CN112851780B - OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用,属于植物生物技术领域。OsLPS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的水稻早衰OsLPS1基因及其突变体在影响水稻衰老和响应外源激素方面具有广阔的应用前景,通过研究激素在水稻衰老中的遗传调控机制,为培育耐早衰优质高产的农作物提供基础。

Description

OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域,更具体的说是涉及OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用。
背景技术
水稻生长发育的过程是其不断对抗、适应生物胁迫和非生物胁迫等不利环境的过程,而植物激素在调节生长发育、参与植物抗逆性方面有着不可缺少的作用,其可以由外界环境胁迫诱导产生,在植物体内往往以低水平调节各种生理反应,这对于保障水稻的生存及生长发育有着极其重要的意义。
植物的衰老是植株在生长发育最后阶段自发启动的一种程序性细胞死亡过程,这一过程由基因控制并受内部外部环境因素影响和诱导;其中包括植物内源激素、遗传和基因调控以及外界环境等影响,这些因素相互联系又相互制约,构成了一个复杂的调控网络。
目前水稻衰老相关基因的研究多集中于定位与功能等方面,对于衰老的分子机理以及激素参与水稻衰老的调控机制并不清楚。因此,需要进一步地深入研究,以揭示激素在水稻衰老中的调控机制,为水稻优质品种的选育奠定基础。
发明内容
有鉴于此,本发明对水稻早衰OsLPS1基因及其突变体进行研究,其在水稻衰老以及响应外源激素胁迫方面表现出显著影响。
本发明采用如下技术方案:
水稻早衰OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用,
OsLPS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
OsLPS1基因突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
上述突变体与OsLPS1基因相比,第566位核苷酸G突变为A,导致编码的氨基酸序列提前终止。该突变体使水稻从三叶期就表现出叶黄的早衰表型,在成熟期还表现出株高、有效分蘖、结实率和千粒重显著降低的现象;其与OsLPS1基因在响应外源激素方面表现出显著差异。
进一步地,响应外源激素为响应外源激素胁迫。
优选地,外源激素为茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)或脱落酸(AbscisicAcid,ABA)。
进一步地,通过以下至少一种方式响应外源激素胁迫:
(1)抑制或促进地上部分长度;
(2)抑制或促进地下部分长度;
(3)上调或下调脱落酸合成及代谢相关基因的表达水平;
(4)上调或下调OsLPS1基因在胁迫前后的表达水平。
进一步地,脱落酸合成及代谢相关基因包括OsABA1、OsABA2、OsABA3、OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3、OsNCED5、OsZEP、OsZDS、OsABA80x1、OsABA80x2或OsABA80x3。
水稻早衰OsLPS1基因及其突变体对外源激素的响应作用在水稻品种选育中的应用,OsLPS1基因及其突变体如上所述。
进一步地,可以分别对待筛选水稻样本、含OsLPS1基因的水稻、含OsLPS1基因突变体的水稻进行组织培养,培养过程中进行外源激素胁迫,对比水稻对外源激素胁迫的响应结果,以筛选耐早衰优质高产水稻品种。
由于优质水稻品种筛选过程中还需要考虑水稻产量、抗逆性等多种因素,实验较为繁琐,因此,充分利用水稻早衰OsLPS1基因及其突变体对外源激素的响应作用进行组培筛选,有利于缩短筛选周期,提高筛选效率。
进一步地,可以利用基因工程的方法对水稻早衰OsLPS1基因及其突变体进行改造或对其表达水平进行调控,进而通过其对外源激素的响应作用筛选耐早衰优质高产水稻品种。
综上所述,本发明提供的水稻早衰OsLPS1基因及其突变体在影响水稻衰老和响应外源激素方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1所示为本发明所用突变体lps1的突变位点示意图;
图2所示为突变体lps1的表型特征;
A:野生型“龙粳31”与突变体lps1三叶期表型;
B:野生型“龙粳31”与突变体lps1三叶期叶片表型;
C:野生型“龙粳31”与突变体lps1分蘖期表型;
D野生型“龙粳31”与突变体lps1成熟期表型;
图3所示为野生型“龙粳31”及突变体lps1材料在MeJA胁迫下的生长情况(A)以及胁迫前后对野生型“龙粳31”与突变体lps1株高(B)和根长(C)的影响;
图4所示为野生型“龙粳31”以及突变体lps1材料在ABA胁迫下的生长情况(A)以及胁迫前后对野生型“龙粳31”与突变体lps1株高(B)和根长(C)的影响;
图5所示为ABA胁迫前后野生型“龙粳31”及突变体lps1中ABA合成和代谢相关基因表达水平;
A:胁迫前;B:胁迫后;
图6所示为ABA胁迫前后野生型“龙粳31”和突变体lps1中OsLPS1基因的表达水平。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1水稻突变体lps1材料的获得
以粳稻品种“龙粳31”野生型为原材料,进行EMS(ethyl methane sulphonate)化学诱变:用清水将待处理的野生型“龙粳31”干种子浸种8-10小时,沥干后在28℃条件下,用浓度为1.5%的EMS溶液浸泡待处理种子10小时,用自来水冲洗10-12小时,最后放入到37℃烘箱内催芽。
对诱变处理后的材料进行自交,从而获得M2代。
M2代突变库中筛选到一早衰突变体,后经多代自交,发现该突变体的早衰表型能稳定遗传,并获得纯合的突变体株系,将其命名为lps1。
提取突变体lps1的基因组DNA,分别用lps1-867F(cggccaaaattatagctgga)和lps1-2260R(atgggcaggaactggtagtg),lps1-2162F(gacttgcatgacagcaggaa)和lps1-3642R(acaacggcattgtttcaggt),lps1-3461F(tcggtcacaacatcaaatcc)和lps1-4868R(gattgcgagggaagtctctg),lps1-4572F(ccgctggcatctaccattat)和lps1-6020R(acaccaggaagtccagaacg),lps1-5762F(ttcttaggataggcgcactga)和lps1-7249R(ctgcccctgtttggataaga),lps1-7056F(gctcatggttaagcatttacagc)和lps1-8486R(cgtgggagaagaggagctta),lps1-8322F(gccggaaagaaaccaaattc)和lps1-9047R(aagtggcaggagcaaacagt)组成的引物对进行PCR鉴定,并进行序列比对。
如图1所示,与野生型“龙粳31”的基因组DNA相比,突变体lps1仅在第一个外显子上有一个单碱基的替换,即OsLPS1基因第566bp的G替换为A,导致其编码的氨基酸序列提前终止。其中,野生型“龙粳31”的OsLPS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;突变体lps1的OsLPS1基因突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2水稻植株表型分析
比较野生型“龙粳31”与突变体lps1水稻植株表型,从三叶期开始就出现叶片发黄的表型(图2A,2B),随着植株不断地生长发育,其叶片发黄的面积逐渐增多,但叶基部一直保持绿色(图2C),这种表型一直持续到成熟期(图2D)。除此之外,成熟期还表现出株高、有效分蘖、结实率和千粒重等显著降低的现象(表1)。
表1野生型与突变体lps1的主要农艺性状比较
实施例3外源激素胁迫试验
选取籽粒饱满的水稻种子(野生型“龙粳31”和突变体lps1),去壳后,用70%的酒精消毒2min,再用30%的次氯酸钠溶液消毒30min,然后用蒸馏水冲洗干净,接种于含有0、2.5μM、5μM MeJA或0.2μM、0.25μMABA的1/2MS培养基上,放在人工气候培养箱中培养10d,分别统计株高和根长,每组3个重复。培养箱设置条件为光照/黑暗(14h/10h),温度为30℃,湿度为70%。
培养10d后,对水稻幼苗进行采样,用无菌水将残留的培养基清洗干净,测定水稻幼苗的株高和根长,每组6个重复。
另外,利用植物总RNA提取试剂盒(Axygen),提取所采样水稻的总RNA,将1μg总RNA利用cDNA反转录试剂盒(TOYOBO)逆转录cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)及表2中的引物进行实时荧光定量PCR,检测ABA相关基因及OsLPS1基因的表达水平,以水稻Actin为内参基因。
表2实时定量引物序列表
试验结果:
1.对MeJA胁迫的生理响应
如图3所示,在无MeJA胁迫的情况下,突变体lps1与野生型的株高和根长差异均不显著;在2.5μM MeJA胁迫下野生型的株高和根长为无MeJA胁迫的85%和54%,而突变体lps1的株高和根长分别为无MeJA胁迫的61%和37%;在5μM MeJA胁迫下野生型的株高和根长为无MeJA胁迫的66%和42%,而突变体lps1的株高和根长分别为无MeJA胁迫的50%和43%;不同浓度的MeJA胁迫条件下,突变体lps1的株高和根长均被显著抑制,表现出对MeJA显著的超敏表型。结果表明,抑制OsLPS1基因的表达可以增强幼苗对MeJA的不耐受性。
2.对ABA胁迫的生理响应
如图4所示,在0.2μMABA胁迫下野生型的株高和根长为无ABA胁迫的52%和90%,而突变体lps1的株高和根长分别为无ABA胁迫的41%和160%;在0.25μM ABA胁迫下野生型的株高和根长为无ABA胁迫的47%和76%,而突变体lps1的株高和根长分别为无ABA胁迫的34%和93%;不同浓度的ABA胁迫显著抑制了突变体lps1的株高,但是在0.2μMABA胁迫下,突变体lps1的根长明显伸长;随着ABA胁迫浓度的升高,其根长又被显著抑制。说明OsLPS1基因的突变可以在一定条件下增强水稻幼苗根对ABA的耐受性。
3.ABA胁迫下突变体lps1中ABA生物合成和代谢相关基因的变化
如图5所示,在ABA胁迫前,与野生型相比,突变体lps1中与ABA合成相关基因OsABA1、OsABA3、OsNCED1、OsNCED3、OsNCED5、OsZEP和OsZDS的表达量显著下调,与ABA代谢相关基因OsABA80x1和OsABA80x2的表达水平显著下调;在ABA胁迫后,突变体lps1中与ABA合成相关基因OsABA3、OsNCED1和OsZEP的表达水平显著上调,而OsNCED3的表达水平被下调,同时与ABA代谢相关基因OsABA80x1显著下调。
结果证实,在ABA胁迫前,突变体lps1中与ABA合成和代谢相关基因的表达受到抑制,而在ABA胁迫后,与ABA合成相关基因(OsABA3、OsNCED1、OsZEP)的表达水平被显著上调,说明OsLPS1基因突变后lps1突变体可以通过影响ABA合成途径响应外源ABA的处理。
4.ABA胁迫下OsLPS1基因的表达水平
如图6所示,在ABA胁迫前,突变体lps1中OsLPS1基因的表达水平显著降低,是野生型中OsLPS1基因表达量的0.3倍;在ABA胁迫后,突变体lps1中OsLPS1基因的表达水平显著上调,是野生型中OsLPS1基因表达量的5.7倍。结果证实,在ABA胁迫下lps1突变体中OsLPS1基因的表达被显著诱导。
综上所述,lps1突变体不但响应外源MeJA处理,还通过影响ABA合成途径响应外源ABA的处理;同时,在ABA的胁迫下,还显著诱导了OsLPS1基因在lps1突变体中的表达水平。因此,进一步研究OsLPS1基因的功能及作用机制,对于抵御水稻叶片衰老、提高水稻抗逆性具有重要意义,为培育具有高抗逆性的水稻新品种提供参考。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.一种水稻早衰OsLPS1基因在粳稻品种响应茉莉酸甲酯或脱落酸外源激素胁迫中的应用,其特征在于,OsLPS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所编码的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
2.权利要求1所述的应用在水稻品种选育中的应用。
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