BR122020018202B1 - Método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta - Google Patents

Abstract

métodos para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio e/ou conteúdo de óleo de uma planta e para gerar uma planta transgênica, construto de ácido nucléico, polipeptídeo isolado, célula vegetal, e, planta transgênica. são providos polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo pelo menos 80% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das seq id nos: 757, 456-756, 758-774, 8385-10836 e 10838-14462; e polinucleotídeo isolado compreendendo sequências de ácidos nucléicos pelo menos 80% idênticas às seq id nos: 377, 1-376, 378-455 e 775-8384. também são providos construtos de ácido nucléico compreendendo os mesmos, polipeptídeos isolados por meio destes codificados, células transgênicas e plantas transgênicas compreendendo os mesmos e métodos para usar os mesmos para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

Description

CAMPO E FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, se refere a polipeptídeos e polinucleotídeos isolados, construtos de ácido nucléico compreendendo os mesmos, células transgênicas compreendendo os mesmos, plantas transgênicas exogenamente expressando os mesmos e mais particularmente, mas não exclusivamente, aos métodos para usar os mesmos para aumentar rendimento (por exemplo, rendimento de semente, rendimento de óleo), biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta.

[002] Um método comum para promover crescimento da planta foi, e continua a ser, o uso de nutrientes naturais assim como sintéticos (fertilizantes). Assim, fertilizantes são o combustível por detrás da “revolução verde”, diretamente responsáveis pelo aumento excepcional nos rendimentos de safra durante os últimos 40 anos e são considerados a despesa geral número um na agricultura. Dos três macronutrientes providos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio é frequentemente o elemento limitante da taxa no crescimento da planta e todas as safras de campo têm uma dependência fundamental no fertilizante nitrogenado inorgânico. O nitrogênio usualmente precisa ser reposto todos os anos, particularmente para cereais, que compreendem mais do que metade das áreas cultivadas no mundo inteiro. Por exemplo, os fertilizantes nitrogenados inorgânicos tais como nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, tipicamente representam 40% dos custos associados com safras tais como milho e trigo.

[003] O nitrogênio é um macronutriente essencial para a planta, responsável pela biossíntese de aminoácidos e ácidos nucléicos, grupos protéticos, hormônios vegetais, defesas químicas da planta, etc. Além disso, o nitrogênio é frequentemente o elemento limitante da taxa no crescimento da planta e todas as safras de campo têm uma dependência fundamental do nitrogênio inorgânico. Assim, o nitrogênio é transportado para a raiz, onde o mesmo é armazenado nas folhas e talo durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta e até o florescimento. No milho por exemplo, as plantas acumulam a maior parte do seu nitrogênio orgânico durante o período de germinação de grão e até o florescimento. Uma vez que a fertilização da planta ocorreu, os grãos começam a se formar e tornam-se o coletor principal de nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser depois redistribuído a partir das folhas e talo que serviram como compartimentos de armazenagem até a formação de grão.

[004] Visto que o fertilizante é rapidamente esgotado a partir da maioria dos tipos de solo, o mesmo deve ser suprido para as safras em crescimento duas ou três vezes durante o período vegetativo. Além disso, a baixa eficiência no uso de nitrogênio (NUE) das safras principais (por exemplo, na faixa de apenas 30 a 70%) afeta negativamente as despesas com insumos para o agricultor, devido ao fertilizante em excesso aplicado. Além disso, o uso excessivo e ineficiente de fertilizantes são os fatores principais responsáveis por problemas ambientais tais como eutrofização de lençóis freáticos, lagos, rios e mares, poluição de nitrato na água potável que pode causar metemoglobinemia, poluição de fosfato, poluição atmosférica e semelhantes. Entretanto, a despeito do impacto negativo dos fertilizantes sobre o ambiente e os limites sobre o uso de fertilizante, que foram regulamentados em diversos países, o uso de fertilizantes é esperado aumentar de modo a sustentar a produção de alimento e fibra para o crescimento populacional rápido sobre recursos de terra limitados.

[005] Por exemplo, foi estimado que em 2050, mais do que 150 milhões de toneladas de fertilizante nitrogenado serão usados anualmente no mundo todo.

[006] A eficiência de uso aumentada de nitrogênio pelas plantas deve permitir que safras sejam cultivadas com insumos fertilizantes mais baixos ou alternativamente sejam cultivadas em solos de qualidade inferior e, portanto, teria impacto econômico significante nos sistemas agrícolas tanto desenvolvidos quanto em desenvolvimento.

[007] O melhoramento genético da eficiência no uso de fertilizante (FUE) nas plantas pode ser gerado por intermédio de reprodução tradicional ou por intermédio de engenharia genética.

[008] Tentativas para gerar plantas com FUE aumentada foram descritas no Pedido de Patente dos EUA No. 20020046419 concedido a Choo et al.; Pedido de Patente dos EUA No. 20050108791 concedido a Edgerton et al.; Pedido de Patente dos EUA No. 20060179511 concedido a Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9: 597-605).

[009] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101: 7833-8) descrevem plantas transgênicas em Dofl que exibem crescimento melhorado sob condições baixas de nitrogênio.

[0010] A Patente dos EUA No. 6.084.153 concedida a Good et al. descreve o uso de um promotor responsivo ao estresse para controlar a expressão da Alanina Aminotransferase (AlaAT) e plantas transgênicas de canola com tolerância melhorada à seca e deficiência de nitrogênio quando comparadas com plantas de controle.

[0011] A população mundial cada vez maior e a disponibilidade cada vez menor em terras aráveis para agricultura afetam o rendimento das plantas e produtos relacionados com planta. A falta global de suprimento de água, desertificação, condições de estresse abiótico (ABS) (por exemplo, salinidade, seca, inundação, temperatura subóptima e poluição química tóxica) e/ou fontes limitadas de nitrogênio e fertilizante causam danos substancial às plantas agrícolas, tais como alterações maiores no metabolismo da planta, morte celular e diminuições no crescimento da planta e produtividade de safra.

[0012] A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente secos que persistem por muito tempo para produzir sérios desequilíbrios hidrológicos tais como danos às safras, falta de suprimento de água e susceptibilidade aumentada para várias doenças.

[0013] A salinidade, altos níveis de sal, afeta um em cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco safras alimentícias principais, isto é, trigo, milho, arroz, batatas e soja, podem tolerar sal excessivo. Efeitos nocivos do sal sobre as plantas resultam tanto do déficit de água, que leva ao estresse osmótico (similar ao estresse pela seca) e o efeito de íons sódio em excesso sobre os processos bioquímicos críticos. Como com congelamento e seca, o alto nível de sal causa déficit de água; e a alta presença de sal dificulta que as raízes da planta extraiam água do seu ambiente. Assim, a salinação de solos que são usados para a produção agrícola é um problema significante e crescente nas regiões que dependem fortemente da agricultura e é agravado pela utilização excessiva, fertilização excessiva e falta d’água, tipicamente causada pela mudança climática e as demandas de crescimento populacional.

[0014] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e desenvolvimento da planta através do ciclo de vida inteiro da planta. Assim, as temperaturas baixas reduzem a taxa de germinação e as temperaturas altas resultam em necrose de folha. Além disso, as plantas maduras que são expostas ao excesso de calor podem experienciar choque térmico, que pode surgir em diversos órgãos, incluindo folhas e particularmente frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse térmico. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo organelas e citoesqueleto e prejudica a função de membrana. O choque térmico pode produzir uma diminuição na síntese global de proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque térmico, por exemplo, chaperonas, que estão envolvidas no redobramento de proteínas desnaturadas pelo calor. O dano pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunção com o estresse pela seca e raramente ocorre sob condições bem irrigadas. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta sob novas formas. Condições de frio excessivo, por exemplo, temperaturas baixas, porém acima do congelamento, afetam as safras de origens tropicais, tais como soja, arroz, milho e algodão. Os danos típicos do frio incluem murchamento, necrose, clorose ou vazamento de íons das membranas celulares. As condições de iluminação excessivas, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de rendimento e qualidade de produto inferior através do amadurecimento atrasado do milho.

[0015] As deficiências de nutriente causam adaptações da arquitetura da raiz, particular e notavelmente por exemplo é a proliferação de raiz dentro das porções ricas em nutriente para aumentar a absorção de nutriente. As deficiências de nutriente causam também a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição tais como pela ativação de mudanças arquiteturais. O engenheiramento da expressão dos genes deflagrados pode fazer com que a planta exiba as mudanças arquiteturais e metabolismo realçado também sob outras condições.

[0016] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas usualmente respondem à deficiência de água pela criação de um sistema radicular mais profundo que permite acesso à umidade localizada em camadas de solo mais profundas. A deflagração deste efeito permitirá que as plantas acessem nutrientes e água localizados em horizontes de solo mais profundos particularmente aqueles prontamente dissolvidos em água como os nitratos.

[0017] O rendimento é afetado pelos diversos fatores, tais como o número e tamanho dos órgãos da planta, arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramos), comprimento de conjunto de grãos, número de grãos cheios, vigor (por exemplo da muda), taxa de crescimento, desenvolvimento de raiz, utilização de água, nutrientes (por exemplo, nitrogênio) e fertilizantes e tolerância ao estresse.

[0018] As safras tais como, milho, arroz, trigo, canola e soja representam mais da metade da ingestão calórica humana total, seja através do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne criados a partir de sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açúcares, proteínas e óleos e metabólitos usados em processos industriais. A capacidade para aumentar o rendimento da planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a composição de celulose ou lignina, aumento da resistência do talo, ampliação do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento na eficiência de fertilização, taxa de acúmulo de matéria seca na semente realçada, modificação do desenvolvimento de semente, enchimento de semente realçada ou aumentando-se o conteúdo de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações em usos agrícolas não agrícolas tais como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.

[0019] Estudos têm mostrado que as adaptações da planta às condições ambientais adversas são traços genéticos complexos com natureza poligênica. Os meios convencionais para melhorias de safra e hortícolas utilizam técnicas de reprodução seletiva para identificar plantas tendo as características desejáveis. Entretanto, a reprodução seletiva é cansativa, consumidora de tempo e tem um resultado imprevisível. Além disso, recursos de germoplasma limitados para a melhora de rendimento e incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies da planta distantemente relacionadas representam problemas significantes encontrados na reprodução convencional. Avanços na engenharia genética têm permitido que a humanidade modifique o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse em plantas. Uma tal tecnologia tem a capacidade para gerar safras ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou hortícolas.

[0020] A publicação WO No. 2009/013750 descreve genes, construtos e métodos de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou rendimento em plantas deste modo geradas.

[0021] A publicação WO No. 2008/122980 descreve genes construtos e métodos para aumentar o conteúdo de óleo, a taxa de crescimento e a biomassa vegetal.

[0022] A publicação WO No. 2008/075364 descreve polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento de fibra vegetal e métodos para usar os mesmos.

[0023] A publicação WO No. 2007/049275 descreve polipeptídeos isolados, polinucleotídeos codificando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para usar os mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizante, tolerância ao estresse abiótico e biomassa vegetal.

[0024] A publicação WO No. 2004/104162 descreve métodos de aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas deste modo geradas.

[0025] A publicação WO No. 2005/121364 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibra vegetal e métodos para usar os mesmos para melhorar a qualidade da fibra, rendimento e/ou biomassa de uma planta produtora de fibra.

[0026] A publicação WO No. 2007/020638 descreve métodos de aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas deste modo geradas.

[0027] A publicação WO No. 2009/083958 descreve métodos de aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizante, tolerância ao estresse biótico/abiótico, rendimento e biomassa na planta e plantas deste modo geradas.

[0028] A publicação WO No. 2010/020941 descreve métodos de aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento e biomassa em plantas e plantas deste modo geradas.

[0029] A publicação WO No. 2009/141824 descreve polinucleotídeos isolados e métodos usando os mesmos para aumentar a utilidade da planta.

[0030] A publicação WO No. 2010/076756 descreve polinucleotídeos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0031] A publicação WO No. 2004/081173 descreve novas sequências reguladoras e construtos derivados da planta e métodos para usar tais sequências para direcionar a expressão de sequências de polinucleotídeo exógenas em plantas.

[0032] A publicação WO No. 2010/049897 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos para usar os mesmos para aumentar o rendimento da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0033] A publicação WO No. 2004/111183 descreve sequências de nucleotídeo para regular a expressão de gene em tricomas e construtos vegetais e métodos utilizando os mesmos.

[0034] A publicação WO No. 2011/080674 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos para usar os mesmos para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo da planta, tolerância ao estresse abiótico e eficiência no uso de nitrogênio das plantas.

[0035] A publicação W02010/100595 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos para usar os mesmos para aumentar o rendimento e/ou características agrícolas da planta.

[0036] A publicação WO2011/015985 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.

[0037] A publicação WO2010/143138 descreve polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos para usar os mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, conteúdo de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0038] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico às SEQ ID NOs: 456774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 1257912583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 1262812637, 12639-12659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 1268312695, 12697-12705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 1272912755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969- 12977, 12979-12984, 12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 1300613010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 1305113054, 13056-13063, 13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 1307913084, 13086-14461 ou 14462, aumentando deste modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[0039] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[0040] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos 80% idêntica às SEQ ID NOs: 1-455, 775-6485, 64876657, 66606664, 6666-6701, 6703-6745, 6748-6818, 6820-6821, 6824-6827, 68296881, 6883, 6885-8383 ou 8384, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[0041] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 7758383 e 8384, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[0042] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio e/ou conteúdo de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico à SEQ ID NO: 10837, aumentando desse modo a eficiência no uso de nitrogênio e/ou conteúdo de óleo da planta.

[0043] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio e/ou conteúdo de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 10837, aumentando desse modo a eficiência no uso de nitrogênio e/ou conteúdo de óleo da planta.

[0044] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 456-774, 8385-8643, 864510650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 12697-12705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 12729-12755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942,12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984,12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063,13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 13079-13084, 13086-14461 ou 14462, em que a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0045] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462.

[0046] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos 80% idêntica às SEQ ID NOs: 1455, 775-6485, 6487-6657, 6660-6664, 6666-6701, 67036745, 6748-6818, 6820-6821, 6824-6827, 6829-6881, 6883, 6885-8383 ou 8384, em que a sequência de ácidos nucléicos é capaz de aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0047] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 775-8383 e 8384.

[0048] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um construto de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas modalidades da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira.

[0049] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga às SEQ ID NOs: 456774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 1257912583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 1262812637, 12639-12659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 1268312695, 12697-12705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 1272912755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887,12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 1293012937, 12940-12942, 12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984, 12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063, 13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 1307913084, 13086-14461 ou 14462, em que a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0050] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836 e 10838-14462.

[0051] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provida uma célula vegetal exogenamente expressando o polinucleotídeo de algumas modalidades da invenção ou o construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção.

[0052] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provida uma célula vegetal exogenamente expressando o polipeptídeo de algumas modalidades da invenção.

[0053] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provida uma planta transgênica compreendendo o construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção.

[0054] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção é provido um método para gerar uma planta transgênica, compreendendo expressar o construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção dentro da planta, gerando deste modo a planta transgênica.

[0055] De acordo com algumas modalidades da invenção, a sequência de ácidos nucléicos codifica uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836 e 10838-14462.

[0056] De acordo com algumas modalidades da invenção, a sequência de ácidos nucléicos é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1455 e 775-8384.

[0057] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455 e 775-8384.

[0058] De acordo com algumas modalidades da invenção, a sequência de ácidos nucléicos codifica a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836 e 10838-14462.

[0059] De acordo com algumas modalidades da invenção, a célula vegetal forma parte de uma planta.

[0060] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob a(s) condição(ões) de estresse abiótico.

[0061] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob a(s) condição(ões) limitante(s) de nitrogênio.

[0062] De acordo com algumas modalidades da invenção, o estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo de salinidade, seca, privação de água, inundação, etiolação, temperatura baixa, temperatura alta, toxidez de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente, excesso de nutriente, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0063] De acordo com algumas modalidades da invenção, o rendimento compreende rendimento de semente ou rendimento de óleo.

[0064] De acordo com algumas modalidades da invenção, o promotor é heterólogo para o polinucleotídeo isolado e/ou para a célula hospedeira.

[0065] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob condições limitantes de nitrogênio.

[0066] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui usados têm os mesmos significados como habitualmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes daqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste de modalidades da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. No caso de conflito, o relatório descritivo de patente, incluindo as definições, controlarão. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são intencionados ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0067] Algumas modalidades da invenção são aqui descritas, apenas por via de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os particulares mostrados são por via de exemplo e para os propósitos de debate ilustrativo das modalidades da invenção. A este respeito, a descrição considerada com os desenhos torna evidente para aqueles versados na técnica como as modalidades da invenção podem ser praticadas.

[0068] Nos desenhos: a Figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467) e o GUSintron (pQYN 6669) usado para expressar as sequências de polinucleotídeos isoladas da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T- DNA borda esquerda; MCS — Sítio de clonagem múltipla; RE — qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron — o gene repórter GUS (sequência codificadora e intron). As sequências de polinucleotídeos isoladas da invenção foram clonadas dentro do vetor ao substituir o gene repórter GUSintron.

[0069] A Figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467) (pQFN ou pQFNc) usado para expressar as sequências de polinucleotídeos isoladas da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB T-DNA borda esquerda; MCS — Sítio de clonagem múltipla; RE — qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal poli-A (sinal de poliadenilação); As sequências de polinucleotídeos isoladas da invenção foram clonadas dentro do MCS do vetor.

[0070] As Figuras 3A-F são imagens representando a visualização do desenvolvimento de raiz de plantas transgênicas exogenamente expressando o polinucleotídeo de algumas modalidades da invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), de estresse osmótico (15% de PEG; Figuras 3C-D) ou limitadas em nitrogênio (Figuras 3E-F). Os transgenes diferentes foram cultivados em placas de ágar transparentes durante 17 dias (7 dias na estufa e 10 dias depois do transplante). As placas foram fotografadas a cada 3 a 4 dias começando no dia 1 depois do transplante. Figura 3A — Uma imagem de uma fotografia das plantas tiradas a seguir de 10 dias depois do transplante nas placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Figura 3B — Uma imagem de análise de raiz das plantas mostradas na Figura 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados pelas setas. Figura 3C — Uma imagem de uma fotografia das plantas tirada a seguir de 10 dias depois do transplante sobre placas de ágar, cultivadas sob altas condições osmóticas (PEG 15%). Figura 3D — Uma imagem da análise de raiz das plantas mostradas na Figura 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados pelas setas. Figura 3E — Uma imagem de uma fotografia das plantas tiradas a seguir de 10 dias depois do transplante sobre placas de ágar, cultivadas sob condições de nitrogênio baixo. Figura 3F — Uma imagem da análise de raiz das plantas mostradas na Figura 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados pelas setas.

[0071] A Figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa RP) usado para expressar as sequências de polinucleotídeos isoladas da invenção. RB - T- DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal poli-A (sinal de poliadenilação); As sequências de polinucleotídeos isoladas de acordo com algumas modalidades da invenção foram clonadas dentro do MCS (Sítio de clonagem múltipla) do vetor.

[0072] A Figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN.

[0073] A Figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.

[0074] A Figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.

[0075] A Figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado (pQXNc) usado para expressar as sequências de polinucleotídeos isoladas de algumas modalidades da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; Sinal poli-A (sinal de poliadenilação); 35S — o promotor 35S (SEQ ID NO: 14463). As sequências de polinucleotídeos isoladas de algumas modalidades da invenção foram clonadas dentro do MCS (Sítio de clonagem múltipla) do vetor.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0076] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, se refere a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, construtos de ácido nucléico codificando os mesmos, células expressando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para usar os mesmos para aumentar rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0077] Antes de explicar pelo menos uma modalidade da invenção em detalhes, deve ser entendido que a invenção não é necessariamente limitada neste documento aos detalhes apresentados na seguinte descrição ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras modalidades ou de ser praticada ou realizada em diversos modos.

[0078] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser usados para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta.

[0079] Assim, como mostrado na seção de Exemplos que segue, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que realçassem o rendimento (por exemplo, rendimento de semente, rendimento de óleo, conteúdo de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta. Genes que afetam os traços de interesse foram identificados [Tabela 53, Exemplo 12, SEQ ID NOs: 1-455 (polinucleotídeos) e SEQ ID NOs: 456-774 (polipeptídeos)] com base na análise de correlação realizada usando ecotipos de Arabidopsis (Exemplos 2 e 3), variedades de tomate (Exemplo 4), ecotipos B. juncea (Exemplos 5 e 6), variedades de Sorgo (Exemplo 7), híbridos de Milho (Exemplo 8), variedades de Soja (Exemplo 9), acessos de Cevada (Exemplo 10) e espécies de Algodão (Exemplos 11) e os perfis de expressão dos genes de acordo com os conjuntos de expressão selecionados (por exemplo, tecidos, estágios desenvolvimentais e condições de estresse) (Tabelas 1-53, Exemplos 1-12). Os polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos tendo a mesma função também foram identificados [Tabela 54, Exemplo 13; SEQ ID NOs: 775-8384 (polinucleotídeos) e SEQ ID NOs: 8385-14462 (polipeptídeos)]. Os polinucleotídeos identificados foram clonados dentro de vetores binários (Exemplo 14) e plantas transgênicas superexpressando os polinucleotídeos e polipeptídeos identificados foram geradas (Exemplo 15) e adicionalmente avaliados quanto ao efeito do gene exógeno sobre o traço de interesse (por exemplo, peso fresco e seco aumentado, área da folha, cobertura e comprimento da raiz, taxa de crescimento relativa (RGR) da área de folha, RGR da cobertura da raiz, RGR do comprimento da raiz, rendimento de semente, rendimento de óleo, matéria seca, índice de colheita, taxa de crescimento, área da roseta, diâmetro da roseta, RGR do número de folha, RGR da cobertura do lote, RGR do diâmetro da roseta, área da lâmina da folha, porcentagem de óleo na semente e peso de 1000 sementes, cobertura do lote, tolerância às condições de estresse abiótico e às condições limitantes de fertilizante; Os exemplos 1618). Todos juntos, estes resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção para aumentar o rendimento (incluindo rendimento de óleo, rendimento de semente e conteúdo de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0080] Assim, de acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, é provido método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-8643, 8645-10650, 10652- 10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 12662-12666,12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 12697-12705, 12707-12709,12711-12717, 12719-12727, 12729-12755, 12757-12811, 12813, 1281512817, 1281912825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 1285512859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902,12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 12945-12954,12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984, 12986-12992,12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019,13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063, 13065-13066,13068-13070, 13073-13076, 13079-13084, 13086-14461 e 14462, aumentando desse modo o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0081] Como aqui usada, a frase “rendimento da planta” se refere à quantidade (por exemplo, como determinada pelo peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por período vegetativo. Consequentemente, o rendimento aumentado afetaria o benefício econômico que se poderia obter da planta em uma certa área de cultivo e/ou tempo de cultivo.

[0082] Deve ser mencionado que um rendimento da planta pode ser afetado por diversos parâmetros incluindo, mas não limitados à biomassa vegetal; vigor da planta; taxa de crescimento; rendimento de semente; quantidade de semente ou grão; qualidade de semente ou grão; rendimento de óleo; conteúdo de óleo, amido e/ou proteína nos órgãos colhidos (por exemplo, sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (flósculos) por panículo (expresso como uma razão de número de sementes cheias em relação ao número de panículos primários); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho de órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área cultivada (densidade); número de órgãos colhidos no campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/localização de carbono dentro da planta); resistência ao sombreamento; número de órgãos colhíveis (por exemplo sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [tal como diâmetro de talo aumentado, espessura ou melhora de propriedades físicas (por exemplo elasticidade)].

[0083] Como aqui usada, a frase “rendimento de semente” se refere ao número ou peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área cultivada ou ao peso de uma única semente ou ao óleo extraído por semente. Consequentemente, o rendimento de semente pode ser afetado pelas dimensões de semente (por exemplo, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), número de sementes (cheias) e taxa de enchimento de semente e pelo conteúdo de óleo da semente. Consequentemente, aumentar o rendimento de semente por planta afetaria o benefício econômico que se pode obter a partir da planta em uma certa área de cultivo e/ou tempo de cultivo; e o aumento do rendimento de semente por área cultivada seria obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas cultivadas na mesma área dada.

[0084] O termo “semente” (também aludido como “grão” ou “caroço”) como aqui usado se refere a uma planta embrionária pequena incluída em uma cobertura chamada de revestimento de semente (usualmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo maduro das plantas gimnospérmicas e angiospérmicas que ocorre depois da fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[0085] A frase “conteúdo de óleo” como aqui usado se refere à quantidade de lipídeos em um dado órgão de planta, nas sementes (conteúdo de óleo da semente) ou na porção vegetativa da planta (conteúdo de óleo vegetativo) e é tipicamente expressa como porcentagem de peso seco (10% de umidade de sementes) ou peso úmido (para a porção vegetativa).

[0086] Deve ser mencionado que o conteúdo de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca de um tecido (por exemplo, semente, porção vegetativa), assim como a massa ou tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de crescimento.

[0087] Em uma modalidade, o aumento no conteúdo de óleo da planta pode ser obtido aumentando-se o tamanho/massa de um tecido(s) da planta que compreenda o óleo por período de crescimento.

[0088] Assim, o conteúdo de óleo aumentado de uma planta pode ser obtido aumentando-se o rendimento, taxa de crescimento, biomassa e vigor da planta.

[0089] Como aqui usada, a frase “biomassa vegetal” se refere à quantidade (por exemplo, medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período vegetativo, que também determinaria ou afetaria o rendimento da planta ou o rendimento por área cultivada. Um aumento na biomassa vegetal pode ser na planta inteira ou em partes da mesma, tais como partes acima do solo (colhíveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[0090] Como aqui usada, a frase “taxa de crescimento” se refere no tamanho do órgão/tecido da planta por tempo (pode ser medido em cm2 por dia).

[0091] Como aqui usada, a frase “vigor da planta” se refere à quantidade (medida em peso) de tecido produzido pela planta em um dado tempo. Consequentemente, o vigor aumentado determinaria ou afetaria o rendimento da planta ou o rendimento por tempo de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor inicial (semente e/ou muda) resulta em posicionamento em campo melhorado.

[0092] Melhorar o vigor inicial é um objetivo importante dos programas modernos de reprodução de arroz tanto nos cultivares de arroz temperados quanto nos tropicais. As raízes longas são importantes para a ancoragem apropriada no solo em arroz semeado na água. Onde o arroz é semeado diretamente em campos inundados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos estão associados com vigor. Onde semeadura em fileira é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para boa emergência de muda. A capacidade para engenheirar vigor inicial nas plantas seria de enorme importância na agricultura. Por exemplo, vigor inicial insuficiente tem sido uma limitação para a introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) à base de germoplasma do Cinturão do Milho no Atlântico Europeu.

[0093] Deve ser mencionado que um rendimento da planta pode ser determinado sob estresse (por exemplo, estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições não estressantes (normais).

[0094] Como aqui usada, a frase “condições não estressantes” se refere às condições de cultivo (por exemplo, água, temperatura, ciclos de luz- escuro, umidade, concentração salina, concentração de fertilizante no solo, suprimento de nutrientes tais como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que significantemente não vai além das condições climáticas e outras abióticas cotidianas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade ótimas de uma planta em qualquer estágio no seu ciclo de vida (por exemplo, em uma planta de safra a partir de semente até uma planta madura e de volta para semente outra vez). As pessoas versadas na técnica estão cientes das condições normais de solo e condições climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser mencionado que embora as condições não estressantes possam incluir algumas variações brandas das condições ótimas (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade para retomar o crescimento.

[0095] A frase “estresse abiótico” como aqui usada se refere a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido pelas condições ambientais subótima de cultivo tal como, por exemplo, salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperaturas baixas ou altas, toxidez de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações de estresse abiótico são debatidas na seção Fundamentos.

[0096] A frase “tolerância ao estresse abiótico” como aqui usada se refere à capacidade de uma planta para suportar um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[0097] As plantas são submetidas a uma faixa de desafios ambientais. Diversos destes, incluindo estresse salino, estresse osmótico geral, estresse pela seca e estresse no congelamento, têm a capacidade para impactar a planta inteira e a disponibilidade de água celular. Não surpreendentemente, depois, as respostas da planta a esta coleção de estresses são relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273 et al. Observe que “a maioria dos estudos sobre a sinalização de estresse aquoso focalizou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e à seca são intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem”. Muitos exemplos de respostas e caminhos similares a este conjunto de estresses foram documentados. Por exemplo, os fatores de transcrição CBF foram mostrados condicionar a resistência ao sal, congelamento e seca (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene rd29B de Arabidopsis é induzido na resposta tanto ao estresse salino quanto ao de desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Na Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma cinase de proteína dependente de cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses tanto de seca quanto sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A cinase induzida por estresse também foi mostrada fosforilar um fator de transcrição, presumivelmente alterando a sua atividade, embora os níveis de transcrito do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse por sal ou pela seca. Similarmente, Saijo et al. demonstraram que uma cinase de proteína dependente de calmodulina induzida por sal/seca do arroz (OsCDPK7) conferiu tolerância aumentada a sal e seca para o arroz quando superexpressa (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 319-327).

[0098] A exposição à desidratação invoca estratégias de sobrevivência similares em plantas tal como o estresse por congelamento (ver, por exemplo, Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e o estresse pela seca induz tolerância ao congelamento (ver, por exemplo, Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatização ao frio, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, por exemplo, área de superfície reduzida ou produção superficial de óleo ou cera. Em um outro exemplo o conteúdo de soluto aumentado da planta impede a evaporação e a perda de água devido ao calor, seca, salinidade, osmótica e semelhantes provendo, portanto, uma melhor tolerância da planta aos estresses acima.

[0099] Será avaliado que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (como descrito acima), também estarão envolvidos na resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos. Naturalmente, os caminhos de resistência globais são relacionados, não idênticos e, portanto, nem todos os genes controlando a resistência para um estresse controlarão a resistência para os outros estresses. Não obstante, se um gene condiciona a resistência para um destes estresses, estaria evidente para uma pessoa versada na técnica testar quanto à resistência a estes estresses relacionados. Métodos de avaliar a resistência a estresse são adicionalmente providos na seção de Exemplos que segue.

[00100] Como aqui usada, a frase “a eficiência no uso de água (WUE)” se refere ao nível de matéria orgânica produzida por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação ao uso de água pela planta, por exemplo, a biomassa produzida por transpiração unitária.

[00101] Como aqui usada, a frase “eficiência no uso de fertilizante” se refere ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento no rendimento, biomassa, vigor e taxa de crescimento da planta por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, espalhamento, absorção, acúmulo, relocação (dentro da planta) e uso de um ou mais dos minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[00102] Como aqui usada, a frase “condições limitantes de fertilizante” se refere às condições de cultivo que incluem um nível (por exemplo, concentração) de um fertilizante aplicado que esteja abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.

[00103] Como aqui usada, a frase “eficiência no uso de nitrogênio (NUE)” se refere ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento no rendimento, biomassa, vigor e taxa de crescimento da planta por unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, espalhamento, absorção, acúmulo, relocação (dentro da planta) e uso de nitrogênio absorvido pela planta.

[00104] Como aqui usada, a frase “condições limitantes de nitrogênio” se refere às condições de cultivo que incluem um nível (por exemplo, concentração) de nitrogênio (por exemplo, amônio ou nitrato) aplicado que esteja abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.

[00105] A NUE e FUE melhoradas da planta são traduzidas no campo em quantidades similares colhidas de rendimento, enquanto implementa menos fertilizantes ou rendimentos aumentados ganhos pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NUE ou FUE melhoradas tem um efeito direto sobre o rendimento da planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas modalidades da invenção positivamente afetam o rendimento da planta, rendimento de semente e biomassa vegetal. Além disso, o benefício da NUE melhorada da planta certamente melhorará a qualidade da safra e constituintes bioquímicos da semente tais como rendimento de proteína e rendimento de óleo.

[00106] Deve ser mencionado que o ABST melhorado conferirá plantas com vigor melhorado também sob condições não estressantes, resultando em safras tendo biomassa e/ou rendimento melhorados por exemplo, fibras alongadas para a indústria do algodão, conteúdo de óleo mais alto.

[00107] O termo “fibra” é usualmente inclusivo de células condutoras de parede fina tais como vasos e traqueídeos e para agregados fibrilares de muitas células fibrosas individuais. Consequentemente, o termo “fibra” se refere a (a) células condutoras e não condutoras de parede fina do xilema; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras de talos, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare usado na fabricação de escovas e vassouras).

[00108] O exemplo de plantas produtoras de fibra, incluem, mas não são limitadas às safras agrícolas tais como algodão, samaúma (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosota, winterfat, balsa, kenaf, roselle, juta, sisal, abacá, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (por exemplo, sisal).

[00109] Como aqui usada, a frase “qualidade da fibra” se refere a pelo menos um parâmetro da fibra que seja agricolamente desejado ou requerido na indústria de fibra (adicionalmente descrito abaixo). Os exemplos de tais parâmetros, incluem, mas não são limitados ao comprimento da fibra, resistência da fibra, bom estado da fibra, peso da fibra por comprimento unitário, razão de maturidade e uniformidade (adicionalmente descrito abaixo).

[00110] A qualidade da fibra de algodão (lint) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e finura da fibra. Consequentemente, a qualidade do lint é considerada superior quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

[00111] Como aqui usada, a frase “rendimento de fibra” se refere ao total ou quantidade de fibras produzidas a partir da planta produtora de fibra.

[00112] Como aqui usado o termo “aumentar” se refere a pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, de aumento no rendimento, rendimento de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta quando comparada com uma planta nativa [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeos ou polipeptídeos) da invenção, por exemplo, uma planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas (por exemplo, idênticas) condições de cultivo].

[00113] A frase “expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno” como aqui usada se refere à suprarregulagem do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta pela introdução do polinucleotídeo exógeno dentro de uma célula vegetal ou planta e expressando pelos meios recombinantes, como adicionalmente aqui descrito abaixo.

[00114] Como aqui usado, “expressar” se refere à expressão ao nível do mRNA e opcionalmente ao do polipeptídeo.

[00115] Como aqui usada, a frase “polinucleotídeo exógeno” se refere a uma sequência heteróloga de ácidos nucléicos que podem não ser naturalmente expressos dentro da planta ou que a superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido dentro da planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucléico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve ser mencionado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácidos nucléicos que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência endógena de ácidos nucléicos da planta.

[00116] O termo “endógeno” como aqui usado se refere a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que esteja presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.

[00117] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção compreende uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 1263912659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 1269712705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 12729-12755,12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 1284712848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977,12979-12984, 12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054,13056-13063, 13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 13079-13084,13086-14461 e 14462.

[00118] A homologia (por exemplo, homologia percentual, identidade + similaridade) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como usando-se parâmetros de default, quando partindo de uma sequência de polipeptídeo; ou o algoritmo tBLASTX (disponível por intermédio da NCBI) tal como usando-se parâmetros de default, que comparam os produtos de tradução conceitual de seis matrizes de uma sequência consulta de nucleotídeo (ambos os filamentos) contra uma base de dados de sequência de proteína.

[00119] De acordo com algumas modalidades da invenção, o termo “homology” ou “homóloga” se refere à identidade de duas ou mais sequências de ácidos nucléicos; ou identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos.

[00120] As sequências homólogas incluem as sequências tanto ortólogas quanto parálogas. O termo “parálogo” se refere às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie levando a genes parálogos. O termo “ortólogo” se refere a genes homólogos em organismos diferentes devido às relações ancestrais.

[00121] Uma opção para identificar ortólogos em espécie de planta monocotiledônea é realizando-se uma pesquisa blast recíproca. Isto pode ser feito por um primeiro blast envolvendo submeter a blast a sequência de interesse contra qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados NCBI publicamente disponível que pode ser encontrada em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov. Se ortólogos no arroz foram procurados, a sequência de interesse seria submetida a blast contra, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA de comprimento completo de Oryza sativa Nipponbare disponíveis na NCBI. Os resultados de blast podem ser filtrados. As sequências de comprimento completo dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são depois novamente submetidas a blast (segundo blast) contra as sequências do organismo a partir do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados do primeiro e segundo blasts são depois comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultante na contagem mais alta (melhor acerto) no primeiro blast identifica no segundo blast a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Usando o mesmo raciocínio um parálogo (homólogo para um gene no mesmo organismo) é achado. No caso de famílias de sequência grandes, o programa ClustalW pode ser usado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/Tools/clustalw2/index (dot) html], seguido por uma árvore de união de vizinhos (Hypertext Transfer Protocol://en (dot) wikipedia (dot) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda a visualiza a clusterização.

[00122] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 12727, 12729-12755, 12683-12695, 12757-12811, 12697-12705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12813, 12815-12817, 12819-12825, 1282712840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 12945-12954, 12956-12962, 12965-12967,12969-12977, 12979-12984, 12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049,13051-13054, 13056-13063, 13065-13066, 13068-13070, 13073-13076,13079-13084, 13086-14461 e 14462.

[00123] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta é efetuado expressando-se dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 456-774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 1266212666, 12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 12697-12705,12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 12729-12755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942,12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984,12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063,13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 13079-13084, 13086-14461 e 14462, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00124] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos apresentada pelas SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 ou 14462.

[00125] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, o método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, é efetuado expressando-se dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00126] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00127] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos apresentada pelas SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 ou 14462.

[00128] De acordo com algumas modalidades da invenção o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucléicos que sejam pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 775-6485, 6487-6657, 6660-6664, 6666-6701, 6703-6745, 67486818, 6820-6821, 6824-6827, 6829-6881, 6883 e 6885-8384.

[00129] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, é provido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 7756485, 6487-6657, 6660-6664, 6666-6701, 6703-6745, 67486818, 6820-6821, 6824-6827, 6829-6881, 6883 e 6885-8384, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00130] De acordo com algumas modalidades da invenção, a homologia é uma homologia global, isto é, uma homologia em relação às sequências inteiras de aminoácidos ou ácidos nucléicos da invenção e não em relação às porções das mesmas.

[00131] De acordo com algumas modalidades da invenção, a identidade é uma identidade global, isto é, uma identidade em relação às sequências inteiras de aminoácido ou de ácidos nucléicos da invenção e não em relação às porções da mesma.

[00132] Identidade (por exemplo, homologia percentual) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como usando-se parâmetros de default.

[00133] De acordo com algumas modalidades da invenção o polinucleotídeo exógeno é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 775-6485, 6487-6657, 6660-6664, 6666-6701, 6703-6745, 6748-6818, 6820-6821, 6824-6827, 6829-6881, 6883 e 6885-8384.

[00134] De acordo com algumas modalidades da invenção o polinucleotídeo exógeno é apresentado pela SEQ ID NO: 1-455, 775-8383 ou 8384.

[00135] Como aqui usado o termo “polinucleotídeo” se refere a uma sequência de ácidos nucléicos de filamento único ou duplo que é isolada e provida na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou uma das sequências de polinucleotídeos compósitas (por exemplo, uma combinação das acima).

[00136] O termo “isolado” se refere a pelo menos parcialmente separado do ambiente natural por exemplo, de uma célula vegetal.

[00137] Como aqui usada, a frase “sequência de polinucleotídeo complementar” se refere a uma sequência, que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro usando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente de RNA. Uma tal sequência pode ser subsequentemente amplificada em vivo ou em vitro usando uma DNA polimerase dependente de DNA.

[00138] Como aqui usada, a frase “sequência de polinucleotídeo genômica” se refere a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossoma e assim a mesma representa uma porção contígua de um cromossoma.

[00139] Como aqui usada, a frase “sequência de polinucleotídeo compósita” se refere a uma sequência, que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência compósita pode incluir algumas sequências exonais requeridas para codificar o polipeptídeo da presente invenção, assim como algumas sequências intrônicas interpostas entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes e tipicamente incluirão sequências de sinal de junção conservada. Tais sequências intrônicas podem incluir ainda elementos reguladoras de expressão de ação cis.

[00140] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, é provido um método para aumentar eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou conteúdo de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10837, aumentando desse modo a eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou conteúdo de óleo da planta.

[00141] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou conteúdo de óleo de uma planta é efetuado expressando-se dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 10837, aumentando desse modo a eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou conteúdo de óleo de uma planta.

[00142] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos apresentada pela SEQ ID NO: 10837.

[00143] As sequências de ácidos nucléicos codificando os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas quanto à expressão. Os exemplos de tais modificações de sequência incluem, mas não são limitadas a um conteúdo de G/C alterado para se aproximar mais intimamente àquele tipicamente encontrado na espécie de planta de interesse e a remoção de códons atipicamente encontrados na espécie de planta habitualmente aludida como otimização de códon.

[00144] A frase “otimização de códon” se refere à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para o uso dentro de um gene estrutural ou fragmento do mesmo que se aproximem do uso de códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácidos nucléicos optimizados se refere a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificado de modo a utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. A sequência de nucleotídeo tipicamente é examinada ao nível de DNA e a região codificadora otimizada para expressão na espécie de planta determinada usando qualquer procedimento adequado, por exemplo como descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15: 677-681). Neste método, o desvio padrão de uso de códon, uma medida de tendência do uso de códon, pode ser calculada achando-se primeiro o desvio proporcional elevado ao quadrado do uso de cada códon do gene nativo em relação àquele dos genes da planta altamente expressos, seguido por um cálculo do desvio médio elevado ao quadrado. A fórmula usada é: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, onde Xn se refere à frequência de uso do códon n em genes de planta altamente expressos, onde Yn para a frequência de uso do códon n no gene de interesse e N se refere ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de uso de códon dos genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é compilada usando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17: 477498).

[00145] Um método de otimizar a sequência de ácidos nucléicos de acordo com o uso de códon preferido para um tipo particular de célula vegetal está fundamentado no uso direto, sem realizar nenhum cálculo estatístico extra, de tabelas de otimização de códon tais como aquelas providas on line na Codon Usage Database através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) ou (dot) jp/codon/). A Base de Dados do Uso de Códon contém tabelas do uso de códon para várias espécies diferentes, com cada tabela de uso de códon tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00146] Usando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural codificando uma proteína de interesse pode ser otimizado no códon para esta espécie particular de planta. Isto é efetuado substituindo-se códons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, com respeito a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos. Entretanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para deletar sítios de restrição existentes, para criar novos nas junções potencialmente úteis (extremidades 5’ e 3’ para adicionar peptídeo de sinal ou cassetes de término, sítios internos que seriam usados para cortar e unir segmentos juntos para produzir uma sequência correta de comprimento completo) ou para eliminar sequências de nucleotídeo que possam negativamente afetar a estabilidade ou expressão do mRNA.

[00147] A sequência de nucleotídeo codificadora de ocorrência natural pode já, antes de qualquer modificação, contém diversos códons que correspondem a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie particular de planta. Portanto, a otimização de códon da sequência de nucleotídeo nativa pode compreender determinar quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativa, não são estatisticamente favorecidos com respeito a uma planta particular e modificar estes códons de acordo com uma tabela de uso de códon da planta particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para uso de códon de planta contanto que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificada seja produzida em um nível mais alto do que a proteína codificada pelo gene de ocorrência natural ou nativo correspondente. A construção de genes sintéticos pela alteração do uso de códon é descrita por exemplo no Pedido de Patente PCT 93/07278.

[00148] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificador.

[00149] Como aqui usada, a frase ‘RNA não codificador” se refere a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Os exemplos de tais moléculas de RNA não codificadora incluem, mas não são limitadas a um RNA de antissentido, um pré-miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).

[00150] Os exemplos não limitantes de polinucleotídeos de RNA não codificador são providos nas SEQ ID Nos: 201, 258, 455, 1269, 1312, 2017, 2174, 2278, 2289, 2564, 2565, 2641, 2642, 2643, 2799, 2827, 2828, 2829,2830, 2835, 2836, 2837, 2852, 2853, 2873, 2877, 3026, 3181, 3250, 3311,3466, 3480, 4017, 4243, 4339, 4346, 4347, 4508, 4509, 4540, 4541, 4546,4547, 4548, 4563, 4564, 4565, 4569, 4570, 4581, 4906, 5530, 5955, 5979,6033 e 6868.

[00151] Assim, a invenção abrange as sequências de ácidos nucléicos descritas acima; fragmentos das mesmas, sequências hibridizáveis com elas, sequências homóloga a elas, sequências codificando polipeptídeos similares com diferentes usos de códon, sequências alteradas distinguidas pelas mutações, tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, de ocorrência natural ou induzidas pelo ser humano, aleatoriamente ou em uma maneira alvejada.

[00152] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 775-6485, 6487-6657, 6660-6664, 66666701, 6703-6745, 6748-6818, 6820-6821, 6824-6827, 6829-6881, 6883 e 6885-8384.

[00153] De acordo com algumas modalidades da invenção a sequência de ácidos nucléicos é capaz de aumentar o rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de água de uma planta.

[00154] De acordo com algumas modalidades da invenção o polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1-455, 775-8383 e 8384.

[00155] De acordo com algumas modalidades da invenção o polinucleotídeo isolado é apresentado pela SEQ ID NO: 1-455, 775-8383 ou 8384.

[00156] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 456-774, 8385-8643,8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585,12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 12662-12666, 12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 12697-12705, 12707-12709, 12711-12717, 12719-12727, 12729-12755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848,12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895,12896, 12898-12902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 12945-12954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984, 12986-12992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 13018-13019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063, 13065-13066, 13068-13070, 13073-13076, 13079-13084, 13086-14461 e 14462.

[00157] De acordo com algumas modalidades da invenção a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar o rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.

[00158] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462.

[00159] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da invenção, é provido um construto de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira.

[00160] A invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais digamos 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-8643, 8645-10650, 10652-10836, 10838-12575, 12577, 12579-12583, 12585, 12586, 12590, 12591, 12593-12615, 12617-12624, 12628-12637, 12639-12659, 1266212666, 12668-12677, 12679-12681, 12683-12695, 12697-12705, 1270712709, 12711-12717, 12719-12727, 12729-12755, 12757-12811, 12813, 12815-12817, 12819-12825, 12827-12840, 12847-12848, 12850, 12853, 12855-12859, 12861-12884, 12886, 12887, 12893, 12895, 12896, 1289812902, 12904-12912, 12916-12926, 12930-12937, 12940-12942, 1294512954, 12956-12962, 12965-12967, 12969-12977, 12979-12984, 1298612992, 12994, 12999-13001, 13003, 13006-13010, 13012-13016, 1301813019, 13021-13029, 13031-13049, 13051-13054, 13056-13063, 1306513066, 13068-13070, 13073-13076, 13079-13084, 13086-14461 e 14462.

[00161] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 10838-14461 e 14462.

[00162] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo é apresentado pelas SEQ ID NOs: 456-774, 8385-10836, 1083814461 ou 14462.

[00163] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e polipeptídeos tendo mutações, tais como deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, de ocorrência natural ou induzida pelo ser humano, aleatoriamente ou em uma maneira alvejada.

[00164] O termo “planta” como aqui usado abrange plantas inteiras, ancestrais e a progênie das plantas e partes da planta, incluindo sementes, brotos, talos, raízes (incluindo tubérculos) e células, tecidos e órgãos de planta. A planta pode estar em qualquer forma incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo um legume forrageiro ou de forragem, planta ornamental, safra alimentícia, árvore ou arbusto selecionados da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotiloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostilis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stilosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophilla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve flor, aipo, couve, linho, repolho crespo, lentilha, semente oleaginosa de colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba açucareira, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, beringela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma safra forrageira. Alternativamente algas e outras não Viridiplantae podem ser usadas para os métodos da presente invenção.

[00165] De acordo com algumas modalidades da invenção, a planta usada pelo método da invenção é uma planta de safra tal como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliva, dendê, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, tremoço, colza, tabaco, choupo e algodão.

[00166] De acordo com algumas modalidades da invenção a planta é uma planta dicotiledônea.

[00167] De acordo com algumas modalidades da invenção a planta é uma planta monocotiledônea.

[00168] De acordo com algumas modalidades da invenção, é provida uma célula vegetal exogenamente expressando o polinucleotídeo de algumas modalidades da invenção, o construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas modalidades da invenção.

[00169] De acordo com algumas modalidades da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é efetuada transformando-se uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguido pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00170] De acordo com algumas modalidades da invenção, a transformação é efetuada introduzindo-se na célula vegetal um construto de ácido nucléico que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas modalidades da invenção e pelo menos um promotor para direcionar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de métodos de transformação adequados são providos abaixo.

[00171] Como mencionado, o construto de ácido nucléico de acordo com algumas modalidades da invenção compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado da invenção.

[00172] De acordo com algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo isolado é operavelmente ligado à sequência promotora.

[00173] Uma sequência codificadora de ácido nucléico é “operavelmente ligada” a uma sequência reguladora (por exemplo, promotora) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00174] Como aqui usado, o termo “promotor” se refere a uma região de DNA que reside a montante do sítio de início transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de RNA. O promotor controla onde (por exemplo, que porção de uma planta) e/ou quando (por exemplo, em qual estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00175] De acordo com algumas modalidades da invenção, o promotor é heterólogo para o polinucleotídeo isolado e/ou para a célula hospedeira.

[00176] Qualquer sequência promotora adequada pode ser usada pelo construto de ácido nucléico da presente invenção. Preferivelmente o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um indutível pelo estresse abiótico.

[00177] De acordo com algumas modalidades da invenção, o promotor é um promotor de planta, que é adequado para a expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula vegetal.

[00178] Os promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [SEQ ID NO: 14463 (pQFNC); SEQ ID NO: 14464 (PH 35S de Brachypodium); SEQ ID NO: 14465 (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985)], promotor At6669 da Arabidopsis (SEQ ID NO: 14466; ver a Publicação PCT No. WO04081173A2 ou o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467); Ubi 1 do milho (poliubiquitina-1 do milho, SEQ ID NO: 14468; Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18: 675-689, 1992; Taylor et al., Plant Cell Rep 12:491-495, 1993); actina 1 do arroz (SEQ ID NO: 14469, McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100: 456-462, 1997); GOS2 (SEQ ID NO: 14470, de Pater et al, Plant J Nov;2(6): 837-44, 1992); promotor Ubi 1 (SEQ ID NO: 14471); promotor RBCS (SEQ ID NO: 14472); ciclofilina do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994); H3 histona do milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1); 107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patente dos EUA Nos. 5.659.026, 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597: 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, e 5.608.142.

[00179] Os promotores específicos de tecido adequados include, mas não limitado aos promotores específicos de flor [por exemplo, AT5G06690 (Tiorredoxina) (alta expressão, SEQ ID NO: 14473), AT5G61520 (AtSTP3) (baixa expressão, SEQ ID NO: 14474) descrito em Buttner et al 2000 Plant, Cell and Environment 23, 175-184 ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12: 255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105: 357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3: 509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, 1993; assim como o promotor STP3 de Arabidopsis (AT5G61520) (Buttner et al., Plant, Cell and Environment 23: 175-184, 2000)], promotores [por exemplo, Napin (originado de Brassica napus que é distinguido por uma atividade promotora específica de semente; Stuitje A. R. et al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; SEQ ID NO: 14475 a partir de genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), PG5a do arroz (US 7.700.835), desenvolvimento precoce de semente de Arabidopsis BAN (SEQ ID NO: 14476, US 2009/0031450 Al), desenvolvimento tardio de semente de Arabidopsis ABI3 (SEQ ID NO: 14477) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), albumina de castanha do Pará (Pearson’ et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zeína (Matzke et al Plant Mol Biol, 143), 323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Plant 199: 515-519, 1996), SPA do Trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997), oleosina do girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [por exemplo, LMW e HMW do trigo, glutenina-1 (Thomas e Flavell, The Plant Cell 2: 1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989; NAR 17: 461-2), gliadinas a, b e g do trigo (EMBO3: 1409-15, 1984), promotor ltrl da cevada, hordeína B1, C, D da cevada (Theor Appl Gen 98: 1253-62, 1999; Plant J 4: 34355, 1993; Mol Gen Genet 250: 750- 60, 1996), DOF da cevada (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), SS2 da cevada (Guerin e Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), Tarp60 do trigo (Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71: 81-98, 2009), hordeína D (D-Hor) e hordeína B (B-Hor) da cevada (Agnelo Furtado, Robert J. Henry e Alessandro Pellegrineschi (2009)], Synthetic Promoter (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina do arroz NRP33, globulina Glb-1 do arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 do arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose PP do arroz (Trans Res 6: 157-68, 1997), família do gene ESR do milho (Plant J 12: 235-46, 1997), gama- Cafirina do sorgo (PMB 32: 1029-35, 1996)], promotores específicos de embrião [por exemplo, OSH1 do arroz (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999), oleosina do arroz (Wu et al, J. Biochem., 123: 386, 1998)] e promotores específicos de flor [por exemplo, AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217: 240-245; 1989), Arabidopsis apetala-3 (Tilly et al., Development. 125: 1647-57, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, AP1) (SEQ ID NO: 14478) (Hempel et al., Development 124: 3845-3853, 1997)] e promotores de raiz [por exemplo, o promotor RAIZP [SEQ ID NO: 14479]; os promotores ExpB5 do arroz e ExpBl da cevada (Won et al. Mol. Cells 30: 369-376, 2010); promotor da monoterpeno sintase de Arabidopsis (AT3G25820) (Chen et al., Plant Phys 135: 1956-66, 2004); promotor Phol de Arabidopsis (SEQ ID NO: 14480, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889902, 2002), que também é levemente induzida pelo estresse Pi].

[00180] Os promotores indutíveis pelo estresse abiótico adequados incluem, mas não limitados aos promotores indutíveis por sal, tais como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236: 331-340, 1993); promotores indutíveis por seca, tais como promotor do gene rabl7 do milho (Pla et al., Plant Mol. Biol. 21: 259-266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et al., Plant J. 11: 1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et al., Plant Mol. Biol. 39: 373-380, 1999); promotores indutíveis por calor, tais como o promotor térmico hsp80 do tomate (Patente dos EUA No. 5.187.267).

[00181] O construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção pode adicionalmente incluir um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas modalidades da invenção, o construto de ácido nucléico utilizado é um vetor transportador, que pode propagar tanto na E. coli (em que o construto compreende um marcador selecionável apropriado e origem de replicação) quanto ser compatível com a propagação nas células. O construto de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossoma artificial.

[00182] O construto de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção pode ser utilizado para transformar estavelmente ou transitoriamente células vegetais. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado dentro do genoma da planta e como tal o mesmo representa um traço estável e hereditário. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado dentro do genoma e como tal o mesmo representa um traço transitório.

[00183] Existem diversos métodos de introduzir genes estranhos dentro das plantas tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42: 205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338: 274-276).

[00184] Os métodos fundamentais de causar integração estável de DNA exógeno dentro do DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467-486; Klee e Rogers em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112; (ii) Captação de DNA Direta: Paszkowski et al., em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a captação direta de DNA dentro de protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. Captação de DNA induzida por breves choques elétricos nas células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA dentro das células ou tecidos vegetais pelo bombardeamento de partícula, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79: 206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75: 30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79: 213-217; transformação de pelos de fibras de vidro ou carbeto de silício de culturas celulares, tecido embrionário ou de calo, Patente dos EUA No. 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen de germinação, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, Londres, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 715-719.

[00185] O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores plasmídicos que contêm segmentos de DNA definidos que integram dentro do DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação de tecido vegetal variam dependendo da espécie de planta e do sistema de liberação de Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento do disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que proveja uma boa fonte para a iniciação de diferenciação de planta inteira. Ver, por exemplo, Horsch et al. em Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar utiliza a combinação do sistema de entrega pela Agrobacterium com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[00186] Existem diversos métodos de transferência de DNA direta dentro da célula vegetal. Na eletroporação, os protoplastos são ligeiramente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente dentro das células usando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartícula, o DNA é adsorvido sobre microprojéteis tais como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados dentro das células ou tecidos vegetais.

[00187] A seguir da transformação estável a propagação da planta é praticada. O método mais comum de propagação de planta é pela semente. A regeneração pela propagação de semente, entretanto, tem a deficiência de que devido à heterozigosidade existe uma falta de uniformidade na safra, visto que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variações genéticas controladas pelas leis Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com os seus próprios traços específicos. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida tal que a planta regenerada tenha os traços e características idênticos da planta transgênica precursora. Portanto, é preferido que a planta transformada seja regenerada pela micropropagação que provê uma reprodução rápida, compatível com as plantas transformadas.

[00188] A micropropagação é um processo de cultivar nova geração de plantas a partir de um único pedaço de tecido que foi excisado a partir de uma planta ou cultivar precursores selecionados. Este processo permite a reprodução em massa das plantas tendo o tecido preferido expressando a proteína de fusion. A nova geração de plantas que é produzida é geneticamente idêntica a e tem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma multiplicação rápida de cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens de clonar plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[00189] A micropropagação é um procedimento de estágio múltiplo que requer alteração de meio de cultura ou condições de cultivo entre estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágio básicos: Estágio um, cultivo do tecido inicial; estágio dois, multiplicação da cultura de tecido; estágio três, diferenciação e formação de planta; e estágio quatro, cultivo e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura de tecido inicial, a cultura de tecido é estabelecida e certificada livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura de tecido inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atingir metas de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas dentro de plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada de modo que a mesma possa ser cultivada no ambiente natural.

[00190] De acordo com algumas modalidades da invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitória de células de folha, células meristemáticas ou da planta inteira.

[00191] A transformação transitória pode ser efetuada por qualquer um dos métodos de transferência de DNA direto descritos acima ou pela infecção viral usando vírus de planta modificados.

[00192] Os vírus que foram mostrados serem úteis para transformação de hospedeiros vegetais incluem CaMV, Vírus Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus mosaico de bromo (BMV) e Vírus Mosaico do Feijão Comum (BV ou BCMV). A transformação das plantas usando vírus de planta está descrita na Patente dos EUA No. 4.855.237 (vírus mosaico do feijão dourado; BGV), EP- A 67.553 (TMV), Pedido Publicado Japonês No. 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications em Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para o uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas são descritas na WO 87/06261.

[00193] De acordo com algumas modalidades da invenção, o vírus usado para transformações transitórias é avirulento e assim é incapaz de causar sintomas severos tais como taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas de anel, enrolamento de folha, amarelamento, listras, formação de varíola, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento de ocorrência natural ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação viral pode ser efetuada usando-se métodos bem conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, aquecimento subletal, tratamento químico ou pelas técnicas de mutagênese dirigidas tais como descritas, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4: 259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00194] As cepas virais adequadas podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis tais como, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) ou pela isolação de plantas infectadas. A isolação de vírus a partir de tecidos vegetais infectados pode ser efetuada pelas técnicas bem conhecidas na técnica tais como descritas, por exemplo por Foster e Taylor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistence (Methods em Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998. Em resumo, tecidos de uma planta infectada acreditada conter uma alta concentração de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flor, são triturados em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser usada em inoculações subsequentes.

[00195] A construção dos vírus de RNA de planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógenas não virais em plantas é demonstrada pelas referências acima assim como em Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172: 285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6: 307-311; French et al. Science (1986) 231: 1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269: 73-76; e Patente dos EUA No. 5.316.931.

[00196] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode primeiro ser clonado dentro de um plasmídeo bacteriano para facilidade de construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode depois ser excisado a partir do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser fixada ao DNA viral, que é depois replicado pelas bactérias. A transcrição e tradução deste DNA produzirá a proteína de revestimento que encapsidará o DNA viral. Se o vírus é um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido dentro de um plasmídeo. O plasmídeo é depois usado para fabricar todas as construções. O vírus de RNA é depois produzido transcrevendo-se a sequência viral do plasmídeo e a tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsidam o RNA viral.

[00197] Em uma modalidade, um polinucleotídeo de vírus de planta é provido em que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa foi deletada a partir de um polinucleotídeo viral, uma sequência codificadora de proteína de revestimento viral de planta não nativo e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da sequência codificadora de proteína de revestimento não nativa, capaz de expressão no hospedeiro vegetal, empacotamento do polinucleotídeo de vírus de planta recombinante e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo de vírus de planta recombinante foi inserido. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídeo não nativa dentro dele, tal que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo de vírus de planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes ou sequências de polinucleotídeos adjacentes no vegetal hospedeiro e incapazes de recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeos não nativos (estranhos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico de vírus de planta nativo ou aos promotores subgenômicos de vírus de planta nativo e um não nativo se mais do que uma sequência de polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeos não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00198] Em uma segunda modalidade, um polinucleotídeo de vírus de planta recombinante é provido como na primeira modalidade exceto que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa é colocada adjacente àquela dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora de proteína de revestimento não nativa.

[00199] Em uma terceira modalidade, um polinucleotídeo de vírus de planta recombinante é provido em que o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos dentro do polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro vegetal e são incapazes de recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeos não nativas podem ser inseridas adjacentes aos promotores de vírus de planta subgenômicos não nativos tal que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto desejado.

[00200] Em uma quarta modalidade, um polinucleotídeo de vírus de planta recombinante é provido como na terceira modalidade exceto que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência codificadora de proteína de revestimento não nativa.

[00201] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo de vírus de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo de vírus de planta recombinante ou vírus de planta recombinante são usados para infectar plantas hospedeiras apropriadas. Os polinucleotídeos de vírus de planta recombinantes são capazes de replicação no hospedeiro, espalhamento sistêmico no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00202] As técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistence (Methods em Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. “Methods em Virology” 7 vols, Academic Press, Nova Iorque 1967-1984; Hill, S. A. “Methods em Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, Nova Iorque, 1985; e Kado e Agrawa, eds. “Principles and Techniques em Plant Virology”, Van Nostrand-Reinhold, Nova Iorque.

[00203] Além do acima, o polinucleotídeo da presente invenção pode também ser introduzido dentro de um genoma de cloroplasto permitindo deste modo a expressão de cloroplasto.

[00204] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógenas ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células vegetais são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para cerca de um. Depois, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por intermédio de bombardeamento de partícula dentro das células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno dentro dos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados tal que sejam integráveis dentro do genoma do cloroplasto por intermédio de recombinação homóloga que é facilmente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para esta finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um trecho de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve pelos procedimentos de seleção sequencial para averiguar que todas ou substancialmente todas das cópias dos genomas de cloroplasto a seguir de tal seleção incluirá o polinucleotídeo exógeno. detalhes adicionais referentes a esta técnica são encontrados nas Pats. U.S. Nos. 4.945.050 e 5.693.507 que são aqui incorporadas por referência. Um polipeptídeo pode assim ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e tornar-se integrado dentro da membrana interna do cloroplasto.

[00205] Visto que os processos que aumentam o rendimento, rendimento de semente, rendimento de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, taxa de crescimento, biomassa, vigor, conteúdo de óleo, eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta pode envolver genes múltiplos atuando aditivamente ou em sinergia (ver, por exemplo, em Quesda et al., Plant Physiol. 130: 951063, 2002), a presente invenção também considera expressar uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira obter deste modo efeito superior sobre o rendimento, rendimento de semente, rendimento de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, taxa de crescimento, biomassa, vigor, conteúdo de óleo, eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00206] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se construtos múltiplos de ácido nucléico, cada um incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, dentro de uma única célula vegetal. A célula transformada pode então ser regenerada em uma planta madura usando os métodos descritos acima.

[00207] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada pela cointrodução dentro de uma única célula da planta de um único construto de ácido nucléico incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes. Um tal construto pode ser planejado com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências de polinucleotídeo exógenas diferentes. Para permitir a cotradução dos polipeptídeos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas por intermédio de uma sequência de sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) que facilita a tradução de sequências de polinucleotídeos posicionadas a jusante da sequência IRES. Neste caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita codificando os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto a partir da extremidade 5’ encapuzada quanto das duas sequências de IRES internas da molécula de RNA policistrônico para deste modo produzir na célula todos os polipeptídeos diferentes. Alternativamente, o construto pode incluir diversas sequências promotoras cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.

[00208] A célula vegetal transformada com o construto incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada dentro de uma planta madura, usando os métodos descritos acima.

[00209] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada pela introdução de construtos de ácido nucléico diferentes, incluindo polinucleotídeos exógenos diferentes, dentro de uma pluralidade das plantas. As plantas transformadas regeneradas podem ser depois cruzadas e a progênie resultante selecionada quanto aos traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor, usando técnicas de reprodução de planta convencionais.

[00210] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.

[00211] Os exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem, salinidade, seca, privação de água, excesso de água (por exemplo, inundação, alagamento), etiolação, temperatura baixa, temperatura alta, toxidez de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente, excesso de nutriente, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00212] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob condições limitantes de fertilizante (por exemplo, condições limitantes de nitrogênio). Os exemplos não limitantes incluem cultivar a planta on solos com baixo conteúdo de nitrogênio (40 a 50% de Nitrogênio do conteúdo presente sob condições normais ou ótimas) ou ainda sob severa deficiência de nitrogênio (010% de Nitrogênio do conteúdo presente sob condições normais ou ótimas).

[00213] Assim, a invenção abrange plantas exogenamente expressando o(s) polinucleotídeo(s), os construtos de ácido nucléico e/ou polipeptídeo(s) da invenção.

[00214] Uma vez expressos dentro da célula vegetal ou da planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado pelos métodos bem conhecidos na técnica tais como, ensaios de atividade, Western blots usando anticorpos capazes de especificamente ligar o polipeptídeo, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), radioimunoensaios (RIA), imuno-histoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e os semelhantes.

[00215] Os métodos de determinar o nível na planta do RNA transcrito a partir do polinucleotídeo exógeno são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a análise de Northern blot, análise da transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) (incluindo a RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização em situ de RNA.

[00216] A informação de sequência e anotações expostas pelas presentes descrições pode ser aproveitada em favor da reprodução clássica. Assim, os dados de subsequência destes polinucleotídeos descritos acima, podem ser usados como marcadores para a seleção assistida por marcador (MAS), na qual um marcador é usado para a seleção indireta de um determinante ou determinantes genéticos de um traço de interesse (por exemplo, biomassa, taxa de crescimento, conteúdo de óleo, rendimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizante). Os dados de ácido nucléico da presente descrição (sequência de DNA ou RNA) pode conter ou estar ligada aos sítios polimórficos ou marcadores genéticos no genoma tais como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), microssatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), impressão digital de DNA (DFP), polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismo de nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.

[00217] Os exemplos de seleções assistidas por marcador incluem, mas não são limitadas à seleção quanto a um traço morfológico (por exemplo, um gene que afete a forma, coloração, esterilidade masculina ou resistência tal como a presença ou ausência de pragana, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma de arroz); seleção quanto a um traço bioquímico (por exemplo, um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de armazenagem); seleção quanto a um traço biológico (por exemplo, raças de patógeno ou biotipos de inseto com base no patógeno hospedeiro ou interação com parasita hospedeiro podem ser usados como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar a sua susceptibilidade aos patógenos ou parasitas).

[00218] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser usados em uma ampla faixa de plantas econômicas, em uma maneira segura e constituição econômica.

[00219] As linhagens de planta exogenamente expressando o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço de planta desejado.

[00220] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado usando métodos conhecidos tais como detalhados abaixo e na seção de Exemplos que segue.

[00221] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, tal como privação de água, temperatura subótima (temperatura baixa, temperatura alta), deficiência de nutriente, excesso de nutriente, um condição de estresse salino, estresse osmótico, toxidez de metal pesado, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00222] Ensaio de tolerância à salinidade — Plantas transgênicas com tolerância às altas concentrações de sal são esperadas exibir melhor germinação, vigor ou crescimento de muda em sal alto. O estresse salino pode ser efetuado em muitos modos tais como, por exemplo, irrigando-se as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando-se as plantas hidroponicamente em uma solução de crescimento hiperosmótica (por exemplo, solução de Hoagland) ou cultivando-se as plantas em um meio de crescimento hiperosmótico [por exemplo, meio de Murashige-Skoog a 50% (meio MS)]. Visto que plantas diferentes variam consideravelmente na sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de crescimento ou meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com aa características específicas do cultivar ou variedade específicos da planta, de modo a inflingir um efeito brando ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para diretrizes como para concentração apropriada ver, Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nova Iorque, 2002 e referências nesta).

[00223] Por exemplo, um teste de tolerância à salinidade pode ser realizado irrigando-se as plantas em estágios desenvolvimentais diferentes com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaCl) aplicados a partir do fundo e a partir do acima para garantir dispersão uniforme do sal. A seguir da exposição à condição de estresse as plantas são frequentemente monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais apareçam nas plantas do tipo selvagem. Assim, a aparência fenotípica externa, o grau de murchamento e sucesso global para atingir a maturidade e rendimento da progênie são comparados entre plantas de controle e transgênicas.

[00224] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não são limitados aos pesos úmido e seco médios, taxa de crescimento, tamanho da folha, cobertura da folha (área de folha global), o peso das sementes produzidas, o tamanho de semente médio e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas não exibindo efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais ou exibindo biomassa mais alta do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00225] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo os ensaios com cloreto de sódio e manitol) são conduzidos para determinar se um fenótipo de estresse osmótico foi específico do cloreto de sódio ou se o mesmo foi um fenótipo relacionado com o estresse osmótico geral. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para os experimentos de germinação com sal e estresse osmótico, o meio é suplementado por exemplo com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaCl ou 100 mM, 200 mM de NaCl, 400 mM de manitol.

[00226] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio Osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes conferindo melhor sobrevivência de planta depois da privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito não iônico sorbitol no meio pode ser realizado. As plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de planta-ágar durante 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 500 mM de sorbitol. O tratamento causa retardo no crescimento, depois tanto as plantas de controle quanto as plantas transgênicas são comparadas, medindose o peso da planta (úmida e seca), rendimento e pelas taxas de crescimento medidas como tempo para florescimento.

[00227] Ao contrário, triagens secas à base de solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. As sementes de plantas Arabidopsis de controle ou outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse pela seca é obtido depois que a irrigação é cessada acompanhada pela colocação dos vasos sobre papel de absorção para realçar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas de controle desenvolvem murchamento severo. As plantas são novamente irrigadas depois de se obter uma fração significante das plantas de controle demonstrando um murchamento severo. As plantas são classificadas comparando-se aos controles para cada um de dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevivência) a seguir da retomada da irrigação.

[00228] Tolerância ao estresse pelo frio - Para analisar o estresse pelo frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C durante 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Mais tarde as plantas são movidas de volta para a estufa. Duas semanas mais tarde os danos do período de congelamento, resultando no retardo de crescimento e outros fenótipos, são comparados tanto entre as plantas de controle quanto transgênicas, medindose o peso da planta (úmida e seca) e comparando-se as taxas de crescimento medidas como tempo para florescimento, tamanho de planta, rendimento e os semelhantes.

[00229] Tolerância ao estresse de calor - A tolerância ao estresse de calor é obtida pela exposição das plantas às temperaturas acima de 34°C durante um certo período. A tolerância de planta é examinada depois de transferir as plantas de volta para 22°C durante a recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas nem aos estresses pelo frio ou calor.

[00230] A eficiência no uso de água — pode ser determinado como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar WUE, o conteúdo de água em relação à folha pode ser medido nas plantas de controle e transgênica. O peso fresco (FW) é imediatamente registrado; depois folhas são embebidas durante 8 horas em água destilada na temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW) é registrado. O peso seco total (DW) é registrado depois da secagem das folhas a 60°C a um peso constante. O conteúdo de água relativo (RWC) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Formula I RWC = [(FW — DW) / (TW — DW)] x 100

[00231] Eficiência no uso de fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, como descrito, por exemplo, Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101: 7833-8). As plantas são analisadas quanto aos seu tamanho, tempo para florescimento, rendimento, conteúdo de proteína de broto e/ou grão global. Os parâmetros checados são o tamanho global da planta madura, o seu peso úmido e seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho de semente médio e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o conteúdo de clorofila das folhas (como situação de nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha é altamente correlacionado), aminoácido e o conteúdo de proteína total das sementes ou outras partes de planta tais como folhas ou brotos, conteúdo de óleo, etc. Similarmente, ao invés de prover nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionando em concentrações crescentes. Mais uma vez, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos como listados acima. Deste modo, a eficiência no uso de nitrogênio (NUE), eficiência no uso de fosfato (PUE) e eficiência no uso de potássio (KUE) são avaliados, checando a capacidade das plantas transgênicas para crescer sob condições restritiva de nutriente.

[00232] Eficiência no uso de nitrogênio — Para analisar se as plantas transgênicas (por exemplo, plantas Arabidopsis) são mais responsivas para nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75 a 3 mM (condições deficientes nitrogênios) ou 6 a 10 mM (concentração de nitrogênio ótima). As plantas são deixadas crescer durante 25 dias adicionais ou até a produção de semente. As plantas são depois analisadas quanto ao seu tamanho global, tempo para florescimento, rendimento, conteúdo de proteína de broto e/ou produção de grão/semente. Os parâmetros checados podem ser o tamanho global da planta, peso úmido e seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio de semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o conteúdo de clorofila de folhas (visto que a situação de nitrogênio da planta e o grau de verdor da folha estão altamente correlacionados), aminoácido e o conteúdo de proteína total das sementes ou outras partes da planta tais como folhas ou brotos e conteúdo de óleo. As plantas transformadas não exibindo efeitos fisiológicos e/ou morfológicos ou exibindo níveis mais altos dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes no uso de nitrogênio.

[00233] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio usando plântulas — O ensaio é feito de acordo com Yanagisawa-S. et al. com modificações menores (“Metabolic engineering with Dofl transciption factor em plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7838). Em resumo, as plantas transgênicas que são cultivadas durante 7 a 10 dias em 0,5 x MS [Murashige- Skoog] suplementado com um agente de seleção são transferidos para duas condições limitantes de nitrogênio: meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) foi 0,75 mM (condições deficientes em nitrogênio) ou 6 a 15 mM (concentração de nitrogênio ótima). As plantas são deixadas crescer durante 30 a 40 dias adicionais e depois fotografadas, individualmente removidas do Ágar (o broto sem as raízes) e imediatamente pesadas (peso fresco) para a análise estatística mais tarde. Os construtos para os quais apenas sementes T1 são disponíveis são semeadas sobre meios seletivos e pelo menos 20 mudas (cada um representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para os meios limitados em nitrogênio. Para os construtos para os quais sementes T2 são disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisados. Usualmente, 20 plantas aleatoriamente selecionado a partir de cada evento são transferidas para os meios limitados em nitrogênio deixadas crescer durante 3 a 4 semanas adicionais e individualmente pesados no final deste período. Plantas transgênicas são comparadas para plantas de controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas simuladas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob os mesmos promotores ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor, mas carecendo de um gene repórter são usadas como controle.

[00234] Determinação de nitrogênio — O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter N orgânico para NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88: 111-113, a redução mediada de Cd- modificada de NO3- para NO2- (Vodovotz 1996 Biotechniques 20: 390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorbância são medidos a 550 nm contra uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98: 168-176.

[00235] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam a porcentagem de sementes de plantas transgênicas que completaria o processo de germinação para a porcentagem de sementes de plantas de controle que são tratados da mesma maneira. As condições normais são consideradas por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação de germinação e vigor de muda é conduzida entre 4 e 14 dias depois do plantio. O meio basal é meio MS a 50% (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).

[00236] A germinação é checada também em condições desfavoráveis tais como frio (incubando em temperaturas mais baixas do que 10°C ao invés de 22°C) ou usando soluções de inibição de semente que contém altas concentrações de um osmólito tal como sorbitol (nas concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaCl).

[00237] O efeito do transgene sobre o vigor, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou conteúdo de óleo da planta pode ser determinado usando métodos conhecidos.

[00238] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimento tais como área de folha, comprimento da fibra, diâmetro da roseta, peso fresco de planta e os semelhantes por tempo.

[00239] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida usando análise de digital de plantas em crescimento. Por exemplo, imagens das plantas em crescimento na estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada pela análise digital. A área de crescimento da roseta é calculada usando a diferença da área da roseta entre dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00240] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo-se a biomassa vegetal produzida, área da roseta, tamanho da folha ou comprimento da raiz por tempo (podem ser medidas em cm2 por dia da área de folha).

[00241] A área de crescimento relativo pode ser calculada usando a Fórmula II. Formula II: Área de taxa de crescimento relativa = Coeficiente de regressão de área ao longo do curso de tempo.

[00242] Assim, a taxa de área de crescimento relativo está em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento do comprimento está em unidades de 1/dia.

[00243] Rendimento de semente - Avaliação do rendimento de semente por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, número) de sementes secas produzida e colhida de 8 a 16 plantas e dividida pelo número de plantas.

[00244] Por exemplo, as sementes totais de 8 a 16 plantas podem ser coletadas, pesadas usando por exemplo, uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O rendimento de semente por área cultivada pode ser calculado da mesma maneira embora levando em conta a área de cultivo dada para uma única planta. O rendimento de semente por área cultivada aumentado seria obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas capazes de cultivar em uma dada área.

[00245] Além disso, o rendimento de semente pode ser determinado por intermédio do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são dispersas sobre uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e depois usando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculada.

[00246] O peso de 1000 sementes pode ser calculado usando a fórmula III: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/ peso da amostra X 1000

[00247] O índice de colheita pode ser calculado usando Fórmula IV Fórmula IV: Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta/ Peso seco médio

[00248] Concentração de proteína de grão - O conteúdo de proteína de grão (g de proteína de grão m-2) é estimado como o produto da massa de grão N (g grão N m-2) multiplicado pelo N/razão de conversão de proteína de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína do grão é estimada como a razão do conteúdo de proteína de grão por massa unitária do grão (g de proteína do grão kg-1 de grão).

[00249] Comprimento da fibra - O comprimento da fibra pode ser medido usando fibrograph. O sistema fibrograph foi usado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio da Metade Superior”. A média da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição de fibra. O fibrograph mede o comprimento em comprimentos intervalos em um dado ponto de porcentagem (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) cottoninc (dot)com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00250] De acordo com algumas modalidades da invenção, o rendimento aumentado do milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumento no número de plantas por área cultivada, aumento no número de espigas por planta, aumento no número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, peso do grão, peso de mil grãos (1000- peso), comprimento/diâmetro da espiga, conteúdo de óleo aumentado por grão e aumento do conteúdo de amido per grão.

[00251] Como mencionado, o aumento de rendimento da planta pode ser determinado pelos diversos parâmetros. Por exemplo, o rendimento aumentado de arroz pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área cultivada, número de panículas por planta, número de espiguetas por panículo, número de flores por panículo, aumento na taxa de enchimento de semente, aumento no peso de mil grãos (1000-peso), aumento no conteúdo de óleo por semente, aumento do conteúdo de amido por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00252] Similarmente, o rendimento aumentado de soja pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área cultivada, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de enchimento de semente, aumento no peso de mil sementes (1000-peso), redução no rompimento de vagem, aumento no conteúdo de óleo por semente, aumento no conteúdo de proteína por semente, entre outras. Um aumento no rendimento também pode resultar na arquitetura modificada ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00253] O rendimento aumentado de canola pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área cultivada, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de enchimento de semente, aumento no peso de mil sementes (1000-peso), redução no rompimento de vagem, aumento do conteúdo de óleo por semente, entre outras. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00254] O rendimento aumentado do algodão pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área cultivada, número de cápsula por planta, número de sementes por cápsula, aumento na taxa de enchimento de semente, aumento no peso de mil sementes (1000-peso), aumento no conteúdo de óleo por semente, melhora no comprimento da fibra, resistência da fibra, entre outras. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00255] Conteúdo de óleo - O conteúdo de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetativa da planta. Em resumo, lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (por exemplo, semente) triturando-se o tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do conteúdo de óleo pode ser realizada usando diversos métodos conhecidos tais como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [ver, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists’ Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (On line)]; a Espectroscopia Próxima ao Infravermelho (NI), que utiliza a absorção de energia próxima ao infravermelho (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito na WO/2001/023884, que é fundamentado na extração do óleo com um solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz dentro da corrente gasosa e partículas de óleo que forma uma luz refletida detectável.

[00256] Assim, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover o rendimento de safras comercialmente desejadas (por exemplo, biomassa de órgão vegetativo tal como madeira de choupo ou órgão reprodutivo tal como número de sementes ou biomassa de semente).

[00257] Qualquer uma das plantas transgênicas descritas acima ou partes das mesmas podem ser processadas para produzir uma preparação de ração, farinha, proteína ou óleo, tal como para animais ruminantes.

[00258] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um conteúdo de óleo aumentado podem ser usadas para produzir óleo vegetal (pela extração do óleo da planta).

[00259] O óleo vegetal (incluindo o óleo de semente e/ou o óleo da porção vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Os produtos exemplares incluem ração animal, matéria prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício combinado, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozer, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria-prima para processo de fermentação. Os produtos exemplares a serem incorporados ao óleo vegetal incluem rações para animais, produtos para alimentação humana tais como salgadinhos extrusados, pães, como um agente aglutinante de alimento, rações de aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentícios, bebidas esportivas, barras de alimento nutricional, suplementos multivitamínicos, bebidas de dieta e alimentos de cereais.

[00260] De acordo com algumas modalidades da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[00261] De acordo com algumas modalidades da invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetativa (óleo da porção vegetativa da planta).

[00262] De acordo com algumas modalidades da invenção, a célula vegetal forma uma parte de uma planta.

[00263] Como aqui usados o termo “cerca de” se refere a ± 10%.

[00264] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significa “incluindo, mas não limitado a”.

[00265] O termo “consistindo de” significa “incluindo e limitado a”.

[00266] O termo “consistindo essencialmente de” significa que a composição, método ou estrutura podem incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicados.

[00267] Como aqui usado, a forma singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[00268] Por todo este documento, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição no formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretado como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser especificamente considerada de forma a incluir todas as subfaixas possíveis descritas, assim como valores numéricos individuais dentro desta faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada ter subfaixas especificamente descritas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., assim como números individuais dentro desta faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto se aplica independente da amplitude da faixa.

[00269] Sempre que uma faixa numérica é aqui indicada, é intencionado incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro da faixa indicada. As frases “variando/varia entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “variando/varia de” um primeiro número indicado “para” um segundo número indicado são aqui usadas intercambiavelmente e são intencionados a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e inteiros entre estes.

[00270] Como aqui usado o termo “método” se refere às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitados àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos técnicos das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00271] É avaliado que certos traços da invenção, que são, para clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, também podem ser providas em combinação em uma única modalidade. Ao contrário, diversos traços da invenção, que são, por brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser providos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos traços descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados traços essenciais destas modalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem estes elementos.

[00272] Várias modalidades e aspectos da presente invenção como delineados acima e como reivindicados na seção reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[00273] Referência é agora feita aos seguintes exemplos, que juntos com as descrições acima ilustram algumas modalidades da invenção em uma maneira não limitante.

[00274] Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols em Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols em Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nova Iorque; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque (1998); metodologias como apresentadas nas Pats. U.S. Nos. 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531, 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cells, J. E., ed. (1994); “Current Protocols em Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), “Selected Methods em Cellular Immunology”, W. H. Freeman e Co., Nova Iorque (1980); os imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura de patente e científica, ver, por exemplo, as Pats. U.S. Nos. 3.791.932, 3.839.153, 3.850.752, 3.850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.879.262, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074, 4.098.876, 4.879.219, 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotídeo Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D. e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D. e Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods em Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todas das quais são incorporadas por referência como se completamente aqui apresentada. Outras referências gerais são providas por todo este documento. Os procedimentos nessas são acreditados ser bem conhecidos na técnica e são providos para a conveniência do leitor. Toda a informação contida nessas é aqui incorporada por referência.

MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA

[00275] Extração de RNA — Tecidos crescendo em várias condições de crescimento (como descritas abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído usando Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) invitrogen (dot) com/content(dot)cfm?pageid=469]. Aproximadamente 30 a 50 mg de tecido foram recolhidos das amostras. Os tecidos pesados foram triturados usando pistilo e almofariz em nitrogênio líquido e recolocados em suspensão em 500 μl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 μl de clorofórmio foram adicionados seguidos pela precipitação usando isopropanol e duas lavagens com 75% de etanol. O RNA foi eluído em 30 μl de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas usando o protocolo de limpeza do mini conjunto RNeasy da Qiagen como pelo protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA USA). Por conveniência, cada tipo de tecido com informação de expressão de microarranjo recebeu uma expressão Set ID.

[00276] Análise de correlação — foi realizada para genes selecionados de acordo com algumas modalidades da invenção, em que os parâmetros distinguidos (parâmetros medidos de acordo com as Ids de correlação) foram usados como “eixo X” para a correlação com o transcriptoma tecidual que foi usado como o “eixo Y”. Para cada gene e parâmetro medido um coeficiente de correlação “R” foi calculado [usando o teste de correlação de Pearson Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html] junto com um valor p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão de gene em um certo tecido e um desempenho fenotípico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5 e 1), existe uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão deste gene) a característica fenotípica (por exemplo, eficiência melhorada no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento e os semelhantes). Uma correlação positiva indica que a expressão do gene em um certo tecido ou estágio desenvolvimental e o vetor de correlação (desempenho fenotípico) são positivamente associados (ambos, a expressão e o desempenho fenotípico aumentam ou diminuem simultaneamente) enquanto uma correlação negativa indica uma associação negativa (enquanto uma está aumentando a outra está diminuindo e vice e versa).

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E PAPEL PREVISTO USANDO FERAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA

[00277] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos que podem aumentar o rendimento da planta, rendimento de semente, rendimento de óleo, conteúdo de óleo, biomassa, taxa de crescimento, rendimento de fibra e/ou qualidade, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio e/ou vigor de uma planta, como segue.

[00278] Os conjuntos de dados de sequência de nucleotídeo aqui usados foram de bases de dados publicamente disponíveis ou de sequências obtidas usando a tecnologia Solexa (por exemplo Cevada e Sorgo). Os dados de sequência de 100 espécies de planta diferentes foram introduzidos dentro de uma única base de dados, compreensiva. Outras informações sobre a expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As bases de dados principais usadas incluem:

Genomas

[00279] Genoma de Arabidopsis [genoma TAIR versão 8 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/)]; Genoma do Arroz [construção 6.0 (Hypertext Transfer Protocol://rice (dot) plantbiology(dot)msu(dot)edu/index. shtml]; Choupo [Populus trichocarpa cessão 1.1 da JGI (cessão de montagem v1.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) genoma (dot) jgi-psf (dot) org/)]; Brachypodium [montagem 4x da JGI, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) brachpodium (dot) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, versão Glyma 1 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Uva [French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization genoma da videira (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) genoscope (dot) cns (dot) fr /)]; Mamona [TIGR/J Craig Venter Institute montagem 4x [(Hypertext Transfer Protocol://msc (dot) jcvi (dot) org/r communis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbi1 [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Genoma parcialmente montado do Milho [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (dot) org/]; As sequências de EST e mRNA expressas foram extraídos das seguintes bases de dados: Sequências de EST e RNA da NCBI (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/dbEST/); RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/RefSeq/); TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/); Bases de dados de proteína e caminho Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/]; AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/biocyc/index (dot) jsp]; ENZYME [Hypertext Transfer Protocol://expasy (dot) org/enzima/]. Os conjuntos de dados de microarranjo foram baixados da: GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).

[00280] Dados de microarranjo patenteados (Ver a WO2008/122980) e Exemplos 2 a 9 abaixo.

Informação de QTL e SNPs

[00281] Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) gramene (dot) org/qtl/].

[00282] Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) panzea (dot) org/index (dot) html].

[00283] Montagem de Base de Dados - foi realizada para construir uma base de dados ampla, rica, confiavelmente anotada e fácil de analisar compreendida de dados de sequências de mRNA genômico, ESTs DNA publicamente disponíveis, de várias safras assim como dados de expressão de gene, anotação de proteína e caminho QTLs e outras informações relevantes.

[00284] A montagem de base de dados é compreendida de uma caixa de ferramentas com ferramentas refino, estruturação, anotação e análise de gene permitindo construir uma base de dados feita de encomenda para cada projeto de verificação de gene. As ferramentas de refino e estruturação de gene permitem detectar confiavelmente variantes de junção e transcritos antissentido, gerando entendimento de diversos resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma “LEADS” de Compugen LTD para analisar genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [ver por exemplo, “Widespread Antisense Transcription”, Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; “Splicing of Alu Sequences”, Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; “Computational analysis of alternative splicing usando EST tissue information”, Xie H et al. Genomics 2002] e foram comprovados ser mais eficientes também na genômica vegetal.

[00285] Clusterização ST e montagem de gene - Para a clusterização e montagem de gene de organismos com dados de sequência de genoma disponíveis (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo) a versão genômica de LEADS (GANG) foi utilizada. Esta ferramenta permite a clusterização mais precisa de ESTs e sequências de mRNA no genoma e prevê a estrutura do gene assim como eventos juncionais alternativos e transcrição antissentido.

[00286] Para os organismos sem nenhum dado de sequência de genoma completo disponível, o software de clusterização “LEADS expresso” foi aplicado. Anotação de gene - os genes e proteínas previstos foram anotados como segue: Pesquisa Blast [Hypertext Transfer Protocol://blast (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] contra todas as sequências de plantas UniProt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/] foi realizada. Os quadros de leitura aberta de cada transcrito putativo foram analisados e a ORF mais longa com número mais alto de homólogos foi selecionado como proteína prevista do transcrito. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/interpro/].

[00287] Blast contra as bases de dados de proteínas AraCyc e ENZYME foi usado para mapear os transcritos previstos para os caminhos AraCyc.

[00288] As proteínas previstas de espécies diferentes foram comparadas usando algoritmo blast [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteína prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.

[00289] Estabelecimento de perfil da expressão de gene – Diversas fontes de dados foram utilizadas para o estabelecimento do perfil de expressão de gene que combinou dados de microarranjo e perfil de expressão digital (ver abaixo). De acordo com o perfil de expressão de gene, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e que são associados com diferentes fenótipos.

[00290] Os conjuntos de dados de microarranjo publicamente disponíveis foram baixados dos websites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados dentro da base de dados. O estabelecimento do perfil de expressão é um dos dados de recurso mais importante para identificar genes importantes para o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[00291] Um resumo do perfil de expressão digital foi compilado para cada cluster de acordo com todas as palavras-chaves incluídas nos registros de sequência compreendendo o cluster. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônica, é uma ferramenta que exibe o perfil de expressão virtual com base nas sequências nas sequências EST formando o cluster de gene. A ferramenta provê o perfil de expressão de um cluster em termos da anatomia da planta (por exemplo, o tecido/órgão nos quais o gene é expresso), estágio desenvolvimental (por exemplo, os estágios desenvolvimentais nos quais um gene pode ser encontrado/expresso) e perfil de tratamento (provê as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso tais como seca, frio, infecção por patógeno, etc). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos clusters diferentes, a expressão digital provê um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um cluster tendo um total de N ESTs para conter X ESTs a partir de uma certa coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, o seguinte é levado em consideração: a) o número de ESTs no cluster, b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas e relacionadas, c) o número global de ESTs disponível representando a espécie. Deste modo clusters com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse indicando uma expressão especializada.

[00292] Recentemente, a exatidão deste sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) em: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. A análise transcriptômica, com base na abundância de EST relativa nos dados foi realizada pelos 454 pirossequenciamento de cDNA representando mRNA da fruta melão. Catorze amostras de cDNA de filamento duplo obtidas a partir de dois genótipos, dois tecidos de fruta (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. O pirossequenciamento de GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas produziram 1.150.657 etiquetas de sequência expressas que montaram em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Cucurbit Genomics [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) icugi (dot) org/] confirmou a exatidão do sequenciamento e montagem. Os padrões de expressão de genes selecionados se ajustaram bem aos seus dados de qRT- PCR.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO DOS PARÂMETROS RENDIMENTO, BIOMASSA E/OU VIGOR RELACIONADOS USANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS DE 44K

[00293] Para produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis thaliana, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 40.000 genes de A. thaliana e transcritos designados com base nos dados da base de Dados TIGR ATH1 v.5 e base de dados de Arabidopsis MPSS (University of Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados com rendimento, componentes de biomassa ou vigor, várias características de planta de 15 ecotipos de Arabidopsis diferentes foram analisadas. Entre eles, nove ecotipos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos Experimentais

[00294] Tecidos de Arabidopsis analisados — Cinco tecidos em estágios desenvolvimental diferentes incluindo raiz, folha, flor na antese, semente em 5 dias depois do florescimento (DAF) e semente em 12 DAF, representando características de planta diferentes, foram amostradas e o RNA foi extraído como descrito acima sob “GENERAL EXPERIMENTAL AND BIOINFORMATICS METHODS”. Para conveniência, cada tipo de tecido para informação de expressão de microarranjo recebeu um Set ID como resumido na Tabela 1 abaixo.Tabela 1Tecidos usados para os conjuntos de expressão do transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 1: São providos os dígitos de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis (1 a 5). DAF = Dias após o florescimento

[00295] Componentes de rendimento e avaliação de parâmetros relacionados com o vigor - Oito dos nove ecotipos de Arabidopsis foram usados em cada um dos 5 blocos repetitivos (denominados A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por canteiro. As plantas foram cultivadas em uma estufa em condições controladas a 22°C e o fertilizante N:P:K (20:20:20; razões em peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado. Durante este tempo dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados através do estágio de muda das plantas cultivadas em uma cultura de tecido em placas de cultura vertical em ágar transparentes. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pelo imageamento digital.

[00296] Imageamento Digital em Cultura de Tecido - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi usado para capturar imagens das plântulas semeadas em placas quadradas em ágar. O sistema de aquisição de imagem consiste de uma câmera digital de reflexo (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (4 bulbos de luz x 150 Watts) e localizado em uma sala escura.

[00297] Imageamento Digital em Estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 7 até dia 30. A mesma câmera acoplada a uma lente de comprimento focal de 24 mm (Canon série EF), colocada em uma montagem de ferro feita de encomenda, foi usada para capturar imagens de plantas maiores semeadas em baldes brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os baldes brancos foram no formato quadrado com medições de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os baldes foram colocados atrás da montagem de ferro, evitando a luz solar direta e a projeção de sombras. Este processo foi repetido a cada 3 a 4 dias durante até 30 dias.

[00298] Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste de um computador pessoal de mesa (processor Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - programa de processamento de imagem com base em Java, ImageJ 1.37, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e está gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenados em um formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00299] Análise de folha - Usando a análise digital os dados de folhas foram calculados, incluindo número de folha, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3 a 4 plantas representativas foram escolhidas a partir de cada canteiro dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os diversos parâmetros (tais como área total de folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00300] Análise de raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias começando no dia 7 na sala de fotografias e o desenvolvimento das raízes foi documentado (ver os exemplos nas Figuras 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula V.Fórmula V: Taxa de crescimento relativa de cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do curso de tempo.

[00301] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com Fórmula VI. A análise foi finalizada com o aparecimento de plantas sobrepostas. Fórmula VI Área relativa da taxa de crescimento vegetativo = Coeficiente de regressão de área vegetativa ao longo do curso de tempo.

[00302] Para comparação entre ecotipos a taxa calculada foi normalizada usando o estágio desenvolvimental de planta como representado pelo número de folhas verdadeiras. Nos casos onde as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo no dia 10 e dia 13), apenas a amostra maior foi escolhida e adicionada à comparação Anova.

[00303] Sementes em análise de siliquas - No dia 70, 15 a 17 siliquas foram coletadas a partir de cada canteiro nos blocos D e E. As siliquas escolhidas foram de cor marrom claro, mas ainda intactas. As siliquas foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro, um retrato digital de alta resolução foi tirada para cada canteiro. Usando as imagens o número de sementes por siliqua foi determinado.

[00304] Peso médio das sementes - No final do experimento todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e um retrato foi tirado. Usando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00305] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletados. As sementes columbianas de 3 canteiros foram misturadas moídas e depois montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat No. 080951 Biolab Ltd.) foram usados como o solvente. A extração foi realizada durante 30 horas em aquecimento médio 50°C. Uma vez que a extração foi finalizada o n-Hexano foi evaporado usando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida a partir do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler’s) 1879, 232, 461) foi usada para criar uma curve de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O conteúdo de óleo de todas as amostras de semente foi determinado usando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra — Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00306] Análise do comprimento da siliqua - No dia 50 da semeadura, 30 siliquas de plantas diferentes em cada canteiro foram amostras no bloco A. As siliquas escolhidas foram amarelo esverdeadas na cor e foram coletadas das partes do fundo de uma haste da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da siliqua.

[00307] Peso seco e rendimento de semente - No dia 80 da semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. Os pesos da biomassa e semente de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) depois da secagem a 30°C em uma câmara de secagem; Rendimento de semente por planta = peso total de semente por planta (g).

[00308] Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado usando a Fórmula VII.Fórmula VII: Rendimento de óleo de semente = Rendimento de semente por planta (g) *% de óleo na semente.

[00309] Índice de colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado usando a Fórmula IV (descrita acima): Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta/ Peso seco médio.

Resultados Experimentais

[00310] Nove ecotipos de Arabidopsis diferentes foram cultivados e distinguidos por 18 parâmetros (chamados de vetores). Tabela 2 Parâmetros correlacionados com Arabidopsis (vetores)

Tabela 2. São providos os parâmetros correlacionados com Arabidopsis (ID de correlação Nos. 118). Abreviações: cm = centímetro(s); g = grama(s); mg = miligrama(s).

[00311] Os valores distinguidos estão resumidos nas Tabelas 3 e 4 abaixo e a análise de correlação é provida na Tabela 5 abaixo. Tabela 3 Parâmetros medidos em ecotipos Arabidopsis

Tabela 3: São providos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos Arabidopsis (linhas 1-5) usando os números ID de correlação descritos na Tabela 2 acima. Tabela 4 Parâmetros medidos em ecotipos Arabidopsis – continuação

6-9) usando os números ID de correlação descritos na Tabela 2 acima. Tabela 5 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais através de acessos de Arabidopsis

Tabela 5. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em tecidos [raízes, sementes, flor e folha; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em diversos componentes de rendimento, biomassa e rendimento direto [Vetor ID de correlação (corr.)] sob condição normal através de acessos de Arabidopsis. P = valor p.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO DE CONDIÇÕES NORMAIS E LIMITANTES DE NITROGÊNIO USANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ARABIDOPSIS DE 44K

[00312] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) Chem (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcritos de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com NUE, componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor várias características de planta de 14 ecotipos de Arabidopsis diferentes foram analisadas. Entre eles, dez ecotipos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos Experimentais

[00313] Dois tecidos das plantas [folhas e hastes] cultivados em dois níveis de fertilização com nitrogênio diferentes (1,5 mM de Nitrogênio ou 6 mM de Nitrogênio) foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima sob “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA”. Por conveniência, cada tipo de tecido da informação de expressão de microarranjo recebeu uma ID do Conjunto como resumido na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 Tecidos usado para conjuntos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 6: São providos os dígitos de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis.

[00314] Avaliação de componentes de rendimento de Arabidopsis e parâmetros relacionados com vigor sob níveis de fertilização com nitrogênio diferentes — 10 acessos de Arabidopsis em 2 canteiros repetitivos cada um contendo 8 plantas por canteiro foram cultivados em estufa. O protocolo de cultivo usado foi como segue: as sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos Eppendorf contendo 0,5 x meio salino basal de Murashige-Skoog e cultivadas a 23°C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro durante 10 dias. Depois, as mudas de tamanho similar foram cuidadosamente transferidas para vasos cheios com uma mistura de perlita e turfa em uma razão 1:1. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram obtidas irrigando-se as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 5 mM de KCl, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos, sob condições normais de irrigação (condições normais de Nitrogênio) foram obtidas aplicando-se uma solução de nitrogênio inorgânico a 6 mM também na forma de KNO3, suplementado com 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos. Para seguir o crescimento da planta, as bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitantes de nitrogênio foram iniciadas e subsequentemente a cada 3 dias durante cerca de 15 dias adicionais. A área vegetal da roseta foi depois determinada a partir dos retratos digitais. O software ImageJ foi usado for quantificar o tamanho da planta a partir dos retratos digitais [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsb (dot) info (dot) nih (dot) gm/AA utilizando roteiros patenteados planejados para analisar o tamanho da área da roseta de plantas individuais como uma função do tempo. O sistema de análise de imagem incluiu um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e gratuitamente disponível na internet [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00315] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 7, aqui abaixo. Tabela 7 Parâmetros correlacionados com Arabidopsis (vetores)

Tabela 7. São providos os parâmetros correlacionados com Arabidopsis (vetores). “N” = Nitrogênio nas concentrações mencionadas; “g” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “t50” = tempo onde 50% das plantas floresceram; “g/ Unidade SPAD” = biomassa de planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida pelos SPAD. “DW” = Peso seco da planta; “FW” = Peso fresco da planta; “Nível N/DW” = nível de Nitrogênio da planta medido em Unidade SPAD por biomassa de planta [g]; “DW/ Nível N” = biomassa de planta por planta [g]/Unidade SPAD; Área da roseta (medida usando análise digital); Cobertura do lote no dia indicado [%](calculado pela divisão da área de planta total com a área de canteiro total); Área da lâmina da folha no dia indicado [cm2] (medida usando análise digital); RGR (taxa de crescimento relativa) da área da roseta no dia indicado [cm2/dia]; t50 de Florescimento [dia] (o dia no qual 50% da planta floresceram); rendimento de semente/ área da roseta no dia 10 [g/cm2] (calculada); rendimento de semente/lâmina de folha [g/cm2] (calculada); rendimento de semente/ Nível N [g/ Unidade SPAD] (calculada).

[00316] Avaliação de NUE, componentes de rendimento e parâmetros relacionados com vigor - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada um contendo 8 plantas por canteiro, em uma estufa com condições de temperatura controlada durante cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com diferentes concentrações de nitrogênio como descrito acima dependendo do tratamento aplicado. Durante este tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foram analisados pelo imageamento digital.

Imageamento digital — Ensaio em estufa

[00317] Um sistema de aquisição de imagem, que consiste de uma câmera digital de reflexo (Canon EOS 400D) acoplada com uma lente de comprimento confocal de 55 mm (Canon série EF-S) colocada em uma montagem de alumínio feita de encomenda, foi usado para capturar imagens das plantas plantadas em recipientes dentro de uma estufa com ambiente controlado. O processo de captura de imagem é repetido a cada 2 a 3 dias começando no dia 9-12 até dia 16-19 (respectivamente) a partir do transplante.

[00318] O sistema de processamento de imagem que foi usado está descrito no Exemplo 2 acima. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem foram salvos em arquivos de texto e analisados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00319] Análise de folha - Usando a análise digital os dados de folhas foram calculados, incluindo número de folha, área da lâmina da folha, cobertura do lote, Diâmetro da roseta e Área da roseta.

[00320] Área da taxa de crescimento relativa: A área da taxa de crescimento relativa da roseta e das folhas foi calculada de acordo com as Fórmulas VIII e IX, respectivamente.Fórmula VIII:

[00321] Taxa de crescimento relativa de área da roseta = Coeficiente de regressão of área da roseta ao longo do curso de tempo.Fórmula IX Taxa de crescimento relativa do número de folhas da planta = Coeficiente de regressão do número de folhas da planta ao longo do curso de tempo.

[00322] Rendimento de semente e Peso de 1000 sementes - No final do experimento todas as sementes de todos os canteiros foram coletadas e pesadas de modo a medir o rendimento de semente por planta em termos de peso total de semente por planta (g). Para o cálculo do peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e um retrato foi tirado. Usando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00323] Peso seco e rendimento de semente - No final do experimento, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) depois de secar a 30°C em uma câmara de secagem.

[00324] Índice de colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado usando a Fórmula IV como descrita acima [Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta/ Peso seco médio].

[00325] T50 dias para o florescimento - Cada uma das repetições foi monitorada quanto à data do florescimento. Dias de florescimento foi calculado a partir da data de semeadura até que 50% dos canteiros florescessem.

[00326] Nível de Nitrogênio da planta - O conteúdo de clorofila das folhas é um bom indicador da situação do nitrogênio na planta visto que o grau de verdura da folha está altamente correlacionado com este parâmetro. O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor SPAD foram feitas sobre a folha jovem completamente desenvolvida. Três medições por folha foram determinadas por canteiro. Com base nesta medição, parâmetros tais como a razão entre rendimento de semente por unidade de nitrogênio [rendimento de semente/Nível N = rendimento de semente por planta [g]/Unidade SPAD], DW da planta por unidade de nitrogênio [DW/ Nível N = biomassa de planta por planta [g]/Unidade SPAD] e nível de nitrogênio por grama de biomassa [Nível N/DW= Unidade SPAD/ biomassa de planta por planta (g)] foram calculados.

[00327] Porcentagem de redução de rendimento de semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio comparada com rendimento de semente produzido nos níveis normais de nitrogênio expressa em porcentagem (%).

Resultados Experimentais

[00328] 10 acessos diferentes de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivados e distinguidos para 37 parâmetros como descritos acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP (Tabela 8 e 9 abaixo). A análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de transcriptomas (Tabela 6) e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 10). Tabela 8 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 8: São providos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos Arabidopsis (linhas 1-5) usando os números ID de correlação descritos na Tabela 7 acima. Tabela 9 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis – continuação

Tabela 9: São providos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsi (linhas 6-10) usando os números ID de correlação descritos na Tabela 7 acima. Tabela 10 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de estresse abiótico através de acessos de Arabidopsis

Tabela 10. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em tecidos [Folhas ou hastes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em diversos componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (corr.)] sob condições de estresse ou condições normais através de acessos de Arabidopsis. P = valor p.

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO USANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO TOMATE DE 44K

[00329] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento entre fenótipos relacionados com NUE e expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo do Tomate, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcritos do Tomate. De modo a definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com NUE, ABST, componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor várias características de planta de 18 variedades diferentes de Tomate foram analisadas. Entre elas, 10 variedades abrangendo a variação observada foram selecionadas para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00330] Correlação de variedades de Tomate através de ecotipos cultivados sob condições de cultivo de baixo Nitrogênio, secas e regulares Procedimentos Experimentais: 10 variedades de Tomate foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por canteiro foram cultivadas em sombra de malha. Em resumo, o protocolo de cultivo foi como segue:

[00331] Condições regulares de cultivo: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4 a 6 Litros/m2 de água por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção de tomate comercial).

[00332] Condições de fertilização com Nitrogênio baixo: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4 a 6 litros/m2 por dia e fertilizados com NPK como recomendado nos protocolos para a produção de tomate comercial) até o estágio de flor. Neste tempo, a fertilização com Nitrogênio foi interrompida.

[00333] Estresse pela seca: A variedade de tomate foi cultivada sob condições normais (4 a 6 Litros/m2 por dia) até o estágio de flor. Neste tempo, a irrigação foi reduzida para 50% comparada com as condições normais. As plantas foram fenotipadas em uma base diária a seguir do descritor padrão de tomate (Tabela 12). A colheita foi conduzida enquanto 50% das frutas estavam vermelhas (maduras). As plantas foram separadas da parte vegetativa e frutas, delas, 2 nós foram analisados quanto aos parâmetros de inflorescência adicionais tais como tamanho, número de flores e peso da inflorescência. O peso fresco de todo o material vegetativo foi medido. As frutas foram separadas por cor (vermelho vs. verde) e de acordo com o tamanho da fruta (pequena, média e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute). Os parâmetros de dados coletados estão resumidos nas Tabelas 13-15, aqui abaixo.

[00334] Tecidos de Tomate Analisados — Dois tecidos em estágios desenvolvimentais diferentes [flor e folha], representando características de planta diferentes, foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID do Conjunto como resumido na Tabela 11 abaixo. Tabela 11 Conjuntos de expressão de transcriptoma de tomate

[00335] A Tabela 12 provê os parâmetros correlacionados com o tomate (Vetores). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 13-15 abaixo. A análise de correlação subsequente foi conduzida. Os resultados foram integrados com a base de dados (Tabela 16). Tabela 12 Parâmetros correlacionados com tomate (vetores)

Tabela 12. São providos os parâmetros correlacionados com tomate. “g” = gramas; “FW” = peso fresco; “NUE” = eficiência no uso de nitrogênio; “RWC” = conteúdo relativo de água; “NUpE” = eficiência na absorção de nitrogênio; “SPAD” = níveis de clorofila; “HI” = índice de colheita (peso vegetativo dividido pelo rendimento); “SLA” = área específica de folha (área de folha dividida pelo peso seco da folha), Tratamento entre parênteses.

[00336] Peso da Fruta (gramas) - No final do experimento [quando 50% das frutas foram maduros (vermelhos)] todas as frutas dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. As frutas totais foram contadas e pesadas. O peso médio das frutas foi calculado dividindo-se o peso de fruta total pelo número de frutas.

[00337] Peso vegetativo da planta (gramas) - No final do experiment [quando 50% das frutas foram maduros (vermelhos)] todas as plantas dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso fresco foi medido (gramas).

[00338] Peso da Inflorescência (gramas) - No final do experiment [quando 50% das frutas foram maduros (vermelhos)] duas inflorescências dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. O peso da inflorescência (g) e o número de flores por inflorescência foram contados.

[00339] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada no tempo de florescimento. As leituras do medidor SPAD foram feitas sobre folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram determinadas por canteiro.

[00340] A eficiência no uso de água (WUE) - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o conteúdo de água relativo da folha foi medido nas plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW) foi imediatamente registrado; depois as folhas foram embebidas durante 8 horas em água destilada na temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW) foi registrado. O peso total seco (DW) foi registrado depois de secar 10 das folhas a 60°C até um peso constante. O conteúdo de água relativo (RWC) foi calculado de acordo com a seguinte Fórmula I [(FW - DW/TW - DW) x 100] como descrito acima. As plantas que mantiveram alto conteúdo de água relativo (RWC) comparado com as linhagens de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas exibindo conteúdo de água relativo reduzido Resultados Experimentais Tabela 13 Parâmetros medidos nos acessos de Tomate (linhas 1-6)

Tabela 13. São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima na Tabela 12) medidos em acessos de tomate (Número de linha) sob todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 14 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linhas 7-12)

Tabela 14. São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima na Tabela 2) medidos em acessos de Tomate (Número de linha) sob todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 15 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linhas 13-18)

Tabela 15: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima na Tabela 12) medido em acessos de Tomate (Número de linha) sob todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento. Tabela 16 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais e de estresse através de ecotipos de tomate

Tabela 16. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em diversos tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (ID do Vetor de Correlação (Corr.))] sob condições normais através de ecotipos de tomate. P = valor p.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE B. JUNCEA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO USANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE B. JUNCEA DE 60K

[00341] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de B. juncea, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcritos de B. juncea. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, várias características de planta de 11 variedades de B. juncea diferentes foram analisadas e usadas para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de NA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson.

[00342] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com características fenotípicas através do ecotipo

Procedimentos Experimentais

[00343] 11 variedades de B. juncea foram cultivadas em três canteiros repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de cultivo foi como segue: Sementes de B. juncea foram semeadas no solo e cultivadas sob condição normal até a colheita. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, as 11 variedades de B. juncea diferentes foram analisados e usados para a análise de expressão de gene. Tabela 17 Tecidos usados para conjuntos de expressão de transcriptoma de B. juncea

[00344] Extração de RNA — Todas as 11 variedades de B. juncea selecionadas foram amostradas para cada tratamento. Os tecidos vegetais [Folha, Vagem, Meristema Lateral e Flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima.

[00345] Os parâmetros de dados coletados foram como segue: Peso fresco (canteiro-colheita) [g/plantaJ — peso fresco total por canteiro no tempo da colheita normalizado para o número de plantas por canteiro.

[00346] Peso de Semente [miligramas /planta] — as sementes totais de cada canteiro foram extraídas, pesadas e normalizadas quanto aos números de plantas em cada canteiro.

[00347] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado: Peso de Semente / peso fresco

[00348] Dias até o pendoamento / florescimento — número de dias até 50% do pendoamento / florescimento para cada canteiro.

[00349] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada no tempo de florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas sobre folha jovem completamente desenvolvida. Três medições por folha foram determinadas para cada canteiro.

[00350] Ramo principal - comprimento médio do nó — comprimento total / número total de nós no ramo principal.

[00351] Ramo lateral - comprimento médio do nó— comprimento total / número total de nós no ramo lateral.

[00352] Ramo principal - 20o comprimento — o comprimento da vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo principal.

[00353] Ramo lateral - 20o comprimento — o comprimento da vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo lateral.

[00354] Ramo principal - 20o No. de semente — número de sementes na vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo principal.

[00355] Ramo lateral - 20o número de semente - número de sementes na vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo lateral.

[00356] Número de ramos laterais — número total de ramos laterais, média de três plantas por canteiro.

[00357] Altura do ramo principal [cm] — comprimento total do ramo principal.

[00358] Posição min do ramo lateral — nó mais baixo no ramo principal que desenvolveu ramo lateral.

[00359] Posição máx do ramo lateral [#nó do ramo principal] — nó mais alto no ramo principal que desenvolveu ramo lateral.

[00360] Número máx de nós no ramo lateral — o número mais alto de nó que um ramo lateral teve por planta.

[00361] Comprimento máx do ramo lateral [cm] — o comprimento máx do ramo lateral por planta.

[00362] Diâmetro máx do ramo lateral [mm] — o diâmetro de base mais alto que um ramo lateral teve por planta.

[00363] Conteúdo de óleo - A análise indireta do conteúdo de óleo foi realizada usando a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists’ Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (On line)];

[00364] Peso fresco (planta única) (g/planta) — peso fresco médio de três plantas por canteiro determinadas no meio da estação.

[00365] Diâmetro da base do ramo principal [mm] — o diâmetro da base do ramo principal, média de três plantas por canteiro.

[00366] 1000 Sementes [g] — peso de 1000 sementes por canteiro.

Resultados Experimentais

[00367] Onze variedades de B. juncea diferentes (isto é, Linhas 1-11) foram cultivadas e distinguidas para a 23 parâmetros como especificados na Tabela 18, abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 1920 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 21). Os resultados foram depois integrados à base de dados. Tabela 18 Parâmetros medidos em acessos de B. juncea

Tabela 18. São providos os parâmetros correlacionados de B. juncea. “g” = gramas; mm = milímetros; “cm” = centímetros; “mg” = miligramas; “SPAD” = níveis de clorofila; Tabela 19 Parâmetros medidos nos acessos de B. juncea (linhas 1-6)

Tabela 19: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima) medidos em acessos de B. juncea (número de linhas) sob condições normais. Tabela 20 Parâmetros medidos nos acessos de B. juncea (linhas 7-11)

Tabela 20: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima) medidos nos acessos de B. juncea (número de linhas) sob condições normais. Tabela 21 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais através de acessos de B. juncea

Tabela 21. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em tecidos [Folhas, meristema, flor e vagens; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em diversos componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [ID de vetor de correlação (corr.)] sob condições normais através de acessos de B. juncea. P = valor p.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE B. JUNCEA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO DE JUNCEA CULTIVADA SOB VÁRIAS DENSIDADES POPULACIONAIS USANDO 60K MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE B. JUNCEA

[00368] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de B. juncea, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcritos de B. juncea. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, várias características de planta de duas variedades de B. juncea diferentes cultivadas sob sete densidades populacionais diferentes foram analisadas e usadas para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foram analisados usando teste de correlação de Pearson.

[00369] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com características fenotípicas através de sete densidades populacionais para dois ecotipos

Procedimentos Experimentais

[00370] Duas variedades de B. juncea foram cultivadas em um campo sob sete densidades populacionais (10, 60, 120, 160, 200, 250 e 300 plantas por m2) em dois canteiros repetitivos. Em resumo, o protocolo de cultivo foi como segue: sementes de B. juncea foram semeadas em solo e cultivadas sob condição normal até a colheita. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, as duas variedades de B. juncea diferentes cultivadas sob várias densidades populacionais foram analisadas e usadas para a análise de expressão de gene. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foram analisados usando o teste de correlação de Pearson para cada ecotipo independentemente. Tabela 22 Tecidos usados para conjuntos de expressão de transcriptoma de B. juncea

Tabela 22: São providos os dígitos de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de B. juncea.

[00371] Extração de RNA — as duas variedades de B. juncea cultivadas sob sete densidades populacionais foram amostradas para cada tratamento. Tecidos vegetais [Flor e Meristema Lateral] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão em microarranjo recebeu um ID do Conjunto.

[00372] Os parâmetros de dados coletados foram como segue: Peso fresco (colhido no canteiro) [g/plantaJ — peso total fresco por canteiro no tempo da colheita normalizado para o número de plantas por canteiro.

[00373] Peso de semente [g/plantaJ — as sementes totais de cada canteiro foram extraídas, pesadas e normalizadas para o número de planta em cada canteiro.

[00374] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado: peso de semente / peso fresco

[00375] Dias até pendoamento / florescimento — número de dias até 50% de pendoamento / florescimento para cada canteiro.

[00376] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada no tempo de florescimento. As leituras do medidor SPAD foram feitas sobre folha jovem completamente desenvolvida. Três medições por folha foram determinadas para cada canteiro.

[00377] Ramo principal - comprimento médio do nó — comprimento total / número total de nós no ramo principal.

[00378] Ramo lateral - comprimento médio do nó— comprimento total / número total de nós no ramo lateral.

[00379] Ramo principal - 20o comprimento — o comprimento da vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo principal.

[00380] Ramo lateral - 20o comprimento — o comprimento da vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo lateral.

[00381] Ramo principal - 20o No. de semente — número de sementes na vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo principal.

[00382] Ramo lateral - 20o número de semente - número de sementes na vagem no 20o nó a partir do ápice do ramo lateral.

[00383] Número de ramos laterais — número total de ramos laterais, média de três plantas por canteiro.

[00384] Altura do ramo principal [cm] — comprimento total do ramo principal.

[00385] Posição min do ramo lateral — nó mais baixo no ramo principal que desenvolveu ramo lateral.

[00386] Posição máx do ramo lateral [#nó do ramo principal] — nó mais alto no ramo principal que desenvolveu ramo lateral.

[00387] Número máx de nós no ramo lateral — o número mais alto de nó que um ramo lateral teve por planta.

[00388] Comprimento máx do ramo lateral [cm] — o comprimento mais alto do ramo lateral por planta.

[00389] Diâmetro máx do ramo lateral [mm] — o diâmetro de base mais alto que um ramo lateral teve por planta.

[00390] Conteúdo de óleo - Análise Indireta do conteúdo de óleo foi realizada usando a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists’ Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (On line)];

[00391] Peso fresco (planta única) (g/planta) — peso médio fresco de três plantas por canteiro tomado no meio da estação.

[00392] Diâmetro base do ramo principal [mm] — o diâmetro da base do ramo principal, média de três plantas por canteiro.

[00393] 1000 Sementes [g] — peso de 1000 sementes por canteiro.

[00394] Ramo principal-número total de vagens — número total de vagens no ramo principal, média de três plantas por canteiro.

[00395] Ramo principal-dist 1-20 — o comprimento entre a vagem mais jovem e a vagem número 20 no ramo principal, média de três plantas por canteiro.

[00396] Ramo lateral-número total de vagens - número total de vagens no ramo lateral mais baixo, média de três plantas por canteiro.

[00397] Ramo lateral-dis. 1-20 — O comprimento entre a vagem mais jovem e a vagem número 20 no ramo lateral mais baixo, média de três plantas por canteiro.

[00398] Peso seco/planta — peso de plantas totais por canteiro na colheita depois de três dias em estufa a 60°C normalizada para o número de plantas por canteiro.

[00399] Área total da folha — A área total da folha por canteiro foi calculada com base em três plantas aleatórias e normalizada para o número de plantas por canteiro.

[00400] Perim. total — O perímetro total de folhas, foi calculado com base em três plantas aleatórias e normalizado para o número de plantas por canteiro.

Resultados Experimentais

[00401] Duas variedades de B. juncea foram cultivadas sob sete densidades populacionais diferentes e distinguidas para a 30 parâmetros como especificado na Tabela 23 abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 24-26 abaixo. A análise de correlação subsequente entre a expressão de genes selecionados em diversos conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram depois integrados para a base de dados (Tabela 27). Tabela 23 Parâmetros de correlação em acessos de B. juncea

Tabela 23. São providos os parâmetros correlacionados de B. juncea. “g” = gramas; mm = milímetros; “cm” = centímetros; “mg” = miligramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “Kg.” = quilogramas; Tabela 24 Parâmetros medidos em variedades de B. juncea em várias densidades populacionais

Tabela 24: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos na Tabela 23 acima) medidos em 2 variedades de B. juncea nas densidades populacionais indicadas sob condições normais. Por exemplo, “linha 1 densidade: 10” se refere à variedade de Juncea 1 cultivada em uma densidade populacional de 10 plantas per m2. Tabela 25 Parâmetros medidos nas variedades de B. juncea em várias densidades populacionais

Tabela 25: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos na Tabela 23 acima) medidos em 2 variedades de B. juncea nas densidades populacionais indicadas sob condições normais. Por exemplo, “linha 2-densidade: 300” se refere à variedade Juncea 2 cultivada em uma densidade populacional de 300 plantas por m2. Tabela 26 Parâmetros medidos nas variedades de B. juncea em várias densidades populacionais

Tabela 26: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos na Tabela 23 acima) medidos em 2 variedades de B. juncea nas densidades populacionais indicadas sob condições normais. Por exemplo, “linha 2-densidade: 200” se refere à variedade Juncea 2 cultivada em uma densidade populacional de 200 plantas por m2. Tabela 27 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em densidades diferentes através de acessos de B. juncea

Tabela 27. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em tecidos [meristema e flor; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em diversos componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [ID de Vetor de correlação (milho)] sob condições normais através de acessos de B. juncea. P = valor p.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO COM PARÂMETROS RELACIONADOS COM ABST USANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO DE 44K

[00402] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento entre fenótipo de planta e nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo do sorgo, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcritos do sorgo. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com os componentes de ABST, rendimento e NUE ou parâmetros relacionados com vigor, várias características de planta de 17 híbridos de sorgo diferentes foram analisadas. Entre eles, 10 híbridos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00403] Correlação de variedades de Sorgo através de ecotipos cultivados sob condições de cultivo regular, condições de seca severa e condições de nitrogênio baixo

Procedimentos Experimentais

[00404] 17 variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 canteiros repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de cultivo foi como segue:

[00405] Condições de cultivo regulares (normais): plantas de sorgo foram cultivadas no campo usando protocolos de fertilização e irrigação comerciais (370 litros por metro, fertilização de 14 unidades de ureia a 21% por período de crescimento inteiro).

[00406] Condições de seca: as sementes de sorgo foram semeadas em solo e cultivadas sob condição normal até em torno de 35 dias da semeadura, em torno do estágio V8 (oito folhas verdes são completamente expandidas, a inicialização ainda não começou). Neste ponto, a irrigação foi interrompida e estresse severo pela seca foi desenvolvido.

[00407] Condições de fertilização de baixo Nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicado no tratamento de crescimento regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes do florescimento.

[00408] Tecidos de Sorgo analisados — Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Tecidos [Folha bandeira, Meristema floral e Flor] de plantas cultivadas sob condições normais, estresse severo pela seca e condições de nitrogênio baixo foram amostradas e o RNA foi extraído como descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID do Conjunto como resumido na Tabela 28 abaixo. Tabela 28 Conjuntos de expressão do transcriptoma do Sorgo

Tabela 28: São providos os conjuntos de expressão de transcriptoma do sorgo 1-9. Folha bandeira = a folha abaixo da flor; Meristema floral = Meristema apical seguindo a iniciação de panículo; Flor = a flor no dia da antese. Os conjuntos de expressão 1, 4 e 7 são de plantas cultivadas sob condições de seca; os conjuntos de expressão 2, 5 e 8 são de plantas cultivadas sob condições de nitrogênio baixo; Os conjuntos de expressão 3, 6 e 9 são de plantas cultivadas sob condições normais.

[00409] os seguintes parâmetros foram coletados usando sistema de imageamento digital:

[00410] No final do período de cultivo os grãos foram separados da ‘cabeça’ da planta e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados:

[00411] Área de Grão Média (cm2) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00412] (I) Razão Média Superior e Inferior da Área de Grão,Largura, Diâmetro e Perímetro - A projeção do grão de área, largura, diâmetro e perímetro foi extraída das imagens digitais usando o pacote de fonte aberta imagemJ (nih). Os dados de semente foram analisados em níveis médios de canteiro como segue:

[00413] Média de todas as sementes.

[00414] Média da fração de 20% superior - conteve a fração de 20% superior de sementes.

[00415] Média da fração de 20% inferior - conteve a fração de 20% inferior de sementes.

[00416] Mais adiante, a razão entre cada fração e a média por canteiro foi calculada para cada um dos parâmetros de dados.

[00417] No final do período de cultivo 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo.

[00418] Área Média da cabeça (cm2) - No final do período de cultivo 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da ‘Cabeça’ foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número de ‘Cabeças’.

[00419] Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da ‘Cabeça’ (eixo mais longo) foi medido a partir destas imagens e foi dividido pelo número de ‘Cabeças’.

[00420] Largura média da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A largura da ‘Cabeça’ foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número de ‘Cabeças’.

[00421] Largura Média da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O perímetro da ‘Cabeça’ foi medido a partir destas imagens e foi dividido pelo número de ‘Cabeças’.

[00422] O sistema de processamento de imagem foi usado, que consiste de um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, o software de processamento de imagem com base no Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e está gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área de semente e comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00423] Os parâmetros adicionais foram coletados amostrando-se 5 plantas por canteiro ou medindo-se os parâmetros através de todas as plantas dentro do canteiro.

[00424] Peso de Grão Total/Cabeça (g) (rendimento de grão) - No final do experimento as cabeças (‘Cabeças’ de planta) dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, toda as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso de grão médio por cabeça foi calculado dividindose o peso de grão total pelo número total de cabeças por canteiro (com base no canteiro). No caso de 5 cabeças, o peso de grãos total de 5 cabeças foi dividido por 5.

[00425] FW de Cabeça/Grama de Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas) as cabeças totais e 5 selecionadas por canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (g) separadamente e o peso médio fresco por planta foi calculado para total (FW de Cabeça/ g de Planta com base no canteiro) e para 5 (FW de Cabeça/ g de Planta com base nas 5 plantas).

[00426] Altura da planta — as plantas foram distinguidas para à altura durante o período de cultivo em 5 pontos de tempo. Em cada medida, as plantas foram medidas quanto à sua altura usando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.

[00427] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas sobre a folha jovem completamente desenvolvida. Três medições por folha foram determinadas por canteiro.

[00428] Peso fresco vegetativo e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescência foram seca) toda a inflorescência e material vegetativo dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso da biomassa e Cabeças de cada canteiro foi separado, medido e dividido pelo número de Cabeças.

[00429] Biomassa de planta (Peso fresco) - No final do experimento (quando a Inflorescência foi seca) o material vegetativo dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletados. A biomassa das plantas sem a inflorescência foi medida e dividida pelo número de plantas.

[00430] FW de Cabeças/(FW de Cabeças + FW de Plantas) - O peso total fresco de cabeças e a sua respectiva biomassa de planta foi medido no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma de pesos de cabeças e plantas.

Resultados Experimentais

[00431] 17 variedades de sorgo diferentes foram cultivadas e distinguidas quanto aos parâmetros diferentes (Tabela 29). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP (Tabelas 30-31) e uma análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de transcriptoma (Tabela 28) e os parâmetros médios (Tabelas 30-31) foi conduzida. Os resultados foram depois integrados com a base de dados (Tabela 32). Tabela 29 Parâmetros correlacionados com o sorgo (vetores)

Tabela 29. São providos os parâmetros correlacionados com o sorgo (vetores). “g” = gramas; 'SPAD” = níveis de clorofila; “FW” = Peso fresco da planta; “normal” = condições de cultivo padrão. Tabela 30 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo (Linhas 1-9)

Tabela 30: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos na Tabela 29 acima) medidos nos acessos (ecotipo) de Sorgo sob condições normais, de nitrogênio baixo e de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 31 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo (Linhas 10-17)

Tabela 31: São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima) medidos em acessos (ecotipo) de Sorgo sob condições normais, de nitrogênio baixo e de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 32 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de estresse abiótico através de acessos de Sorgo

Tabela 32. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em tecidos [Folha bandeira, Meristema Floral, Haste e Flor; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em diversos componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [ID do Vetor de Correlação (con.)] sob condições de estresse ou condições normais através de acessos de Sorgo. P = valor p.

EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO DESEMPENHO COM RENDIMENTO E PARÂMETROS RELACIONADOS COM NUE USANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO MILHO DE 60K

[00432] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento entre fenótipo de planta e nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo do milho, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcritos do milho.

Correlação de híbridos do milho através de ecotipos cultivados sob condições de cultivo regulares Procedimentos Experimentais

[00433] 12 híbridos de Milho foram cultivados no campo em 3 canteiros repetitivos. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo usando protocolos de fertilização e irrigação comerciais. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com estresse e componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, os 12 híbridos de milho diferentes foram analisados. Entre eles, 10 híbridos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00434] Tecidos de milho analisados — Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados por 3 pontos de tempo (TP2 = V6-V8, TP5 = R1-R2, TP6 = R3-R4). Quatro tipos de tecidos vegetais [Espiga, folha bandeira indicada na Tabela 33 como “folha’, parte distal do grão e internós] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu uma ID do Conjunto como resumido na Tabela 33 abaixo. Tabela 33 Conjuntos de expressão de transcriptoma do Milho sob condi decs normais

Tabela 33: São providos o número de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do Milho. Folha = a folha abaixo da espiga principal; Espiga = a flor fêmea no dia da antese; Internós = internós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta.

[00435] Os seguintes parâmetros foram coletados usando sistema de imageamento digital:

[00436] Área de grão (cm2) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número (Num) de grãos.

[00437] Comprimento de grão e largura de grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma de comprimentos /ou larguras de grão (eixo mais longo) foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00438] Área da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de Espiga foi medida a partir destas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00439] Comprimento de Espiga e Largura de Espiga (cm) - No final do período de cultivo 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas usando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da Espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir destas imagens e foram divididos pelo número de espigas.

[00440] O sistema de processamento de imagem foi usado, que consiste de um computador de mesa pessoal (processor Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base no Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e está gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (Padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para a área de semente e comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00441] Parâmetros adicionais foram coletados pela amostragem de 6 plantas por canteiro ou medindo-se o parâmetro através de todas as plantas dentro do canteiro.

[00442] Peso de Grão Normalizado por planta (g) - No final do experimento todas as espigas dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. Seis espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais também foram debulhadas juntas e pesadas. O peso do grão médio por espiga foi calculado dividindo-se o peso de grão total pelo número total de espigas por canteiro (com base no canteiro). No caso de 6 espigas, o peso total de grãos de 6 espigas foi dividido por 6.

[00443] FW de Espiga (g) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) totais e 6 espigas selecionadas por canteiro dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (g) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para o total (FW de Espiga por canteiro) e para 6 (FW de Espiga por planta).

[00444] Altura da planta e Altura da Espiga - As plantas foram distinguidas pela altura na colheita. Em cada medida, 6 plantas foram medidas quanto à sua altura usando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo da borla. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o lugar onde a espiga principal está localizada.

[00445] Número de folha por planta - As plantas foram distinguidas para ao número de folha durante o período de cultivo em 5 pontos de tempo. Em cada medida, as plantas foram medidas quanto ao seu número de folha contando-se todas as de 3 plantas selecionadas por canteiro.

[00446] Taxa de crescimento relativa do número de folha - foi calculada usando a Fórmula IX (acima).

[00447] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado usando um medidor de clorofila SPAD 502 da Minolta e a medição foi realizada 64 dias após a Semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas sobre folha jovem completamente desenvolvida. Três medições por folha foram determinadas por canteiro. Os dados foram determinados depois de 46 e 54 dias depois da semeadura (DPS).

[00448] Peso seco por planta - No final do experimento (quando a Inflorescência foi seca) todo o material vegetativo dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletados.

[00449] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo raízes) depois de secagem a 70°C em estufa durante 48 horas.

[00450] Índice de colheita (HI) (Milho)- O índice de colheita foi calculado usando a Fórmula X. Fórmula X Índice de colheita = Peso seco de grão médio por Espiga / (Peso seco vegetativo médio por Espiga + Peso seco médio da Espiga)

[00451] Porcentagem de Espiga Cheia [%] - a mesma foi calculada como a porcentagem da área de Espiga com grãos da espiga total.

[00452] Cheia por Toda a Espiga - a mesma foi calculada como o comprimento da espiga com grãos da espiga total.

[00453] Diâmetro do sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido usando uma régua.

[00454] Número de Fileiras de Grão por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.

Resultados Experimentais

[00455] 12 híbridos de milho diferentes foram cultivados e distinguidos quanto aos parâmetros diferentes. Os parâmetros correlacionados são descritos na Tabela 34 abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP (Tabelas 35-36) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 37). Os resultados foram depois integrados com a base de dados. Tabela 34 Parâmetros correlacionados com o milho (vetores)

Tabela 34. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Nível de clorofila depois de 46 e 54 dias depois da semeadura (DPS). “FW” = peso fresco; “DW” = peso seco. Tabela 35 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais (linhas 1- 6)

Tabela 35. São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 36 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo regulares (linhas 7-12)

Tabela 36. São providos os valores de cada um dos parâmetros (como descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são Tabela 37 Correlação entre o nível de expressão de selecionados LYD genes de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob normal través de milho acessos

Tabela 37. “ID Con.” - ID de Correlação do Conjunto de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 34 acima. “Conjunto Exp.” - Conjunto de Expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor p.

EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DA SOJA (GLYCINE MAX) E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO USANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DA B. SOJA DE 44K

[00456] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo da Soja, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 42.000 genes e transcritos da Soja. De modo a definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com a arquitetura da planta ou parâmetros relacionados com o vigor da planta, várias características de planta de 29 variedades de Glycine max diferentes foram analisadas e 12 variedades foram adicionalmente usadas para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson.

[00457] Correlação de níveis de expressão dos genes de Glycine max com características fenotípicas através do ecotipo

Procedimentos Experimentais

[00458] 29 variedades de Soja foram cultivadas em três canteiros repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de cultivo foi como segue: sementes de Soja foram semeadas em solo e cultivadas sob condições normais até a colheita. De modo a definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados com a arquitetura ou parâmetros relacionados com vigor, 12 variedades de Soja diferentes (das 29 variedades) foram analisadas e usadas para a análise de expressão de gene. A análise foi realizada em dois períodos de tempo predeterminados: na formação da vagem (quando as vagens de soja são formadas) e no tempo de colheita (quando as vagens de soja estiverem prontas para colheita, com sementes maduras). A Tabela 39 descreve os parâmetros de soja correlacionados. Os meios para cada um dos parâmetros medidos foram calculados usando o software JMP (Tabelas 40-41) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 42). Os resultados foram depois integrados com a base de dados. Tabela 38 Conjuntos de expressão de transcriptoma da Soja

Tabela 38: São providos os conjuntos de expressão de transcriptoma da soja.

[00459] Extração de RNA — Todas as 12 variedades de Soja selecionadas foram amostradas por tratamento. Os tecidos vegetais [folha, raiz, haste, vagem, meristema apical, botões de flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima.

[00460] Os parâmetros de dados coletados foram como segue:

[00461] Diâmetro da base do ramo principal [mm] na formação da vagem — o diâmetro médio da base do ramo principal (com base no diâmetro) de três plantas por canteiro.

[00462] Peso fresco [g/planta] na formação da vagem — peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) antes da secagem na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00463] Peso seco [g/planta] na formação da vagem — peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo raízes) depois da secagem a 70°C em estufa durante 48 horas na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00464] Número total de nós com vagens nos ramos laterais [valor/planta]- a contagem de nós que contêm vagens nos ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00465] Número de ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00466] Peso total de ramos laterais na formação da vagem [g/planta] - peso de todos os ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00467] Peso total de vagens na haste principal na formação da vagem [g/planta] - peso de todas as vagens na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00468] Número total de nós na haste principal [valor/planta] - contagem de número de nós na haste principal começando dos primeiros nós acima do solo, média de três plantas por canteiro.

[00469] Número total de vagens com 1 semente nos ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente em todos os ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00470] Número total de vagens com 2 sementes nos ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes em todos os ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00471] Número total de vagens com 3 sementes nos ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes em todos os ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00472] Número total de vagens com 4 sementes nos ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes em todos os ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00473] Número total de vagens com 1 semente na haste principal na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00474] Número total de vagens com 2 sementes na haste principal na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00475] Número total de vagens com 3 sementes na haste principal na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00476] Número total de vagens com 4 sementes na haste principal na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00477] Número total de sementes por planta na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número de sementes nos ramos laterais e haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00478] Número total de sementes nos ramos laterais na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes nos ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00479] Número total de sementes na haste principal na formação da vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes na haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00480] Altura da planta na formação da vagem [cm/planta] - comprimento total da parte de acima do solo até a ponta da haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00481] Altura da planta na colheita [cm/planta] - comprimento total da parte de acima do solo até a ponta da haste principal na colheita, média de três plantas por canteiro.

[00482] Peso total de vagens nos ramos laterais na formação da vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00483] Razão do número de vagens por nós na haste principal na formação da vagem - calculada na fórmula XI, média de três plantas por canteiro. Fórmula XI: Número total de vagens na haste principal /Número total de nós na haste principal, média de três plantas por canteiro.

[00484] Razão do número total de sementes na haste principal para número de sementes nos ramos laterais - calculada na fórmula XII, média de três plantas por canteiro. Fórmula XII: Número total de sementes na haste principal na formação da vagem/ Número total de sementes nos ramos laterais na formação da vagem.

[00485] Peso total de vagens por planta na formação da vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais e haste principal na formação da vagem, média de três plantas por canteiro.

[00486] Dias até 50% de florescimento [dias] — número de dias até 50% de florescimento para cada canteiro.

[00487] Dias até 100% de florescimento [dias] — número de dias até 100% de florescimento para cada canteiro.

[00488] Maturidade [dias] - medida quando 95% das vagens em um canteiro amadureceram (se tornaram 100% marrons). Queda de folha retardada e hastes verdes não são consideradas na designação de maturidade. Os testes são observados 3 dias por semana, dia sim dia não, quanto à maturidade. A data de maturidade é a data que 95% das vagens atingiram a cor final. A maturidade é expressa em dias depois de 31 de agosto [de acordo com a definição aceita de maturidade no USA, Descriptor list for SOYBEAN, Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) ars-grin (dot) gov/cgi- bin/npgs/html/desclist (dot) pl?51].

[00489] Qualidade de semente [classificada de 1 a 5] - medição na colheita, uma estimativa visual com base em diversas centenas de sementes. O parâmetro é classificado de acordo com as seguintes contagens considerando a quantidade e grau de rugas, revestimento defeituoso (rachaduras), esverdeamento e mofado ou outro pigmento. A classificação é 1-muito boa, 2-boa, 3-regular, 4-insatisfatória, 5-muito insatisfatória.

[00490] Apresentação [CLASSIFICADA 1 A 5] - é classificada na maturidade por canteiro de acordo com as seguintes contagens: 1-a maioria das plantas em um canteiro estão eretas, 2-Todas as plantas levemente inclinadas ou umas poucas plantas no chão, 3-todas as plantas moderadamente inclinadas ou 25% a 50% no chão, 4-todas as plantas consideravelmente inclinadas ou 50% a 80% no chão, 5-a maioria das plantas no chão. Nota: contagens intermediárias tais como 1,5 são aceitáveis.

[00491] Tamanho da semente [g] - peso de 1000 sementes por canteiro normalizado para 13% de umidade, medida na colheita.

[00492] Peso total de sementes por planta [g/planta] - calculada na colheita (por 2 fileiras internas de um canteiro podado) como peso em gramas de sementes limpas ajustadas para 13% de umidade e divididas pelo número total de plantas em duas fileiras internas de um canteiro podado.

[00493] Rendimento na colheita [bushels/hectare] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas de um canteiro podado) como peso em gramas de sementes limpas, ajustado para 13% de umidade e depois expresso como bushels por acre.

[00494] Sementes por vagem médias por ramo lateral [número] - Calcular Num de Sementes nos ramos laterais - na formação da vagem e dividir pelo número de Número total de vagens com sementes nos ramos laterais - na formação da vagem.

[00495] Sementes por vagem médias da haste principal [número] - Calcular o Número Total de Sementes na haste principal na formação da vagem e dividir pelo número de Número total de vagens com sementes na haste principal na formação da vagem.

[00496] Comprimento médio dos internós da haste principal [cm] - Calcular a Altura da planta na formação da vagem e dividir pelo número total de nós na haste principal na formação da vagem.

[00497] Número total de vagens com sementes na haste principal [número] — contagem de todas as vagens contendo sementes na haste principal na formação da vagem.

[00498] Número total de vagens com sementes nos ramos laterais [número]- contagem de todas as vagens contendo sementes nos ramos laterais na formação da vagem.

[00499] Número total de vagens por planta na formação da vagem [número]- contagem das vagens na haste principal e ramos laterais na formação da vagem.

Resultados Experimentais

[00500] Doze variedades de Soja diferentes foram cultivadas e distinguidas para 40 parâmetros como especificado na Tabela 39 abaixo. Os meios para cada um dos parâmetros medidos foram calculados usando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 40-41 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 42). Os resultados foram depois integrados com a base de dados. Tabela 39 Parâmetros correlacionados com a Soja (vetores)

Tabela 39. Tabela 40 Parâmetros medidos nas variedades de Soja (linhas 1-6)

Tabela 40. Tabela 41 Parâmetros medidos nas variedades de Soja (linhas 7-1 2))

Tabela 41. Tabela 42 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais através de variedades de soja

Tabela 42. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em diversos tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [rendimento, biomassa e arquitetura de planta (ID de Vetor de Correlação (Con.))] sob condições normais através de soja variedades. P = valor p.

EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO DESEMPENHO USANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA DE 44K

[00501] De modo a produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 47.500 genes e transcritos de cevada. De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, várias características de planta de 25 acessos de foram analisados. Entre eles, 13 acessos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros distinguidos foi analisada usando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos Experimentais

[00502] Cinco tecidos em estágios desenvolvimentais diferentes [meristema, flor, espiga de inicialização, haste, folha bandeira], representando características de planta diferentes, foram amostradas e o RNA foi extraído como descrito acima sob “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA”.

[00503] Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID do Conjunto como resumido na Tabela 43 abaixo.Tabela 43 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada

Tabela 43: São providos os dígitos de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Cevada.

[00504] Avaliação dos componentes de rendimento e parâmetros relacionados com vigor da Cevada — 13 acessos da cevada em 4 blocos repetitivos (chamados de A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por canteiro foram cultivadas em sombra de malha. As plantas foram fenotipadas em uma base diária seguindo o descritor padrão da cevada (Tabela 44, abaixo). A colheita foi conduzida quando 50% das espigas foram secas para evitar a liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas em parte vegetativa e espigas, delas, 5 espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para a análise de grão adicional tal como medição de tamanho, contagem de grão por espiga e Rendimento de Grão por espiga. Todo o material foi secado em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) usando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem incluiu um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e gratuitamente disponível na internet [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute). Tabela 44 Descritores padrão da cevada

Tabela 44.

[00505] No final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas dos canteiros dentro dos blocos A-D foram coletadas e as seguintes medições foram realizadas: (i) Grãos por espiga - O número total de grãos de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foi contado. Os grãos médios por espiga foram calculados dividindo-se o número total de grãos pelo número de espigas. (ii) Tamanho médio do grão (cm) - Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram escaneados e as imagens foram analisadas usando o sistema de imageamento digital. A varredura de grão foi feita usando o escâner da Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisada com o software Image J. O tamanho de grão médio foi calculado dividindo-se o tamanho de grão total pelo número de grão total. (iii) Peso de grão médio (mgr) - Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram contadas e pesadas. O peso médio foi calculado dividindo-se o peso total pelo número total de grãos. (iv) Rendimento de Grão por espiga (g) - O total de grãos de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foi pesado. O Rendimento de Grão foi calculado dividindo-se o peso total pelo número de espiga. (v) Análise do comprimento da espiga - As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas usando fita métrica excluindo as barbas. (vi) Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.

[00506] Parâmetros adicionais foram medidos como segue:

[00507] Contagem do hábito de crescimento — No estágio de crescimento 10 (inicialização), cada uma das plantas foi classificada quanto Pa natureza do seu hábito de crescimento. A escala que foi usada foi 1 para natureza prostada até 9 para ereto.

[00508] Pilosidade das folhas basais - No estágio de crescimento 5 (bainhas de folha fortemente eretas; final do broto), de cada uma das plantas foi classificada quanto à sua natureza pilosa da folha antes da última. A escala que foi usada foi 1 para a natureza prostada até 9 para ereto.

[00509] Altura da planta — No estágio de colheita (50% das espigas foram secas), cada um das plantas foi medida quanto à sua altura usando fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da espiga mais longa excluindo as barbas.

[00510] Dias para florescimento — Cada uma das plantas foi monitorada quanto à data de florescimento. Os dias de florescimento foram calculados a partir da data de semeadura até a data de florescimento.

[00511] Pigmentação da haste - No estágio de crescimento 10 (inicialização), cada um das plantas foi classificada quanto à sua cor da haste. A escala que foi usada foi 1 para verde até 5 para púrpura profunda.

[00512] Peso vegetativo seco e rendimento de espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas e material vegetativo dos canteiros dentro dos blocos A-D são coletados. O peso da biomassa e espigas de cada canteiro foi separado, medido e dividido pelo número de plantas.

[00513] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) depois de secar a 70°C em estufa durante 48 horas;

[00514] Rendimento de espiga por planta = peso total da espiga por planta (g) depois de secar a 30°C em estufa durante 48 horas. Tabela 45 Parâmetros carrelacionados da cevada (vetores)

Tabela 45. São providos os parâmetros correlacionados da cevada (vetores).

Resultados Experimentais

[00515] 13 acessos de cevada diferentes foram cultivados e distinguidos para 12 parâmetros como descritos acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada usando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 46 e 47 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de expressão de transcriptoma (Tabela 43) e os parâmetros médios (Tabelas 46-47) foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados com a base de dados (Tabela 48 abaixo). Tabela 46 Parâmetros medidos de IDs de Correlação em acessos de Cevada (linhas 1-6)

Tabela 46. São providos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de cevada de acordo com as Identificações de Correlação (ver Tabela 45). Tabela 47 Acessos da cevada, parâmetros adicionais medidos (linhas 7-13)

Tabela 47. São providos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de cevada de acordo com as Identificações de Correlação (ver Tabela 45). Tabela 48 Correlação entre o nível de expressão dos polinucleotídeos selecionados da invenção e seus homólogos em tecidos específicos ou estágios desenvolvimentais e o desempenho fenotípico através de acessos de cevada

Tabela 48. São providas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes melhoradores de rendimento e seus homólogos em diversos tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico (ID do Vetor de correlação (Corr.))] sob condições normais através de variedades de cevada. P = valor p.

EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE COTTON E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO PARA DESENVOLVIMENTO DE FIBRA VEGETAL USANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO ALGODÃO

[00516] De modo a conduzir a análise de correlação da expressão de gene de alto rendimento, os presentes inventores usaram microarranjo de oligonucleotídeo do algodão, planejado e produzido pela “Comparative Evolutionary Genomics of Cotton” [Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto) www.cottonevolution (dot) info/). Este Microarranjo de Oligonucleotídeo de Algodão é composto de 12.006 oligonucleotídeos da Integrated DNA Technologies (IDT) derivados de uma montagem de mais do que 180.000 ESTs de Gossypium sequenciados a partir de 30 bibliotecas de cDNA. Para detalhes adicionais ver PCT/IL2005/000627 e PCT/IL2007/001590 que são aqui completamente incorporadas por referência. Tabela 49 Conjuntos experimentais de transcriptoma do algodão

Tabela 49. São providos os conjuntos de expressão do transcriptoma do algodão.

[00517] De modo a definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e comprimento de fibra, fibras de 8 linhagens de algodão diferentes foram analisadas. Estas fibras foram selecionadas apresentando qualidade muito boa da fibra e alto índice de índice de fiapos (tipos Pima, originando de outra espécie de algodão, a saber G. barbadense), níveis diferentes de qualidade e índices de fiapo de várias linhagens de G. hirsutum: qualidade boa e alto índice de fiapo (tipo Acala) e qualidade insatisfatória e índice de fiapo curto (tipo Tamcot e variedades velhas). Um resumo do comprimento de fibra das diferentes linhagens é provido na Tabela 51.

Procedimentos Experimentais

[00518] Extração de RNA - Estágios de desenvolvimento de fibra, representando características de fibra diferentes, em 5, 10 e 15 DPA (Dias Depois da Antese) foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima.

[00519] Avaliação do comprimento da fibra - O comprimento da fibra das linhagens de algodão selecionadas foi medido usando fibrograph. O sistema fibrograph foi usado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio da Metade Superior”. A Média da Metade Superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição de fibra. O fibrograph mede o comprimento em comprimentos de intervalo em um dado ponto de porcentagem World Wide Web (dot) cottoninc (dot) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length].

Resultados Experimentais

[00520] Oito linhagens de algodão diferentes foram cultivadas e seu comprimento de fibra foi medido. Os valores UHM das fibras estão resumidos na Tabela 51 aqui abaixo. A correlação entre o nível de expressão de genes de algumas modalidades da invenção e o comprimento da fibra do algodão sob condições de cultivo normais foi realizada (Tabela 52). Tabela 50 Parâmetro de correlação do algodão

Tabela 50. Tabela 51 Sumário do comprimento de fibra (UHM) das 8 linhagens de algodão diferentes

Tabela 51: É apresentada a UHM de 8 linhagens de algodão diferentes. Tabela 52 Correlação entre o nível de expressão de genes LYD selecionados de algumas modalidades da invenção em diversos tecidos e comprimentos da fibra do algodão sob normal condições de cultivo no algodão

Tabela 52. São providas as correlações entre o nível de expressão dos genes e o efeito sobre o comprimento da fibra. “Conj. Exp.” - Conjunto de Expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor p.

EXEMPLO 12 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM O RENDIMENTO,BIOMASSA, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, CONTEÚDO DE ÓLEO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO DE PLANTAS E EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO

[00521] Com base nas ferramentas de bioinformática e experimentais descritas acima, os presentes inventores identificaram 201 genes que têm um maior impacto sobre o rendimento, rendimento de semente, rendimento de óleo, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de fertilizante (por exemplo, nitrogênio) quando a expressão dos mesmos é aumentada em plantas. Os genes identificados (incluindo genes, variantes, sequências selecionadas dos mesmos e sequências clonadas identificados pelas ferramentas de bioinformática) e sequências de polipeptídeo por meio destes codificadas estão resumidas na Tabela 53, abaixo. Tabela 53 Polinucleotídeos identificados que afetam o rendimento da planta, rendimento de semente, rendimento de óleo, conteúdo de óleo, biomassa, taxa de crescimento, vigor, rendimento de fibra, qualidade da fibra tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta

Tabela 53: São providos os genes identificados, sua anotação, organismo e identificadores de sequência de polinucleotídeo e polipeptídeo. “polinucl.” = polinucleotídeo; “polipep.” = polipeptídeo.

EXEMPLO 13 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM O RENDIMENTO DE SEMENTE, RENDIMENTO DE ÓLEO, TAXA DE CRESCIMENTO, CONTEÚDO DE ÓLEO, RENDIMENTO DE FIBRA,QUALIDADE DA FIBRA, BIOMASSA, VIGOR, ABST E/OU NUE DE UMA PLANTA

[00522] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados para definições e classificações funcionais na escala de comparações de genoma inteiro. Os ortólogos e parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: Os primeiros evoluíram a partir de um ancestral comum pela especialização e os últimos estão relacionados pelos eventos de duplicação. É assumido que os parálogos que surgem a partir de eventos de duplicação antigos são prováveis de terem divergido na função enquanto que os ortólogos verdadeiros são mais prováveis de reterem função idêntica ao longo do tempo evolucionário.

[00523] Para identificar ortólogos putativos dos genes que afetam o rendimento da planta, rendimento de óleo, conteúdo de óleo, rendimento de semente, taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas usando o BLAST (Ferramenta Básica de Busca de Alinhamento Local (Basic Local Alignment Search Tool)). As sequências suficientemente similares foram tentativamente agrupadas. Estes ortólogos putativos foram adicionalmente organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumida ser uma representação das relações evolucionárias entre a taxa biológica. Os grupos ortólogos putativos foram analisados de acordo com a sua concordância com o filograma e nos casos de discordâncias estes grupos ortólogos foram decompostos consequentemente.

[00524] Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas de EST foram classificadas usando um vocabulário fixo de termos personalizados tais como estágios desenvolvimentais (por exemplo, genes mostrando perfil de expressão similar através do desenvolvimento com suprarregulagem em estágio específico, tal como no estágio de enchimento de semente) e/ou órgão de planta (por exemplo, genes mostrando perfil de expressão similar através de seus órgãos com suprarregulagem em órgãos específicos tais como semente). As anotações de todos os ESTs agrupados para um gene foram analisadas estatisticamente comparando-se a sua frequência no agrupamento versus a sua abundância na base de dados, permitindo a construção de um perfil de expressão numérico e gráfico deste gene, que é chamado de “expressão digital”. A justificativa de usar estes dois métodos complementares com métodos de estudo de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação de expressão fenotípica está fundamentada na suposição de que ortólogos verdadeiros são prováveis de reter função idêntica ao longo do tempo evolucionário. Estes métodos proveem conjuntos diferentes de indicações nas similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades nos aminoácidos idênticos ao nível de sequência nos domínios de proteína e similaridade nos perfis de expressão.

[00525] A busca e identificação de genes homólogos envolve a triagem de informação de sequência disponível, por exemplo, nas bases de dados públicas tais como a Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ), Genbank e a Base de Dados de Sequências de Ácidos Nucléicos de Laboratório de Biologia Molecular Européia (EMBL) ou versões das mesmas ou a base de dados MIPS. Vários algoritmos de busca diferentes foram desenvolvidos, incluindo, mas não limitados ao conjunto de programas aludido como programas BLAST. Existem cinco implementações de BLAST, três planejadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas planejadas para consultas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends em Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem alinhamento e comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula a identidade de sequência percentual e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realizar a análise BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Outros de tais software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para achar o alinhamento de duas sequências completas que maximize o número de combinações e minimiza o número de lacunas.

[00526] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada usando análise de similaridade de sequência. Para realizar esta análise pode-se usar programas padrão para alinhamentos múltiplos por exemplo Clustal W. Uma árvore de junção de vizinhos das proteínas homólogas aos genes nesta invenção pode ser usada para prover uma visão geral de relações estruturais e ancestrais. A identidade de sequência pode ser calculada usando um programa de alinhamento como descrito acima. É esperado que outras plantas carregarão um gene funcional similar (ortólogo) ou uma família de genes similares e estes genes proverão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção. Os exemplos de outras plantas são aqui incluídos mas não limitados a Cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Milho (Zea mays), Algodão (Gossypium), Colza (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Cana de Açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorghum bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum), Trigo (Triticum aestivum).

[00527] As análises mencionadas acima para homologia de sequência podem ser realizadas em uma sequência de comprimento completo, mas também pode ser fundamentada em uma comparação de certas regiões tais como domínios conservados. A identificação de tais domínios, também estaria bem dentro da domínio da pessoa versada na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível por computador dos ácidos nucléicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informação publicamente disponível sobre domínios de proteína, motivos e caixas conservados. Esta informação está disponível nas bases de dados PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) biochem (dot) ucl (dot) ac (dot) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (dot) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol://pir (dot) Georgetown (dot) edu/) ou Pfam (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) Sanger (dot) ac (dot) uk/Software/Pfam/). Os programas de análise de sequência planejados para a busca de motivo podem ser usados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados como mencionados acima. Os programas de computador preferidos incluem, mas não são limitados ao MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.

[00528] Uma pessoa versada na técnica pode usar as sequências homólogas aqui providas para achar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína abrangem, peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido relativas à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similares como a proteína não modificada a partir da qual eles são derivados. Para produzir tais homólogos, aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades similares (mudanças conservativas, tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou decompor estruturas α-helicoidais ou estruturas de folha β similares). As tabelas de substituição conservativas são bem conhecidas na técnica (ver por exemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Os homólogos de um ácido nucléico abrangem ácidos nucléicos tendo substituições, deleções e/ou inserções de nucleotídeos relativas ao ácido nucléico não modificadas em questão e tendo atividade biológica e funcional similares como o ácido nucléico não modificado a partir do qual são derivados.

[00529] A Tabela 54, abaixo, lista um resumo de sequências ortólogas e homólogas das sequências de polinucleotídeos e sequências polipeptídeos apresentadas na Tabela 53 acima, que foram identificadas a partir das bases de dados usando o software BLAST da NCBI (por exemplo, usando os algoritmos Blastp e tBlastn) e needle (pacote EMBOSS) como sendo pelo menos 80% homólogas aos polinucleotídeos e polipeptídeos selecionados e que são esperadas aumentar o rendimento da planta, rendimento de semente, rendimento de óleo, conteúdo de óleo, taxa de crescimento, rendimento de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta. Tabela 54 Polinucleotídeos e polipeptídeos homólogos que podem aumentar o rendimento da planta, rendimento de semente, rendimento de óleo, conteúdo de óleo, taxa de crescimento, rendimento de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta

Tabela 54: São providos polinucleotídeos (Polin.) e polipeptídeos (Polip.) que são homólogos aos polinucleotídeos ou polipeptídeos identificados da Tabela 53. Hom. = homólogo; “glob.” = global; “Iden.” = idêntico; Algor. = Algoritmo;

EXEMPLO 14 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DE PLANTA

[00530] Para validar o seu papel na melhora do conteúdo de óleo, rendimento da planta, rendimento de semente, conteúdo de óleo, biomassa, taxa de crescimento, rendimento de fibra, qualidade da fibra, ABST, NUE e/ou vigor, os genes selecionados foram superexpressos em plantas, como segue.

Estratégia de Clonagem

[00531] Os genes selecionados daqueles listados nos Exemplos 12 e 13 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta de comprimento completo (ORF) foi primeiro identificado. No caso de agrupamentos de ORF- EST e em alguns casos as sequências de mRNA já publicadas foram analisadas para identificar o quadro de leitura aberta inteiro comparando-se os resultados de diversos algoritmos de tradução para as proteínas conhecidas de outra espécie de planta. Para clonar os cDNAs de comprimento completo, a transcrição reversa (RT) seguida pela reação da cadeia da polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído de folhas, flores, siliquas ou outros tecidos vegetais, cultivados sob condições normais e diferentemente tratados. O RNA total foi extraído como descrito em “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA” acima. A produção de cDNA e a amplificação pela PCR foi realizada usando protocolos padrão descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque) que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os produtos de PCR são purificados usando o conjunto de purificação pela PCR (Qiagen). No caso onde a sequência codificadora inteira não foi encontrada, o conjunto RACE da Invitrogen (RACE = Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA) foi usado para avaliar o transcrito de cDNA completo do gene a partir de amostras de RNA descritas acima. Os produtos RACE foram clonados dentro de vetor de cópia alta seguido pelo sequenciamento ou diretamente sequenciados.

[00532] A informação do procedimento RACE foi usado para a clonagem da ORF de comprimento completo dos genes correspondentes.

[00533] No caso do DNA genômico ser clonado, os genes foram amplificados pela PCR direta no DNA genômico extraído do tecido de folha usando o conjunto DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104).

[00534] Usualmente, 2 conjuntos de iniciadores foram sintetizados para a amplificação de cada gene a partir de um cDNA ou uma sequência genômica; um conjunto externo de iniciadores e um conjunto interno (iniciadores de PCR abrigados). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação de PCR não resultar em um produto satisfatório para sequenciamento), um iniciador adicional (ou dois) dos iniciadores de PCR abrigados foi usado.

[00535] Para facilitar a clonagem dos cDNAs/ sequências genômicas, um 8-12 por extensão foi adicionado à 5’ de cada iniciador. A extensão de iniciador inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição foram selecionados usando dois parâmetros: (a). O sítio não existe na sequência de cDNA; e (b). Os sítios de restrição nos iniciadores avançados e reversos são planejados tal que o cDNA digerido é inserido na formação de sentido dentro do vetor binário utilizado para a transformação.

[00536] Cada produto de PCR digerido foi inserido dentro de um vetor de cópia alto pUC19 [New England BioLabs Inc] ou dentro de plasmídeos que se originam deste vetor. Em alguns casos o produto de PCR não digerido foi inserido dentro de pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

[00537] O sequenciamento dos produtos de PCR amplificados foi realizado, usando o sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Em alguns casos, depois de confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido dentro de um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 por intermédio da digestão com endonucleases de restrição apropriadas. Em qualquer caso o inserto foi seguido pela cópia única do terminador NOS (SEQ ID NO: 14481). Os produtos digeridos e o vetor plasmídico linearizado foram ligados usando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça).

[00538] Plasmídeos de alta cópia contendo os genes clonados foram digeridos com as endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com os sítios designados nos iniciadores e clonados dentro de vetores binários.

[00539] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas por um fornecedor comercial GeneArt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) geneart (dot) com/]. O DNA sintético foi planejado em silico. Os sítios de enzimas de restrição adequados foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5’ e na extremidade 3’ para permitir a clonagem mais tarde no vetor binário pQFNc a jusante do promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467).

[00540] Vetores binários usados para clonagem: O plasmídeo pPI foi construído inserindo-se uma sequência de sinal poli-(A) sintética, originaria do vetor plasmídico básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; em 4658-4811) dentro do sítio de restrição Hind-III do vetor binário pBI101,3 (Clontech, Acc. No. U12640). pGI (pBXYN) é similar ao pPI, mas o gene original na cadeia principal, o gene GUS, é substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (SEQ ID NO: 14481) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 24550, 1990). pGI foi usado no passado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente sob o Controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810_ 812 (28 de fevereiro de 1985); SEQ ID NO: 14465].

[00541] Os vetores pGI modificados [pQXNc (Figura 8); ou pQFN (Figura 2), pQFNc (Figura 2) ou pQYN 6669 (Figura 1)] são versões modificadas do vetor pGI no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita de modo que o gene e seu promotor correspondente estejam fechados para a borda direita e o gene NPTII esteja fechado para a borda esquerda.

[00542] At6669, a sequência promotora de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 14467) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante para os genes clonados, seguido pela ligação de DNA e extração de plasmídeo binário a partir das colônias de E. coli positivas, como descrito acima.

[00543] As colônias foram analisadas pela PCR usando os iniciadores abrangendo os insertos que são planejados para transpor o promotor e gene introduzidos. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00544] Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são providos na Tabela 55 abaixo.

EXEMPLO 15 PRODUÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS TRANSGÊNICAS EXPRESSANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS IDENTIFICADOS DE ALGUMAS MODALIDADES DA INVENÇÃO Métodos Experimentais

[00545] Produção de células de Agrobacterium tumefaciens abrigando os vetores binários de acordo com algumas modalidades da invenção - Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 14 acima foram usados para transformar células de Agrobacterium. Dois construtos binários adicionais, tendo apenas o At6669 ou o promotor 35S ou nenhum promotor adicional foi usado como Controles negativos.

[00546] Os vetores binários foram introduzidos nas células competentes GV301 ou LB4404 de Agrobacterium tumefaciens (cerca de 109 células/mL) pela eletroporação. A eletroporação foi realizada usando um eletroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) e programa de electroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas foram cultivadas em meio líquido LB a 28°C durante 3 horas, depois plaqueado em LB ágar suplementado com gentamicina (50 mg/L; para as cepas de Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg/L; para a cepa de Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28°C durante 48 horas. As colônias de Abrobacterium, que são desenvolvidas no meio seletivo, foram analisados ainda pela PCR usando os iniciadores planejados para transpor a sequência inserida no plasmídeo. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados para verificar que as sequências de polinucleotídeo corretas da invenção foram devidamente introduzidas nas células de Agrobacterium.Preparação de plantas arabidopsis para transformação - Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas T0) foram transformadas de acordo com o procedimento Floral Dip [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Female reproductive tissues are the primary targets of agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123(3): 895-904] com modificações menores. Resumidamente, plantas T0 de Arabidopsis thaliana Columbia (Col0) foram semeadas em vasos de 250 ml enchido com mistura de crescimento à base de turva úmida. Os vasos foram cobertos com folha de alumínio e uma cúpula de plástico, mantidos a 4°C durante 34 dias, depois descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24°C sob ciclos de claro/escuro de 16/8 horas. As plantas T0 foram prontas para transformação seis dias antes da antese.Preparação da agrobacterium carreando os vetores binários para transformação em plantas Arabidopsis - Colônias únicas de agrobacterium carreando os vetores binários abrigando os genes de algumas modalidades da invenção foram cultivados em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28°C durante 48 horas sob agitação vigorosa e centrifugadas a 4000 rpm durante 5 minutos. Os grânulos compreendendo células de Agrobacterium foram recolocadas em suspensão em um meio de transformação que contém meia concentração (2,15 g/L) de Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044 μM de benzilamino purina (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); 5% de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada, no pH de 5,7.Transformação de plantas arabidopsis com a agrobacterium - A transformação de plantas T0 foi realizada invertendo-se cada planta dentro de uma suspensão de Agrobacterium tal que o tecido de planta acima do solo fosse submergido durante 3 a 5 segundos. Cada planta T0 inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja plástica, depois coberta com cúpula plástica clara para manter a umidade e foi mantida no escuro na temperatura ambiente durante 18 horas para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformada (transgênica) foram depois descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas na estufa durante 3 a 5 semanas até que as siliquas estivessem marrom e secas, depois as sementes foram colhidas das plantas e mantidas na temperatura ambiente até a semeadura. Geração de plantas transgênicas T1 e T2 - Para gerar plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, as sementes coletadas das plantas T0 transgênicas foram esterilizadas na superfície embebendo-as em etanol a 70% durante 1 minuto, seguido pelo embebimento em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton durante 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície foram cuidadosamente lavadas em água destilada estéril depois colocadas nas placas de cultura contendo meia concentração de Murashig-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar vegetal; 50 mM de canamicina; e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C durante 48 horas depois transferidas para uma sala de crescimento a 25°C durante uma semana adicional de incubação. As plantas de Arabidopsis Vital T1 foram transferidas para uma das placas de cultura fresca para mais uma semana de incubação. A seguir da incubação as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e plantadas em mistura de crescimento contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa até a maturidade. As sementes colhidas a partir das plantas T1 foram cultivadas e desenvolvidas até a maturidade como plantas T2 sob as mesmas condições como usadas para cultivar e desenvolver as plantas T1. EXEMPLO 16 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA QUANTO AO RENDIMENTO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DE PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS DE ENSAIOS EM ESTUFA (Ensaios GH —SM) Ensaio 1: Rendimento de semente, biomassa de planta e taxa de crescimento de planta sob condições normais de estufa - Este ensaio segue a produção de rendimento de semente, a formação de biomassa e o crescimento da área da roseta das plantas cultivadas na estufa em condições de cultivo não limitantes de nitrogênio. As sementes de Arabidopsis transgênica foram semeadas em meio de ágar suplementado com ^ meio de MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas T2 transgênicas foram depois transplantadas para bandejas 1.7 cheias com turfa e perlita em uma razão 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo 6 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até sementes maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa de planta remanescente (o tecido acima do solo) também foi colhido e pesado imediatamente ou a seguir da secagem em estufa a 50°C durante 24 horas. Cada construto foi validado na sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com um construto conformado por um vetor vazio carreando o promotor At6669 e o marcador selecionável foram usadas como Controle.

[00547] As plantas foram analisadas quanto ao seu tamanho global, taxa de crescimento, florescimento, rendimento de semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (HI - rendimento de semente/matéria seca). O desempenho de plantas transgênicas foi comparado com o crescimento de plantas de Controle em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas simuladas expressando o gene repórter uidA (GUSIntron) ou absolutamente sem nenhum gene, sob os mesmos promotores que foram usados como Controle.

[00548] O experimento foi planejado na distribuição de canteiro randomizado abrigado. Para cada gene da invenção três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto.Imageamento digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste de uma câmera reflexiva digital (Canon EOS 300D) acoplada com uma lente de comprimento focal de (Série Canon EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (4 lâmpadas claras x 150 Watts) foi usado para capturar imagens das amostras de planta.

[00549] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias começando no dia 1 depois do transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em um suporte de ferro personalizado, foi usada para capturar imagens de plantas maiores semeadas em baldes brancos em uma estufa ambientalmente controlada. Os baldes que são quadrados no formato incluem bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, os baldes foram colocados em baixo da montagem de ferro, evitando a luz solar direta e a projeção de sombras.

[00550] Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste de um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - Imagem J 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística (SAS institute).

[00551] Análise de folha - Usando a análise digital os dados de folhas foram calculados, incluindo número de folha, área da roseta, diâmetro da roseta e área da lâmina da folha.

[00552] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativa (RGR) do número de folha [fórmula IX (descrita acima)], área da roseta [fórmula VIII (descrita acima)], cobertura do canteiro (fórmula XIII, abaixo) e índice de colheita [fórmula IV (descrita acima)] foi calculada com as fórmulas indicadas. Fórmula XIII Taxa de crescimento relativa da cobertura do canteiro = Coeficiente de regressão de cobertura do canteiro ao longo do curso de tempo.

[00553] Peso médio de sementes - No final do experimento todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Usando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00554] Peso seco e rendimento de semente - Em cerca de 80 dias da semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso de semente de cada canteiro foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada canteiro. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) depois de secar a 30°C em uma câmara de secagem; Rendimento de semente por planta = peso total de semente por planta (g). Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g).

[00555] O índice de colheita (HI) foi calculado usando a Fórmula IV como descrita acima.

[00556] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento todas as sementes de cada canteiro foram coletadas. As sementes de 3 canteiros foram misturadas moídas e depois montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat No. 080951 Biolab Ltd.) foram usados como o solvente. A extração foi realizada durante 30 horas em aquecimento médio de 50°C. Uma vez que a extração terminou o n-Hexano foi evaporado usando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida a partir do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler’s) 1879, 232, 461) foi usado para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O conteúdo de óleo de todas as amostras de semente foi determinada usando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra - Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00557] Análise do comprimento da siliqua - No dia 50 a partir da semeadura, 30 siliquas de plantas diferentes em cada canteiro foram amostradas no bloco A. As siliquas escolhidas foram amarelo-esverdeadas na cor e foram coletadas das partes mais baixas de uma haste da planta em desenvolvimento. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da siliqua.

[00558] Análises estatísticas - Para identificar genes e construtos com desempenho superior, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados usando o teste t de Student e os resultados são considerados significantes se o valor p foi menor do que 0,1. O pacote de software JMP statistics foi usado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

[00559] As Tabelas 56 a 60 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas exogenamente expressando os construtos de gene usando os ensaios de maturação de semente (GH-SM) sob condições normais. A avaliação de cada gene foi realizada testando-se o desempenho de números de evento diferentes. Evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significante. Tabela 56 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais de cultivo sob regulagem do promotor At6669

EXEMPLO 17 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA QUANTO AO RENDIMENTO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DE PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA ATÉ O PENDOAMENTO (ENSAIOS GH-SB) Ensaio 2: Melhora do desempenho de planta medido até o estágio de pendoamento: biomassa de planta e taxa de crescimento de planta sob condições normais de estufa (ensaios GH-SB). Este ensaio segue a formação de biomassa de planta e o desenvolvimento da área da roseta das plantas cultivadas na estufa sob condições normais de cultivo. Sementes de Arabidopsis transgênicas foram semeadas em meio de ágar suplementado com / meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram depois transplantadas para 1,7 bandejas cheias com turfa e perlita em uma razão 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo 6 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até o estágio de pendoamento. A biomassa de planta (o tecido acima do solo) foi pesado diretamente depois da colheita da roseta (peso fresco da planta [FW]). A seguir as plantas foram secadas em uma estufa a 50°C durante 48 horas e pesadas (Peso seco da planta [DW]).

[00560] Cada construto foi validado na sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com um construto conformado por um vetor vazio carreando o promotor 35S e o marcador selecionável foi usado como controle.

[00561] As plantas foram analisadas quanto ao seu tamanho global, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado com o das plantas de controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas simuladas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou absolutamente sem nenhum gene, sob o mesmo promotor foram usadas como controle.

[00562] O experimento foi planejado na distribuição de canteiro aleatória abrigada. Para cada gene da invenção três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto.

[00563] Imageamento digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste de uma câmera reflexiva digital (Canon EOS 300D) acoplada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (4 lâmpadas claras x 150 Watts) foi usado para capturar imagens das amostras de planta. O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias começando a partir do dia 1 depois do transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em um suporte de ferro personalizado, foi usado para capturar imagens de plantas maiores semeadas em baldes brancos em uma estufa ambientalmente controlada. Os baldes foram quadrados no formato e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, os baldes foram colocados em baixo da montagem de ferro, evitando-se luz solar direta e a projeção de sombras.

[00564] Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste de um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - Image J 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00565] Análise de Folha - Usando a análise digital os dados de folhas foram calculados, incluindo número de folha, área da roseta, diâmetro da roseta e área da lâmina da folha.

[00566] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativa (RGR) do número de folha (Fórmula IX, descrita acima), área da roseta (Fórmula VIII descrita acima) e cobertura do canteiro (Fórmula XIII, descrita acima) foram calculadas usando as fórmulas indicadas.

[00567] Peso Fresco e Seco de Planta - Em torno do dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e diretamente pesadas para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50°C em uma câmara de secagem durante cerca de 48 horas antes da pesagem para determinar o peso seco da planta (DW).

[00568] Análise estatística - Para identificar genes e construtos com desempenho superior, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados usando o teste t de Student e os resultados são considerados significantes se o valor p foi menor do que 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi usado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Resultados Experimentais:

[00569] As Tabelas 61 a 64 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas expressando os construtos de genes usando os Ensaios GH-SB.

[00570] Os genes listados nas Tabelas 61 a 64 melhoraram o desempenho de planta quando cultivados em condições normais. Estes genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética maior, biomassa (peso fresco, peso seco, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura do canteiro), taxa de crescimento relativa, área relativa da lâmina e área relativa do pecíolo. Os genes foram clonados sob a regulagem de um promotor constitutivo At6669 (SEQ ID NO: 14467). A avaliação de cada gene foi realizada testando-se o desempenho de números de eventos diferentes. Evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significante. Tabela 61 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais

EXEMPLO 18 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES NORMAIS USANDO ENSAIOS IN VITRO [CULTURA DE TECIDO DE PLANTAS T2 E T1, ENSAIOS TC -T2 E TC-T1]

[00571] Sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio de Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar vegetal como agente de solidificação] na presença de Canamicina (usada como um agente de seleção). Depois da semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e depois cultivadas a 25°C sob ciclos diários de 12 horas de luz 12 horas escuro por 7 a 10 dias. Neste ponto de tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas para placas contendo ^ meio MS (15 mM de N). Para os experimentos realizados nas linhagens T2, cada placa conteve 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção pelo menos quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto. Para os experimentos realizados nas linhagens T1, cada placa conteve 5 mudas de eventos transgênicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (réplicas) foram plantadas. No total, para as linhagens T1, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas expressando os polinucleotídeos da invenção foram comparados com a medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) usado no mesmo experimento.

[00572] Imageamento digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste de uma câmara reflexiva digital (Canon EOS 300D) acoplada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (4 lâmpadas claras x 150 Watts) e localizado em um quarto escuro, foi usado para capturar imagens da plântulas semeadas em placas de ágar.

[00573] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (ver por exemplo as imagens nas Figuras 3A- F). Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste de um computador de mesa pessoal (processor Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - Image J 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e gratuitamente disponível na internet no Hypertext Transfer Protocol (Protocolo de Transferência de Hipertexto)://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00574] Análise de Muda - Usando a análise digital os dados de muda foram calculados, incluindo área de folha, cobertura da raiz e comprimento de raiz.

[00575] A taxa de crescimento relativa para os diversos parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas XIV (RGR da área de folha) e XV (RGR do comprimento de raiz). Fórmula XIV: Taxa de crescimento relativa da área de folha = Coeficiente de regressão da área de folha ao longo do curso de tempo. Fórmula XV: Taxa de crescimento relativa do comprimento de raiz = Coeficiente de regressão do comprimento de raiz ao longo do curso de tempo.

[00576] No final do experimento, as plântulas foram removidas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As plântulas foram depois secadas durante 24 horas a 60°C e mais uma vez pesadas para a medição do peso seco da planta para análise estatística posterior. Os pesos fresco e seco são providos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada comparando-se a cobertura da área de folha, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais e os resultados foram usados para resolver o efeito do gene introduzido sobre o vigor da planta sob condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido sobre o acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando-se os pesos fresco e seco das plantas com aqueles das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada construto criado, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em réplicas.

[00577] Análise estatística - Para identificar genes conferindo vigor da planta significantemente melhorado ou arquitetura de raiz ampliada, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparadas com aqueles obtidos a partir das plantas de controle. Para identificar genes e construtos com desempenho superior, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene em relação a um controle os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados significantes se p < 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi usado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultados Experimentais:

[00578] As Tabelas 65 a 67 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas expressando os construtos de gene usando os Ensaios TC-T2.

[00579] Os genes apresentados na Tabela 65 mostraram uma melhora significante visto que eles produziram biomassa de planta maior (peso fresco e seco de planta) na geração T2 quando cultivados sob condições normais de cultivo, comparados com as plantas de controle. Os genes foram clonados sob a regulagem de um promotor constitutivo (At6669, SEQ ID NO: 14467). A avaliação de cada gene foi realizada testando-se o desempenho de números diferentes de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais do que um ensaio de cultura de tecido. Os resultados obtidos neste segundo dos experimentos também foram significantemente positivos.Tabela 65 Genes mostrando desempenho de planta melhorado em condições normais de cultivo sob a regulagem do promotor At6669

[00580] Os genes apresentados nas Tabelas 66 e 67 mostram uma melhora significante no desempenho da planta visto que eles produziram uma biomassa de folha (área de folha) e biomassa de raiz (comprimento de raiz e cobertura de raiz) maiores (Tabela 66) e uma taxa de crescimento relativa mais alta da área de folha, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 67) quando cultivados sob condições normais de cultivo, comparados com as plantas de controle. As plantas produzindo biomassa de raiz maior tiveram melhores possibilidades para absorver quantidades maiores de nitrogênio do solo. As plantas produzindo biomassa de folha maior tiveram melhor capacidade para produzir assimilados. Os genes foram clonados sob a regulagem de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação de cada gene foi realizada testando-se o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais do que um ensaio de cultura de tecido. Este segundo experimento confirmou o incremento significante no desempenho de folha e raiz. O evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significante. Tabela 66 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais de cultivo sob A regulagem do promotor At6669

Resultados de plantas T1

[00581] Os genes apresentados nas Tabelas 68 a 70 mostraram uma melhora significante na biomassa de planta e desenvolvimento de raiz visto que eles produziram uma biomassa mais alta (peso seco e fresco, Tabela 68), uma folha mais larga e biomassa de raiz (área de folha, comprimento de raiz e cobertura de raiz) (Tabela 69) e uma taxa de crescimento relativa mais alta da área de folha, cobertura da raiz e comprimento de raiz (Tabela 70) quando cultivados sob condições normais de cultivo, comparados com as plantas de controle. As plantas produzindo biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades para absorver maiores quantidades de nitrogênio do solo. As plantas produzindo maior folha biomassa tem melhor capacidade para produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulagem de um promotor constitutivo (At6669; SEQ ID NO: 14467). A avaliação de cada gene foi realizada testando-se o desempenho de números de eventos diferentes. Alguns dos genes foram avaliados em mais do que um ensaio de cultura de tecido. Este segundo experimento confirmou o incremento significante no desempenho de folha e raiz. O evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significante. As Tabelas 68 a 70 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas expressando os construtos de gene usando os ensaios TC-T1. Tabela 68 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais de cultivo sob regulagem do promotor A6669

Tabela 68. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Incr.” =% de incremento; “p-val.” - valor p, L- p<0,01. Os transgenes foram sob a regulagem transcricional do novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467). “-” = os resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 69 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais de cultivo sob regulagem do promotor At6669

Tabela 69. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Incr.” =% de incremento; “p-val.” - valor p, L- p<0,01. Os transgenes foram sob a regulagem transcricional do novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467). “-” = os resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 70 Genes mostrando desempenho de planta melhorado nas condições normais de cultivo sob a regulagem do promotor At6669

Tabela 70. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Incr.” =% de incremento; “p-val.” - valor p, L- p<0,01. Os transgenes foram sob a regulagem transcricional do novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 14467). “-” = os resultados ainda estão indisponíveis.

[00582] Estes resultados demonstram que os polinucleotídeos da invenção são capazes de melhorar o rendimento e traços agrícolas importantes valiosos adicionais tais como aumento de biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, rendimento, vigor, rendimento de fibra e/ou qualidade. Assim, as plantas transformadas mostrando peso fresco e seco melhorados demonstram a capacidade do gene para melhorar a biomassa um traço chave de safras para forragem e produtividade da planta; as plantas transformadas mostrando melhora de rendimento de semente demonstram a capacidade dos genes para melhorar a produtividade de planta; as plantas transformadas mostrando melhora de cobertura do lote e diâmetro da roseta demonstram a capacidade dos genes para melhorar a resistência de planta seca visto que os mesmos reduzem a perda de água do solo pela evaporação simples e reduzem a competição com ervas daninhas; consequentemente, reduzem a necessidade para usar herbicidas para controlar as ervas daninhas. As plantas transformadas mostrando melhora de taxa de crescimento relativa de diversos órgãos (folha e raiz) demonstram a capacidade do gene para promover o crescimento da planta e consequentemente, reduzirão a necessidade de período de crescimento e/ou alternativamente melhorarão a utilização de nutrientes e água disponíveis levando ao aumento de produtividade da terra; as plantas transformadas mostrando melhora de número de órgão como demonstrado pelo parâmetro do número de folha exibindo um potencial para melhorar o rendimento da biomassa importante para safras forrageiras e melhorar a produtividade da planta; plantas transformadas mostrando comprimento de raiz e cobertura aumentadas demonstram a capacidade do gene para melhorar a resistência à seca e melhor utilização de fertilizantes visto que as raízes podem atingir volume de solo maior; as plantas transformadas mostrando melhora da área relativa ao pecíolo da folha e área da lâmina da folha demonstram a capacidade dos genes para enfrentar resultados em intensidades de luz limitadas de aumentar as densidades populacionais da planta e consequentemente, melhorar a produtividade da terra.

[00583] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com as modalidades específicas da mesma, fica evidente que muitas alternativas, modificações e variações estarão evidentes para aqueles versados na técnica.Consequentemente, é pretendido abranger todas de tais alternativas, modificações e variações que caiam dentro do espírito e escopo amplo das reivindicações anexas.

[00584] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são neste incorporados em sua totalidade por referência dentro do relatório descritivo, no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados ser aqui incorporados por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste documento não devem ser interpretadas como uma admissão que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Até o grau que os cabeçalhos de seção são usados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (4)

1. Método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, caracterizado pelo fato de superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo tendo a sequencia de ácido nucleico como estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 406, que codifica o polipeptideo estabelecido pela SEQ ID NO: 764, ou susas sequências degeneradas que codificam o polipeptideo estabelecido pela SEQ ID NO: 764, ou (ii) SEQ ID NO: 152, que codifica o polipeptideo estabelecido pela SEQ ID NO: 607, ou susas sequências degeneradas que codificam o polipeptideo estabelecido pela SEQ ID NO: 607, aumentando desse modo o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 406 e 152.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ainda selecionar uma planta que superexpressa o referido polinucleotídeo para um aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor e / ou eficiência de uso de nitrogênio em comparação com uma planta de controle da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ainda selecionar uma planta que superexpressa o referido polinucleotídeo para uma biomassa e / ou taxa de crescimento aumentada em comparação com uma planta controle da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento.

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