno porte. O método UFIG foi desenvolvido com base no sistema de irrigação por linha de sprinklers (Hanks et al. 1976 Soil Soc Am. J. 40 p. 426-429) com algumas modificações significativas. Em vez de irrigação por sprinklers, foi utilizada a irrigação por gotejamento. Para se criar uma camada uniforme e profunda molhada (pelo menos' 6'0 cm de profundidade), e não a camada em forma de cebola que é tipicamente criada para a irrigação por gotejamento, um sistema de irrigação por gotejamento com compensação de baixa pressão foi utilizado. Esse sistema possibilita suprir pequena quantidades de água em um período de tempo relativamente longo. O estudo de campo para o estresse por seca foi realizado em solo leve, em campo aberto (net house), próximo a Rehovot, Israel. Entre 4 a 5 eventos foram avaliados para cada gene e as populações de segregação nula foram usadas como controle negativo. Durante as três primeiras semanas, todas as plantas cresceram em um viveiro sob condições normais de irrigação. Depois desse período, as plantas foram transplantadas de acordo com o protocolo comercial de crescimento, mantendo uma distância de 30 cm entre as plantas atingindo uma densidade total de 2.600 plantas por 1000 m2 (a densidade recomendada para crescimento comercial). Cada planta foi transplantada próxima a um gotejador de água e ainda sujeita a dois tratamentos diferentes: Ideal (100%): condições ideais de irrigação 100%). A irrigação foi aplicada a cada 2 dias como em um suprimento de água padrão recomendado. O suprimento de água padrão recomendado é a quantidade aplicada por cultivadores comerciais de acorde com protocolos de padronização.

[00481] Estresse Severo (50%) 50% da quantidade ideal de irrigação de água foram aplicados uma vez por dia (no mesmo tempo, em que uma irrigação regular é aplicada.).

[00482] Todos os fertilizantes foram aplicados de acordo com protocolos de padronização locais. Nitrogênio foi igualmente aplicado, como recomendado, em todos os tratamentos através do sistema de irrigação. Cada fileira, com 193 cm de largura, contendo duas linhas de irrigação por gotejamento criando uma cobertura de seis gotejadores por 1 m2. O controle da irrigação foi realizado separadamente para cada tratamento. O experimento foi estruturado em um projeto de quatro blocos aleatórios, oito plantas por lote. Os diferentes regimes de água foram iniciados apenas quatro semanas com três transplantes, quando as plantas iniciaram o estágio de florescimento. A disponibilidade de água no solo foi registrada usando tensiômetros (usados para determinar o potencial métrico de água Wm, -que permite uma avaliação da severidade do estresse).

[00483] Ensaio 2 - Experimento com banho de sal no tomate - As sementes de tomate transgênico São semeadas em bandejas contendo um meio de crescimento denitrificado. As mudas são germinadas sob condições de viveiro. E modelo experimental usado foi o de 3 blocos distribuídos aleatoriamente, onde 10 plantas por eventos foram semeadas em cada bloco. Na fase da primeira folha verdadeira, as bandejas foram transferidas para diferentes "tanques" contendo solução de crescimento de NaC1 a 300 mM. Para o tratamento normal, uma solução completa de Hoagland foi aplicada. Cinco eventos para cada gene foram avaliados enquanto populações de segregação nula foram usadas como controle negativo. O experimento é realizado por um período de 8 semanas, em que parâmetros como o conteúdo de clorofila (medido em unidades SPAD), as biomassas das plantas (FW e DW) foram medidas.

[00484] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção a configurações específicas disso, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações tornam-se visíveis para aqueles com experiência na arte. Portanto, ela é destinada a abarcar todas essas alternativas, modificações e variações que estejam dentro do espírito e do amplo escopo das reivindicações anexadas.

[00485] Todas as publicações, patentes e aplicações de patentes mencionadas nesta especificação estão aqui incorporadas em sua integralidade por referência na especificação, da mesma forma que como se cada publicação individual, patente, ou aplicação de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência nesta aplicação não será entendida corno admissão de que tal referência esteja disponível corno arte anterior à presente invenção. Na medida em que títulos de seção são usados, eles não devem ser entendidos como necessariamente limitadores. REFERÊNCIAS CITADAS

[00486] (Referências adicionais são citadas aqui, mais acima)

[00487] World Wide Web (ponto) fao (ponto) org/ag/agl/agll/spush/degrad (ponto) htm.

[00488] World Wide Web (ponto) fao (ponto) org/ag/agl/aglw/Watermanagement/introduc (ponto) stm.

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[00490] Flowers TJ, Yeo Ar (1995). Breeding for salinity resistance in crop plants where next? Aust J Plant Physiol 22:875-884.

[00491] Nguyen BD, Brar DS, Bui BC, Nguyen TV, Pham LN, Nguyen HT (2003). Identification and mapping of the QTL for aluminum tolerance introgressed from the new source, ORYZA RUFIPOGON into indica vice ( Oryza cativa L„). Theor Appl Genet. 106583-93.

[00492] Sanchez AC, Subudhi PK, Rosenow DT, Nguyen HT (2002). Mapping QTLs associated with drought resistance in sorghum (Sorghum bicolor L. Moench).

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[00497] Rontein D, Basset G, Hanson AD (2002). Metabolic engineering of osmoprotectant accumulation in plante,.. Metab Eng 4:49-56 Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43.

[00498] Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000). Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the. Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol 123:895-904. Conteúdo do OD-Rom

[00499] O seguinte lista o conteúdo de um arquivo do CD-ROM que está aqui apenso e arquivado com a aplicação. Informações do arquivo são fornecidas como: Nome do arquivo/tamanho em byte/data de criação/sistema operacional/formato da máquina.

[00500] CD-ROM 1 (.1 arquivo de LISTAGEM DE SEQUÊNCIA): 1. "43562 Sequence Listing.txt’’ 3,856,000 bytes/ July 24, 2008/ Microsoft Windows XP Professional/ PC. Legenda da Figura Figura 1 A) RB B) NOS pro C) NPT-II D) NOS ter E) Poly-A signal F) H, S, X, B, Sm G) GUS H) Sc I) NOS ter J) R-I K) LB

Claims

1. Método de aumento da biomassa, da taxa de crescimento, produtividade de semente, eficiência do uso de nitrogênio e/ou estresse abiótico de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender superexpressar em uma planta um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos conforme estabelecido pela (i) SEQ ID NO: 1559 ou 81, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 271, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, ou (ii) SEQ ID NO: 447, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 1016, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, em que quando dito estresse abiótico é estresse por salinidade, então a dita tolerância ao dito estresse por salinidade é um aumento na dita produtividade de semente e/ou um aumento na dita taxa de crescimento sob estresse por salinidade quando comparado a uma planta nativa da mesma espécie a qual é cultivada nas mesmas condições de crescimento, assim aumentando a biomassa, taxa de crescimento, produtividade de semente, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta, em que o estresse abiótico é selecionado do grupo que consiste de estresse por salinidade e deficiência de nitrogênio.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda selecionar plantas que superexpressam dito polinucleotídeo para uma biomassa, taxa de crescimento, produtividade de semente, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de nitrogênio aumentados quando comparados com uma planta controle da mesma espécie a qual é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, em que o estresse abiótico é selecionado do grupo que consiste de estresse por salinidade e deficiência de nitrogênio.

3. Método para aumentar o comprimento de raiz, cobertura de raiz, taxa de crescimento da área de roseta, taxa de crescimento do diâmetro da roseta, e/ou produtividade de semente de uma planta quando comparados com o comprimento de raiz, cobertura de raiz, taxa de crescimento da área de roseta, taxa de crescimento do diâmetro da roseta, e/ou produtividade de semente de uma planta controle da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, caracterizado pelo fato de compreender: (a) superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácidos nucleicos estabelecida pelo: (i) SEQ ID NO: 1559 ou 81, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 271, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, ou (ii) SEQ ID NO: 447, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 1016, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo, e (b) selecionar a partir das plantas resultantes da etapa (a) uma planta que exiba comprimento de raiz, cobertura de raiz, taxa de crescimento da área de roseta, taxa de crescimento do diâmetro da roseta, e/ou produtividade de semente aumentados quando comparados com uma planta controle da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, em que quando ditas condições de crescimento compreendem estresse por salinidade, então dita seleção é por uma planta que exiba dita produtividade de semente aumentada e/ou dita taxa de crescimento aumentada comparada com dita planta controle da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, assim aumentando o comprimento de raiz, cobertura de raiz, taxa de crescimento da área de roseta, taxa de crescimento do diâmetro da roseta, e/ou produtividade de semente de uma planta quando comparados com o comprimento de raiz, cobertura de raiz, taxa de crescimento da área de roseta, taxa de crescimento do diâmetro da roseta, e/ou produtividade de semente de uma planta controle da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita seleção na etapa (b) é realizada sob condições normais.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita seleção na etapa (b) é realizada sob um estresse abiótico, em que dito estresse abiótico é selecionado do grupo que consiste de estresse por salinidade e deficiência de nitrogênio.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita seleção de dita planta que exibe dito comprimento de raiz aumentado, dita taxa de crescimento da área da roseta aumentada, dita taxa de crescimento do diâmetro da roseta aumentada e/ou dita produtividade de semente aumentada é realizada sob condições normais.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita seleção de dita planta que exibe dita cobertura de raiz aumentada é realizada sob condições de deficiência de nitrogênio.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita seleção de dita planta que exibe dita taxa de crescimento aumentada da área de roseta, dita taxa de crescimento aumentada do diâmetro da roseta, e/ou dita produtividade de semente aumentada é realizada sob um estresse de salinidade.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que dita sequência de ácido nucleico é apresentada pela SEQ ID NO: 1559 ou 81, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 271, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que dita sequência de ácido nucleico é apresentada pela SEQ ID NO: 1559 ou 81.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 9 e 10, caracterizado pelo fato de compreender ainda crescer a planta que superexpresssa dito polinucleotídeo sob o estresse abiótico.