BR122020018668B1 - Método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento da semente, rendimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou tolerância ao estresse abiótico em uma planta - Google Patents

Abstract

Apresenta polipeptídeos isolados que são pelo menos 80% homólogos às ID. DAS SEQ. Nºs: 529, 475-528, 530- 770, 6179-9796, 9798-10421, polinucleotídeos isolados que são pelo menos 80% idênticos às ID. DAS SEQ. Nºs: 314, 1-313, 315-474, 771-6178, construtos de ácido nucleico compreendendo os referidos, células transgênicas expressando os referidos, plantas transgênicas expressando os referidos e método de uso dos referidos para aumento da tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, capacidade fotossintética, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, e/ou eficiência do uso de nitrogênio de uma planta.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO

[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas configurações, se refere a polipeptídeos isolados e polinucleotídeos, construtos de ácido nucleico compreendendo os referidos, plantas transgênicas expressando os referidos e métodos de uso dos referidos para aumento da tolerância ao estresse abiótico (TEA), eficiência do uso de água (EUA), rendimento (por exemplo, quantidade e/ou qualidade do grão), rendimento da fibra, qualidade da fibra, biomassa, teor de óleo, taxa de crescimento, vigor, eficiência do uso de nitrogênio (EUN) e/ou eficiência do uso de fertilizante (EUF) de uma planta.

[002] Condições de estresse abiótico (EAB; também referido como “estresse ambiental”) tais como salinidade, seca, inundação, temperatura subótima e poluição química tóxica, causam danos substanciais a plantações agrícolas. A maioria das plantas desenvolveram estratégias para protegê-las contra essas condições. Entretanto, se a gravidade e a duração dessas condições de estresse forem muito altas, os efeitos sobre o desenvolvimento da planta, e sobre o crescimento e rendimento da maioria das plantações comestíveis são profundos. Além disso, a maioria das plantações comestíveis são altamente suscetíveis ao estresse abiótico e, dessa forma, necessitam de condições ideais de cultivo para produções agrícolas comerciais. A exposição contínua ao estresse causa grandes alterações no metabolismo da planta, o que, ao final, leva à morte das células e, consequentemente, a perdas no rendimento.

[003] Seca é um fenômeno gradual que envolve períodos anormais de clima seco que persiste por tempo suficiente para produzir sérios desequilíbrios hidrológicos, tais como danos à safra, redução do suprimento de água e aumento da susceptibilidade a diversas doenças. Em casos graves, a seca pode durar muitos anos e resultar em efeitos devastadores sobre a agricultura e sobre os suprimentos de água. Além disso, a seca está associada ao aumento da susceptibilidade a diversas doenças.

[004] Para a maioria das plantações comestíveis, as regiões de terra do mundo são muito áridas. Adicionalmente, o uso exagerado da água disponível resulta no aumento da perda de terra utilizável para a agricultura (desertificação), e o aumento do acúmulo de sal nos solos soma-se à perda de água disponível nos solos.

[005] A salinidade, altos níveis de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais safras agrícolas, a saber, trigo, milho, arroz, batatas e soja, pode tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as plantações resultam da falta de água, que leva ao estresse osmótico (similar ao estresse de seca), e do efeito do excesso de íons de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Como nas geadas e secas, o alto teor de sal causa falta de água; e a presença de alto teor de sal torna difícil para as raízes das plantas extrair água de seus ambientes. A salinidade do solo, dessa forma, é uma das variáveis mais importantes que determinam se uma planta pode florescer. Em muitas partes do mundo, superfícies de tamanho considerável são incultiváveis devido à salinidade naturalmente alta do solo. Assim, a salinação dos solos que são utilizados para produção agrícola representam um problema significativo e elevado nas regiões que dependem altamente da agricultura, e é piorado pela super utilização, super fertilização e redução do suprimento de água, causado normalmente por mudanças climáticas e pelas demandas da população crescente. A tolerância ao sal é de especial importância logo cedo no ciclo de vida das plantas, visto que a evaporação da superfície do solo causa o movimento ascendente da água, e o sal se acumula na camada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Por outro lado, a germinação normalmente ocorre em uma concentração de sal que é maior que o nível médio de sal em todo o perfil do solo.

[006] A transdução do sinal de sal e estresse de seca consiste da homeostase iônica e osmótica sinalizando rotas. O aspecto iônico do estresse de sal é sinalizado via rota de SOS (do inglês “Salt Overly Sensitive”, Sensível ao Revestimento Salínico) onde um complexo de proteína quinase SOS3-SOS2 responsiva ao cálcio controla a expressão e atividade dos transportadores de íons, tais como SOS1. O componente osmótico do estresse de sal envolve reações complexas de plantas que se sobrepõem com respostas de seca e/ou estresse do frio.

[007] Temperaturas subótimas afetam o cultivo e desenvolvimento da planta ao longo de todo o ciclo de vida da planta. Assim, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e altas temperaturas resultam em necrose da folha. Além disso, plantas maduras que são expostas ao excesso de calor podem sofrer choque térmico, o que pode ocorrer em diversos órgãos, incluindo as folhas e, especialmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse de calor. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto, e prejudica a função da membrana. O choque térmico pode produzir uma diminuição em toda a síntese proteica, acompanhado pela expressão das proteínas do choque térmico, por exemplo, acompanhantes, que estão envolvidos nas redobragens de proteínas desnaturadas pelo calor. Danos ao pólen causados por alta temperatura ocorrem quase sempre em conjunto com estresse de seca, e ocorrem raramente sob condições bem regadas. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Em condições de resfriamento excessivo, por exemplo, baixo porém acima do congelamento, as temperaturas afetam as culturas de origens tropicais, tais como soja, arroz, milho e algodão. Danos comuns do resfriamento incluem murchamento, necrose, clorose ou vazamento de íons das membranas celulares. Os mecanismo subjacentes de sensibilidade ao resfriamento ainda não estão completamente compreendidos, mas provavelmente envolve o nível de saturação da membrana e outras deficiências fisiológicas. Condições de excesso de luz, que ocorre sob condições atmosféricas claras subsequente ao final do verão/noites de outono frias, pode levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o resfriamento pode levar a perdas no rendimento e qualidade inferior do produto na maturação retardada do milho.

[008] Aspectos comuns da resposta à seca, frio e estresse salino [Revisado em Xiong e Zhu (2002) Ambiente de Célula Vegetal. 25: 131-139] inclui: (a) mudanças temporárias nos níveis de cálcio citoplasmático, precocemente, no evento de sinalização; (b) transdução de sinal via proteínas quinase ativadas por mitógenos e/ou dependentes de cálcio (CDPKs, sigla do inglês “calcium dependent protein kinases”) e proteínas fosfatases; (c) aumento nos níveis de ácido abscísico em resposta ao estresse ativando um subconjunto de respostas; (d) inositol fosfatos como moléculas de sinalização (pelo menos para um subconjunto de mudanças transcricionais responsivas ao estresse); (e) ativação de fosfolipases, as quais, por sua vez, gera uma matriz diversa de moléculas mensageiras secundárias, algumas das quais podem regular a atividade das quinases responsivas aos estresse; (f) indução de genes do tipo ambundantes na embiogenese tardia (LEA, sigla do inglês “late embryogenesis abundant”) incluindo genes COR/RD responsivos a CRT/DRE; (g) níveis elevados de antioxidantes e osmólitos compatíveis, tais como prolina e açúcares solúveis; e (h) acúmulo de espécies reativas de oxigênio, tais como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A biossíntese do ácido abscísico é regulada por estresse osmótico em etapas múltiplas. A sinalizção do estresse osmótico dependente e independente de ABA (ácido abscísico) primeiro modifica de maneira constitutiva os fatores de transcrição, levando à expressão de ativadores de resposta transcricional precoce, o que, então, ativa genes causadores de tolerância ao estresse a jusante.

[009] Diversos genes que aumentam a tolerância ao frio ou ao estresse salínico podem melhorar a proteção contra estresse à seca, incluindo, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREB1, OsCDPK7 (Saijo et al. 2000, Plant J. 23: 319-327) ou AVP1 (uma bomba de prótons vacuolar pirofosfatase, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).

[0010] Estudos mostraram que as adaptações das plantas a condições ambientais adversas são tratos genéticos complexos com natureza poligência. Meios convencionais para melhoria das colheiras e da horticultura utilizam técnicas seletivas de produção para identificar plantas apresentando caracterísitcas desejáveis. Entretanto, a produção seletiva é entediante, consome tempo e tem um resultado imprevisível. Além disso, recursos limitados de germoplasma para melhoria do rendimento e incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados na produção convencional. Avanços na engenharia genética têm permitido à humanidade modificar o germoplasma das plantas por meio da expressão de genes-de-interesse em plantas. Tal tecnologia possui a capacidade de gerar colheitas ou plantas com melhoras nos tratos econômicos, agronômicos ou de horticultura.

[0011] Os esforços da engenharia genética, visando obter tolerância ao estresse abiótico em culturas transgênicas, foram descritas em diversas publicações [Apse and Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmstrom et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110: 249-257, 1996), Pilon- Smits and Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995) and Tarczynski et al. (Science 259: 508- 510, 1993)].

[0012] Diversas patentes e pedidos de patentes divulgam genes e proteínas que podem ser utilizados para aumento da tolerância das plantas ao estresse abiótico. Estas incluime, por exemplo, os Pedidos de Patente dos EUA N.°s. 5.296.462 e 5.3566816 (para aumento da tolerância ao estresse do frio); Pedido de Patente dos EUA N.° 6.670.528 (para aumento da TEA); Pedido de Patente dos EUA N.° 6.720.477 (para aumento da TEA); Pedido de Patente de Serviços dos EUA N.°s. 09/938842 E 10/342224 (para aumento da TEA); Pedido de Patente de Serviços dos EUA. N.° 10/231035 (para aumento da TEA); WO2004/104162 (para aumento da TEA e biomassa); WO2007/020638 (para aumento da TEA, biomassa vigor e/ou rendimento); WO2007/049275 (para aumento da TEA, biomassa vigor e/ou rendimento); WO2010/076756 (para aumento da TEA, biomass e/ou rendimento); WO2009/083958 (para aumento da eficiência do uso de água, eficiência do uso de nitrogênio, tolerância ao estresse biótico/abiótico, rendimento e/ou biomassa); WO2010/020941 (para aumento da eficiência do uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento e/ou biomassa); WO2009/141824 (para aumento da utilidade da planta); WO2010/049897 (para aumento do rendimento da planta).

[0013] Faltas de nutrientes causam adaptações da arquitetura da raiz, especialmente e de forma notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de partes embutidas ricas em nutrientes para aumentar a absorsão de nutrientes. Faltas de nutrientes também causam a ativação das rotas metabólicas da planta, que maximiza os processos de absorção, assimilação e distribuição, tais como por ativação das mudanças arquiteturais. O planejamento da expressão dos genes disparados pode fazer com que a planta apresente mudanças arquiteturais e metabolismo melhorado também sob outras condições.

[0014] Além disso, é amplamente sabido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raiz profunda, que permite o acesso à umidade localizada nas camadas mais profundas do solo. Disparar esse efeito permitirá que as plantas tenham acesso aos nutrientes e a água, localizados nos horizontes mais profundos do solo, em particular aqueles prontamente dissolvidos em água, como nitratos.

[0015] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era, e continua sendo, o uso de nutrientes naturais, bem como o de nutrientes sintéticos (fertilizantes). Assim, os fertilizantes são o combustível por trás da “revolução verde”, diretamente responsável pelo aumento excepcional nos rendimentos da cultura durante os últimos 40 anos, e são considerados a despesa indireta número um na agricultura. Por exemplo, os fertilizantes nitrogenados inorgânicos, tais como nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, contabilizam tipicamente 40% dos custos associados às culturas, tais como as de milho e trigo. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K), o nitrogênio é frequentemente o elemento limitador no crescimento da planta e todas culturas do campo têm uma dependência fundamental do fertilizante nitrogenado inorgânico. O nitrogênio é responsável pela biossíntese de aminoácidos e ácidos nucleicos, de grupos prostéticos, hormônios vegetais, defesas químicas vegetais, etc. e geralmente precisa ser reposto todo ano, em particular para cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Assim, o nitrogênio é translocado ao broto, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta e até a floração. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o volume de seu nitrogênio orgânico durante o período de germinação do grão, e até a floração. Uma vez que ocorreu a fertilização da planta, o grão começa a se formar e se torna o principal sequestrador de nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser então redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram de compartimentos de armazenamento até a formação do grão.

[0016] Visto que o fertilizante é esgotado rapidamente da maioria dos tipos de solo, ele deve ser fornecido para culturas crescentes duas ou três vezes durante o período vegetativo. Além disso, a baixa eficiência de uso do nitrogênio (EUN) das culturas principais (por exemplo, na faixa de apenas 30-70%) afeta negativamente as despesas com insumos para o fazendeiro, devido ao fertilizante aplicado em excesso. Além disso, o uso excessivo e ineficiente de fertilizantes são os fatores responsáveis por problemas ambientais, tais como eutrofização de águas subterrâneas, lagos, rios e mares, poluição por nitrato na água potável, que pode causar metemoglobinemia, poluição por fosfato, poluição atmosférica e similares. Entretanto, apesar do impacto negativo dos fertilizantes ao meio ambiente, e dos limites sobre o uso do fertilizante, que foram sancionados em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente, a fim de suportar a produção de alimentos e fibras para o crescimento rápido da população em recursos terrestres limitados. Por exemplo, foi estimado que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizante nitrogenado serão utilizadas anualmente em todo o mundo.

[0017] A eficiência de uso aumentada do nitrogênio pelas plantas deve permitir que as culturas sejam cultivadas com baixos insumos de fertilizante, ou alternativamente cultivadas em solos de qualidade mais pobre e teria, portanto, impacto econômico significativo, tanto nos sistemas agrícolas desenvolvidos como nos em desenvolvimento.

[0018] A melhora genética da eficiência do uso de nitrogênio (EUN) nas plantas pode ser gerada ou por reprodução tradicional ou por engenharia genética.

[0019] Tentativas de gerar plantas com EUN aumentado foram descritas na Patente Dos EUA Pedido Publicação N°. 20020046419 (Patente Dos EUA N° 7,262,055 para Choo, et al.); Patente Dos EUA Pedido No. 20050108791 para Edgerton et al.; Patente Dos EUA Pedido N° 20060179511 para Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[0020] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 2004 101:7833-8) descreve as plantas transgênicas Dof1 que apresentam crescimento melhorado sob condições de nitrogênio baixas.

[0021] Patente Dos EUA N° 6,084,153 para Good et al. apresenta o uso de stress responsive promoter para controlar a expressão de Alanina Amino Transferase (AlaAT) e plantas de canola transgênicas com tolerância melhorada à seca e à deficiência de nitrogênio quando comparadas a outras plantas.

[0022] O rendimento é afetado por vários fatores, tais como o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramos), o comprimento definido dos grãos, o número de grãos cheios, o vigor (por exemplo, muda), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização da água, nutrientes (por exemplo, nitrogênio) e fertilizantes, e tolerância ao estresse.

[0023] Culturas tais como milho, arroz, trigo, canola e soja, contabilizam mais da metade da ingestão calórica humana, seja por meio do consumo direto das sementes em si ou por meio do consumo de produtos cárneos criados de sementes processadas ou forragem. As sementes são também uma fonte de açúcares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A capacidade de aumentar o rendimento da planta, seja por meio do aumento da taxa de acumulação de matéria seca, modificando a composição dacelulose ou da lignina, aumento da resistência do caule, ampliação do tamanho do meristema, alteração do padrão de ramificação da planta, elevação das folhas, aumento na eficiência da fertilização, taxa de acumulação de matéria seca da semente aumentada, modificação do desenvolvimento da semente, preenchimento melhorado da semente ou pelo aumento do teor de óleo, fécula ou proteína nas sementes, teriam muitas aplicações em usos agrícolas e não agrícolas, tais como na produção biotecnológica de medicamentos, anticorpos ou vacinas.

[0024] Óleos vegetais ou de sementes são a principal fonte de energia e nutrição na dieta humana e na animal. Eles também são utilizados para a produção de produtos industriais, tais como tintas para pintura, tintas e lubrificantes. Além disso,os óleos vegetais representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa, que podem ser utilizados como combustível. Visto que os combustíveis fósseis utilizados atualmente são recursos finitos e estão sendo esgotados gradualmente, as culturas de biomassa de crescimento rápido podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou para matéria- prima energética e podem reduzir a dependência de fontes de energia fósseis. Entretanto, o principal entrave para o aumento do consumo de óleos vegetais como biocombustíveis é o preço do óleo, que ainda é maior que o do combustível fóssil. Além disso, a taxa de produção de óleo da planta é limitada pela disponibilidade de terras agrícolas e água. Deste modo, o aumento dos rendimentos do óleo da planta a partir da mesma área de crescimento podem superar efetivamente a escassez no espaço de produção e podem diminuir os preços do óleo vegetal ao mesmo tempo.

[0025] Os estudos voltados ao aumento dos rendimentos do óleo da planta focam na identificação dos genesenvolvidos no metabolismo do óleo, bem como nos genes capazes de aumentar os rendimentos da planta e da semente nas plantas transgênicas. Os genes conhecidos por estarem envolvidos no aumento dos rendimentos do óleo da planta inclui aqueles participantes na síntese ou no sequestro de ácidos graxos, tais como desaturase [por exemplo, DELTA6, DELTA12 or acyl-ACP (Ssi2; Arabidopsis Information Resource [Recurso de Informações sobre Arabidopsis](TAIR; Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/), TAIR N° AT2G43710)], OleosinA (TAIR No. AT3G01570) or FAD3 (TAIR N° AT2G29980), e vários fatores de transcrição e ativadores, tais como Lec1 [TAIR N° AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26;93(7): 1195-205], Lec2 [TAIR N° AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR N° AT3G26790), ABI3 [TAIR N° AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wri1 [TAIR N° AT3G54320, Cernac and Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575-85].

[0026] Os esforços da engenharia genética voltados ao aumento do teor de óleo nas plantas (por exemplo, nas sementes) incluem retículo endoplásmico aumentado (FAD3) e desaturases plastidais (FAD7) de ácidos graxos na batata (Zabrouskov V., et al., 2002; Physiol Plant. 116:172-185); superexpressando os fatores de transcrição GmDof4 e GmDof11 (Wang HW et al., 2007; Plant J. 52:716-29); superexpressando uma glicerol-3-fosfato desidrogenase da levedura sob o controle de um promotor específico da semente (Vigeolas H, et al. 2007, Plant Biotechnol J. 5:431-41; Patente dos EUA Pedido N° 20060168684); utilizando genes FAE1 da Arabidopsis e SLC1-1 da levedura SLC1-1 para melhoras no teor de ácido erúcico e de óleo na colza (Katavic V, et al., 2000, Biochem Soc Trans. 28:935-7).

[0027] Vários pedidos de patente apresentam genes e proteínas que podem aumentar o teor de óleo nas plantas. Elas incluem, por exemplo, a Patente dos EUA Pedido N° 20080076179 (proteína do metabolismo lipídico); Patente dos EUA Pedido N° 20060206961 (o polipeptídeo Ypr140w); Patente dos EUA Pedido N° 20060174373 [proteína melhoradora da síntese de triaciglicerol (TEP)]; Patente dos EUA Pedido Nos 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943 (apresentam plantas transgênicas com eficiência de uso do nitrogênio melhorada, que podem ser utilizadas para a conversão a combustível ou matérias-primas químicas); WO2008/122980 (polinucleotídeos para aumento do teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor de uma planta).

[0028] O algodão e os subprodutos do algodão proporcionam matérias primas que são utilizadas para produzir uma riqueza de produtos com base no consumo, além de têxteis, incluindo produtos alimentícios de algodão, alimentação do gado, fertilizante e papel. A produção, comercialização, consumo e negociação dos produtos de algodão gera um excesso de $100 bilhões anualmente só nos EUA, fazendo do algodão a cultura de valor agregado número um.

[0029] Embora 90% do valor do algodão como uma cultura resida na fibra (fiapo), o rendimento e a qualidade da fibra declinaram devido à erosão geral na diversidade genética das variedades do algodão, e uma vulnerabilidade aumentada da cultura às condições ambientais.

[0030] Existem muitas variedades de plantas de algodão, das quais as fibras de algodão com uma gama de características podem ser obtidas e utilizadas para várias aplicações. As fibras de algodão podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, das quais algumas são consideradas altamente desejáveis dentro da indústria têxtil para a produção de produtos de qualidade elevada e exploração otimizada das tecnologias modernas de rotação. As propriedades comercialmente desejáveis incluem comprimento, uniformidade do comprimento, finura, coeficiente de amadurecimento, produção diminuída de fibras de penugem, micronaire, resistência do fardo e resistência da fibra simples. Muito esforço foi posto na melhora das características das fibras de algodão, voltado pricipalmente ao comprimento da fibra e à finura da fibra. Em particular, existe uma grande demanda para fibras de algodão de comprimentos específicos.

[0031] Uma fibra de algodão é composta de uma única célula que se diferenciou de uma célula epidermal da casca da semente, desenvolvendo-se por meio de quatro estágios, a saber, estágios de iniciação, alongamento, espessamento da parede secundária da célula e maturação. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão começa na célula epidermal do óvulo imediatamente após a floração, depois da qual a fibra de algodão alonga-se rapidamente por aproximadamente 21 dias. O alongamento da fibra é então terminado, e uma parede secundária da célula é formada e crescida por meio da maturação para se tornar uma fibra de algodão madura.

[0032] Diversos genes candidatos, que estão associados com o alongamento, a formação a qualidade e rendimento das fibras de algodão foram apresentados em vários pedidos de patente, tais como a Patente dos EUA N° 5.880.100 e pedidos de patente dos EUA Ser. Nos 08/580.545, 08/867.484 e 09/262.653 (descrevendo os genes envolvidos no estágio de alongamento da fibra de algodão); WO0245485 (melhorando a qualidade da fibra pela modulação de sacarose sintase); Patentes dos EUA N° 6.472.588 e WO0117333 (aumentando a qualidade da fibra pela transformação com um DNA codificando uma sacarose fosfato sintase); WO9508914 (utilizando um promotor específico da fibra e uma sequência codificadora que codificam a peroxidase do algodão); WO9626639 (utilizando uma sequência promotora específica do dovário para expressar os hormônios modificadores do crescimento da planta no tecido do óvulo do algodão, para alterar as características da qualidade da fibra, tais como a dimensão e a resistência da fibra); Patente dos EUA N° 5.981.834, Patente dos EUA N° 5.597.718, Patente dos EUA N° 5.620.882, Patente dos EUA N° 5.521.708 e Patente dos EUA N° 5.495.070 (sequências codificadoras para alterar as características da fibra das plantas transgênicas produtoras de fibra); pedidos de patente dos EUA 2002049999 e EUA 2003074697 (expressando uma codificação do gene para endoxiloglucano transferase, catalase ou peroxidase para melhora das características da fibra de algodão); WO 01/40250 (melhorando a qulidade da fibra de algodão pela modulação da expressão gênica do fator de transcrição); WO 96/40924 (uma região regulatória da iniciação transcricionalda fibra de algodão que é expressa na fibra de algodão); EP0834566 (um gene que controla o mecanismo de formação de fibra na planta de algodão); WO2005/121364 (melhorando a qualidade da fibra de algodão pela modulação da expressão gênica); WO2008/075364 (melhorando a qualidade da fibra,o rendimento/biomassa/vigor e/ou a tolerância ao estresse abiótico das plantas).

[0033] A publicação WO N° 2004/104162 apresenta métodos de aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa nas plantas e plantas geradas desse modo.

[0034] A publicação WO N° 2004/111183 apresenta sequências de nucleotídeos para regular a expressão gênica nos tricomas e construtos da planta e métodos que utilizem os referidos.

[0035] A publicação WO N° 2004/081173 apresenta sequências regulatórias derivadas da planta nova e construtos e métodos de uso de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotídeo nas plantas.

[0036] A publicação WO N° 2005/121364 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos referidos para melhora na qualidade da fibra, o rendimento e/ou a biomassa de uma planta produtora de fibras.

[0037] A publicação WO N° 2007/049275 apresenta polipeptídeos isolados, polinucleotídeos codificando os referidos, plantas transgênicas expressando os referidos e métodos de uso dos referidos para aumento da eficiência de uso do fertilizante, tolerância ao estresse abiótico e biomassa da planta.

[0038] A publicação WO N° 2007/020638 apresenta métodos de aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa nas plantas e nas plantas geradas desse modo.

[0039] A publicação WO N° 2008/122980 apresenta construtos de genes e métodos para aumento do teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa das plantas.

[0040] A publicação WO N° 2008/075364 apresenta polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos referidos.

[0041] A publicação WO N° 2009/083958 apresenta métodos de aumento da eficiência do uso de água, da eficiência de uso do fertilizante, tolerância ao estresse biótico/abiótico, rendimento e biomassa na planta e nas plantas geradas desse modo.

[0042] A publicação WO N° 2009/141824 apresenta polinucleotídeos isolados e métodos de uso dos referidos para aumento da utilidade da planta.

[0043] A publicação WO N° 2009/013750 apresenta genes, construtos e métodos de aumento da tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou rendimento nas plantas geradas desse modo.

[0044] A publicação WO N° 2010/020941 apresenta métodos de aumento da eficiência de uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento e biomassa nas plantas e nas plantas geradas desse modo.

[0045] A publicação WO N° 2010/076756 apresenta polinucleotídeos isolados para aumento da tolerância ao estresse abiótico, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência de uso do nitrogênio de uma planta.

[0046] A publicação WO2010/100595 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento da planta e/ou características agrícolas.

[0047] A publicação WO N° 2010/049897 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência de uso do nitrogênio.

[0048] A publicação WO2010/143138 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento da eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso do fertilizante, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso da água.

[0049] A publicação WO N° 2011/080674 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência de uso do nitrogênio.

[0050] A publicação WO2011/015985 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos para aumento das qualidades desejáveis da planta.

[0051] A publicação WO2011/135527 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados para aumento do rendimento da planta e/ou características agrícolas.

[0052] A publicação WO2012/028993 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento da eficiência de uso do nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[0053] A publicação WO2012/085862 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidospara melhora das propriedades da planta.

[0054] A publicação WO2012/150598 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência de uso do nitrogênio.

[0055] A publicação WO2013/027223 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento da planta e/ou características agrícolas.

[0056] A publicação WO2013/080203 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento da eficiência de uso do nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[0057] A publicação WO2013/098819 apresenta polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, e métodos de uso dos referidos para aumento do rendimento das plantas.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0058] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico ao N° DE ID. DAS SEQ.: 475-770, 6179-9796, 9798-10420 ou 10421, assim aumentando o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0059] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID. DAS SEQ.: 475-770 e 6179-10421, aumentando assim o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0060] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de produção de uma cultura compreendendo o crescimento de uma plantação comestível transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo pelo menos 80% homolóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consisite dos NOS DE ID. DAS SEQ.: 475-770, 6179-9796 e 9798-10421, onde a plantação comestível é derivada das plantas selecionadas para rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, capacidade fotossintética aumentada, eficiência de uso do nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada em comparação com uma planta do tipo silvestre da mesma espécie, que cresce sob as mesmas condições de crescimento, e a plantação comestível tendo o rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, capacidade fotossintética aumentada, eficiência de uso do nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada, produzindo assim a cultura.

[0061] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% idêntica ao N° DE ID DA SEQ: 1-474, 771-6177 ou 6178, aumentando assim o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0062] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste do sNOS DE ID. DAS SEQ.:1-474 e 771-6178, aumentando assim o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0063] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de produção de uma cultura compreendendo o crescimento de uma plantação comestível transformada com um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID. DAS SEQ.:1-474 and 771-6178, onde a plantação comestível é derivada das plantas selecionadas para rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, capacidade fotossintética aumentada, eficiência de uso do nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada em comparação a uma planta do tipo silvestre da mesma espécie, que cresce sob as mesmas condições de crescimento, e a plantação comestível tendo o rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, capacidade fotossintética aumentada, eficiência de uso do nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada, produzindo assim a cultura.

[0064] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos estabelecida no ID. DA SEQ. N°: 475-770, 6179-9796, 9798-10420 ou 10421, onde a referida sequência de aminoácidos é capaz de aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0065] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID. DAS SEQ.: 475-770 e 6179-10421.

[0066] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% idêntica aos NOS DE ID. DAS SEQ.: 1-474 e 771-6178, onde a referida sequência de ácidos nucleicos é capaz de aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0067] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID. DAS SEQ.: 1-474 e 771-6178.

[0068] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção, e um promotor para direcionar a transcrição da referida sequência de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira.

[0069] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga ao N° DE ID. DAS SEQ.: 475-770, 6179-9796, 9798-10420 ou 10421, onde a referida sequência de aminoácidos é capaz de aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0070] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID. DAS SEQ.: 475-770 e 6179-10421.

[0071] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma célula vegetal expressando exogenamente o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, ou o construto de ácido nucleico de algumas configurações da invenção.

[0072] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma célula vegetal expressando exogenamente o polipeptídeo de algumas configurações da invenção.

[0073] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucleicos codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID DE SEQ 475-770 e 6179-10421.

[0074] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucleicos é selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID DE SEQ 1-474 e 771-6178.

[0075] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID DE SEQ 1-474 e 771-6178.

[0076] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucleicos codifica a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste dos NOS DE ID DE SEQ 475-770 e 6179-10421.

[0077] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula vegetal forma parte de uma planta.

[0078] De acordo com algumas configurações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta expressando o referido polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.

[0079] De acordo com algumas configurações da invenção, o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo que consiste de salinidade, seca, estrese osmótico, privação de água, inundação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, deficiência de nitrogênio, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0080] De acordo com algumas configurações da invenção, o rendimento compreende o rendimento da semente ou o rendimento do óleo.

[0081] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é apresentada uma planta transgênica compreendendo construções de ácido nucleico, de algumas configurações desta invenção ou, a célula vegetal de algumas configurações desta invenção.

[0082] De acordo com algumas configurações da invenção, o método também compreende o cultivo de plantas expressando os mencionados polinucleotídeos exógenos sob condições limitantes de nitrogênio.

[0083] De acordo com algumas configurações da invenção o promotor é heterólogo ao referido polinucleotídeo isolado e/ou à referida célula hospedeira.

[0084] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é apresentado um método de cultura, o método compreendendo semeadura de sementes e/ou plantio de plântulas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção ou, com o construto do ácido nucléico de algumas configurações da invenção, caracterizado pelo fato de que a planta é derivada de plantas selecionadas de pelo menos uma característica, selecionada a partir de um grupo consistindo de: eficiência do uso de nitrogênio aumentada, capacidade fotossintética aumentada, tolerância ao estresse abiótico aumentada, biomassa aumentada, taxa de crescimento aumentada, vigor aumentado, rendimento aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado e teor de óleo aumentado, em comparação com uma planta não transformada, dessa forma desenvolvendo a colheita.

[0085] De acordo com algumas configurações da invenção a planta não-transformada é uma planta do tipo selvagem com um histórico genético idêntico. De acordo com algumas configurações da invenção a planta não- transformada é um uma planta do tipo selvagem de mesma espécie.

[0086] De acordo com algumas configurações da invenção a planta não-transformada é um uma planta do tipo selvagem que é cultivada sob condições idênticas.

[0087] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é apresentado um método de produção de uma colheita compreendendo o cultivo de uma plantação comestível transformada com um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo pelo menos 80% homólogo à sequência de aminoácido selecionada a partir de um grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475-770, 6179-9796, 9798- 10420 ou 10421, caracterizado pelo fato de que a plantação comestível é derivada de plantas selecionadas para o rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, a capacidade fotossintética aumentada, eficiência do uso de nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada, em comparação com uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, que está sendo cultivada sob as mesmas condições, e a plantação comestível tendo o rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentada, capacidade fotossintética aumentada, eficiência do uso de nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentado, produzindo dessa forma a colheita.

[0088] De acordo com algumas configurações da presente invenção é apresentado um método de produção de uma colheita compreendendo o crescimento de uma plantação transformada com um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo selecionado a partir de um grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421, caracterizado pelo fato de que a plantação comestível é derivada de plantas selecionadas para rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado, a capacidade fotossintética aumentada, eficiência do uso de nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada, em comparação com uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, que está sendo cultivada sob as mesmas condições, e a plantação comestível, com o rendimento aumentado, taxa de crescimento aumentada, biomassa aumentada, vigor aumentado, teor de óleo aumentado, rendimento da semente aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentada, capacidade fotossintética aumentada, eficiência do uso de nitrogênio aumentada e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentado, produzindo dessa forma a colheita.

[0089] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é apresentado um método de cultura, o método compreendendo semeadura de sementes e/ou plantio de plântulas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção ou, com o construto de ácido nucléico de algumas configurações da invenção, caracterizado pelo fato de que a planta é derivada de plantas selecionadas por pelo menos um trato selecionado a partir de um grupo consistindo de: eficiência do uso de nitrogênio aumentada, capacidade fotossintética aumentada, tolerância ao estresse abiótico aumentada, biomassa aumentada, taxa de crescimento aumentada, vigor aumentado, rendimento aumentado, rendimento da fibra aumentado, qualidade da fibra aumentada, comprimento da fibra aumentado e teor de óleo aumentado, em comparação com uma planta não transformada, dessa forma desenvolvendo a colheita.

[0090] Salvo indicação contrária, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por um perito na arte à qual o invento pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalente aos descritos no presente instrumento possam ser utilizados para a prática ou teste das configurações desta invenção, exemplos de métodos e / ou materiais são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo suas definições, são as vigentes. Além disso, os materiais métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não destinam a ser necessariamente restritivos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0091] Algumas configurações desta invenção descritas neste documento, a título de exemplo apenas, mencionarão os desenhos anexos. Com referência específica ao desenho em evidência, ressalta-se que as particularidades apresentadas são apenas exemplos e têm o propósito de ilustrar a discussão das configurações da invenção. A este respeito, a descrição realizada com estes desenhos torna evidente para os peritos na arte de como as configurações da invenção podem ser praticadas.

Nos desenhos:

[0092] A figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID. DAS SEQ. N°s: 10446) e o GUSintron (pQYN 6669) utilizados para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB - T-DNA região direita; LB - T- DNA região esquerda; MCS - Local de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina-sintase; NPT-II = gene da neomicina- fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron). As sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no vetor substituindo o gene repórter GUSintron.

[0093] A figura 2 Ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID. DAS SEQ. N°s: 10446) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB - T-DNA região direita; LB - T-DNA região esquerda; MCS - Local de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina-sintase; NPT-II = gene da neomicina-fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; PolyA signal (sinal de poliadenilação), as sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no MCS do vetor.

[0094] As figuras 3A-F - Imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento de raízes de plantas transgênicas que expressam de forma exógena o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob estresse osmótico normal (FIGs. 3A-B), (15% PEG; FIGs. 3C-D) ou as condições limitante de nitrogênio (FIGs. 3E-F). Os diferentes trangenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias em viveiro e 10 após transplante). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias, iniciando-se no dia 1 após o transplante. FIG. 3A - Imagem de uma foto das plantas tiradas 10 dias após o transplante em placas de ágar, quando cultivado sob condições normal (padrão) FIG. 3B - Imagem da análise da raiz apresentada na FIG. 3A, onde os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. FIG. 3C - Imagem de uma foto das plantas tiradas após 10 dias do transplante em placas de ágar, cultivo sob condições osmóticas elevadas (PEG 15%) FIG. 3D - Imagem da análise da raiz apresentada na FIG. 3C onde os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. FIG. 3E - Imagem da fotografia das plantas tirada após 10 dias do transplante em placas ágar, com cultivo sob condições de baixo nitrogênio. FIG. 3F - Imagem da análise da raiz das plantas apresentadas na FIG. 3E onde os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.

[0095] A figura 4 É uma ilustração esquemática do plasmídeo binário alterado pGI contendo o promotor de raiz (pQNa RP) utilizado para expressar as sequências dos polinucleotídeos da invenção. RB - T-DNA região direita; LB - T-DNA região esquerda; NOS pro = promotor da nopalina-sintase; NPT- II = gene da neomicina- fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); As sequências do polinucleotídeo isolado, de acordo com algumas configurações da invenção foram clonadas no MCS (Local de clonagem múltipla) do vetor.

[0096] A figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN.

[0097] A figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.

[0098] A figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.

[0099] A figura 8 É uma ilustração esquemática do plasmídeo binário alterado pGI (pQXNc) utilizado para demonstrar as sequências do polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção. RB - T-DNA região direita; LB - T-DNA região esquerda; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina-fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor de 35S (pQFNC; da ID. DAS SEQ. N°s: 10442). As sequências do polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção foram clonadas no MCS (Local de clonagem múltipla) do vetor.

DESCRIÇÃO DE CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[00100] A presente invenção em algumas configurações da mesma, refere-se a polipeptídeos isolados e polinucleotídeos, construções de ácido nucleico que compreendem os polipeptídeos isolados , as plantas transgênicas que expressam o referido e, os método de uso do referido para aumentar a tolerância ao stress abiótico (ABST), eficiência do uso da água (WUE), rendimento (ex. quantidade ou qualidade de grãos), rendimento de fibra, qualidade de fibra, biomassa, teor de óleo, taxa de crescimento, capacidade fotossintética, vigor, eficiência no uso de nitrogênio (NUE) e/ ou eficiência no uso de fertilizante (FUE) de uma planta.

[00101] Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção detalhadamente, deve ser compreendido que a invenção não está necessariamente limitada à sua aplicação aos detalhes apresentados na descrição a seguir ou exemplificados pelos exemplos. A invenção é capaz de abranger outras configurações ou de ser praticada ou executada de diversas outras maneiras.

[00102] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para gerar construções de ácido nucleico e plantas transgênicas, bem como para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso da água, (ex. rendimento de sementes), taxa de crescimento, capacidade fotossintética, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, comprimento, eficiência no uso de nitrogênio e/ ou eficiência no uso de fertilizantes em uma planta.

[00103] Conforme apresentado na seção de exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas bioinformáticas para identificar polinucleotídeos e polipeptídeos que aumentam a tolerância ao estresse abiótico, rendimento (ex. rendimento de semente, rendimento de óleo e teor de óleo e/ou fertilizantes (ex. nitrogênio) eficiência de uso de uma planta. Genes que afetam as características de interesse foram identificadas (ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 para polipeptídeos e ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 para polinucleotídeos) baseado na expressão de perfis genéticos de diversas variedades de Sorgo (Exemplos 2-5 na seção de exemplos que segue), Híbridos de milho (Exemplo 6-9 na seção de exemplos que segue), variedades de Painço (Exemplo 10 na seção de exemplos que segue), Adições de cevada (Exemplos 11-12 na seção de exemplos que segue), variedades de tomate (Exemplo 13 na seção de exemplos que segue), variedades de soja (Exemplo 14 na seção de exemplos que segue), linhas de algodão (Exemplo 15 na seção de exemplos que segue), e ecótipos e tecidos de Arabidopsis (Exemplos16 e17 na seção de exemplos que segue), homologia com genes conhecidos por afetar as característica de interesse e, a utilização de perfil de expressão digital em tecidos e condições específicas (Quadro 1-151, Exemplos 1-18 na seção de exemplos que segue). Homólogos (ex., ortologia) polinucleotídeos e polipeptídeos que possuem a mesma função também foram identificados:(ID. DAS SEQ. N°s: 6179-10421 para os polipeptídeos e da ID. DAS SEQ. N°s: 771-6178 para os polinucleotídeos; quadro152, Exemplo 19 na seção de exemplos que segue). Foram geradas plantas transgênicas sobreexpressando os polinucleotídeos e polipeptídeos identificados (Exemplos 20-22 na seção de exemplos que segue) e, descobriu-se que possuíam um aumento da tolerância às condições de estresse abiótico (ex. estresse hídrico, estresse salino e estresse osmótico), aumento do rendimento ex., rendimento de semente, peso de 1000 sementes, índice de colheita), aumento da biomassa (ex., peso fresco e seco, área rosácea), aumento do vigor e taxa de crescimento (ex. taxa de crescimento relativa), aumento da capacidade fotossintética (ex. superfície foliar, quantidade de folhas), evasão de seca (ex. floração precoce e surgimento de inflorescência), e aumento da eficiência de uso do nitrogênio (Quadros 154-181, Exemplos 23-25 na seção de exemplos que segue) quando comparadas à plantas cultivadas some mesmas condições. Juntos, estes resultados sugerem o uso de novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção [ex., ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421 (para os polipeptídeos) e ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178 (para os polinucleotídeos) para o aumento do rendimento [(ex. rendimento de óleo, rendimento de semente e teor de óleo)], taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso da água, e tolerância ao estresse abiótico da planta. Desse modo de acordo com o aspecto de algumas configurações da invenção, é apresentado um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, rendimento, rendimento de semente, rendimento da fibra, qualidade, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou eficiência no uso de fertilizantes (ex., eficiência no uso de nitrogênio) da planta, compreendendo a expressão dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de pelo menos 80%,pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou até 100% homologo à sequência de ácido amino selecionada do grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475770 e 6179-10421, deste modo, aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00104] Conforme aqui contida, a frase "rendimento da planta" refere- se ao montante (ex. determinado por peso ou tamanho) ou quantidade (número) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por período de cultivo. Portanto, o aumento no rendimento pode afetar os benefícios econômicos que podem ser obtidos pelo cultivo da planta em determinadas áreas e/ou período de cultivo.

[00105] Cabe notar que o rendimento da planta pode ser afetado por diversos parâmetros, incluindo, mas não limitado a: biomassa da planta, vigor da planta, taxa de crescimento, rendimento da semente, quantidade de semente ou grão, rendimento do óleo, teor do óleo, amido e/ou proteína nos órgãos colhidos (ex. sementes ou partes vegetativas da planta), quantidade de flores (brotos) por panículo (indicadas como uma porcentagem da quantidade de sementes por panícula primária); índice de colheita; quantidade de plantas cultivadas por área, quantidade e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área, quantidade de plantas por área de cultivo, (densidade), quantidade de órgãos colhidos no campo; total da área foliar; assimilação de carbono e divisão do carbono (distribuição/alocação do carbono na planta); resistência à sombra, quantidade de órgãos cultiváveis (ex. sementes), sementes por cápsula, peso por semente, e arquitetura modificada como[aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhora das propriedades físicas. (Ex. elasticidade)].

[00106] Conforme aqui utilizada a frase "rendimento da semente" refere-se à quantidade ou peso das sementes por planta, sementes por cápsula ou por área de cultivo ou pelo peso de uma única semente ou ao óleo extraído por semente. Portanto, o rendimento da semente pode ser prejudicado pelas dimensões da semente (ex. comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), quantidade de semente (enchimento) e taxa de enchimento de sementes e por teor de óleo por semente. Portanto, o aumento do rendimento da semente pode afetar os benefícios econômicos que podem ser obtidos do cultivo da planta em determinadas áreas e/ou período de cultivo. E, o aumento do rendimento da semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se a quantidade de plantas cultivadas em uma mesma área.

[00107] O termo "semente" (também chamado como "grão" ou "núcleo") conforme aqui utilizado, refere-se a uma pequena planta embrionária encapsulada em uma capa chamada casca da semente (geralmente, com algum alimento armazenado), o produto do óvulo maduro das plantas gimnosperma e angiosperma que ocorrem após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[00108] A frase "teor de óleo" conforme aqui mencionado, refere-se à quantidade de lipídios em um determinado órgão da planta, seja ele a semente (teor do óleo da semente) ou a parte vegetativa da planta (teor do óleo da parte vegetativa) e geralmente é descrito como uma porcentagem do peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a parte vegetativa).

[00109] Cabe notar que o teor do óleo é afetado pela produção intrínseca do óleo de um tecido (ex. semente, parte vegetativa), bem como a massa ou o tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de crescimento.

[00110] Em uma configuração, o aumento do teor de óleo da planta pode ser obtido aumentando-se o tamanho/massa do (s) tecido (s) da planta que contém o óleo por período de crescimento. Desse modo, o aumento do teor do óleo de uma planta pode ser obtido aumentando-se o rendimento, taxa de crescimento, biomassa e vigor da planta.

[00111] Conforme aqui utilizada, a frase "biomassa da planta" refere-se à quantidade (ex. calculada em grãos de tecido seco) de um tecido produzido pela planta em um período de cultivo, que também determina ou afeta o rendimento da planta ou o rendimento por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ser realizado na planta toda ou em algumas partes da mesma, tais como, partes de superfície (cultiváveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[00112] Em uma configuração, o aumento do teor de óleo da planta pode ser obtido aumentando-se o tamanho/massa do (s) tecido (s) da planta que contém o óleo por período de crescimento. Desse modo, o aumento do teor do óleo de uma planta pode ser obtido aumentando-se o rendimento, taxa de crescimento, biomassa e vigor da planta.

[00113] Conforme aqui utilizada, a frase "biomassa da planta" refere-se à quantidade (ex. calculada em grãos de tecido seco) de um tecido produzido pela planta em um período de cultivo, que também determina ou afeta o rendimento da planta ou o rendimento por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ser realizado na planta toda ou em algumas partes da mesma, tais como, partes de superfície (cultiváveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[00114] A melhoria no vigor precoce é um importante objetivo do modernos programas de cultivo de arroz, tanto nos campos em clima temperado quanto tropical. Raízes compridas são importante para garantir uma maior fixação no solo no caso de arroz semeado em várzea. NO caso onde o arroz é semeado diretamente nos campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente pela água, brotos longos são associados ao vigor. Em casos onde o plantio por semeadeiras é praticado, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para o surgimento de boas mudas. A capacidade de estimular o vigor precoce utilizando-se a engenharia, é muito importante para a agricultura. Por exemplo, vigor precoce fraco tem sido uma limitação à introdução de amidos híbridos (Zea mays L.) baseados em germoplasmas do Cinturão do milho da região euro-atlântica.

[00115] Cabe notar que o rendimento da planta pode ser determinado sob estresse (ex., estresse abiótico, condições limitadoras de nitrogênio) e/ou condições de não-estresse (normal).

[00116] Conforme aqui utilizada a frase "condições de não-estresse" refere-se às condições de crescimento (ex. água, temperatura, ciclos noite-dia, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, provisão de nutrientes tais como nitrogênio, fósforo e/ou potássio) que não sofrem muita alteração além do cotidiano climático e outras condições abióticas que as plantas tenham que enfrentar e, que permitam o crescimento ideal, o metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida (ex. em uma safra da planta de sua semente a uma planta madura e o retorno para uma semente novamente). Alguém conhecedor da arte que estamos abordando, sabe quais são as condições normais de solo e clima para uma determinada planta e localização geográfica. Cabe notar que enquanto as condições de não-estresse podem incluir algumas variações leves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de planta para outra), tais variações não causam o cessamento do crescimento da planta sem a capacidade de retomar o crescimento.

[00117] A frase " estresse abiótico" conforme aqui utilizada, refere-se à qualquer efeito adverso no metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade da planta. Logo, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambiental subótimas tais como, por exemplo, salinidade, estresse osmótico, privação de água, seca, alagamento, resfriamento, baixa ou alta temperatura, alta toxidade de metal, anaerobioses, deficiência de nutrientes (ex. deficiência de nitrogênio ou limitação de nitrogênio), poluição atmosférica e radiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas nas seção relativa ao contexto.

[00118] A frase "tolerância ao estresse abiótico" conforme aqui utilizada, refere-se à capacidade de uma planta de resistir ao estresse abiótico sem sofrer um substancial alteração em seu metabolismo, crescimento, produtividade e /ou viabilidade.

[00119] As plantas estão sujeitas a diversos desafios ambientais. Muitos deles, incluindo estresse de sal, estresses osmóticos gerais, estresse de seca e estresse de resfriamento podem impactar na planta como um todo, bem como na disponibilidade celular de água. Não é de se admirar então, que as respostas da planta para todos estes estresses, estejam relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273 et al. observe que "a maior parte do estudos sobre indícios de estresse de água focaram primeiramente no estresse de sal, pois a resposta da planta ao sal e a seca está intimamente relacionada e, os mecanismos se sobrepõem. Muitos exemplos de respostas e caminhos similares a este conjunto de estresse foram documentados. Por exemplo, os fatores de transcrição CBF foram apresentados em relação à resistência do sal, resfriamento e seca (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e o de desidratação, um processo que é amplamente mediado pelo processo de transdução do sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 11632-11637), resultando em uma atividade alterada dos fatores de transcrição que se unem à um elemento de entrada dentro do promotor rd29B. Nas Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo) Patharker e Cushman mostraram que a quinase da proteína cálcio-dependente (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses de sal e seca (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A quinase de estresse induzido também estava presente na fosforilação, um fator de transcrição, supostamente alterando suas atividades, embora os níveis de transcrição do fator de transcrição alvo não foram alterados em resposta ao estresse de sal e seca. Similarmente, Saijo et al. demonstrou que uma quinase de proteína de arroz induzida ao sal/seca dependente de calmodulina (OsCDPK7) atribuiu um aumento da tolerância do arroz ao sal e a seca, quando sobrecarregado (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 319-327).

[00120] A exposição à desidratação remete a estratégias similares de sobrevivência em plantas, bem como o estresse de resfriamento (consultar por exemplo, Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) bem como o estresse de seca induz à tolerância a resfriamento (consultar por exemplo, Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Planta 188: 265270). Além da indução das proteínas de aclimatação ao frio, estratégias que permitem que plantas sobrevivam em condições de pouca água podem incluir, por exemplo, redução da área de superfície ou óleo de superfície ou produção de cera. Em outro exemplo, o aumento do teor de soluto da planta previne a evaporação e a perda de água por calor, seca, salinidade, osmótica e similares, fornecendo assim, uma melhor tolerância da planta em relação aos estresses mencionados acima.

[00121] Deve ser compreendido que algumas rotas envolvidos na resistência de um estresse (conforme descrito acima), também estarão envolvidos na resistência à outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou por genes homólogos. Certamente, as rotas de resistência, de maneira geral, são relacionadas, não idênticas, e portanto, nem todos os genes que controlam a resistências à um estresse controlará a resistências à outros estresses. No entanto, se um gene condiciona resistência a um desses estresses, isso seria evidente para um indivíduo qualificado na arte de testes de resistência a estresses relacionados. Os métodos de avaliação de resistência do estresse são demonstrados mais adiante na seção seguinte denominada Exemplos.

[00122] Conforme aqui contida, a frase “eficiência do uso de água (EUA)” refere-se ao nível de matéria orgânica produzida por unidade de água consumida pela planta, ou seja, o peso seco da planta em relação à utilização de água da planta, por exemplo, a biomassa produzida por unidade de transpiração.

[00123] Conforme aqui contida, a frase “eficiência do uso de fertilizante” (EUF), refere-se ao(s) processo(s) metabólicos, os quais levam a um aumento do rendimento, da biomassa, do vigor e da taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicado da planta. O processo metabólico pode ser a compreensão, propagação, absorção, acumulação e realocação (dentro da planta) e o uso de um ou mais minerais, bem como as meações orgânicas absorvidas pela planta, como o nitrogênio, fosfato e/ou potássio.

[00124] Conforme aqui contida, a frase “condições limitadoras de fertilizante” refere-se às condições de crescimento, as quais incluem um nível (por exemplo, concentração) de um fertilizante aplicado abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade usuais da planta.

[00125] Conforme aqui contida, a frase “eficiência do uso do nitrogênio (EUN)” refere-se ao(s) processo(s) metabólicos os quais levam a um aumento do rendimento, da biomassa, do vigor e da taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicado da planta. O processo metabólico pode ser a compreensão, propagação, absorção, acumulação e realocação (dentro da planta) e o uso de nitrogênio, fosfato e/ou potássio da planta.

[00126] Conforme aqui contida, a frase “condições limitadoras de nitrogênio” referem-se às condições de crescimento, as quais incluem um nível (por exemplo, concentração) de nitrogênio (por exemplo, amônia ou nitrato) aplicado abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade usuais da planta.

[00127] A melhora de EUN e EUF da planta é traduzida no campo tanto em quantidades similares de rendimento da colheita, enquanto implementa menos fertilizantes, quanto no aumento do rendimento ganho ao implementar os mesmos níveis de fertilizante. Dessa forma, a melhora de EUN e EUF tem um efeito direto no rendimento da planta no campo. Dessa forma, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas configurações da invenção foram afetadas positivamente pelo rendimento da planta e da semente, bem como da biomassa da planta.

[00128] Adicionalmente, o benefício da melhora de EUN da planta certamente irá melhorar a qualidade da produção e os componentes bioquímicos da semente como rendimento da proteína e do óleo.

[00129] Cabe notar que a melhora no TEA irá conferir às plantas vigor e condições sem estresse, resultando na produção de melhora da biomassa e/ou rendimento, por exemplo, fibras alongadas para a indústria de algodão e maior teor de óleo.

[00130] O termo “fibra” é normalmente integrado às células condutoras de paredes espessas, tais como vasos e traqueídos e agregados fibrilares de várias fibras individuais de células. Consequentemente, o termo “fibra” refere-se a (a) células condutoras e não-condutoras de paredes espessas do xilema; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo àquelas do floema, casca, tecido do solo e epidermes; e (c) fibras do tronco, folhas, raízes, sementes e flores ou pteridófitas (como as Sorghum vulgare utilizadas na manufatura de escovas e vassouras).

[00131] Exemplos de plantas produtoras de fibra, incluem, mas não se limitam a produção de agricultura como algodão, paineira-vermelha-da-índia (Kapok, Ceiba pentandra) Chilopsis, chaparral, Krascheninnikovia, pau-de- balsa, kenaf, rosela, juta, sisal, abaca, linho, milho, cana de açúcar, cannabis, rami, kapok, fibra de coco, bambu, barba-de-velho e Agave spp. (por exemplo, sisal).

[00132] Conforme aqui contida, a frase “qualidade de fibra” refere-se a, pelo menos, um parâmetro de fibra, o qual é agricolamente desejável ou necessário na indústria de fibra (descritos mais adiante nos termos indicados). Exemplos de tais parâmetros incluem, mas não se limitam a comprimento, força, fitness e peso de fibra por unidade de comprimento, relação de maturidade e uniformidade (descritos mais adiante nos termos indicados).

[00133] A qualidade da fibra de algodão (cotão) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, força e finura da fibra. Assim, a qualidade do cotão é considerada superior quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

[00134] Conforme aqui contido, o termo “crescente” refere-se a pelo menos 2%, a pelo menos 3%, a pelo menos 4%, a pelo menos 5%, a pelo menos 10%, a pelo menos 15%, a pelo menos 20%, a pelo menos 30%, a pelo menos 40%, a pelo menos 50%, a pelo menos 60%, a pelo menos 70%, a pelo menos 80% do aumento na tolerância do estresse abiótico, na eficiência do uso de água, rendimento (por exemplo, rendimento das sementes), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, qualidade e comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência do uso de nitrogênio e/ou eficiência do uso de fertilizante de uma planta comparado com plantas nativas e exóticas [i.e. uma planta não modificada com biomoléculas (polinucleotídeos ou polipeptídeos) da invenção, e.g., uma planta não alterada da mesma espécie que cresce nas mesmas (por exemplo, idênticas) condições de crescimento.]

[00135] A frase “expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno” aqui mencionada refere-se aos aumentos nos níveis de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro de uma planta, introduzindo o polinucleotídeo exógeno numa célula da planta e expressando os meios recombinantes, descritos mais adiantes nos termos indicados.

[00136] Tal como “expressando” refere- se a expressão no RNA mensageiro e, opcionalmente, no nível de polipeptídeo.

[00137] Conforme aqui contida, a frase “polinucleotídeo exógeno” refere-se à uma sequência heteróloga do ácido nucleico que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de uma espécie diferente) ou qual superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de forma estável ou transitória, a fim de produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) e/ou uma molécula do polipeptídeo. Deve- se notar que o polinucleotídeo exógeno pode incluir uma sequência do ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga à uma sequência de endógena de ácidos nucleicos da planta.

[00138] O termo “endógeno” aqui mencionado refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo é apresentado ou naturalmente expressado dentro da planta ou de uma célula desta.

[00139] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção comprime uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo, cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97"%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais do que 100% homologa à sequência de aminoácidos selecionadas do grupo, sendo composta de ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421.

[00140] As sequências homólogas incluem sequências ortólogas e parólogas. O termo "parólogas" refere-se ao gene-duplicações dentro do genoma de uma espécie de genes parólogo. O termo "ortólogas" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos, devido à relação ancestral. Dessa forma, ortólogos são as contrapartes evolutivas homólogas derivadas de um único gene ancestral no último ancestral comum de duas espécies. (Koonin EV e Galperin MY (Sequence - Evolution - Function: Computational Approaches in Comparative Genomics. Boston: Kluwer Academic; 2003 capítulo 2, Evolutionary Concept in Genetics and Genomics. Disponível em: ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20255) e portanto tendo grande probabilidade de terem a mesma função.

[00141] Uma opção para identificar ortólogas em espécies de plantas monocotiledôneas é realizar uma pesquisa de explosão recíproca. Isto pode ser feito por uma primeira explosão envolvendo detonação o sequência de interesse contra qualquer banco de dados de sequência, tais como o banco de dados NCBI publicamente disponível que pode ser encontrado em: ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se ortólogas em arroz foram procuradas, o sequência de interesse teria sido explodida em relação a, por exemplo, 28.469 clones de DNA complementar em toda sua extensão, de Oryza sativa Nipponbare disponível no CNIB. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências completas de resultados filtrados e não filtrados são explodidos novamente (segunda explosão) em relação às sequências do organismo do qual é derivado da sequência inicial. Os resultados das duas explosões são então comparados. Uma ortóloga é identificada quando a sequência, resultando em maior pontuação (melhor sucesso) na primeira explosão, identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência inicial) como o melhor êxito. Utilizando o mesmo raciocínio, uma paráloga (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrada. No caso de famílias de grandes sequência, pode ser utilizado o programa ClustalW [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido de neighbor-joining tree (Hypertext Transfer Protocol://en (dot) wikipedia (dot) org/wiki/Neighbor-joining) o qual auxiliar visualizar o agrupamento.

[00142] Homologia (por exemplo, percentual de homologia, identidade + similaridade) pode ser determinada usando quaisquer softwares de comparação de homologia computando uma sequência de alinhamento.

[00143] Identidade (por exemplo, percentual de homologia) pode ser determinada usando quaisquer softwares de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do Centro Nacional de Informação da Biotecnologia (CNIB), utilizando-os como parâmetros.

[00144] De acordo com algumas configurações da invenção, o termo “homologia” ou “homólogo” refere-se a identidade de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos; ou a identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácido até uma ou mais sequências de ácido nucleico.

[00145] De acordo com algumas configurações, a homologia é uma homologia, i.e. uma homologia sobre uma sequência completa de aminoácido ou ácido nucleico da invenção e não sobre as partes destas.

[00146] O grau de homologia da identidade entre duas ou mais sequências podem ser determinadas utilizando diversas ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Seguindo uma descrição não limitadora de tais ferramentas, as quais podem ser utilizadas com algumas configurações da invenção.

[00147] O alinhamento do pareamento global foi definido por S.B. Needleman e C.D. Wunsch, “um método geral aplicável à pesquisa de similaridades em sequências de aminoácidos de duas proteínas" Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48.

[00148] Por exemplo, ao iniciar uma sequência de polipeptídeo e a comparar a outras sequências de polipeptídeo, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 Neddleman-Wunsch (disponível em emboss (ponto)sourceforge(ponto)net net/apps/cvs/emboss/apps/needle(ponto)html) pode ser utilizado para encontrar um alinhamento ideal (incluindo intervalos) de duas sequências em toda sua extensão - um “alinhamento global”. Os parâmetros padrão para o algoritmo Needlman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluindo: gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.

[00149] De acordo com algumas configurações da invenção, o limite usado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 Needleman- Wunsch é de 80%, 81%, %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00150] Ao iniciar uma sequência de polipeptídeo e comparando com sequências de polinucleotídeos, o algoritmo OneModel FramePlus [Halperin, E., Faigler, S. and Gill-More, R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequences. Bioinformatics, 15, 867- 873) (disponível em http://biocceleration(ponto)com/Products(ponto)html], pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrão: model=frame+_p2n.model mode=local.

[00151] De acordo com algumas configurações da invenção, o limite usado para determinar a homologia utilizando o algoritmo OneModel FramePlus é de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00152] Ao iniciar uma sequência de polinucleotídeo e comparar com outras sequências de polinucleotídeos no algoritmo EMBOSS-6.0.1 Needleman-Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html), pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrão: (EMBOSS-6.0.1) gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00153] De acordo com algumas configurações da invenção, o limite usado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 Needleman- Wunsch para comparação de polinucleotídeos com polinucleotídeos é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00154] De acordo com algumas configurações, a determinação do grau de homologia necessária para mais adiante empregar o algoritmo Smith-Waterman (comparação de proteína-proteína ou nucleotídeo-nucleotídeo).

[00155] Os parâmetros padrão do algoritmo GenCore 6.0 SmithWaterman inclui: model =sw.model.

[00156] De acordo com algumas configurações da invenção, o limite usado para determinar a homologia utilizando o algoritmo Smith-Waterman é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00157] De acordo com algumas configurações da invenção, a homologia global é executada em sequências, as quais são pré-selecionadas pela homologia local do polipeptídeo ou polinucleotídeo inicial (por exemplo, 60% da identidade sobre 60% do comprimento da sequência), antes da execução da homologia global do polipeptídeo ou polinucleotídeo inicial (por exemplo, 80% da homologia global na sequência inteira). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionas pelo software BLAST com algoritmo Blastp e tBlastn como filtros para a primeira etapa, bem como a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento do algoritmo Frame+ para a segunda etapa. A identidade local (alinhamentos de explosão) é definido com um máximo *permitido de 60% da identidade em 60% dos comprimentos das sequências, por ser utilizado apenas como um filtro para a etapa de alinhamento global. Numa configuração específica (quando a identidade local é utilizada) a filtragem padrão do pacote Blast não é utilizado (pelo parâmetro “F F”).

[00158] Na segunda etapa, homólogos são definidos pela identidade global de pelo menos, 80% do gene central da sequência do polipeptídeo.

[00159] De acordo com algumas configurações da invenção, duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ótimo para sequências de proteína ou nucleotídeos são utilizados:

1. Entre duas proteínas (seguindo o filtro bastsp):

[00160] O algoritmo EMBOSS-6.0.1 Needleman-Wunsch com as seguintes alterações nos parâmetros: gapopen=8 gapextend=2. Os outros parâmetros são imutáveis nas opções padrão aqui listadas:

Qualificadores avançados (espontâneos): -[no]brief boolean [Y] Breve identidade e similaridade Qualificadores associados:

[00161] Qualificadores gerais: -auto boolean Desligar prompts

2. Entre a sequência de proteínas e a sequência de nucleotídeos (de acordo com o filtro tblastn): Aplicação GenCore 6.0 OneModel utilizando-se o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal - q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. Os outros parâmetros permanecem inalterados nas opções padrão: Utilização: om -model= <model_fname> [-q=]consulta [-db=] banco de dados [options] -model= <model_fname> Especificar o modelo que quer executar. Todos os modelos fornecidos pela Compugen estão localizados no diretório $CGNROOT/models/.

[00162] Parâmetros válidos para linha de comando: - dev=<dev_name>

[00163] Selecionar o dispositivo a ser utilização pela aplicação.

[00164] Os dispositivos válidos são: bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAME_N2P, e modelos FRAME_P2N). xlg - BioXL/G (válido para todos os modelos exceto XSW). xlp - BioXL/P válido para SW, FRAME+_N2P, e modelos FRAME_P2N). xlh - BioXL/H (válido para SW, FRAME+_N2P, e modelos FRAME_P2N). soft - Dispositivo de Software (para todos os modelos).

[00165] q=<query> Define a configuração de consulta A consulta pode ser uma sequência de arquivos ou uma referência de banco de dados, Uma consulta pode ser especificada por um nome ou por um número de acesso. O formato é detectado automaticamente. Entretanto, um formato pode ser especificado utilizando-se o parâmetros -qfmt. Se uma consulta não for especificada o programa solicitará uma. Se a configuração da consulta for uma referência de banco de dados, um arquivo de saída será produzido para cada sequência na consulta.

[00166] -db=<database name> Seleciona a configuração do banco de dados. A configuração do banco de dados pode ser uma sequência de arquivos ou uma referência de banco de dados. O formato do banco de dados é detectado automaticamente. Entretanto, um formato de banco de dados pode ser especificado utilizando o parâmetros -dfmt.

[00167] -qacc Adicionar este parâmetro à linha de comando se a consulta for especificada utilizando os números de registro. -qacc Adicionar este parâmetro na linha de comando se o banco de dados for especificado utilizando os números de registro. -dfmt/- qfmt=<format_type>

[00168] Selecionar o tipo do formato do banco de dados/consulta. Os formatos possíveis são: fasta - fasta com tipo de seq. detectado automaticamente. fastap - fasta seq. proteína. fastan - fasta seq. nucleica. gcg - formato gcg , tipo detectado automaticamente. gcg9seq - formato gcg9, tipo detectado automaticamente. gcg9seqp - formato gcg9 seq. proteína. gcg9seqn - formato gcg9 seq. nucleica. nbrf - nbrf seq, tipo detectado automaticamente. nbrfp - nbrf seq. proteína. nbrfp - nbrf seq. nucleica. embl - formato embl e swissprot genbank - formato genbank (nucleica). blast - formato blast. nbrf_gcg - seq. nbrf-gcg, tipo detectado automaticamente. nbrf_gcgp - seq. proteína nbrf-gcg. nbrf_gcgn - seq. nucleica nbrf-gcg.

[00169] raw - sequência raw ascii, tipo é detectado automaticamente. rawp - sequência de proteína raw ascii. rawn - sequência nucleica raw ascii.

[00170] pir - formato pir codata, tipo é detectado automaticamente. profile - perfil gcg (válido somente para -qfmt em SW, XSW, FRAME_P2N, e FRAME+_P2N). - out=<out_fname> Nome do arquivo de saída. - suffix=<name> Nome do sufixo do arquivo de saída. - gapop=<n> Penalidade de intervalo existente. Este parâmetro não é válido para FRAME+. Para o FrameSearch o padrão é 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0.

[00171] -gapext=<n> Penalidade de intervalo aumentada. Este parâmetro não é válido para FRAME+. Para o FrameSearch o padrão é 4,0. Paraoutrosmodelos:opadrãoparaaspesquisasdeproteínas é0,05, e o padrão para pesquisas de nucleicos é 1,0.

[00172] -qgapop=<n> Penalidade para abertura de uma intervalo na sequência de consulta. O padrão é 10,0. Valido para XSW.

[00173] - -qgapext=<n> Penalidade por aumentar uma intervalo na sequência de consulta. O padrão é 0,05.

[00174] Valido para XSW.

[00175] -start=<n> Posição na sequência de consulta para iniciar uma pesquisa. - end=<n> Posição na sequência de consulta para finalizar uma pesquisa.

[00176] -qtrans Executa uma pesquisa traduzida, relevante para a consulta nucleico em relação ao banco de dados da proteína. A consulta do ácido nucleico é traduzida para seis quadros de leitura e um resultado é fornecido para cada quadro.

[00177] Válido para SW e XSW.

[00178] -dtrans Executa uma pesquisa traduzida relevante para uma consulta de proteína em um banco de dados de DNA. Cada entrada do banco de dados é traduzida para seis quadros de leitura e um resultado é fornecido para cada quadro. Válido para SW e XSW.

[00179] Observação: As opções "-qtrans" e "-dtrans" são mutualmente exclusivas.

[00180]

[00181] -matrix=<matrix_file> Especifica a matriz de comparação a ser utilizada na pesquisa. A matriz deverá possuir o formato BLAST. Se o arquivo da matriz não for localizado em

[00182] $CGNROOT/tables/matrix, especificar o caminho completo como o valor do parâmetro da matriz.

[00183] -trans=<transtab_name> Quadro de tradução. A localização padrão do quadro é $CGNROOT/tables/trans.

[00184] -onestrand Restringe a busca somente ao filamento superior da consulta/banco de dados da sequência nucleica.

[00185] -list=<n> A quantidade máxima de saídas na lista de ocorrência. O padrão é 50.

[00186] -docalign=<n> A quantidade de linhas de documentação precedendo cada alinhamento. O padrão é 10. thr_score=<score_name> Pontuação que estabelece limites na visualização dos resultados. Pontuações que são menores do que -thr_min value ou maiores que

[00187] -thr_max não são apresentadas. As opções válidas são: qualidade. zscore. -escore.

[00188] -thr_max=<n> Limite máximo da pontuação. Resultados que sejam maiores que -thr_max value não são mostrados.

[00189] -thr_min=<n> Limite mínimo de pontuação. Resultados que sejam menores que -thr_min value não são mostrados.

[00190] -align=<n> Quantidade de alinhamentos reportada no arquivo de saída.

[00191] -noalign Não exibe o alinhamento. Observação: Os parâmetros "-align" e "-noalign" são mutualmente exclusivos.

[00192] -outfmt=<format_name> Especifica o tipo de formato de saída. O formato padrão é PFS. Os valores possíveis são:

[00193] PFS - formato de texto PFS FASTA - formato de texto FASTA BLAST - formato de texto BLAST

[00194] -nonorm Não executa a normalização da pontuação.

[00195] -norm=<norm_name> Especifica o método de normalização. As opções válidas são: log - normalização logarítmica.

[00196] std - normalização padrão.

[00197] stat - Método estatístico de Pearson.

[00198] Observação: Os parâmetros "-nonorm" e "-norm" não podem ser utilizados em conjunto Observação: Os parâmetros -xgapop, - xgapext, -fgapop, -fgapext, -ygapop, -ygapext, -delop, e -

[00199] delext se aplicam somente ao FRAME+.

[00200] -xgapop=<n> Penalidade por abrir um intervalo quando um códon (triplete) for inserido. O padrão é 12,0.

[00201] -xgapext=<n> Penalidade por aumentar um intervalo quando um códon (triplete) for inserido O padrão é 4,0.

[00202] -ygapop=<n> Penalidade por abrir uma lacuna quando um aminoácido for apagado. O padrão é 12,0.

[00203] -ygapext=<n> Penalidade por aumentar um intervalo quando um aminoácido for apagado. O padrão é 4,0.

[00204] -fgapop=<n> Penalidade por abrir um intervalo quando uma base de DNA for inserida. O padrão é 6,0.

[00205] -fgapext=<n> Penalidade por abrir um intervalo quando uma base de DNA for inserida. O padrão é 7,0.

[00206] -delop=<n> Penalidade por abrir um in tervalo quando uma base de DNA for apagada. O padrão é 6 , 0 . -delext=<n> Penalidade por aumentar um intervalo uma base de DNA for apagada. O padrão é 7,0.

[00207] -silent Nenhuma tela de saída é produzida.

[00208] -host=<host_name> Nome da hospedagem em que o servidor será executado. Por padrão a aplicação utiliza a hospedagem especificada no arquivo $CGNROOT/cgnhosts.

[00209] -wait Não acessar o background quando o dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para os dispositivos Parseq ou Soft pseudo.

[00210] -batch Executar o programa no background. Quando esta opção for selecionada o arquivo "$CGNROOT/defaults/batch.defaults" é utilizado na escolha do comando batch. Se este arquivo não existir, o comando "at now" será utilizado para executar o programa.

[00211] Observação: os parâmetros "-batch" e “-wait" são mutualmente exclusivos.

[00212] -version Imprimir os números da versão do software.

[00213] -help Exibe esta mensagem de ajuda. Para se obter um tipo de ajuda mais específico: "om -model=<model_fname> -help".

[00214] De acordo com algumas configurações, homologia é uma homologia local ou uma identidade local.

[00215] As ferramentas de alinhamento local incluem, mas não se limitam a BlastP, BlastN, BlastX ou software TBLASTN do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), FASTA, e o algoritmo de SmithWaterman.

[00216] Uma pesquisa tblastn permite que seja realizada uma comparação entre a sequência de proteína com as traduções dos seis quadros do banco de dados do nucleotídeo. Pode ser um método muito produtivo de se localizar regiões codificadoras de proteínas homólogas em sequências de nucleotídeos não anotadas tais como as sequências de tags expressas (ESTs) e registros do projeto genoma (HTG), localizados no banco de dados BLAST est e htgs, respectivamente.

[00217] Os parâmetros padrão para blastp incluem: Sequências-alvo máximas: 100; Limite esperado: e-5; Tamanho da palavra: 3; Máximo de correspondências em uma gama de consultas: 0; Parâmetros de pontuação: Matriz - BLOSUM62; filtros e máscaras: Filtrar - regiões com baixa complexidade.

[00218] As ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluindo, mas não limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceitual do seis quadros de uma consulta de uma sequência (ambos filamentos) em relação a um banco de dados de uma sequência de proteínas. Os parâmetros padrão incluem: Sequências-alvo máximas: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3; Máximo de correspondências em uma gama de consultas: 0; Parâmetros de pontuação: Matriz - BLOSUM62; filtros e máscaras: Filtrar - regiões com baixa complexidade.

[00219] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de pelo menos, 80%, pelo menos 80%, pelo menos 81%,pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%,pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%,pelo menos 90%,pelo menos 91%,pelo menos 92%, pelo menos 93%,pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%,pelo menos 99%, ou mais, como por exemplo, 100% idêntico à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421.

[00220] De acordo com algumas configurações da invenção, o método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, rendimento, rendimento de semente, rendimento da fibra, qualidade, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou eficiência no uso de fertilizantes (ex., eficiência no uso de nitrogênio) da planta, é realizado expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de pelo menos 80%,pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, como por exemplo 100% idêntico à sequência de ácido amino selecionada do grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 617910421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00221] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido definida pela ID. DAS SEQ. N°s: 475-770, 617910420 ou 10421.

[00222] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, o método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta, é realizado expressando-se dentro da planta um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475- 770 e 6179-10421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00223] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é fornecido um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta, contendo uma expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que selecionado do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179- 10421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00224] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido definida pela ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 617910421.

[00225] De acordo com algumas configurações da invenção, o método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, rendimento, rendimento de semente, rendimento da fibra, qualidade, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou eficiência no uso de fertilizantes (ex., eficiência no uso de nitrogênio) da planta, é realizado expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de pelo menos 80%,pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, como por exemplo 100% idêntico à sequência de ácido amino selecionada do grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 617910421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00226] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido definida pela ID. DAS SEQ. N°s: 475-770, 617910420 ou 10421.

[00227] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, o método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta, é realizado expressando-se dentro da planta um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475- 770 e 6179-10421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00228] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é fornecido um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta, contendo uma expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que selecionado do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179- 10421, deste modo aumentando a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00229] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido definida pela ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 617910421.

[00230] Conforme aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples ou dupla, a qual é isolada e dada na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), sequência de polinucleotídeo genômico e/ou sequências de polinucleotídeo composto (como por exemplo, uma combinação do exposto).

[00231] O termo "isolado" refere-se pelo menos parcialmente separado do ambiente natural, como por exemplo uma célula vegetal.

[00232] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência de polinucleotídeo complementar" refere-se à uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro, utilizando-se uma transcriptase reversa ou qualquer outro RNA dependente do DNA polimerase. Tal sequência pode ser posteriormente ampliada in vivo ou in vitro utilizando-se um DNA dependente do DNA polimerase.

[00233] Conforme aqui utilizada a frase "sequência de polinucleotídeo genômico" refere-se à sequência derivada (solada) de um cromossomo e, desse modo, e\ representa uma porção contínua do cromossomo.

[00234] Conforme aqui utilizada a frase "sequências de polinucleotídeo composto" refere-se à uma sequência que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode conter algumas sequências éxon necessária para codificar os polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas intercalando entre si. A sequências intrônicas pode ser originárias de qualquer fonte, incluindo outros genes e tipicamente possuirá sequências conservadas de sinais de splincing. Tais sequências intrônicas podem ainda possuir elementos regulatórios expressando uma ação cis.

[00235] As sequências e ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para tal expressão. Exemplos de tais modificações sequenciais incluem mas não se limitam a um conteúdo GC para que seja possível uma abordagem mais próxima que é tipicamente encontrada nas espécies vegetais de interesse e, a remoção de códons que normalmente não são encontrados em espécies vegetais, normalmente chamado de otimização de códons.

[00236] A frase "otimização de códon" refere-se à escolha do DNA adequado do nucleotídeo para utilização em um gene estrutural ou fragmento, que se aproxime da mesmo utilização dos códons nas planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou uma sequência de ácido nucleico refere-se a um gene em que a sequência de nucleotídeo de gene nativo ou que ocorre espontaneamente foi modificada a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. A sequência de nucleotídeo normalmente é avaliada eu um nível de DNA e a região de codificação otimizada para a expressão em espécies vegetais, é determinada utilizando-se qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677- 681). Neste método, os desvio padrão do uso do códon, uma medida para que o viés de uso do códon seja calculado primeiramente encontrando-se o desvio proporcional quadrado da utilização de cada códon do gene nativo relacionado ao genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo da média do desvio quadrado. A formula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, onde Xn refere-se à frequência de uso do códon em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon no gene de interesse e N, refere-se à quantidade total de códons no gene de interesse. Um quadro de utilização de códons de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é copilado utilizando-se os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[00237] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização de um códon preferido por um determinado tipo de célula vegetal baseia-se na utilização direta, sem a necessidade de outros cálculos estatísticos dos quadros de otimização de códon, tais como os fornecidos on-line em bancos de dados de utilização de códons como o banco de DNA do NIAS (Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) or (dot) jp/codon/). O banco de dados de utilização de códons contém quadros de utilização para diversas espécies, sendo que cada quadro de utilização foi estatisticamente determinado com base nos dados apresentados no Genbank.

[00238] Ao utilizar-se os quadro acima mencionados para determinar os códons preferidos ou, favoritos de cada aminoácido para uma determinada espécie (por exemplo: arroz) uma sequência de nucleotídeos de ocorrência natural que codifique uma proteína de interesse pode ter o códon otimizado para determinada espécie vegetal. Isto é realizado por meio da substituição dos códons que possam ter uma baixa incidência estatística em genomas de determinadas espécies pelos códons seus correspondentes, em relação aos aminoácidos que são estatisticamente mais favorecidos. Entretanto, um ou mais códon favorecido pode ser escolhido para apagar locais com limitações e criar novos locais com junções potencialmente úteis (finais 5' e 3' para adicionar um peptídeo sinal ou, cassetes de terminação, locais internos que possam ser utilizados para cortar e unir segmentos e produzir uma sequência integral), ou, eliminar sequências de nucleotídeos que possam ter um efeito negativo na estabilidade ou expressão do mRNA.

[00239] A sequência de nucleotídeo codificada que ocorrer naturalmente pode, antes mesmo de qualquer modificação, conter uma quantidade de códons que corresponda ao códon estatisticamente favorecido, em determinadas espécies vegetais. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa pode conter determinantes em que códons, presentes na sequência nucleotídea nativa, não sejam estatisticamente favorecidos em relação a uma determinada planta e, modificar tais códons, de acordo com um quadro de utilização de códon de uma determinada planta, a fim de se produzir um códon derivativo otimizado. Uma sequência de nucleotídeo pode ser total ou parcialmente otimizadas para a utilização de códons e plantas, desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificada seja produzida em um nível superior que o da proteína codificada pelo gene nativo ou que ocorre naturalmente. O construto de genes sintéticos pela alteração da utilização do códon foi descrita por exemplo, na publicação WO 93/07278 (Koziel M., et al.).

[00240] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificante.

[00241] Conforme aqui utilizado, a frase "RNA não codificante" refere-se à uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácido (polipeptídeo). Exemplos de tais moléculas de RNA não codificante incluem, mas não se limitam ao RNA antessentido e pre-miRNA (precursor de um microRNA), ou um precursor de um RNA interagindo-Piwi (piRNA).

[00242] Diversos exemplos de polinucleotídeos com RNA não codificante são fornecidos na ID. DAS SEQ. N°s: 217, 218, 261, 262, 473, 474, 2066, 2827, 2886, 3165, 3166, 3167, 3168, 3180, 3181, 3213, 3215, 5247, 6108, 6163.

[00243] Portanto, a invenção compreende as sequências de ácido nucleico acima estabelecidas e seus fragmentos, sequências que podem ser tornar híbridas com as mesmas, sequências homólogas às mesmas, sequências que codificam polipeptídeos semelhantes com a utilização diferentes de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações , tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, sejam elas ocorridas naturalmente ou induzidas pelo homem, aleatória ou de uma maneira direcionada.

[00244] A invenção apresenta um o polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência ácido nucleica de pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178.

[00245] De acordo com algumas configurações da invenção a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a tolerância do estresse abiótico, a eficiência do uso de água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, rendimento, rendimento da semente, rendimento da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou eficiência de uso de fertilizante (ex. eficiência de uso do nitrogênio) da planta.

[00246] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo das ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178.

[00247] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo isolado é estabelecido pelas ID. DAS SEQ. N°s: 1-474, 7716177 ou 6178.

[00248] A invenção apresenta um o polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência ácido nucleica codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, como por exemplo, 100% homologo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na ID. DAS SEQ. N°s: 475-770, 6179-10420 ou 10421.

[00249] De acordo com algumas configurações da invenção o polipeptídeo compreendendo um sequência de aminoácido selecionada pelo grupo consistindo da ID. DAS SEQ. N°s: 475-770, 6179-10421.

[00250] De acordo com algumas configurações da invenção, a polipeptídeo é definido pelas ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421.

[00251] A invenção também engloba fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e polipeptídeos com mutações tais como, exclusão, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos, seja naturalmente ou induzido pelo ser humano, seja aleatório ou de maneira orientada.

[00252] O termo "planta" conforme aqui utilizado, engloba plantas inteiras, nas ascendência ou descendência de plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caule, raízes (incluindo tubérculos) e células, órgãos e tecidos de plantas. As plantas podem ser de qualquer formato, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, calos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae , em particular plantas monocotiledónea e dicotiledóneas, incluindo forragens ou leguminosas de forragem, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou determinados tipos de arbustos que compreendem a Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas , repolho, canola , cenoura, couve-flor, aipo , couve, linho, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata , arroz, soja , palha, beterraba, cana-de- açúcar , girassol , tomate , abóbora , milho , trigo , cevada , centeio , aveia , amendoim , ervilha , lentilha e alfafa , algodão , colza, canola , pimenta , girassol , tabaco , berinjela , eucalipto , uma árvore , uma planta ornamental , uma gramínea perene e uma colheita de forragem. Como alternativa, algas e outras plantas que não são da família Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.

[00253] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta usada pelo método da invenção é uma planta de cultura, tais como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, sésamo, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, milho, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, álamo e algodão.

[00254] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta é uma planta dicotiledónea.

[00255] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta é uma planta monocotiledónea.

[00256] De acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma célula de planta de forma exógena que expressa o polinucleótido de algumas configurações da invenção, o construto de ácido nucleico de algumas configurações da invenção e/ou o polipéptido de algumas configurações da invenção.

[00257] De acordo com algumas configurações da invenção, a expressão do polinucleótido exógeno da presente invenção dentro da planta é efetuada através da transformação de um ou mais células da planta com o polinucleótido exógeno, seguido por geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para a expressão do polinucleótido exógeno na planta madura.

[00258] De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é efetuada através da introdução à célula vegetal de um construto de ácido nucleico que inclui o polinucleótido exógeno de algumas configurações da invenção e, pelo menos, um promotor para dirigir a transcrição do polinucleótido exógeno em uma célula hospedeira (uma célula de planta). Mais detalhes de métodos adequados de transformação são providos abaixo.

[00259] Como mencionado, o construto de ácido nucléico, de acordo com algumas configurações da invenção, compreende uma sequência de promotor e o polinucleótido isolado das algumas configurações da invenção.

[00260] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleótido isolado é operacionalmente ligado à sequência promotora.

[00261] Uma sequência de codificação de ácido nucleico está "operativamente ligada" a uma sequência reguladora (por exemplo, promotor), se a sequência reguladora é capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência de codificação ligada ao mesmo.

[00262] Tal como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a uma região de ADN que se situa a montante do local de iniciação da transcrição de um gene ao qual se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrição do RNA. Os controles do promotor onde (por exemplo, se for o caso, que parte de uma planta), e/ou quando (por exemplo, em que fase ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00263] De acordo com algumas configurações da invenção, o promotor é heterólogo para o polinucleótido isolado e/ou para a célula hospedeira.

[00264] Tal como aqui utilizada, a frase "promotor heterólogo" refere- se a um promotor de uma espécie diferente, ou a partir das mesmas espécies, mas a partir de um locus de um gene diferente a partir da sequência de polinucleótido isolado.

[00265] Qualquer sequência de promotor adequado pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção. De preferência, o promotor é um promotor constitutivo, específico do tecido, ou um promotor induzível de estresse abiótico.

[00266] De acordo com algumas configurações da invenção, o promotor é um promotor vegetal, que é adequado para a expressão do polinucleótido exógeno em uma célula de planta.

[00267] Os promotores adequados para expressão em trigo incluem, mas não estão limitados a, promotor de trigo SPA (ID. DA SEQ. N°: 10422; Albanietal, Célula da Planta, 9: 171- 184, 1997, que é aqui totalmente incorporada por referência), LMW de trigo (ID. DA SEQ. N°: 10423 (mais promotor LMW), e ID. DA SEQ. N°: 10424 (promotor de LMW) e glutenina HMW-1 (ID. DA SEQ. N°: 10423 (promotor mais longo de glutenina-1 LMW de trigo), e ID. DA SEQ. N°: 10426 (trigo glutenina HMW-1 Promotor); Thomas e Flavell, A Célula da Planta 2:1171-1180; . Furtado e colaboradores, 2009 Plant Biotechnology Journal 7:240-253, cada uma das quais é aqui totalmente incorporada por referência), trigo alfa, beta e gama gliadinas [por exemplo, ID. DA SEQ. N°: 10427 (alfa gliadina de trigo, B genoma promotor); ID. DA SEQ. N°: 10428 (trigo gama gliadina promotor); EMBO 3:1409- 1415, 1984, que é aqui totalmente incorporada por referência], TdPR60 trigo [ID. DA SEQ. N°: 10429 (TdPR60 trigo mais promotor) ou ID. DA SEQ. N°: 10430 (trigo TdPR60 promotor); . Kovalchuk e colaboradores, Biol. Mol. Planta 71:81-98, 2009, que é aqui totalmente incorporada por referência], o milho UB1 Promotor [cultivar Nongda 105 (ID. DA SEQ. N°: 10431); GenBank: DQ141598.1; Taylor e colaboradores, Rep. Célula Planta 1993 12:. 491-495, que é aqui totalmente incorporada por referência; e cultivar B73 (ID. DA SEQ. N°: 10432); Christensen, AH, e colaboradores. Biol. Mol. . Planta 18 (4), 675-689 (1992), que é aqui totalmente incorporada por referência]; actina de arroz 1 (ID. DA SEQ. N°: 10433; Mc Elroy e colaboradores. 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163-171, que é aqui totalmente incorporada por referência]; arroz GOS2 [ID. DA SEQ. N°: 10434 (arroz GOS2 mais promotor), e ID. DA SEQ. N°: 10435 (arroz GOS2 Promotor); De Pater e colaboradores. Planta J. 1992; 2: 837-44, que é aqui incorporado por referência], arabidopsis Pho1 [ID. DA SEQ. N°: 10436 (Arabidopsis PHO1 Promotor); Hamburger e colaboradores., Célula da Planta. 2002; 14: 889-902, que é aqui totalmente incorporada por referência], promotores ExpansinB, por exemplo, arroz ExpB5 [ID. DA SEQ. N°: 10437 (arroz ExpB5 promotor mais longo) e ID. DA SEQ. N°: 10438 (arroz ExpB5 promotor)] e Cevada ExpBl [ID. DA SEQ. N°: 10439 (Cevada ExpBl Promoter), Won e colaboradores Células Mol. 2010; 30:369-76, que é aqui totalmente incorporada por referência], cevada SS2 (sintase de sacarose 2) [(ID. DA SEQ. N°: 10440), Guerin e Carbonero, Physiology Maio de 1997, vol. 114 no. 1 55-62, que é aqui totalmente incorporada por referência]; e arroz PG5a [SEQ ID NO.10441, US 7,700,835, Nakase e colaboradores., Biol. Mol. Planta. 32:621-30, 1996, a qual é aqui incorporada por referência.

[00268] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, promotor 35S do CaMV [ID. DA SEQ. N°: 10442 (CaMV 35S (QFNC) Promotor); ID. DA SEQ. N°: 10443 (PJJ 35S de Brachypodium); ID. DA SEQ. N°: 10444 (CaMV 35S (DVO) Promotor) (Odell e colaboradores, Nature 313:. 810-812, 1985)], At6669 promotor de Arabidopsis (ID. DA SEQ. N°: 10445 (Arabidopsis At6669 (OLD) Promotor); ver Publicação PCT No. WO04081173A2 ou o novo promotor At6669 (ID. DA SEQ. N°: 10446 (Arabidopsis At6669 (NOVO) Promoter)); milho UB1 Promotor [cultivar Nongda 105 (ID. DA SEQ. N°: 10431); GenBank: DQ141598.1; Taylor e colaboradores, Rep. Célula Planta 1993 12:. 491-495, que é aqui totalmente incorporada por referência; e cultivar B73 (ID. DA SEQ. N°: 10432); Christensen, AH, e colaboradores. Biol. Mol. Planta. Planta 18 (4), 675-689 (1992), que é aqui totalmente incorporada por referência]; actina de arroz 1 (ID. DA SEQ. N°: . 10433, McElroy e colaboradores, Célula da Planta 2:. 163-171, 1990); pEMU (Last e colaboradores, Theor. Apl. Genet. 81:581588, 1991); CaMV 19S (Nilsson e colaboradores., Fisiol. Ant. 100:456-462, 1997); arroz GOS2 [ID. DA SEQ. N°: 0 10434 (arroz GOS2 promotor mais longo), e ID. DA SEQ. N°: 10435 (arroz GOS2 Promotor), de Pater e colaboradores, Plant J Nov; 2 (6):837-44, 1992]; RBCS promotor (ID. DA SEQ. N°: 10447); Arroz ciclofilina (Bucholz, e colaboradores, Biol. Mol. Planta. 25 (5):837-43, 1994); Milho H3 histona (Lepetit e colaboradores, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An e colaboradores, Plant J. 10 (1); 107-121, 1996) e MAS Super Sintético (Ni e colaboradores, The Plant Journal 7: 661-76, 1995.). Outros promotores constitutivos incluem os da Patente dos EUA . Nos. 5.659.026, 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597: 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.

[00269] Promotores específicos de tecido adequados incluem, mas não se limitam a, promotores específicos de folha [por exemplo, AT5G06690 (tioredoxina) (expressão elevada, ID. DA SEQ. N°: 10448), AT5G61520 (AtSTP3) (baixa expressão, ID. DA SEQ. N°: 10449) descritos em Buttner e colaboradores 2000 Planta, Célula e Ambiente 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto e colaboradores, Plant J. 12:. 255-265, 1997; Kwon e colaboradores., Fisiologia da Planta. 105:357-67, 1994; Yamamoto e colaboradores., Fisiologia da Célula da Planta. 35:773-778, 1994; . Gotor e colaboradores, Plant J. 3:509- 18, 1993; Orozco e colaboradores., Biologia Molecular da Planta 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka e colaboradores., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 90:9586-9590, 1993; bem como Arabidopsis STP3 (AT5G61520) promotor (Buttner e colaboradores, Planta, Célula e Ambiente. 23:175-184, 2000)], os promotores preferidos de semente, [por exemplo, Napina (originado a partir de Brassica napus, que é caracterizada por uma atividade específica do promotor da semente; Stuitje A.R. e colaboradores. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; ID. DA SEQ. N°: 10450 (Promotor NAPINA Brassica napus) a partir de genes específicos das sementes (Simon e colaboradores., Biol. Mol. Planta 5. 191, 1985; Scofield e colaboradores, J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, e colaboradores., Biologia Molecular da Planta 14: 633 1990), arroz PG5a (ID. DA SEQ. N°: 10441; Dos EUA 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes de Arabidopsis BAN (AT1G61720) (ID. DA SEQ. N°: 10451; EUA 2009/0031450 A1), desenvolvimento tardio de sementes de Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) (ID. DA SEQ. N°: 10452, Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor mais longo) ou ID. DA SEQ. N°: 10453 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promoter)) (Ng e colaboradores, Biologia Molecular da Planta. 54: 25-38, 2004), Albumina de nozes do Brasil (Pearson e colaboradores, Biol. Molecular da Planta 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, e colaboradores. Biol. Mol. Planta. da Planta 10: 203-214, 1988), glutelina (arroz) (Takaiwa, e colaboradores, Gen. Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, e colaboradores., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke e colaboradores, Biologia Molecular da Planta, 143) 0,323-32 1990), napA (Stalberg, e colaboradores, Planta 199: 515-519, 1996), trigo SPA (ID. DA SE. N°: 10422; Albanietal, Célula da Planta, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, e colaboradores, Biol. Mol. da Planta 19: 873876, 1992)], promotores específicos de endosperma [por exemplo, LMW de trigo (ID. DA SEQ. N°: 10423 (promotor mais longo LMW trigo ), e ID. DA SEQ. N°: 10424 (Promotor LMW de trigo) e glutenina HMW-1 [(ID. DA SEQ. N°: 10425 (promotor mais longo de glutenina-1 LMW de trigo), e ID. DA SEQ. N°: 10426 (Promotor de glutenina-1 HMW de trigo), Thomas e Flavell, A Célula da Planta 2:1171-1180, 1990; Genet. Gen. Mol. 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), alfa trigo, gliadinas beta e gama (ID. DA SEQ. N°: 10427 (gliadina alfa de trigo, (genoma B) promotor); ID. DA SEQ. N°: 10428 (promotor de gliadina gama de trigo); EMBO 3:1409-1415, 1984), cevada ltrl promotor, cevada B1, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-1262, 1999; Planta J 4:343-55, 1993; Genet. Gen. Mol. 250:750- 60, 1996), Cevada (Mena e colaboradores, The Plant Journal, 116 (1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (ID. DA SEQ. N°: 10440 (Cevada SS2 Promotor); Guerin e Carbonero Fisiologia Vegetal. 114: 1 55-62, 1997), Trigo Tarp60 (Kovalchuk e colaboradores, Biol. Mol. Planta 71: 81-98, 2009), cevada D-hordeína (D-Hor) e B-hordeína (B -Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry e Alessandro Pellegrineschi (2009)], Promotor sintético (Vicente- Carbajosa e colaboradores, Plant J. 13:. 629-640, 1998), prolamina do arroz NRP33, arroz -globulina Glb- 1 (Wu e colaboradores, Fisiologia Celular da Planta 39 (8) 885- 889, 1998), alfa-globulina do arroz REB/OHP-1 (Nakase e colaboradores. Biol. Mol. . da Planta 33: 513-S22, 1997), arroz PP ADP- glicose (Trans Res 6: 157-68, 1997), a família do gene ESR milho (Plant J. 12: 235-46, 1997), sorgo gama-kafirin (PMB 32: 1029-1035, 1996)], os promotores específicos de embrião [por exemplo, arroz OSH1 (Sato e colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 93: 8117-8122), Knox (Postma- Haarsma e colaboradores, Biol. Mol. da Planta 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu e colaboradores, J. Biochem, 123:. 386, 1998)], e promotores específicos de flor [por exemplo, AtPRP4, sintase de chalene (CHSA) (Van der Meer, e colaboradores., Biologia Molecular da Planta 15, 95- 109, 1990), LAT52 (Twell e colaboradores, Genet. Gen Mol. 217:240-245; 1989), Arabidopsis apetala- 3 (Tilly e colaboradores, HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/95219 03" \\ o "Desenvolvimento (Cambridge, Inglaterra..)" 125: 1647-1657, 1998), Arabidopsis apetala 1 (AT1G69120, API) (ID. DA SEQ. N°: 10454 (Arabidopsis (AT1G69120) APETALA 1)) (Hempel e colaboradores, Desenvolvimento 124:. 3.8453.853, 1997)], e promotores raiz [por exemplo, o promotor RAIZP [ID. DA SEQ. N°: 10455]; arroz ExpB5 (ID. DA SEQ. N°: 10438 (arroz ExpB5 Promotor); ou ID. DA SEQ. N°: 10437 (arroz ExpB5 Promotor mais longo)) e cevada ExpB1 promotores (ID. DA SEQ. N°: 10439) (Won e colaboradores. Células Mol. 30: 369-376, 2010); arabidopsis ATTPS CIN (AT3G25820) promotora (ID. DA SEQ. N°: 10456; . Chen e colaboradores, Planta Phys 135:1956-1966, 2004); Arabidopsis promotor Pho1(ID. DA SEQ. N°: 10436, Hamburger e colaboradores., Cel da Planta. 14: 889-902, 2002), o qual também é ligeiramente induzido por estresse].

[00270] Promotores abióticos induzíveis por estresse adequados incluem, mas não se limitam a, promotores induzíveis ao sal, tais como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei e colaboradores., Genet. Gen. Mol. 236:331340, 1993); promotores induzíveis da seca, como promotor do gene rab17 do milho (Pla e colaboradores., Biol. Mol. da Planta 21:259-266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk e colaboradores, Plant J. 11:12851295, 1997) and milho Ivr2 promotor do gente (Pelleschi e colaboradores., Biol. Mol. da Planta 39:373-380, 1999); promotores induzíveis pelo calor, tais como promotor hsp80- de tomate pelo calor (EUA Pat. No. 5.187.267).

[00271] O construto de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ainda incluir um marcador de seleção apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas configurações da invenção, o construto de ácido nucleico utilizado é um vetor de transporte, que pode propagar-se tanto em E. coli (em que o construto compreende um marcador de seleção apropriado e origem de replicação) e ser compatível com a propagação em células.

[00272] O construto, de acordo com a presente invenção, pode ser, por exemplo, um plasmídio, um bacmídio, um fagemídio, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00273] O construto do ácido nucléico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar de modo estável ou transiente as células da planta. Na transformação estável, o polinucleótido exógeno é integrado no genoma da planta e, como tal, representa uma característica estável e hereditária. Na transformação transiente, o polinucleótido exógeno é expresso pela célula transformada, mas não está integrado no genoma e, como tal, representa um traço transiente.

[00274] Existem vários métodos de introdução de genes estranhos em plantas tanto monocotiledóneas e dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Planta Rev.. Fisiol., Plant. Biol. Mol. (1991) 42:205-225; . Shimamoto e colaboradores, Nature (1989) 338:274-276).

[00275] Os principais métodos que causam a integração estável do ADN exógeno no ADN genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de genes mediada por Agrobacterium: Klee e colaboradores. (1987) Rev. Anual Fisiologia da Planta. 38:467-486; Klee e Rogers em Cultura celular e Genética de Células Somáticas de Plantas, Vol. 6, Biologia Molecular de Genes de Plantas Nucleares, eds. Schell, J., e Vasil, LK, Academic Publishers, San Diego, na Califórnia. (1989) p. 2- 25; Gatenby, em Biotecnologia da Planta, eds. Kung, S. e Arntzen, CJ, Butterworth Publishers, Boston, Massachusetts. (1989) p. 93-112. (ii) a absorção direta de ADN: Paszkowski e colaboradores em Cultura celular e Genética de Células Somáticas de Plantas, Vol. 6, Biologia Molecular de Genes de Plantas Nucleares, eds. Schell, J., e Vasil, LK, Academic Publishers, San Diego, na Califórnia. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção directa de DNA para protoplastos, Toriyama, K. e colaboradores (1988) Bio/Tecnologia 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por breve choque elétrico de células vegetais: Zhang e colaboradores. Rep. da Célula da Planta. (1988) 7:379-384. Fromm e colaboradores. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de ADN em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein e colaboradores. Bio/Tecnologia (1988) 6:559-563; McCabe e colaboradores. Bio/Tecnologia (1988) 6:923-926; Sanford, Fisiol. Planta. (1990) 79:206-209; através da utilização de sistemas de micropipeta: Neuhaus e colaboradores., Theor. Genet. Aplic. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Fisiol. Planta. (1990) 79:213-217; fibras de vidro ou carboneto de silício suiça transformação de culturas de células ou embriões, tecidos de calos, Pat dos . No. 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen de germinação, DeWet e colaboradores, em Manipulação Experimental do Tecido do Óvulo, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715-719.

[00276] O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores plasmídicos que contêm segmentos de DNA definidos que se integram no ADN genômico da planta. Métodos de inoculação de tecido vegetal variam dependendo da espécie de planta e o sistema de entrega de Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o processo de disco de folha, que pode ser realizado com qualquer explante de tecido, que proporciona uma boa fonte para o início da diferenciação da planta inteira. Ver, por exemplo, Horsch e colaboradores, em Manual de Biologia Molecular da Planta A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de liberação de Agrobacterium em combinação com infiltração por vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável para a criação de plantas transgênicas dicotiledôneas.

[00277] Existem vários métodos de transferência direta de DNA em células de plantas. Em eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjecção, o DNA é mecanicamente injetado directamente nas células usando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento com micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, tais como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados para as células ou tecidos vegetais.

[00278] Após a transformação estável, a propagação da planta é exercida. O método mais comum de propagação de planta é por sementes. Regeneração por multiplicação de sementes, no entanto, tem a deficiência de que, devido a heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variações genéticas por regras Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada qual crescerá com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de tal forma que a planta regenerada tenha as características idênticas e as características da planta transgênica parental. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por meio de micropropagação que proporciona uma reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.

[00279] A micropropagação é um processo de crescimento de novas usinas de geração a partir de uma única peça de tecido que tenha sido retirada a partir de uma planta-mãe selecionada ou cultivares. Este processo permite a reprodução em massa de plantas que possuem o tecido preferido que expressam a proteína de fusão. As novas usinas de geração que são produzidas são geneticamente idênticas, e tem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa do material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação de plantas e a qualidade e uniformidade de plantas produzidas.

[00280] A micropropagação é um procedimento em várias fases que exige a alteração das condições do meio de cultura ou crescimento entre as fases. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro fases básicas: A primeira fase, cultura de tecidos inicial; a segunda fase, de cultura de tecidos de multiplicação; terceira fase, diferenciação e formação vegetal; e fase quatro, cultura de efeito estufa e endurecimento. Durante a primeira fase, cultura inicial de tecidos, a cultura de tecidos é estabelecida e sem contaminantes certificados. Durante a segunda fase, a cultura de tecidos inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecidos seja produzido a partir das mudas para atingir as metas de produção. Durante a terceira fase, as amostras de tecidos cultivados na fase dois são divididas e crescidas em plântulas individuais. Na fase quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para o endurecimento, em que a tolerância das plantas à luz é aumentada gradualmente, de modo que elas podem ser cultivadas no ambiente natural.

[00281] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação transiente de células da folha, células do meristema apical ou toda a planta.

[00282] A transformação transiente pode ser efetuada por qualquer dos métodos de transferência direta de ADN descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de plantas modificadas.

[00283] Os vírus que se mostraram úteis para a transformação de plantas hospedeiras incluem CaMV, vírus mosaico do tabaco (TMV), vírus mosaico do bromo (BMV) e vírus mosaico comum do feijão (BV ou BCMV). A transformação de plantas usando vírus de plantas é descrita na Pat. dos EUA. No. 4.855.237 (vírus do mosaico dourado; BGV), EP-A 67.553 (TMV), pedido japonês publicado No. 63- 14693 (TMV), EPA 194809 (BV), EPA 278667 (BV); e Gluzman, Y. e colaboradores, Comunicações em Biologia Molecular.: Vetores virais, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, pp. 172-189 (1988). Partículas de Pseudovirus para utilização na expressão de DNA estranho em diversos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas em WO 87/06261.

[00284] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para as transformações transientes é avirulento e, portanto, é incapaz de causar sintomas graves, tais como a redução da taxa de crescimento, mosaico, manchas de anel, enrolamento da folha, amarelecimento, formação de estrias, formação de varíola, formação de tumores e corrosão. Um vírus avirulento apropriado pode ser um vírus avirulento que ocorre naturalmente ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser efetuada usando métodos bem conhecidos na área, incluindo, mas não limitado a, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigida, conforme descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Patologia Molecular da Planta 4:259 - 269, 2003), Gal-on e colaboradores. (1992), Atreya e colaboradores. (1992) e Huet e colaboradores. (1994).

[00285] Estirpes de vírus adequados podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis, tais como, por exemplo, Coleta de Cultura do Tipo Americana (ATCC) ou por isolamento a partir de plantas infectadas. O isolamento do vírus a partir de tecidos de plantas infectadas pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na área, tais como descritos, por exemplo por Foster e Taylor, Eds. "Protocolos de Virologia da Planta: De Isolamento do Vírus à Resistência Transgência (Métodos na Biologia Molecular (Humana Pr), Vol 81) ", Humana Press, 1998. Resumidamente, os tecidos de uma planta infectada presumivelmente contêm uma alta concentração de um vírus adequado, de preferência folhas jovens e pétalas de flores, são moídos em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada de vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[00286] Construção de vírus RNA de planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleótido exógeno não virais em plantas é demonstrado pelas referências acima, bem como por Dawson, WO e colaboradores, Virologia (1989) 172:. 285-292; Takamatsu e colaboradores. EMBO J. (1987) 6:307-311; French e colaboradores. Ciência (1986) 231:1294-1297; Takamatsu e colaboradores. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Pat. dos EUA. No. 5,316,931.

[00287] Quando o vírus é um vírus DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no próprio vírus. Por outro lado, o vírus pode ser primeiramente clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode então ser excisado do plasmídeo. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser ligada ao DNA viral, o qual é então replicado pela bactéria. A transcrição e transmissão deste DNA vai produzir a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se vírus é um vírus RNA, o vírus é geralmente clonado como um ADNc e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então usado para fazer todos os construtos. O vírus RNA é então produzido por transcrição da sequência viral do plasmídeo e a transmissão dos genes virais para produzir a proteína (s) de revestimento que encapsida o RNA viral.

[00288] Em uma realização, um polinucleótido viral da planta é provido, em que a sequência de proteína de revestimento de codificação nativa foi deletada de um polinucleótido viral, uma sequência de codificação da proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, de preferência o promotor subgenômico de sequência de codificação da proteína de revestimento não nativo, capaz de expressão no hospedeiro da planta, a embalagem do polinucleótido viral da planta recombinante, e assegurando uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleótido viral da planta recombinante, foi inserido. Por outro lado, o agente da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleótido não nativo em seu interior, de tal modo que a proteína seja produzida. O polinucleótido viral da planta recombinante pode conter um ou mais promotores adicionais subgenômicos não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transmissão ou expressão de genes adjacentes ou sequências polinucleotídicas na planta hospedeira e incapaz de recombinação entre si e com os promotores subgenômicos nativos. Sequências polinucleotídicas não nativas (estranhas) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral da planta nativa ou os promotores subgenômicos virais da planta não nativa, se mais de uma sequência de polinucleótido estiver incluída. As sequências de polinucleótidos não nativos são transmitidas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00289] Em uma segunda configuração, um polinucleótido viral da planta recombinante é provido como na primeira configuração, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativo é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos da proteína de revestimento não nativo, ao invés de uma sequência de codificação da proteína de revestimento não nativo.

[00290] Em uma terceira configuração, um polinucleótido viral da planta recombinante é provido, em que o gene da proteína de revestimento nativo é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleótido viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar os genes adjacentes em uma planta hospedeira e são incapazes de recombinação uns com os outros e com os promotores nativos subgenômicos. As sequências de polinucleótidos não nativos podem ser inseridas adjacentes aos promotores virais da planta subgenômica não nativa, de modo que as sequências são transmitidas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir os produtos desejados.

[00291] Em uma quarta configuração, um polinucleótideo viral da planta é provido como na terceira configuração, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativo é substituída por uma sequência de codificação da proteína de revestimento não nativo.

[00292] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas do revestimento codificadas pelo polinucleótido viral da planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleótido viral da planta recombinante ou vírus da planta recombinante é usado para infectar plantas hospedeiras adequadas. O polinucleótido viral da planta recombinante é capaz de se replicar no hospedeiro, disseminação sistêmica no hospedeiro, e a transmissão ou expressão do gene estranho (polinucleótido exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00293] As técnicas para a inoculação de vírus de plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Protocolos de Virologia da Planta: Do Isolamento do Vírus à Resistência Transgênica (Métodos na Biologia Molecular (Humana Pr), Vol 81) ", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Métodos na Virologia" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, SA "Métodos na Virologia da Planta", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, DGA "Virologia Aplicada à Planta", Wiley, Nova Iorque, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Princípios e Técnicas na Virologia da Planta", Van Nostrand-Reinhold, Nova Iorque.

[00294] Além do exposto acima, o polinucleótido da presente invenção pode também ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo assim a expressão do cloroplasto.

[00295] Uma técnica para a introdução de sequências de polinucleótidos exógenos no genoma de cloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos. Em primeiro lugar, as células vegetais são quimicamente tratadas, de modo a reduzir o número de cloroplasto por célula até cerca de um. A seguir, o polinucleótido exógeno é introduzido por meio de bombardeamento de partículas no interior das células, com o objetivo de introduzir, pelo menos, uma molécula polinucleotídica exógena nos cloroplastos. Os polinucleótidos exógenos selecionados de tal modo que sejam integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é facilmente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para este fim, o polinucleótido exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão de polinucleótido que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleótido exógeno inclui um marcador selecionável, que serve por procedimentos sequenciais de seleção para verificar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas de cloroplastos após tal seleção irão incluir o polinucleótido exógeno. Detalhes adicionais relativos a esta técnica são encontrados na Pat. dos EUA Nos. Nos. 4.945.050; e 5.693.507, que são aqui incorporadas por referência. Um polipéptido pode, portanto, ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e tornar-se integrado na membrana interna do cloroplasto.

[00296] Como os processos que aumentam a eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de fertilizantes, teor de óleo, produção, produção de sementes, produção de fibras, a qualidade da fibra, comprimento de fibra, taxa de crescimento, a capacidade fotossintética, biomassa, vigor, eficiência do uso da água, e/ou a tolerância ao estresse abiótico de uma planta pode envolver múltiplos genes atuando de forma aditiva ou sinérgica (ver, por exemplo, em Quesda e colaboradores., Fisiol. Da Planta 130:951-063, 2002), a presente invenção também prevê a expressão de uma pluralidade de polinucleótidos exógenos em uma única planta hospedeira para atingir, portanto, efeito superior na eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de fertilizantes, teor de óleo, produção, produção de sementes, produção de fibras, qualidade da fibra, comprimento de fibra, taxa de crescimento, capacidade fotossintética, biomassa, vigor, eficiência do uso da água, e/ou a tolerância ao estresse abiótico.

[00297] A expressão de uma pluralidade de polinucleótidos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada co-introduzindo vários construtos de ácido nucleico, cada qual incluindo um polinucleótido exógeno diferente, em uma única célula da planta. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura usando os métodos descritos acima.

[00298] Por outro lado, a expressão de uma pluralidade de polinucleótidos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada co-introduzindo em uma única célula da planta um único construto de ácido nucleico, incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleótidos exógenos. Tal construção pode ser projetada com uma sequência de promotor único que pode transmitir um mensageiro policistrônico RNA, incluindo todas as sequências diferenciadas de polinucleotido exógeno. Para permitir a co- transmissão dos polipéptidos diferentes codificados pelo RNA do mensageiro policistrônico, as sequências polinucleotídicas podem ser interligadas por uma sequência de local de entrada de ribossoma interno (IRES), que facilita a transmissão de sequências de polinucleótidos posicionados a jusante da sequência IRES. Neste caso, uma molécula RNA policistrônica transmitida que codifica os diferentes polipéptidos descritos acima serão transmitidas de ambas as extremidades revestidas e as duas sequências IRES internas da molécula RNA policistrônica para produzir na célula todos os polipéptidos diferentes. Por outro lado, o construto pode incluir várias sequências promotoras cada qual ligada a uma sequência polinucleotídica exógena diferente.

[00299] A célula da planta transformada com o construto, incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotidos exógenos, pode ser regenerada em uma planta madura, utilizando os métodos descritos acima.

[00300] Por outro lado, a expressão de uma pluralidade de polinucleótidos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes construções de ácido nucleico diferente, incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleótidos exógenos em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e progênie resultantes selecionadas para tolerância superior ao estresse abiótico, eficiência do uso da água, a eficiência do uso de fertilizantes, crescimento, biomassa, rendimento e/ou traços de vigor, usando técnicas convencionais de reprodução da planta.

[00301] De acordo com algumas configurações da invenção, o método compreende ainda o cultivo da planta que expressa o polinucleótido exógeno sob estresse abiótico.

[00302] Exemplos não limitativos de condições de estresse abiótico incluem, salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (por exemplo, inundações, alagamentos), baixa temperatura (por exemplo, estresse do frio), alta temperatura, toxicidade do metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente (por exemplo, deficiência de azoto ou limitação de azoto), excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00303] De acordo com algumas configurações da invenção, o método compreende ainda o cultivo da planta que expressa o polinucleótido exógeno sob condições que limitam o fertilizador (por ex., condições que limitam o nitrogênio). Exemplos não limitativos incluem o cultivo da planta em solos com baixo teor de nitrogênio (40- 50% do nitrogênio do conteúdo presente em condições normais ou ideais), ou mesmo sob deficiência de nitrogênio (0-10% do nitrogênio do conteúdo presente em condições normais ou condições ideais).

[00304] Portanto, a invenção engloba plantas que expressam o polinucleótido exógeno (s), os construtos de ácido nucleico e/ou de polipéptido (s) da invenção.

[00305] Uma vez expresso dentro da célula vegetal ou toda a planta, o nível do polipéptido codificado pelo polinucleótido exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na área, tais como testes de atividade, transferências de Western utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipéptido, Ensaio Imuno Adsorvente ligado à Enzima (ELISA), ensaios radio- imunes (RIE), imuno-histoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e assim por diante.

[00306] Métodos para determinar o nível da planta do RNA transcrito a partir do polinucleótido exógeno são bem conhecidos na área e incluem, por exemplo, análise Northern blot, análise de reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo quantitativa, semi-quantitativa ou em tempo real de RT-PCR) e hibridação RNA- in situ.

[00307] As informações da sequência e anotações descobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitadas em favor da reprodução clássica. Portanto, os dados de sub-sequência destes polinucleótidos acima descritos podem ser usados como marcadores para a seleção assistida por marcadores (MAS), em que um marcador é utilizado para a seleção indirecta de um determinante genético ou determinantes de um traço de interesse [por exemplo, o estresse abiótico a tolerância, a eficiência do uso da água, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção, produção de sementes, produção de fibras, a qualidade da fibra, comprimento de fibra, capacidade fotossintética, e/ou a eficiência do uso de fertilizantes (por exemplo, a eficiência de uso de nitrogênio)]. Dados de ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estarem ligados a locais polimórficos ou marcadores genéticos do genoma, tais como polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), microssatélites e polimorfismo de nucleótido único (SNP), impressão digital do DNA (DFP), polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipéptido codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.

[00308] Exemplos de seleções assistidas de marcador incluem, mas não estão limitados a, seleção para uma característica morfológica (por exemplo, um gene que afeta a forma, coloração, esterilidade masculina ou resistência, tal como a presença ou ausência de aresta, bainha da folha, coloração, altura, cor do grão , aroma de arroz); seleção de uma característica bioquímica (por exemplo, um gene que codifica uma proteína que pode ser extraída e observada; por exemplo, as isoenzimas e proteínas de armazenamento); seleção de uma característica biológica (por exemplo, corridas de agentes patogênicos ou biótipos de insetos baseados em patógeno hospedeiro ou interação de parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador, uma vez a constituição genética de um organismo pode afetar a sua susceptibilidade a agentes patogênicos ou parasitas).

[00309] Os polinucleótidos e os polipéptidos descritos acima podem ser utilizados em uma grande variedade de plantas econômicas, de uma forma segura e a baixo custo.

[00310] Portanto, de acordo com uma configuração adicional da presente invenção, é provido um método para avaliar uma característica de uma planta, o método compreendendo: (a) expressar em uma planta ou uma parte desta, o construto de ácido nucleico de algumas configurações da invenção; e (b) avaliar uma característica de uma planta, em comparação com uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (por exemplo, uma planta não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando assim a característica da planta.

[00311] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421, em que a referida planta é derivada de uma planta selecionada para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso de água, aumento da taxa de crescimento, aumento da força, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento do rendimento, aumento da produção de semente, aumento do rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética, e/ou aumento de eficiência do uso de fertilizantes (por exemplo, aumento da eficiência da utilização de azoto), em comparação com uma planta de controle, produzindo desse modo a cultura.

[00312] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421, em que a planta de colheita é derivada de plantas selecionadas para maior tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, o aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, comprimento de fibra aumentada, aumento da capacidade fotossintética, e/ou a eficiência aumentada do uso de fertilizantes (por exemplo, eficiência de utilização aumentada de azoto), em comparação com uma planta de tipo selvagem da mesma espécie que é cultivado sob as mesmas condições de crescimento, e a planta de colheita ter a maior tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, o aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade, e ou aumento da eficiência fotossintética/uso de fertilizantes (por exemplo, o aumento da eficiência no uso de nitrogênio), produzindo, assim, a cultura.

[00313] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178, em que a referida planta é derivada de uma planta selecionada para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso de água, aumento da taxa de crescimento, aumento da força, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento do rendimento, aumento da produção de semente, aumento do rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética, e/ou aumento de eficiência do uso de fertilizantes (por exemplo, aumento da eficiência da utilização de azoto), em comparação com uma planta de controle, produzindo desse modo a cultura.

[00314] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178, em que a planta de colheita é derivada de plantas selecionadas para maior tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, o aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, comprimento de fibra aumentada, aumento da capacidade fotossintética, e/ou a eficiência aumentada do uso de fertilizantes (por exemplo, eficiência de utilização aumentada de azoto), em comparação com uma planta de tipo selvagem da mesma espécie que é cultivado sob as mesmas condições de crescimento, e a planta de colheita ter a maior tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, o aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade, e ou aumento da eficiência fotossintética/uso de fertilizantes (por exemplo, o aumento da eficiência no uso de nitrogênio), produzindo, assim, a cultura.

[00315] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização da invenção é provido um método de crescimento de uma cultura compreendendo sementes de nucleação e/ou o plantio de plântulas de uma planta transformada com o polinucleótido exógeno da presente invenção, por exemplo, o polinucleótido que codifica o polipéptido de algumas configurações da invenção, em que a planta é derivada de plantas selecionadas por pelo menos uma característica seleccionada a partir do grupo consistindo de tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência de utilização de água, aumento da taxa de crescimento, aumento da força, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento de rendimento, aumento da produção de semente, aumento do rendimento da fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética, e/ou aumento de eficiência do uso de fertilizantes (por exemplo, aumento da eficiência da utilização de azoto), em comparação com uma planta não transformada.

[00316] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de ácido nucléico estabelecida em ID. DAS SEQ. N°s: 475-770 e 6179-10421, em que a planta de colheita é derivada de plantas selecionadas para pelo menos uma característica selecionada do grupo consistindo de tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, o aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, comprimento de fibra aumentada, aumento da capacidade fotossintética, e/ou a eficiência aumentada do uso de fertilizantes (por exemplo, eficiência de utilização aumentada de azoto), em comparação com uma planta não transformada, produzindo, assim, a cultura.

[00317] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de produção de uma colheita que compreende o cultivo de sementes e/ou plantio de mudas uma cultura de uma planta que expressa um polinucleótido exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo mudas de uma planta transformada com um polinucleotido exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico de cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de ácido nucléico estabelecida em ID. DAS SEQ. N°s: 1-474 e 771-6178, em que a planta de colheita é derivada de plantas selecionadas para pelo menos uma característica selecionada do grupo consistindo de tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência do uso da água, aumento da taxa de crescimento, maior vigor, aumento de biomassa, aumento do teor de óleo, o aumento da produtividade, aumento da produtividade de grãos, aumento da rendimento de fibras, aumento da qualidade da fibra, comprimento de fibra aumentada, aumento da capacidade fotossintética, e/ou a eficiência aumentada do uso de fertilizantes (por exemplo, eficiência de utilização aumentada de azoto), em comparação com uma planta não transformada, produzindo, assim, a cultura.

[00318] O efeito do transgene (o polinucleótido exógeno que codifica o polipéptido) na tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, tais como detalhado abaixo e na seção de Exemplos que se seguem.

[00319] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (ou seja, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, tais como privação de água, temperatura abaixo do ideal (baixa temperatura, alta temperatura), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, condição de estresse salino, estresse osmótico, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e radiação UV.

[00320] Teste de tolerância à salinidade - Plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal devem apresentar melhor germinação, vigor ou crescimento em teor elevado de sal. O estresse salino pode ser realizado de várias maneiras, tais como, por exemplo, irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, através do cultivo das plantas hidropónicas em uma solução de crescimento hiperosmótico (por exemplo, solução Hoagland), ou por cultura das plantas em um meio de crescimento hiperosmótico [por exemplo, 50% de meio Murashige-Skoog (meio MS)]. Visto que diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de crescimento, ou meio de crescimento pode ser ajustado de acordo com as características específicas de cultivo ou variedade da planta específica, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para obter orientações quanto à concentração adequada ver, Bernstein e Kafkafi, o crescimento da raiz no estresse salino em: Raízes de plantas, The Hidden Half 3a ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nova Iorque, 2002, e referências).

[00321] Por exemplo, um teste de tolerância à salinidade pode ser realizado pela irrigação de plantas em diferentes fases de desenvolvimento, com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, NaCl 400 mM) aplicadas do fundo e do topo para assegurar uma dispersão de sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são freqüentemente monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicas significativas apareçam em plantas do tipo selvagem. Portanto, a aparência fenotípica externa, grau de murchidão e sucesso global para atingir a maturidade e progênie de rendimento são comparados entre plantas de controle e transgênicas.

[00322] Os parâmetros quantitativos de tolerância medida incluem, mas não estão limitados ao peso médio molhado e seco, taxa de crescimento, tamanho da folha, cobertura da folha (área total da folha), peso das sementes produzidas, tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não apresentem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou exibem maior biomassa de plantas de tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00323] Teste de tolerância osmótica - Testes de osmótico (incluindo cloreto de sódio e manitol ensaios) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico é específico ao cloreto de sódio ou fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para as experiências com sal e germinação de estresse osmótico, o meio é suplementado com, por exemplo, 50 mM, 100 mM, NaCl 200 mM ou 100 mM, 200 mM de NaCl, 400 mM de manitol.

[00324] Teste de tolerância à seca/Teste osmótico - Tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevivência da planta após a privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, uma tensão osmótica produzida pelo sorbitol osmólito não iônico no meio pode ser realizada. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e crescidas em placas de ágar de plantas durante 4 dias, após os quais são transferidos para placas contendo 500 mM de sorbitol. O tratamento provoca retardo do crescimento, em seguida as plantas de controle e transgênicas são comparadas, através da medição de peso da planta (úmida e seca), rendimento, e por taxas de crescimento medidas conforme o tempo para o florescimento.

[00325] Por outro lado, as triagens secas à base do solo são realizadas com plantas que sobreexpressam os polinucleótidos acima descritos. As sementes de plantas de Arabidopsis de controle, ou outras plantas transgênicas que sobreexpressam o polipéptido da invenção são germinadas e transplantadas para vasos. O estresse seco é obtido após a irrigação ter cessado, acompanhado pelca colocação dos vasos em papel absorvente para aumentar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas de controle desenvolvem murchidão grave. As plantas são remolhadas após a obtenção de uma fração significativa das plantas de controle, que indica uma murcha grave. As plantas são classificadas em relação aos controles para cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e de recuperação (sobrevivência) após a remolhagem.

[00326] A manutenção de um fenótipo sob condição seca, em comparação com as condições normais, pode ser determinada como a "razão Seca/Normal", que representa a razão para o parâmetro especificado de resultados de condições de seca (parâmetro medido sob Seca) dividido pelo parâmetro medido em condições normais.

[00327] Tolerância ao estresse do frio - Analisar estresse causado pelo frio, (25 dias) as plantas maduras são transferidas para as câmaras de 4° C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Mais tarde, as plantas são transferidas para a estufa.

[00328] Tolerância ao estresse do calor - Tolerância ao estresse do calor é obtida por exposição das plantas a temperaturas acima de 34 °C durante um certo período. Tolerância da planta é examinada após a transferência das plantas para 22 °C para a recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não exposas a estresse do frio ou quente.

[00329] Eficiência do uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por unidade de transpiração. Para analisar WUE, o teor relativo de água da folha pode ser medido nas plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (PF) é registrado de imediato; em seguida, as folhas são embebidas durante 8 horas em água destilada a temperatura ambiente no escuro, o peso túrgido (PT) é registrado. O peso total seco (PS) é registrado após a secagem das folhas, a 60 DC para um peso constante. O conteúdo relativo de água (CRA) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Fórmula I

[00330] Eficiência do uso do fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais sensíveis aos adubos, as plantas são cultivadas em placas de agar ou vasos com uma quantidade limitada de adubo, como descrito, por exemplo, em Yanagisawa e colaboradores (Proc Natl Acad Sci US A. 2004 ; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto à sua dimensão global, tempo para o florescimento, produtividade, teor de proteína da parte aérea e/ou grãos. Os parâmetros verificados são o tamanho global da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e a produção de sementes por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o estado da planta de azoto e o grau de folha verdura está altamente correlacionado), o aminoácido e o teor total de proteína de sementes ou de outras partes de plantas, tais como folhas ou rebentos, o teor de óleo, etc. Do mesmo modo, ao invés de fornecer azoto a quantidades limitantes, fosfato de potássio pode ser adicionado em concentrações crescentes. Mais uma vez, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Desta forma, a eficiência do uso de nitrogênio (EUN), eficiência do uso de fosfato (PUE) e eficiência do uso de potássio (KUE) são avaliados, verificando a capacidade das plantas transgênicas para prosperar em condições de restrição de nutrientes.

[00331] Eficiência do uso de nitrogênio - Analisar se as plantas transgênicas (por exemplo, plantas de Arabidopsis) são mais sensíveis ao nitrogênio, plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições deficientes de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração ideal de nitrogênio).

[00332] As plantas devem crescer durante mais 25 dias, ou até a produção de sementes. As plantas são então analisadas em seu tamanho total, o tempo até à floração, rendimento, teor de proteína de rebentos e/ou grão/ produção de semente. Os parâmetros verificados são o tamanho global da planta, peso úmido e seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e a produção de sementes por planta. Outros parâmetros que podem ser testadas são: o teor de clorofila das folhas (como o estado da planta de azoto e o grau de folha verdura está altamente correlacionado), o aminoácido e o teor total de proteína de sementes ou de outras partes de plantas, tais como folhas ou rebentos, o teor de óleo. As plantas transformadas que não apresentem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou exibem maior biomassa de plantas de tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes ao uso de nitrogênio.

[00333] Teste de eficiência do uso de nitrogênio com o uso de mudas - O teste é feito de acordo com Yanagisawa-S. e colaboradores. com pequenas modificações ("Engenharia metabólica com fator de transcrição DOF1 em plantas: Melhoria da assimilação de nitrogênio e de crescimento em condições de baixo nitrogênio"Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7.833-7.838). Resumidamente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: Meio MS em que a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) foi de 0,75 mM (condições deficientes de nitrogênio) ou 6-15 mM (concentração ideal de nitrogênio). As plantas devem crescer durante mais 30-40 dias e em seguida fotografadas, individualmente removidas do agar (a foto sem as raízes) e imediatamente pesadas (peso fresco) para posterior análise estatística. Construções para as quais estão disponíveis apenas sementes T1 são semeadas em meios seletivos e pelo menos 20 mudas (cada qual representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferida para os meios de comunicação de limitação de nitrogênio. Para construções para as quais estão disponíveis Sementes T2, são analisados diferentes eventos de transformação. Normalmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para os meios limitativos de nitrogênio para crescimento durante 3-4 semanas adicionais e pesados individualmente no final desse período. As plantas transgênicas são comparadas para controlar as plantas cultivadas em paralelo nas mesmas condições. Plantas transgênicas Mock que expressam o gene uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas que carregam o mesmo promotor, mas que carecem de um gene repórter são utilizadas como controle.

[00334] Determinação de Nitrogênio - O procedimento para determinação da concentração N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter N orgânico para NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111- 113, a redução mediada por Cd modificado de NO3- para NO2(Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvância são medidos a 550 nm contra uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito detalhadamente em Samonte e colaboradores. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00335] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam a percentagem de sementes de plantas transgênicas que podem completar o processo de germinação com a percentagem de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma maneira. As condições normais são consideradas, por exemplo, as incubações a 22 °C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação de germinação e vigor da plântula é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. A mídia basal é de 50% MS médio (Murashige e Skoog, 1962 Fisiologia da Planta 15, 473- 497).

[00336] A germinação é verificada também em condições desfavoráveis, tais como frio (incubação a temperaturas inferiores a 10DC, ao invés de 22 DC), ou a utilização de soluções de inibição de sementes que contêm concentrações elevadas de um agente osmótico, tais como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, ou superior a 1000 mM) ou a aplicação de concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaCl).

[00337] O efeito do transgene do vigor da planta, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou teor de óleo pode ser determinada utilizando métodos conhecidos.

[00338] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento, tais como área foliar, comprimento das fibras, diâmetro da roseta, massa fresca e similares por vez.

[00339] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida usando a análise digital de plantas em crescimento. Por exemplo, imagens de plantas em crescimento na estufa na base podem ser captadas a cada 3 dias, e a área da roseta pode ser calculada através da análise digital. O crescimento da área da roseta é calculada utilizando a diferença de área de roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00340] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo-se a biomassa vegetal produzida, a área de roseta, o tamanho da folha ou comprimento de raiz por unidade de tempo (pode ser medida em cm2 por dia de área foliar).

[00341] Área de crescimento relativo (TCR) pode ser calculada usando a Fórmula II. Fórmula II: Área da taxa de crescimento relativo = Coeficiente de Regressão da área ao longo do decurso de tempo

[00342] Portanto, a taxa da área de crescimento relativa está em unidades de unidades de superfície (por exemplo, mm2/dia ou cm2/dia) e a taxa de crescimento em comprimento é em unidades de unidades de comprimento (por exemplo, cm/dia ou mm/dia).

[00343] Por exemplo, RGR pode ser determinado para a altura da planta (Fórmula IX), SPAD (Fórmula XIII), número de perfilhos (Fórmula XIV), comprimento da raiz (Fórmula XVII), crescimento vegetativo (Fórmula XVII), número de folhas (Fórmula XXI), área de roseta (Fórmula XXII), diâmetro da roseta (Fórmula XXIII), cobertura plot (Fórmula XXIV), área foliar da lâmina (Fórmula XX), e área foliar (Fórmula XXVI).

[00344] Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo da altura da planta = Coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do curso do tempo (medida em cm/dia).

[00345] Fórmula XIII: Taxa de crescimento relativo de SPAD = Coeficiente de Regressão de medições SPAD ao longo do decurso de tempo

[00346] Fórmula XIV: Taxa de crescimento relativo do número de perfilhos = Coeficiente de regressão do número de perfilhos ao longo decurso de tempo (medido em unidades de "número de perfilhos/dia").

[00347] Fórmula XVII: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do curso do tempo (medido em cm/dia).

[00348] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com a Fórmula XVII abaixo. Fórmula XVII: Taxa de crescimento relativo do crescimento vegetativo = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso do tempo (medido em cm2 por dia).

[00349] Fórmula XXI: Taxa de crescimento relativo do número de folha = Coeficiente de regressão do número de folha ao longo do curso do tempo (medido em número por dia).

[00350] Fórmula XXII: Taxa de crescimento relativo da área da roseta = Coeficiente de regressão da área da roseta ao longo do curso do tempo (medido em cm2 por dia).

[00351] Fórmula XXIII: Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta = Coeficiente de regressão do diâmetro da roseta ao longo do curso do tempo (medido em cm por dia).

[00352] Fórmula XXIV: Taxa de crescimento relativo da cobertura plot = Coeficiente de regressão do plot (medido em cm2 por dia).

[00353] Fórmula XX: Taxa de crescimento relativo da área de lâmina da folha = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso do tempo (medido em cm2 por dia).

[00354] Fórmula XXVI: Taxa de crescimento relativo da área da folha = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso do tempo (medido em cm2 por dia).

[00355] Produção de sementes - Avaliação da produção de sementes por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (o peso ou o tamanho) ou a quantidade (isto é, número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e divididas pelo número de plantas.

[00356] Por exemplo, o total de sementes de 8-16 plantas podem ser colhidas e pesadas, por exemplo, utilizando uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção de sementes por área de crescimento pode ser calculada da mesma forma, tendo em conta a crescente área dada de uma única planta. O aumento do rendimento de sementes por área de cultivo pode ser alcançado através do aumento da produção de sementes por planta, e/ou pelo aumento do número de plantas capazes de crescer em uma determinada área.

[00357] Além disso, o rendimento de sementes pode ser determinado através do peso de 1000 sementes. O peso das 1000 sementes pode ser determinado conformes segue: as sementes são dispersadas em uma bandeja de vidro e uma foto é tirada. Cada amostra é ponderada e, em seguida, usando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.

[00358] O peso das 1000 sementes pode ser calculado por meio da fórmula III: Fórmula III: 1000 Peso da Semente = número de semente na amostra / peso da amostra X 1000

[00359] O índice de colheita pode ser calculado utilizando fórmulas IV, V, VIII e XI abaixo. Fórmula IV: Índice de colheita (semente) = Rendimento médio de sementes por planta/ Peso médio seco Fórmula V: Índice de colheita (Sorghum) = Peso médio do grão seco por cabeça / (peso seco vegetativo médio per capita + Peso seco médio por cabeça) Fórmula VIII: Índice de Colheita (milho) = Peso médio de grãos por planta/ (Peso seco vegetativo médio por planta mais peso médio de grãos por planta)

[00360] Índice de colheita (para cevada) - O índice de colheita é calculado usando a Fórmula XI. Fórmula XI: Índice de Colheita (cevada) = Peso médio seco da espiga por planta/ (Peso seco vegetativo médio por planta mais peso médio da espiga por planta)

[00361] Segue uma lista não limitada de parâmetros adicionais que podem ser detectados para mostrar o efeito do transgene nas características da planta desejada. Fórmula VI: Circularidade do grao = 4 x 3,14 (área de grãos/perímetro2) Fórmula VII: volume do entrenó = 3,14 x (d/2) 2 xl Fórmula X: Peso normalizado da espiga por planta + peso seco vegetativo Fórmula XII: Razão Raiz/Foto = peso total da raiz na colheita/ peso total da parte vegetativa acima do solo no momento da colheita. Fórmula XV: Relação entre o número de vagens por nó na haste principal no conjunto de vagens = número total de vagens na haste principal /Número total de nós na haste principal, média de três plantas por parcela. Fórmula XVI: Razão entre o número total de sementes na haste principal com o número de sementes em ramos laterais = Número total de sementes na haste principal no conjunto de vagens/ Número total de sementes em ramos laterais no conjunto de vagens. Fórmula XXV: Área Relativa do Pecíolo = (área do Petiol)/área da roseta (medida em %).

[00362] Concentração de proteína no grão - Teor de proteína dos grãos (g de proteína de grão de m-2) como o produto da massa de grãos N (g grão N m-2) multiplicado pela taxa de conversão de proteína/N de k 5.13 (Mosse 1990, supra). Concentração de proteína no grão é estimada como o teor de proteína dos grãos por massa de unidade do grão (proteína do grão g grão kg-1).

[00363] Comprimento da fibra - O comprimento da fibra pode ser medido utilizando fibrografia. O sistema do fibrógrafo foi usado para calcular o comprimento em termos de comprimento da "Média da Metade Superior". A Média da Metade Superior (MMS) é o comprimento médio de mais de metade da distribuição das fibras. O comprimento das medidas do fibrógrafo em comprimentos em um determinado ponto percentual (Hypertext Transfer Protocol:Web (dot) cottoninc//World Wide (ponto) com/ClassificationofCotton/Pg=4#Corpo?).

[00364] De acordo com algumas configurações da invenção, o aumento de rendimento do milho pode ser manifestado como uma ou mais das seguintes características: aumento do número de plantas por área de crescimento, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de linhas por espiga, número de grãos por fileira de espiga, peso de grãos, peso de mil grãos (1000- peso), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por núcleo e aumento do teor de amido por núcleo.

[00365] Como mencionado, o aumento do rendimento das plantas pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento do rendimento de arroz pode ser manifestado pelo aumento em um ou mais das seguintes características: número de plantas por área de crescimento, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento de grãos, aumento do peso de mil grãos (1000-peso), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. O aumento no rendimento pode também resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer devido a arquitetura modificada.

[00366] Similarmente, o aumento do rendimento da soja pode ser manifestado pelo aumento em um ou mais das seguintes características: número de plantas por área de crescimento, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento de grãos, aumento de peso de mil sementes (1000-peso), reduzir pod quebra, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteína por sementes, entre outros. O aumento no rendimento pode também resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer devido a arquitetura modificada.

[00367] O aumento do rendimento da canola pode ser manifestado pelo aumento em um ou mais das seguintes características: número de plantas por área de crescimento, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento de grãos, aumento de peso de mil sementes (1000-peso), reduzir pod quebra, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. O aumento no rendimento pode também resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer devido a arquitetura modificada.

[00368] O aumento do rendimento do algodão pode ser manifestado pelo aumento em um ou mais das seguintes características: número de plantas por área de crescimento, número de capulhos por planta, número de sementes por capulhos, aumento da taxa de enchimento de sementes, aumento de peso de mil sementes (1000-peso), aumento no teor de óleo por semente, aumento no comprimento da fibra, resistência da fibra, entre outros. O aumento no rendimento pode também resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer devido a arquitetura modificada.

[00369] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado por extração do óleo da semente ou a parte vegetativa da planta Resumidamente, os lípidos (óleo) podem ser removidos a partir da planta (por exemplo, sementes) por trituração do tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e extração do óleo em um extrator contínuo. A análise indireta de conteúdo de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos, tais como Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida por átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver, por exemplo, Conway TF. . Earle e FR de 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN:: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)]; Espectroscopia do infravermelho próximo (IP) que utiliza a absorção de energia do infravermelho próximo (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no documento WO/2001/023884, que se baseia na extração de petróleo de um solvente, a evaporação do solvente sob uma corrente de gás que forma partículas de óleo, e dirige uma luz para dentro da corrente de gás e partículas de óleo que forma uma luz refletida detectável.

[00370] O rendimento de óleo de semente pode ser calculado da seguinte forma: O rendimento da semente por planta (gr.) Óleo % em semente.

[00371] Portanto, a presente invenção é de elevado valor agrícola para promover o rendimento de culturas comercialmente desejadas (por exemplo, biomassa de órgãos vegetativos, tais como madeira de choupo, ou órgão reprodutor, tais como o número de sementes ou biomassa das sementes).

[00372] Qualquer das plantas transgênicas descritas anteriormente ou suas partes podem ser processadas para produzir uma preparação de alimentos para animais, refeição, proteína ou óleo, tal como para os animais ruminantes.

[00373] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo podem ser usadas para produzir o óleo vegetal (por extração do óleo a partir da planta).

[00374] O óleo vegetal (incluindo o óleo de semente e/ou a parte do óleo vegetal) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Produtos exemplares incluem alimentação animal, matéria-prima para a modificação química, plástico biodegradável, blended produto alimentar, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, lanche alimentos, cosméticos, e processo de fermentação de matéria-prima. Produtos exemplares a serem incorporados ao óleo vegetal incluem alimentos para animais, produtos alimentares humanos, como salgadinhos extrusados, pães, como um agente de ligação alimentar, alimentos de aquicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas esportivas, barras de alimentos nutricionais, suplementos multi-vitamínicos, bebidas dietéticas e alimentos à base de cereais.

[00375] De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[00376] De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo da parte vegetativa (óleo da parte vegetativa da planta).

[00377] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula da planta forma uma parte de uma planta.

[00378] De acordo com outra configuração da presente invenção, é provido um alimento que compreende as plantas ou partes das mesmas da presente invenção.

[00379] Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de" refere-se a ±10%.

[00380] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e os seus conjugados significam "incluindo mas não limitado a".

[00381] O termo "constituído por" significa "incluindo e limitado a".

[00382] O termo "consistindo essencialmente em" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, as etapas e/ou partes, mas só se os ingredientes, as etapas e/ou partes adicionais que não alteram materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00383] Tal como utilizado na especificação e nas reivindicações, a forma singular de "a", "um", e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo as suas misturas.

[00384] Ao longo deste pedido, várias configurações da presente invenção podem ser apresentadas em uma gama de formatos. Deve ser entendido que a descrição em uma gama de formatos é apenas por conveniência e brevidade, e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível quanto ao âmbito da invenção. Por conseguinte, a descrição de uma gama deve ser especificamente divulgada para todas as possíveis sub-gamas, bem como valores numéricos individuais dentro desta gama. Por exemplo, a descrição de uma gama tal como entre 1 e 6 deve ser considerada como tendo subintervalos especificamente descritos, tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, a partir de 3 a 6, etc., bem como os números individuais dentro dessa gama, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto aplica-se independentemente da extensão da gama.

[00385] Sempre que uma gama numérica é indicada neste documento, que se destina a incluir qualquer número citado (fracionado ou integral) dentro da gama indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indica um segundo número indica e "variando/varia de" um primeiro número indica "para" um segundo número indica são aqui utilizados indiferentemente e pretendem incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os números fracionários e integrais entre os mesmos.

[00386] Tal como aqui utilizado, o termo "método" refere-se a modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitado a, práticas, meios, técnicas e procedimentos quer conhecidos, ou facilmente desenvolvidos a partir de práticas conhecidos, meios, técnicas e procedimentos por praticantes das áreas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00387] Quando é feita referência à listagem de sequências específicas, tal referência deve ser entendida para abranger também sequências que correspondem substancialmente com a sua sequência complementar como incluindo variações de sequência menores, resultante de, por exemplo, erros de sequenciação, clonagem de erros, ou outras alterações que resultam na substituição de bases, supressão de base ou de adição de base, desde que a frequência de tais variações seja menos de 1 em 50 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em 100 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em cada 200 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em 500 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em cada 1000 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em 5.000 nucleotídeos, em alternativa, menos de 1 em 10.000 nucleotídeos.

[00388] É apreciado que certas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de realizações separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma única realização. Por outro lado, várias características da invenção que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada ou apropriada em qualquer outra configuração descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias configurações não devem ser consideradas características essenciais dessas configurações, a menos que a configuração seja inoperativa sem estes elementos.

[00389] Várias realizações e aspectos da presente invenção, tal como delineado acima e conforme

[00390] Reivindicado nas reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos que se seguem.

EXEMPLOS

[00391] É agora feita referência aos exemplos seguintes, que em conjunto com as descrições acima ilustram algumas configurações da invenção de uma forma não limitativa.

MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA

[00392] Extração de RNA - Tecidos em crescimento em várias condições de crescimento (como descrito abaixo) foram amostrados e RNA foi extraído usando o reagente TRIzol de Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) invitrogen (ponto) com/content (dot) cfm? pageid=469]. Cerca de 30-50 mg de tecido foi retirado das amostras. Os tecidos pesados foram moídos usando pilão em nitrogênio líquido e novamente suspensos em 500 μl de Reagente TRIzol. O RNA foi eluído em 30 μl de água isenta de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza do minikit Qiagen em conformidade com o protocolo do fabricante (Qiagen Inc., CA EUA). Para conveniência, cada tipo de tecido com as informações da expressão do micro-arranjo recebeu uma ID do Conjunto da expressão. Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados de acordo com algumas configurações da invenção, em que os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as IDs da correlação ) foram usados como "eixo x" para a correlação com a transcrição do tecido que foi utilizado como o "eixo Y ". Para cada gene e parâmetro medido, um coeficiente de correlação "R" foi calculado (utilizando a correlação de Pearson), juntamente com um valor de p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de expressão de um gene num tecido específico e um desempenho fenotípico entre ecótipo/variedade/híbrido é elevado em termos de valor absoluto (entre 0,5-1), existe uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão deste gene) a característica fenotípica (por exemplo, o aumento da eficiência da utilização de azoto, a tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento e assim por diante).

Exemplo 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO, RENDIMENTO E IMPORTANTES TRAÇOS AGRONÔMICOS EM PLANTAS

[00393] Os presentes inventores identificaram polinucleotideos cuja regulação positiva de expressão dos mesmos pode aumentar a tolerância ao estresse abiótico (ABST), uso eficiente da água (EUA), produtividade, teor de óleo, taxa de crescimento, vigor, biomassa, produção de fibra e qualidade, eficiência no uso de nitrogênio (EUN) e eficiência do uso de fertilizantes (EUF) de uma planta.

[00394] Todos os conjuntos de dados de sequências de nucleotídeos usados aqui foram originados a partir de banco de dados publicamente disponíveis ou da realização de sequenciamento utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de plantas foram introduzidos em um único banco de dados abrangente. Outras informações sobre a expressão gênica, anotação de proteínas, enzimas e vias também foram incorporados. As principais bancos de dados utilizados incluem: Genomas Genoma de Arabidopsis [TAIR versão genoma 6 (Protocolo de transferência de hipertexto:// World Wide Web (dot) Arabidopsis (ponto) org/)] Genoma do arroz [IRGSP construir 4.0 (Hypertext Transfer Protocol:// rgp (dot) dna (dot) affrc (dot) ir (dot) jp/IRGSP/)]. Poplar [Populus trichocarpa liberar 1.1 de JGI (montagem v1.0 release) (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) genoma (dot) JGI-psf (ponto) org/)] Braquipodium [JGI 4x montagem, Protocolo de transferência de hipertexto:// World Wide Web (dot) brachpodium (ponto) org)] Soja [DOE-JGI SCP, versão Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) phytozome (ponto) net/)] Grape [Francês Italiano-Consórcio Público para Grapevine Genome Caracterização genoma da videira (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) Genoscope (DOT) CNS (dot) fr /)] Castobean [TIGR/J Craig Venter Institute 4x montagem [HYPERLINK "http://msc.jcvi.org/r_communis": // msc (dot) JCVI (ponto) org / r_communis] Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbi1 (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) phytozome (ponto) net/)] Genoma parcialmente montado de milho [Protocolo de transferência de hipertexto:// maizesequence (ponto) org/] ESTs e mRNA expressos foram extraídos dos seguintes bancos de dados: Versões GenBank 154, 157, 160, 161, 164, 165, 166 e 168 (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/dbEST/) RefSeq (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/RefSeq/). TAIR (Protocolo de transferência de hipertexto:// World Wide Web (dot) Arabidopsis (ponto) org/)] Proteína e Bancos de dados UniProt [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) UniProt (ponto) org/]. AraCyc [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) Arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (dot) jsp]. ENZIMA [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// ExPASy (ponto) org/enzima/]. Conjuntos de dados de microarranjos foram baixados a partir de: GEO (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) TAIR (Protocolo de transferência de hipertexto:// World Wide Web.arabidopsis.org/). Dados de microarranjos de propriedade (WO2008/122980 e Exemplo 2 abaixo). Informações QTL e SNPs Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) gramene (dot) org/qtl/]. Panzea [Protocolo de Transferência de Hipertexto://World Wide Web (dot) panzea (dot) org/index (dot) html].

[00395] Database assembly - foi desenvolvido para construir um banco de dados amplo, rico, confiável e fácil para analisar o banc de dados composto das sequências genômicas disponíveis publicamente mRNA, ESTs DNA, dados de diversas culturas, bem como a expressão de genes, anotação de proteínas e QTLs de dados da via, e outras informações relevantes.

[00396] A montagem do banco de dados é composta por uma caixa de ferramentas de refinamento, estruturação e anotação do gene, e ferramentas de análise que permitem a construção de um banco de dados personalizado para cada projeto de descoberta do gene. As ferramentas de refinamento e estruturação do gene permitem detectar de forma confiável variantes de encaixe e transcritos anti- sentido, gerando compreensão de vários resultados fenotípicos possíveis de um único gene. Os recursos da plataforma "LEADS" de Compugen LTD para a análise do genoma humano foram confirmados e aceitos pela comunidade científica [ver, por exemplo, "Divulgação da Transcrição Anti-Sentido", Yelin, e colaboradores. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev- Maor, e colaboradores. (2003) Science 300 (5623), 1288-1291; “Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information”, Xie H e colaboradores. Genomics 2002], e provaram ser mais eficientes também na genômica da planta.

[00397] Agrupamento EST e montagem do gene - Para armazenamento do gene e montagem de organismos com dados disponíveis do sequenciamento de genoma (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, Brachypodium, choupo, soja, sorgo) a versão LEADS genômica (GANG) foi empregada. Esta ferramenta permite o agrupamento mais preciso das sequências ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura do gene, bem como eventos de emenda alternativa e transcrição anti-sentido.

[00398] Para os organismos sem dados completos disponíveis do sequenciamento de genoma, software de agrupamento de LEADS expressos foi aplicado.

[00399] Anotação de gene - Genes e proteínas previstas foram anotados conforme segue Pesquisa de explosão [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// explosão (ponto) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] contra todos planta UniProt [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) UniProt (ponto) org/] sequências foi realizada. Quadros de leitura abertos de cada transcrição putativa foram analisados e ORF mais longo com maior número de homólogos foi selecionado como proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas por InterPro [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (ponto) uk/Interpro/].

[00400] Explosão contra proteínas de AraCyc e bancos de dados de ENZIMA foi usado para mapear as transcrições previstas para vias AraCyc.

[00401] Proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas usando o algoritmo de explosão [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] para validar a precisão da sequência prevista da proteína para a detecção eficiente de ortólogos.

[00402] Perfil de expressão gênica - Várias fontes de dados foram exploradas para o perfil de expressão gênica, ou seja, os dados de microarranjos e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil de expressão gênica, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são co-regulados por diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associadas a diferentes fenótipos.

[00403] Conjuntos de dados de microarranjos publicamente disponíveis foram baixados de sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados, e integrados no banco de dados. O perfil da expressão é um dos dados de recursos mais importantes para a identificação de genes importantes para ABST, aumento da produtividade, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, WUE, NUE e FUE de uma planta.

[00404] Um resumo do perfil de expressão digital foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequência que compõem o agrupamento. Expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que mostra o perfil de expressão virtual com base nas sequências de EST que formam o aglomerado de genes. A ferramenta provê o perfil de expressão de um agrupamento em termos de anatomia vegetal (por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso), estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento em que um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (fornece as condições fisiológicas em que um gene é expresso, tais como a seca, frio infecção patogênica, etc). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos diferentes grupos, a expressão digital oferece um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um grupo dotado de um total de N ESTs para conter X ESTs a partir de um determinado conjunto de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, o seguinte é levado em consideração: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número total de ESTs disponíveis representando as espécies. Portanto, os agrupamentos com baixos valores de probabilidade estão altamente enriquecidos com ESTs a partir do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.

[00405] Recentemente, a precisão deste sistema foi demonstrada por Portnoy e colaboradores, 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) em.: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. Análise do transcriptoma, com base na abundância relativa EST em dados foi realizada por 454 pirosequenciamento de cDNA representando mRNA do melão. Quatorze amostras cDNA de vertente dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos do fruto (polpa e casca) e quatro estágios de desenvolvimento foram sequenciados. Pirosequenciamento GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizados e purificadas rendeu 1.150.657 etiquetas de sequências expressas, que formaram 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra o Banco de Dados Genômico Cucurbit [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) icugi (ponto) org/] confirmou a precisão do sequenciamento e montagem. Padrões de expressão de genes selecionados ajustou-se bem aos seus dados qRT-PCR.

Exemplo 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA CAPACIDADE COM RENDIMENTO, NUE, E PARÂMETROS ABSTRATOS RELACIONADOS MEDIDOS EM CAMPOS USANDO MICRO-ARRANJOS OLIGONUCLEOTÍDEOS SORGO 44K

[00406] A fim de produzir uma análise de correlação de rendimento elevado entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleótido de sorgo, produzida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (ponto) chem. (Ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (dot) asp? LPage=50879]. O oligonucleotídeo matriz representa cerca de 44.000 genes de sorgo e transcrições. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA com ABST, rendimento e componentes NUE ou parâmetros de vigor relacionados, foram analisadas diversas características das plantas de 17 diferentes híbridos de sorgo. Entre eles, 10 híbridos que englobam a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada através do teste de correlação de Pearson [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00407] Correlação de variedades de sorgo através de ecótipos cultivados sob condições de crescimento normais, condições de seca severa e baixas condições de nitrogênio

Procedimentos experimentais

[00408] 17 Variedades de sorgo foram cultivadas em três lotes repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de crescimento foi o seguinte:

[00409] 1. Condições normais de crescimento: plantas de sorgo foram cultivadas no campo, utilizando protocolos comerciais de fertilização e irrigação, que incluem 370 m3 de água por dunam (1000 m2) por todo o período de crescimento e fertilização de 14 unidades de URAN® 21% (Solução de Fertilizante de Nitrogênio; Vendas PCS, Northbrook, IL , EUA) (condições normais de crescimento).

[00410] Condições de seca: sementes de sorgo foram semeadas em solo e cultivadas sob condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, em torno de estágio V8 (oito folhas verdes são totalmente expandidas, não inicializadas). Neste ponto, a irrigação é interrompida, e estresse hídrico severo foi desenvolvido.

[00411] Baixas condições de adubação nitrogenada: plantas de sorgo foram adubadas com 50% menos da quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de crescimento regular. Todo o fertilizante foi aplicado antes da floração.

[00412] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados por cada tratamento. Tecidos [folha da bandeira, meristema de flor e flor] de plantas que crescem em condições normais, severo estresse hídrico e baixas condições de nitrogênio foram amostrados e RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido das informações da expressão do micro- arranjo recebeu uma ID do Conjunto tal como resumido na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Conjunto da Expressão transcriptom sorgo em experimentos de campo

Tabela 1: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptom do sorgo. Folha da bandeira = a folha abaixo da flor; meristema da flor = Meristema apical após o início da panícula; Flor = a flor no dia da antese.

[00413] Os seguintes parâmetros foram coletados por meio de sistema digital de imagens:

[00414] Área média de grãos (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00415] A razão superior e inferior méda da área de grãos, largura, comprimento, diâmetro e perímetro - projeção de grãos da área, largura, comprimento, diâmetro e perímetro foram extraídos das imagens digitais usando imagem do pacote da fonte aberta (NIH). Dados de sementes foram analisados em níveis médios de lote como se segue:

[00416] Média de todas as sementes.

[00417] Média de fracção superior a 20% - continha fração 20% superior de sementes.

[00418] Média de fração 20% inferior- continha fração 20% inferior de sementes.

[00419] Além disso, a relação entre cada fração e média do lote foi calculada para cada um dos parâmetros de dados.

[00420] No final do período de crescimento, 5 “cabeças” foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo.

[00421] Comprimento médio do grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos fo grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00422] Área média da cabeça (cm2) - No final do período de crescimento, 5 “cabeças” foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da Cabeça foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Cabeças.

[00423] Comprimento médio da cabeça (cm) - No final do período de crescimento, 5 'cabeças' foram fotografadas, e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da Cabeça foi medido a partir dessas imagens e foi dividido pelo número de Cabeças.

[00424] Largura média da cabeça (cm) - No final do período de crescimento, 5 'cabeças foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A largura da Cabeça foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Cabeças.

[00425] Perímetro médio da cabeça (cm) - No final de período de crescimento, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O perímetro da Cabeça foi medido a partir dessas imagens e foi dividido pelo número de Cabeças.

[00426] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1,37, o software de processamento de imagem baseado em Java, que foi desenvolvido nos EUA National Institutes of Health e está disponível gratuitamente na internet em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em uma baixa compressão no formato JPEG (padrão do grupo Joint Photographic Experts). A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para a área de sementes e o comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

[00427] Os parâmetros adicionais foram coletados para amostragtem de 5 plantas por lote ou medindo o parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00428] Peso total de sementes por cabeça (produção de grãos) (gr.) - No final do experimento ("Cabeças” da planta) cabeças dentro de blocos AC foram coletadas 5 cabeças foram separadamente trilhadas e grãos foram ponderados, todas as cabeças adicionais foram trilhadas juntas e ponderadas. O peso médio de grãos por cabeça foi calculado dividindo-se o peso total de grãos por número total de cabeças por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total de grãos das 5 cabeças foi dividido por 5.

[00429] PF (peso fresco) cabeça por planta (gr.) - No final do experimento (quando foram colhidas cabeças) total de cabeças e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro de blocos AC foram colhidas separadamente. As cabeças (totais e 5) foram pesadas (gr.) separadamente, e o peso médio fresco por planta foi calculado para o total (PF Cabeça/Planta gr. baseado no lote) e por 5 cabeças (Cabeça/Planta PF. baseado em 5 plantas).

[00430] Peso da planta - As plantas foram caracterizadas em altura durante o período de crescimento de 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas em sua altura usando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da maior folha.

[00431] Número da folha da planta - As plantas foram caracterizadas por número da folha durante o período de crescimento em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto ao seu número de folhas, contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00432] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta 502 SPAD e medição foi realizada 64 dias pós a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feita em pequenas folhas completamente desenvolvidas. Três medidas foram tomadas por folha por lote.

[00433] Peso fresco vegetativo e Cabeças - No final, fazer experimento (Quando uma inflorescencia estava seca) Toda inflorescencia e materiais coletados vegetativo were de lotes dentro dos blocos AC. A biomassa e peso das cabeças de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de cabeças.

[00434] Biomassa vegetal (peso fresco) - No final do experimento (quando a inflorescência estava seca) o material vegetativo dos lotes dentro de blocos AC foram coletados. A biomassa das plantas sem a inflorescência foi medida e dividida pelo número de plantas.

[00435] PF (peso fresco) cabeças/(PF cabeças + PF Plantas) - O peso fresco total de cabeças e sua respectiva biomassa de planta foram medidos no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e plantas.

[00436] Peso Seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo raízes) após secagem a 70 DC no forno durante 48 horas. Índice de colheita ((Sorgo) - O índice de colheita foi calculado usando a Fórmula V. Fórmula V:

[00437] Índice de colheita (Sorghum) = Peso médio do grão seco por cabeça / (peso seco vegetativo médio per capita + Peso seco médio por cabeça)

[00438] Parâmetros de dados colhidos são resumidos na Tabela 2, aqui a seguir Tabela 2 Parâmetros Sorgo correlacionados (vetores)

Tabela 2. Parâmetros correlacionados Sorgo (vetores). “gr” = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "PF" = peso fresco; "PS" = peso seco; condições de crescimento = padrão "normal"; "DPS" = dias pós-semeadura; "Baixo N" = condições baixo teor de azoto; "PF Cabeça" = peso fresco das cabeças colhidas foi dividido pelo número de cabeças fenotipadas; "Área do Grão Médio da Razão Inferior" = área de grãos da fração menor de grãos.

Resultados Experimentais

[00439] 17 diferentes híbridos de sorgo foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros (Tabela 2). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 38) e uma análise de correlação posterior foi realizada (Tabela 9). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 3 Parâmetros medidos em acessos de sorgo em condições normais

Tabela 3: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), sob condições normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 4 Parâmetros adicionais medidos em acessos de sorgo em condições normais

Tabela 4: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), sob condições normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 5 Parâmetros medidos em acessos de sorgo em condições de nitrogênio baixo

Tabela 5: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), sob condições normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 6 Parâmetros adicionais medidos em acessos de sorgo em condições de crescimento de nitrogênio baixo

Tabela 6: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), em condições de baixo nitrogênio. As Condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 7 Parâmetros medidos em acessos de sorgo em condições . secas

Tabela 7: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), sob condições secas. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 8 Parâmetros adicionais medidos em acessos de sorgo em condições secas de crescimento

Tabela 8: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medido em acessos de sorgo (ID da semente), sob condições secas. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 9 Correlação entre o nível de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob baixa nitrogênio, condições normais ou de estresseou seca em todos os acessos sorgo

Tabela 9. As correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "Corr. ID "- ID de ajuste de correspondência de acordo com os parâmetros da tabela correlacionada acima. "Exp. Set "- Expressão set. “R” = coeficiente de correlação Pearson; "P" = valor p.

Exemplo 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA CAPACIDADE COM RENDIMENTO, NUE, E PARÂMETROS ABSTRATOS RELACIONADOS MEDIDOS EM CAMPOS USANDO MICRO-ARRANJOS OLIGONUCLEOTÍDEOS SORGO 65K

[00440] A fim de produzir uma análise de correlação de rendimento elevado entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleótido de sorgo, produzido por Agilent Technologies [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (ponto) chem. (Ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (dot) asp? LPage=50879]. O oligonucleotídeo matriz representa cerca de 65.000 genes de sorgo e transcrições. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA com ABST, rendimento e componentes NUE ou parâmetros de vigor relacionados, foram analisadas diversas características das plantas de 12 diferentes híbridos de sorgo. Entre eles, 8 híbridos que englobam a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada através do teste de correlação de Pearson [Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00441] 12 Variedades de sorgo foram cultivadas em três lotes repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de crescimento foi o seguinte:

[00442] Condições normais de crescimento: plantas de sorgo foram cultivadas no campo, utilizando protocolos comerciais de fertilização e irrigação, que incluem 452 m3 de água por dunam (1000 m2) por todo o período de crescimento e fertilização de 14 unidades de URAN® 21% (Solução de Fertilizante de Nitrogênio; Vendas PCS, Northbrook, IL , EUA) (condições normais de crescimento).

[00443] Condições de seca: sementes de sorgo foram semeadas em solo e cultivadas sob condição normal até estádio de florescimento (59 dias após a semeadura), tratamento de seca foi imposta por irrigar plantas com 50% de água em relação ao tratamento normal a partir desta fase [309 m3 de água por dunam (1000 metros quadrados ) por todo período de crescimento].

[00444] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 12 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados por cada tratamento. Tecidos [folha da bandeira, tronco superior, parte inferior do caule, flores, grãos] representando diferentes características das plantas, de plantas que crescem em condições normais e condições de estresse da seca foram amostrados e RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido das informações da expressão do micro-arranjo recebeu uma ID do Conjunto tal como resumido na Tabela 10 abaixo. Tabela 10 Conjunto da Expressão transcriptom sorgo . em experimentos de campo

Tabela 10: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptom do sorgo. Folha da bandeira = folha abaixo da flor.

[00445] Componentes de produção de sorgo e avaliação de parâmetros relacionados ao vigor - As plantas foram fenotipadas como mostrado nas Tabelas 11-12 abaixo. Os seguintes parâmetros foram coletados por meio de sistema digital de imagens:

[00446] Área média de grãos (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos. Comprimento médio do grão (cm) No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00447] Comprimento médio do grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00448] Perímetro médio do grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00449] Circularidade do grão - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da 'cabeça' da planta. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A circularidade dos grãos foi calculada com base na fórmula geral VI. Fórmula VI: Circularidade do grao = 4 x 3,14 (área de grãos/perímetro2)

[00450] Área média da cabeça (cm2) - No final do período de crescimento, 8 “cabeças” foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da Cabeça foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Cabeças.

[00451] Comprimento médio da cabeça (cm) - No final do período de crescimento, 8 'cabeças' foram fotografadas, e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da Cabeça (eixo mais longo) foi medido a partir dessas imagens e foi dividido pelo número de Cabeças.

[00452] Largura média da cabeça (cm) - No final do período de crescimento, 8 'cabeças foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A largura da Cabeça (eixo mais longo) foi medido a partir dessas imagens e foi dividido pelo número de Cabeças.

[00453] Foi utilizado um sistema de processamento de imagem, que consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível gratuitamente na internet em http://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00454] Parâmetros adicionais foram coletados por meio de amostragem de 8 plantas por lote ou pela medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00455] Peso seco de cabeça no enchimento do grão (gr.) - 5 cabeças por lote foram coletadas no estágio de enchimento do grão (R2-R3) e pesadas após secagem em forno (peso seco).

[00456] Pesos secos de cabeça na colheita (gr.) - Ao fim do período de crescimento, as cabeças foram coletadas (estágio de colheita), de 8 plantas por lote ou do restante das plantas no lote. As cabeças foram pesadas após secagem em forno (peso seco), e foi calculada a média de peso de cabeça por planta ou por lote.

[00457] Rendimento total da semente (gr.) - Ao fim do período de crescimento, as cabeças foram coletadas (estágio de colheita). 8 cabeças foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados. A média de peso dos grãos por planta foi calculada dividindo o peso de grãos total pelo número de plantas. Peso de 1000 sementes [gr] - peso de 1000 sementes por lote. Número de grãos (num.) - foi calculado dividindo o rendimento da semente por peso de 1000 sementes.

[00458] Altura da planta (cm.) - As plantas foram caracterizadas quanto a aultira durante o período de crescimento em 6 pontos de tempo (inclusive na colheita). Em cada medição, as plantas foram medidas quanto a altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.

[00459] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e as medições foram realizadas nos estágios de início de enchimento do grão (SPAD_earlyGF) e fim de enchimento do grão (SPAD_lateGF). As leituras do medidor SPAD foram realizadas em folhas completamente desenvolvidas. Foram tomadas três medições por folha por planta.

[00460] Peso seco e fresco vegetativo por planta (gr.) - Ao fim do período de crescimento, todo o material vegetativo (exceto raízes) dos lotes foi coletado e pesado antes (peso fresco) e após (peso seco) secagem em forno. A biomassa por planta foi calculada dividindo a biomassa total pelo número de plantas.

[00461] Teor de água relativo (RWC - relative water content, %) - no estágio de enchimento do grão, foram coletadas folhas de 5 plantas por lote. As medições de teor de água relativo foram realizadas como segue: o peso fresco (FW - fresh weight) foi registrado imediatamente após a amostragem da folha; então, as folhas foram imersas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW - turgid weight) foi registrado. O peso seco (DW - dry weight) total foi registrado após secar as folhas a 60 DC até um peso constante. O teor de água relativo (RWC) é calculado de acordo com a Fórmula Formula I (acima).

[00462] Área específica da folha (SLA - specific leaf area)) - no estágio de enchimento do grão, foram coletadas folhas de 5 plantas por lote. As folhas foram escaneadas para obter a área de folha por planta, e então as folhas foram secas em um forno para obter o peso seco das folhas por planta. A área específica da folha foi calculada pela área da folha dividida pelo peso seco da folha.

[00463] Condutância estomática (F) (GF) (mmol m-2 s-1) - as plantas foram avaliadas quanto à condutância de seus estômatos utilizando um Porômetro Foliar SC-1 (Decagon devices) nos estágios de floração (F) e enchimento do grão (GF). As leituras de condutância estomática foram realizadas em folhas completamente desenvolvidas, para 2 folhas e 2 plantas por lote.

[00464] Comprimento (cm), largura (cm) e volume (cm3) do entrenó superior - Entrenós superiores de pelo menos 5 plantas por lote foram separados da planta durante a floração (F) e na colheita (H). Os entrenós foram medidos quanto a seu comprimento (l) e largura (d) utilizando uma régua e um paquímetro. O volume do entrenó foi calculado utilizando a Fórmula VII. Fórmula VII: volume do entrenó = 3,14 x (d/2) 2 x l

[00465] Densidade fresca e seca do entrenó superior (F) e (H) (gr/cm3) - Esses parâmetros foram medidos em dois pontos de tempo durante o curso do experimento: na floração (F) e na colheita (H). Os entrenós superiores de pelo menos 5 plantas por lote foram separados da planta e pesados (peso fesco e seco). Para obter a densidade do caule, o peso do caule (fresco ou seco) foi dividido pelo volume do caule (vide acima).

[00466] Comprimento (cm), largura (cm) e volume (cm3) do entrenó inferior - Entrenós superiores de pelo menos 5 plantas por lote foram separados da planta durante a floração (F) e na colheita (H). Os entrenós foram medidos quanto a seu comprimento (l) e largura (d) utilizando uma régua e um paquímetro. O volume do entrenó foi calculado utilizando a Fórmula VII acima.

[00467] Densidade fresca e seca do entrenó inferior (F) e (H) (gr/cm3) - Esses parâmetros foram medidos em dois pontos de tempo durante o curso do experimento: na floração (F) e na colheita (H). Entrenós inferiores de pelo menos 5 plantas por lote foram separados da planta e pesados (peso fresco e seco). Para obter a densidade do caule, o peso do caule (fresco ou seco) foi dividido pelo volume do caule (vide acima).

[00468] Número de dias até o espigamento [num] - Calculado como o número de dias a partir da semeadura até que 50% do lote atinja o espigamento.

[00469] Número de dias até maturidade [num] - Calculado como o número de dias a partir da semeadura até que 50% do lote atinja a maturidade da semente.

[00470] Manutenção de desempenho em condições de seca: Representa a razão para o parâmetro especificado de resultados de condição de Seca dividido pelos resultados de condições Normais (mmanutenção do fenótipo em seca em comparação a condições normais).

[00471] Os parâmetros de dados coletados são resumidos nas Tabelas 11-12, abaixo. Tabela 11 Parâmetros correlacionados a Sorgo em condições de seca (vetores)

Tabela 11. São fornecidos os parâmetros corelacionados a Sorgo (vetores). “gr.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; "FW" = Peso Fresco da; “DW” = Peso Seco da planta; “GF” = estágio de crescimento de enchimento do grão; “F” = estágio de floração; “H” = estágio de colheita. Tabela 12 Parâmetros correlacionados a Sorgo para manutenção em condições de seca (vetores)

Tabela 12. São fornecidos os parâmetros corelacionados a Sorgo (vetores). “gr.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; "FW" = Peso Fresco da planta; “DW”= Peso Seco da plant; “Manutenção em seca” = calculada % de alteração em seca vs. condições de crescimento normais. “GF” =estágio de crescimento e enchimento do grão; “F” = estágio de floração; “H” = estágio de colheita. “D/N” = razão para o parâmetro especificado de resultados de condição de Seca dividido pelos resultados de condições Normais (manutenção de fenótipo em seca em comparação a condições normais).

Resultados Experimentais

[00472] Doze híbridos de sorghum diferentes foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros (Tabelas 11-12). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 13-18) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabelas 19-20). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 13 Tabela 13: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de sorgo (Linhagem) em condições de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimenta"

Tabela 14 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo em condições de crescimento em seca

Tabela 14: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 15 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo em condições de crescimento em seca

Tabela 15: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) em condições de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 16 Parâmetros calculados em acessos de Sorgo em condições de seca (manutenção de desempenho em condições de crescimento em seca vs. normais)

Tabela 16: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de sorghum (Linhagem) para manutenção de desempenho em seca (calculados como % de mudança em condições de crescimento em seca vs normais). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental Tabela 17 Parâmetros adicionais calculados em acessos de Sorgo em condições de seca (manutenção de desempenho em condições de crescimento em seca vs normais)

Tabela 17: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de sorghum (Linhagem) para manutenção de desempenho em seca (calculados como % de mudança em condições de crescimento em seca vs normais). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 18

[00473] Parâmetros adicionais calculados em acessos de Sorgo em condições de seca (manutenção de desempenho em condições de crescimento em seca vs normais)

Tabela 18: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de sorghum (Linhagem) para manutenção de desempenho em seca (calculados como % de mudança em condições de crescimento em seca vs normais). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 19 Correlação entre o nível de expressão dos genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de stress de seca dentre acessos de Sorgo

Tabela 19. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 20 Correlação entre o nível de expressão dos genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção nos diversos tecidos e o desempenho fenotípico de manutenção de desempenho em seca dentre acessos de Sorgo

Tabela 20. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGHUM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT COM PARÂMETROS RELACIONADOS A BIOMASSA, EUN, E TEA MEDIDOS EM CONDIÇÕES SEMIHIDROPÔNICAS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 44K OLUGONUCLEOTÍDEOS DE SORGUHM Parâmetros referentes a vigor de Sorgo em condições de alta salinidade (NaCl 100 mM), baixa temperatura (10 ± 2 °C), baixo nitrogênio e condições de crescimento normais - Dez híbridos de Sorgo foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa em condições semihidropônicas. De forma resumida, o protocolo de cultivo foi como segue: As sementes de Sorgo foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculita e turfa em uma razão de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para Condições de crescimento normais (Hoagland Completa contendo solução de Nitrogênio 16 mM, a 28 ± 2 °C), condições de alta salinidade (NaCl 100 mM em adição à solução Hoagland Completa), condições de baixa temperatura (10 ± 2 °C na presença da solução Hoagland Completa), ou condições de baixo nitrogênio (a quantidade de nitrogênio total foi reduzida em 90% a partir da solução Hoagland Completa (ou seja, para uma concentração final de 10% da solução Hoagland completa, quantidade final de Nitrogênio 1,2 mM). Todas as plantas foram cultivadas a 28 ± 2 °C exceto onde indicado de outra forma (ou seja, condições de temperatura baixa).

[00474] A solução Hoagland Completa consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de microelementos ‘Super coratina' (Ferro EDDHA [etilenediamina-N,N'-bis(ácido 2-hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8].

[00475] Tecidos de Sorgo analizados - Todos os 10 híbridos de Sorgo foram amostrados por cada tratamento. Três tecidos [folhas, meristemas e raízes] crescend em NaCl 100 mM, baixa temperatura (10 ± 2 °C), baixo Nitrogênio (Nitrogênio 1,2 mM) ou em condições Normais foram amostrados e RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido na Tabela 21 abaixo. Tabela 21 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo em condições Semihidropônicas

Tabela 21: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2 °C; NaCl = NaCl 100 mM; baixo nitrogênio = Nitrogênio 1,2 mM; Condições normais = Nitrogênio 16 mM.

[00476] Biomassa, vigor, eficiência do uso de nitrogênio e componentes relacionados a crescimento de Sorgo

[00477] DW da Raiz [gr]- Ao fim do experimento, o material de raiz foi coletado, medido e dividido pelo número de Plantas. DW de Broto [gr] - Ao fim do experimento, o material de broto (sem raízes) foi coletado, medido e dividido pelo número de Plantas.

[00478] Biomassa total [gr]- biomassa total incluindo raízes e brotos. Número de folhas [num] - número de folhas abertas.

[00479] TCR de Número de Folhas - calculada a taxa de crescimento relativo (TCR) do número de folhas.

[00480] Broto/Raiz - biomassa de brotos dividida pela biomassa de raízes.

[00481] EUN por biomassa total - eficiência do uso de nitrogênio (EUN) da biomassa total.

[00482] EUN por biomassa de raiz - eficiência do uso de nitrogênio (EUN) da biomassa total.

[00483] EUN por biomassa de broto- eficiência do uso de nitrogênio (EUN) da biomassa total.

[00484] Porcentagem de redução de biomassa de raiz comparado ao normal - a diferença (redução em porcentagem) entre a biomassa de raiz em condições normais e de baixo nitrogênio.

[00485] Porcentagem de redução de biomassa de broto comparado ao normal - a diferença (redução em porcentagem) entre a biomassa de broto em condições normais e de baixo nitrogênio.

[00486] Porcentagem de redução de biomassa total comparado ao normal -a diferença (redução em porcentagem) entre a biomassa total (broto e raiz) em condições normais e de baixo nitrogênio.

[00487] Altura da planta [cm] - As plantas são caracterizadas quanto a altura durante o período de crescimento em 5 pontos do tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto a altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.

[00488] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote.

[00489] Biomassa de Raiz [DW, gr.]/SPAD- biomassa de raiz dividida por resultados de SPAD.

[00490] Biomass de Broto [DW, gr.]/SPAD- biomassa de broto dividida por resultados de SPAD.

[00491] Biomassa Total (Raiz+Broto) [DW, gr.]/SPAD- biomassa total dividida por resultados de SPAD.

[00492] Nível de nitrogênio da planta - O teor de clorofila é um bom indicador do status de nitrogênio da planta, uma vez que o grau de verdor da folha é altamente correlacionado a este parâmetro. O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote.

Resultados Experimentais

[00493] 10 diferentes híbridos de Sorgo foram cultivados e caracterizados para vários parâmetros de biomassa e eficiência do uso de nitrogênio (EUN) conforme descritos na Tabela 22, abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 23-30 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 31). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 22 Parâmetros correlacionados a Sorgo (vetores)

Tabela 22: São fornecidos os parâmetros correlacionados a Sorgo. “N” = nitrogênio; Condições de frio = 10 ± 2 DC; NaCl = NaCl 100 mM; Baixo nitrogênio = Nitrogênio 1,2 mM; Condições normais = Nitrogênio 16 mM; “TP” = ponto de tempo. Dessa forma, TP1, TP2 e TP3 referem-se a pontos de tempo 1, 2 (TP1 + 8 dias) e 3 (TP2 + 7 dias), respectivamente. Tabela 23 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos em condições de crescimento de baixo nitrogênio

Tabela 23: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de baixo nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 24 Parâmetros adicionais calculados em acessos de sorghum, parâmetros medidos em condições de crescimento de baixo nitrogênio

Tabela 24: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de baixo nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 25 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos em condições de crescimento de salinidade

Tabela 25: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento de NaCl 100 mM. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 26 Parâmetros adicionais calculados em acessos de sorghum, parâmetros medidos em condições de crescimento de salinidade

Tabela 26: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento de NaCl

[00494] 100 mM. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 27 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos em condições de crescimento de frio

Tabela 27: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento de frio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 28 Parâmetros adicionais calculados em acessos de sorghum, parâmetros medidos em condições de crescimento de . frio

Tabela 28: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento de frio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 29 Parâmetros adicionais calculados em acessos de sorghum, parâmetros medidos em condições de crescimento regulares

Tabela 29: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento regulares.

[00495] As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 30 Parâmetros adicionais calculados em acessos de sorghum, parâmetros medidos em condições de crescimento regulares

Tabela 30: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da Semente) em condições de crescimento regulares. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 31 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em divresos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio, normal, frio ou estresse de salinidade dentre acessos de Sorgo

Tabela 31. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGHUM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT UTILIZANDO MICROARRANJO DE 60K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE SORGHUM

[00496] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput entre fenótipo da planta e nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de sorghum, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 60.000 genes e transcritos de sorghum. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados a vigor, diversas características vegetais de 10 diferentes híbridos de sorghum foram analisadas. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00497] Correlação de variedades de Sorgo dentre ecótipos cultivados em câmaras de cultivo em temperatura de 30°C ou 14°C em condições de luz baixa (100 μE) e luz elevada (250 μE).

[00498] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados para cada condição. Tecidos foliares cultivados em 30 °C e luz baixa (100 μE m-2 seg-1), 14 °C e luz baixa (100 μE m-2 seg-i), 30 °C e luz elevada (250 μE m-2 seg-i), 14 °C e luz elevada (250 μE m-2 seg-1) foram amostrados em estágio vegetativo de quatro ou cinco folhas, e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido na Tabela 32 abaixo. Tabela 32 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo em experimentos de câmara de cultivo

Tabela 32: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorghum.

[00499] Os seguintes parâmetros (Tabela 33) foram coletados por amostragem de 8-10 plantas por lote ou por medição do parâmetro dentre todas as plantas dentro do lote.

[00500] Taxa de Crescimento Relativo (TCR) foi calculada como coeficiente de regressão de peso seco vegetativo ao longo do curso do tempo.

[00501] Número de folhas [num] - As plantas foram caracterizadas por número de folhas durante o período de crescimento. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto a seu número de folhas por contagem de todas as folhas das plantas selecionadas por lote. Peso fresco (FW) de broto [gr.]</ - peso fresco de broto por planta, medição de todos os tecidos vegetativos acima do solo.

[00502] Peso seco (DW) de broto [gr.] - peso seco de broto por planta, medição de todos os tecidos vegetativos acima do solo após secagem a 70 DC em forno por 48 horas.

[00503] Temperatura das folhas [oC] -a temperatura das folhas foi medida utilizando um dispositivo termômetro IV 568 Fluke. As medições foram realizadas em folhas abertas.

[00504] Os dados dos parâmetros coletados são resumidos na Tabela 33, abaixo. Tabela 33 Parâmetros correlacionados a Sorgo (vetores)

Tabela 33. São fornecidos os parâmetros correlacionados a Sorgo (vetores).

Resultados Experimentais

[00505] 10 diferentes acessos de Sorgo foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A Tabela 33 descreve os parâmetros correlacionados de Sorgo. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 34-37 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabela 38) foi realizada. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 34 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo em 14 °C e luz elevada (250 μE m-2 seg-!)

Tabela 34: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (Linhagem) em 14 °C e luz elevada (250 μE m-2 seg-!). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 35 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo em 30°C e luz elevada (250 μE m-2 seg-!)

Tabela 35: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (Linhagem) em 30°C e luz elevada (250 μE m-2 seg-!). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 36 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo em 14 °C e luz baixa (100, μE m-2 seg-1)

Tabela 36: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (Linhagem) em 14 °C e luz baixa (100 μE m-2 seg-1). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 37 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo em 30°C e luz baixa (100 μE m-2 seg-i)

Tabela 37: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Sorgo (Linhagem) em 30°C e luz baixa (100 μE m-2 seg-1). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 38 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em combinações de tratamentos de condições de temperatura e luz (14 °C ou 30 °C; luz elevada (250 μE m-2 seg- ) ou luz baixa (100 μE m-2, seg-i) dentre acessos de Sorgo

Tabela 38. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT COM PARÂMETROS RELACIONADOS A RENDIMENTO E EUN UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 60K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE MILHO

[00506] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput entre fenótipo da planta e nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de milho, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 60.000 genes e transcritos de milho.

[00507] Correlação de híbridos de Milho entre ecótipos cultivados em condições de baixo Nitrogênio

Procedimentos experimentais

[00508] Doze híbridos de Milho foram cultivados em 3 lotes repetitivos, em campo. Sementes de Milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando protocolos de fertilização e irrigação comerciais, que incluíram 485 m3 de água por dunam (1000 metros quadrados) durante todo o período de crescimento e fertilização de 30 unidades de URAN® 21% de fertilização por dunam durante todo o período de crescimento (condições normais). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados a EUN e componentes de rendimento ou vigor, os 12 diferentes híbridos de milho foram analisados. Dentre eles, 11 híbridos englobando a variância observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00509] Tecidos de Milho analisados - Todos os 11 híbridos de milho selecionados foram amostrados para cada tratamento (baixo N e condições normais), em três pontos de tempo: TP2 = V6-V8 (seis a oito folhas de colar são visíveis, fase de crescimento rápido e começa a determinação de fileiras de grãos); TP5 = R1-R2 (embonecamento - emborrachamento); e TP6 = R3- R4 (leitoso - pastoso). Quatro tipos de tecidos vegetais [Orelha, lâmina foliar indicada na Tabela como folha, parte distal do grão e entrenó] foram amostrados e RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido nas Tabelas 39-40 abaixo. Tabela 39 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho em condições de baixo nitrogênio

Tabela 39: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho em condições de baixo nitrogênio Folha = a folha abaixo da orelha principal; Meristema floral = Meristema apical após iniciação da flor masculina; Orelha = a flor feminina no dia de ântese. Grão Distal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área extrema do sabugo, Grão Basal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área basal do sabugo; Entrenós = entrenós localizados acima e abaixo da orelha principal da planta. Tabela 40 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho tem condições de crescimento normais

Tabela 40: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho em condições de crescimento normais. Folha = a folha abaixo da orelha principal; Meristema floral = Meristema apical após o início da flor masculina; Orelha = a flor feminina no dia de ântese. Grão Distal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área extrema do sabugo, Grão Basal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área basal do sabugo; Entrenós = entrenós localizados acima e abaixo da orelha principal da planta.

[00510] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de captura de imagens digital: Área do Grão (cm2) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00511] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos/ ou larguras (eixo mais longo) dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00512] Área da Orelha (cm2) - Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área da Orelha foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Orelhas.

[00513] Comprimento da Orelha (cm) e Largura da Orelha (mm)- Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. O comprimento e largura (eixo mais longo) da Orelha foram medidos a partir dessas imagens e divididos pelo número de orelhas.

[00514] O sistema de processamento de imagens que foi utilizado consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00515] Parâmetros adicionais foram coletados por meio de amostragem de 6 plantas por lote ou pela medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00516] Peso de Grão Normalizado por planta (kg) - Ao fim do experimento, todas as orelhas de lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. Seis orelhas foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as orelhas adicionais foram debulhadas juntas e pesadas também. O peso médio de grãos por orelha foi calculado dividindo o peso total de grãos pelo número total de orelhas por lote (com base no lote). No caso de 6 orelhas, o peso total de grãos de 6 orelhas foi dividido por 6.

[00517] Orelha FW (kg) - Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) o total de orelhas e 6 orelhas selecionadas por lote dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a média de orelhas por planta foi calculada para total (FW Orelha por lote) e para 6 (FW Orelha por planta).

[00518] Altura da planta e altura da orelha [cm] - As plantas foram caracterizadas quanto a altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta antes do pendão. A altura da orelha foi medida a partir do nível do solo até o lugar onde está localizada a orelha principal.

[00519] Número de folhas por planta [num] -As plantas foram caracterizadas por número de folhas durante o período de crescimento em 5 pontos de tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto a seu número de folhas por contagem de todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00520] A Taxa de Crescimento Relativo</ foi calculada utilizando a Fórmula II (descrita acima).

[00521] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada nos estágios iniciais do enchimento do grão (R1-R2) e estágio final de enchimento do grão (R3-R4). As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote. Os dados foram coletados após 46 e 54 dias a partir da semeadura (DPS).

[00522] Peso seco por planta [kg]- Ao fim do experimento (quando as inflorescências estavam secas) todo o material vegetativo dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.

[00523] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto raízes) após secagem a 70 DC em forno por 48 horas.

[00524] Índice de Colheita (HI - Harvest Index) (Milho) - O índice de colheita por planta foi calculado utilizando a Fórmula VIII.

[00525] Fórmula VIII: Índice de Colheita (Milho) = Peso médio de grão por planta/ (Peso seco vegetativo médio por planta mais Peso médio de grão por planta)

[00526] Porcentagem de Orelha Preenchida [%] - foi calculada como a porcentagem da área da Orelha com grãos, do total da orelha.

[00527] Diâmetro do sabugo [mm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00528] Número de Fileiras de Grãos por Orelha [num] - O número de fileiras em cada orelha foi contado.

Resultados Experimentais

[00529] Doze diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros. A Tabela 41 descreve os parâmetros correlacionados ao Milho. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 42-47) e uma subsequente análise de correlação foi realizada (Tabela 48-49). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 41 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores) em condições de baixo nitrogênio

Tabela 41. “cm” = centímetros “mm” = milímetros; “kg” = quilogramas; SPAD em R1-R2 e SPAD R3-R4: Nível de clorofila após estágios inicial e final de enchimento do grão; “EUN” = eficiência do uso de nitrogênio; “ECN” = eficiência de captação de nitrogênio; “LAI” = área foliar; “N” = nitrogênio; Baixo N = em condições de baixo nitrogênio; “Normal” = em condições normais; “dunam” = 1000 m2. “Final” - Na colheita. Tabela 42 Parâmetros correlacionados a milho (vetores) em condições

Tabela 42. “cm” = centímetros “mm” = milímetros; “kg” = quilogramas; SPAD em R1-R2 e SPAD R3-R4: Nível de clorofila após estágios inicial e final de enchimento de grãos; “EUN” = eficiência do uso de nitrogênio; “ECN” = eficiência de captação de nitrogênio; “LAI” = área foliar; “N” = nitrogênio; Baixo N = em condições de baixo nitrogênio; “Normal” = em condições normais; “dunam” = 1000 m2. Tabela 43 Parâmetros medidos em acessos de milho em condições de baixo nitrogênio

Tabela 43. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento de baixo nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 44 Parâmetros adicionais em acessos de Milho em condições de baixo nitrogênio

Tabela 44. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento de baixo nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 45 Parâmetros medidos em acessos de Milho em condições de crescimento normais

Tabela 45. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 46 Parâmetros adicionais em acessos de Milho em condições de crescimento normais

Tabela 46. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 47 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio dentre acessos de milho

Tabela 47. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 48 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio dentre acessos de milho

Tabela 48. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT COM PARÂMETROS RELACIONADOS A RENDIMENTO E EUN UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 44K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE MILHO

[00530] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput entre fenótipo da planta e nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de milho, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 44.000 genes e transcritos de milho. Correlação de híbridos de Milho dentre ecótipos cultivados em condições de crescimento regulares

Procedimentos experimentais

[00531] Doze híbridos de Milho foram cultivados em 3 lotes repetitivos, em campo. Sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando protocolos de fertilização e irrigação comerciais. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros de estresse e componentes de rendimento ou vigor relacionados, os 12 diferentes híbridos de milho foram analisados. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variância observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analizada utilizando teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00532] Tecidos de Milho analisados - Todos os 10 híbridos selecionados foram amostrados para 3 pontos de tempo (TP2 = V6-V8, TP5 = R1-R2, TP6=R3-R4).

[00533] Quatro tipos de tecidos vegetais [Orelha, lâmina foliar (indicada na Tabela 49 como “folha”), parte distal do grão, e entrenó] crescendo em condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido na Tabela 49 abaixo. Tabela 49 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho tem condições de crescimento normais

Tabela 49: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho. Folha = a folha abaixo da orelha principal; Meristema floral = Meristema apical após o início da flor masculina; Orelha = a flor feminina no dia de ântese. Grão Distal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área extrema do sabugo, Grão Basal= grãos de desenvolvimento de milho a partir da área basal do sabugo; Entrenós = entrenós localizados acima e abaixo da orelha principal da planta. TP= ponto de tempo.

[00534] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de captura de imagens digital:

[00535] Área do Grão (cm2) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00536] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos/ ou larguras (eixo mais longo) dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00537] Área da Orelha (cm2) - Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área da Orelha foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Orelhas.

[00538] Comprimento da Orelha e Largura da Orelha (cm) - Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. O comprimento e largura (eixo mais longo) da Orelha foram medidos a partir dessas imagens e divididos pelo número de orelhas.

[00539] O sistema de processamento de imagens que foi utilizado consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00540] Parâmetros adicionais foram coletados por meio de amostragem de 6 plantas por lote ou pela medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00541] Peso de Grão Normalizado por planta (gr.) - Ao fim do experimento, todas as orelhas de lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. Seis orelhas foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as orelhas adicionais foram debulhadas juntas e pesadas também. O peso médio de grãos por orelha foi calculado dividindo o peso total de grãos pelo número total de orelhas por lote (com base no lote). No caso de 6 orelhas, o peso total de grãos de 6 orelhas foi dividido por 6.

[00542] Orelha FW (gr.) - Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) as orelhas totais e as 6 orelhas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a média de orelhas por planta foi calculada para total (FW Orelha por lote) e para 6 (FW Orelha por planta).

[00543] Altura da planta e altura da orelha [cm] - As plantas foram caracterizadas quanto a altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta antes do pendão. A altura da orelha foi medida a partir do nível do solo até o lugar onde está localizada a orelha principal.

[00544] Número de folhas por planta [num] -As plantas foram caracterizadas por número de folhas durante o período de crescimento em 5 pontos de tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto a seu número de folhas por contagem de todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00545] A Taxa de Crescimento Relativo</ foi calculada utilizando a Fórmula II (descrita acima).

[00546] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote. Os dados foram coletados após 46 e 54 dias a partir da semeadura (DPS).

[00547] Peso seco por planta - Ao fim do experimento (quando as inflorescências estavam secas) todo o material vegetativo dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.

[00548] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto raízes) após secagem a 70 DC em forno por 48 horas. Índice de Colheita (HI - Harvest Index) (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula VIII. Porcentagem de Orelha Preenchida [%] - foi calculada como a porcentagem da área da Orelha com grãos, do total da orelha.

[00549] Diâmetro do sabugo [mm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00550] Número de Fileiras de Grãos por Orelha [num] - O número de fileiras em cada orelha foi contado.

[00551] Os dados dos parâmetros coletados são resumidos na Tabela 50, abaixo. Tabela 50 Parâmetros correlacionados de milho (vetores)

Tabela 50. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Nível de clorofila após 46 e 54 dias a partir da semeadura (DPS). “FW” = peso fresco; “DW” = peso seco. "TP" = Ponto de tempo.

Resultados Experimentais

[00552] Doze diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros. Os parâmetros correlacionados são descritos na Tabela 50 acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 51-52) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 53). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 51 Parâmetros medidos em acessos de Milho em condições normais

Tabela 51. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) em condições de crescimento regulares. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 52 Parâmetros adicionais em acessos de Milho em condições de crescimento regulares

Tabela 52. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) em condições de crescimento regulares. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 53 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais dentre acessos de milho

Tabela 53. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT COM PARÂMETROS RELACIONAOS A RENDIMENTO, EUN E TEA MEDIDOS EM CONDIÇÕES SEMI-HIDROPÔNICAS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 60K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE MILHO

[00553] Parâmetros relacionados a vigor de milho em condições de crescimento de baixo nitrogênio (1,6 mM), salinidade (NaCl 100 mM), baixa temperatura (10 ± 2 °C) e condições de crescimento normais - Doze híbridos de Milho foram cultivados em 5 lotes repetitivos, cada um contendo 7 plantas, em uma estufa em condições semi-hidropônicas. De forma resumida, o protocolo de cultivo foi como segue: Sementes de milho foram semeadas em bandejas com uma mistura de vermiculita e turfa em uma razão de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para a solução de alta salinidade (NaCl 100 mM em adição à solução de Hoagland Completa), baixa temperatura (10 ± 2 °C na presença de solução de Hoagland Completa), solução de baixo nitrogênio (a quantidade de nitrogênio total foi reduzida em 90% a partir da solução de Hoagland completa, ou seja, para uma concentração final de 10% da solução de Hoagland completa, quantidade total de N1,6 mM) ou em solução de crescimento Normal (Hoagland Completa contendo solução de N 16 mM, a 28 ± 2 °C). As plantas foram cultivadas a 28 ± 2 °C a menos que indicado de outra forma.

[00554] A solução Hoagland Completa consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,136 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de microelementos ‘Super coratina' (Ferro EDDHA [etilenediamina-N,N'-bis(ácido 2-hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8.

Procedimentos experimentais

[00555] Tecidos de Milho analisados - Doze híbridos de Milho selecionados foram amostrados para cada tratamento. Dois tecidos [folhas e ponta da raiz] representando diferentes características vegetais foram amostrados. Foram amostradas plantas de todos os 4 tratamentos aplicados: salinidade (NaCl 100 mM), baixa temperatura (10 ± 2 °C), baixo Nitrogênio (N 1,6 mM) e condições Normais. A amostragem foi realizada no estágio vegetativo (V4-5) e RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informações de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido nas Tabelas 54-57 abaixo. Tabela 54 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho em condições normais em sistema semi-hidropônico

Tabela 54: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condições normais. Tabela 55 São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condiçõesde frio em sistema semi-hidropônico

Tabela 55: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condições de frio. Tabela 56

[00556] Conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condições de baixo nitrogênio em sistema semi-hidropônico Tabela 56: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condições de baixo nitrogênio Nitrogênio 1,6Mm. Tabela 57 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho em condições de alta salinidade em sistema semi-hidropônico

Tabela 57: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho a NaCl 100 mM.

Avaliação de parâmetros fenotípicos

[00557] Dez diferentes híbridos de Milho foram cultivados e caracterizados no estágio vegetativo (V4-5) para os seguintes parâmetros: Peso seco (DW) de folhas = peso seco de folhas por planta (média de cinco plantas); "Crescimento de Altura da Planta" = foi calculado como um coeficiente de regressão da altura da planta [cm] durante o curso do tempo (média de cinco plantas); Peso seco (DW) de raiz - peso seco de raiz por planta, todos os tecidos vegetativos acima do solo (média de quatro plantas); Peso seco (DW) de broto - peso seco de broto por planta, todos os tecidos vegetativos acima do solo (média de quatro plantas) após secagem a 70°C em forno por 48 horas; Peso fresco (FW) de broto - peso fresco de broto por planta, todos os tecidos vegetativos acima do solo (média de quatro plantas);

[00558] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 30 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote.

[00559] Crescimento de altura da planta - a taxa de crescimento relativo (TCR) da Altura da Planta foi calculada utilizando a Fórmula IX: Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo da Altura da Planta = coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do curso do tempo (medido em cm/dia). Comprimento da raiz - o comprimento da raiz foi medido no estágio de desenvolvimento V4.

[00560] Os parâmetros de dados coletados são resumidos nas Tabelas 58-59, abaixo. Tabela 58 Parâmetros correlacionados a Milho (vetores) em condições de frio

Tabela 58: São fornecidos os parâmetros correlacionados de Milho em condições de frio. “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “SPAD” = níveis de clorofila. Tabela 59 Parâmetros correlacionados de Milho (vetores) em condições de crescimento normais, de baixo nitrogênio e salinidade

Tabela 59: São fornecidos os parâmetros correlacionados de Milho em condições de crescimento normais, baixo nitrogênio e salinidade. “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “SPAD” = níveis de clorofila.

Resultados Experimentais

[00561] Doze diferentes acessos de milho foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros conforme descrito acima. As Tabelas 58-59 descrevem os parâmetros correlacionados de milho. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 60-63 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabelas 64-67) foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 60 Acessos de Milho, parâmetros medidos em condições de crescimento de baixo nitrogênio

Tabela 60: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Milho (Linhagem) em condições de baixo nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 61 Acessos de Milho, parâmetros medidos em condições de crescimento de NaCl 100 mM

Tabela 61: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Milho (Linhagem) em condições de crescimento de NaCl 100 mM. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 62 Acessos de Milho, parâmetros medidos em condições de crescimento de frio

Tabela 62: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Milho (Linhagem) em condições de crescimento de frio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 63 Acessos de Milho, parâmetros medidos em condições de crescimento regulares

Tabela 63: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Milho (Linhagem) em condições de crescimento regulares. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 64 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio dentre acessos de milho

Tabela 64. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 65 Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de baixo nitrogênio dentre acessos de Milho

Tabela 65. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 66 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de frio, dentre acessos de Milho

Tabela 66. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 67 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de salinidade dentre acessos de Milho .

Tabela 67. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT QUANDO CULTIVADO EM CONDIÇÕES NORMAIS E DE DESFOLHAMENTO UTILIZANDO MICROARRANJO DE 60K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE MILHO

[00562] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Milho, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 60K genes e transcritos de Milho desenhados com base nos dados de bancos de dados Públicos (Exemplo 1). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados a rendimento, componentes de biomassa ou vigor, diversas características vegetais de 13 diferentes híbridos de Milho foram analisados em condições normais e de desfolhamento. Os mesmos híbridos foram submetidos a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00563] Treze linhagemgens híbridas de milho foram cultivadas em 6 lotes repetitivos, em campo. Sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando protocolos de fertilização e irrigação comerciais. Após o embonecamento, 3 lotes em cada linhagem híbrida passou pelo tratamento de desfolhamento. Nesse tratamento, todas as folhas acima da orelha foram removidas. Após o tratamento, todas as plantas foram cultivadas de acordo com os mesmos protocolos de fertilização e irrigação comerciais. Três tecidos em estágios desenvolvimentais de floração (R1) e enchimento do grão (R3) incluindo folha (floração - R1), caule (floração - R1 e enchimento do grão - R3), e mericaulea floral (floração - R1) representando diferentes características vegetais, foram amostrados de plantas tratadas e não tratadas. O RNA foi extraído conforme descrito em “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA”. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 68-69 abaixo. Tabela 68 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho (em condições normais)

Tabela 68. São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho. Tabela 69 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho (Em condições de desfolhamento)

Tabela 69 São fornecidos números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho.

[00564] Os parâmetros a seguir foram coletados por captura de imagens.

[00565] O sistema de processamento de imagens que foi utilizado consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00566] Peso de 1000 grãos (gr.) - Ao fim do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram coletadas e pesadas e o peso de 1000 foi calculado.

[00567] Área da Orelha (cm2) - Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sicaulea de processamento de imagens descrito abaixo. A área da Orelha foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Orelhas.

[00568] Comprimento da Orelha e Largura da Orelha (cm) - Ao fim do período de crescimento, 6 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. O comprimento e largura (eixo mais longo) da Orelha foram medidos a partir dessas imagens e divididos pelo número de orelhas.

[00569] Área do Grão (cm2) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00570] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos/ ou larguras (eixo mais longo) dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00571] Perímetro do Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, os grão sforam separados da orelha. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00572] Área de orelha preenchida de grãos (cm2) - Ao fim do período de crescimento, 5 orelhas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sicaulea de processamento de imagens descrito abaixo. A área de orelha preenchida com grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de orelhas.

[00573] Preenchido por Orelha Inteira - foi calculado como o comprimento da orelha com grãos do total da orelha.

[00574] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 6 plantas por lote (SP) ou por medição do parâmetro dentre todas as plantas dentro do lote.

[00575] Largura do sabugo [mm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00576] Peso médio (avr.) da orelha [gr.] - Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) as orelhas totais e as 6 orelhas selecionadas por lotes foram coletadas. As orelhas foram pesadas e a média de orelha por planta foi calculada. O peso de orelha foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%.

[00577] Altura da planta e altura da orelha [cm] - As plantas foram caracterizadas quanto a altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta antes do pendão. A altura da orelha foi medida a partir do nível do solo até o lugar onde está localizada a orelha principal.

[00578] Número de fileiras da orelha (num) - O número de fileiras por orelha foi contado.

[00579] Orelha peso fresco por planta (GF) - Durante o período de enchimento do grão (GF) orelhas totais e 6 orelhas selecionadas por lote foram coletadas separadamente. As orelhas foram pesadas e a média de peso de orelha por planta foi calculada.

[00580] Peso seco de orelhas (Kg) - Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) as orelhas totais e as 6 orelhas selecionadas por lotes foram coletadas e pesadas. O peso de orelha foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%.

[00581] Peso fresco de orelhas (Kg) - Ao fim do experimento (quando as orelhas foram colhidas) as orelhas totais e as 6 orelhas selecionadas por lotes foram coletadas e pesadas.

[00582] Orelhas por planta (num) - o número de orelhas por planta foi contado.

[00583] Rendimento de Grãos (Kg.) - Ao fim do experimento, todas as orelhas foram coletadas. Orelhas de 6 plantas de cada lote foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados.

[00584] Peso seco de Grãos (Kg.) - Ao fim do experimento, todas as orelhas foram coletadas. Orelhas de 6 plantas de cada lote foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados. O peso dos grãos foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%.

[00585] Rendimento de grão por orelha (Kg.) - Ao fim do experimento, todas as orelhas foram coletadas. 5 orelhas de cada lote foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados. A média de peso de grão por orelha foi calculada dividindo o peso de grão total pelo número de orelhas.

[00586] Área de folhas cm2) por planta (GF, e HD) [LAI] = Área de folha total de 6 plantas em um lote. Este parâmetro foi medido utilizando um medidor de área de Folha em dois pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD) e durante o período de enchimento do grão (GF).

[00587] Peso fresco de folhas (gr.) (GF, e HD) - Este parâmetro foi medido em dois pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD) e durante o período de enchimento do grão (GF). As folhas utilizadas para a medição de LAI foram pesadas.

[00588] Peso fresco do caule inferior (gr.) (GF, HD, e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e pesados. A média de peso de entrenós por planta foi calculada por divisão do peso total de grão pelo número de plantas.

[00589] Comprimento de caule inferior (cm) (GF, HD, e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e seus comprimentos foram medidos utilizando uma régua. A média de comprimento de entrenó por planta foi calculada dividindo o peso total de grão pelo número de plantas.

[00590] Largura do caule inferior (mm) (GF, HD, e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e seus diâmetros foram meidos utilizando um paquímetro. A média de largura de entrenó por planta foi calculada dividindo o peso total de grão pelo número de plantas.

[00591] Crescimento de altura da planta - a taxa de crescimento relativo (RGR) da Altura da Planta foi calculada utilizando a Fórmula IX acima, por Coeficiente de regressão de altura da Planta ao longo do curso do tempo, medida em cm/dia).

[00592] SPAD [unidade SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote. Os dados foram coletados após 46 e 54 dias a partir da semeadura (DPS).

[00593] Peso fresco do caule (gr.) (GF e HD) - Este parâmetro foi medido em dois pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD) e durante o período de enchimento do grão (GF). Os caules das plantas utilizados para medição de LAI foram pesados.

[00594] Matéria seca total (kg) - A matéria seca total foi calculada como segue: Fórmula X: Peso de orelha normalizado por planta + peso seco vegetativo

[00595] Peso fresco de caule superior (gr.) (GF, HD e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e pesados. A média de peso de entrenós por planta foi calculada por divisão do peso total de grão pelo número de plantas.

[00596] Comprimento do caule superior (cm) (GF, HD e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e seus comprimentos foram medidos utilizando uma régua.

[00597] Largura do caule superior (mm) (GF, HD e H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no espigamento (HD), durante o período de enchimento do grão (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados e seus diâmetros foram medidos utilizando um paquímetro.

[00598] Peso seco vegetativo (Kg.) - peso total da porção vegetativa de 6 plantas (acima do solo exceto raízes) após secagem a 70DC em forno por 48 horas dividido pelo número de plantas.

[00599] Peso fresco vegetativo (Kg.) - peso total da porção vegetativa de 6 plantas (acima do solo exceto raízes).

[00600] Número de nós - os nós no caule foram contados no estágio de espigamento do desenvolvimento vegetal. Tabela 70 Parâmetros correlacionados a Milho (vetores) em condições normais e em Desfolhamento

Tabela 70. São fornecidos os parâmetros correlacionados a milho (vetores). “SPAD” = níveis de clorofila; "FW" = Peso Fresco da planta; “DW” = Peso Seco da planta; “GF” = estágio de crescimento de enchimento do grão; “HD” = estágio de espigamento; “H” = estágio de colheita. “SP” = 6 plantas selecionadas para determinação de fenótipo.

[00601] Treze variedades de milho foram cultivadas e caracterizadas para parâmetros conforme descrito acima. A média para cada parâmetro foi calculada utilizando o software JMP, e os valores estão resumidos nas Tabelas 71-74 abaixo. Uma correlação subsequente entre os diversos conjuntos de transcriptoma para todas ou subconjuntos de linhagens foi realizada pela unidade de bioinformática e os resultados foram integrados ao banco de dados (Tabelas 75 e 76 abaixo). Tabela 71

Tabela 71. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental Tabela 72 Parâmetros medidos em Híbridos de Milho em condições normais, linhagens de milho adicionais

Tabela 72. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 73 Parâmetros medidos em Híbridos de Milho em desfolhamento

Tabela 73. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) em condições de crescimento de desfolhamento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 74 Parâmetros medidos em Híbridos de Milho em desfolhamento, linhagens de milho adicionais

Tabela 74. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) em condições de crescimento de desfolhamento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental.

[00602] As Tabelas 75 e 76 abaixo apresentam as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes de melhoria de rendimento e seus homólogos em diversos tecidos [conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor (vetor de Correlação (Cor))] com condições normais e de desfolhamento dentre variedades de milho . P = valor-p. Tabela 75 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais dentre variedades de milho

Tabela 75. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 76 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de desfolhamento dentre variedades de milho

Tabela 76. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SETARIA ITALICA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 60K DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE SETARIA ITALICA

[00603] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput comparando entre fenótipo vegetal e nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Setaria italica, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 60K genes e transcritos de Setaria itálica Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados a rendimento ou vigor, diversas características vegetais de 14 diferentes acessos de Setaria italica foram analisados. Dentre eles, 11 acessos englobando a variância observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00604] Quatorze variedades de Setaria italica foram cultivadas em 5 lotes repetitivos, em campo. De forma resumida, o protocolo de cultivo foi como segue: 1. Condições de crescimento regulares: Plantas de Setaria italica foram cultivadas no campo utilizando protocolos de fertilização e irrigação comerciais, que incluem 283 m3 de água por dunam (100 metros quadrados) durante todo o período de cultivo e fertilização de 16 unidades de URAN® 32% (Solução Fertilizadora de Nitrogênio PCS Sales, Northbrook, IL, EUA) (condições de crescimento normais).

[00605] 2. Condições de seca: Sementes de Setaria italica foram semeadas em solo e cultivadas em condição normal até o estágio de espigamento (22 dias após a semeadura), e então foi imposto tratamento de seca irrigando as plantas com 50% de água com relação ao tratamento normal (171 m3 de água por dunam durante todo o período de cultivo).

[00606] Analisado Setaria italica tquestões - Todas as 15 (Acima você indicou que havia somente 14 acessos de Setaria italica) linhagens de Setaria italica foram amostradas para cada tratamento. Três tecidos [folha, flor, e caule] em 2 diferentes estágios de desenvolvimento [floração, enchimento do grão], representando diferentes características vegetais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido nas Tabelas 77-78 abaixo. Tabela 77 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Setaria italica em condições de seca

Tabela 77. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições de seca. Tabela 78 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Setaria italica em condições normais

Tabela 78. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições normais.

[00607] Avaliação de parâmetros relacionados a vigor e componentes de rendimento de Setaria italica - As plantas foram continuamente fenotipadas durante o período de crescimento e na colheita (Tabelas 80-85, abaixo). O sistema de análise de imagens inclui um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. A seguir, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00608] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de captura de imagens digital:

[00609] Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da ‘Cabeça’ da Planta e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados:

[00610] Área Média de Grão (cm2) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00611] Média de Comprimento e largura de Grão (cm) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos e larguras de grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e dividida pelo número de grãos.

[00612] Ao fim do período de crescimento, 14 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo.

[00613] Média de Perímetro de Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, grãos foram separados da ‘Cabeça’ da Planta. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00614] Área Média de Cabeça (cm2) - A área da ‘Cabeça’ foi medida a partir dessas imagens e dividida pelo número de ‘Cabeças’.

[00615] Comprimento e largura Média de Cabeça (cm) - O comprimento e largura (eixo mais longo) da ‘Cabeça’ foram medidos a partir dessas imagens e divididos pelo número de ‘Cabeças’.

[00616] O sistema de processamento de imagens que foi utilizado consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00617] Parâmetros adicionais foram coletados por meio de amostragem de 5 plantas por lote ou pela medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00618] Peso da cabeça (Kg.) e número de cabeças (num.) - Ao fim do experimento, as cabeças foram colhidas de cada lote e foram contadas e pesadas.

[00619] Rendimento de Grão Total (gr.) - Ao fim do experimento (‘Cabeças’ de planta) cabeças de lotes foram coletadas, as cabeças foram debulhadas e os grãos foram pesados. Em adição, o peso médio de grão por cabeça foi calculado dividindo o peso de grão total pelo número total de cabeças por lote (com base no lote).

[00620] Peso de 1000 sementes [gr] -

[00621] peso de 1000 sementes por lote.

[00622] Biomassa na colheita [kg]- Ao fim do experimento, a porção vegetativa acima do solo (exceto raízes) dos lotes foi pesada.

[00623] Matéria seca total por lote [kg] - Calculada como a porção Vegetativa acima do solo mais o peso seco de todas as cabeças por lote.

[00624] Número (num) de dias até ântese - Calculado como o número de dias a partir da semeadura até que 50% do lote atinja ântese.

[00625] Manutenção de desempenho em condições de seca: Representa a razão para o parâmetro especificado de resultados de condição de Seca dividido pelos resultados de condições Normais (mmanutenção do fenótipo em seca em comparação a condições normais). Os dados dos parâmetros coletados são resumidos na Tabela 79, abaixo. Tabela 79 Parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)

Tabela 79. São fornecidos os parâmetros coletados de Setaria italica.

Resultados Experimentais

[00626] Quatorze diferentes acessos de Setaria italica foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros conforme descrito acima (Tabela 79). A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 80-85 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de transcriptoma e a média dos parâmetros (Tabelas 80-85) foi conduzida (Tabelas 86-88). A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 80 IDs de parâmetros de correlação medidos em Setaria italica acessos em condições de seca

Tabela 80: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) em condições de crescimento de seca.

[00627] As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental Tabela 81 Parâmetros medidos adicionais de IDs de Correlação em acessos de Setaria italica em condições de seca

Tabela 81: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) em condições de crescimento de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 82 Parâmetros de IDs de correlação medidos em acessos de Setaria italica para Manutenção de desempenho em condições de seca

Tabela 82: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) para manutenção de desempenho em seca (calculados como % de mundança em condições de crescimento de vs condições de crescimento normais). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 83 Parâmetros adicionais de IDs de correlação medidos em acessos de Setaria italica para Manutenção de desempenho em condições de seca

Tabela 83: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, .etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) para manutenção de desempenho em seca (calculados como % de mundança em condições de crescimento de vs condições de crescimento normais). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 84 Parâmetros de Ids de correlação medidos em acessos de Setaria italica em condições normais

Tabela 84: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 85 Parâmetros adicionais de IDs de correlação medidos em acessos de Setaria italica em condições normais

Tabela 85: IDs de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, .etc. referem- se àquelas descritas na Tabela 79 acima [parâmetros correlacionados a Setaria italica (vetores)]. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Setaria italica (linhagem) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 86 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de seca dentre variedades de Setaria italica

Tabela 86. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 87 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico de manutenção de desempenho em condições de seca dentre variedades de Setaria itálica

Tabela 87. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p. Tabela 88 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais dentre variedades de Setaria italica

Tabela 88. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 44K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE CEVADA

[00628] Para produzir uma análise de correlalção do tipo high throughput comparando entre fenótipo vegetal e nível de expressão de gene em condições normais, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Cevada, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 44.000 genes e transcriptomas de Cevada. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados a rendimento ou vigor, diversas características vegetais de 25 diferentes acessos de Cevadaforam analisadas. Dentre eles, 13 acessos englobando a variância observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00629] Tecidos de Cevada analisados - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [meristema, flor, espiga jovem, caule e lâmina da folha], representando diferentes características vegetais, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido na Tabela 89 abaixo. Tabela 89

Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada Tabela 89. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada.

[00630] Avaliação de parâmetros relacionados a vigor e componentes de rendimento de Cevada - 25 acessos de Cevada em 4 blocos repetitivos (denominados A, B, C, e D), cada um contendo 4 plantas por lote foram cultivados em uma estufa. As plantas tiveram seu fenótipo determinado diariamente seguindo o descritor padrão de cevada (Tabela 90, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% das espigas estavam secas para evitar liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas entre a parte vegetativa e as espigas e, destas, 5 espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para análises adicionais de grãos, tal como medição de tamanho, contagem de grãos por espiga e rendimento de grãos por espiga. Todo o material foi seco em forno e as sementes foram debulhadas manualmente das espigas antes da medição das características das sementes (peso e tamanho) utilizando escaneamento e análise de imagem. O sistema de análise de imagens inclui um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. A seguir, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Tabela 90 Descritores padrão de cevada

Tabela 90. Grãos por espiga - Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Foi contado o número total de grãos de 5 espigas que foram manualmente debulhadas. A média de grãos por espiga é calculada dividindo o número total de grãos pelo número de espigas.

[00631] Média de tamanho de grão (cm) Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O total de grãos de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foi escaneado e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de captação de imagens digital. O escaneamento de grãos foi realizado utilizando um scanner Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisado com o software Image J. A média de tamanho dos grãos foi calculada dividindo o tamanho total de grãos pelo número total de grãos.

[00632] Média de peso dos grãos (mgr)

[00633] Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado e pesado. A média de peso foi calculada dividindo o peso total pelo número total de grãos. “Mgr” = miligramas.

[00634] Rendimento de grãos por espiga (gr.) - Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. O rendimento dos grãos foi calculado dividindo o peso total pelo número de espigas. Análise de comprimento de espiga - Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando uma fita métrica, excluindo as barbas da espiga.

[00635] Análise de número de espigas - Ao fim do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas de lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Foram contadas as espigas por planta.

[00636] Pontuação de hábito de crescimento - No estágio de crescimento 10 (espigamento), cada uma das plantas recebeu uma pontuação por sua natureza de hábito de crescimento. A escala que foi usada foi de 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.

[00637] Pelugem das folhas basais - No estágio de crescimento 5 (bainha da folha fortemente ereta; fim do perfilhamento), cada uma das plantas recebeu uma pontuação por sua natureza de pelugem da penúltima folha. A escala que foi usada foi de 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.

[00638] Altura da planta - Ao fim do estágio de colheita (50% das espigas estavam secas) cada uma das plantas foi medida quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da espiga mais longa, excluindo barbas da espiga.

[00639] Dias até a floração - Cada uma das plantas foi monitorada quanto à data da floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data de semeadura até a data de floração.

[00640] Pigmentação do caule - Ao fim do estágio de crescimento 10 (espigamento), cada uma das plantas recebeu uma pontuação quanto à cor de seu caule. A escala que foi utilizada foi de 1 para verde até 5 para totalmente roxa.

[00641] Peso seco vegetativo e rendimento da espiga - Ao fim do estágio de colheita (50% das espigas estavam secas) todas as espigas e material vegetativo de lotes dentro dos blocos A-D foram coletados. A biomassa e peso das espigas de cada lote foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas.

[00642] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto raízes) após secagem a 70 DC em forno por 48 horas.

[00643] Rendimento de espiga por planta = peso total de espigas por planta (gr.) após secagem a 30 DC em forno por 48 horas.

[00644] Índice de Colheita (para cevada) - O índice de colheita é calculado utilizando a Fórmula XI. Fórmula XI

[00645] Índice de Colheita = Média de peso seco de espiga por planta/(Média de peso seco vegetativo por planta + Média de peso seco de espiga por planta)

[00646] Os dados dos parâmetros coletados são resumidos na Tabela 91, abaixo. Tabela 91 Parâmetros correlacionados a cevada (vetores)

Tabela 91. São fornecidos os parâmetros correlacionados a cevada. “mm2” milímetros quadrados; “gr.” = Gramas; “cm” = centímetros.

Resultados Experimentais

[00647] 13 diferentes acessos de Cevada foram cultivados e caracterizados quanto aos parâmetros descritos acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 92 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os diversos conjuntos de transcriptoma e os parâmetros medidos foi conduzida (Tabela 93). A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 92 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada

Tabela 92. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linhagem). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental Tabela 93 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico em condições de fertilização, normais dentre acessos de cevada

Tabela 93. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em diversos tecidos e o desempenho fenotípico. “Corr. ID “ - ID de conjunto de correlações de acordo com a Tabela de parâmetros correlacionados acima. “Exp. Set” - Conjunto de Expressão “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor-p.

EXEMPLO 12 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DO TIPO HIGH THROUGHPUT UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 60K OLIGONUCLEOTÍDEOS DE CEVADA

[00648] Para produzir uma análise de correlação do tipo high throughput comparando entre fenótipo vegetal e nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Cevada, produzido por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 60K genes e transcriptomas de Cevada. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados a rendimento ou vigor, diversas características vegetais de 15 diferentes acessos de Cevadaforam analisadas. Dentre eles, 10 acessos englobando a variância observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00649] Tecidos de Cevada analisados - seis estágios de tecido [folha, meristema, ponta de raiz, raiz adventícia, espiga, caule] em diferentes estágios de desenvolvimento [vegetativo, reprodutivo], representando diferentes características vegetais, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de microarranjo de expressão recebeu uma ID de Conjunto conforme resumido nas Tabelas 94-96 abaixo. Tabela 94 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada em condições de seca e recuperação

Tabela 94. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições de seca e de recuperação. Tabela 95 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições normais e de baixo nitrogênio (conjunto 1)

Tabela 95. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições normais e de baixo nitrogênio (conjunto 1 - estágio vegetativo). Tabela 96 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições normais e de baixo nitrogênio (conjunto 2)

Tabela 96. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada em condições normais e de baixo nitrogênio (conjunto 2 - estágio reprodutivo).

[00650] Avaliação de parâmetros relacionados a vigor e cmponentes de rendimento de cevada - 15 acessos de Cevada em 5 blocos repetitivos, cada um contendo 5 plantas por lote, foram cultivados em uma estufa. Três tratamentos diferentes foram aplicados: as plantas foram regularmente fertilizadas e regadas durante o crescimento vegetal até a colheita (conforme recomendado para cultivo comercial, condições de crescimento normais que incluem irrigação 2-3 vezes por semana, e fertilização fornecida nos primeiros 1,5 meses do período de crescimento); em baixo Nitrogênio (80% menos Nitrogênio); ou em estresse de seca (ciclos de seca e reirrigação foram conduzidos durante todo o experimento, em geral 40% menos água foi forneida no tratamento de seca). As plantas foram caracterizadas quanto ao fenótipo diariamente seguindo os parâmetros listados nas Tabelas 97-100 abaixo. A colheita foi realizada enquanto todas as espigas estavam secas. Todo o material foi seco em forno e as sementes foram debulhadas manualmente das espigas antes da medição das características das sementes (peso e tamanho) utilizando escaneamento e análise de imagem. O sistema de análise de imagens inclui um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens com base em Java, que foi desenolvido no U.S. National Institutes of Health e está disponível de graça na internet em [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. A seguir, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00651] Rendimento de grãos (gr.) - Ao fim do experimento, todas as espigas dos plotes foram coletadas. O total de grãos de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. O rendimento de grãos foi calculado por lote ou por planta.

[00652] Análise de comprimento e largura da espiga - Ao fim do experimento, o comprimento e a largura de cinco espigas escolhidas por planta foram medidos utilizando uma fita métrica, excluindo as barbas da espiga.

[00653] Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.

[00654] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da espiga mais longa, excluindo as barbas da espiga, em dois momentos de tempo, no Crescimento vegetativo (30 dias após semeadura) e na colheita.

[00655] Peso da espiga - A biomassa e o peso de espiga de cada lote foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas.

[00656] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto raízes) após secagem a 70°C em forno por 48 horas em dois pontos de tempo, no crescimento vegetativo (30 dias após semeadura) e na colheita.

[00657] Espiguetas por espiga = o número de espiguetas por espiga foi contado.

[00658] Razão Raiz/Broto - A Razão Raiz/Broto é calculada utilizando a Fórmula XII. Fórmula XII Razão Raíz/Broto = peso total da raiz na colheita / peso total da porção vegetativa acima do solo na colheita.

[00659] N.° total de perfilhos- todos os perfilhos foram contados por lote em dois pontos de tempo, no crescimento vegetativo (30 dias após a semeadura) e na colheita.

[00660] Porcentagem de perfilhos reprodutivos - o número de perfilhos reprodutivos carregando uma espiga na colheita foi dividido pelo número total de perfilhos.

[00661] SPAD [unidade de SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por lote.

[00662] FW da Raiz (gr.), comprimento da raiz (cm) e N.° de raízes laterais - 3 plantas por lote foram selecionadas para medição de peso da raíz, comprimento da raiz e para contagem do número de raízes laterais formadas.

[00663] FW (peso fresco) do Broto) - o peso de 3 plantas por lote foi registrado em três diferentes pontos de tempo.

[00664] Média de Área de Grão (cm2) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00665] Média de Comprimento e largura do Grão (cm) - Ao fim do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos ou larguras (eixo mais longo) dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00666] Média de perímetro do Grão (cm) - Ao fim do período de cerscimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00667] Data de espigamento - o dia no qual o estágio de brotamento foi observad o foi registrado e o número de dias a partir da semeadura até o espigamento foi calculado.

[00668] Teor de água relativo - O Peso Fresco (FW) de três folhas de três plantas cada de diferentes IDs de semente foram imediatamente registrados; então as folhas foram imersas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. O peso seco (DW - dry weight) total foi registrado após secar as folhas a 60°C até um peso constante. O teor de água relatiov (RWC) é calculado de acordo com a Fórmula I acima.

[00669] Índice de Colheita (cevada) - O índice de colheita é calculado utilizando a Fórmula XI acima.

[00670] Taxa de crescimento relativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) da Altura da Planta (Fórmula IX acima), SPAD (Fórmula XIII abaixo) e o número de perfilhos (Fórmula XIII) são calculados como segue: Fórmula XIII Taxa de crescimento relativo de SPAD = Coeficiente de regressão de medições de SPAD ao longo do curso do tempo. Fórmula XIV Taxa de crescimento relativo do Número de perfilhos = Coeficiente de regressão do número de perfilhos ao longo do curso do tempo (medido em unidades de “número de perfilhos/dia”).

[00671] RAZÃO Seca/Normal: Representa a razão para o parâmetro especificado de resultados de condição de Seca dividido pelos resultados de condições Normais (mmanutenção do fenótipo em seca em comparação a condições normais).

[00672] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos nas Tabelas 97-100, abaixo Tabela 97 Parâmetros correlacionados a cevada (vetores) em condições de seca e de Recuperação

Tabela 97. São fornecidos os parâmetros correlacionados a cevada. “ “DW” = peso seco“. Tabela 98 Parâmetros correlacionados de cevada (vetores) para manutenção de desempenho em condições de seca

Tabela 98. São fornecidos os parâmetros correlacionados a cevada. “ “DW” = peso seco; “razão” - razão para os parâmetros especificados de resultados de condição de Seca divididos pelos resultados de condições Normais (manutenção de fenótipo em condições de seca em comparação a condições normais). Tabela 99 Parâmetros correlacionados de cevada (vetores) em condições de baixo nitrogênio e condições normais (conjunto 1)

Tabela 99. São fornecidos os parâmetros correlacionados a cevada. “TP” = ponto de tempo; “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “Baixo N” = Baixo Nitrogênio; “Normal” = condições de crescimento regulares.”Máx” = máximo. Tabela 100 Parâmetros correlacionados de cevada (vetores) em condições de baixo nitrogênio e condições normais (conjunto 2)

Tabela 100. São fornecidos os parâmetros correlacionados a cevada. “TP” = ponto de tempo; “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “Baixo N” = Baixo Nitrogênio; “Normal” = condições de crescimento regulares.”Máx” = máximo.

Resultados Experimentais

[00673] 15 diferentes acessos de Cevada foram cultivados e caracterizados quanto a diferentes parâmetros conforme descrito acima. As Tabelas 97-100 descrevem os parâmetros correlacionados a Cevada. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 101-109 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabelas 110-113) foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 101 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada em condições de seca e de recuperação

Tabela 101. São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 97) medidos em acessos de Barley (linhagem) em condições de crescimento de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 102 Parâmetros medidos de IDs de correlação adicionais em acessos de Cevada em condições de seca e de recuperação

Tabela 102. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 97), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições de crescimento durante a seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 103 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) para manutenção do desempenho sob condições de seca

Tabela 103. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 98), medidos em acessos de Cevada (linhagem) para manutenção do desempenho durante a seca (calculado como % de alteração durante a seca vs condições normais de crescimento). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 104 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) para manutenção do desempenho sob condições de seca

Tabela 104. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 98), medidos em acessos de Cevada (linhagem) para manutenção do desempenho durante a seca (calculado como % de alteração durante a seca vs condições normais de crescimento). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 105 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) sob condições de baixo teor de nitrogênio e sob condições normais (grupo 1)

Tabela 105. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 99), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições de baixo teor de N e sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 106 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) sob condições normais (grupo 2)

Tabela 106. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 100), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 107 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) sob condições normais (grupo 2)

Tabela 107. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 100), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 108 Parâmetros medidos de Ids de correlação em acessos de Cevada) sob condições de baixo teor de nitrogênio (grupo 2)

Tabela 108. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 100), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições de crescimento com baixo teor de N. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 109 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada) sob condições de baixo teor de nitrogênio (grupo 2)

Tabela 109. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima na Tabela 100), medidos em acessos de Cevada (linhagem) sob condições de crescimento com baixo teor de N. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 110 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico durante as condições de estresse na seca nos acessos de Cevada

Tabela 110. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela 97 acima. “Conj. Exp.”

[00674] Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p. Tabela 111 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico da manutenção do desempenho sob condições de seca nos acessos de Cevada

Tabela 111. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela 98 acima. “Conj. Exp.”

[00675] Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p. Tabela 112 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições crescimento normais e de baixo teor de nitrogênio nos acessos de Cevada (grupo 1)

Tabela 112. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela 99 acima. “Conj. Exp.”

[00676] Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p. Tabela 113 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo teor de nitrogênio e sob condições normais de crescimento nos acessos de . Cevada (grupo _ 2)

Tabela 113. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela 100 acima. “Conj. Exp.”

[00677] Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p.

EXEMPLO 13 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICRO- MATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE TOMATE 44K

[00678] A fim de realizar uma análise de correlação de alta produtividade entre fenótipos relacionados de ABST e NUE e expressão genética, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleotídeos de Tomate, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. A matriz de oligonucleotídeos representa cerca de 44.000 genes de Tomate e transcrições. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com ABST, NUE, componentes de rendimento ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características genéticas de planta de 18 diferentes variedades de Tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00679] Correlação de variedades de Tomate nos Ecotipos cultivados durante a seca, sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio e sob condições de crescimento regulares

Procedimentos Experimentais:

[00680] Dez variedades de Tomate foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por lote de terra, em estufa. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte:

[00681] Condições regulares de crescimento: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais: 4-6 Litros/m2 de água por dia e fertilizadas com NPK (nitrogênio, fósforo e potássio na proporção de 6:6:6, respectivamente) conforme recomendado em protocolos para a produção comercial de tomate.

[00682] Estresse na seca: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 Litros/m2 por dia com fertilizantes) até a florescência. Neste momento, a irrigação foi reduzida para 50% em comparação às condições normais.

[00683] Condições de fertilização com baixo teor de nitrogênio: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 Litros/m2 por dia e fertilizadas com NPK conforme recomendado em protocolos para a produção comercial de tomate) até a florescência. Neste momento, a fertilização com nitrogênio foi interrompida.

[00684] As plantas foram fenotipadas diariamente seguindo a descrição padrão de tomates (Tabela 115). A colheita foi realizada enquanto 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas como parte vegetativa e frutos, destes 2 nodos foram analisados quanto aos parâmetros adicionais inflorescentes, tais como tamanho, número de flores e peso inflorescente. O peso fresco de todo o material vegetativo foi medido. Os frutos foram separados por cores (vermelhos vs. verdes) e de acordo com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando-se o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

[00685] Tecidos de tomate analisados - Dois tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características genéticas da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Para maior conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de micro-matriz recebeu um ID de Grupo conforme resumido na Tabela 114 abaixo. Tabela 114 Grupos de expressão de transcrição de Tomate .

Tabela 114: São apresentados os Grupos de expressão de transcriptoma de tomate.

[00686] A média de cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando-se o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 116122 abaixo. A análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 123) com o coeficiente de correlação (R) e os valores de p. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 115 Parâmetros correlacionados de Tomate (vetores)

Tabela 115. São apresentados os parâmetros correlacionados de tomate. “gr.” = gramas; “FW” = peso fresco; “NUE” = eficiência do uso de nitrogênio; “RWC” = teor relativo de água; “NUpE” = eficiência da captação de nitrogênio; “SPAD” = níveis de clorofila; “HI” = índice de colheita (peso vegetativo dividido pelo rendimento); “SLA” = área específica da folha (área da folha dividida pelo peso sexo da folha).

[00687] Rendimento de Fruto (gramas) - Ao final do experimento [quando 50% dos furtos estavam maduros (vermelhos)], todos os frutos dos lotes de terra dentro dos blocos A-C foram colhidos. Todos os frutos foram contados e pesados. O peso médio dos frutos foi calculado dividindo-se o peso total do fruto pelo número de frutos.

[00688] Rendimento/SLA - O Rendimento de Fruto dividido pela área específica da folha proporciona uma medição do equilíbrio entre os processos reprodutivo e vegetativo.

[00689] Rendimento/Área Total da Folha - O Rendimento de Fruto dividido pela Área Total da Folha proporciona uma medição do equilíbrio entre os processos reprodutivo e vegetativo.

[00690] Peso fresco da planta (gramas) Ao final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todas as plantas dos lotes de terra Dentro dos blocos A-C foram colhidos. O peso fresco foi medido (gramas).

[00691] Peso da Inflorescência (gramas) - Ao final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], duas inflorescências dos lotes de terra dentro dos blocos A-C foram colhidos. O peso da inflorescência (gr.) e o número de flores por inflorescência foram contados.

[00692] SPAD [unidade de SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando-se um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da florescência. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folha jovem totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram realizadas por lote de terra.

[00693] Eficiência do Uso da Água (WUE) - pode ser determinados como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor relativo de água da folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. O Peso Fresco (FW) foi imediatamente registrado; então as folhas foram embebidas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. O Peso Seco Total (DW) foi registrado após a secagem das folhas a 60 °C até um peso constante. O Teor Relativo de Água (RWC) foi calculado de acordo coma seguinte Fórmula I [(FW - DW/TW - DW) x 100] conforme descrito acima.

[00694] As plantas que mantiveram alto teor relativo de água (RWC) em comparação às linhagens de Controle foram consideradas mais tolerante à seca que aquelas que apresentam reduzido teor relativo de água. Resultados Experimentais Tabela 116 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de seca

Tabela 116: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 117 Parâmetros adicionais medidos em acessos _ de Tomate sob condições de seca

Tabela 117. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de seca. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 118 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais

Tabela 118: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 119 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições normais

Tabela 119: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 120 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo teor de nitrogênio

Tabela 120: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 121 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo teor de nitrogênio

Tabela 121: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 122 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo teor de nitrogênio

Tabela 122: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 123 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo teor de nitrogênio, normais ou de estresse na seca nos acessos de Tomate

Tabela 123. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. Exp. ID” = Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p.

[00695] Correlação de características genéticas iniciais de vigor na coleção de Ecotipos de Tomate sob NaCl 300 mM, baixo teor de nitrogênio e condições normais de crescimento - Dez híbridos de tomate foram cultivados em 3 lotes de terra repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa sob condições semi- hidropônicas. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte: As sementes de Tomate foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculita e turfa em uma proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para solução de alta salinidade (NaCl 300 mM além da solução de Hoagland completa), solução de baixo teor de nitrogênio (a quantidade de nitrogênio total foi reduzida em 90% a partir da solução de Hoagland completa, quantidade final de N 0,8 mM), ou em solução de crescimento Normal (Hoagland completa contendo solução de N 8 mM, a 28 ± 2 °C). As plantas foram cultivadas a 28 ± 2 °C.

[00696] A solução de Hoagland completa consiste em: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de micro-elementos ‘Super coratin’ (ferro- EDDHA [etilenodiamina-N,N’-bis(2-ácido hidroxifenilacético)]- 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8.

[00697] Tecidos de tomate analisados - Todas as 10 variedades selecionadas de Tomate foram amostradas para cada tratamento. Dois tipos de tecidos [folhas e raízes] foram amostrados e o RNA foi extraídos conforme descrito acima. Para maior conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de micro-matriz recebeu um ID de Grupo conforme resumido na Tabela 124 abaixo. Tabela 124 Grupos de expressão de transcrição de, Tomate

Tabela 124. São apresentados os grupos experimentais de transcriptoma de tomate.

[00698] Parâmetros relacionados ao vigor do Tomate - Após 5 semanas de cultivo, as plantas foram colhidas e analisadas quanto ao número de folhas, altura da planta, níveis de clorofila (unidades de SPAD), diferentes índices de eficiência do uso de nitrogênio (NUE) e biomassa da planta. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando-se o software de análise estatística JMP (SAS Institute). Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 125 abaixo.

[00699] Número de folhas - número de folhas abertas.

[00700] Número de Folhas RGR - taxa de crescimento relativo (RGR) calculada do número de folhas.

[00701] Broto/Raiz - biomassa de broto dividida pela biomassa de raízes.

[00702] Biomassa total NUE - eficiência do uso de nitrogênio (NUE) calculado como biomassa total dividida pela concentração de nitrogênio.

[00703] Biomassa de raiz NUE - eficiência do uso de nitrogênio (NUE) do cultivo da raiz calculada como biomassa da raiz dividida pela concentração de nitrogênio

[00704] Biomassa de broto NUE - eficiência do uso de nitrogênio (NUE) do cultivo do broto calculada como biomassa do broto dividida pela concentração de nitrogênio.

[00705] Percentual de redução de biomassa da raiz em comparação ao normal - a diferença (redução em percentual) entre biomassa da raiz sob condições normais e sob condições de baixo teor de nitrogênio.

[00706] Percentual de redução de biomassa de broto em comparação ao normal - a diferença (redução em percentual) entre biomassa de broto sob condições normais e sob condições de baixo teor de nitrogênio.

[00707] Percentual de redução de biomassa total em comparação ao normal - a diferença (redução em percentual) entre biomassa total (broto e raiz) sob condições normais e sob condições de baixo teor de nitrogênio.

[00708] Altura da planta - As plantas foram caracterizadas quanto à altura durante o período de cultivo em 5 tempos avaliáveis. Em cada medição, as plantas foram medidas quanto á sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida desde o chão até o topo da maior folha.

[00709] SPAD [unidade de SPAD] - O teor de clorofila foi determinado utilizando-se um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folha jovem totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram realizadas por lote de terra.

[00710] Biomassa da raiz [DW, gr.]/SPAD - biomassa da raiz dividida pelos resultados de SPAD.

[00711] Biomassa de broto [DW, gr.]/SPAD - biomassa de broto dividida pelos resultados de SPAD.

[00712] Biomassa total (Raiz + Broto) [DW, gr.]/SPAD - biomassa total dividida pelos resultados de SPAD. Tabela 125 Parâmetros correlacionados de Tomate (vetores)

Tabela 125. São apresentados os parâmetros correlacionados do tomate. “NUE” = eficiência do uso de nitrogênio; “DW” = peso seco; “cm” = centímetros;

Resultados Experimentais

[00713] Dez diferentes variedades de Tomate foram cultivadas e caracterizadas quanto aos parâmetros conforme descritos acima (Tabela 125). A média de cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando-se o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 126-

[00714] 129 abaixo. A análise de correlação subsequente foi realizadas (Tabela 130). Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 126 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo teor de Trogênio

Tabela 126. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (Linhagem) sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 127 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo teor de nitrogênio

Tabela 127. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (Linhagem) sob condições de crescimento com baixo teor de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 128 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais

Tabela 128. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (Linhagem) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 129 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de salinidade

Tabela 129. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de Tomate (Linhagem) sob condições de crescimento em salinidade. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 130 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo teor de nitrogênio, normais ou de estresse em salinidade nos acessos de Tomate

Tabela 130. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela 125 acima. “Conj. Exp.”

[00715] Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p.

EXEMPLO 14 PRODUÇÃO TRANSCRIPTOMA DE SOJA (GLYCINE MAX) E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO UTILIZANDO MICRO-MATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE SOJA 44K B.

[00716] A fim de realizar uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleotídeos de Soja, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo em matriz representa aproximadamente 42.000 genes e transcrições da Soja. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados à arquitetura de plantas ou parâmetros relacionados ao vigor da planta, diversas características de planta de 29 diferentes variedades de Glycine max foram analisadas e 12 variedades foram ainda utilizadas para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando-se o teste de correlação de Pearson.

Procedimentos Experimentais

[00717] Vinte e nove variedades de soja foram cultivadas em três lotes de terra repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte: Sementes de Soja foram semeadas no solo e cultivadas sob condições normais até a colheita.

Tecidos de soja analisados

[00718] Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento ou parâmetros relacionados à arquitetura de plantas ou parâmetros relacionados ao vigor, 12 diferentes variedades de soja (de 29 variedades) foram analisadas e utilizadas para as análises de expressão genética conforme descrito acima. A análise foi realizada em dois períodos pré-determinados: na formação da vagem (quando as vagens da soja são formadas) e no momento da colheita (quando as vagens da soja estão prontas para a colheita, com sementes maduras). Cada tipo de tecido com informações de expressão de micro-matriz recebeu um ID de Grupo conforme resumido na Tabela 131 abaixo. Tabela 131 Grupos de expressão de transcriptoma de Soja

Tabela 131. São apresentados os grupos de expressão de transcriptoma de soja.

[00719] Extração de RNA - Todas as 12 variedades selecionadas de soja foram amostradas. Os tecidos de planta [folha, raiz, caule, vagem, meristema apical, botões de flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima.

[00720] Componentes de rendimento da Soja e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor.

[00721] Os parâmetros de dados coletados foram os seguintes:

[00722] Diâmetro da base do galho principal [mm] na formação da vagem - o diâmetro da base do galho principal (diâmetro da base) médio de três plantas por lote de terra.

[00723] Peso fresco [gr./planta] na formação da vagem - peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto as raízes) antes da secagem na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00724] Peso seco [gr./planta] na formação da vagem - peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto as raízes) após a secagem a 70 °C em forno por 48 horas na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00725] Número total de nodos com vagens nos galhos laterais [num/planta]- contagem de nodos que contêm vagens nos galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00726] Número de galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00727] Peso total de galhos laterais na formação da vagem [gr./planta] - peso de todos os galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00728] Peso total das vagens no caule principal na formação da vagem [gr./planta] - peso de todas as vagens no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00729] Número total de nodos no caule principal [num/planta] - contagem do número de nodos no caule principal, começando do primeiro nodo acima do solo, média de três plantas por lote de terra.

[00730] Número total de vagens com 1 semente nos galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente em todos os galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00731] Número total de vagens com 2 sementes nos galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes em todos os galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00732] Número total de vagens com 3 sementes nos galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes em todos os galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00733] Número total de vagens com 4 sementes nos galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes em todos os galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00734] Número total de vagens com 1 semente no caule principal na formação da vagem [num/planta] contagem do número de vagens contendo 1 semente no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00735] Número total de vagens com 2 sementes no caule principal na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00736] Número total de vagens com 3 sementes no caule principal na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00737] Número total de vagens com 4 sementes no caule principal na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00738] Número total de sementes por planta na formação da vagem [num/planta] - contagem do número de sementes nos galhos laterais e no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00739] Número total de sementes nos galhos laterais na formação da vagem [num/planta] - contagem do número total de sementes nos galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00740] Número total de sementes no caule principal na formação da vagem [num/planta] - contagem do número total de sementes no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00741] Altura da planta na formação da vagem [cm/planta] - comprimento total desde o ponto acima do solo até a ponta do caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00742] Altura da planta na colheita [cm/planta] - comprimento total desde o ponto acima do solo até a ponta do caule principal na colheita, média de três plantas por lote de terra.

[00743] Peso total das vagens nos galhos laterais na formação da vagem [gr./planta] - peso de todas as vagens nos galhos laterais na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00744] Proporção do número de vagens por nodo no caule principal na formação da vagem - calculada na fórmula XV, média de três plantas por lote de terra. Fórmula XV: Número total de vagens no caule principal/número total de nodos no caule principal, média de três plantas por lote de terra.

[00745] Proporção entre o número total de sementes no caule principal e o número de sementes nos galhos laterais - calculada na fórmula XVI, média de três plantas por lote de terra. Fórmula XVI: Número total de sementes no caule principal na formação da vagem/Número total de sementes nos galhos laterais na formação da vagem.

[00746] Peso total das vagens por planta na formação da vagem [gr./planta] - peso de todas as vagens nos galhos laterais e no caule principal na formação da vagem, média de três plantas por lote de terra.

[00747] Dias até 50% de florescência [dias] - número de dias até 50% de florescência para cada lote de terra.

[00748] Dias até 100% de florescência [dias] - número de dias até 100% de florescência para cada lote de terra.

[00749] Maturidade [dias] - medição como 95% das vagens em um lote de terra que amadureceram (ficaram 100% marrons). A queda atrasada de folhas e caules verdes não são considerados na designação da maturidade. Os testes são observados 3 dias por semana, a cada dois dias, quanto à maturidade. A data de maturidade é a data em que 95% das vagens atingiram a cor final. A maturidade é expressa em dias após 31 de agosto [de acordo com a definição aceita de maturidade nos EUA, Lista de descrição para SOJA, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ars-grin (dot) gov/cgi-bin/npgs/html/desclist (dot) pl?51].

[00750] Qualidade da semente [classificada de 1-5] - medição na colheita, uma estimativa visual com base em várias centenas de sementes. O parâmetro é classificado de acordo com as seguintes pontuações considerando a quantidade e o grau de enrrugamento, revestimento defeituoso (rachaduras), esverdeamento, e bolor ou outro pigmento. A classificação é 1-muito boa, 2- boa, 3- regular, 4-ruim, 5-muito ruim.

[00751] Verticalidade [classificada de 1-5] - é classificada na maturidade por lote de terra de acordo com as seguintes pontuações: 1-a maior parte das plantas em um lote de terra está ereta, 2-todas as plantas levemente inclinadas ou algumas plantas caídas, 3-todas as plantas moderadamente inclinadas, ou 25%-50% caídas, 4-todas as plantas consideravelmente inclinadas, ou 50%-80% caídas, 5-a maior parte das plantas está caída. Nota: pontuações intermediárias, por exemplo, 1,5, são aceitáveis.

[00752] Tamanho da semente [gr.] - peso de 1000 sementes por lote de terra normalizado para 13% de umidade, medição feita na colheita.

[00753] Peso total de sementes por planta [gr./planta] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas de um lote de terra delimitado) como peso em gramas de sementes limpas ajustado para 13% de umidade e dividido pelo número total de plantas em duas fileiras internas de um lote de terra delimitado.

[00754] Rendimento na colheita [alqueires/hectare] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas e um lote de terra delimitado) como peso em gramas de sementes limpas, ajustado para 13% de umidade, e então expresso como alqueires por acre.

[00755] Sementes médias por galho lateral por vagem [número de] - Calcular o Número de Sementes nos galhos laterais na formação da vagem e dividir pelo Número total de vagens com sementes nos galhos laterais na formação da vagem.

[00756] Sementes médias no caule principal por vagem [número de] - Calcular o Número total de sementes no caule principal na formação da vagem e dividir pelo Número total de vagens com sementes no caule principal na formação da vagem.

[00757] Comprimento médio internodos no caule principal [cm] - Calcular a Altura da planta na formação da vagem e dividir pelo Número total de nodos no caule principal na formação da vagem.

[00758] Número total de vagens com sementes no caule principal [número de] - contagem de todas as vagens contendo sementes no caule principal na formação da vagem.

[00759] Número total de vagens com sementes nos galhos laterais [número de] - contagem de todas as vagens contendo sementes nos galhos laterais na formação da vagem.

[00760] Número total de vagens por planta na formação da vagem [número de] - contagem das vagens no caule principal e nos galhos laterais na formação da vagem.

[00761] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 132 abaixo. Tabela 132 Parâmetros correlacionados da soja (vetores)

Tabela 132. São apresentados os parâmetros correlacionados da soja. “DW” = peso seco.

Resultados Experimentais

[00762] Os diferentes acessos de soja foram cultivados e caracterizados para diferentes parâmetros conforme descrito acima. A Tabela 132 descreve os parâmetros correlacionados da soja. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando-se o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 133-134 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários grupos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabela 135) foi realizada. Em seguida, os resultados foram integrados na base de dados. Tabela 133 Parâmetros medidos em variedades de Soja linhagens 1-6)

Tabela 133. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de soja (linhagem) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 134 Parâmetros medidos em variedades de Soja (linhagens 7-12)

Tabela 134. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de soja (linhagem) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 135 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais nas variedades de soja

Tabela 135. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” – ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. Conj. Exp.” - Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p.

EXEMPLO 15 DESENVOLVIMENTO DE FIBRA DE PLANTA EM ALGODÃO PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ALGODÃO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICRO- MATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE ALGODÃO

[00763] A fim de realizar uma análise de correlação de expressão genética de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram micro- matriz de oligonucleotídeos de algodão, projetada e produzida por “Comparative Evolutionary Genomics of Cotton” [Hypertext Transfer Protocol cottonevolution (dot) info/). Esta Micro-Matriz de oligonucleotídeos de Algodão é composta por 12.006 oligonucleotídeos da Integrated DNA Technologies (IDT) derivados de um conjunto de mais de 180.000 ESTs de Gossypium sequenciados a partir de 30 bibliotecas de cDNA. Para detalhes adicionais, vide PCT/IL2005/000627 e PCT/IL2007/001590 que são aqui incorporadas na íntegra por referência. Tabela 136 Grupos experimental de transcriptoma de algodão

Tabela 136. São apresentados os Grupos de expressão de transcriptoma de algodão. “5d” = 5 dias após a antese; “10d” = 10 dias após a antese; “15d” = 15 dias após a antese. “DPA” = dias após a antese.

[00764] Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e comprimento de fibra, foram analisadas as fibras de 8 diferentes linhagens de algodão. Essas fibras foram selecionadas demonstrando uma qualidade de fibra muito boa e alto índice de fiapo (tipos Pima, originário de outras espécies de algodão, a saber, G. barbadense), diferentes níveis de qualidade e índices de fiapo de várias linhagens de G. hirsutum: boa qualidade e alto índice de fiapo (tipo Acala) e baixa qualidade e baixo índice de fiapo (tipo Tamcot, e variedades antigas). Um resumo do comprimento de fibra das diferentes linhagens é mostrado na Tabela 137.

Procedimentos Experimentais

[00765] Extração de RNA - Estágios de desenvolvimento da fibra, representando diferentes características da fibra, em 5, 10 e 15 DPA, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima.

[00766] Avaliação do comprimento de fibra - O comprimento de fibra das linhagens selecionadas de algodão foi medido utilizando fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento de “Média da Metade Superior”. A média da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual World Wide Web (dot) cottoninc (dot) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length].

Resultados Experimentais

[00767] Oito diferentes linhagens de algodão foram cultivadas e o comprimento de fibra destas foi medido. Os valores de UHM das fibras estão resumidos na Tabela 137 abaixo. O valor de R-quadrado foi calculado (Tabela 138). Tabela 137 Resumo do comprimento de fibra das 8 diferentes linhagens de algodão

Tabela 137: São apresentadas as médias do comprimento de fibra de 8 diferentes linhagens de algodão.

Tabela 138 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em algodão Tabela 138. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. Exp.” - Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p

EXEMPLO 16 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS AO RENDIMENTO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO MICRO-MATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS 44K

[00768] Para realizar a análise de correlação de alta produtividade comparando o fenótipo da planta com o nível de expressão genética, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleotídeos de Arabidopsis thaliana, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. A matriz de oligonucleotídeos representa cerca de 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetados com base em dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e das bases de dados Arabidopsis MPSS (Universidade de Delaware). Para definir correlações entre os níveis de expressão e rendimento de RNA, os componentes de biomassa ou parâmetros relacionados ao vigor, diversas características de planta dos 15 diferentes Ecotipos de Arabidopsis foram analisadas. Entre eles, nove Ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando-se o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos Experimentais

[00769] Tecidos de Arabidopsis analisados - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo raiz, folha, flor na antese, semente em 5 dias após a florescência (DAF) e semente em 12 DAF, representando diferentes características de planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido com informações de expressão de micro-matriz recebeu um ID de Grupo conforme resumido na Tabela 139 abaixo. Tabela 139 Tecidos utilizados para os grupos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 139: São apresentados os números de identificação (ID) de cada um dos Grupos de expressão de Arabidopsis (1 5). DAF = dias após a florescência.

[00770] Avaliação dos componentes de rendimento e parâmetros relacionados ao vigor - Nove Ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (nomeados como A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por lote de terra. As plantas foram cultivadas em uma estufa sob condições controladas a 22 °C, e o fertilizante N:P:K (20:20:20; proporções em peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado. Durante este tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados durante o estágio de mudas das plantas cultivadas em placas de ágar verticais cultivadas transparentes (análise das mudas). A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisadas por meio de imagens digitais.

[00771] Imagem digital para análise das mudas - Um sistema laboratorial de aquisição de imagem foi utilizado para capturar imagens de pequenas plantas vistas em placas quadradas de ágar. O sistema de aquisição de imagens consiste em uma câmera digital de reflexo (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente focal com 55 mm de comprimento (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que incluía 4 unidades de luz (lâmpada de 4x150 Watts) e localizado em um quarto escuro.

[00772] Imagens digitais em estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3-4 dias, começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera acoplada a uma lente focal com 24 mm de comprimento (Canon série EF), colocada em um suporte de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores vistas em vasos brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os vasos brancos tinha formato quadrado medindo 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os tubos foram colocados abaixo do suporte de ferro, evitando a luz solar direta e com sombra direta. Este processo foi repetido a cada 3-4 dias por até 30 dias.

[00773] Um sistema de análise de imagens foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal desktop (processador Intel P43.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagens com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível gratuitamente na Internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando-se o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

[00774] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de cada lote de terra dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e introduzida entre duas bandejas de vidro, cada planta foi fotografada e os vários parâmetros (tais como área total da folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00775] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes Ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento das raízes foi documentado (vide exemplos nas Figuras 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula XVII. Fórmula XVII Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz no decorrer do tempo (medido em cm por dia).

[00776] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com a Fórmula XVII abaixo. Fórmula XVII: Taxa de crescimento relativo de crescimento vegetativo = Coeficiente de regressão da área da folha no decorrer do tempo (medida em cm2 por dia).

[00777] A análise foi finalizada com o surgimento de plantas em sobreposição.

[00778] Para comparação entre Ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando-se o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas reais. Nos casos em que as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), somente a amostra maior foi escolhida e incluída na comparação Anova.

[00779] Sementes em análise de síliquas - No dia 70, 15-17 síliquas foram coletadas de cada lote de terra nos blocos D e E. As síliquas escolhidas tinham cor castanho claro, porém ainda estavam intactas. As síliquas foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro, uma foto digital de alta resolução foi tirada para cada lote de terra. Utilizando as imagens, o número de sementes por síliqua foi determinado.

[00780] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos lotes de terra dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e fotografadas. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00781] Percentual de óleo nas sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos lotes de terra dos blocos A-C foram coletadas. As sementes Columbia de 3 lotes de terra foram trituradas misturadas e então colocadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas sob calor médio de 50 °C. Quando a extração foi concluída, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 °C e sob condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler’s) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando-se a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra - Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00782] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote de terra foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas tinham coloração verde- amarela e foram coletadas das partes inferiores do caule de uma planta cultivada. Uma foto digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.

[00783] Peso seco e rendimento de semente - No dia 80 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30 °C em uma câmara de secagem. O peso da biomassa e da semente de cada lote de terra foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto as raízes) após a secagem a 30 °C em uma câmara de secagem; Rendimento de semente por planta = peso total de semente por planta (gr.).

[00784] Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado utilizando a Fórmula XIX. Fórmula XIX: Rendimento de óleo da semente = Rendimento da semente por planta (gr.) * % de óleo na semente.

[00785] Índice de colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (descrita acima).

Resultados Experimentais

[00786] Nove diferentes Ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados para 18 parâmetros (chamados de vetores). A Tabela 140 descreve os parâmetros correlacionados de Arabidopsis. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando-se o software JMP (Tabelas 141142) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 143). Os resultados foram então integrados à base de dados. Tabela 140 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 140. São apresentados os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (ID de Correlação Nos. 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); gr. = grama(s); mg = miligrama(s).

[00787] Os valores caracterizados estão resumidos nas Tabelas 141 e 142 abaixo. Tabela 141 Parâmetros medidos em Ecotipos de Arabidopsis

Tabela 141: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de arabidopsis (linhagem). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 142 Parâmetros adicionais medidos em Ecotipos de Arabidopsis

Tabela 142: São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descritos acima) medidos em acessos de arabidopsis (linhagem). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 143 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais nos acessos de Arabidopsis

Tabela 143. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. Exp.” - Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p

EXEMPLO 17 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICRO- MATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE ARABIDOPSIS 44K

[00788] A fim de realizar a análise de correlação de alta produtividade comparando o fenótipo de planta com o nível de expressão genética, os presentes inventores utilizaram uma micro-matriz de oligonucleotídeos de Arabidopsis, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. A matriz de oligonucleotídeos representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com NUE, componentes de rendimento ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características de planta de 14 diferentes Ecotipos de Arabidopsis foram analisadas. Entre elas, dez Ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando-se o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos Experimentais

[00789] Tecidos de Arabidopsis analisados - Dois tecidos de plantas [folhas e caules] cultivados em dois diferentes níveis de fertilização com nitrogênio (Nitrogênio 1,5 mM ou Nitrogênio 6 mM) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tipo de tecido com informações de expressão de micro-matriz recebeu um ID de Grupo conforme resumido na Tabela 135 abaixo. Tabela 144 Grupos experimentais de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 144. São apresentados os Grupos de expressão de transcriptoma de arabidopsis.

[00790] Avaliação dos componentes de rendimento de Arabidopsis e parâmetros relacionados ao vigor sob diferentes níveis de fertilização com Nitrogênio - 10 acessos de Arabidopsis em 2 lotes de terra repetitivos, cada um contendo 8 plantas por lote de terra, foram cultivados em estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte: sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos de Eppendorf contendo 0,5 x Murashige- Skoog de meio salino basal e cultivadas a 23 °C sob ciclos diários de 12 horas com luz e 12 horas no escuro durante 10 dias. Em seguida, mudas de tamanhos semelhantes foram cuidadosamente transferidas para potes preenchidos com uma mistura de perlita e turfa em uma proporção de 1:1. Condições constantes de limitação de nitrogênio foram atingidas irrigando-se as plantas com uma solução contendo nitrogênio inorgânico 1,5 mM na forma de KNO3, suplementado com CaCl2 2 mM, KH2PO4 1,25 mM, MgSO4 1,50 mM, KCl 5 mM, H3BO3 0,01 mM e microelementos, enquanto que as condições normais de irrigação foram atingidas aplicando-se uma solução de nitrogênio inorgânico 6 mM também na forma de KNO3, suplementada com CaCl2 2 mM, KH2PO4 1,25 mM, MgSO4 1,50 mM, H3BO3 0,01 mM e microelementos. Para acompanhar o crescimento da planta, bandejas foram fotografadas no dia em que as condições de limitação de nitrogênio foram iniciadas e subsequentemente a cada 3 dias durante aproximadamente mais 15 dias. A área da roseta foi então determinada a partir das fotos digitais. O software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotos digitais [Hypertext Transfer Protocol://rsb (dot) info (dot) nih (dot) gov/ij/] utilizando scripts próprios projetados para analisar o tamanho da área da roseta a partir de plantas individuais em função do tempo. O sistema de análise de imagem incluía um computador pessoal desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagens com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível gratuitamente na Internet no endereço [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando-se o software de análise estatística JMP (SAS Institute). Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 145 abaixo. Tabela 145 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 145. “N” = Nitrogênio nas concentrações observadas; “gr.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “t50” = tempo em que 50% das plantas floresceram; “gr./ unidade de SPAD” = biomassa da planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida por SPAD. “DW” = peso seco da planta; “Nível de N /DW” = Nível de nitrogênio da planta medido em unidade de SPAD por biomassa da planta [gr.]; “DW/ Nível de N” = biomassa da planta por planta [gr.]/unidade de SPAD.

[00791] Avaliação de NUE, componentes de rendimento e parâmetros relacionados ao vigor - Dez Ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada uma contendo 8 plantas por lote de terra, em uma estufa com condições de temperatura controlada por aproximadamente 12 semanas. As plantas foram irrigadas com diferentes concentrações de nitrogênio conforme descrito acima dependendo do tratamento aplicado. Durante este período, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por meio de imagens digitais.

Imagens digitais - Ensaio em estufa

[00792] Um sistema de aquisição de imagens, que consiste em uma câmera digital de reflexo (Canon EOS 400D) acoplada a uma lente focal com 55 mm de comprimento (Canon série EF-S) colocada em um suporte de alumínio customizado, foi utilizado para capturar as imagens das plantas em recipientes em uma em uma estufa com ambiente controlado. O processo de captura de imagem é repetido a cada 2-3 dias começando no dia 9-12 até o dia 16-19 (respectivamente) a contar do transplante.

[00793] Um sistema de processamento de imagens foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagens com base em Java, que foi desenvolvido no U.S.

[00794] National Institutes of Health e disponível gratuitamente na Internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados resultantes do processamento das imagens foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando-se o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

[00795] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, área de lâmina da folha, diâmetro e área da roseta.

[00796] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) da área de lâmina da folha (Fórmula XX), o número de folhas (Fórmula XXI), a área da roseta (Fórmula XXII), o diâmetro da roseta (Fórmula XXIII), a abrangência do lote de terra (Fórmula XXIV) e a Área Relativa do Pecíolo (XXV) são calculados como segue: Fórmula XX Taxa de crescimento relativo da área de lâmina da folha = Coeficiente de regressão da área da folha no decorrer do tempo (medido em cm2 por dia) Fórmula XXI Taxa de crescimento relativo do número de folhas = Coeficiente de regressão do número de folhas no decorrer do tempo (medido em número por dia). Fórmula XXII Taxa de crescimento relativo da área da roseta = Coeficiente de regressão da área da roseta no decorrer do tempo (medido em cm2 por dia). Fórmula XXIII Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta = Coeficiente de regressão do diâmetro da roseta no decorrer do tempo (medido em cm por dia). Fórmula XXIV Taxa de crescimento relativo da abrangência do lote de terra = Coeficiente de regressão do lote de terra (medido em cm2 por dia). Fórmula XXV: Área Relativa do Pecíolo = (Área do Pecíolo)/Área da Roseta (medida em %).

[00797] Rendimento de semente e peso de 1000 sementes - Ao final do experimento, todas as sementes de todos os lotes de terra foram coletadas e pesadas a fim de medir o rendimento de semente por planta em termos de peso total de semente por planta (gr.). Para o cálculo do peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e fotografadas. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00798] Peso seco e rendimento de semente - Ao final do experimento, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30 °C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesadas e divididas pelo Número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (exceto as raízes) após a secagem a 30 °C em uma câmara de secagem.

[00799] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado utilizando-se a Fórmula IV conforme descrito acima.

[00800] T50 dias até a florescência - Cada uma das repetições foi monitorada quanto a data da florescência. Os dias de florescência foram calculados após a data da semeadura até que 50% dos lotes de terra florescessem.

[00801] Nível de nitrogênio da planta - O teor de clorofila das folhas é um bom indicador da condição de nitrogênio da planta, uma vez que o grau de coloração verde da folha está altamente correlacionado a este parâmetro. O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da florescência. As leituras do medidor de SPAD foram realizadas em folha jovem totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram realizadas por lote de terra. Com base nesta medição, foram calculados parâmetros tais como a proporção entre o rendimento de semente por unidade de nitrogênio [rendimento de semente/nível de N = rendimento de semente por planta [gr.]/unidade de SPAD], DW da planta por unidade de nitrogênio [DW/Nível de N= biomassa da planta por planta [gr.]/unidade de SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [Nível de N/DW= unidade de SPAD/biomassa da planta por planta (gr.)].

[00802] Percentual de redução do rendimento de semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas sob condições de limitação de nitrogênio em comparação ao rendimento de semente gerado em níveis normais de nitrogênio, expresso em %.

Resultados Experimentais

[00803] Dez diferentes acessos de Arabidopsis (Ecotipos) foram cultivados e caracterizados para 37 parâmetros conforme descrito acima (Tabela 145). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando-se o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 146149 abaixo. Foi realizada a análise de correlação subsequente entre os vários grupos de transcriptoma (Tabela 144) e os parâmetros medidos. Seguem os resultados integrados à base de dados. Tabela 146 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 146. São apresentados os parâmetros medidos sob diversos tratamentos em diversos Ecotipos (acessos de Arabidopsis). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 147 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 147. São apresentados os parâmetros medidos sob diversos tratamentos em diversos Ecotipos (acessos de Arabidopsis). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 148 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 148. São apresentados os parâmetros medidos sob diversos tratamentos em diversos Ecotipos (acessos de Arabidopsis). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 149 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 149. São apresentados os parâmetros medidos sob diversos tratamentos em diversos Ecotipos (acessos de Arabidopsis). As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 150 Correlação entre o nível de expressão de genes LAB selecionados de algumas configurações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo teor de nitrogênio e sob condições normais nos acessos de Arabidopsis

Tabela 150. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Corr.” - ID do Grupo de Correlação de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. Exp.” - Grupo de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = Valor de p.

EXEMPLO 18 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM ABST, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, RENDIMENTO, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, WUE, NUE E/OU FUE EM PLANTAS

[00804] Com base nas ferramentas de bioinformática e experimentais descritas acima, os presentes inventores identificaram 218 genes que exibem um impacto maior sobre a tolerância ao estresse abiótico, rendimento da planta, teor de óleo, taxa de crescimento, vigor, biomassa, rendimento e qualidade da fibra, capacidade fotossintética, taxa de crescimento, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso da água e eficiência do uso de fertilizante quando sua expressão é aumentada nas plantas. Os genes identificados, suas sequências curadas de polinucleotídeos e polipeptídeos, bem como suas sequências atualizadas de acordo com a base de dados GenBank estão resumidos na Tabela 151 abaixo. Tabela 151 Genes identificados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso da água, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, eficiência do uso de nitrogênio e eficiência do uso de fertilizante de uma planta

Tabela 151. São apresentados os genes idênticos cuja expressão em plantas aumenta a tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso da água, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, rendimento de fibra, qualidade da fibra, taxa de crescimento, teor de óleo, eficiência do uso de nitrogênio e eficiência do uso de fertilizante de uma planta. “Polin.” - polinucleotídeo; “Polip.” - polipeptídeo.

EXEMPLO 19 IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS QUE AFETAM ABST, WUE, RENDIMENTO, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, NUE E/OU FUE DE UMA PLANTA

[00805] Os conceitos de ortologia e paralogia têm sido recentemente aplicados às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações de genoma completo. Os ortólogos e parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização, e os últimos estão relacionados por eventos de duplicação. Assume-se que os parálogos resultantes de eventos de duplicação ancestral provavelmente divergiram em termos de função, ao passo que os ortólogos verdadeiros são mais prováveis de manter função idêntica durante o período de evolução.

[00806] A identificação de ortólogos putativos dos genes identificados na Tabela 151 acima pode ser realizada utilizando-se diversas ferramentas, tais como a BLAST (/Basic Local Alignment Search Tool/ [Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico]). As sequências suficientemente similares foram provisoriamente agrupadas. Estes ortólogos putativos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama ramificado (árvore) considerado uma representação das relações de evolução entre as taxas biológicas. Os grupos de ortólogos putativos foram analisados quanto á sua concordância com o filograma e em casos de discordância estes grupos de ortólogos eram devidamente rompidos.

[00807] Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando-se um vocabulário fixo de termos customizados, assim como os estágios de desenvolvimento (ou seja, genes apresentando perfil de expressão semelhante através do desenvolvimento com regulação ascendente em estágio específico, por exemplo, o estágio de preenchimento da semente) e/ou órgão da planta (ou seja, genes que apresentam perfil de expressão semelhante em seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, por exemplo, a semente). As anotações de todos os ESTs agrupados para um gene foram analisadas estatisticamente por comparação de sua frequência no grupo versus sua abundância na base de dados, permitindo construir um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é denominado “expressão digital”. A justificativa para o uso destes dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação de expressão fenotípica tem como base a suposição de que verdadeiros ortólogos são prováveis de manter função idêntica durante o período de evolução. Estes métodos provêem diferentes grupos de indicações em similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades no nível de sequência - aminoácidos idênticos nos domínios de proteína e similaridade nos perfis de expressão.

[00808] Os métodos de busca e identificação de homólogos de rendimento e características genéticas agronômicas aprimoradas, tais como tolerância ABS e polipeptídeos ou polinucleotídeos relacionados a FUE, estão dentro do escopo dos técnicos no assunto. A busca e identificação de genes homólogos envolve a triagem das informações de sequência disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, que incluem, entre outros, a DNA Database of Japan (DDBJ), Genbank, e a European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) ou versões destas ou a base de dados MIPS. Diversos diferentes algoritmos de busca foram desenvolvidos, incluindo, entre outros, o conjunto de programas denominado programas BLAST. Existem cinco implementações do BLAST, três projetadas para filas de sequência nucleotídica (BLASTN, BLASTX, e TBLASTX) e duas projetadas para filas de sequência protéicas (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). esses métodos envolvem o alinhamento e a comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula o percentual de identidade da sequência e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização da análise BLAST está disponível publicamente pelo National Centre for Biotechnology Information [Centro Nacional de Informações de Biotecnologia]. Outros software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximizam o número de correspondências e minimizam o número de gaps.

[00809] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família genética. A análise de uma família genética pode ser realizada utilizando-se a análise de similaridade da sequência. Para realizar esta análise, pode- se utilizar programas padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de junção de vizinhos das proteínas homólogas aos genes na presente invenção pode ser utilizada para prover uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade de sequência pode ser calculada utilizando-se um programa de alinhamento conforme descrito acima. Espera- se que outras plantas carreguem um gene funcional similar (ortólogo) ou uma família de genes similares e aqueles genes proverão o mesmo fenótipo preferido que os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção. Exemplos de outras plantas são aqui incluídas, entre outras, cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), óleo de semente de colza (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), sorgo (Sorghum bicolor), soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum), trigo (Triticum aestivum).

[00810] As análises acima mencionadas da homologia da sequência são preferivelmente realizadas em uma sequência de comprimento total, porém também podem ser baseadas em uma comparação de certas regiões, tais como domínios conservados. A identificação destes domínios também estaria dentro do escopo dos técnicos no assunto e envolveria, por exemplo, um formato legível em computador dos ácidos nucléicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações disponíveis publicamente sobre domínios de proteína, motivos e caixas conservados. Estas informações estão disponíveis nas bases de dados PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) biochem (dot) ucl (dot) ac (dot) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (dot) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol://pir (dot) Georgetown (dot) edu/) ou Pfam (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) sanger (dot) ac (dot) uk/Software/Pfam/). Os programas de análise de sequência projetados para a busca de motivo podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionado acima. Os programas de computador preferidos incluem, entre outros, MEME, SIGNALSCAN, e GENESCAN.

[00811] Um técnico no assunto pode utilizar as sequências homólogas aqui providas para encontrar sequências semelhantes em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similar à proteína não modificada da qual são derivados. Para produzir estes homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades semelhantes (alterações de conservação, tal como similar hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensidade para formar ou quebrar estruturas a-helicoidais ou estruturas de 3 camadas). As tabelas de substituição conservadora são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Os homólogos de um ácido nucléico abrangem ácidos nucléicos tendo substituições, deleções e/ou inserções nucleotídicas em relação ao ácido nucléico não modificado em questão e tendo atividade biológica e funcional semelhante ao ácido nucléico não modificado do qual são derivados.

[00812] Os polinucleotídeos e polipeptídeos com homologia significativa com os genes identificados descritos na Tabela 151 (Exemplo 18 acima) foram identificados a partir de bases de dados utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para o primeiro estágio, e o Needle (pacote EMBOSS) ou alinhamento de algoritmo Frame+ para o segundo estágio. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo de - 60% de Identidade em uma faixa de 60% dos comprimentos de sequência uma vez que utiliza somente um filtro para o estágio de alinhamento global. O filtro padrão do pacote Blast não foi utilizado (definindo-se o parâmetro “-F F”).

[00813] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base em uma identidade global de pelo menos 80% da sequência genética de polipeptídeo principal. Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para sequências protéicas ou nucleotídicas foram utilizadas neste pedido: 1. Entre duas proteínas (após o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. Os demais parâmetros permaneceram inalterados em relação às opções padrão acima descritas.

[00814] 2. Entre uma sequência protéica e uma sequência nucleotídica (após o filtro tblastn): Aplicativo GenCore 6.0 OneModel utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal -q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. Os demais parâmetros permaneceram inalterados em relação às opções padrão acima descritas.

[00815] As sequências polipeptídicas em fila foram ID DE SEQ. NOs: 475-770 [que são codificadas pelos polinucleotídeos ID DE SEQ. NOs:1-474 mostrados na Tabela 151) acima] e as sequências de ortólogos e homólogos identificadas tendo pelo menos 80% de identidade de sequência global são apresentadas na Tabela 152 abaixo. Espera-se que estes genes homólogos aumentem o ABST da planta, o rendimento, rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, rendimento de fibra, qualidade da fibra, comprimento de fibra, capacidade fotossintética, biomassa, vigor, WUE e/ou NUE de uma planta. Tabela 152 Homólogos dos genes/polipeptídeos identificados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso da água, rendimento, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, biomassa, taxa de crescimento, eficiência do uso de nitrogênio e eficiência do uso de fertilizante de uma planta

Tabela 152: São apresentados os polipeptídeos (polip.) e os polinucleotídeos (polin.) homólogos dos genes para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento de fibra, qualidade da fibra, biomassa, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso da água e eficiência do uso de fertilizante genes de uma planta que são listados na Tabela 151 acima. A homologia foi calculada como % de identidade ao longo das sequências alinhadas. As sequências em fila eram os polinucleotídeos e polipeptídeos mostrados na Tabela 151 acima, e as sequências de sujeito são sequências protéicas e polinucleotídicas identificadas na base de dados com base em mais de 80% de identidade global para as sequências nucleotídicas e/ou polipeptídicas em fila. Hom. = Homologia; Glob. = Global; Algor. = Algoritmo.

[00816] O resultado da abordagem genômica funcional aqui descrita é um grupo de genes altamente previsto para melhorar a ABST, o rendimento e/ou outras características genéticas agronômicas importantes, tais como taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso da água e eficiência do uso de fertilizante de uma planta aumentando-se sua expressão. Embora cada gene seja previsto por ter seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais que um gene proporcione um efeito aditivo ou sinergístico sobre o rendimento da planta e/ou sobre o desempenho de outros rendimentos agronômicos importantes. A alteração da expressão de cada gene aqui descrito isoladamente ou o grupo de genes juntos aumenta o rendimento total e/ou outras características genéticas agronômicas importantes e assim espera-se aumentar a produtividade agrícola.

EXEMPLO 20 CLONAGEM DE GENES E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DA PLANTA

[00817] Para validar seu papel na melhora do rendimento, os genes selecionados foram superexpressados nas plantas, conforme a seguir.

Estratégia de clonagem

[00818] Os genes selecionados a partir daqueles apresentados nos exemplos 1-19 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, as fases de leitura aberta (ORFs, sigla em inglês para open reading frames) integrais foram identificadas. Os clusters de EST e, em alguns casos, as sequências de mRNA, foram analisados para identificar a fase de leitura aberta inteira por meio da comparação dos resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de plantas.

[00819] A fim de clonar os cDNAs integrais, a transcrição reversa (RT, sigla em inglês para reverse transcription) seguida pela reação em cadeia da polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, raízes ou outros tecidos da planta, crescendo sob condições normais/limitativas ou de estresse. A extração do RNA total, a produção do cDNA e a amplificação do PCR foram realizadas utilizando os protocolos padrão descritos em outros locais (Sambrook J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York.), os quais são bem conhecidos por pessoas com experiência na técnica. Os produtos PCR foram purificados utilizando o kit de purificação PCR (Qiagen).

[00820] Geralmente, 2 conjuntos de iniciadores foram preparados para a amplificação de cada gene, via PCR aninhada (se necessário). Ambos os conjuntos de iniciadores foram utilizados para amplificação no cDNA. No caso em que nenhum produto foi obtido, uma reação PCR aninhada foi realizada. A PCR aninhada foi realizada por meio da amplificação dos gene utilizando iniciadores externos e então utilizando o produto PCR produzido como um modelo para uma segunda reação PCR, quando o conjunto interno de iniciadores foi utilizado. Alternativamente, um ou dois dos iniciadores internos foram utilizados para a amplificação do gene, tanto na primeira como na segunda reação PCR (significando que somente 2-3 iniciadores são designados para um gene). Para facilitar a clonagem adicional dos cDNAs, uma extensão de 8-12 pares de bases (bp, sigla em inglês para base pairs) foi adicionada aos 5' de cada iniciador interno. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local de restrição não existe na sequência cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores diretos e reversos foram designados de tal modo que o cDNA digerido foi inserido na direção do sentido no vetor binário utilizado para a transformação.

[00821] Os produtos PCR foram digeridos com as endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto PCR digerido foi inserido em um vetor de cópias elevadas pUC19 (New England BioLabs Inc), ou em plasmídeos originados deste vetor. Em alguns casos, o produto PCR não digerido foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) ou no pJET1.2 (Kit de Clonagem PCR CloneJET, Thermo Scientific) ou diretamente no vetor binário. Os produtos digeridos e o vetor linearizado de plasmídeo foram ligados utilizando a enzima de ligase DNA T4 (Roche, Suíça).

[00822] Foi realizado o sequenciamento dos genes inseridos, utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 (por exemplo, pQFNc) e o terminador NOS (N.° DE ID. DAS SEQ.: 10457) via digestão com as endonucleases de restrição apropriadas.

[00823] Diversas sequências do DNA dos genes selecionados foram sintetizadas pela GeneArt (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). O DNA sintetizado foi designado in silico. Os locais das enzimas de restrição adequadas foram adicionados às sequências clonadas ao fim dos 5' e ao fim dos 3' para permitir a clonagem posterior no vetor binário desejado.

[00824] Vetores binários - O vetor do plasmídeo pPI foi construído por meio da inserção de uma sequência de sinais poli-(A) sintéticos, originada do vetor básico do plasmídeo pGL3 (Promega, N.° de Acesso GenBank U47295; nucleotídeos 4658-4811) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, N.° de Acesso GenBank U12640). O pGI é similar ao pPI, mas o gene original na estrutura é GUS-Intron, e não GUS.

[00825] O vetor pGI modificado (por exemplo, pQFN, pQFNc, pQYN_6669, pQNa_RP, pQFYN ou pQXNc) é uma versão modificada do vetor pGI na qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, então o gene e seu promotor correspondente ficam próximos à borda direita e o gene NPTII está próximo à borda esquerda.

[00826] At6669, a nova sequência promotora de Arabidopsis thaliana (N.° DE ID DA SEQ: 10446) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante dos

[00827] fs clonados, seguida pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário a partir das colônias positivas de E. coli conforme descrito acima. As colônias foram analisadas pela PCR utilizando os iniciadores que cobrem o insumo que foi designado para abranger o promotor e o gene introduzidos. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00828] No caso em que um DNA genômico foi clonado, os genes foram amplificados por meio da PCR direta no DNA genômico extraído a partir do tecido da folha utilizando o kit DNAeasy (N.° de Cat. Qiagen 69104). Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são providos na Tabela 153 abaixo. Tabela 153

Tabela 153: São providos os identificadores de sequência dos genes clonados, os iniciadores utilizados para a clonagem, os nomes dos genes, os vetores utilizados para a clonagem e es espécies de plantas das quais os genes foram clonados.

EXEMPLO 21 TRANSFORMANDO CÉLULAS DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00829] Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 20 acima foi utilizado para transformar células de Agrobacterium. Dois construtos binários adicionais, tendo apenas o promotor At6669 ou o 35S ou nenhum promotor adicional, foram utilizados como controles negativos.

[00830] Os vetores binários foram introduzidos nas células competentes GV301 ou LB4404 do Agrobacterium tumefaciens (aproximadamente 109 células/mL) por eletroporação. A eletroporação foi realizada utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). Ascélulas tratadas foram cultivadas em meio LB líquido a 28 °C por 3 horas, e então banhado sobre ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para cepas GV301de Agrobacterium) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepa LB4404 de Agrobacterium) e canamicina (50 mg/L) a 28 DC por 48 horas. As colônias de Agrobacterium, que foram desenvolvidas no meio seletivo, foram ainda analisadas pela PCR utilizando os iniciadores designados para abranger a sequência inserida no plasmídeo pPI. Os produtos PCR resultantes foram isolados e sequenciados para verificar se as sequências corretas de polinucleotídeos da invenção estão introduzidas adequadamente nas células de Agrobacterium.

EXEMPLO 22 TRANSFORMAÇÃO DAS PLANTAS DE ARABIDOPSIS THALIANA COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00831] As plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (plantas T0) foram transformadas utilizando o procedimento Floral Dip descrito por Clough e Bent, 1998 (Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43) e por Desfeux et al., 2000 (Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Method. Plant Physiol, Julho de 2000, Vol. 123, pp. 895-904), com mínimas modificações. Resumidamente, as Plantas T0 foram semeadas em vasos de 250 ml preenchidos com uma mistura de crescimento à base de turfa. Os vasos foram cobertos com uma folha de alumínio e uma cúpula plástica, mantidos a 4 °C por 3-4 dias, e então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24 DC sob ciclos de luz/escuridão de 16/8 horas. As plantas T0 estavam prontas para a transformação seis dias antes da ântese.

[00832] Colônias únicas de Agrobacterium carregando os construtos binários foram geradas conforme descrito no Exemplo 21 acima. As colônias foram cultivadas no meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28 °C por 48 horas sob agitação vigorosa, e então centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. As partículas compreendendo as células de Agrobacterium foram ressuspensas em um meio de transformação contendo metade da concentração (2,15 g/L) de Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044 μM de benzilaminopurina (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); 5% de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água bidestilada, a um pH de 5,7.

[00833] A transformação das plantas T0 foi realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium, de tal modo que o tecido da planta acima do nível do solo foi submerso por 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada foi colocada imediatamente em uma bandeja plástica, e então coberta com uma cúpula de plástico transparente para manter a umidade e foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 18 horas, para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então descobertas e transferidas para uma estufa, para recuperação e amadurecimento. As plantas transgênicas T0 foram cultivadas na estufa por 35 semanas até que as síliquas estivessem marrons e secas. As sementes foram colhidas das plantas e mantidas a temperatura ambiente até a semeadura.

[00834] Para a geração de plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, as sementes colhidas das plantas transgênicas T0 foram esterilizadas na superfície pela imersão de 70% de etanol por 1 minuto, seguida pela imersão em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície são lavadas minuciosamente em água destilada estéril, e então colocadas em placas de cultura contendo metade da concentração de Murashige-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar da planta; 50 mM de canamicina; e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas, e então transferidas para uma sala de crescimento a 25 °C para uma semana de incubação adicional. As plantas vitais de Arabidopsis T1 foram transferidas para placas de cultura frescas, para outra semana de incubação. Após a incubação, as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e plantadas em uma mistura de crescimento contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram permitidas a crescer em uma estufa para amadurecimento. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e cresceram até o amadurecimento como plantas T2 sob as mesmas condições utilizadas para o cultivo e o crescimento das plantas T1.

EXEMPLO 23 AVALIAÇÃO DE ABST DA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA, RENDIMENTO E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB ESTRESSE ABIÓTICO, BEM COMO SOB CONDIÇÕES PADRÃO DE CRESCIMENTO NO ENSAIO NA ESTUFA (ensaios GH- SM) Ensaio 1 - ABST medido até o rendimento da semente (ensaio de amadurecimento da semente)

[00835] Rendimento da semente, biomassa da planta e taxa de crescimento da planta sob condições de seca e condições padrão de crescimento nos experimentos na estufa - Este ensaio segue a produção do rendimento da semente, a formação de biomassa e a área de crescimento da roseta das plantas crescidas na estufa sob condições de seca e sob condições padrão de crescimento. As sementes de Arabidopsis transgênica foram semeadas em um meio de phytogel suplementado com Yz de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram então transplantadas em bandejas 1,7 preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:2 e tufo no fundo da bandeja, e uma rede abaixo das bandejas (a fim de facilitar a drenagem da água). Metade das plantas foi irrigada com água da torneira (condições padrão de crescimento) quando o peso da bandeja alcançou 50% de sua capacidade de campo. A outra metade das plantas foi irrigada com água da torneira quando o peso da bandeja alcançou 20% de sua capacidade de campo, a fim de induzir estresse pela seca. Todas as plantas cresceram na estufa até o amadurecimento das sementes. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa remanescente da planta (o tecido acima do nível do solo) também foi colhida e pesada imediatamente ou após a secagem em forno a 50 °C por 24 horas.

[00836] Cada construto foi validado em sua geração T2 (sob o controle do promotor At6669, N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). Plantas transgênicas transformadas com um construto conformado por um vetor vazio carregando o promotor At6669 (N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446) e o marcador selecionado foram utilizados como controles.

[00837] As plantas foram analisadas quanto a seu tamanho total, taxa de crescimento, floração, rendimento da semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (IC- rendimento da semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle crescidas em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas de simulação sem nenhum tipo de gene, sob o mesmo promotor, foram utilizadas como controles.

[00838] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes randomizados aninhados. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto.

[00839] Obtenção de imagens digital - Um sistema de aquisição de imagens laboratoriais, que consiste de uma câmera refletora digital (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente de distância focal de 55 mm (série Canon EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts), é utilizado para capturar imagens das amostras de planta.

[00840] O processo de captura de imagens foi repetido a cada 2 dias, iniciando a partir do primeiro dia após o transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em um suporte de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores semeadas em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas eram quadradas e incluíam bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas sob o suporte de ferro, enquanto evitavam luz solar direta e a projeção de sombras.

[00841] Um sistema de análise de imagens foi utilizado, o qual consiste de um computador desktop pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagens com base em Java, desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível gratuitamente na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas no formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00842] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo número de folhas, área da roseta, diâmetro da roseta, área da lâmina da folha, Área Relativa do Pecíolo e comprimento do pecíolo da folha.

[00843] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) do número de folhas [fórmula XXI (descrita acima)], área da roseta (Fórmula XXII, acima), cobertura do lote (Fórmula XXIV, acima) e índice de colheita (Fórmula IV) foram calculados com as fórmulas indicadas.

[00844] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as sementes foram colhidas. As sementes foram dispersas em uma bandeja de vidro e uma foto foi. Utilizando a análise digital, foi calculado o número de sementes em cada amostra.

[00845] Peso seco e rendimento da semente - Aproximadamente no dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e secas a 30 °C em uma câmara secadora. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada lote.

[00846] Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do nível do solo (excluindo as raízes) após a secagem a 30 °C em uma câmara secadora; Rendimento da semente por planta = peso total da semente por planta (g.). Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g.).

[00847] O índice de colheita (IC) foi calculado utilizando a Fórmula IV conforme descrito acima.

[00848] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abióticos, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos a partir das plantas de controle. Para identificar os genes e construtos superiores, os resultados dos eventos de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student e os resultados eram considerados significativos se o valor de p fosse menor que 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

[00849] As tabelas 154-163 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas expressam exogenamente os construtos do gene utilizando os ensaios de amadurecimento da semente na estufa (GH-SM) sob condições padrão de crescimento (Tabelas 154-158) ou sob condições de seca (Tabelas 159-163). As plantas transgênicas expressando esses genes apresentam maior biomassa (Tabelas 154, 155, 157, 159, 160, 162), rendimento (Tabelas 157, 158, 162, 163), vigor e taxa de crescimento (Tabela 154, 156, 159 e 161) e tempo de floração (Tabelas 154 e 159) em comparação às plantas de controle crescidas em condições idênticas de crescimento. Além disso, o aumento do desempenho da planta sob condições de estresse pela seca, em comparação às plantas de controle, indicou tolerância aumentada a uma condição de estresse abiótico, como a seca. A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. O evento com valor de p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Deve-se observar que um incremento negativo (em porcentagens), quando encontrado da floração ou na emergência de inflorescência, indica prevenção contra a seca da planta. Tabela 154 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento . sob regulação do promotor At6669

Tabela 154. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 155 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor At6669

Tabela 155. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 156 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento, sob regulação do promotor At6669

Tabela 156. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 157 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor At6669

Tabela 157. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 158 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor At6669

Tabela 158. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 159 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669 Tabela 159. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 160 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 160. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 161 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 161. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 162 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 162. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 163 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 163. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

EXEMPLO 24 AVALIAÇÃO DE ABST DA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA, BIOMASSA E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB ESTRESSE ABIÓTICO, BEM COMO SOB CONDIÇÕES PADRÃO NO ENSAIO NA ESTUFA (Ensaios GH - SB) Ensaio 2 - ABST medido até o estágio de florescimento.

[00850] A biomassa da planta e a taxa de crescimento da planta sob condições de seca e condições padrão de crescimento nos experimentos na estufa - Este ensaio segue a formação da biomassa da planta e a área de crescimento da roseta das plantas crescidas na estufa sob condições de seca e condições padrão de crescimento. As sementes de Arabidopsis transgênicas foram semeadas em um meio de phytogel suplementado com ^ de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram então transplantadas em bandejas 1,7 preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:2 e tufo no fundo da bandeja, e uma rede abaixo das bandejas (a fim de facilitar a drenagem da água). Metade das plantas foi irrigada com água da torneira (condições padrão de crescimento) quando o peso da bandeja alcançou 50% de sua capacidade de campo. A outra metade das plantas foi irrigada com água da torneira quando o peso da bandeja alcançou 20% de sua capacidade de campo, a fim de induzir estresse pela seca (condições de seca). Todas as plantas cresceram na estufa até o estágio de florescimento. Na colheita, a biomassa remanescente da planta (o tecido acima do nível do solo) foi pesada diretamente após a colheita da roseta (peso fresco [PF] da planta). Daí em diante, as plantas foram secas em um forno a 50°C por 48 horas e pesadas (peso seco [PS] da planta).

[00851] Cada construto foi validado em sua geração T2 (sob o controle do promotor At6669, N.° DE ID. DAS SEQ.:10446). Plantas transgênicas transformadas com um construto conformado por um vetor vazio carregando o promotor At6669 (N.° DE ID. DAS SEQ.:10446) e o marcador selecionável foi utilizado como controle.

[00852] As plantas foram analisadas quanto a seu tamanho total, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle crescidas em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas de simulação sem nenhum tipo de gene, sob o mesmo promotor, foram utilizadas como controles.

[00853] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes randomizados aninhados. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto.

[00854] Obtenção de imagens digital - Um sistema de aquisição de imagens laboratoriais, que consiste de uma câmera refletora digital (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente de distância focal de 55 mm (série Canon EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts), é utilizado para capturar imagens das amostras de planta.

[00855] O processo de captura de imagens foi repetido a cada 2 dias, iniciando a partir do primeiro dia após o transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em um suporte de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores semeadas em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas eram quadradas e incluíam bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas sob o suporte de ferro, enquanto evitavam luz solar direta e a projeção de sombras.

[00856] Um sistema de análise de imagens foi utilizado, o qual consiste de um computador desktop pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagens com base em Java, desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível gratuitamente na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas no formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00857] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) da área da lâmina da folha (Fórmula XX), número de folhas (Fórmula XXI), área da roseta (Fórmula XXII), diâmetro da roseta (Fórmula XXIII), cobertura do lote (Fórmula XXIV) e a Área Relativa do Pecíolo (XXV) foram calculadas conforme descrito abaixo.

[00858] Peso fresco e seco da planta - Aproximadamente no dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (PF) e secas a 50 DC em uma câmara secadora por aproximadamente 48 horas antes da pesagem para determinar o peso seco da planta (PS).

[00859] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abióticos, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos a partir das plantas de controle. Para identificar os genes e construtos superiores, os resultados dos eventos de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student e os resultados eram considerados significativos se o valor de p fosse menor que 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados experimentais:

[00860] Os genes foram clonados sob a regulação de uma constitutiva (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. O evento com valor de p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo.

[00861] Os genes listados nas Tabelas 164-166 melhoraram a ABST da planta quando crescida sob condições de seca. Esses genes produziram plantas maiores com maior área fotossintética e biomassa aumentada e taxa de crescimento [peso seco, peso fresco, número de folhas, diâmetro da roseta, área da roseta, cobertura do lote, taxa de crescimento (TCR) do número de folhas, taxa de crescimento (TCR) da cobertura do lote, taxa de crescimento (TCR) do diâmetro da roseta] quando crescida sob condições de seca.

[00862] Os genes listados nas Tabelas 167-169 melhoraram o desempenho da planta quando crescida sob condições padrão (normais) de crescimento. Esses genes produziram plantas maiores com maior área fotossintética e biomassa aumentada e taxa de crescimento [peso seco, peso fresco, número de folhas, diâmetro da roseta, área da roseta, cobertura do lote, taxa de crescimento (TCR) do número de folhas, taxa de crescimento (TCR) da cobertura do lote, taxa de crescimento (TCR) do diâmetro da roseta] quando crescida sob condições normais. Tabela 164 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 164. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 165 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

Tabela 165. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 166 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento na seca sob regulação do promotor At6669

> Tabela 166. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

Tabela 167 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento . sob regulação do promotor At6669

Tabela 167. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 168 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor At6669

Tabela 168. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 169 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor At6669

Tabela 169. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

EXEMPLO 25 AVALIANDO O CRESCIMENTO DA PLANTA ARABIDOPSIS SOB ESTRESSE ABIÓTICO, BEM COMO SOB CONDIÇÕES FAVORÁVEIS POR MEIO DAS ANÁLISES DA MUDA

[00863] Ensaio 3: Análise da muda do crescimento das plantas sob estresse osmótico [poli(etileno glicol) (PEG)] - Uma das consequências da seca é a indução de estresse osmótico na área ao redor das raízes; portanto, em muitos estudos científicos, PEG (por exemplo, 2,2% de PEG) é utilizado para simular as condições de estresse osmótico semelhante à alta osmolaridade encontrada durante o estresse pela seca.

[00864] Ensaio 4: Análise da muda do crescimento das plantas sob condições de alta salinidade (NaCl) - A alta salinidade é um estresse abiótico que desafia os sistemas da raiz das plantas. Desse modo, um ensaio no qual as plantas crescem sob alta salinidade (110-120 mM NaCl) foi conduzido e o desempenho da planta em termos de crescimento do broto e da raiz foi avaliado.

[00865] Ensaio 5: Análise da muda do crescimento das plantas sob níveis baixos e favoráveis de concentração de nitrogênio - O nitrogênio baixo é outro estresse abiótico que impacta no crescimento da raiz e da muda. Portanto, foi realizado um ensaio que examina o desempenho da planta sob concentrações baixas (0.75 mM de Nitrogênio) e favoráveis (15 mM de Nitrogênio) de nitrogênio.

Descrição do experimento para os ensaios 3 e 4:

[00866] As sementes esterilizadas na superfície foram semeadas no meio basal [50% de meio Murashige- Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar da planta como agente solidificante] na presença de Canamicina (para selecionar somente plantas transgênicas). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2-3 dias para estratificação a 4 °C e então crescidas a 25 °C, sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, por 7 a 10 dias. Neste ponto no tempo, as mudas escolhidas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo 2,2% de PEG: 0,5 de meio MS (ensaio 3), 110-120 mM de NaCl: 0.5 de meio MS (ensaio 4), ou condições normais de crescimento (0,5 de meio MS). Cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico, e 3-4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos de transformação independentes foram analisados de cada construto. As plantas expressando os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.

Descrição do experimento para o ensaio 5:

[00867] As sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio Murashige- Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar da planta como agente solidificante] na presença de Canamicina (utilizada como agente selecionador). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2-3 dias para estratificação a °C e então crescidas a 25 °C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, por 7 a 10 dias. Neste ponto no tempo, as mudas escolhidas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo ^ de meio MS (15 mM N) para o tratamento de concentração normal de nitrogênio e 0,75 mM de nitrogênio para os tratamentos de baixa concentração de nitrogênio. Para experimentos realizados nas linhagens T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico, e 3-4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos de transformação independentes foram analisados de cada construto. Para experimentos realizados nas linhagens T1, cada placa continha 5 mudas de eventos transgênicos independentes, e 3-4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. No total, para as linhagens T1, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas expressando os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.

[00868] Obtenção de imagens digital - Um sistema de aquisição de imagens laboratoriais, que consiste de uma câmera refletora digital (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente de distância focal de 55 mm (série Canon EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts), e localizado em uma sala escura, foi utilizado para a captura de imagens de plântulas semeadas nas placas de ágar.

[00869] O processo de captura de imagens foi repetido a cada 3-4 dias, iniciando no dia 1 até o dia 10 (para exemplo, vide as imagens nas figuras 3A-F).

[00870] Um sistema de análise de imagens foi utilizado, o qual consiste de um computador desktop pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagens com base em Java, desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível gratuitamente na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas na resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas no formato JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00871] Análise da muda - Utilizando a análise digital, os dados da muda foram calculados, incluindo a área da folha, cobertura da raiz e comprimento da raiz.

[00872] A taxa de crescimento relativo para os vários parâmetros de mudas foi calculada de acordo com as seguintes Fórmulas XXVI (abaixo) e XVII (acima). Fórmula XXVI: Taxa de crescimento relativo da área da folha = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso temporal (medido em cm2 por dia).

[00873] Ao final do experimento, as plântulas forma removidas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As plântulas foram então secas por 24 horas a 60 DC, e pesadas novamente para medir o peso seco da planta para uma posterior análise estatística. A taxa de crescimento foi determinada pela comparação da cobertura da área da folha, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta, sob estresse abiótico, bem como sob condições ideais. De modo similar, o efeito do gene introduzido na acumulação de biomassa, sob estresse abiótico, bem como sob condições ideais, foi determinado pela comparação do peso fresco e do peso seco das plantas ao das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). De cada construto criado, 3-5 eventos de transformação independentes são examinados em réplicas.

[00874] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abióticos ou arquitetura ampliada da raiz, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos a partir das plantas de controle. Para identificar os genes e construtos superiores, os resultados dos eventos de transformação independentes foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento do gene sobre um controle, os dados foram analisados utilizando o teste t de Student e o valor de p foi calculado. Os resultados eram considerados significativos se o valor de p fosse < 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados experimentais

[00875] Os genes listados na Tabela 170 melhoraram a biomassa da planta quando crescida em condições padrão. Esses genes produziram maior biomassa da planta (peso fresco e seco da planta) quando crescida sob condições padrão, em comparação às plantas de controle. A maior biomassa da planta sob essas condições de crescimento indica a alta capacidade da planta de metabolizar melhor os nutrientes presentes no meio. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 170). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 170 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento . sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 170. “CONT.” - Controle; “Méd.” - Média; “% Incr.” = % de incremento; "val. de p" - valor de p; L- p<0,01.

[00876] Os genes listados nas Tabelas 171-172 melhoraram o desempenho da folha e da raiz quando crescida em condições padrão. Esses genes produziram maior desempenho da folha e da raiz (área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescida sob condições padrão de crescimento, em comparação às plantas de controle. As plantas que produzem maior biomassa na raiz têm melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de água e nitrogênio do solo. As plantas que produzem maiores folhas têm uma melhor capacidade de produzir assimilados. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 171) ou na geração T1 (Tabela 172.) Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 171 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 171. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 172 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor A6669 (geração T1)

Tabela 172. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00877] Os genes listados nas Tabelas 173-174 melhoraram a taxa de crescimento da planta (área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescida em condições padrão de crescimento. Esses genes produziram plantas que cresceram mais rápido que as plantas de controle, quando crescidas sob condições padrão de crescimento. As plantas que mostram uma taxa de crescimento rápido mostram um melhor estabelecimento da planta no solo. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área da folha e do comprimento e cobertura da raiz foi medida. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 173) ou na geração T1 (Tabela 174.) Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 173 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor A6669 (geração . T2)

Tabela 173. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01 Tabela 174 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições normais de crescimento sob regulação do promotor A6669 (geração T1)

Tabela 174. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00878] Os genes apresentados na Tabela 175 mostraram uma melhora significativa na ABST da planta. Esses genes produziram maior biomassa da planta (peso fresco e seco da planta) quando crescida sob condições de alta salinidade (ensaio 4), em comparação às plantas de controle. A maior biomassa da planta sob estas condições de crescimento indica a alta capacidade da planta de metabolizar melhor os nutrientes presentes no meio. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 175). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 175 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Alta Salinidade sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 175. “CONT.” - Controle; “Méd.” - Média; “% Incr.” = % de incremento; "val. de p" - valor de p; L- p<0,01.

[00879] Os genes apresentados na Tabela 176 mostraram uma melhora significativa na ABST da planta. Esses genes produzem uma maior área da folha e biomassa da raiz (área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescidas sob condições de crescimento em alta salinidade (ensaio 4), em comparação às plantas de controle. As plantas que produzem maior biomassa da raiz têm melhores possibilidades de absorver uma maior quantidade de água do solo. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 176). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 176 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Alta Salinidade sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 176. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00880] Os genes apresentados na Tabela 177 mostraram uma melhora significativa na ABST da planta. Esses genes melhoraram a taxa de crescimento da planta (taxa de crescimento da área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescida sob condições de crescimento em alta salinidade (ensaio 4), em comparação às plantas de controle. As plantas que mostram uma taxa de crescimento rápido mostram um melhor estabelecimento da planta no solo. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área da folha e do comprimento e cobertura da raiz foi medida. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 177). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 177 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de Alta Salinidade sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 177. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00881] Os genes apresentados nas Tabelas 178-179 mostraram uma melhora significativa na EUN da planta, uma vez que eles produziram maior biomassa da planta (peso fresco e seco da planta) na geração T2 (Tabela

[00882] 178) ou na geração T1 (Tabela 179) quando crescida sob condições de crescimento limitantes de nitrogênio (ensaio 5), em comparação às plantas de controle que cresceram sob condições idênticas de crescimento. A maior biomassa da planta sob essas condições de crescimento indica a alta capacidade da planta de metabolizar melhor os nutrientes presentes no meio. Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 178 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 178. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 179 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T1)

Tabela 179. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00883] Os genes apresentados nas Tabelas 180-181 mostraram uma melhora significativa na EUN da planta, uma vez que eles melhoraram o desempenho da folha e da raiz quando crescidas sob condições de baixo nitrogênio (ensaio 5). Esses genes produziram uma maior área da folha e biomassa da raiz (área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescidas sob condições de crescimento com baixo nitrogênio, em comparação às plantas de controle. As plantas que produzem uma maior biomassa da raiz têm melhores possibilidades de absorver uma maior quantidade de água e nitrogênio do solo. As plantas que produzem folhas maiores têm uma melhor capacidade de produzir assimilados. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 180) ou na geração T1 (Tabela 181). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 180 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 180. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 181 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T1)

Tabela 181. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00884] Os genes apresentados nas Tabelas 182-183 mostraram uma melhora significativa na EUN da planta. Esses genes melhoraram a taxa de crescimento da planta (taxa de crescimento da área da folha, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando crescida sob condições de crescimento com baixo nitrogênio (ensaio 5), em comparação às plantas de controle. As plantas que mostram uma taxa de crescimento rápido mostram um melhor estabelecimento da planta no solo. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área da folha e do comprimento e cobertura da raiz foi medida. As plantas foram avaliadas na geração T2 (Tabela 182) ou na geração T1 (Tabela 183). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; N.° DE ID. DAS SEQ.: 10446). A avaliação de cada gene foi realizada por meio do teste de desempenho do diferente número de eventos. Alguns dos eventos foram avaliados em mais de uma análise da muda resultando em resultados positivos também. Tabela 182 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T2)

Tabela 182. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01. Tabela 183 Genes mostrando desempenho melhorado da planta em condições de crescimento em Baixo Nitrogênio sob regulação do promotor A6669 (geração T1)

Tabela 183. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Incr." = % de incremento; "val. de p" - valor de p, L- p<0,01.

[00885] Esses resultados demonstram que os polinucleotídeos da invenção são capazes de melhorar o rendimento e as particularidades agrícolas importantes, valiosas e adicionais, como o aumento da biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência de uso do nitrogênio, rendimento, vigor, rendimento e/ou qualidade da fibra. Desse modo, as plantas transformadas que mostram peso seco e fresco melhorados demonstram a capacidade gênica de melhorar a biomassa, uma particularidade fundamental das culturas para forragem e produtividade da planta; as plantas transformadas que mostram melhora no rendimento da semente demonstram a capacidade gênica de melhorar a produtividade da planta; as plantas transformadas que mostram melhora na cobertura do lote e no diâmetro da roseta demonstram a capacidade gênica de melhorar a resistência à seca das plantas, conforme reduzem a perda de água no solo pela simples evaporação e reduzem a concorrência com as ervas daninhas; consequentemente reduzindo a necessidade de uso de herbicidas para o controle de ervas daninhas. As plantas transformadas que mostram melhora na taxa de crescimento relativo de vários órgãos (folha e raiz) demonstram a capacidade gênica de promover o crescimento da planta e, consequentemente, a redução do período de crescimento necessário e/ou, alternativamente, a melhora na utilização dos nutrientes disponíveis e condução de água para o aumento da produtividade da terra; As plantas transformadas que mostram melhora no número de órgãos, conforme demonstrado pelo parâmetro de número de folhas exibem um potencial para melhorar o rendimento da biomassa, importante para culturas de forragem, e melhorar a produtividade da planta; As plantas transformadas que mostram aumento no comprimento e na cobertura da raiz demonstram a capacidade gênica de melhorar a resistência à seca e uma melhor utilização dos fertilizantes, visto que as raízes podem atingir um maior volume do solo; As plantas transformadas que mostram melhora da área relativa do pecíolo da folha e da área da lâmina da folha demonstram a capacidade gênica de lidar com os resultados de intensidades limitadas de luz a partir do aumento das densidades da população de plantas e, consequentemente, a melhora da produtividade da terra.

[00886] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com as configurações específicas daqui, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles com experiência na técnica. Consequentemente, é pretendido abranger todas as alternativas, modificações e variações dentro da essência e escopo abrangente das reivindicações em anexo.

[00887] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são incorporados aqui em sua totalidade por referência na especificação, como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada aqui por referência. Além disso, citações ou identificações de qualquer referência neste pedido não devem ser construídas como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Na medida em que os títulos das seções sejam utilizados, eles não devem ser construídos como necessariamente limitantes.

Legenda das Figuras

[00888] Figuras 1 e 2 T1) borda esquerda T2) borda direita T3) promotor síntase napalina T4) Gene de neomicina fosfotransferase T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T7) local de clonagem múltipla T8) gene intron de GUS {beta-glucuronidade] T9) Enzima de Restrição T10) pQYN-6669 T11) pQFN, pQFNc

[00889] Figura 3 T12) condições normais T13) Estresse osmótico (15% de PEG) T14) Condições limitadoras de nitrogênio

[00890] Figura 4 T1) borda esquerda T2) borda direita T3) promotor síntase napalina T4) Gene de neomicina fosfotransferase T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T7) local de clonagem múltipla T9) Enzima de Restrição T15) Promotor de Raiz T16) pQNa_RP

[00891] Figura 5 T1) borda esquerda T2) borda direita T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T17) gene de neomicia fosfotransferase ORF T18) promotor de NOS T19) Local de inversão T20) tDNA invertido T21) 2° intron (IV2) do Gene ST-LS1 T22) ORF de gene intron de Gus [beta-glucuronidase] T23) comp rev de pQYN tDNA

[00892] Figura 6 T1) borda esquerda T2) borda direita T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T17) gene de neomicia fosfotransferase ORF T18) promotor de NOS T19) Local de inversão T20) tDNA invertido T24) promotor de 6669 Cid506 T25) Inserir Cassete T26) pQFN

[00893] Figura 7 T1) borda esquerda T2) borda direita T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T17) gene de neomicia fosfotransferase ORF T18) promotor de NOS T19) Local de inversão T20) tDNA invertido T21) 2° intron (IV2) do Gene ST-LS1 T24) promotor de 6669 Cid506 T27) gene intron de GUS [beta-glucuronidase]ORF T28) Inserir GUS+NOSTer T29) pQFYN

[00894] Figura 8 T1) borda esquerda T2) borda direita T3) promotor síntase napalina T4) Gene de neomicina fosfotransferase T5) terminador de síntase nopalina T6) Sinal de poliadenilação T7) local de clonagem múltipla T9) enzima de restrição T30) pQXNc

Claims (8)

1. Método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento da semente, rendimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou tolerância ao estresse abiótico em uma planta, caracterizado pelo fato de: (a) transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 368 ou 110, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 584, ou suas sequências degeneradas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 584, e (b) gerar uma planta madura a partir da referida célula vegetal, aumentando assim o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento da semente, rendimento da fibra, capacidade fotossintética, e/ou tolerância ao estresse abiótico em uma planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 368 e 110, ou é uma sequência códon-otimizada da mesma que codifica o referido polipeptídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 368 e 110.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 368.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, caracterizado ainda pelo cultivo da planta transformada com o referido polinucleotídeo sob o estresse abiótico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, caracterizado pelo fato de que o referido estresse abiótico é selecionado do grupo que consiste em salinidade, seca, estresse osmótico, privação de água, alagamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, deficiência de nitrogênio, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, caracterizado ainda pela seleção da referida planta madura transformada com o referido polinucleotídeo para um aumento de rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, rendimento de fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico em comparação com uma planta controle da mesma espécie sob as mesmas condições de crescimento.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, caracterizado ainda por selecionar a referida planta madura transformada com o referido polinucleotídeo por um tempo reduzido para floração e/ou tempo para emergência de inflorescência em comparação com uma planta controle da mesma espécie sob as mesmas condições de crescimento.

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