BR122021002308B1

BR122021002308B1 - Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado

Info

Publication number: BR122021002308B1
Application number: BR122021002308-5A
Authority: BR
Inventors: Eyal Emmanuel; Hagai Karchi
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2010-04-28
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2021-11-09
Also published as: AU2018204224A1; EP2563112A2; WO2011135527A2; CA2797200C; CA3070921A1; BR122021002337B1; AU2011246876A1; MX2021013896A; MX2021013894A; US20210087577A1; US11542522B2; AU2020267286B2; AR080975A1; AU2011246876B2; MX2021013898A; AU2016228223A1; US20130125258A1; BR122021002340B1; BR112012027504B1; AU2016228223B2

Abstract

provê polinucleotídeos isolados compreendendo a sequência ácidos nucleicos pelo menos 80% idêntica aos ids das seqs nºs: 321, 1-320, 322-480, 793-2945 ou 2946; polipeptídeos isolados que compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga aos ids das seqs nºs: 517, 481-516, 518-792, 2947-4662 ou 4663, construções de ácidos nucleicos compreendendo o mesmo, células transgênicas e plantas expressando o mesmo, e métodos de uso do mesmo para aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de nitrogênio da planta.

Description

DIVIDIDO DO BR112012027504-6, DEPOSITADO EM 27/04/2011 CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[0001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas configurações, está relacionada a polinucleotídeos e polipeptídios isolados que podem aumentar a produção (ex.: biomassa, quantidade e/ou qualidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, tolerância ao estresse abiótico (ABST), eficiência no uso de água (WUE), eficiência no uso de nitrogênio (NUE) e ou eficiência no uso de fertilizantes (FUE) de uma planta.

[0002] O crescimento constante da população mundial e a disponibilidade decrescente de terras aráveis afetam a produção das plantas e de produtos relacionados a elas. A escassez global de fornecimento de água, a desertificação, as condições de estresse abiótico (ABS) (ex.: salinidade, estiagem, inundações, temperatura subótima e poluição química tóxica), e/ou fontes de nitrogênio e fertilização limitadas causam danos substanciais a plantas agrícolas, tais como grandes alterações no metabolismo da planta, morte celular, e diminuições no crescimento da planta e na produtividade da safra.

[0003] A estiagem é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente seco que ocorrem por tempo suficiente para produzir sérios desequilíbrios hidrológicos, tais como danos à safra, escassez no fornecimento de água e maior suscetibilidade a diversas doenças.

[0004] A salinidade, altos níveis de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais safras de comida, ou seja, trigo, milho, arroz e soja, podem tolerar sal em excesso. Efeitos prejudiciais do sal nas plantas resultam tanto de escassez de água, o que leva ao estresse osmótico (similar ao estresse de estiagem), como do efeito de excesso de íons de sódio em processos bioquímicos críticos. Bem como congelamento e estiagem, o excesso de sal causa escassez de água; e a presença de excesso de sal dificulta a extração de água em seu ambiente para as raízes das plantas. Assim, a salinização dos solos que são utilizados para produção agrícola é um problema significante e crescente em regiões que dependem muito da agricultura, e é piorado pelo exagero na utilização, o exagero na fertilização e pela escassez de água, tipicamente causados por mudanças climáticas e pelas exigências da crescente população.

[0005] As temperaturas otimizadas afetam o crescimento e desenvolvimento da planta ao longo de todo o seu ciclo de vida. Assim, temperaturas altas reduzem as taxas de germinação e altas temperaturas resultam em necrose das folhas. Além disso, plantas maduras que são expostas a excesso de calor podem sofrer de choque térmico, que pode aparecer em diversos órgãos, incluindo folhas e, particularmente, frutas, quando a respiração é insuficiente para superar o estresse com o calor. O calor também danifica estruturas celulares, incluindo organelas e citoesqueletos, e prejudicas as funções da membrana. O choque térmico pode produzir uma diminuição na síntese geral de proteína, seguida pela expressão de proteínas de choque térmico, por exemplo: chaperonas, que são envolvidas em retomar as proteínas danificadas pelo calor. Os danos causados ao pólen pela temperatura alta quase sempre ocorrem junto com o estresse com a estiagem, e raramente ocorrem sob condições com bastante água. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da plantas de novas maneiras. Condições frias em excesso, ex.: temperaturas baixas, porém acima de zero, afetam colheitas de origens tropicais, como soja, arroz, milho e algodão. O dano causado pelo frio normalmente inclui murchidão, necrose, clorose ou vazamento de íons em membranas de células. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e qualidade inferior do produto por meio do amadurecimento atrasado do milho.

[0006] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz; particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição, como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta exiba mudanças em sua arquitetura e metabolismo melhorado também sob outras condições.

[0007] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permite o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.

[0008] Os nutrientes (macro e micronutrientes) otimizados afetam o crescimento e o desenvolvimento planta durante todo o seu ciclo de vida. Uma abordagem comum para promover o crescimento de uma planta foi, e continua a ser, o uso de nutrientes (fertilizantes) naturais, bem como sintéticos. Dessa forma, os fertilizantes são o combustível atrás da “revolução verde”, diretamente responsáveis pelo crescimento excepcional no rendimento das culturas durante os últimos 40 anos, e são considerados o número um das despesas gerais na agricultura. Dos três macronutrientes fornecidos como os principais fertilizantes [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio é, frequentemente, o elemento limitante da taxa no crescimento das plantas e todas as culturas arvenses apresentam uma dependência fundamental do fertilizante nitrogenado inorgânico. O nitrogênio é responsável pela biossíntese de aminoácidos e ácidos nucléicos, grupos protéticos, hormônios vegetais, defesa química das plantas e similares; é deslocado para o broto, onde é armazenado nas folhas e haste durante a rápida fase de desenvolvimento da planta e até a floração. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o grosso de seu nitrogênio orgânico durante o período de germinação do grão e até a floração. Uma vez que a fertilização da planta tenha ocorrido, os grãos começam a ser formados e se tornam o principal depósito de nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser então redistribuído a partir das folhas e do caule que servem como compartimentos de armazenagem até a formação do grão. Fósforo (P) e Potássio (K) possuem uma correlação direta com o rendimento e tolerância geral da planta.

[0009] Uma vez que o fertilizante esgota-se rapidamente na maioria dos tipos de solo, ele deve ser fornecido às safras em fase de crescimento duas ou três vezes durante a estação de cultivo, especialmente para cereais, os quais compreendem mais da metade das áreas cultivadas no mundo. Por exemplo, os fertilizantes nitrogenados inorgânicos como o nitrato de amônio, o nitrato de potássio ou a uréia, tipicamente respondem por 40% dos custos associados com as culturas como as do milho e trigo. Além disso, a baixa eficiência do uso do nitrogênio (NUE) das principais culturas (por exemplo, na variação de apenas 30-70%) afeta negativamente as despesas com insumos do agricultor, devido ao excesso de fertilizante aplicado. Além disso, o uso excessivo e ineficiente de fertilizantes são os maiores fatores responsáveis por problemas ambientais como a eutrofização de águas subterrâneas, lagos, rios e mares, a poluição da água potável por nitrato, que pode causar metemoglobinemia, a poluição por fosfato, a poluição atmosférica, e assim por diante. No entanto, apesar do impacto negativo dos fertilizantes sobre o meio ambiente, e os limites do uso dos fertilizantes, que foram legislados em diversos países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente a fim de sustentar a produção de alimentos e de fibras devido ao rápido crescimento populacional em recursos terrestres limitados. Por exemplo, estimou-se que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizante nitrogenado serão utilizados anualmente no mundo inteiro.

[0010] O aumento da eficiência do uso do nitrogênio pelas plantas deve permitir que as safras sejam cultivadas com menor aplicação de fertilizantes ou, alternativamente, cultivadas em solos de qualidade mais pobre e teriam, portanto, um impacto econômico significativo tanto em sistemas agrícolas desenvolvidos quanto em desenvolvimento.

[0011] A produção é afetada por diversos fatores, como, o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (o número de ramos, por exemplo), comprimento dos grãos, número de grãos preenchidos, vigor (ex.: mudas), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização de água, nutrientes (ex.: nitrogênio) e fertilizantes, e tolerância ao estresse.

[0012] Colheitas como de milho, arroz, trigo, canola e soja são responsáveis por mais da metade da ingestão calórica dos humanos, seja por consumo direto das sementes ou por consumo de produtos contendo carne, criados por sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açúcar, óleos e metabolitos utilizados no processo industrial. A habilidade de aumentar a produção da planta, seja aumentando a taxa acumulação de matérias secas, modificação da composição da celulose ou da lignina, aumento da força do caule, modificação do padrão de ramo da planta, e ramo da planta, enrijecimento de diques, aumento na eficiência da fertilização, taxa melhorada de acumulação de matérias secas na semente, modificação do desenvolvimento da semente, preenchimento melhorado da semente ou por aumento de conteúdo de óleo, amido ou proteína nas sementes teria diversas aplicações em usos agrícolas e não-agrícolas como na produção biotecnológica de fármacos, anticorpos ou vacinas.

[0013] Estudos mostraram que adaptações da planta a condições ambientais adversas são complexos traços genéticos com natureza poligênica. Meios convencionais para melhora de colheita e horticultura utilizam técnicas seletivas de criação para identificar plantas que possuam características desejáveis. Entretanto, criação seletiva é tediosa, consume tempo e possui uma conclusão imprevisível. Além do mais, recursos limitados de plasma germinal para melhora na produção e incompatibilidade em cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionados representam problemas significantes encontrados na criação convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que os seres humanos modificassem os plasmas germinais das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Tal tecnologia possui a capacidade de gerar colheitas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.

[0014] A melhora genética da eficiência da utilização de fertilizantes (FUE) na plantas pode ser gerada por meio do melhoramento tradicional ou por meio da engenharia genética. Tentativas para gerar plantas com aumento da FUE foram descritas no Pedido de Patente Norte-americana N.° 20020046419 para Choo, et al.; Pedido de Patente Norte-americana N.° 2005010879 para Edgerton et al.; Pedido de Patente Norte-americana No 20060179511 para Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[0015] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:78338) descrevem plantas transgênicas com um gene adicional, Dofl, que exibem crescimento melhorado sob condições de baixo teor de nitrogênio.

[0016] A Patente Norte-americana N.° 6.084.153 para Good et al. revela o uso de promotor responsivo ao estresse para controlar a expressão de Alanina Aminotransferase (AlaAT) e plantas transgênicas de canola que melhoraram a tolerância à seca e à deficiência de nitrogênio em comparação com as plantas de controle.

[0017] A publicação WO No 2009/013750 revela genes, construções e métodos para aumentar a tolerância de estresse abiótico, biomassa e/ou produção em plantas geradas assim

[0018] A publicação WO No 2008/122980 revela genes, construções e métodos para aumentar o conteúdo de óleo, taxa de crescimento e biomassa das plantas.

[0019] A publicação WO No 2008/075364 revela polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de utilizar o mesmo

[0020] A publicação WO No 2007/049275 revela polipeptídios isolados, polinucleotídeos codificando o mesmo, plantas transgênicas expressando o mesmo e métodos para utilizar o mesmo para aumentar a tolerância de estresse abiótico e biomassa.

[0021] A publicação WO No 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância de estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas geradas assim

[0022] A publicação WO No 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídios envolvidos no desenvolvimento de fibra e métodos para utilizar a mesma para melhorar a qualidade da fibra, produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibra.

[0023] A publicação WO No 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância de estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas geradas assim

[0024] A publicação WO N.° 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência do uso da água, a eficiência da utilização de fertilizantes, a tolerância ao estresse biótico/abiótico, o rendimento e a biomassa em plantas e em plantas geradas por meio deles.

[0025] A publicação WO N.° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência da utilização do nitrogênio, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento e a biomassa em plantas e em plantas geradas por meio deles.

[0026] A publicação WO N.° 2009/141824 revela polinucleotídeos isolados e métodos utilizando os mesmos a fim de aumentar a utilidade da planta.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0027] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência codificando um polipeptídio pelo menos 80% idêntico a N.° Ident. da Sequência: 481, -792, 2947-4662 ou 4663, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização de nitrogênio da planta.

[0028] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, apresenta-se um método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta ao estresse abiótico, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste das Ident. da Sequência N.°s : 481-792 e 2947-4663, aumentando, dessa forma, a eficiência da utilização do nitrogênio, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio da planta.

[0029] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica as Ident. da Sequência N.°s: 1-480, 793-2945 ou 2946, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização uso de nitrogênio da planta.

[0030] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo das Ident. da Sequência N.°s: 1-480 e 793-2946, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização de nitrogênio da planta.

[0031] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos apresentada nas Ident. da Sequência N.°s: 481-792, 2947-4662 ou 4663, caracterizada em que a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência do uso no nitrogênio de uma planta.

[0032] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídio que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s:481-792, e 2947-4663.

[0033] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, apresenta-se um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de acido nucleico pelo menos 80% idêntica às Ident. da Sequência N°s: 1-480, 793-2945 ou 2946, onde a sequência de aminoácido seja capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou eficiência da utilização do nitrogênio da planta.

[0034] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é provido um polipeptídio isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo das Ident. da Sequência N°s: 1-480, e 793-2946.

[0035] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[0036] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% homóloga as Ident. da Sequência N°s: 481-792, 2947-4662 ou 4663, onde a sequência de aminoácido seja capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a tolerância de uma planta ao estresse abiótico, e/ou eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta.

[0037] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é provido um polipeptídio isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s: 481-792, e 2947-4663.

[0038] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa exogenamente o polinucleotídeo da invenção, ou a construção de ácido nucleico da invenção.

[0039] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa exogenamente o polipeptídeo da invenção.

[0040] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgênica compreendendo a construção do ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.

[0041] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s: 481-792, e 2947-4663.

[0042] De acordo com algumas aplicações da invenção a sequência de ácido nucléico é selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s: 1-480, e 793-2946.

[0043] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo consiste na sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s: 1-480, e 793-2946.

[0044] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N°s: 481-792, e 2947-4663.

[0045] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula de planta faz parte de uma planta.

[0046] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.

[0047] De acordo com algumas aplicações da invenção, o estresse abiótico é selecionado dentre um grupo que consiste em salinidade, seca, privação de água, inundação, estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e Irradiação UV.

[0048] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rendimento compreende rendimento de sementes ou rendimento de óleo.

[0049] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob condições limitadoras de nitrogênio.

[0050] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.

[0051] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e/ou científicos usados no presente têm o mesmo significado daquele comumente entendido pelo perito na especialidade na qual esta invenção pertence. Embora na prática ou verificação das realizações da invenção possam ser usados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente, métodos e/ou materiais exemplares são descritos a seguir. Em caso de conflitos, a especificação da patente, inclusive as definições, serão o controle. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não servem necessariamente para serem limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0052] Algumas realizações da invenção estão descritas no presente, apenas como exemplo, com referência aos desenhos que o acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhe, vale notar que as particularidades mostradas servem como exemplo e para fins de discussão ilustrativa de realizações da invenção. A esse respeito, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente aos peritos na especialidade como as realizações da invenção podem ser praticadas.Nos desenhos:

[0053] A figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídio binário pGI contendo o novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência: 4668) e o GUSintron (pQYN_6669) utilizado para expressar as seqüências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do -DNA; MCS - Local múltiplo de clonagem; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor síntase nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador síntase nopalina; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); Gusintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e íntron). As sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no vetor durante a substituição do gene repórter GUSintron;

[0054] A figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídio binário pGI contendo o novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência: 4668) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as seqüências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do - DNA; MCS - Local múltiplo de clonagem; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor síntase nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador síntase nopalina; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); Gusintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e íntron). As sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no MCS do vetor;

[0055] As figuras 3A-F são imagens ilustrando a visualização do desenvolvimento raiz de plantas transgênicas expressando exogenamente o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção quando cultivados em placas de agar transparentes sob condições normais (FIGs. 3A-B), de estresse osmótico (15% PEG, FIGs. 3C-D) ou de limite de nitrogênio (FIGs. 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de agar transparentes por 17 dias (7 dias no viveiro e 10 dias após o transplante). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias a partir do dia 1 após o transplantio. Figura 3A - Imagem de uma fotografia de plantas tirada depois de 10 dias pós-transplantio em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Figura 3B - Imagem de análise de raízes das plantas mostradas na Figura 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3C - Imagem de uma fotografia de plantas tirade depois de 10 dias pós-transplantio em placas de ágar, cultivadas sob condições osmóticas elevadas (PEG 15 %). Figura 3D - Imagem de análise de raiz das plantas mostradas na Figura 3C na qual o comprimento das raízes medidas é representado por setas. Figura 3E - Imagem de uma fotografia de plantas tirade depois de 10 dias pós-transplantio em placas de ágar, cultivadas sob condições de pouco nitrogênio. Figura 3F - Imagem de análise de raiz das plantas mostradas na Figura 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas;

[0056] A figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raíz (pQNa_RP) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promoter de síntese de nopalina; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de síntese de nopalina; sinal Poly-A (sinal de poliadenilação); As sequências de polinucleotídeos isolados de acordo com algumas aplicações da invenção foram clonadas para o MCS [Multiple Cloning Site - Local de Clonagem Múltipla] do vetor.

[0057] A figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN;

[0058] A figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN;

[0059] A figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN; e

[0060] A figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQXNc,que é um plasmídeo binário pGI modificado utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados de algumas das aplicações da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor de síntese de nopalina; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de síntese de nopalina; RE = qualquer enzima de restrição; sinal Poly-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (Ident. da Sequência N.°:4666). As sequências de polinucleotídeos isolados de algumas aplicações da invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.

DESCRIÇÃO DE REALIZAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0061] A presente invenção, em algumas de suas aplicações, refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, construções de ácidos nucleicos, células transgênicas e plantas transgênicas compreendendo as mesmas e métodos de geração e utilização das mesmas, e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a métodos de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta.

[0062] Antes de explicar ao menos uma realização da invenção em detalhes, vale compreender que a invenção não se limita necessariamente em sua aplicação aos detalhes apresentados na descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras realizações ou de ser praticada ou executada de várias maneiras.

[0063] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídios e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o teor de óleo, o vigor e/ou a tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0064] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que aumentam o rendimento (por exemplo, o rendimento de semente, o rendimento de óleo e o teor de óleo), a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou fertilizante (por exemplo: nitrogênio) a eficiência na utilização de nitrogênio de uma planta. Genes que afetam a característica de interesse foram identificados [Exemplo 1, Tabela 1, N.°s Ident. da Sequência: 1-288 (polinucleotídeos) e 481-727 (polipeptídeos)] com base nos perfis de expressão em tecidos e condições específicos de diversos acessos de Cevada (Exemplo 3, Tabelas 3-8), acessos/ecotipos de Arabidopsis (Exemplos 4-5, Tabelas 9-16), variedades de Sorgo (Exemplo 6, Tabelas 17-25) e híbridos de Milho (Exemplo 7, Tabelas 26-31). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos tendo a mesma função também foram identificados (Exemplo 2, Tabela 2, N.°s Ident. da Sequência 793-2946 (polinucleotídeos) e 2947-4663 (polipeptídios)]. Células de Agrobacterium tumefaciens foram transformadas com vetores binários contendo os genes identificados (Exemplo 9) e plantas transgênicas expressando os mesmos foram geradas (Exemplo 10). Descobriu-se que plantas transgênicas sobre-expressando os polinucleotídeos identificados exibiam aumento de biomassa, produção, produção de óleo, material seca, índice de colheita, taxa de crescimento, “área de roseta”, produção de sementes e peso de 1000 sementes (Tabelas 33-48; Exemplos 11 e 12). Num todo, esses resultados sugerem a utilização dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção para aumentar a o rendimento (inclusive o rendimento de óleo, o rendimento de sementes e o teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência na utilização de fertilizante (por exemplo: nitrogênio) de uma planta.

[0065] Portanto, de acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão na planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou mais, por exemplo 100 % homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das Ident. da Sequência N.°s 481-792 e 2947-4663, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização de nitrogênio da planta.

[0066] Conforme aqui utilizada, a frase “rendimento da planta” refere-se à quantidade (conforme determinada por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por estação de cultivo. Portanto, o maior rendimento poderia afetar o benefício econômico que se pode obter a partir da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.

[0067] Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser afetado por vários parâmetros incluindo, entre outros, a biomassa da planta; o vigor da planta; a taxa de crescimento; o rendimento de semente; a quantidade de sementes ou grãos; a qualidade de sementes ou grãos; o rendimento de óleo; o teor de óleo, amido e/ou proteína nos órgãos colhidos (por exemplo, sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (botões) por panícula (expressa como a proporção entre o número de sementes preenchidas e o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de cultivo (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e divisão de carbono (a distribuição/alocação de carbono em uma planta); resistência à sombra; número de órgãos colhíveis (por exemplo, sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [por exemplo, aumento do diâmetro, espessura ou melhora das propriedades físicas do talo (por exemplo, elasticidade)].

[0068] Conforme aqui utilizada, a frase “rendimento de semente” refere- se ao número ou peso das sementes por planta, sementes por vagem, ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, o rendimento de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (por exemplo, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), número de sementes (preenchidas) e taxa de preenchimento de semente e por teor de óleo da semente. Portanto, o aumento do rendimento de semente por planta poderia afetar o beneficio econômico que se pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento do rendimento de semente por área de cultivo pode ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas cultivadas na mesma determinada área.

[0069] O termo “semente” (também denominada “grão” ou “cerne”), conforme aqui utilizado, refere-se a uma pequena planta embrionária protegida por uma cobertura denominada revestimento de semente (geralmente com algum alimento estocado), o produto do óvulo maduro de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta-mãe.

[0070] A frase “teor de óleo”, conforme aqui utilizada, refere-se à quantidade de lipídios em um determinado órgão de planta, tanto as sementes (teor de óleo da semente) ou a parte vegetativa da planta (teor de óleo vegetativo) e é tipicamente expressa como percentual de peso seco (10% umidade de sementes) ou peso úmido (para a parte vegetativa).

[0071] Deve ser observado que o teor de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca de um tecido (por exemplo, semente, parte vegetativa), bem como a massa ou o tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de crescimento.

[0072] Em uma configuração, o aumento do teor de óleo da planta pode ser realizado aumentando-se o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta que compreende óleo por período de crescimento. Assim, o maior teor de óleo de uma planta pode ser obtido aumentado o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.

[0073] Conforme aqui utilizada, a frase “biomassa da planta” refere-se à quantidade (ex.: medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em uma estação de cultivo, que poderia também determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes desta, por exemplo, partes acima do solo (colhíveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[0074] Conforme aqui utilizada, a frase “taxa de crescimento” refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta no decorrer do tempo (pode ser medida em cm2 ao dia).

[0075] Conforme aqui utilizada, a frase “vigor da planta” refere-se à quantidade (medida por peso) de tecido produzido pela planta em um determinado tempo. Portanto, o aumento do vigor poderia determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por época de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor precoce (semente e/ou muda) resulta na melhora da estrutura do campo.

[0076] A melhora do vigor precoce é um objetivo importante de programas modernos de criação de arroz tanto em cultivares temperados ou tropicais. Raízes longas são importantes para a ancoragem apropriada do solo em arroz de semente com água. Quando o arroz for plantado em campos alagados, e quando as plantas tiverem que emergir rapidamente por meio da água, brotos mais longos são associados com vigor. Quando for utilizada uma semeadeira, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para boa emergência de mudas. A capacidade de realizar a engenharia de forma precoce em plantas seria muito importante na agricultura. Por exemplo, baixo vigor precoce tem sido uma limitação à introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) com base no plasma germinativo Corn Belt [Cinturão do Milho] no Atlântico Europeu.

[0077] Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser determinado sob estresse (por exemplo, estresse abiótico, condições de limitação de nitrogênio) ou condições sem estresse (normais).

[0078] Conforme aqui utilizada, a frase “condições sem estresse” refere- se às condições de crescimento (por exemplo, água, temperatura, ciclos de luz-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente, por exemplo, nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não vão significantemente além das condições climáticas do dia-a-dia e outras condições abiótica que as plantas podem encontrar, e que permitem o crescimento ideal, o metabolismo, a reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida (por exemplo, em uma planta de cultivo desde a semente até a planta matura e de volta à semente). Pessoas com técnica na arte estão cientes de condições normais de solo e condições climáticas para uma dada planta em uma dada locação geográfica. Deve ser observado que embora as condições sem estresse possam incluir algumas pequenas variações em relação às condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), essas variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.

[0079] A frase “estresse abiótico”, conforme aqui utilizada, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Assim, o estresse abiótico pode ser induzido por condições crescimento ambiental sub-ideais, por exemplo, salinidade, privação de água, cheias, geadas, baixa ou alta temperatura, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou radiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.

[0080] A frase “tolerância ao estresse abiótico”, conforme aqui utilizada, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[0081] As plantas são sujeitas a uma variedade de desafios ambientais. Muitas destas, incluindo estresse de sal, estresse osmótico geral, estresse de estiagem e estresse de congelamento, possuem a capacidade de impactar toda a disponibilidade de água celular e da planta. Não é surpresa, portanto, que as respostas da planta a essa coleção de estresses são relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273 et al. observa que “a maioria dos estudos sobre a sinalização de estresse de água tiveram como foco primário o estresse de sal, pois as respostas da planta ao sal e à estiagem são relacionadas de forma próxima e os mecanismos se sobrepõem”. Muitos exemplos de respostas e vias similares a essa configuração de estresses foram documentados. Por exemplo, os fatores de transcrição CBF foram analisados como sendo resistentes às condições de sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta tanto ao estresse de sal como ao estresse de desidratação, um processo que é mediado amplamente por meio de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada dos fatores de transcrição que são vinculados a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Na Mesembryanthemum crystallinum (folha-de-gelo), Patharker e Cushman demonstraram que uma quinase de proteína dependente de cálcio (McCDPK1) é induzida por exposição a estresses de sal e estiagem (Patharker and Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A quinase induzida por estresse também foi mostrada para fosforilar um fator de transcrição, presumidamente alterando a sua atividade, embora os níveis de transcrição do fator alvo de transcrição não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. De modo similar, Saijo et. al demonstrou que uma quinase de proteína dependente de calmodulina induzido por estiagem/sal de arroz (OsCDPK7) conferiu maior tolerância a sal e estiagem ao arroz quando super-expressada (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 319-327).A exposição à desidratação invoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, bem como o estresse de congelamento (vide, por exemplo, Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz a tolerância ao congelamento (vide, por exemplo, Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Planta 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimação fria, as estratégias que permitem que as plantas sobrevivam sob baixas condições de água incluem, por exemplo, área reduzida de superfície, ou produção de óleo ou cera na superfície. Em outro exemplo, o maior conteúdo de soluto da planta previne a evaporação e perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osmótico e os similares, fornecendo, portanto, melhor tolerância à planta para os estresses acima.Estima-se que algumas vias envolvidas na resistência a um estresse (conforme descrito acima) também estarão envolvidas na resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou por homólogos. De fato, as vias gerais de resistência são relacionadas, não idênticas e, portanto, todos os genes controlando a resistência a um estresse controlarão e resistência a outros estresses. Todavia, caso um gene seja resistente às condições de um desses estresses, seria aparente a uma pessoa com conhecimento na técnica testar quanto à resistência a esses estresses relacionados. Métodos de avaliação de resistência ao estresse são fornecidos na seção de Exemplos que segue.

[0082] Conforme aqui utilizada, a frase “eficiência no uso água (WUE)” refere-se ao nível de matéria orgânica produzida pro unidade de água consumida pela planta, ou seja, o peso seco de uma planta em relação ao uso de água da planta, ou seja, a biomassa produzida por unidade de transpiração.

[0083] Conforme aqui utilizada, a frase “eficiência no uso de fertilizante” refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento do rendimento da planta, da biomassa, do vigor e da taxa crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, dispersão, absorção, acúmulo, relocação (na planta) e uso um ou mais das metades orgânicas ou minerais absorvidas pela planta, como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[0084] Conforme aqui utilizada, a frase “condições de limitação de fertilizante” refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (por exemplo, concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal, crescimento, reprodução e/ou viabilidade da planta.

[0085] Conforme aqui utilizada, a frase “eficiência no uso de nitrogênio (NUE)” refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento do rendimento da planta, da biomassa, do vigor e da taxa crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, dispersão, absorção, acúmulo, relocação (na planta) e uso de nitrogênio absorvido pela planta.

[0086] Conforme aqui utilizada, a frase “condições de limitação de nitrogênio” refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (por exemplo, concentração) de nitrogênio (por exemplo, amônio ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal, crescimento, reprodução e/ou viabilidade da planta.

[0087] O NUE e o FUE melhorados da planta são traduzidos no campo seja por colheita de quantidades similares de rendimento, enquanto implementa-se menos fertilizantes, ou rendimentos melhorados adquiridos pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Dessa forma, o NUE e o FUE melhorados possuem um efeito direto no rendimento da planta no campo. Dessa forma, os polinucleotídeos e os polipeptídios de algumas funções da invenção afetam positivamente o rendimento da planta e da semente e a biomassa da planta. Além disso, o benefício do NUE da melhora da planta certamente melhorará a qualidade da colheita e constituintes bioquímicos da semente, tais como o rendimento de proteína e o rendimento de óleo.

[0088] Deve ser observado que o ABST melhorado proporcionará às plantas um vigor melhorado também sob condições de não-estresse, resultando em colheitas com melhores biomassas e/ou rendimento, por exemplo, fibras alongadas para a indústria de algodão, maior teor de óleo.

[0089] O termo “fibra” é utilizado inclusive para as células condutoras com paredes grossas, tais como vasos e traqueídes e para conjuntos fibrilares de diversas células individuais de fibra. Assim, o termo “fibra” refere-se a (a) células de paredes grossas condutoras e não-condutoras do xílem; (b) fibras de origem interno ao xílem, incluindo aquelas do floema, do súber, do tecido da planta e da epiderme; e (c) fibras de hastes, folhas, raízes, sementes e flores de inflorescência (tais como aquelas de Sorgo vulgare utilizadas na fabricação de vassouras e escovas.

[0090] Exemplos de plantas produtoras de fibras incluem, mas não se limitam a, colheitas de agricultura como algodão, árvores de Bombax (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosote, winterfat, balsa, kenaf, roseta, juta, sisal abacá, linhaça, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, mafumeira, cairo, bambu, Tillandsia usneoides e agave spp. (ex.: sisal).

[0091] Conforme utilizada aqui, a frase “qualidade da fibra” refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que seja desejado agriculturalmente, ou necessário na indústria de fibra (descrito mais abaixo). Exemplos de tais parâmetros incluem, mas não se limitam a, comprimento da fibra, força da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento de unidade, razão e maturidade da fibra (descritos mais abaixo).

[0092] A qualidade da fibra de algodão (filaça) é normalmente medida de acordo com o comprimento, força e qualidade da fibra. Dessa forma, a qualidade da fibra é considerada maior quando a fibra é mais longa, mais forte e com mais qualidade.

[0093] Conforme aqui utilizada, a frase “rendimento da fibra” refere-se ao volume ou quantidade de fibras produzidas a partir da planta produtora de fibras.

[0094] Conforme aqui utilizado, o termo “aumento” refere-se ao aumento de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, no rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta em comparação a uma planta nativa [ou seja, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, por exemplo, uma planta não transformada da mesma espécie (por exemplo, idêntica) que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento).

[0095] A frase “expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno”, conforme utilizada aqui, refere-se a regular o nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta introduzindo o polinucleotídeo exógeno dentro de uma célula de planta ou planta e expressando por meio recombinantes, conforme descrito mais abaixo.

[0096] Conforme utilizada aqui, a expressão “expressando” refere-se a expressão no mRNA e, opcionalmente, ao nível do polipeptídio.

[0097] Conforme aqui utilizada, a frase “polinucleotídeo exógeno” refere-se a uma sequência heteróloga de ácido nucleico que pode não ser naturalmente expresso na planta ou cuja superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de forma estável ou temporária, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídio. Deve ser observado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que seja idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência endógena de ácido nucleico da planta.

[0098] O termo “endógeno”, conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídio que está e/ou expressado naturalmente dentro de uma planta ou célula da mesma.

[0099] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídio que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s 481-792, e 2947-4663.

[00100] A homologia (por exemplo, homologia percentual, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação Biotecnológica] (NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão, ao iniciar a partir de uma sequência polipeptídica; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via o NCBI), por exemplo utilizando parâmetros padrão, que compara os produtos de translação conceptual de seis quadros de uma sequência de fila de nucleotídeo (ambas as fitas) contra uma base de dados de sequência protéica.

[00101] De acordo com algumas aplicações da invenção, o termo “homologia” ou “homólogo” refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos; ou à identificação de duas ou mais sequências de aminoácidos.

[00102] As sequências homólogas incluem tanto sequências ortólogas como parálogas. O termo “parálogas” refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie que leva a genes parálogos. O termo “ortólogos” refere-se a genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral.

[00103] Uma opção de identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledôneas é fazendo uma pesquisa blast recíproca. Isto pode ser realizado por um primeiro blast envolvendo o blasting da sequência de interesse contra qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados NCBI disponível ao público que pode ser encontrada em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse sofreria um blasting contra, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza sativa Nipponbare disponível na NCBI. Os resultados do blast podem ser filtrados. As sequências de comprimento total de qualquer um dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então submetidas a um blasting reverso (segundo blast) contra as sequências do organismo do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados do primeiro e segundo blasts são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultante na maior pontuação (melhor opção) no primeiro blast identificar no segundo blast a sequência de fila (a sequência original de interesse) como a melhor opção. Utilizando a mesma justificativa, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/Tools/clustalw2/index (dot) html], seguido de uma árvore de junção de vizinhos (Hypertext Transfer Protocol://en (dot) wikipedia (dot) org/wiki/Neighbor-joining) que a ajuda a visualizar o clustering.

[00104] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácido que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s : 481-792, and 2947-4663.

[00105] De acordo com o aspecto de algumas aplicações da invenção, o método de aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, é afetado pela expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 481-792 e 2947-4663, aumentando, assim, o rendimento, biomassa taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00106] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos apresentada nas Ident. da Sequência N.°s: 481-792, 29474662 ou 4663.

[00107] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, o método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta ao estresse abiótico, é efetuada pela expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionado do grupo que consiste das Ident. da Sequência N.°s: 481-792 e 2947-4663, aumentando, dessa forma, a eficiência da utilização do nitrogênio, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio da planta.

[00108] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídio selecionado do grupo consistindo das Ident. da Sequência N.°s: 481-792 e 2947-4663, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização de nitrogênio da planta.

[00109] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídio que consiste na sequência de aminoácido definida pela Ident. da Sequência N.°: 481-792, 2947-4662 ou 4663.

[00110] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 1-480, e 793-2946.

[00111] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão na planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, por exemplo 100 % idêntica à sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste dasIdent. da Sequência N.°s :1-480, e 793-2946, aumentando assim a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.

[00112] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácidos ou ácido nucleico da invenção e não sobre suas porções.

[00113] De acordo com algumas aplicações da invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácidos ou ácido nucleico da invenção e não sobre suas porções.

[00114] A identidade (ou seja, a homologia percentual) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação Biotecnológica] (NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão.

[00115] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 1-480, e 793-2946.

[00116] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é apresentado nas Ident. da Sequência N.°s:1-480, 793-2945 ou 2946.

[00117] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é definido pela sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 1-480, e 793-2946.

[00118] Conforme aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma sequência de fita única ou dupla-fita de ácido nucleico que seja isolada e provida na forma de uma sequência de RNA, uma sequência complementar de polinucleotídeo (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou sequências compostas de polinucleotídeo (por exemplo, uma combinação destes acima).

[00119] O termo “isolado(a)” refere-se pelo menos a parcialmente separado(a) do ambiente natural, por exemplo, de uma célula de planta.

[00120] Conforme aqui utilizada, a frase “sequência complementar de polinucleotídeo” refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente do RNA. Essa sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando uma DNA polimerase dependente do DNA.

[00121] Conforme aqui utilizada, a frase “sequência genômica de polinucleotídeo” refere-se a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, assim, representa uma parte contígua de um cromossomo.

[00122] Conforme aqui utilizada, a frase “sequência composta de polinucleotídeo” refere-se a uma sequência, que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídio da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas que se interpõem entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, inclusive de outros genes, e tipicamente incluirão sequências de sinal de splicing conservadas. Essas sequências intrônicas podem ainda incluir elementos reguladores de expressão de ação cis.

[00123] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídios da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos de tais modificações de sequência incluem, mas não se limitam a, um conteúdo G/C alterado para abordar mais proximamente aquele tipicamente encontrado em espécies de plantas de interesse, e a remoção de códons encontrados atipicamente em espécies de plantas comumente referidas como otimização de códon.

[00124] A frase “otimização de códon” refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento deste que se aproxima do uso do códon dentro de uma planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucleico otimizado refere- se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificada para utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro de uma planta. A sequência de nucleotídeo é tipicamente analisada ao nível do DNA e a região de codificação otimizada para expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Neste método, o desvio padrão do uso do códon, uma medida do desvio do uso do códon, pode ser calculado primeiramente encontrando-se o desvio proporcional quadrado do uso de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de planta altamente expressos, seguido de um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn)/Yn ] 2/N, onde Xn refere- se à frequência de uso do códon em genes de planta de alta expressão, em que Yn refere-se à frequência de uso do códon no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela do uso de códon a partir de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[00125] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico de acordo com o uso de códon preferido para um tipo de célula de planta em particular é feito com base no uso direto, sem a realização de quaisquer cálculos estatísticos adicionais, das Tabelas de otimização de códon, como aquelas providas on-line na base de dados de uso de códon do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences [Instituto Nacional de Ciências Agrobiológica]) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) ou (dot) jp/codon/). A base de dados de uso de códon contém tabelas de uso de códon para diversas espécies diferentes, onde cada tabela de uso de códon foi estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00126] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie em particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural que codifica uma proteína de interesse pode ser o códon otimizado para aquela espécie de planta em particular. Isso é afetado pela substituição de códons que podem ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com códons correspondentes, com relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos sítios em junções potencialmente úteis (terminações 5’ e 3’ para adicionar peptídeo de sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequência de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.

[00127] A sequência de nucleotídeo de codificação de ocorrência natural já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta em particular. Portanto, a otimização de códon da sequência nativa de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência nativa de nucleotídeo, não são estatisticamente favorecidos em relação a uma planta em particular, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códon da planta em particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência modificada de nucleotídeo pode ser totalmente ou parcialmente otimizada para uso de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência modificada de nucleotídeo seja produzida em um nível mais elevado que a proteína codificada pelo gene correspondente de ocorrência natural ou nativo. A construção de genes sintéticos por meio da alteração do uso de códon é descrito, por exemplo, no Pedido de Patente PCT 93/07278.

[00128] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não-codificador.

[00129] Conforme utilizada aqui, a frase ‘RNA não-codificador’ refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácido (um polipeptídeo). Exemplos de tais moléculas RNA não-codificadoras incluem, mas não se limitam a, um RNA anti-sentido, um pré-miRNA (precursor de um microRNA), ou um precursor um RNA Piwi-interativo (piRNA).

[00130] Exemplo não-limitadores de polinucleotídeo de RNA não- codificadores são fornecidos nas Ident. da Sequência N.°s: 201-213, 280-288 e 476-480.

[00131] Assim, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima; seus fragmentos, sequências hibridizáveis com estas, sequências homólogas a estas, sequências que codificam polipeptídeos similares com uso de códon diferente, sequências alteradas caracterizadas por mutações, tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.

[00132] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 1-480, e 793-2946.

[00133] De acordo com algumas aplicações da invenção, a seqüência de ácido nucleico é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de água e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[00134] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado compreende a sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo consistindo das Ident. da Sequência N.°s: 1-480, e 7932946.

[00135] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é apresentado pelas Ident. da Sequência N.°s: 1-480, 793-2945 ou 2946.

[00136] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 481-792, e 2947-4663.

[00137] De acordo com algumas aplicações da invenção, a seqüência de aminoácido é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de água e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[00138] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídio que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas Ident. da Sequência N.°s: 481-792, e 2947-4663.

[00139] A invenção apresenta um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das Ident. da Sequência N.°s: 481-792, e 2947-4663.

[00140] De acordo com algumas aplicações da invenção, a seqüência de aminoácido é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de água e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[00141] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das Ident. da Sequência N.°s:481-792, e 2947-4663.

[00142] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo é determinado pela Ident. da Sequência N.°: 481-792, 2947-4662 ou 4663.

[00143] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[00144] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídios e polipeptídios descritos acima tendo mutações, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.

[00145] O termo ‘“planta”, conforme aqui utilizado, abrange plantas totais, ancestrais e progênie de plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), bem como células, tecidos e órgãos de plantas. A planta pode estar em qualquer forma, inclusive culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo uma forrageira ou legume forrageiro, planta ornamental, cultivo de alimento, árvore, ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve-de-folha, linhaça, couve, lentilha, canola, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora espaguete, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, semente de canola, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e um cultivo de forragem. Alternativamente, algas e outras espécies não-Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção. De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta usada pelo método da invenção são plantas de cultivo tais como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, palmeira de óleo, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, canola, tabaco, cholpo e algodão.

[00146] De acordo com algumas aplicações da invenção, é provida uma célula vegetal que expressa exogenamente o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção, a combinação de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.

[00147] De acordo com algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é executada transformando uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e o cultivo da planta madura em condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00148] De acordo com algumas aplicações da invenção, a transformação é realizada pela introdução, na célula de planta, de uma construção de ácido nucleico que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações da invenção e pelo menos um promotor da transcrição direta do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula de planta). Maiores detalhes da abordagem de transformação adequada são fornecidos abaixo.

[00149] Conforme mencionado, a construção do ácido nucleico de acordo com algumas aplicações da invenção compreende uma sequência do promotor e o polinucleotídeo isolado da invenção.

[00150] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é operavelmente ligado à sequência do promotor.

[00151] Uma sequência de ácido nucléico codificadora é "operavelmente ligada" a uma sequência reguladora (ex.: promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulatório sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00152] Conforme aqui utilizado, o termo “promotor” refere-se a uma região de DNA que fica acima do sítio de início de transcrição de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (ou seja, em que parte de uma planta) e/ou quando (ou seja, em qual estágio ou condição no ciclo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00153] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.

[00154] Qualquer sequência promotora adequada pode ser utilizada pela construção de ácido nucleico da presente invenção. De forma preferencial, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um induzível de estresse abiótico.

[00155] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é uma planta promotora, a qual é adequada para expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta.

[00156] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [N.°s Ident. da Sequência: 4666 (pQFNC); N.° Ident. da Sequência 5158 (PJJ 35S de Brachypodium); N.° Ident. da Sequência 5159 (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985)], promotor de Arabidopsis At6669 (N.° Ident. da Sequência 4665; vide Publicação PCT N.° WO04081173A2 ou o novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668); Ubi 1 de milho (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); Ubi 1 promoter (N.° Ident. da Sequência: 5157); RBCS promoter (N.° Ident. da Sequência: 5156); Rice cyclophilin (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histona de milho H3 (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Synthetic Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Norte-americanas N.°s. 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.

[00157] Promotores adequados específicos do tecido incluem, entre outros, promotores específicos de folhas [conforme descrito, por exemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos de semente [por exemplo, Napina (originada da Brassica napus, que é caracterizada por uma atividade promotora específica da semente; Stuitje A. R. et.al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; N.° Ident. da Sequência: 4667), de genes específicos de sementes (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Brazil Nut albumin (Pearson’ et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), Trigo SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873876, 1992)], promotores específicos de endosperma [por exemplo, trigo LMW e HMW, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:4612), gliadinas a, b e g do trigo (EMBO3:1409-15, 1984), promotor de ltrl da cevada, hordeína B1, C, D da cevada (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), Cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 de arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucose PP do arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), família de gene ESR do milho (Plant J 12:23546, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embrião [por exemplo, OSH1 de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flor [p. ex., AtPRP4, síntase de chalene (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala- 3] e promotores de raiz tais como o promotor ROOTP [N.° Ident. da Sequência: 4669].

[00158] Promotores adequados que induzem o estresse abiótico incluem, entre outros, promotores induzíveis de sal, tais como RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis de estiagem, tais como o promotor do gene rab17 do milho (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis de calor, tais como promotor de hsp80 de tomate (Patente Norte-americana N.° 5,187,267).

[00159] A construção de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ainda incluir um marcador selecionável adequado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações da invenção, a construção de ácido nucleico utilizada é um vetor-ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a construção compreende um marcador selecionável adequado e uma origem de replicação) e pode ser compatível com a propagação em células. A construção de acordo com a presente invenção por ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagómido, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00160] A construção de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ser utilizada para transformar as células de planta de forma estável ou temporária. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e, dessa forma, representa uma característica estável e herdada. Na transformação temporária, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, porém não é integrado no genoma e, dessa forma. representa uma característica temporária.

[00161] Há diversos métodos de se introduzir genes estranhos tanto em plantas monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00162] Os métodos básicos para realizar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobactérias: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S, e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Captação direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por rápido choque elétrico de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células de planta ou tecidos por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; fibras de vidro ou transformação de whisker com carbeto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido de calos, Patente Norte-americana N.o. 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinativo, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

[00163] O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídio que contêm segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie de planta e do sistema de liberação da agrobactéria. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que ofereça uma boa fonte para o início de toda a diferenciação da planta. Vide, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de liberação de agrobactéria em combinação com infiltração à vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[00164] Há vários métodos de transferência direta de DNA em células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são rapidamente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, por exemplo, cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.

[00165] Após a transformação estável, é realizada a propagação da planta. O método mais comum de propagação de planta é por semente. A regeneração por propagação de semente, no entanto, tem uma deficiência. Devido à heterozigosidade, há uma ausência de uniformidade no cultivo, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com suas próprias características específicas. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada tenha as características idênticas e as características da planta transgênica precursora. Assim, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que gera uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[00166] A micropropagação é um processo de crescimento de plantas de nova geração a partir de um único pedaço de tecido que foi retirado de uma planta precursora selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas tendo o tecido preferido que expressa a proteína de fusão. As plantas de nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas e possuem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[00167] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que exige a alteração do meio de cultura ou das condições de crescimento entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura inicial do tecido; estágio dois, multiplicação da cultura do tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quatro, cultura e endurecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é definida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em pequenas plantas individuais. No estágio quatro, as pequenas plantas individuais transformadas são transferidas para uma estufa para endurecimento onde a tolerância das plantas à luz aumenta gradualmente, de modo que possa ser cultivada no ambiente natural.

[00168] De acordo com algumas aplicações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação temporária de células de folha, células meristemáticas ou toda a planta.

[00169] A transformação temporária pode ser realizada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de planta modificados.

[00170] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrito na Patente Norte-americanas N.° 4.855.237 (vírus do mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Pedido de Patente Japonesa Publicado N.° 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritos na WO 87/06261.

[00171] De acordo com algumas aplicações da invenção, o vírus utilizado para as transformações temporárias é não virulento e, assim, incapaz de causar graves sintomas, tais como menor taxa de crescimento, mosaico, manchas em anel, enrolamento da folha, amarelamento, aparecimento de listras, formação de erupções, formação de tumor e formação de furos. Um vírus não virulento adequado pode ser um vírus não virulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser realizada utilizando-se métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese orientada conforme descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00172] Cepas adequadas de vírus podem ser obtidas de fontes disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection [Coleção de Cultura Tipo Americana] (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de planta infectada pode ser realizado por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Foster e Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998. Resumidamente, os tecidos de uma planta infectada que supostamente contenha uma alta concentração de vírus adequados, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flores, são triturados em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada pelo vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[00173] A construção dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e na Patente Norte-americana 5.316.931.

[00174] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídio bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode ser então extraído do plasmídio. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e translação desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídio. O plasmídio é então utilizado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídio e pela translação dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que fazem a encapsidação do RNA viral.

[00175] Em uma aplicação, é provido um polinucleotídeo viral de planta no qual a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídeo viral, e foi inserida uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa, capaz de realizar a expressão no hospedeiro da planta, o empacotamento do polinucleotídeo viral de planta recombinante, e de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídeo não nativo em seu interior, de modo que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral de planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos adicionais não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeo no hospedeiro da planta e incapaz de realizar a recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativos (estranhos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou aos promotores subgenômicos virais nativos e não nativos da planta caso mais que uma sequência de polinucleotídeo seja incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativo são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para gerar os produtos desejados.

[00176] Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é provido como na primeira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00177] Em uma terceira configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante no qual o gene da proteína de revestimento nativa está adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de realizar recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos de planta, de modo que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores subgenômicos para gerar o produto desejado.

[00178] Em uma quarta configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na terceira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.

[00179] Os vetores virais são encapsidados pela proteína de revestimentos codificada pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral de planta recombinante ou vírus de planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras adequadas. O polinucleotídeo viral de planta recombinante é capaz de realizar a replicação no hospedeiro, a difusão sistêmica no hospedeiro e a transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada. As técnicas de inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. “Principles and Techniques in Plant Virology”, Van Nostrand-Reinhold, New York.

[00180] Além do que foi acima exposto, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, permitindo assim a expressão do cloroplasto.

[00181] É conhecida uma técnica de introdução de sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma do cloroplastos. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células de planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma que são integráveis no genoma de cloroplastos via recombinação homóloga, que é prontamente feita pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um estiramento de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve, por meio de procedimentos de seleção sequencial, para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto após essa seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes referentes a esta técnica são encontrados nas Patentes Norte-americanas N.os. 4,945,050; e 5,693,507 que são aqui incorporadas por referência. Um polipeptídio pode, então, ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e se integrar à membrana interna do cloroplasto.

[00182] Uma vez que os processos que aumentam o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta podem envolver múltiplos genes que atuam aditivamente ou em sinergia (vide, por exemplo, Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também considera a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para, dessa forma, atingir um efeito superior sobre o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor e/ou a tolerância ao estresse abiótico.

[00183] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela cointrodução de múltiplas construções de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula de planta. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura, utilizando os métodos descritos acima.

[00184] Alternativamente, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela cointrodução, em uma única célula de planta de uma única construção de ácido nucleico, incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes. Essa construção pode ser projetada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico que inclui todas as diferentes sequências de polinucleotídeo exógeno. Para permitir a co-translação dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser interligadas por uma sequência de sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) que facilita a translação de sequências de polinucleotídeo posicionadas abaixo da sequência IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídios descritos acima será traduzida tanto da terminação 5’ fechada como das duas sequências IRES internas da molécula de RNA policistrônico para assim produzir, na célula, diferentes polipeptídeos. Alternativamente, a construção pode incluir várias sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.

[00185] A célula da planta transformada com o constructo incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes pode ser regenerada em uma planta madura, utilizando os métodos descritos acima.

[00186] De forma alternativa, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser feita pela introdução de diferentes constructos de ácido nucleico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em diversas plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso de água, eficiência do uso de fertilizantes, crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.

[00187] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.

[00188] Exemplos não limitadores de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estiagem, privação de água, excesso de água (ex. inundação, alagamento), estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00189] Assim, a invenção abrange plantas que expressam exogenamente o(s) polinucleotídeo(s), as construções de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptídeo(s) da invenção.

[00190] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou da planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bastante conhecidos na técnica tais como, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente o polipeptídeo, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), ensaios radioimunológicos (RIA), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.

[00191] Métodos para determinar, na planta, o nível do RNA transcrito a partir do polinucleotídeo exógeno são bastante conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização de RNA in situ.

[00192] A informações da sequência e as anotações reveladas pelos presentes ensinamentos podem ser utilizadas em favor da procriação clássica. Assim, dados de sub-sequência dos polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção auxiliada por marcador (MAS), na qual um marcador é utilizado para a seleção indireta de um determinante ou de determinantes genéticos de uma característica de interesse (por exemplo, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, rendimento e/ou qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizante). Os dados de ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou ser ligados a sítios polimórficos ou marcadores genéticos no genoma, tais como polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP), microsatélites e polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP), impressão digital de DNA (DFP), polimorfismo do comprimento do fragmento amplificado (AFLP), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídio codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA. Exemplos seleções auxiliadas por marcador incluem, entre outras, a seleção de uma característica morfológica (por exemplo, um gene que afeta a forma, a cor, a esterilidade do macho ou a resistência, como a presença ou ausência aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de uma característica bioquímica (por exemplo, um gene que codifica uma proteína que pode ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de armazenamento); seleção de uma característica biológica (por exemplo, raças patogênicas ou biótipos de insetos com base na interação do patógeno hospedeiro ou do parasita hospedeiro, podem ser utilizadas como um marcador, uma vez que a constituição genética de um organismo pode afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).

[00193] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla faixa de plantas econômicas, de forma segura e barata.

[00194] As linhas de planta que expressam exogenamente o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são selecionadas para identificar aquelas que demonstram o maior aumento da característica desejada da planta.

[00195] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo) na tolerância de estresse abiótico pode ser determinada utilizando-se métodos conhecidos, tais como os detalhados abaixo na seção de Exemplo que segue.

[00196] Tolerância ao estresse abiótico - As plantas transformadas (ou seja, que expressam o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, por exemplo, privação de água, temperatura subideal (baixa temperatura, alta temperatura), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, a condição de estresse por sal, estresse osmótico, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e radiação UV.

[00197] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que as plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal demonstrem melhor germinação, vigor ou crescimento da muda com alta concentração de sal. O estresse ao sal pode ser efetuado de muitas formas, como, por exemplo, irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (ex.: solução de Hoaglan) ou cultivando as plantas em um meio de cultivo hiperosmótico (ex.: 50% meio de Murashige-Skoog [meio MS]). Uma vez que diferentes plantas variam consideravelmente em termos de sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou da variedade de planta específica, de modo a impor um efeito ameno ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para obter diretrizes sobre a concentração apropriada, vide Bernstein and Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editors) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e suas referências).

[00198] Por exemplo, um teste de tolerância à salinidade pode ser realizado por meio da irrigação das plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão uniforme de sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até que efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais apareçam nas plantas do tipo selvagem. Assim, a aparência fenotípica externa, grau em que a planta murchou e o sucesso geral para atingir a maturidade e resultado são comparados entre as plantas de controle e transgênicas.

[00199] Os parâmetros quantitativos da tolerância medida incluem, entre outras, o peso médio úmido e seco, a taxa de crescimento, o tamanho da folha, a cobertura da folha (área geral da folha), o peso das sementes resultantes, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que apresentam maior biomassa que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00200] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo osmótico era específico de cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ser mais tolerantes à estiagem e/ou ao congelamento. Para os experimentos de germinação com sal e estresse osmótico, o meio é complementado, por exemplo, com NaCl 50 mM, 100mM, 200mM ou com NaCl 100mM, 200 mM e manitol 400 mM.

[00201] Ensaio de tolerância à seca/ensaio osmótico - A tolerância à seca é feita para identificar os genes gerando melhor sobrevida de plantas após falta de água aguda. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, pode ser realizado um estresse osmótico gerado pelo osmólito não iônico sorbitol no meio. As plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar de plantas por 4 dias, após no qual são transferidas para placas contendo 500mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento no crescimento, então, as plantas de controle e transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmido e seco), a produção e pelos índices de crescimento medidos no momento da floração.

[00202] Ao contrário, são feitas seleções da seca com base no solo com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. As sementes das plantas controle Arabidopsis ou de outras plantas transgênicas que superexpressam o polipeptídio da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido após cessada a irrigação, seguida pela colocação dos vasos em papel absorvente para aumentar o índice de secagem do solo. As plantas transgênicas e as controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas controle desenvolve grave definhamento. As plantas são novamente aguadas após a obtenção de uma fração significativa das plantas controle que apresenta grave definhamento. As plantas são classificadas comparando-se aos controles para cada um dos dois critérios: tolerância às condições de estiagem e recuperação (sobrevida) após a reidratação.

[00203] Tolerância ao estresse de frio - Para analisar o estresse ao frio, plantas maduras (com 25 dias) são transferidas para câmaras de 4 °C por 1 ou 2 semanas, com luz elementar. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos do período de frio, resultando em retardamento no crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas de controle e transgênicas, medindo o peso da planta (úmido e seco) e comparando os índices de crescimento medidos no momento da floração, o tamanho da planta, o rendimento, entre outros.

[00204] Tolerância ao estresse ao calor - A tolerância ao estresse ao calor é atingida expondo as plantas a temperaturas acima de 34 °C por um período determinado. A tolerância da planta é analisada após a transferência das plantas de volta à condição de 22°C para recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas ao estresse pelo frio ou calor.

[00205] Eficiência do uso de água - pode ser determinada como a biomassa gerada por unidade transpiração. Para analisar o WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido nas plantas transgênicas e de controle. O peso fresco (FW) é registrado imediatamente; então as folhas são encharcadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) é registrado. O peso seco total (DW) é registrado após a secagem das folhas a 60 °C para um peso constante. O teor relativo de água (TRA) é calculado de acordo com a seguinte fórmula I: Fórmula I RWC = [(FW - DW)/(TW - DW)] x 100

[00206] Eficiência do uso de fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, por exemplo, em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo de florescimento, rendimento, conteúdo de proteína do galho e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho total da planta madura, sua umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o conteúdo de clorofila das folhas (uma vez que o status de nitrogênio e o grau de verdor da folha estão correlacionados), conteúdo de aminoácido e proteína total das sementes ou outras partes das plantas, como folhas ou galhos, conteúdo de óleo, etc. De forma semelhante, em vez de fornecerem nitrogênio em quantidades limitadas, podem ser adicionados fosfato ou potássio em concentrações elevadas. Novamente, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos relacionados acima. Dessa forma, a eficiência do uso de nitrogênio (NUE), eficiência do uso de fosfato (PUE) e eficiência do uso de potássio (KUE) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de florescerem sob condições restritas de nutrientes. Eficiência do uso do nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (por exemplo, plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 610 mM (concentração de nitrogênio adequada). É permitido que as plantas cresçam por mais 25 ou até a produção de sementes. As plantas são então analisadas por seu tamanho total, tempo de florescência, produção, teor de proteína do broto e/ou grão/ produção de semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho total da planta, umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de nitrogênio da planta e o grau de verdor da folha são altamente co-relacionados), aminoácido e o teor total de proteína das sementes ou de outras partes da planta tais como as folhas ou brotos e o teor de óleo. Plantas transformadas não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou apresentam níveis maiores de parâmetros medidos do que de plantas silvestres, são identificadas como plantas de eficiência de uso do nitrogênio.

[00207] Estudo de eficiência do uso de nitrogênio utilizando plantas - O estudo é feito de acordo Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações (“Engenharia metabólica com o fator de transcrição Dof1 em plantas: Assimilação melhorada de nitrogênio e crescimento sob condições com pouco nitrogênio” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7838). Resumidamente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7 a 10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção, são transferidas para duas condições de limitação de nitrogênio: O meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Ágar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Construções para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em mídia seletiva e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento independente de transformação) são cuidadosamente transferidas para o local de limitação de nitrogênio. Para construções para as quais sementes T2 estão disponíveis, diferentes eventos de transformação são analisados. Normalmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o local com limitações de nitrogênio, com permissão para crescer mais 3-4 semanas e serem pesadas no final de tal período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas contendo somente o mesmo promotor, porém sem qualquer gene repórter utilizado como controle.

[00208] Determinação de nitrogênio - O procedimento para determinação de concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolvem o método de digestão de persulfato de potássio para converter N orgânico para NO3 (Purcell and King 1996 Argon. J. 10 88:111-113, a redução mediada de Cd modificada de NO3 para NO2 (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito por meio do ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores e absorção são medidos em 550nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et.al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00209] Teste de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes das plantas transgênicas que poderia completar o processo de germinação com o percentual de sementes de plantas controle que são tratadas da mesma forma. São consideradas condições normais, por exemplo, incubações a 22 °C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é meio MS 50% (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).

[00210] A germinação é verificada também sob condições desfavoráveis, por exemplo, frio (incubação em temperaturas inferiores a 10 °C em vez de 22 °C) ou utilizando soluções de inibição de semente que contenham altas concentrações de um osmólito, por exemplo, sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou aplicando- se concentrações crescentes de sal (de NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM).

[00211] O efeito da transgene no vigor, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou teor de óleo pode ser determinada utilizando métodos conhecidos.

[00212] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento, tais como a área foliar, o comprimento da fibra, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e similares por unidade de tempo.

[00213] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando-se análise digital de plantas em cultivo. Por exemplo, imagens de plantas cultivadas em estufa em base de canteiro podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença de área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00214] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por período (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha).

[00215] A área de crescimento relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área da taxa de crescimento relativo = Coeficiente de regressão da área ao longo do ciclo de tempo.

[00216] Assim, a taxa da área de crescimento relativo está em unidades de 1/dia e o taxa de crescimento por comprimento está em unidades de 1/dia.

[00217] Rendimento de semente - A avaliação do rendimento de semente por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (ou seja, numérica) de sementes secas produzidas e colhidas de 8 a 16 plantas e dividida pelo número de plantas.

[00218] Por exemplo, o total de sementes de 8 a 16 plantas pode ser coletado, pesado utilizando, por exemplo, uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O rendimento de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma forma enquanto se leva em consideração a área de cultivo designada a uma única planta. O aumento do rendimento de semente por área de cultivo poderia ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas capazes de crescer em uma determinada área.

[00219] Além disso, o rendimento de semente pode ser determinado pelo peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e fotografadas. Cada amostra é pesada e então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.

[00220] O peso de 1000 sementes pode ser calculado utilizando-se a fórmula II: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000 O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando-se a Fórmula IV Fórmula IV: Índice de Colheita = Rendimento médio de semente por planta/Peso médio seco

[00221] Concentração protéica do grão - O teor de proteína do grão (g proteína do grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g grão N m-2) multiplicada pela razão de conversão de N/proteína de k-5,13 (Musgoe 1990, supra). A concentração protéica do grão é estimada como a proporção entre teor de proteína do grão por massa unitária do grão (g proteína do grão kg-1 grão).

[00222] Comprimento da fibra - O comprimento da fibra pode ser medido por fibrografia. O sistema de fibrografia foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio da Metade Superior”. O comprimento médio da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. A fibrografia mede o comprimento em comprimentos amplos de um determinado ponto percentual (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) cottoninc (dot) com/ClassificationofCotton/?Pg=4# Length).

[00223] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rendimento aumentado do milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: Aumento no número de plantas por área de cultivo, aumento no número de espigas por planta, aumento no número de fileiras por espiga, número de cernes por cada fileira, peso da cerne, peso de mil cernes (peso-1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento no teor de óleo por cerne e aumento no conteúdo de amido por cerne.

[00224] Como mencionado, o aumento do rendimento da planta pode ser determinado por diversos parâmetros. Por exemplo, o rendimento aumentado de arroz pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: no número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso- 1000), aumento no teor de óleo por semente, aumento no conteúdo de amido por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorres por cause de uma arquitetura modificada.

[00225] Similarmente, o rendimento aumentado de soja pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), redução na quebra de vagens, aumento no teor de óleo por semente, aumento no conteúdo de proteína por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorres por cause de uma arquitetura modificada.

[00226] O rendimento aumentado de canola pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso- 1000), redução na quebra de vagens, aumento no teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorres por cause de uma arquitetura modificada.

[00227] O rendimento aumentado de algodão pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), aumento no teor de óleo por semente, melhora no comprimento da fibra, força da fibra, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorres por cause de uma arquitetura modificada.

[00228] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da parte vegetativa da planta. Resumidamente, os lipídios (óleo) podem ser extraídos da planta (por exemplo, a semente) por trituração do tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e extração do óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando-se vários métodos conhecidos, tais como Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists’ Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)]; por Espectroscopia Próxima do Infravermelho (NI), que utiliza a absorção da energia quase no infravermelho (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito na WO/2001/023884, que é com base na extração de solvente de óleo, evaporação do solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo, e direcionamento de uma luz no fluxo de gás e de partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.

[00229] Assim, esta invenção é de grande valor à agricultura por promover o rendimento de colheitas desejadas comercialmente (p. ex., biomassa do órgão vegetativo como madeira de álamo ou órgão reprodutivo, como número de sementes ou biomassa de semente).

[00230] Quaisquer das plantas transgênicas conforme acima descritas ou partes destas podem ser processadas para produzir um alimento, refeição, proteína ou preparação de óleo, por exemplo, para animais ruminantes.As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um teor de óleo aumentado podem ser usadas para produzir óleo vegetal (pela extração de óleo da planta).

[00231] O óleo à base de plantas (incluindo o óleo de semente e/ou o óleo da parte vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção, pode ser combinado com uma variedade de outros componentes. Os componentes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Exemplos de produtos incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos, e matéria-prima para processo de fermentação. Exemplos de produtos a serem incorporados ao óleo à base de plantas incluem rações animais, alimentos para humanos, tais como, salgadinhos extrudados, pães, como agente ligante de alimentos, rações para aquicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas para praticantes de esportes, barras nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.

[00232] De acordo com algumas aplicações da invenção, o oleo compreende um óleo de semente.

[00233] De acordo com algumas aplicações da invenção, o oleo compreende um óleo de parte vegetativa.

[00234] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula da planta faz parte de uma planta.

[00235] Conforme utilizado aqui, o termo “aproximadamente” refere-se a ± 10 %.

[00236] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e suas formas conjugadas significam “incluindo, mas não se limitando a”.

[00237] O termo “consistindo de meios [sic] “incluindo e limitado(a) a".

[00238] O termo “consistindo essencialmente de” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não altere materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00239] Como aqui usado, a forma singular “um” e “o” inclui referências no plural, a não ser quando o contexto claramente especifica o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.

[00240] Ao longo dessa solicitação, várias aplicações dessa invenção podem estar presentes em formato variado. Deve-se compreender que a descrição no formato variado é simplesmente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Consequentemente, deve-se considerar que a descrição de uma variação deve ter revelado especificamente todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Por exemplo, deve-se considerar que a descrição de uma variação como a de 1 a 6 tenha revelado especificamente subvariações como as de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela variação, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.

[00241] Sempre que uma variação numérica for indicada aqui, significa que inclui qualquer numeral mencionado (fracionado ou integral) dentro da variação indicada. As frases “variando/varia entre”, uma primeira indica o número e uma segunda indica o número e “variando/varia de” uma primeira indica o número “para” uma segunda indica o número, são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam que incluem o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionados ou integrais deles.

[00242] Conforme utilizado aqui, o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos por praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00243] É observado que certas características da invenção, as quais são, por uma questão de clareza, descritas no contexto de aplicações separadas, podem também ser providas em combinação como uma única configuração. Inversamente, várias características da invenção que são, por uma questão de brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, podem também ser providas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada ou como adequada em qualquer outra configuração descrita da invenção. Determinados recursos descritos no contexto de várias aplicações não são devem considerados recursos essenciais destas aplicações, a menos que a configuração é inoperante sem aqueles elementos.

[00244] Várias aplicações e aspectos da presente invenção conforme acima colocado e conforme clamado na seção de reivindicações a seguir encontra apoio experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00245] É feita agora referência aos exemplos, que junto com as descrições acima, ilustram algumas aplicações da invenção de forma não- limitante.

[00246] De modo geral, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas cuidadosamente na literatura. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conformes descritas nas Patentes Americanas Números 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic e Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman e Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e na literatura científica, vide, por exemplo, Patentes Norte- americanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos aqui incorporados por referência como se fossem integralmente aqui definidos. Outras referências gerais são apresentadas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos descritos sejam bem conhecidos no ramo e são fornecidos para conveniência para o leitor. Todas as informações contidas na literatura são incorporadas aqui como referência.

MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA

[00247] Extração de RNA - Tecidos desenvolvendo em várias condições de desenvolvimento foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando o Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) invitrogen (dot) com/content (dot) cfm?pageid=469]. Aproximadamente de 30 a 50 mg de tecido foram retirados das amostras. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pistilo e cadinho em nitrogênio líquido e ressuspenso em 500 μl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 μl de clorofórmio foram adicionados, seguido de precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol 75%. O RNA foi eluído em 30 μl de água sem RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza com minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Incs, CA USA). Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu uma ID do Conjunto de expressão.

[00248] Análise de correlação - foi realizada para os genes selecionados de acordo com algumas aplicações da invenção, nas quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com os IDs de correlação) foram utilizados como “eixo x” para correlação com a transcrição do tecido que foi utilizado como “eixo Y”. Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação “R” (utilizando a correlação de Pearson) juntamente com um valor de p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de expressão de um gene em certo tecido e um desempenho fenotípico ao longo dos ecotipos/variedade/híbrido é alto no valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão de tal gene) e o caráter fenotípico (ex.: melhor eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento e similares).

EXEMPLO 1 IDENTIFICANDO GENES QUE MELHORAM O RENDIMENTO E CARACTERÍSTICAS AGRONÔMICAS IMPORTANTES EM PLANTAS

[00249] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos cuja expressão em plantas pode aumentar o rendimento, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico (ABST), eficiência no uso de nitrogênio (NUE), eficiência no uso de água (QUE) e eficiência no uso de fertilizante (FUE) de uma planta, conforme segue.

[00250] Todos os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeo aqui utilizados foram originados de bases de dados disponíveis ao público ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, Cevada e Sorgo). Os dados de sequência de 100 diferentes espécies de planta foram introduzidos em uma única e abrangente base de dados. Outras informações sobre a expressão do gene, anotação de proteína, enzimas e vias também foram incorporadas.

[00251] As principais bases de dados utilizadas incluem:• GenomasO O genoma Arabidopsis [TAIR genome version 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/)]O Genoma do arroz [IRGSP build 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (dot) dna (dot) affrc (dot) go (dot) jp/IRGSP/)];O Álamo [Populus trichocarpa release 1.1 from JGI (assembly release v1.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) genome (dot) jgi-psf (dot) org/)];O Brachypodium [JGI 4x assembly, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) brachpodium (dot) org)];O Soja [DOE-JGI SCP, version Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)];O Uva [French-Italian Public Consortium for Grapevine Genoma Characterization grapevine genoma (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) genoscope (dot) cns (dot) fr /)];O Feijão em fava [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly [(Hypertext Transfer Protocol://msc (dot) jcvi (dot) org/r communis];O Soja [DOE-JGI SCP, versão Sbi1 [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)];O Genoma parcialmente montado do milho [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (dot) org/];• As sequências de EST e mRNA expressas foram extraídas das seguintes bases de dados:O GenBank Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/dbEST O RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/RefSeq/); TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis(dot) org/);• Bases de dados de proteínas e viasO Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/].O AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/biocyc/index (dot) jsp].O ENZYME [Hypertext Transfer Protocol://expasy (dot) org/enzyme/].• Os conjuntos de dados de micromatriz foram baixados de:O GEO (Hypertext Transfer Protocol://World WideWeb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)O TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World WideWeb.arabidopsis.org/).O Os conjuntos proprietários de dados de micromatriz (WO2008/122980).• Informações de QTL e SNPsO Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) gramene (dot) org/qtl/].O Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) PAnzea (dot) org/index (dot) html].

[00252] Conjunto de base de dados - foi realizada para construir uma base de dados anotada ampla, rica, confiável e de fácil análise contendo sequências genômicas de mRNA, ESTs DNA disponíveis ao público, dados de vários cultivos, bem como QTLs de dados de expressão de gene, anotação de proteína e vias, e outras informações relevantes.

[00253] O conjunto de base de dados compreende uma caixa de ferramentas de refinação, estruturação, anotação e análise de genes, permitindo a construção de uma base de dados personalizada para cada projeto de descoberta de gene. As ferramentas de refinação e estruturação de genes permite detectar, de forma confiável, variantes de conexão e transcrições antisense, gerar a compreensão de vários resultados fenotípicos em potencial de um único gene. As capacidades da plataforma “LEADS” da Compugen LTD para análise do genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade cientifica [vide, por exemplo, “Widespread Antisense Transcription”, Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; “Splicing of Alu Sequences”, Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; “Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information”, Xie H et al. Genomics 2002], e também demonstraram ser mais eficientes no genoma de planta.

[00254] Clustering de EST e montagem de gene - Para o clustering e a montagem de genes de organismos com dados disponíveis da sequência de genoma (arabidopsis, arroz, feijão em fava, uva, brachypodium, álamo, soja, sorgo), a versão LEADS genômica (GANG) foi empregada. Essa ferramenta permite um clustering mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura do gene, bem como eventos alternativos de splicing e transcrição anti-sense.

[00255] Para organismos sem dados completos de sequência de genoma disponíveis, o software de clustering “expressed LEADS” foi aplicado.

[00256] Anotação de gene - Os genes e proteínas previstos foram anotados como segue: foi realizada uma busca em blast [Hypertext Transfer Protocol://blast (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] contra todas as sequências de planta UniProt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/]. Quadros de leitura aberta de cada suposta transcrição foram analisados e ORF mais longo com maior número de homólogos foi selecionado como a proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas por InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/interpro/]. Blast contra proteínas de AraCyc e bases de dados ENZYME foram utilizadas para mapear as transcrições previstas para via de AraCyc.

[00257] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando algoritmo de blast [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] para validar a precisão da sequência protéica prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.

[00258] Perfil de expressão de gene - Várias fontes de dados foram exploradas para o perfil de expressão de gene, sendo eles dados de micromatriz e perfil digital de expressão (vide abaixo). De acordo com o perfil de expressão de gene, a análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e que estão associados a diferentes fenótipos.

[00259] Conjuntos de dados de micromatriz disponíveis ao público foram baixadas dos sites da TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos dados de recurso mais importantes para identificar genes importantes para rendimento.

[00260] Um resumo de perfil de expressão digital foi compilado para cada cluster de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequência compreendendo o cluster. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe um perfil de expressão virtual com base nas sequências EST que formam o cluster do gene. A ferramenta provê o perfil de expressão de um cluster em termos de anatomia da planta (por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso), estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (provê as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, tais como estiagem, frio, infecção por patógenos, etc). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos diferentes clusters, a expressão digital provê um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um cluster ter um total de N ESTs para conter X ESTs de uma certa coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no cluster, b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas e relacionadas, c) o número total de ESTs disponíveis que representam a espécie. Assim, os clusters com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) in: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) in: Quatorze amostras de cDNA de dupla-fita obtidas de dois genótipos, dois tecidos de fruta (polpa e casca) e quatro estágios de desenvolvimento foram sequenciados. O pirosequenciamento GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas resultaram em 1.150.657 tags de sequência expressas que se montaram em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos em comparação à base de dados Cucurbit Genomics [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) icugi (dot) org/] confirmou a precisão do sequenciamento e da montagem. Os padrões de expressão de genes selecionados correspondeu bem aos seus dados qRT-PCR.

[00261] No geral, 213 genes (N.°s Ident. da Sequência: 1-288 e 289-480 para polinucleotídeos e N.°s Ident. da Sequência: 481-727 e 728-792 para polipeptídeos) foram identificadas como tendo um grande impacto na produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento [sic], conteúdo de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizantes da planta quando sua expressão é aumentada nas plantas. Os genes identificados, seu polinucleotídeo organizado e as sequências polipeptídicas, bem como suas sequências atualizadas de acordo com a base de dados Genbank são apresentados na Tabela 1 abaixo.Tabela 1

[00262] Genes identificados para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante da planta.

Tabela 1: São apresentados os genes identificados, sua anotação, organismo e polinucleotídeo e identificadores de sequência polipeptídica. “polin.” = polinucleotídeo; "polip." = polipeptídeo.

EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM O RENDIMENTO, O RENDIMENTO DA FIBRA, A QUALIDADE DA FIBRA, TAXA DE CRESCIMENTO, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, O VIGOR, A ABST E/OU A NUE DE UMA PLANTA

[00263] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados a caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações de genoma total. Os ortólogos e os parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: Os primeiros evoluíram de um ancestral comum por especialização e os outros estão relacionados por eventos de duplicação. Assume-se que os parálogos resultantes de eventos de duplicação de ancestrais provavelmente divergiram em termos de função enquanto que os reais ortólogos são mais prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução.

[00264] Para identificar supostos ortólogos dos genes que afetam o rendimento da planta, o rendimento de óleo, o teor de óleo, o rendimento de semente, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a tolerância ao estresse abiótico e eficiência no uso de fertilizante (FUE) genes e/ou eficiência no uso de nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas utilizando a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool [Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local]). Tentou-se agrupar as sequências suficientemente similares. Esses supostos ortólogos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como sendo uma representação das relações de evolução entre a taxa biológica. Os supostos grupos ortólogos foram analisados quanto à sua concordância com o filograma e em casos de desacordos esses grupos ortólogos foram devidamente quebrados.

[00265] Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos padrão, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram perfil similar de expressão por meio do desenvolvimento com regulação ascendente em estágio específico, tal como o estágio de preenchimento da semente) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que apresentam perfil similar de expressão em todos os seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, tais como a semente). As anotações de todos os ESTs em cluster para um gene foram analisadas estatisticamente por comparação com sua frequência no cluster versus sua abundância na base de dados, permitindo a construção de um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é denominado “expressão digital”. A justificativa de utilizar esses dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação de expressão de fenótipo é com base na suposição de que ortólogos reais são prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução. Esses métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações em similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades no nível de sequência - aminoácidos idênticos nos domínios de proteína e similaridade em perfis de expressão.

[00266] A busca e identificação de genes homólogos envolve a triagem das informação de sequência disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, tais como a base de dados de DNA do Japão (DDBJ), Genbank, e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) ou versões destas ou a base de dados MIPS. Diversos diferentes algoritmos de pesquisa foram desenvolvidos, incluindo entre outros, o conjunto de programas denominado programas BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetados para filas de sequência de nucleotídio (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e dois projetados para filas de sequência protéica (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Esses métodos envolvem o alinhamento e a comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula a identidade de sequência percentual e realiza a análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização da análise BLAST está disponível ao público por meio do National Centre for Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia]. Outros softwares ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para descobrir o alinhamento de duas sequências completas que aumentam o número de correspondências e reduzem o número de gaps.

[00267] Esses genes homólogos podem pertencer à mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada utilizando a análise de similaridade da sequência. Para realizar essa análise, pode-se utilizar programas padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de junção de vizinhança das proteínas homólogas aos genes nesta invenção pode ser utilizada para prover uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento conforme descrito acima. Espera-se que outras plantas carreguem um gene de função similar (ortólogo) ou uma família de genes similares e esses genes proverão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, esses membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção. Exemplos de outras plantas aqui incluídos, entre outros, são cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), óleo- semente de nabo (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), cana de açúcar (Saccharum officinarum), sorgo (Sorghum bicolor), soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum), trigo (Triticum aestivum).

[00268] As análises de homologia de sequência acima mencionadas podem ser realizadas em uma sequência de comprimento total, porém podem ser também com base em uma comparação de determinadas regiões, por exemplo, domínios conservados. A identificação desses domínios também estaria na esfera de conhecimento do técnico no assunto e envolveria, por exemplo, um formato legível por computador dos ácidos nucleicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações disponíveis ao público sobre domínios de proteína, tópicos e caixas conservados. Essas informações estão disponíveis da base de dados PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) biochem (dot) ucl (dot) ac (dot) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (dot) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol://pir (dot) Georgetown (dot) edu/) ou Pfam (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) sanger (dot) ac (dot) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequência projetados para a busca de tópico podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionado acima. Os programas de computador preferidos incluem, entre outros, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.

[00269] Um técnico no assunto pode utilizar as sequências homólogas aqui providas para encontrar sequências similares em outra espécie e em outros organismos. Homólogos de uma proteína abrangem peptídios, oligopeptídios, polipeptídios, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similar à da proteína não modificada da qual são derivados. Para produzir esses homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades similares (alterações conservativas, tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensidade similares para formar ou quebrar estruturas a-helicoidais ou estruturas de 3 folhas). As tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Homólogos de um ácido nucleico abrangem ácidos nucleicos tendo substituições, deleções e/ou inserções de nucleotídio em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e tendo atividade biológica e funcional similar às do ácido nucleico não modificado do qual são derivados.A tabela 2, mostrada abaixo, lista um sumário de sequência ortólogas e homólogas das sequências de polinucleotídeos (N.°s Ident. da Sequência: 1-288 e 289-480) e das sequências de polipeptídeos (N.°s Ident. da Sequência: 481-727 e 728-792) apresentadas na Tabela 1 acima, que foram identificadas a partir de bases de dados utilizando o software NCBI BLAST ( por exemplo, utilizando os algoritmos Blastp e tBlastn) e agulha (pacote EMBOSS) como sendo pelo menos 80% homólogos aos polipeptídeos e polinucleotídeos selecionados, esperando-se que eles aumentem o rendimento da planta, o rendimento da semente, o rendimento do óleo, teor do óleo, a taxa de crescimento, rendimento da fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta.Tabela 2

[00270] Genes/polipeptídeos homólogos identificados para aumentar o rendimento, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta.

Tabela 2: São fornecidos os polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos dos genes para aumentar o rendimento (por exemplo, rendimento do óleo, rendimento da semente, rendimento da fibra e/ou sua qualidade), a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta que são listados na Tabela 1 acima. A homologia foi calcula com % de identidade sobre as sequências alinhadas. As sequências em questão eram sequências de polinucleotídeos SEQ ID N.°s: 1-288 e 289-480; e polipeptídeos SEQ ID N.°s: 481-727, e 728-792 e as sequências assunto são sequências de proteínas identificadas no banco de dados com base em mais de 80% de identificação global com as sequências traduzidas preditas das sequências de nucleotídeos ou sequências de polipeptídeos em questão. Nucl." = polinucleotídeo; "polyp." = polipeptídeo; "Algor." = algoritmo (utilizado para alinhamento de seqüência e determinação da percentagem da homologia); “Hom.” - homologa; “iden.” - identidade.

[00271] A saída da abordagem funcional dos genomas aqui descrita é um conjunto de genes altamente previsto para melhorar o rendimento e/ou outras características agrônomas importantes, tais como a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, biomassa, taxa de crescimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizante de uma planta aumentando a sua expressão. Embora seja previsto que cada gene tenha seu próprio impacto, é esperado que a modificação do modo de expressão de mais que um gene proporcione um efeito aditivo ou sinergístico sobre o rendimento da planta e/ou o desempenho de outros rendimentos agronômicos importantes. Alterar a expressão de cada gene descrito aqui sozinho ou um de conjunto de genes juntos aumenta o rendimento geral e/ou outras características agronômicas importantes, esperando, assim, aumentar a produtividade agrícola.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE BARLEY E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PRODUÇÃO UTILIZANDO A MICROMATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE BARLEY 44K

[00272] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotído de Barley, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo de raiz representa cerca de 47.500 genes e transcrições de Barley. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e componentes de rendimento ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características de planta de 25 diferentes adesões de Barley foram analisadas. Dentre elas, 13 adesões abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00273] Cinco tecidos em diferentes etapas de desenvolvimento [meristema, flor, espiga, caule, folha bandeira], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS”.

[00274] Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 Conjuntos de expressão de transcriptom Barley

Tabela 3: São fornecidas as letras de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Barley.

[00275] Os componentes de rendimento e vigor de Barley relacionados aos parâmetros de avaliação - 13 adesões de Barley em 4 blocos repetitivos (nomeados de A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por canteiro foram cultivados na estufa. As plantas foram fenotipadas em uma base diária seguindo o descritor padrão de Barley (Tabela 4, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% das espigas estavam secas para evitar a liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas nas partes vegetativas e na espiga. Dessas, 5 espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para análise adicional dos grãos, como medição de tamanho, contagem de grãos por espiga e rendimento de grãos por espiga. Todo o material foi seco no forno e as sementes foram debulhadas manualmente das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) utilizando o escaneamento e a análise de imagem. O sistema de análise de imagem incluía um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1,37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).Tabela 4 Descritores padrão Barley

Tabela 4.

[00276] Ao fim do experimento (50 % das espigas foram secas) todas as espigas de parcelas dentro dos transectos A-D foram coletadas, e as seguintes medições foram realizadas:(i) Grãos por espiga - O número total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. A média de grãos por espiga foi calculada ao dividir o número total de grãos pelo número de espigas.(ii) Tamanho médio do grão (cm) - O total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi digitalizado e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de imagiologia digital. O escaneamento de grãos foi feito utilizando o scanner Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisado com o software Image J. A média de grãos por espiga foi calculada pela divisão do tamanho total de grãos pelo número total de grãos.(iii) Peso médio dos grãos (mg) - O total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado e pesado. O peso médio foi calculado pela divisão do peso total pelo número total de grãos.(iv) Produção de grãos por espiga (g) - O total de grãos de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. O rendimento do grão foi calculado pela divisão do peso total pelo número de espigas.(v) Análise de comprimento da espiga - Cinco espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando fita métrica, excluindo as praganas.(vi) Análise do número de espigas - Foram contadas as espigas por planta.

[00277] Parâmetros adicionais foram medidos como segue:

[00278] Classificação de hábito de crescimento - No estágio de crescimento 10 (booting), cada uma das plantas foi classificada por sua natureza de hábito de crescimento. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostática até 9 para ereto.

[00279] Quantidade de pelos de folhas basais - No estágio de crescimento 5 (bainha da folha extremamente ereta; fim de afilhamento), cada uma das plantas foi classificada pela sua natureza de quantidade de pelos da penúltima folha. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostática até 9 para ereto.

[00280] Altura da planta - No estágio de colheita, (50% das espigas estavam secas) cada uma das plantas foi medida pela altura utilizando fita métrica. A altura foi medida do nível do chão até o topo da espiga mais logo, fora os espinhos.

[00281] Dias para florescimento - Cada uma das plantas foi monitorada por data de florescimento. Os dias de florescimento foram calculados do dia de cultivo até a data de florescimento.

[00282] Pigmentação do caule - No estágio de crescimento 10 (booting), cada uma das plantas foi classificada pela cor de seu caule. A escala que foi utilizada foi 1 para verde até 5 para roxo total.

[00283] Peso seco vegetativo e rendimento de espigas - Ao final do experimento, (50% das espigas estavam secas) todas as sementes dos canteiros dos blocos A-D foram coletadas. A biomassa e o peso das espigas de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas.

[00284] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 70°C em forno por 48 horas.

[00285] Rendimento de espiga por planta = peso total de espiga por planta (gr) após a secagem a 30°C em forno por 48 horas.

[00286] Índice de Colheita (por Barley) - O índice de colheita é calculado utilizando-se a Fórmula IV.

[00287] Fórmula V: Índice de Colheita = Média de peso seco de espiga por planta/ (Média de peso seco vegetativo por planta + Média de peso seco de espiga por planta) Tabela 5 Parâmetros correlacionados de Barley (vetores)

Tabela 5. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Barley (vetores).

Resultados experimentais

[00288] Treze diferentes adesões de Barley foram cultivadas e caracterizadas para 13 parâmetros, conforme descrito abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumios nas Tabelas 6 e 7 abaixo. A análise subsequente de correlação entre os diversos conjuntos de expressão transcrição (Tabela 3) e os parâmetros médios, foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados (Tabela 8 abaixo). Tabela 6 Parâmetros de correlação IDS medidos em adesões de Barley

Tabela 6. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nas adesões de Barley de acordo com as seguintes identificações de correlação (Ids de correlação): 6 = Espigas por planta; 10 = Dias para florescimento; 3 = Peso de grão; 5 = Comprimento da espiga; 2 = Tamanho dos Grãos; 1 = Grãos por espiga; 7 = Hábito de crescimento. Tabela 7 Adesões de Barley, parâmetros adicionais medidos

Tabela 7. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nas adesões de Barley de acordo com as seguintes identificações de correlação (Ids de correlação): 8 = Quantidade de pelos de folhas basais; 9 = Altura da planta; 4 = Rendimento de grãos por espiga; 11 = Pigmentação do caule; 12 = Peso seco vegetativo; 13 = Índice de colheita. Tabela 8 Correlação entre o nível de expressão dos polinucleotídeos selecionados da invenção e seus homólogos em tecidos específicos ou estágios de desenvolvimento e a performance fenotípica ao longo dos ecotipos de Barley

Tabela 8. São fornecidas as correlações (R) e valores-p (P) entre os níveis de expressão dos genes selecionados de algumas configurações da invenção em diversos tecidos ou estágio de desenvolvimento (Conjuntos de expressões) e a performance fenotípica em diversos rendimentos (rendimento de semente, rendimento do óleo, teor de óleo), na biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor [Correlação (Corr.) vetor (Vec.)] Expressão (Exp.)] Corr. Vetor. = vetor de correlação especificados nas Tabelas 5, 6 e 7; Exp. Conjunto = conjunto de expressões especificados na Tabela 3.

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PARÂMETROS DE RENDIMENTO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO A MICROMATRIZ INTEGRAL DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE GENOMA DE ARABIDOPSIS 44K

[00289] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotído de Arabidopsis thaliana produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O oligonucleotído de matriz representa aproximadamente 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetadas com base nos dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e das bases de dados de Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados ao rendimento, biomassa ou vigor, várias características de planta de 15 diferentes ecotipos de Arabidopsis foram analisados. Dentre eles, nove ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00290] Cinco tecidos em diferentes fases de desinvolvimento, incluindo raíz, folha, flor em antese, semente 5 dias após a floração (DAF), e semente 12 DAF, representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS”. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 9 abaixo. Tabela 9 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de Arabidopsis transcriptom

Tabela 9: São fornecidas as letras de identificação (ID) dos conjuntos de expressão de Arabidopsis (A-E). DAF = dias após o florescimento.

[00291] Componentes de rendimento e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor - oito de nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (a saber, A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por canteiro. As plantas foram cultivadas em uma estufa sob condições controladas em 22 °C, o fertilizante N:P:K (20:20:20; relações de peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado; Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados durante o estágio de muda de plantas cultivadas em cultura do tecido em placas de ágar transparentes com crescimento vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagem digital.

[00292] Imagem digital em Cultura de tecidos - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi utilizado para capturar imagens de plantas semeadas em placas quadradas de ágar. O sistema de aquisição de imagem de laboratório consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que incluía 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura.

[00293] Imagem digital em estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera com uma lente de comprimento focal de 24 mm (Canon EF series), colocada em um cavalete de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores cerradas em vasos brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os vasos brancos tinham formato quadrado com medidas de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.

[00294] Foi utilizado um sistema de análise de imagem que consistia em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem baseado em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00295] Análise da folha - Utilizando análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número, a área, o perímetro, o comprimento e a largura da folha. No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de cada canteiro dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como, área total da folha, comprimento laminar etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade do limbo foi calculada como a largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00296] Ánalise da raiz - Durante 17 dias, os diferente ecotipos foram cultivados em placas de agar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias, começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento da raízes foi documentado (veja exemplo nas Figuras 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula VI.Fórmula VI: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente da cobertura da raiz ao longo do tempo.

[00297] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com a Fórmula VII. A análise foi concluída com o aparecimento de plantas sobrepostas. Fórmula VII:

[00298] Área da taxa de crescimento vegetativo relativo = Coeficiente da regressão da área vegetativa ao longo do tempo.

[00299] Para comparação entre os ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas reais. No casos em que as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), somente a maior amostra foi escolhida e acrescentada à comparação Anova.

[00300] Sementes em análise de síliquas - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletadas de cada canteiro nos blocos D e E. As síliquas escolhidas estavam marrom claras, porém ainda intactas. As síliquas foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto digital em alta resolução foi tirada de cada canteiro. Utilizando as imagens, o número de sementes por síliqua foi determinado.

[00301] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00302] Percentual de óleo nas sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Sementes Columbia de 3 canteiros foram misturadas e trituradas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como solvente. A extração foi realizada por 30 horas sob aquecimento médio de 50°C. Quando a extração estava concluída, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler’s) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a NMR de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinada utilizando a NMR de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00303] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada canteiro foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas era verde-amarelas e foram coletadas das partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.

[00304] Peso seco e rendimento de semente - No dia 80 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 30°C em uma câmara de secagem; rendimento de semente por planta = peso total da semente por planta (g).

[00305] Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado utilizando a Fórmula VIII. Fórmula VIII: Rendimento de óleo da semente = Rendimento de semente por planta (g) * % de óleo na semente. Índice de Colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado utilizando- se a Fórmula IV (descrita abaixo): Índice de Colheita=Rendimento médio de semente por planta/ Peso médio seco.

Resultados experimentais

[00306] Nove diferentes ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados para 18 parâmetros (nomeados como vetores). Tabela 10 Parâmetros correlacionados da Arabidopsis (vetores)

Tabela 10. São apresentados os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (IDs de correlação Nos. 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); g = grama(s); mg = miligrama(s).

[00307] Os valores caracterizados estão resumidos nas Tabelas 11 e 12 abaixo. Tabela 11 Parâmetros medidos em ecotipos da Arabidopsis

Tabela 11. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 15 = Rendimento de semente por planta (gram); rendimento de óleo por planta (mg); 12 = % de óleo por semente; 11 = peso de 1000 sementes (gr); 5 = matéria seca por planta (gr); 17 = índice de colheita; 10 = área total da folha por planta (cm); 13 = sementes por síliqua; 14 = comprimento da síliqua (cm).Tabela 12 Parâmetros adicionais medidos em ecotipos da Arabidopsis

[00308] Tabela 12. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 6 = taxa de crescimento vegetativo (cm2/dia) até 8 folhas reais; 3 = crescimento relativo da raiz (cm/dia) (dia 13); 2 = Comprimento da raiz, dia 7 (cm); 1 = comprimento da raiz, dia 13 (cm); 4 = peso fresco por planta (gr) no estágio de brotação; 9 = comprimento da lâmina (cm); 8 = Largura da lâmina (cm) = Largura da lâmina (cm); 18 = Largura/comprimento da folha; 7 = Circularidade do limbo.

[00309] A Tabela 13 abaixo apresenta os genes de algumas aplicações da invenção, os parâmetros caracterizados (que são utilizados como eixo x para correlação) e o transcriptom de tecido correlacionado com o valor de correlação (R, calculado utilizando a correlação de Pearson). Quando o coeficiente de correlação (R) entres os níveis de expressão de um gene em certo tecido e uma performance fenotípica ao longo dos ecotipos é alto no valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão de tal gene) e o caráter fenotípico. Tabela 13 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados em tecidos específicos ou estágios de desenvolvimento e a performance fenotípica ao longo dos ecotipos de Barley

Tabela 13. São fornecidas as correlações entre o nível de expressão de genes que melhoram o rendimento e seus homólogos em tecidos específicos ou estágios de desenvolvimento (conjuntos de expressão) e a performance fenotípica (vetor ao longo dos ecotipos de Barley. Os caráteres fenotípicos [correlação (Corr.) vetor (Vec.)] incluem o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor, conforme descrito nas Tabelas 10-12. Exp. Conjunto = conjunto de expressões de acordo com a Tabela 9 acima.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PARÂMETROS DE RENDIMENTO E CONDIÇÕES LIMITADORAS DE NITROGÊNIO UTILIZANDO A MICROMATRIZ INTEGRAL DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE ARABIDOPSIS 44K

[00310] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) chem (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Arabidopsis. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados ao rendimento, biomassa ou vigor, várias características de planta de 14 diferentes ecotipos de Arabidopsis foram analisados. Dentre eles, dez ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00311] Dois tecidos das plantas [folhas e caules] crescendo em dois níveis de fertilização com nitrogênio diferentes (1,5 mM de Nitrogênio ou 6 mM de Nitrogênio) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS”. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 14 abaixo. Tabela 14 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de Arabidopsis transcriptom

Tabela 14: São fornecidas as letras de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis.

[00312] Avaliação dos componentes de rendimento da Arabidopsis e parâmetros relacionados ao vigor sob diferentes níveis de fertilização de nitrogênio - 10 adesões de Arabidopsis em 2 canteiros repetitivos, cada um contendo 8 plantas por canteiro, foram cultivadas na estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi: Sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos de Eppendorf contendo 0,5 x Murashige-Skoog sal basal médio e cultivado em 23 °C sob ciclos diários de 12 horas claras e 12 horas escuras por 10 dias. Então, mudas de tamanho similar foram cuidadosamente transferidas para canteiros preenchidos com uma mistura de turfa e perlita em uma razão de 1:1. Condições constantes de limite de nitrogênio foram conseguidas por meio da irrigação de plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 2 mM CaC12, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 5 mM de KCl, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos, enquanto que a condição normal de irrigação (condição normal de Nitrogênio) foi conseguida por meio da aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3, suplementado com 2 mM e CaCl2, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos. Para seguir o crescimento da planta, as bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitadoras de nitrogênio foram iniciada e, subsequentemente, a cada 3 dias por 15 dias adicionais. A área da planta de roseta foi, então, determinada a partir das fotografias digitais. O software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotografias digitais [Hypertext Transfer Protocol://rsb (dot) info (dot) nih (dot) gov/ij/], utilizando scripts proprietários projetados para analisar o tamanho da área da roseta a partir de plantas individuais com uma função do tempo. O sistema de análise de imagem incluía um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1,37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00313] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 15 abaixo. Tabela 15 Parâmetros correlacionados da Arabidopsis (vetores)

Tabela 15. São apresentados os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores). “N” = Nitrogênio nas concentrações notadas; “g ” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “t50” = tempo onde 50% das plantas floresceram; “unidade g/SPAD” = biomassa da planta expressada em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida por SPAD. “DW” = Peso Seco da Planta; “FW” = Peso Fresco da planta; “Nível N/DW” = nível de nitrogênio da planta medido em unidade de SPAD por biomassa de planta [g]; “Nível DW/ N” = biomassa de planta por planta [g]/unidade de SPAD; Área da Roseta (medida utilizando-se análise digital); Cobertura do Canteiro no dia indicado [%](calculado pela divisão da área total da planta com a área total do canteiro); Área do Limbo da Folha no dia indicado [cm2] (medido por meio da análise digital); RGR (taxa de crescimento relativo) da Área da Roseta no dia indicado [cm2/dia]; Florescimento t50 [dia[(o dia no qual 50% da planta floresce); rendimento da semente/área da roseta no dia 10 [g/cm2] (calculada); rendimento da semente/limbo da folha [g/cm2] (calculada); rendimento da semente/ nível N [g/ unidade de SPA] (calculada).

[00314] A avaliação de NUE, componentes de rendimento e parâmetros relacionados ao vigor - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada uma contendo oito plantas por canteiro, em uma estufa com condições de temperatura controlada por cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com diferentes concentrações de nitrogênio, conforme descrito acima, dependendo do tratamento aplicado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagem digital.

Imagem digital - Estudo de estufa

[00315] Um sistema de aquisição de imagem, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 400D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), colocada em uma montagem customizada de alumínio, foi utilizado para capturar imagens de plantas plantadas em contêineres com uma estufa ambiental controlada. O processo de captura de imagem é repetido a cada 2-3 dias, começando no dia 9-12 até o dia 16-19 (respectivamente) do transplante.

[00316] O sistema de processamento de imagens que foi utilizado é descrito no Exemplo 4 acima. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de processamento de imagem foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número, a área de limbo da folha, a cobertura do canteiro, o diâmetro da Roseta e a área da Roseta da folha.

[00317] Área de taxa de crescimento relativo: A taxa de crescimento relativo da roseta e das folhas foi calculada de acordo com as Fórmulas XII e XIV, respectivamente.

[00318] O rendimento da semente e o peso de 1000 sementes - No final do experimento todas as sementes de todos os canteiros foram coletadas e pesadas para medir o rendimento da semente por planta em termos de peso total de semente por planta (gr). Para o cálculo do peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00319] Peso seco e rendimento de semente - No final do experimento, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 30 °C em uma câmara de secagem.

[00320] Índice de colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV conforme descrito acima [Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta/peso médio seco].

[00321] T50 dias para florescimento - Cada uma das plantas foi monitorada por data de florescimento. Os dias de florescimento foram calculados do dia de cultivo até que 50% dos canteiros estivessem florescidos. Nível de nitrogênio da planta - O conteúdo de clorofila das folhas é um bom indicador do status de nitrogênio da planta, já que o grau de verdor da folha é altamente correlaciona a tal parâmetro. O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro. Com base nesta medida, parâmetros como a razão entre o rendimento da semente por unidade de nitrogênio [rendimento da semente/nível N = rendimento da semente por planta [g]/unidade de SPAD], DW da planta por unidade de nitrogênio [DW/ nível N = biomassa da planta por planta [g]/unidade de SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [nível N/DW= unidade de SPAD/ biomassa da planta por planta (g)] foram calculados.

[00322] A porcentagem da redução do rendimento da semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas sob condições limitadoras de nitrogênio comparadas ao rendimento de sementes produzidas em níveis normais de nitrogênio expressados em %.

Resultados experimentais

[00323] Dez diferentes adesões de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivadas e caracterizadas para 37 parâmetros, conforme descrito abaixo. A média de cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP. A subsequente análise de correlação entre os diversos conjuntos de transcriptoma (Tabela 14) foi conduzida. A seguir os resultados integrados ao banco de dados. Tabela 16 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados da invenção e seus homólogos nos tecidos sob condições normal ou limitante de fertilização com nitrogênio e o desempenho fenotípico dentre os ecotipos de Arabidopsis

Tabela 16. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes de melhoria de produção e seus homólogos nos tecidos (folhas e caules) sob condições limitantes (1,5mM de Nitrogênio) ou normais (6 mM de Nitrogênio) (conjuntos de expressão) e o desempenho fenotípico em diversos componentes de produção (produção de sementes, produção de óleo, conteúdo de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [vetor (Vec.)de Correlação (Corr.)] sob condições normais ou limitantes de Nitrogênio. Vec. Corr. = vetor de correlação de acordo com a Tabela 15 acima; Exp. Conjunto = conjunto de expressões de acordo com a Tabela 14 acima. P = valor p.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE ALTO RENDIMENTO COM PARÂMETROS RELACIONADOS A ABST UTILIZANDO MICROARRANJOS DE 44K DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE SORGO

[00324] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Sorgo, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Sorgo. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com ABST, parâmetros relacionados ao rendimento ou vigor, várias características de planta de 17 diferentes variedades de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00325] Correlação de variedades de Sorgo em meio a ecótiopos cultivados sob severas condições de estiagem

Procedimentos experimentais

[00326] Dezessete variedades de Sorgo foram cultivadas em três canteiros repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: Sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas sob condições normais até cerca de 35 dias da semeadura, por volta de V8 (Última folha visível, mas ainda enrolada, orelha começando a inchar ). Nesse momento, a irrigação foi para e foi desenvolvido um estresse de estiagem severo. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com estiagem, parâmetros relacionados ou componentes de rendimento, as 17 diferentes variedades de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

[00327] Todas as 10 variedades selecionadas de Sorgo foram amostradas para cada tratamento. Tecidos vegetais [Folha bandeira, Meristema floral e Flor] cultivados sob severo estresse de estiagem e plantas cultivadas sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS”. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 17 abaixo. Tabela 17 Conjuntos de expressão de transcriptom em Sorgo

Tabela 17: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo 1, 2, 3 e 4. Folha bandeira = a folha abaixo da flor; Meristema floral = Meristema apical seguindo o início da panícula; Flor = a flor no dia de antese. Conjuntos de expressão 1, 2 e 3 são de plantas cultivadas sob condições normais. O conjunto de expressão 4 deriva de plantas cultivadas sob condições de estiagem.

[00328] Os seguintes parâmetros foram coletados utilizando um sistema de imagem digital:

[00329] Ao final do período de cultivo, os grãos são separados da Planta ‘Cabeça’ e os seguintes parâmetros são medidos e coletados:(i) Área Média dos Grãos (cm2) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.(ii) Comprimento Médio dos Grãos (cm) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.

[00330] Ao fim do período de cultivo, 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagens descrito abaixo.(i) Área Média da Cabeça (cm2) A área da ‘Cabeça’ foi medida a partir das imagens e foi dividida pelo número de ‘Cabeças’.(ii) Comprimento Médio da Cabeça (cm) O comprimento da ‘Cabeça’ (eixo mais longo) foi medido a partir das imagens e foi dividido pelo número de ‘Cabeças’.

[00331] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, que consiste em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00332] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de cinco plantas por canteiro ou pela medição de parâmetro ao longo de todas as plantas dentro do canteiro.

[00333] Peso médio das sementes/Cabeça (gr) - Ao final do experimento (‘Cabeças’ de plantas), as cabeças dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e pesadas. O peso médio dos grãos por cabeça foi calculado dividindo o peso total dos grãos pelo número de cabeças totais por canteiro (com base no canteiro). Em caso de cinco cabeças, o peso total dos grãos de cinco cabeças foi dividido por 5.

[00334] Peso Fresco de Cabeça/Planta g - Ao final experimento (quando as cabeças foram colhidas) total e cinco cabeças selecionadas por canteiro dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e cinco) foram pesadas (g) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total (Peso Fresco da Cabeça/Planta g com base no canteiro) e para as cinco (Peso Fresco da Cabeça/Planta g com base em cinco plantas).

[00335] Altura das plantas - As plantas foram caracterizadas quanto à sua altura durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, as alturas das plantas foram medidas utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do chão até o topo da folha mais longa.

[00336] Número de folhas das plantas - As plantas foram caracterizadas quanto ao seu número de folhas durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, o número de folhas das plantas foi medido, contando todas as folhas das três plantas selecionadas por canteiro.

[00337] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando as Fórmulas IX e X.Fórmula IX:A taxa de crescimento relativa da altura da planta = Coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do curso de tempo.Formula XA taxa de crescimento relativa do número de folhas da planta = Coeficiente de regressão do número de folhas da planta ao longo do curso de tempo.

[00338] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro.

[00339] Peso seco vegetativo e Cabeças - Ao final do experimento, (quando a Inflorescência estava seca) todo material vegetativo e as Inflorescências dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. A biomassa e o peso das cabeças de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de Cabeças.

[00340] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 70 °C em forno por 48 horas.

[00341] Índice de colheita (IC) (Sorgo) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XI.Formula XI:Índice de Colheita = Média de peso seco de grãos por Cabeça/(Média de peso seco vegetativo por Cabeça + Média de peso seco de Cabeça).Peso Fresco de Cabeças (Peso Fresco de Cabeças + Peso Fresco de Plantas) - O peso fresco total de cabeças e sua respectiva biomassa de planta foi medida no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e das plantas.

Resultados experimentais

[00342] 16 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e caracterizadas para diferentes parâmetros: A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 19-20) e uma análise de correlação posterior entre os diversos conjuntos de transcriptom (Tabela 17) e os parâmetros médios, foram conduzidos (Tabelas 21). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 18 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 18. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). "g" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "FW" = Peso fresco da Planta; "normal" = condições de crescimento padrão. Tabela 19 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo

Tabela 19: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da semente) em condições normais e secas. As condições de crescimento estão especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 20 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo

Tabela 20: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (como descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID da semente) em condições normais e secas. As condições de crescimento estão especificadas na seção de procedimento experimental Tabela 21 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e desempenho fenotípico sob condições de estresse normal ou abiótico por meio de acessos de Sorgo

Tabela 21. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes de melhoria de rendimento e seus homólogos nos tecidos [Folha bandeira, Meristema da flor e flor; Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico em diversas taxas de rendimento, biomassas, taxas de crescimento e/ou componentes de vigor [Correlação (Corr.) vetor (Vec.)] sob condições de estresse ou em condições normais em acessos Sorgo. P = valor p.

[00343] Parâmetros relacionados ao vigor do sorgo sob 100 mM NaCl e baixas temperaturas (10 ± 2 °C) - Dez variedades de sorgo foram cultivadas em três lotes repetidos, cada um contendo 17 plantas, em uma net house (estufa) sob condições semi-hidrôponicas. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: as sementes de sorgo foram semeadas em bandejas cheias de uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para uma solução de alta salinidade (100 mM NaCl, além da solução completa de Hogland), de baixa temperatura (10 ± 2 °C na presença de solução completa de Hogland) ou em Solução de crescimento normal [solução completa de Hogland a 28 ± 2°C].A solução completa de Hogland consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de micro elementos de 'Super coratin "(Iron-EDDHA [etilenodiamina-N, N'-bis (2-ácido hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro, e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8].

[00344] Todas as 10 variedades selecionadas de Sorgo foram amostradas para cada tratamento. Dois tecidos [folhas e raízes] cultivadas a 100 mM de NaCl, baixa temperatura (10 ± 2 °C) ou sob condições Normais (Hogland completo a uma temperatura entre 28 ± 2 °C) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS ”. Tabela 22 Conjuntos de expressão de transcriptom em Sorgo

Tabela 22: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptom em Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2 °C; NaCl = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio = 1,2mm de Nitrogênio; Condições normais = 16mM de Nitrogênio.

Resultados experimentais

[00345] 10 variedades diferentes de Sorgo foram cultivadas diferentes e caracterizadas para os seguintes parâmetros: "Número de folhas Normal" = o número de folhas por planta em condições normais (média de cinco plantas); "Altura Normal da Planta" = a altura da planta em condições normais (média de cinco plantas); "Raiz DW 100 mM NaCl" - o peso seco da raiz por planta em condições de salinidade (média de cinco plantas); A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 24 abaixo. Foram realizadas análises de correlação posteriores entre os diversos conjuntos de transcriptom e os parâmetros médios (Tabela 25). Os resultados foram então integrados ao banco de dados.Tabela 23 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 23: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2 °C; NaCl = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio = 1,2 mm de Nitrogênio; Condições normais = 16 mM de Nitrogênio * TP-3 se refere ao registro de tempo 3.Tabela 24 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos.

Tabela 24: São fornecidos os parâmetros medidos sob 100 mM NaCl e condições de baixa temperatura (8-10 °C) em acessos de Sorgo (ID da semente) de acordo com os números de ID Correlacionados (descritos na Tabela 23 acima) como a seguir: F [100 mM NaCl: Número de folhas]; B [100 mM NaCl: Raiz DW]; L [100 mM NaCl: Parte Aérea DW]; G [100 mM NaCl: Altura da planta]; E [baixa temperatura: Número de folhas]; A [baixa temperatura: Raiz DW]; H [baixa temperatura: Parte Aérea DW]; M [Normal: Número de folhas], I [Normal: Parte Aérea DW]. Tabela 25 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção nas raízes e desempenho fenotípico sob condições de estresse normal ou abiótico por meio de acessos de Sorgo

Tabela 25. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes de melhora da produção e seus homólogos em diversos tecidos [Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor (Vetor de correlação)] sob condições de estresse abiótico (salinidade) ou condições normais dentre os acessos de Sorgo. Cor - vetor de Correlation conforme descrito acima (Tabela 23). P = valor p.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE MILHO E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PRODUÇÃO UTILIZANDO MICROMATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE MILHO 60K

[00346] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotído de milho produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeos representa cerca de 46K de genes e transcritos de Milho desenhados com base em informações de bancos de dados públicos (Exemplo 1). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados ao rendimento, biomassa ou vigor, várias características de planta de 12 diferentes híbridos de milho foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].

Procedimentos experimentais

[00347] Cinco tecidos de diferentes fases de desenvolvimento, incluindo Orelha (floração -R1), folha (floração -R1), Grão de Folha da parte basal da orelha, Grão da orelha distal, representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS”. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 26 abaixo. Tabela 26 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de Milho transcriptom

Tabela 26: São fornecidas as letras de identificação (ID) dos conjuntos de expressão de Milho (A-K).

[00348] Os seguintes parâmetros foram coletados:

[00349] Área do Grão (cm2) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A área do grão foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.

[00350] Comprimento e Largura do Grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A soma dos comprimentos/larguras do grão (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.

[00351] Área da Espiga (cm2) - No fim do período de cultivo seis espigas foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. A área da espiga foi medida a partir das imagens e divida pelo número de espigas.

[00352] Comprimento e Largura da Espiga (cm) - No fim do período de cultivo seis espigas foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. O comprimento e a largura da espiga (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de espigas.

[00353] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, que consiste em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00354] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de seis plantas por canteiro ou pela medição de parâmetro ao longo de todas as plantas dentro do canteiro.

[00355] Peso de Grão Normalizado por planta (g) - Ao final do experimento todas as orelhas de parcelas dos transectos A-C foram coletadas. 6 orelhas foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as orelhas adicionais foram debulhadas juntas e pesadas também. O peso dos grãos foi normalizado utilizando a umidade relativa como 0%. O peso médio dos grãos normalizado por espiga foi calculado dividindo o peso total normalizado dos grãos pelo número total de espigas por canteiro (com base no canteiro). Em caso de seis espigas, o peso total dos grãos de seis espigas foi dividido por 6.

[00356] Peso Fresco da Espiga (g) - No fim do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e seis espigas selecionadas por canteiro dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas (total e com seis) foram pesadas (g) separadamente e a espiga média por planta foi calculada quanto ao total (Peso Fresco da Espiga por canteiro) e quanto a seis (Peso Fresco da Espiga por planta).

[00357] Altura da planta e Altura da espiga - As plantas foram caracterizadas quanto à sua altura durante a colheita. Em cada medição, as alturas de seis plantas foram medidas utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do chão até o topo da planta abaixo da borla. A altura da espiga foi medida do nível do chão até o local onde a espiga principal está localizada

[00358] Número de folhas por plantas - As plantas foram caracterizadas quanto ao seu número de folhas durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, o número de folhas das plantas foi medido, contando todas as folhas das três plantas selecionadas por canteiro.

[00359] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando o coeficiente de regressão da variação do número de folhas durante o curso do tempo.

[00360] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro. Os dados foram coletados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS)

[00361] Peso seco por planta - Ao fim do experimento, quando todo o material vegetativo das parcelas dentro dos transectos A-C foi coletado, pesado e dividido pelo número de plantas.

[00362] Diâmetro da orelha [cm]- O diâmetro da orelha no meio da orelha foi medido utilizando uma régua.

[00363] Diâmetro da espiga [cm] - O diâmetro da espiga sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00364] Número de Fileiras de Cerne por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. Foi calculada a media de 6 orelhas por parcela. Tabela 27 Parâmetros correlacionados de milho (vetores)

Tabela 27.Doze milho variedades foram cultivadas, e caracterizadas para os parâmetros, conforme descrito acima. A media para cada parâmetro foi calculada utilizando o software JMP software, e os valores foram resumidos na Tabela 28 abaixo. A subsequente correlação entre os diversos conjuntos de transcriptoma para todas as ou para subconjuntos de linhas foi realizada pela unidade de bioinformática e os resultados foram integrados ao banco de dados.Tabela 28Parâmetros medidos em Híbrido de Milho

Tabela 28.Tabela 29Parâmetros medidos em Híbrido de Milho parâmetros adicionais

Tabela 29.Tabela 30Parâmetros medidos em Híbrido de Milho parâmetros adicionais

Tabela 30.Tabela 31Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais dentre as variedades de milho

Tabela 31. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes de melhora de produção e seus homólogos em diversos tecidos [conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação (Cor))] sob condições normais dentre as variedades de milho. P = valor p.

EXEMPLO 8 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA A EXPRESSÃO DA PLANTA

[00365] Para validar seu papel na melhoria no teor de óleo, no rendimento da planta, no rendimento de semente, na biomassa, na taxa de crescimento, no rendimento da fibra, na qualidade da fibra, ABST, NUE e/ou vigor, os genes selecionados foram superexpressos em plantas, como a seguir.

Estratégia de clonagem Os genes citados nos Exemplos

[00366] 1-7 aqui logo acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta (ORF) de comprimento total foi primeiro identificado. No caso de clusters ORF-EST e em alguns casos já publicados, as sequências de mRNA foram analisadas para identificar todo o quadro de leitura aberta por comparação dos resultados de vários algoritmos de translação a proteínas conhecidas de outra espécie de planta. Para clonar os cDNAs de comprimento total, a transcrição reversa (RT) seguida da reação em cadeia de polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído de folhas, flores, síliquas ou outros tecidos de planta, cultivadas sob condições tratadas diferentes e normais. O RNA total foi extraído conforme descrito em “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA” acima. A produção de cDNA e a amplificação de PCR foram realizadas utilizando protocolos padrão descritos (Sambrook J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. O Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) o qual é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Os produtos da PCR são purificados utilizando o kit de purificação por PCR (Qiagen). No caso em que toda a sequência de codificação não foi encontrada, o kit RACE da Invitrogen (RACE = R apid A mplification of cDNA E nds) [Rápido Acesso às Extremidades de cDNA] foi utilizado para acessar a transcrição completa do cDNA do gene a partir das amostras de RNA descritas acima. Os produtos do RACE foram clonados em vetor de alta cópia seguido de sequenciamento ou sequenciados diretamente.

[00367] As informações do procedimento RACE foram utilizadas para clonagem de todo o comprimento ORF dos genes correspondentes.

[00368] Caso o DNA genômico tenha sido clonado, os genes foram amplificados por PCR direta em DNA genômico extraído do tecido de folha utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104).

[00369] De modo geral, 2 conjuntos de primers foram sintetizados para a amplificação de cada gene de um cDNA ou de uma sequência genômica; um conjunto externo de primers e um conjunto interno (primers PCR em ninho). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação PCR não resulta em um produto satisfatório para o sequenciamento), outro primer (ou outros dois) dos primers PCR em ninho foram utilizados.

[00370] Para facilitar a clonagem dos cDNAs/ sequências genômicas, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada ao 5’ de cada primer. A extensão do primer inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a). O local não existe na sequência de cDNA; e (b). Os sítios de restrição nos primers anteriores e posteriores foram projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na for-mação sense no vetor binário utilizado para a transformação.

[00371] Cada produto de digestão de PCR foi inserido em um vetor de alta cópia pUC19 (New England BioLabs Inc], ou em plasmídeos originados deste vetor. Em alguns casos, o produto não digerido de PCR foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

[00372] O sequenciamento dos produtos PCR amplificados foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Em alguns casos, após a confirmação das sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi intruduzido em um vetor binário pGI contend o promoter At6669 por digestão com as endonucleases de restrição apropriadas. Em qualquer caso, a inserção foi seguida de uma cópia simples do terminador NOS (N.° Ident. da Sequência: 8092). Os produtos digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado são ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça).

[00373] Plasmídeos de alta cópia contendo os genes clonados foram digeridos com endonucleases de restrição (New England Biolabs Inc) de acordo com os locais designados nos primers e clonados em vetores binários de acordo com a Tabela 32, abaixo.

[00374] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas por um fornecedor comercial, a saber, GeneArt, GmbH [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) geneart (dot) com/)]. O DNA sintético foi projetado em silico. Locais adequados de restrição de enzimas foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para possibilitar a clonagem posterior nos vetores binários pQFN a jusante do promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência: 4668).

[00375] Vetores binários utilizados para clonagem: O pPI plasmídeo é construído por meio da inserção de uma sequência de sinais poli-(A) sintéticos, provenientes de vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-481 1) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101,3 (Clontech, Acc. No. U12640). O pGI (pBXYN) é semelhante ao pPI, entretanto o gene original na espinha dorsal, o gene GUS, é substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (N.° Ident. da Sequência: 4664) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). O pGI foi utilizado no passado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 February 1985); N.° Ident. da Sequência: 4666].

[00376] O vetor pGI modificado [pQXYNc (Figura 8), ou pQFN (Figura 2), pQFNc ( Figura 2) ou pQYN_6669 (Figura 1) são versões modificadas do vetor pGI em que o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, de modo que o gene e seu promotor correspondente estão próximos da borda direita e o gene NPTII está próximo da borda esquerda.

[00377] At6669, a sequência promotora do Arabidopsis thaliana (N.°Ident. da Sequência: 4668) foi inserida no vetor binário modificado pGI, a montante dos genes clonados, seguida pela ligação de DNA e extração de plasmídeo binário de colônia positivas de E. coli, conforme descrito acima.

[00378] As colônias foram analisadas por PCR utilizando os primers cobrindo a inserção, que foram projetados para abranger o promotor e o gene introduzidos. Plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00379] Os genes que foram clonados pelos presentes inventores são apresentados na Tabela 32 abaixo. Tabela 32Genes clonados em plasmídeos de número de alta cópia

Tabela 32. São fornecidos os genes que foram clonados em plasmídeos de alta cópia, junto com os primers utilizados para a clonagem, os organismos dos quais os genes foram clonados e as sequências de polinucleotídeos (“polyn.”) e polipeptídeos (“polyp.”) resultantes dos genes clonados.

EXEMPLO 9 TRANSFORMANDO CÉLULAS AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO GENES PUTATIVOS

[00380] Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 8 acima foram utilizados para transformar células Agrobacterium. Duas construções binárias adicionais, possuindo um gene repórter GUS/luciferase substituir o gene selecionado (posicionado a jusante do promotor At6669), são utilizados como controles negativos.

[00381] Os vetores binários foram introduzidos às Agrobacterium tumefaciens GV301, ou células competentes LB4404 (cerca de 109 células/mL) por eletroporação. A eletroporação foi realizada utilizando um electroporator MicroPulser (BioRad), cubetas 0,2 cm (BioRad) e programa de eletroporação EC-2 (BioRad). As células tratadas foram cultivadas em meio LB líquido a 28 °C por 3 horas, então postas em ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para as cepas de Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepas de Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28 °C por 48 horas. Colônias de Abrobacterium que se desenvolveram no meio seletivo foram analisados por PCR utilizando os primers que foram projetados para abranger a sequência inserida no pPI plasmídeo. Os produtos resultantes da PCR foram isolados e sequenciados como descrito no Exemplo 8 acima, para verificar que as sequências corretas de nucleotídeo foram devidamente introduzidas às células Agrobacterium.

EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS TRANSGÊNICAS EXPRESSANDO GENES SELECIONADOS DE ACORDO COM ALGUMAS APLICAÇÕES DA INVENÇÃO Materiais e Métodos Experimentais

[00382] Transformação da planta - A Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas T0) foram transformadas de acordo com o procedimento Floral Dip [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Tecidos reprodutivos femininos são os alvos principais da transformação em meio de Agrobacterium em Arabidopsis pelo método floral-dip. Plant Physiol. 123(3): 895-904] com pequenas modificações. Resumidamente, as plantas Arabidopsis thaliana Columbia (Col0) T0 foram semeadas em vasos de 250 ml preenchidos com mix de crescimento úmido à base de turfa. Os vasos foram cobertos com folha de papel alumínio e uma cobertura plástica, mantidos a 4 °C por 3 a 4 dias, e então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24 °C em ciclos de 16/8 horas de luz/escuro. As plantas T0 estavam prontas para a transformação seis dias antes da antese.

[00383] Colônias individuais de Agrobacterium carregando os vetores binários que abrigam os genes de rendimento foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28 °C por 48 horas sob vigorosa agitação e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os grânulos compreendendo células de Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação que continha meia potência (2,15 g/L) de Murashige-Skoog (Duchefa); benzilaminopurina 0,044 μM (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); sacarose a 5%; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água bidestilada em pH de 5,7.

[00384] A transformação de plantas T0 foi realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o tecido da planta acima do solo ficasse submerso por 3 a 5 segundos. Cada planta T0 inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja plástica, e então coberta com uma tampa de plástico transparente para manter a umidade e foi mantida no escuro em temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas T0 transgênicas foram cultivadas em uma estufa por 3 a 5 semanas até que as síliquas estivessem marrons e secas, e então as sementes foram colhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiente até a semeadura.

[00385] Para gerar plantas transgênicas T1 e T2 contendo os genes, as sementes coletadas de plantas T0 transgênicas tiverem a superfície esterilizada por embebimento em etanol a 70% por 1 minuto, seguida do embebimento em hipoclorito de sódio a 5% e triton a 0,05% por 5 minutos. As sementes com superfície esterilizada foram totalmente lavadas em água destilada estéril e então colocadas em placas de cultura contendo meia potência de Murashig- Skoog (Duchefa); sacarose a 2%; ágar de planta a 0,8%; canamicina 50 mM; e carbenicilina 200 mM (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4 °C por 48 horas e então transferidas para uma sala de crescimento a 25 °C por mais uma semana de incubação. As plantas Arabidopsis T1 vitais foram transferidas para placas de cultura fresca para mais uma semana de incubação. Após a incubação, as plantas T1 foram retiradas das placas de cultura e plantadas em mix de crescimento contido em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa até a maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e cresceram até a maturidade assim como as plantas T2 sob as mesmas condições de cultivo e crescimento das plantas T1.

EXEMPLO 11 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICO PARA PRODUÇÃO DE SEMENTES E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA (GH -SM Ensaios)

[00386] Ensaio 1: Produção de sementes, biomassa da planta e taxa de crescimento da planta sob condições normais de estufa - Este ensaio segue a produção da produção de sementes, a formação da biomassa e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas em estufa em condições de crescimento não limitantes de nitrogênio. As sementes transgênicas de Arabdopsis foram semeadas em um meio de ágar suplementadas com meio V2 MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litros com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo 6 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes amadurecerem. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa restante da planta (o tecido acima do solo) também foi colhido e pesado imediatamente ou após a secagem no forno a 50 ° C por 24 horas.

[00387] Cada construção foi validada como sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma construção conformada por um vetor vazio transportando o promotor At6669 e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.

[00388] As plantas foram analisadas quanto ao tamanho geral, taxa de crescimento, florescimento, rendimento de semente, peso de 1000 sementes, matéria seca e índice de colheita (IC - rendimento de semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas é comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Mock- plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou até mesmo com nenhum gene, foram utilizados como controle sob o mesmo promotor.

[00389] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes em nichos [nested] randomizados. Para cada gene da invenção 3 de cada 5 eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construção.

[00390] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, o qual consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acompanhada de uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S series), instalada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui quatro unidades de luz (4 x lâmpadas de 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de plantas.

[00391] O processo de captura de imagens foi repetido a cada dois dias a partir do 1 ° dia após o transplantio até o dia 15. A mesma câmera, posicionada em uma moldura de ferro customizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serrada em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas têm sua forma quadrada e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras.

[00392] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00393] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, a área da roseta, o diâmetro da roseta, e a área do limbo da folha.

[00394] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) do número da folha [fórmula X (descrito acima)], área da roseta (fórmula XII), cobertura do canteiro (fórmula XIII) e do índice da colheita (fórmula IV) foi calculada com as fórmulas indicadas.Fórmula XII:Taxa de crescimento relativo da área rosácea = coeficiente de regressão da área rosácea ao longo do curso do tempo.Fórmula XIII:Taxa de crescimento relativo da cobertura plana = coeficiente de regressão da cobertura plana ao longo do curso do tempo.

[00395] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e foi tirada uma foto. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00396] Peso seco de plantas e rendimento de sementes - Em cerca de 80 dias após a semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30 °C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso das sementes de cada lote foi medido e dividido pelo número de plantas em cada lote. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 30°C em uma câmara de secagem; rendimento de semente por planta = peso total da semente por planta (g). Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g ).

[00397] O índice de colheita (IC) foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima.

[00398] Percentual de óleo nas sementes - No final do experimento todas as sementes de cada canteiro foram coletadas. Sementes de 3 canteiros foram misturadas e trituradas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n- Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como solvente. A extração foi realizada por 30 horas com temperatura média de 50 °C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador sob 35 °C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler’s) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a NMR de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a NMR de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00399] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada canteiro foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas eram verde-amarelas e foram coletadas das partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.

[00400] Análises estatísticas - Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

[00401] As Tabelas 33-37 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas expressando exógenamente as construções gênicas utilizando os GH -SM Ensaios.Tabela 33Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 33. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 34Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 34. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 35Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 35. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. RGR = taxa de crescimento relativo. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 36Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 36. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento;"p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 37Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 37. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Ensaio 2: Melhora do desempenho da planta medido até a fase de alongamento dos entrenós: biomassa vegetal e taxa de crescimento vegetal sob condições normais de estufa (GH -SB Ensaios) - Este ensaio segue a formação de biomassa vegetal e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas em estufa sob condições de crescimento normais. As sementes transgênicas de Arabdopsis foram semeadas em um meio de ágar suplementadas com meio V2 MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litros com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo de 6 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes amadurecerem. A biomassa da planta (o tecido acima do solo) foi pesada diretamente após a colheita da roseta (peso fresco da planta [Peso Fresco]). Em seguida, as plantas foram secas em um forno a 50 °C por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [Peso Seco]).

[00402] Cada construção foi validada como sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma construção conformada por um vetor vazio transportando o promotor 35S e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.

[00403] As plantas foram analisadas pelo seu tamanho geral, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas é comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Mock- plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou até mesmo com nenhum gene, foram utilizados como controle sob o mesmo promotor.

[00404] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes em nichos [nested] randomizados. Para cada gene da invenção 3 de cada 5 eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construção.

[00405] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, o qual consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acompanhada de uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S series), instalada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui quatro unidades de luz (4 x lâmpadas de 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de plantas.

[00406] O processo de captura de imagens foi repetido a cada dois dias a partir do 1 ° dia após o transplantio até o dia 15. A mesma câmera, posicionada em uma moldura de ferro customizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serrada em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas tinham sua forma quadrada e incluíam bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras.

[00407] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00408] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, a área da roseta, o diâmetro da roseta, e a área do limbo da folha.

[00409] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) do número da folha [Fórmula X (descrita acima)], área da roseta (fórmula XII, descrita acima) e cobertura do canteiro (Fórmula XIII, descrita acima) é calculada com as fórmulas indicadas.

[00410] Peso Fresco e Seco da Planta - Por volta do dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e colocadas em uma câmara de secagem a 50 °C por 48 horas para secagem antes da pesagem para determinar o peso seco da planta (DW).

[00411] Análises estatísticas - Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados Experimentais:

[00412] Os genes listados nas Tabelas 38-42 melhoraram o desempenho da planta quando cultivadas em condições normais. Estes genes produziram plantas maiores com uma maior área fotossintética e biomassa (peso fresco, peso seco, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura da parcela). Os genes foram clonados sob a regulação de um constitutivo (At6669; Ident. da Sequência N.°:4668). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes.

[00413] As Tabelas 38-42 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas expressando as construções gênicas utilizando os GH -SB Ensaios.Tabela 38Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 38. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 39Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 39. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento;"p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 40Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 40. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento;"p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 41Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 41. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 42Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 42. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento;"p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).

EXEMPLO 12 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICO SOB CONDIÇÕES NORMAIS UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO [CULTURA DE TECIDO T2 E T1 PLANTAS, TC -T2 E TC-T1 ENSAIOS]

[00414] As sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em meio basal [50 % meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente solidificante] na presença de canamicina (utilizada com um agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4 °C e então cultivadas a 25 °C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Neste ponto, plântulas selecionadas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo meio Q MS (15 mM de N). Para experimentos realizados em linha T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicatas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro ou cinco eventos independentes de transformação foram analisados de cada construção. Para experimentos realizados em linha T1, cada placa continha 5 mudas de 5 eventos transgênicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (replicatas) foram plantadas. No total, para linha Ti, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.

[00415] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que inclui 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para a captura de imagens de pequenas plantas semeadas em placas de ágar quadradas.

[00416] O processo de captação de imagem foi repetido a cada 3-4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (vide, por exemplo, as imagens nas Figuras 3A-F). Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem com base em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00417] Análise da muda - Por meio de análise digital, os dados da muda foram calculados, incluindo a área foliar, a cobertura de raiz e o comprimento da raiz.

[00418] A taxa de crescimento relativo para os diversos parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas XIV, VI (descrita acima) e XV.Fórmula XIVTaxa de crescimento relativo da área área foliar = coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso do tempo.Fórmula XV:Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do tempo.

[00419] Ao final do experimento, as pequenas plantas foram retiradas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As pequenas plantas foram então secas por 24 horas a 60 °C e novamente pesadas para medição do peso seco da planta para posterior análise estatística. Os pesos seco e fresco são fornecidos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada comparando a cobertura da área da folha, a cobertura da raiz e o comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados foram utilizados para determinar o efeito do gene introduzido no vigor da planta sob condições ideais. De forma semelhante, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando o peso fresco e seco da planta ao das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada construção criada, 3 a 5 eventos independentes de transformação foram examinados em replicatas.

[00420] Análises estatísticas - Para identificar os genes conferindo tolerância significativamente maior ao vigor da planta ou maior arquitetura de raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados aos obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene em relação a um controle, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor de p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos para p <0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados Experimentais:

[00421] As Tabelas 43-45 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas expressando as construções gênicas utilizando os TC -T2 Ensaios.

[00422] Os genes apresentados na Tabela 43 mostraram uma melhora significativa uma vez que produziram uma biomassa vegetal maior (peso fresco e peso seco da planta) na geração T2 quando cultivados sob condições de crescimento normais, comparado a plantas controle. Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669, Ident. da Sequência N.°:4668).

[00423] A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Os resultados obtidos nesses segundos experimentos também foram significantemente positivos. Tabela 43Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 43. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).

[00424] Os genes apresentados nas Tabelas 44 e 45 demonstraram uma melhora significante no desempenho da planta, já que elas produziram uma maior biomassa da folha (área da folha) e biomassa da raiz (comprimento e cobertura da raiz) (Tabela 44) e uma taxa de crescimento relativo mais alta da área da folha, cobertura e comprimento da raiz (Tabela 45) quando cultivadas sob condições de crescimento normais, comparadas a outras plantas. Plantas que produzem maior biomassa de raiz têm melhores possibilidades de absorver uma grande quantidade de nitrogênio do solo. Plantas que produzem maior biomassa de folha têm melhor capacidade de produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Esse segundo experimento confirmou a significante melhora no desempenho da folha e da raiz. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes.Tabela 44Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 44. "CONT." - Controle; "Ave." - Média; "% Incr." = % aumento; "p- val." - valor p, L- p<0,01.Tabela 45Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 45. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668). Resultados das plantas T1

[00425] Os genes apresentados nas Tabelas 46-48 mostraram uma melhora significativa na biomassa vegetal e desenvolvimento da raiz uma vez que produziram uma biomassa maior (peso seco e fresco, Tabela 46), uma biomassa foliar e radicular maior (área foliar, comprimento da raiz e cobertura radicular) (Tabela 47), e uma maior taxa de crescimento relativo da área de folhas, cobertura radicular e comprimento da raiz (Tabela 48) quando cultivados sob condições normais, comparado com plantas controle. Plantas que produzem maior biomassa de raiz têm melhores possibilidades de absorver uma grande quantidade de nitrogênio do solo. Plantas que produzem maior biomassa de folha têm melhor capacidade de produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669; Ident. da Sequência N.°:4668). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Esse segundo experimento confirmou a significante melhora no desempenho da folha e da raiz. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes.

[00426] As Tabelas 46-48 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas expressando as construções gênicas utilizando os TC -T1 Ensaios.Tabela 46Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 46. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p- val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência4668).Tabela 47Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 47. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência 4668).Tabela 48Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor At6669

Tabela 48. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p- val." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob a regulação transcripcional do novo promotor At6669 (N.° Ident. da Sequência4668).

[00427] Estes resultados demonstram que os polinucleotídeos da invenção são capazes de melhorar a produção e traços de grande valor agrícola adicionais tais como aumento de biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, produção, vigor, produção e/ou qualidade das fibras. Assim, plantas transformadas apresentando peso fresco e seco melhorados demonstram a capacidade do gene de melhorar a biomassa, um traço chave de safras para forragem e produtividade vegetal; plantas transformadas apresentando melhora de produção de sementes demonstram a capacidade dos genes de melhorar a produtividade vegetal; plantas transformadas apresentando melhora na cobertura da parcela e diâmetro da roseta demonstram a capacidade dos genes de melhorar a resistência da planta à estiagem uma vez que reduzem a perda de água do solo por evaporação simples e reduzem a competição com ervas daninhas; portanto reduzem a necessidade da utilização de herbicidas para controle de ervas daninhas. Plantas transformadas apresentando melhora da taxa de crescimento relativo de diversos órgãos (folha e raiz) demonstram a capacidade do gene de promover crescimento vegetal e portando encurtar o período de crescimento necessário e/ou alternativamente melhorar a utilização da água e dos nutrientes disponíveis levando a um aumento da produtividade da terra; Plantas transformadas apresentando melhora de número de órgãos como demonstrado pelo parâmetro número de folhas exibem um potencial para melhorar a produção de biomassa safras importante para forragem e melhorar a produtividade vegetal; Plantas transformadas apresentando comprimento e cobertura radiculares aumentados demonstra a capacidade do gene de melhorar a resistência à estiagem e utilizar melhor os fertilizantes uma vez que as raízes podem alcançar um maior volume de solo; Plantas transformadas apresentando melhoria da área relativa do pecíolo e área da lâmina foliar demonstram a capacidade dos genes de lidar com intensidades limitadas de luz resulta do aumento das densidades populacionais vegetais e assim melhoram a produtividade da terra.

[00428] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as aplicações específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão óbvias àqueles com conhecimento na técnica. Coerentemente, a intenção é englobar todas as alternativas, modificações e variações que caem dentro do espírito e do amplo escopo das reivindicações em anexo.

[00429] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são incorporados aqui em sua totalidade por meio de referência na especificação, na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual tivesse sido especificamente e individualmente indicada para ser incorporado aqui por referência. Além disso, qualquer citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser vista como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitado.LEGENDA DAS FIGURAS:Figuras 1T1) borda esquerdaT2) borda direita T3) promotor de síntase nopalinaT4) gene de neomicia fosfotransferaseT5) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilaçãoT7) local de clonagem múltiplaT8) gene intron de GUS [beta-glucuronidase]T9) enzima de restriçãoT10) PQYN - 6609Figura 2T1) borda esquerdaT2) borda direitaT3) promotor de síntase nopalinaT4) gene de neomicia fosfotransferaseT5) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilaçãoT7) local de clonagem múltiplaT9) enzima de restriçãoT11) pQFN,pQFNcFiguras 3A, 3B e 3CT12) Condições normaisT13) Estresse osmótico (15% DE PEG)T14) Condições de nitrogênio limitantesFigura 4T1) borda esquerdaT2) borda direitaT3) promotor de síntase nopalinaT4) gene de neomicia fosfotransferaseT5) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilação T7) Local de clonagem múltiplaT9) enzima de restriçãoT15) Promotor de RaizT16) pQNa_RPFigura 5T1) borda esquerdaT2) borda direitaT3) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilaçãoT16) gene de neomicia fosfotransferase ORFT17) promotor de NOST18) Local de inversãoT19) 2.° intron (IV2) do gente ST-LS1T20) tDNA invertidoT21) gene intron de GUS [beta-glucuronidase] ORFT22) ver comp de pQYN Tdna 5714bpFigura 6T1) borda esquerdaT2) borda direitaT5) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilaçãoT16) gene de neomicia fosfotransferase ORFT17) promotor de NOST18) Local de inversãoT20) tDNA invertidoT23) promotor de 6669 Cid506T24) Cassete de inserçãoT25) PQFN 5967bpFigura 7 T1) borda esquerdaT2) borda direitaT3) terminador de síntase nopalinaT6) sinal de poliadenilaçãoT16) gene intron de GUS [beta-glucuronidase] ORFT17) promotor de NOST18) Local de inversãoT19) 2.° intron (IV2) do gente ST-LS1T20) tDNA invertidoT21) gene de neomicia fosfotransferase ORFT23) promotor de 6669 Cid506T26) Inserção de GUS+NOSTerT27) PQFYN 8004 bpFigura 8T1) borda esquerdaT2) borda direitaT3) promotor de síntase nopalinaT4) gene de neomicia fosfotransferaseT5) terminador de síntase nopalinaT7) local de clonagem múltiplaT9) enzima de restriçãoT28) PQNXc

Claims

1. Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende(a) transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo definido por uma sequência de ácido nucleico estabelecida na:(i) SEQ ID NO: 328, que codifica um polipeptídeo definido por uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 745, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 745, ou(ii) SEQ ID NO: 45, que codifica um polipeptídeo caracterizado pela sequência de aminoácidos apresentada pela SEQ ID NO: 525, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 525, e(b) gerar uma planta madura a partir da referida célula vegetal, aumentando assim a produção, biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 328, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 745, ou suas sequências degeneradas que codificam o referido polipeptídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 328 e 45.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é apresentada pela SEQ ID NO: 328.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ainda selecionar a referida planta madura regenerada transformada com o referido polinucleotídeo exógeno para um aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor em comparação com uma planta de controle da mesma espécie nas mesmas condições de crescimento.

8. Construto de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico como definida na:(i) SEQ ID NO: 328, que codifica um polipeptídeo definido pela sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 745, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 745, ou(ii) SEQ ID NO: 45, que codifica um polipeptídeo definido pela sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 525, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 525,e um promotor heterólogo não associado nativamente ao referido polinucleotídeo para direcionar a transcrição da referida sequência de ácido nucleico em uma célula vegetal.

9. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 328, que codifica um polipeptídeo definido pela sequência de aminoácido estabelecida pela SEQ ID NO: 745, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo.

10. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 328 e 45.

11. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NOs: 328.

12. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.