BR112014029908B1

BR112014029908B1 - Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, e, construção de ácido nucléico

Info

Publication number: BR112014029908B1
Application number: BR112014029908-0A
Authority: BR
Inventors: Limor Poraty-Gavra; Ilya Pankratov; Hagay Karchi
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2022-02-15
Also published as: BR122021002082B1; MX2014014542A; BR122021002085B1; BR122021002088B1; AU2019200805A1; WO2013179211A1; US9834782B2; CA2873846A1; BR112014029908A2; AU2021203894A1; BR122021002092B1; BR122021002081B1; AU2019200805B2; US20210189413A1; AU2013269156B2; US20150167015A1; AU2013269156A1; US10982222B2; BR122021002102B1; US20210189412A1

Abstract

método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, método de produção de uma cultura, polinucleotídeo isolado, estrutura de ácido nucleico, polipeptídeo isolado, célula de planta e planta, são fornecidos polinucleotídeos isolados, polipeptídeos codificados respectivos, estruturas de ácido nucleico compreendendo os mesmos, células de plantas e plantas compreendendo os mesmos e métodos para geração de plantas com aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, resistência ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio, caracterizado pelos polinucleotídeos codificarem polipeptídeos, pelo menos, 80% idênticos à id seq. nº: 574 a 930, 6266 a 10549 ou 10550, tal como os polinucleotídeos estabelecidos na id seq. nº: 1 a 573 e 931 a 6265.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se aos polinucleotídeos e polipeptídeos isolados que podem aumentar a produção (por exemplo, biomassa, qualidade e/ou quantidade de grão, produção de sementes, produção de óleo), taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico (ABST| abiotic stress tolerance), eficiência no uso da água (WUE| water use efficiency), eficiência no uso de nitrogênio (NUE| nitrogen use efficiency) e/ou eficiência no uso de fertilizantes(FUE|fertilizer use efficiency) de uma planta.

[002] A produção é afetada por diversos fatores, tal como o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramificações), o comprimento estabelecido dos grãos, o número de grãos cheios, o vigor (por exemplo, a muda), a taxa de crescimento, o desenvolvimento da raiz, o uso de água, nutrientes (por exemplo, o nitrogênio) e fertilizantes e a tolerância ao estresse.

[003] Culturas como as do milho, arroz, trigo, canola e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica total humana, seja através do consumo direto de sementes ou através do consumo de produtos de carne de animais criados com sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açúcares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A capacidade de aumentar a produção da planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a celulose ou a composição da lignina, aumento da resistência do caule, aumento do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento da eficiência da fertilização, aumento da taxa de acúmulo de matéria seca da semente, modificação do desenvolvimento da semente, melhora do enchimento da semente ou o aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações na utilização agrícola e não agrícola como na produção biotecnològica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.

[004] Os óleos de semente ou vegetais sào a principal fonte de energia e nutrição na dieta humana e animal. Eles também são utilizados para a produção de produtos industriais, tais como pinturas, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos da planta representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa, os quais podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fósseis utilizados atualmente são fontes limitadas e estão sendo esgotadas gradualmente, as safras de biomassa de crescimento rápido podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou para matérias-primas de energia e podem reduzir a dependência dos fornecimentos de energia fóssil. No entanto, o obstáculo principal para o aumento do consumo de óleos de planta como biocombustível é o preço do óleo, o qual ainda é maia alto que o combustível fóssil. Além disso, a taxa de produção do óleo da planta é limitada através da disponibilidade de território agrícola e água. Desse modo, o aumento nas produções de óleo de planta da mesma área de crescimento pode superar efetivamente a escassez no espaço de produção e pode diminuir os preços do óleo vegetal ao mesmo tempo.

[005] Estudos que visam o aumento das produções de óleo de planta focam-se na identificação dos genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como em genes capazes de aumentar as produções de semente e planta nas plantas transgênicas. Genes conhecidos por estar envolvidos no aumento das produções de óleo de planta incluem aqueles que participam na síntese ou captura do ácido graxo, tal como desaturase [p.ex., DELTA6, DELTA12 ou acil-ACP (Ssi2; Fonte de Informação de Arabidopsis (TAIR; http://www (ponto] arabidopsis (ponto) org/J, TAIR N° AT2G43710)], OleosinA (TAIR N°. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR N°. AT2G29980) e vários fatores de transcrição e ativadores, tal como Led [TAIR N°. AT1G21970, Lotan et ai. 1998. Ceil. 26;93(7):1195-205], Lec2 [TAIR Nβ. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIR N°. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wril [TAIR N°. AT3G54320, Cernac and Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575- 65] .

[006] Esforços da engenharia genética que visam o aumento no teor de óleo nas plantas (p.ex., em sementes) incluem a regulação ascendente do retículo endoplasmático (FAD3) e plasitidal (FAD7), ácido graxo desaturase em batata (Zabrouskov V., et al., 2002; Physiol Plant. 116:172-185); superexpressando os fatores de transcrição GmDof4 e GmDofll (Wang HW et al., 2007; Plant J. 52:716-29); superexpressando glicerol-3-fosfato desidrogeπase em leveduras sob o controle de um promotor especifico de planta (Vigeolas H, et al. 2007, Plant Biotechnol J. 5:431-41; Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060168684); utilizando genes FAE1 de Arabidopsis e SICl-1 de leveduras para melhorias no ácido erúcico e teor de óleo em colza (Katavic V, et al., 2000, Biochem Soc Trans. 28:935-7).

[007] Diversos pedidos de patente revelam genes e proteínas que podem aumentar o teor de óleo em plantas. Estes incluem, por exemplo, o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20080076179 (proteína de metabolismo lipidico); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060206961 (polipeptídeo Yprl40w); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060174373 [síntese de triacilgliceróis que reforçam a proteína (TEP)]; os Pedidos de Patente Norte-Americana Ne 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943 (que revelam plantas transgênicas com aumento da eficiência no uso de nitrogênio que podem ser utilizadas para conversão em combustível ou matérias-primas químicas) e o W02008/122980 (polinucleotideos para aumento do teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou vigor de uma planta).

[008] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era, e continua sendo, o uso dos nutrientes naturais, bem como de nutrientes sintéticos (fertilizantes). Deste modo, os fertilizantes são o combustível por trás da "revolução verde", diretamente responsáveis pelo aumento excepcional do rendimento das culturas nos últimos 40 anos e considerados como a despesa geral número umi da agricultura. Por exemplo, fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio, tais como o nitrato de amónio, nitrato de potássio ou ureia, tipicamente correspondem a 40% dos custos associados às culturas, tais como o milho e o trigo. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N) , Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio frequentemente atua como elemento limitador da taxa no crescimento da planta e todas as áreas de cultura têm uma dependência fundamental dos fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio. 0 nitrogênio é responsável pela biossintese do amido e ácidos nucleicos, grupos protêticos, hormônios da planta, defesas químicas da planta, etc., e normalmente precisa ser reposto todo ano, particularmente para os cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Deste modo, o nitrogênio é trans locado para o broto, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta, e, por conseguinte, até que floresça. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o volume de seu nitrogênio orgânico durante o período da germinação do grão e até que floresça. Uma vez que a fertilização da planta ocorre, os grãos começam a se formarem e a se tornarem o receptáculo principal do nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser, então, redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram como compartimentos de armazenagem até a formação do grão.

[009] Como o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido às culturas em crescimento duas ou três vezes durante a época de crescimento. Além disso, a baixa eficiência no uso de nitrogênio (NUE) das principais culturas (p.ex., na faixa de somente 30-70%) afeta de modo negativo as despesas de investimento do fazendeiro por conta do excesso de fertilizante aplicado. Além disso, os usos excessivos e ineficientes de fertilizantes são os principais fatores responsáveis por problemas ambientais, tais como eutrofização das águas subterrâneas, de lagos, rios e mares e poluição por nitrato em água potável, o que pode causar metemoglobinemia, poluição por fosfato, poluição atmosférica e similares. Contudo, a despeito do impacto negativo dos fertilizantes no meio ambiente e dos limites de uso de fertilizantes que foram controlados por lei em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente, a fim de apoiar a produção de alimentos e de fibras devido ao rápido crescimento populacional e aos recursos limitados da terra. Por exemplo, estima-se que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizantes a base de nitrogênio sejam utilizadas em todo o mundo por ano.

[0010] 0 aumento da eficiência no uso de nitrogênio pelas plantas deve viabilizar o cultivo das culturas com um investimento mais baixo em fertilizantes, ou, alternativamente, o cultivo em solos de qualidade inferior e, assim, ter um impacto econômico significativo tanto nos sistemas desenvolvidos de agricultura quanto nos sistemas em desenvolvimento.

[0011] O aprimoramento genérico da eficiência no uso de fertilizantes (FUE) nas plantas pode ser gerado ou através da reprodução tradicional ou por engenharia genética.

[0012] Tentativas de geração de plantas com FUE melhorada foram descritas no N° de Pedido de Patente Americano 20020046419, de Choo, et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20050108791, de Edgerton et al,; N° de Pedido de Patente Americano 20060179511, de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[0013] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:1833—8) descreve plantas transgênicas Dofl que apresentam um crescimento melhorado sob condições de baixo nível de nitrogênio.

[0014] O N° de Patente Americano 6.084.153, de Good et al. divulga o uso de um promotor sensível ao estresse para controlar a expressão da ALanina Aminotransferase (ALaAT I Alanine Amine Transferase) e das plantas de canola transgênica com resistência à seca e deficiência de nitrogênio melhorada quando comparadas às plantas de controle.

[0015] Condições de estresse abiótico (ABS I abiotic stress; também conhecido como "estresse ambiental") tais como salinidade, seca, inundação, temperatura subaproveitada e poluição química tóxica, causam danos substanciais às plantas agrícolas. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para se proteger contra essas condições. No entanto, se a gravidade e a duração das condições do estresse forem grandes demais, os efeitos no desenvolvimento da planta, no crescimento e na produção da maioria das espécies vegetais são profundos. Além disso, a maioria das espécies vegetais é altamente suscetível ao estresse abiõtico e, portanto, exigem condições de crescimento ideai para as safras da cultura comercial. A exposição continua ao estresse causa alterações importantes no metabolismo vegetal que em última análise, leva à morte celular e, consequentemente, gera perdas.

[0016] A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente secos que duram o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios, como danos á cultura, falta de abastecimento de água e aumento da suscetibilidade a várias doenças, Em casos graves, a seca pode durar muitos anos e resulta em efeitos devastadores na agricultura e abastecimento de água. Além disso, a seca está associada com o aumento da suscetibilidade a várias doenças.

[0017] Para a maioria das plantas de cultivo, as regiões de plantio do mundo são muito áridas. Além disso, o uso excessivo de água disponível resulta em maior perda de terra agrícola utilizável (desertificaçâo), e aumento da acumulação de sal em solos adiciona à perda de água disponível em solos.

[0018] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, i.e. trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as plantas resultam tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico {semelhante ao estresse causado pela seca), quanto do efeito do excesso de ions de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. A salinidade do solo, portanto, é uma das variáveis mais importantes que determinam se uma planta pode prosperar. Em muitas partes do mundo, áreas de terra consideráveis são incultiváveis devido à salinidade do solo ser naturalmente alta. Assim, a salinização dos solos que são usados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente nas regiões que dependem fortemente da agricultura e está a agravar-se pelo excesso de utilização, excesso de fertilização e escassez de água, geralmente causado por alterações climáticas e pelas demandas do aumento da população. A tolerância ao sal é de particular importância no início do ciclo de vida da planta, já que a evaporação da superfície do solo faz com que o movimento ascendente de água e sal se acumule na camada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Por outro lado, a germinação normalmente ocorre em uma concentração de sal que é maior do que o nível médio de sal em todo o perfil do solo.

[0019] A transdução do sinal de estresse do sal e da seca consiste em caminhos de sinalização da homeostase iônica e osmótica. O aspecto iónico do estresse do sal é sinalizado através do caminho SOS, onde um complexo de quinase de proteína SOS3-SOS2 responsiva a cálcio controla a expressão e a atividade dos transportadores de ions, como o SOS1. O componente osmótico do estresse de sal envolve reações complexas da planta que se sobrepõem com respostas de estresse da seca e/ou do frio.

[0020] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrosa da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. 0 calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, p.ex., as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. 0 dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, p.ex., temperaturas baixas, mas acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, o milho e o algodão. O dano típico causado pela frio inclui o emurchecimento, a necrose, a clorose ou perda de ions das membranas celulares. Os mecanismos subjacentes de sensibilidade ac frio não são compietamente compreendidos ainda, mas provavelmente envolvem o nível de saturação de membrana e outras deficiências fisiológicas. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar á fotoinibição da fotossintese (interrupção da fotossintese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho.

[0021] Aspectos comuns da seca, resposta ao estresse do frio e sal [Revisto em Xiong e Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25:131-139] incluem: (a) alterações transitórias nos níveis de cálcio citoplasmátioo prévio no evento de sinalização; (b) sinal de transdução através de quinase de proteína dependente de cálcio (CDPK's I calcium dependent protein Jíinases) e/ou ativada por mitógeno e fosfatases da proteína; (c) aumentos nos níveis de ácido absclsico em resposta ao estresse, desencadeando um subconjunto das respostas; (d) fosfatos de inositol como moléculas de sinal (pelo menos para um subconjunto das alterações transitórias responsivas ao stress; (e) ativação de f osfolipases, que por sua vez, geram um leque diversificado de moléculas do segundo mensageiro, alguns dos quais podem regular a atividade das quinases responsivos ao stress; (f) a indução dos genes do tipo abundantes na embriogênese tardia (LEA | late embryogenesis abundant), incluindo os genes responsivos CR/RD CRT/DRE; (g) aumento dos niveis de antioxidantes e osmólitos compatíveis como prolina e açúcares solúveis; e (h) a acumulação de espécies reativas de oxigênio, como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A biossíntese do ácido abscísico é regulada por estresse osmótico em várias etapas. A sinalização do estresse osmótico, tanto dependente da ABA quanto independente, modificam primeiramente os fatores de transcrição constitutivamente expressos, levando à expressão dos ativadores transcricionais de resposta prévia, que em seguida, ativam os genes efetores de tolerância ao estresse a jusante.

[0022] Vários genes que aumentam a tolerância ao estresse do frio ou sal também podem melhorar a proteção ao estresse de seca, incluindo, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREBl, OsCDPK? (Saijo et al. 2000, Plant J. 23; 319-327) ou AVP1 (a vacuolar pyrophosphatase-proton pump, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 11444-11449).

[0023] Estudos demonstraram que adaptações da planta a condições ambientais adversas sâo traços genéticos complexos de natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras de horticulturas utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora da produção e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados *

[0024] Os esforços da engenharia genética, focados em conferir tolerância ao estresse abiótico às culturas transgènicas, foram descritos em várias publicações [Apse e Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951- 963, 2002), Holmstrõm et al. (Nature 379: 683-664, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110; 249-2S7, 1996), Pilon-Smits and Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995) e Tarczynski et al. (Science 259: 508-510, 1993)].

[0025] Várias patentes e pedidos de patente divulgam os genes e as proteínas que podem ser utilizados para aumentar a tolerância das plantas ao estresse abiótico. Estas incluem, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N" 5.296.462 e 5.356.S16 (para aumentar a tolerância ao estresse ao frio); a Patente Norte-Americana N° 6.670.528 (para aumentar a ABST); a Patente Norte- Americana N° 6.720.477 (para aumentar a ABST); Na de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 09/936B42 e 10/342224 (para aumentar a ABST); Nfl de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 10/231035 (para aumentar a ABST); W02004/104162 (para aumentar a ABST e biomassa); W02007/020638 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); W02007/049275 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); WO2010/076756 (para aumentar a ABST, biomassa e/ou produção); W02009/083958 (para aumentar a eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico-abiótico, produção e/ou biomassa); W02010/020941 (para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e/ou biomassa); WO2009/141824 (para aumentar a utilidade da planta); W02010/049897 (para aumentar a produção da planta).

[0026] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz, particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta mostre as mudanças em sua arquitetura e o metabolismo melhorado, também, sob outras condições.

[0027] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem ã deficiência de água criando um sistema de raizes mais profundas que permitem o acesso â umidade localizada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente, aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.

[0028] O algodão e subprodutos do algodão fornecem matérias-primas que são utilizadas para produzir uma grande variedade de produtos com base nos consumidores, Além de têxteis, incluindo gêneros alimentícios do algodão, ração animal, fertilizante e papel. A produção, comercialização, consumo e comércio de produtos baseados em algodão geram um excesso de 100 bilhões de dólares anualmente apenas nos EUA, fazendo do algodão a cultura número um em termos de valor acrescentado.

[0029] Apesar de 90% do valor do algodão como uma cultura residir na fibra (fiapo}, a produção e qualidade da fibra diminuiu devido à erosão geral na diversidade genética de variedades de algodão e uma vulnerabilidade acrescida da cultura às condições ambientais.

[0030] Existem muitas variedades de algodoeiros, das quais fibras de algodão com uma gama de características podem ser obtidas e utilizadas para várias aplicações. As fibras de algodão podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, algumas das quais são consideradas altamente desejáveis dentro da indústria têxtil para a produção de produtos de qualidade cada vez mais alta e exploração otimizada de tecnologias de fiação modernas. Propriedades comercialmente desejáveis incluem comprimento, uniformidade do comprimento, finura, relação de maturidade, produção reduzida da fibra, micronário, resistência do feixe e resistência da fibra única, Muito esforço tem sido posto na melhoria das características das fibras de algodão, principalmente focando o comprimento da fibra e a finura da fibra. Em particular, há uma grande demanda de fibras de algodão de comprimentos específicos.

[0031] Uma fibra de algodão é composta de uma única célula que se diferenciou de uma célula epidérmica da cobertura da semente, desenvolvendo-se através de quatro estágios, ou seja, iniciação, alongamento, estágios de espessamento e maturação de parede celular secundária. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão começa na célula epidérmica do óvulo imediatamente após o florescimento, depois do qual a fibra de algodão rapidamente se alonga por cerca de 21 dias. 0 alongamento da fibra é então finalizado, e uma parede celular secundária é formada e crescida através de maturação, tornando-se uma fibra de algodão madura.

[0032] Vários genes candidatos que estão associados ao alongamento, à formação, á qualidade e à produção das fibras de algodão foram divulgados em vários pedidos de patentes, tais como a Patente Morte-Americana N* 5.800,100 e N& de Série de Pedido de Patente Norte- Americana 09/580.545, 08/867.484 e 09/262.653 (que descrevem os genes envolvidos na fase de alongamento da fibra de algodão); WO0245485 (que melhoram a qualidade da fibra, modulando a sintase de sacarose); Patentes Norte- Americanas N* 6.472.588 e WO0117333 (que aumentam a qualidade da fibra por transformação com sintase de codificação de fosfato de sacarose do DNA); WO9508914 (que utiliza um promotor especifico da fibra e uma sequência de codificação que codifica a peroxidase de algodão); WO9626639 (que utiliza uma sequência de promoção especifica do ovário para expressar o crescimento da planta, modificando os hormônios no tecido do óvulo do algodão, alterando características de qualidade da fibra, tais como dimensão de fibra e força); Patente Norte-Americana Ne 5.981.834, Patente Norte-Americana N° 5.597.718, Patente Norte-Americana Np 5.620.982, Patente Norte-Americana Na 5.521.709 e Patente Norte-Americana Ne 5.495.070 (sequências de codificação para alterar as características das plantas que produzem fibras transgênicas); Pedido de Patente Norte-Americana N’ 2002049999 e Patente Norte- Americana N° 2003074697 (que expressam um código genético para transferase endoxiloglucana, catalase ou peroxidase para melhorar as características da fibra de algodão); WO 01/40250 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão genética do fator de transcrição); WO 96/40924 (uma região reguladora da iniciação transcricional da fibra de algodão associada, a qual é expressa em fibra de algodão); EP0834566 (um gene que controla o mecanismo de formação da fibra no algodoeiro),* WO2005/121364 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão do gene); W02008/Q75364 (que melhora a tolerância de qualidade, produção/biomassa/vigor e/ou estresse abiótico da fibra das plantas).

[0033] A publicação WO N* 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biemassa em plantas geradas deste modo.

[0034] A publicação WO N° 2004/111183 divulga sequências de nucleotideos para regular a expressão do gene em tricomas e estruturas de plantas e métodos utilizando os mesmos.

[0035] A publicação WO N° 2004/081173 divulga novas sequências e estruturas regulatórias derivadas da planta e métodos de utilização de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotideo exógeno nas plantas.

[0036] A publicação WO N° 2005/121364 revela polinucleotideos e polipeptideos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método de uso dos mesmos, a fim de aumentar a qualidade das fibras, a produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras,

[0037] A publicação WO N* 2007/049275 revela polipeptideos isolados, polinucleotideos que codificam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse abiótico da planta e biomassa.

[0038] A publicação WO Na 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas e plantas geradas desse modo.

[0039] A publicação WO N° 2008/122980 revela estruturas de genes e métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa de plantas.

[0040] A publicação WO 2008/075364 revela polinucleotideos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos mesmos.

[0041] A publicação WO N® 2009/08395B revela métodos para aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico/abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0042] A publicação WO Ne 2009/141824 revela polinucleotideos isolados e métodos para uso dos mesmos para aumentar a utilidade da planta.

[0043] A publicação WO N° 2009/013750 revela genes, estruturas e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou produção em plantas geradas desse modo.

[0044] A publicação WO N° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0045] A publicação WO N° 2010/076756 divulga polinucleotideos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta,

[0046] A publicação W02010/100595 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0047] A publicação WO N° 2010/049897 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0048] A publicação W02010/143138 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.

[0049] A publicação WO N° 2011/080674 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0050] A publicação W02011/015985 divulga polinucleotideos e polipeptideos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.

[0051] A publicação W02011/135527 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0052] A publicação WO2012/028993 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[0053] A publicação WO2012/0B5862 divulga polinucleotideos e polipeptideos Isolados e métodos de uso dos mesmos para melhorar as propriedades da planta.

[0054] A publicação WO2013/027223 divulga polinucleotideos e polipeptideos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0055] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta am polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nncleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, 80% homólogo (p,ex., idêntico) à ID SEQ, N° [Identificação de Seguência tfe] : 574-930, 6266-8621, 8623-10549 ou 10550, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta,

[0056] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nuclelco que codifica um polipeptideo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 574-930 e 6266-10550, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0057] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, ê fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, 80% homólogo á sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. ND 574-930, 6266-9621 e 062310550, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumente da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.

[0058] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita da planta transformada com um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEG, N° 574-930, 6266-6621 e 3623-10550, caracterizado pela planta da colheita ser derivada de plantas selecionadas para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta tipo selvagem da mesma espécie, a qual é cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta da colheita tendo o aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita.

[0059] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, c/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. Ne 1-573, 931-6264 ou 6265 aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0060] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, è fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-573 e 931-6265, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0061] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleôtideo exógeno, o qual compreende uma sequência de ácido nucleico, a qual é, pelo menos, 80% idêntica á sequência de ácido nucleico selecionada da um grupo consistindo da ID SEQ. N* 1-573 e 931-6265, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.

[0062] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma expressão de planta transformada com um polinucleotideo exógeno, o qual compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, B0% idêntica á sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. JP: 1-573, e 931-6265, caracterizado pela planta da colheita ser derivada de plantas selecionadas para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta tipo selvagem da mesma espécie, a qual é cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta da colheita tendo o aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita,

[0063] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleíco que codifica um polipeptideo, o qual compreende uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à sequência de aminoácido estabelecida na ID SEQ. Nfl 574-930, 6266-8621, 8623-10549 ou 10550, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0064] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, o qual compreende a sequência de aminoácido selecionada de um grupo Consistindo da ID SEQ. 574-930 e 6266-10550.

[0065] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 00% idêntica à ID SEQ. N” 1-573 e 931-6265, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0066] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-573 e 931-6265.

[0067] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotideo isolado de algumas aplicações da invenção, e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[0068] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptideo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à ID SEQ. Nft 574-930, 6265-0621, 0623-10549 ou 10550, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0069] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptideo isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 574-930 e 6266-10550,

[0070] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polinucleotideo de algumas aplicações da invenção, ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.

[0071] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polipeptideo de algumas aplicações da invenção.

[0072] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgénica, compreendendo a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, ou a célula de planta de algumas aplicações da invenção.

[0073] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de cultivo de uma colheita, o método compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantação de plântulas de uma planta transformada com o polinucleotideo isolado de algumas aplicações da invenção, ou com a estrutura do ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas por, pelo menos, um traço selecionado do grupo consistindo de: aumento na eficiência no uso de nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra, e aumento do teor de óleo, conforme comparado a uma planta n3o transformada, cultivando, desta forma, a colheita.

[0074] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido de um grupo consistindo da ID SEQ. N& 574-930 e 6266-10550.

[0075] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada de um grupo consistindo da ÍD SEQ. N° 1-573 e 931-6265.

[0076] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo consiste da sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. Ka 1-573 e 931-6265.

[0077] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. Ne 574-930, 6266-10550.

[0078] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula da planta forma parte de uma planta.

[0079] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotideo exógeno sob estresse abiótico.

[0080] De acordo com algumas aplicações da invenção, o estresse abiótico é selecionado de um grupo consistindo de salinidade, seca, estresse osmótico, privação de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0081] De acordo com algumas aplicações da invenção, a produção compreende a produção de semente ou produção de óleo.

[0082] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotideo exógeno sob condições limitantes de nitrogênio.

[0083] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotideo isolado e/ou à célula hospedeira.

[0084] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem de base genética idêntica.

[0085] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie,

[0086] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é cultivada sob condições de cultivo idênticas.

[0087] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual a invenção refere-se. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste das aplicações da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o quadro reivindicatório da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0088] ALgumas aplicações da invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência especifica aos desenhos em detalhes, enfatiza-se que as particularidades mostradas são exemplares e para os propósitos de discussão ilustrativa das aplicações da invenção. Nesse sentido, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as aplicações da invenção podem ser praticadas. Nos desenhos:

[0089] A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. hP 10575) e o GUSintron (pQYN 6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotideo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro * promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotideo isolado da invenção foram clonadas no vetor enquanto substituíam o gene repórter GUSintron.

[0090] A Figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. 10575) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotideo isolado da invenção. RB [right border] - borda direita do T-DNA; LB [left border] - borda esquerda do T-DNA; MGS [Multiple cloning site]- Local de clonagem múltipla; RE [restriction enzyme] - qualquer enzima de restrição; NOS pro (nopallnha synthase promoter] = promotor da nopalina sintase; NPT-II 1 neomycin phosphotransferase] = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter [nopalinha synthase terminator] = termiπador da nopalina sintase; Sinai poli-A (siπal de poliadenilação) GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron)■ As sequências do polinucleotideo isolado da invenção foram clonadas no MCS do vetor.

[0091] As Figuras 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas de forma exógena expressando o polinucleotideo de algumas aplicações da invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figs. 3C"D) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ãgar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação Fig. 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de IQ dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Fig. 39 - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3A na qual os comprimentos das raizes medidas são representados por setas. Fig. 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de Aqar, cultivadas sob condições altamente csmóticas (PEG 15%) . Fig. 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fág. 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias apôs a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogénio. Fig. 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig, 3E na qual os comprimentos das raizes medidas são representados por setas.

[0092] A Figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmideo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa RP; ID SEQ. ND 10584) utilizado para expressar as sequências do polinucleotideo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II « gene da neomicina fcsfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilaçào; as sequências do polinucleotideo isolado, de acordo com algumas aplicações da presente invenção, foram clonadas no MCS [local de clonagem múltipla] do vetor. uma ilustração

[0093] A Figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN.

[0094] A Figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.

[0095] A Figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.

[0096] A Figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário modificado pGI (pQXNc) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II - gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de nopalina sintase; RE - qualquer enzima de restrição; sinal de Poli-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (pçjfnc.; ID SEQ. Ne 10571). As sequências de polinucleotideo isolado de algumas aplicações da invenção foram clonadas no MC5 (local de clonagem múltipla) do vetor.

DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇAO

[0097] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se aos polinucleotideos e polipeptideos isolados, estruturas do ácido nucléico, Células transgênicas e plantas transgénícas compreendendo os mesmos e métodos para geração e uso dos mesmos e, mais particularmente, mas não exclusivamentet aos métodos para aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta.

[0098] Antes de explicar, pelo menos, uma aplicação da invenção etn detalhes, deve ser entendido que a invenção não é necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

[0099] Os presentes inventores identificaram novos polipeptideos e polinucleotideos que podem ser utilizados para aumentar a produção, taxa de crescimento/ biomassa, teor de óleo, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de fertilizante (p.ex., nitrogênio} de uma planta.

[00100] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar os polinucleotldeos que aumentam a produção (p.ex., produção de semente, produção de óleo, teor de óleo}, taxa de crescimento, biomassa, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de fertilizante (p.ex., nitrogênio) de uma planta. Genes que afetam o traço de interesse foram identificados com base nos perfis de expressão e número de cópia do gene de diversos ecotipos de Cevada, Arabidopsis, Sorgo, Milho, Brachypαdium, Milho painço. Soja e Tomate, acessos, variedades em vários tecidos, estágios de desenvolvimento, ABST e condições limitantes de fertilizante; bem como homologia com genes conhecidos por afetar o traço de interesse e utilizando perfil de expressão digital em tecidos e condições especificas (Tabelas 1, 3-95, Exemplos 1 e 3-15 da seção de Exemplos a seguir). Polipeptideos e polinucleotldeos homólogos tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 2, Exemplo 2 da seção de Exemplos a seguir). Os novos polinucleotldeos foram clonados nas estruturas de ãcldo nuclélco (p.ex., vetores binários, Exemplo 16 e Tabela 97 da seção de Exemplos a seguir), transformados em células agrobâcteriuiji tuniefaciens (Exemplo 17 da seção de Exemplos a seguir), e plantas Arabidopsis transgênicas transformadas com os polinucleotldeos isolados foram geradas (Exemplo 16 da seção de Exemplos a seguir) para avaliação cu o efeito do transgene no desempenho da planta (Exemplos 15-21 da seção de Exemplos a seguir). Plantas transgênicas expressando de forma exógena os genes de algumas aplicações da invenção exibem aumento da biomassa, produção, taxa de crescimento, vigor, eficiência no uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado às plantas de controle sob as mesmas (p.ex., idênticas) condições de cultivo (Tabelas 98-111; Exemplos 19- 21 na seção de Exemplos a seguir). De modo geral, esses resultados sugerem o uso dos novos polinucleotideos e polipeptideos da invenção para aumentar a produção (incluindo produção de óleo, produção de semente e teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou qualidade de fibra, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de fertilizante (p.ex., nitrogénio) de uma planta.

[00101] Assim, de acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido uma método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogénio} e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar na planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, cerca de 80$, pelo menos, cerca de Sl%, pelo menos, cerca de 02%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 04%, pelo menos, cerca de 05%, pelo menos, cerca de 86%, pelo manos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 8 8%, pelo menos, cerca de 89%, pelo manos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 9θ%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homólogo ã sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. Ne 574-930, 6266-6621 e 8623-10550, aumentado, desse modo, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio! e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00102] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da planta" refere-se ao montante (p.ex<, conforme determinado por peso ou tamanho} ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por plantas ou por estação de crescimento- Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o beneficio económico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.

[00103] É importante observar que a produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; qualidade da semente ou grão; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (p.ex., sementes ou partes vegetais da planta); número de flores (florezinhas) por panícula (expressado como uma proporção do número de sementes preenchidos sobre o número de paniculas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de crescimento (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuiçào/alocaçào de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos coletáveis (p,ex., sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [como aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhoria das propriedades físicas (p.ex., elasticidade)).

[00104] Conforme utilizada aqui, a expressão ''produção de semente" refere-se ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo cu ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de semente pode ser afetada pelas dimensões da semente (p.ex,, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume}, pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o beneficio económico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.

[00105] O termo "semente" (também referido como "grão" cu "núcleo"), conforme utilizado aqui, refere- se a uma planta embriônica pequena confinada em uma cobertura chamada de revestimento de semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[00106] A expressão "teor de óleo", conforme utilizada aqui, refere-se á quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal] e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes] ou peso úmido (para a porção vegetal) .

[00107] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (p.ex., semente, parte vegetal), bem como a massa ou tamanho do tecido de produção de óleo por planta ou por periodo de crescimento.

[00108] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/rnassa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando a produção, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta,

[00109] Conforme utilizada aqui, a expressão "biomassa da planta" refere-se à quantidade (p.ex., medida em gramas de tecido secado pelo ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período de cultivo, que também pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Dm aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita}, biomassa vegetal, raizes e sementes,

[00110] Conforme utilizada aqui, a expressão "taxa de crescimento" refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medido em cm2 por dia}.

[00111] Conforme utilizada aqui, a expressão "vigor da planta" refere-se à quantidade (medida pelo peso) ou tecido produzido pela planta em um determinado período. Portanto o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produção da planta cu a produção por período de cultivo ou por área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.

[00112] Melhorar o vigor precoce é um objetivo importante de modernos programas de reprodução de arroz em cultivares da arroz temperado e tropical. Raizes longas são importantes para fixação adequada do solo em arroz pré-germinado. Quando o arroz é diretamente semeado em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados coro vigor. Onde a semeadura de perfuração é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para bom surgimento das mudas. A habilidade de projetar vigor precoce nas plantas seria de grande importância na agricultura. Por exemplo, baixo vigor precoce tem sido uma limitação na introdução do milho (Zea mays L.) híbrido com base no gerrcoplasma do Cinturão do Milho no Atlântico Europeu.

[00113] Deve-se observar que uma produção de planta pode ser determinada sob estresse (p.ex., estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições de não estresse (normal).

[00114] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições de não estresse" refere-se às condições de crescimento (p.ex,, água, temperatura, ciclos claro-escuro, umidade, concentração de sai, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente tal como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão Além das condições climáticas diárias e outras abíóticas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento ideal, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio em seu ciclo de vida (p.ex., em uma planta de cultura da semente para uma planta madura e de volta para a semente novamente). Os técnicos no assunto estão cientes das condições normais do solo e climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta cesse o crescimento sent a capacidade de retomar o crescimento.

[00115] A expressão "estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambiental subótímas como, p.ex., salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperatura baixa ou elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.

[00116] A expressão "tolerância ao estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[00117] As plantas são submetidas a uma gama de desafios ambientais. Diversos desses, incluindo estresse salino, estresse oamótico geral, estresse árido e estresse de congelamento, têm a habilidade de impactar a planta total e disponibilidade de água celular. Não é de surpreender, então, que as respostas da planta a essa coleção de estresses estejam relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Planta Biol. 53: 247-273 et al. Observe que "a maioria dos estudos na sinalização de estresse hídrico focou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e estiagem estão infimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem". Muitos exemplos de respostas similares e caminhos para esse conjunto de estresses foram documentados. For exemplo, os fatores de transcrição de CBF demonstraram condicionamento de resistência ao sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 207-291). 0 gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei, EUA 97; 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se Ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B, Em Mesembryanthemum crystallínujn (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma proteína cinase dependente do cálcio (McCDPKl) é induzida pela exposição aos estresses de estiagem e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: €19-691) . A clnase induzida por estresse também demonstraram fosforilar um fator de transcrição, provavelmente alterando sua atividade, embora os niveis transcrições do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. Similarmente, Saijc et al, demonstraram que uma proteína cinase dependente de calmodulina induzida por sal/estiagem de arroz (OsCDBKl) conferiu tolerância elevada ao sal e estiagem para o arroz quando superexpressa (Saijo et al, (2000) Planta J. 23; 319-321).

[00118] A exposição à desidratação evoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, p.ex,, Yelenosky (1989) Planta Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz tolerância de congelamento (vide, p.ex., Siminovitch et al. 11982} Planta Physiol 69: 25Q-255; e Guy et al. (19921 Plant 188: 265-210). Além da indução de proteínas de aclimatação fria, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, p.ex., área de superfície reduzida, ou produção de óleo ou cera da superfície. Em outro exemplo, o teor de soluto elevado da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osmótico e similares, portanto provendo uma melhor tolerância aos estresses acima.

[00119] Será entendido que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também serão envolvidos em resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos, Certamente, aos caminhos de resistência estão relacionados, não idênticos e portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Não obstante, se uma resistência de condições de gene a um desses estresses, estaria evidente ao especialista na técnica o teste para resistência a esses estresses relacionados. Os métodos de avaliação da resistência ao estresse também São fornecidos na seção de Exemplos a seguir.

[00120] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso da água (HUE I water use efficiency}" refere-se ao nivel de matéria orgânica produzido por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação à utilização de água da planta, p.ex-, a biomassa produzida por transpiração unitária.

[00121] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de fertilizante" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de um ou mais minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais oomo nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[00122] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de fertilizante" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nivel necessário para c metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00123] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de nitrogênio (NUE)" refere-se ao(s) processo Is) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada. 0 processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.

[00124] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex,, concentração) de nitrogênio (isto é, amónia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00125] A NUE e FÜE melhorada da planta são traduzidas no campo em quantidade semelhante de colheita da produção, enquanto implementam menos fertilizantes, ou produções melhoradas adquiridas pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NÜE ou FUE melhorada tem um efeito direto na produção de planta no oampo. Assim, os polinucleotldeos e polipeptideos de algumas aplicações da invenção afetam positivamente a produção de planta, produção de semente e biomassa de planta. Além disso, o beneficio da NUE melhorada de planta certamente melhorará a qualidade da cultura e constituintes bioquímicos da semente tais como produção de proteína e produção de óleo,

[00126] Deve-se observar que um ABST melhorado conferirá ãs plantas vigor melhorado também em condições de não estresse, resultando em culturas que possuem biomassa e/ou produção melhorada, p.ex,, fibras alongadas para a indústria de algodão, teor de óleo mais alto.

[00127] 0 termo "fibra" é normalmente inclusivo de células de condução de parede espessa, tais como vasos e traqueídeos e para fibrilar agregados de muitas células de fibra individual. Bor isso, o termo "fibra" refere-se a (a) células de condução e não condução de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxylary, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras dos caules, folhas, raizes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras}.

[00128] Exemplos de planta que produz fibra, incluem, entre outros, culturas agrícolas tais como algodão, árvore de seda de algodão (Paina, Ceiba pentandra}, salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, winterfat, balsa, quenafe, rosala, juta, sisal abaca, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (p.ex., sisal).

[00129] Conforme utilizada aqui, a parâmetro de fibra que é agricolamente desejado, ou requerido na indústria de fibra (também descrito adiante). Exemplos de tais parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento da unidade, proporção de maturidade e uniformidade (também descrito adiante).

[00130] A qualidade da fibra de algodão (gaze) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e delicadeza da fibra. Consequentemente, a qualidade da gaze é considerada mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

[00131] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da fibra" refere-se ã quantidade ou qualidade das fibras produzidas da planta que produz fibra.

[00132] Conforme utilizado aqui, o termo "aumento" refere-se a, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 3%, pelo menos, cerca de 4%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% de aumento na produção, produção de semente, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou produção de tolerância ao estresse abiótico de ama planta comparada a uma planta nativa ou planta do tipo selvagem [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotideo ou polipeptideos) da invenção, p.ex., um planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as resmas condições (p.ex., idênticas) de crescimento],

[00133] A expressão "expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno", conforme utilizada aqui, refere-se ã regulação ascendente do nível de expressão de um polinucleotideo exógeno dentro da planta, introduzindo o polinucleotideo exógeno em uma planta ou célula da planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme também descrito logo abaixo.

[00134] Conforme utilizado aqui, "expressar" refere-se ã expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível de polipeptideo.

[00135] Conforme utilizada aqui, a expressão "polinucleotideo exógeno" refere-se a uma sequência de ácido nucleico heterôlogo que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (p.ex., uma sequência de áoído nucleico de espécies diferentes) ou na qual a superexpressão na planta é desejada. O polinucleotideo exógeno pode ser introduzido na planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA I ribonucleic acid) e/ou uma molécula de polipeptideo. Deve-se observar que o polinucleotideo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta,

[00136] O termo "endógeno", conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer polinucleotideo ou polipeptideo que está presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.

[00137] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno da invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo tendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, cerca de 301, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 03%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 99%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consiste das ID SEQ> N° 574-930, 6266-6621e 10550,

[00138] As Sequências homólogas incluem ambas as sequências, ortólogas e parãlogas. 0 termo "parálogo" refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie conduzindo aos genes parálogos. O termo "ortólogo" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos devido ã relação ancestral,

[00139] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledõnias é a realização de uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito através de uma primeira explosão, envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer base de dados da sequência, tal como a base de dados do NCBI publicament.e disponível que pode ser encontrada em: http://www [Hypertext Transfer Protocol://World wide Web I Protocolo de Transferência de Hipertexto:Rede Mundial de Computadores / Internet] (ponto] ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria detonada novamente, p.ex., os 23,469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível em NCBI. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências de comprimento total dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então detonadas de volta (segunda explosão} contra as sequências do organismo das quais a sequência de interesse é derivada. Os resultados das primeira e segunda explosões são, então, comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de união vizinha (http^//en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-jolning) que ajuda na visualização do agrupamento.

[00140] A homologia (p.ex., percentual de homologia, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia que calcule o alinhamento de sequência em pares.

[00141] A identidade (p.ex., percentual de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [NCBI I Centro Nacional de Informação de Biotecnologia], tal como utilizando parâmetros padrões.

[00142] De acordo com algumas aplicações da invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00143] De acordo com algumas aplicações da invenção, o termo "homologia" ou “homólogo" refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou identidade de duas ou mais sequências de amínoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácidos para uma ou mais sequências de ácido nucleico.

[00144] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00145] 0 grau de homologia ou de identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinado usando várias ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Na sequência há uma descrição não limitante de tais ferramentas, que podem ser utilizadas juntamente com algumas aplicações da invenção.

[00146] Alinhamento global em pares foi definido por S. B. Needleman e C. D. Wunsch, ''A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequence of two proteins" Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48),

[00147] Por exemplo, ao começar com uma sequência polipeptidica e comparar com outras sequências polipeptídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman- Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/a pps/needle(ponto)html) pode ser utilizado para encontrar o alinhamento ideal (incluindo as lacunas) de duas sequências juntamente com seus comprimentos totais - um "ALinhamento global". Os parâmetros padrões para o algoritmo de Needleman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluem; gapopen-10; gapextend=0.5; datafile™ EBLOSUM62; brief=¥ES.

[00148] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros utilizados com a ferramenta EMBOSS-6.0.1 (para a comparação proteína-proteina) incluem: gapopen=8; gapextend-2; datafile^ EBLOSUM62; brief=YES.

[00149] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMSOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch é 30%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00150] Ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar a sequências polinucleotídicas, o algoritmo OneModel FramePlus (Halperin, E., Faigler,S. e Gill-More,R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequences. Bioinformatics, 15, 867-873) (disponível em http://www(ponto)biocceleration(ponto)com/Products(ponto)ht ml) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões: model = frame+_p2n.model mode=local.

[00151] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros usados com o algoritmo OneModel FramePlus são model=frame+_p2n.model, mode^qglobal.

[00152] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo OneModel FramePlus é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00153] Ao começar com uma sequência polinucleotidica e comparar com outras sequências polinucleotídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman- Wunsch (disponível em http://emboss(ponto]sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/a pps/needle(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões. (EMBOSS-6.0.1) gapopen^lO; gapextend^O.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00154] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros usados com o algoritmo EMBOSS- 6.0.1 de Needleman-Wunsch são gapopen^lO; gapextend=0.2; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00155] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch para a comparação de polinucleotideos com polinucleotideos é 90%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00156] De acordo com algumas aplicações, as determinações do grau de homologia requerem adicionalmente o emprego do algoritmo de Smith-Waterman (para a comparação proteína-proteína ou comparação nucleotideo-nucleotídeo).

[00157] Os parâmetros padrões para o algoritmo GenCore 6.0 Smith-Waterman incluem: modelo =sw.model.

[00158] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo de Smith-Waterman é 00%, 81%, 02%, 03%, 64%, 85%, 86%, 97%, 00%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00159] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia global é realizada sobre as sequências pré-selecionadas por homologia local para o polipeptideo ou polinucleotideo de interesse (p.ex., 60% de identidade sobre 60% do comprimento da sequência) antes da realização da homologia global para o polipeptideo ou polinucleotideo de interesse (p.ex., 80% de homologia global sobre toda a sequência). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionadas usando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn agindo como filtros para o primeiro estágio e a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento Estrutura+algoritmico para o segundo estágio, A identidade local (alinhamentos Blast) é definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências, porque é utilizada tão somente como um filtro para a fase de alinhamento global. Nesta aplicação específica (quando a identidade local é utilizada) a filtragem padrão do pacote Blast não é utilizada (estabelecendo o parâmetro *-F F").

[00160] No segundo estágio, os homólogos são definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica principal.

[00161] De acordo com algumas aplicações da invenção, duas formas distintas para a descoberta do alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou nucleotídica sâo utilizadas:

1. Entre duas proteínas (seguindo o filtro blastp):

[00162] ALgoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões listadas aqui:

[00163] Qualificadores padrões (Obrigatórios): [-asequence] sequência Nome do arquivo da sequência e formato opcional, ou referência (entrada EUA}. [-bsequence] seqall Nome do arquivo da(s) sequência(s) e formato opcional, ou referência (entrada EUA} . -gapopen flutuante [10,0 para qualquer sequência]. A penalidade da lacuna aberta é uma classificação tomada quando uma lacuna é criada. O melhor valor depende da escolha do arranjo de comparação. 0 valor padrão pressupõe que você estâ usando o arranjo EBLOSUM62 para as sequências de proteína e a matriz EDNAFULL para as sequências nucleotídícas [número de virgula flutuante de 1,0a 100,0). -gapextend flutuante [0,5 para qualquer sequência]. A penalidade pela extensão da lacuna, é adicionada ã penalidade da lacuna padrão para cada base ou resíduo na lacuna. Esta é o tempo pelo qual a lacuna é penalizada. Normalmente espera-se poucas lacunas grandes e não muitas lacunas pequenas, assim a penalidade sobre a extensão da lacuna deveria ser menor que a penalidade da lacuna. Uma exceção se dá quando uma ou mais sequências são lidas sozinhas com possíveis erros de sequência em cujo caso você esperaria muitas lacunas de base simples. Pode-se obter este resultado estabelecendo a penalidade por lacuna aberta para zero (ou muito baixa) e usando a penalidade de extensão da lacuna para controlar a classificação da lacuna (número de virgula flutuante de 0,0 a 10,0). [-outfile] alinhamento [*.needle] Nome do arquivo de alinhamento de saída.

[00164] Qualificadores Adicionais (Opcional); -datafile matrixf [EBLOSUM62 para proteína, EDNAFULL para DNA] . Este é um arquivo do arranjo de classificação utilizado ao comparar as sequências. Por padrão, este é o arquivo 'EBLOSUM62' (para proteínas) QU O arquivo 'EDNAFULL' (para sequências nucleicas) Estes arquivos são encontrados no diretório 'data' da instalação EMBOSS.

[00165] Qualificadores Avançados (Espontâneos); -[no]brief booleano [Y] Breve identidade e similaridade.

[00166] Qualificadores Associados; -asequence" Qualificadores Associados. -sbeginl inteiro Inicia a sequência a ser uti1i zada. -sendl inteiro Finaliza a sequência a ser utilizada. -sreversel -saskl booleano booleano Reverso Pede (se DNA). pa ra iniciar/finalizar/reverter, "snucleotidel booleano A sequência é nucleotidica. -sproteinl booleano A sequência é de proteína. -s1cwerl booleano Faz minúsculas. -supperl booleano Faz maiusculas. -sformat 1 cadeia Formato de sequência de entrada. -sdbnamel cadeia Nome da base de dados. -sidl cadeia Nome da entrada. -ufol cadeia Recursos UFO- -fformatl cadeia Formato dos Recursos. -fopenfilel cadeia Nome do arquivo dos recursos. "-bseqtaence" Qualificadores Associados. -sbegin2 utilizada. inteiro Inicia cada sequência a ser -sendí utilizada. inteiro Finaliza cada sequência a ser -sreverse2 booleano Reverso (se DNA)* -sask2 booleano Pede para iπiciar/f ina Liza r/reverter. -snucleotideZ booleano A sequência é nucleotídica. -sproteína2 booleano A sequência é de proteína. -s1ower2 booleano Faz minúsculas. -supper2 booleano Faz maiusculas. -sformat2 cadeia Formato de sequência de entrada. -sdbnameZ cadeia Nome da base de dados. -sid2 cadeia Nome da entrada. -ufo2 cade ia Recursos UFO. -ffôrmat2 cadeia Formato dos Recursos. -fopenfile2 cadeia Nome do arquivo dos recursos. "-outfile" Qualificadores Associados. -aformat3 cadeia Formato dos ALinhamentos. -aextensionJ cadeia Extensão do nome do arquivo. -adirectory3 cadeia Diretório de Saída. -aname3 cadeia Nome do arquivo de base. -awidth3 inteiro Largura do alinhamento. -aaccshow3 booleano Mostra o número de acesso no cabeçalho. -adesshow3 booleano Mostra a descrição no cabeçalho. -ausashow3 booleano Mostra o USA completo no alinhamento * -aglobaU booleano Mostra a sequência completa no alinhamento. -auto

[00167] booleano Qualificadores Gerais: Desliga as solicitações. -stdout booleano Escreve 0 primeiro arquivo para a saída padrãos. -filtro booleano Lê o primeiro arquivo a partir da entrada padrão. escreve o primeiro arquivo para a saída padrão. -Opções booleano Solicita os valores padrão e adicionais. -debug booleano Escreve a saída de depuração do programa .dbg -verbose booleano Registra algumas/todas as opções de linha de comando, -help booleano Registra as opções de linha de comando. Maiores informações sobre os qualificadores associados e gerais podem ser encontradas com - help - verbose. -warning booleano Registra as advertências. -error booleano Registra os erros. -fatal booleano Registra os erros fatais. “die booleano Registra as mensagens de expiração do programa. 2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotidica (seguindo o filtro rblastn) Aplicação de GenCore 6.0 OneModel utilizando a estrutura+algoritmo com os seguintes parâmetros; model=frame+_p2n,model mode-qglobal -q=protein.sequence -db- nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões:

[00168] Uso: om -model=<model_fname> [-q=]query [-db-]database [options]. “model=<πiodel_fname> Especifica o modelo que quer executar. Todos os modelos fornecidos pela Compugen estão localizados no diretório SCGNROOT/modela/.

[00169] Parâmetros válidos de linha de comando: -dev=<dev_name> Seleciona o dispositivo a ser utilizado pela aplicação.

[00170] Os dispositivos válidos são: bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAME_N2P, e modelos FRAME_P2N). xlg - BioXL/G (válido para todos os modelos, exceto XSW) . xlp - BioXL/P (válido para SN, FRAME+_N2R, e modelos i FRAME_P2N). xlp - BioXL/H (válido para sw, FRAME+N2P, e modelos ; FRAME_P2«). soft - Dispositivo do software (para todas os modelos). -q=<query> Define o conjunto de consultas* As consultas podem ser um arquivo de sequência ou uma referência ã base de dados. Você pode especificar uma consulta pelo nome ou por número de acesso. 0 formato é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -qfmt» Se uma consulta nâo for especificada, o programa solicita uma. Se o conjunto de consultas for uma referência à base de dados, um arquivo de salda é produzido para cada sequência na consulta, -db=<database naine> Escolha o conjunto de base de dados. 0 conjunto de base de dados pode ser um arquivo de sequência ou uma referência á base de dados. O formato da base de dados é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -dfmt. -qacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma consulta for especificada usando os números de acesso. -dacc Adiciona este parâmetro ã linha de comande se uma base de dados for especificada usando os números de acesso. -dfTnt/-qfmt=<fôrmat_type> Escolhe o tipo do formato da base de dados/consulta.

[00171] Os formatos possíveis são; fasta - fasta com o tipo de sequência autodetectada. fastap - sequência de proteína fasta, fastan - sequência nucleica fasta, gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado. gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado. gcg^seqp — sequência de proteína de formato gcg9. gcgSseqn - sequência nucleica dB formato gcg9. nbrf - sequência nbrf, o tipo é autodetectado. nbrfp - sequência de proteína nbrf. nbrfn - sequência nucleica nbrf. etnbl - formato embl e swissprot, genbank - formato genbank (nucleico) * blast - formato blast, nbrfgcq - sequência nbrf_gcg, o tipo é autodetectado. nbrfgcgp - sequência de proteína nbrf-gcg. nbrfgcqn - sequência nuclelca nbrf-gcg. raw - sequência raw ascii, o tipo é autodetectado. rawp - sequência de proteína raw ascii, rawn — sequência πucleica raw ascii. pir - formato pir codata, o tipo é autodetectado. Profile - perfil gcg (válido somente para -qfmt em SW, XSW, FRAME_P2N e FRAME+_P2N). -out=<out_fname> 0 noiπe do arquivo de saida. -suffix=<name> 0 sufixo do nome do arquivo de saída. -gapop=<n> Penalidade sobre a abertura de lacuna. Este parâmetro não è válido para a FRAME+. Para a FrameSearch o padrão é 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0. -gapext=<n> Penalidade por extensão de lacuna. Este parâmetro não é válido para FRAME+. Para a FrameSearch o padrão é 4,0. Para outros modelos: o padrão para as pesquisas de proteína é 0,05 e o padrão para as pesquisas nucleicas é 1,0. A penalidade pela abertura de uma lacuna na sequência de consultas. 0 padrão é 10,0. válido para XSW. -qgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna na sequência de questões. O padrão é 0,05. Válido para XSW, -start=<n> A posição na sequência de consulta para iniciar a pesquisa. -end-<n> A posição na sequência de consulta para interromper a pesquisa, -qtrans Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta nucleica contra uma base de dados de proteína. A consulta nucleica ê traduzida para seis estruturas de leitura e um resultado ê fornecido para cada estrutura. Válido para o SW e XSW, Nota: as opções "-qtrans" e "-dtrans" são mutuamente exclusivas. “matrix='<matrix_file> Especifica o arranjo de comparação a ser utilizada na pesquisa. 0 arranjo deve estar em formato BLAST. Se o arquivo do arranjo não for localizado em SCGNROOT/tables/matrix, especifique o caminho completo como o valor do -matrix parameter. -trans=<transtab_name> Tabela de tradução. A localização padrão para a tabela é ÇCGNROOT/tables/trans. -onestrand Restringe a pesquisa para somente a vertente superior da consulta/base de dados da sequência nucleica, -list=<n> O tamanho máximo da lista de acertos de saída. 0 padrão é 50. *”dQcalign=<n> O número das linhas de documentação precedente a cada alinhamento. 0 padrão é 10. -thr_score='<score _name> A classificação que coloca um limite à exibição dos resultados. Classificações menores que o valor mínimo de -thrjnin ou maiores que o valor - thr_max não são mostradas. As opções válidas são: qualidade. Escore. Escore. -thr max=<n> O limite mais alto da classificação. Resultados maiores que o valor -thrjnax não são mostrados. -thr_min=<n> O menor limite da classificação. Resultados menores que o valor -thr_min não são mostrados. -align=<n> 0 número de alinhamentos registrados no arquivo de saída. -noalign Não exibe o alinhamento. Nota: os parâmetros '■'-align" e "-noalign." são mutuamente exclusivos. -outfmt=<format_name> Especifica o tipo de formato de saída. 0 formato padrão é PFS. Os valores possíveis são: PF'S - Formato de texto PFS FASTA - formato de texto FASTA BLAST - formato de texto BLAST -nonorm Não realiza a normalização da classificação. -norm=<nom_name> Especifique o método de normalização. As opções válidas são: log - normalização do algoritmo, std ■ normalização padrão. stat - Método estatístico de Ervilharson Nota: os parâmetros "-nonorm" e "-norm" não podem ser utilizados juntos. Nota: Parâmetros -xgapop, -xgapext, -fgapop, -fgapext, - ygapop, -ygapext, -delop e -delext se aplicam somente a FRAME+ . -xgapcp=<n> A penalidade para a abertura de tuna lacuna ao inserir um codão (triplo). 0 padrão é 12,0. ~xgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). 0 padrão é 4,0. -ygapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir um aminoácido. 0 padrão é 12,0. -ygapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 4,0, -fgapop~<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir uma base de DMA. O padrão é 6,0. -fgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir uma base de DNA- 0 padrão é 7,0. -delop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir uma base de DMA. 0 padrão é 6,0. -delext-<n> A penalidade para a extensão de urna lacuna ao excluir uma base de ONA. O padrão é 7,0. -silent Nenhuma saida para a tela é produzida. -host=<host_name> O nome do organizador sobre o qual o servidor funciona. Por padrão, a aplicação usa um organizador especifico no arquivo íCGNROOT/cgnhosts. -wait Não acesse o segundo plano quando o dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para o pseudodispositivo Parseq ou Soft. -batch Execute o trabalho em segundo plano. Quando esta opção for específica, o arquivo 'l$CGNROOT/de faults/batch. defaults" é utilizado para escolher o comando batch. Se o arquivo não existir, o comando "at now" é utilizado para executar o trabalho. Nota: Os parâmetros "-batch" e "-wait" são mutuamente exclusivos. -version Imprime o número de versão do software. -help Exibe esta mensagem de ajuda. Para ajuda mais específica digite: "om -model=<model_fname> -help".

[00172] De acordo com algumas aplicações, a homologia ê uma homologia local ou uma identidade local,

[00173] As ferramentas de algoritmo local incluem, mas não são limitadas ao software BlastP, BlastN, BlastX ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), FASTA e o algoritmo de SmithWaterman.

[00174] Uma pesquisa tblastn permite a comparação entre uma sequência de proteína e as traduções de seis estruturas de uma base de dados de nucleotideos. Pode ser uma maneira bastante produtiva de encontrar regiões codificadas de proteína homóloga em sequências de nucleotidecs não anotadas, tais como as etiquetas de sequências expressas [ESTs I expressed sequence tags] e projetos de registros do genoma (HTG), localizados nas bases de dados BLAST est e htgs, respectivamente.

[00175] Os parâmetros padrões para o blastp incluem: Sequências de alvo máximo: 100,- Limite esperado: e-5; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - 0LOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00176] Ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluem, mas não são limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceituai de seis estruturas de uma sequência de consultas de nucleotideαs (a mb as as vertentes) contra uma base de dados de sequência de proteína. Os parâmetros padrões incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00177] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno da invenção codifica um polipeptideo tendo uma sequência de aminoãeidos de, pelo menos, 00%, pelo menos 01%, pelo menos 82%, pelo menos B3%, pelo menos 94%, pelo menos 85%, pelo menos 06%, pelo menos 67%, pelo menos 08%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistente de ID SEQ N°: 574-930, 6266-3621 e 8623-10550.

[00178] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 02%, pelo menos, cerca de 03%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 06%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 09%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% idêntica á sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. ti ° 574-930, 6266-0621 e 8623-10550, aumentando, desta forma, a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio} e/ou tolerância ao estresse abiótico de urna planta.

[00179] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno codifica um polipeptideo consistindo de uma sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. Na 574-930, 6266-10549 ou 10550.

[00180] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, □ método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado expressando dentro da planta de um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ, N° 574-930, e 6266-10550, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência nc uso de fertilizante (p.ex.f eficiência no uso de nitrogênio} e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00181] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 574*930 e 6266-10550, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00182] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno codifica um polipeptideo consistindo na sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. Ne 574-930, 6266-10549 ou 10550.

[00183] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 00%, pelo menos, cerca de 01%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste das ID SEQ. Ne 1-573 e 931-6265.

[00184] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, ê fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante [p.ex,, eficiência no uso de nitrogênio] e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 01%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-573 e 931-6265, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00185] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno ê, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de S8%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotideo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. M” 1-573 e 931-6265,

[00186] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-573, 931-6264 ou 6265.

[00187] De acordo Com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno é estabelecido pela sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-573, 931-6265.

[00188] Conforme utilizado aqui, o termo "polinucleotídeow refere-se a uma sequência de ácido nucleico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotideo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotideo e/ou uma sequência polinucleotideo composta (p.ex., uma combinação das sequências acima).

[00189] C termo "isolado[a)" refere-se a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, p.ex,, de uma célula da planta,

[00190] Conforme Utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotideo complementar" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro utilizando a transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Essa sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de DMA dependente de DNA.

[00191] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência genõmica de polinucleotideo" refere-se a uma sequência derivada {isolada) de um cromossomo e, dessa forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.

[00192] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotideo composta" refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genõmica. A sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptideo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpostas entre si. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinais entrelaçados preservadas, Essas sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão cis-atuantes.

[00193] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptideos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.

[00194] A expressão "otimização de códons" refere-se à seleção de nucleotideos de DNA apropriados para a utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que aborde a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou que ocorra naturalmente tenha sido modificado a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. Tipicamente, a sequência de nucleotídeo é examinada no nível do DNA e na região de codificação otimizada para expressão na espécie vegetal determinada utilizando qualquer procedimento adequado, p,ex., conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:Í77-681). Nesse método, o desvio padrào de utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do cõdonr pode ser calculado descobrindo primeiramente o quadrado do desvio proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do quadrado do desvio médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU • n - 1 H [ (Xn - Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se á frequência de utilização do códon n no gene e interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse, Uma Tabela de utilização de côdons de genes altamente expressos de dicotiledõneas está compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc AcID's Res. 17:477-498}.

[00195] Um método para otimizar a sequência de Acido nucleico de acordo com a utilização preferido do códon para um tipo de célula de planta particular é com base na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, de Tabelas de otimização de côdons como aquelas disponíveis online na Base de Dados de utilização de Côdons através do banco de DNA do NIAS [National Institute of Agrobiological Sciences I Instituto Nacional de Ciências Agrobiolôgicas) no Japão {http://www (ponto) Jcazusa (ponto) ou (ponto) jp/codon/) . A Base de Dados de utilização de Côdons contêm tabelas de utilização de côdons para diversas espécies diferentes, com cada Tabela de utilização de côdons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00196] Utilizando as Tabelas acima para determinar os côdons mais preferidos ou mais favorecidos de cada aminoácido em uma espécie particular (p.ex., arroz), uma sequência de nuclectideo que ocorre naturalmente e que codifica uma proteína de interesse pode ter o códon otimizado para aquela espécie de planta particular, Isso é efetuado substituindo os côdons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com côdons correspondentes, em relação a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos, No entanto, um ou mais côdons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos em uniões potência linen te úteis (terminais 5' e 3' para adicionar o peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sitios internos que possam ser utilizados para cortar e reunir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta}, ou para eliminar sequências de nucleotideo que possam afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA,

[00197] A sequência de nucleotideo codificador que ocorre naturalmente já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponda a um côdon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotideo nativa podem compreender a determinação quais côdons, dentro da sequência de nucleotideo nativo, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotideo modificado pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização do códon da planta desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotideo modificada seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou nativo. A estrutura de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, p.ex., no Pedido de Patente PCT (Patent Cooperation Treaty (Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes) 93/0727B.

[00198] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo exógeno é um RNA não codificador.

[00199] Conforme utilizada aqui, a expressão "RNA não codificador"' refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácídos (um polipeptideo). Exemplos dessas moléculas de RNA não codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antissenso, um pré-miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA)-

[00200] Exemplos não limitantes de polinucleotldeos de RNA não codificadores são apresentados nas ID SEQ. N* 253-261, 330-333 e 571-573.

[00201] Dessa forma, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima, fragmentos delas, sequências hibridizantes encontradas nelas, sequências homólogas delas, sequências codificando polipeptideos semelhantes com diferentes utilizações de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações, como exclusão, introdução ou substituição de um ou mais nucleotideos, ocorrendo naturalmente ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00202] A invenção fornece um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 00%, pelo menos, cerca de 01%, pelo menos, cerca de 02%, pelo menos, cerca de 03%, peio menos, cerca de 04%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 06%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 09%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos. 757558 cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex,, 100% idêntica ao polinucleotideo selecionado a partir do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-573 e 931-6265.

[00203] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz: de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio] e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00204] De acorda com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo isolado, compreendendo a sequência de ácido nucleico, é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. Ne 1-573 e 931-6265.

[00205] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo isolado é estabelecido pela ID SEQ, N° 1-573, 931-6264 ou 931-6265.

[00206] A invenção fornece um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 03%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 09%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cercã de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga á sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 574-930, 6266-8621, 8623- 10549 ou 10550.

[00207] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácidos ê capaz de aumentar a produção, produção de semente, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio), produção de tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.

[00208] A invenção fornece um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 574-930 e 6266-10550.

[00209] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotideo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[00210] A invenção fornece um polipeptideo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 8 9%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%. pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácídos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N* S74-930, 6266-0621, 8623-10549 ou 10550.

[00211] De aCçrdç com algumas aplicações da invenção, o polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácídos é selecionado do grupo que consiste da ID SEQ. 574-930 e 6266-10550.

[00212] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptideo é estabelecido pelas ID SEQ. N° 574-930, 6266-10549 ou 10550.

[00213] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptideos descritos acima e de polipeptídeos apresentando mutações, como exclusões, introduções ou substituições de um ou mais aminoácídos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00214] 0 termo "planta", conforme utilizado aqui, abrange planta integrais, ancestrais e progénies das plantas e partes da planta, incluindo as sementes, os brotos, os caules, as raizes (incluindo os tubérculos} e células, tecidas e órgãos da planta. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametõfitos, esporôfitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à monocotlledôneas e as dicotiledôneas, incluindo uma forragem ou leguminosa forrageira, planta ornamental, cultura alimentar, árvore ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, ALbizia amara, ALsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans. Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Bétula spp., Brassica spp., Sruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Buchá frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica. Capsicum spp.. Cassia spp., Ceπtroeπa pubesceπs, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Cαffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cyπthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichus spp., Dorycπium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp.. Eleusine coracana, Eragrestls spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp-, Feijoa sellowlana. Fragaria spp,, Flemingia spp, Freycinetia banks Ii, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javaπica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogoπ contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute. Indigo incamata. Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lótus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculents, Medicago saliva. Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientuπi, Nicotiaπum spp., Onobrychis spp,r Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Parses gratíssima, Petunia spp,, Phaseelus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatuπi, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vlcia spp-, Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenouras, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilhas, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma cultura forrageira. ALternativamente, algas e outras não-Vixidíplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.

[00215] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de cultura como o arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, choupo e algodão.

[00216] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.

[00217] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta monocotiledónia.

[00218] De acordo com algumas aplicações da invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando de forma exógena o polinucleotideo de algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção e/ou o polipeptideo de algumas aplicações da invenção.

[00219] De acordo corn algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotideo exógeno da invenção dentro da planta é afetada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotideo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotideo exógeno dentro da planta madura.

[00220] De acordo com algumas aplicações da invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma estrutura de ácido nucleico na célula da planta que inclua o polinucleotideo exógeno de algumas aplicações da invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotideo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de abordagens de transformação adequadas são apresentadas abaixo.

[00221] Conforme mencionado, a estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações da invenção, compreende uma sequência promotora e o polinucleotideo isolado da invenção.

[00222] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.

[00223] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "operacionalmente ligada" a uma sequência reguladora (p.ex., o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00224] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que fica a montante do sitio da inicial transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (p.ex., qual porção de uma planta] e/ou quando (p.ex., em que estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00225] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotideo isolado e/ou á célula hospedeira.

[00226] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor heterólogo" refere-se a um promotor de uma espécie diferente ou da mesma espécie, mas de um lócus de gene diferente, a partir da sequência de polinucleotideo isolado.

[00227] Qualquer sequência adequada de promotor pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor especifico do tecido ou induzivel ao estresse abiótico.

[00228] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é um promotor de planta que é adequado para expressão do polinucleotideo exógeno em uma célula de planta,

[00229] Promotores adequados para expressão em trigo incluem, mas não se limitam a promotor SPA de trigo (ID SEQ. N* 10551; ALbaπietal, Plant Cell, 9; 171- 1B4, 1997, que é totalmente incorporado aqui por referência), trigo LMW [ID SEQ. N* 10552 (promotor mais longo LMW) e ID SEQ. N° 10553 (promotor LMW)] e glutanina-1 HMW [ID SEQ. N° 10554 (promotor mais longo glutenina-l trigo LMW) e ID SEQ. Ns 10555 (Promotor glutenina-1 trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180; Furtado et al., 2009 Plant Biotechnology Journal 7:240-253» cada um é completamente incorporado aqui por referência] trigo alfa, beta e gama gliadinas [p.ex., SEQ ID NO: 10556 (trigo alfa giiadina, genoma B, promotor); ID SEQ. N'1 10557 (trigo gama gliadina promotor); EMBO 3:1490-15, 1994, que é totalmente incorporado aqui por referência] trigo TdPRõO [ID SEQ. N° 10558 (trigo TdPR60 promotor mais longo) ou ID SEQ. 10559 (promotor do trigo TdPRSO); Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:61-96, 2009, que é totalmente incorporado aqui por referência], promotor do milho Ubl [cultivares Nongda IOS (ID SEQ. N° 10556); GenBank: DQ14159θ.U Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 10561); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N® 10562; Mc Elroy et al. 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163-171, que é totalmente incorporado aqui por referência), e arroz GOS2 [ID SEQ. N” 10563 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 10564 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al. Plant J. 1992 ; 2: 837-44, que é totalmente incorporado aqui por referência), Arabidopsis Phol [ID SEQ. N“ 10565 (Arabidopsis Phol Promotor); Hamburger et al», Plant Cell. 2002 ; 14: 089-902, que é totalmente incorporado aqui por referência), promotores ExpansinB, p.ex., arroz ExpB5 [ID SEQ. Nç 10566 (promotor mais longo do arroz ExpB5) e SEQ ID NO: 10567 (promotor do arroz ExpB5) e Cevada ExpBl [ID SEQ. N° 10568 (promotor da cevada ExpBl), Won et al. Mol Cells. 2010; 30:369-76, que é totalmente incorporado aqui por referência), cevada SS2 (sacarose sintase 2) [(ID SEQ. N° 10569), Guerin and Carbonero, Plant Physiology May 1997 vol, 114 no. 1 55-62, que ê totalmente incorporado aqui por referencial, e arroz PG5a [ID SEQ. N® 10570, US 7.700.835, Nakase et al., Plant Mol Biol. 32:621-30, 1996, que é totalmente incorporado aqui por referência].

[00230] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [ID SEQ. N® 10571 (Promotor CaMV 35S (QFNC) ) ; ID SEQ. N° 10572 (PJJ 35S de Brachypodíum) ; ID SEQ. N° 10573 (Promtor CaMV 35S (VELHO)) (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985)], promotor Arabidopsis At6669 (ID SEQ. NΦ 10574 (Promoter Arabidopsis At6669 (VELHO)),* ver Publicação PCT N°, WGO4081173A2 ou o novo promotor At6669 (ID SEQ, Nó 10575 (Promotor Arabidopsis At6669 (NOVO)); Promoter do milho Ubl [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 10560); GenBank: DQ141590.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 [ID SEQ. N° 10561); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. IB (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N° 10562, McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:501-586, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al.. Physiol. Plant 100:456-462, 1997); arroz GOS2 [ID SEQ. Nβ 10563 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 10564 (Promoter do arroz GOS2); De Pater et al.. Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); promotor RBCS (ID SEQ. N° 10576) Ciclofiliπa do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25 (5):837-43, 1994); histone H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet- 231: 276-205, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10 (1);107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Americanas ND: 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5-466,705; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.

[00231] Promotores específicos de tecido adequados incluem, mas não se limitam a promotores específicos de folha [p.ex., AT5G06690 (Thioredoxin) (expressão elevada, ID SEQ. Na 10577), AT5G61520 (AtSTP3) (expressão rebaixada, ID SEQ. N° 10578) descrito em Buttner et al 2000 Plant, Cell and Environment 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12:255- 265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al-, Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EGA 90:9586-9590, 1993; bem como o promotor Arabidopsis STP3 (AT5G61520) (Buttner et al., Plant, Cell and Environment 23:175-184, 2000)], promotores preferidos de semente [p.ex., Napin (originados da Brassica napus, sendo caracterizado por uma atividade promotora específica de semente; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; ID SEQ. Na: 10579 (Promotor Brassica napvs NAPIN) a partir dos genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), arroz FG5a (ID SEQ. N° 10570; US 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes Arabidopsis BAN (AT1G61720) (ID SEQ. N° 10580, US 2009/0031450 Al), desenvolvimento tardio de sementes Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) (ID SEQ. N° 10581 (Arabidopsis ABI3 (AT3G2465O) Promotor mais longo) ou 10582 {Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor)) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), ALbumina de castanha do Brasil (Pearson et al.. Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol, Bid, 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo S6/S5S (ID SEQ. N° 10551; ALbanietal, Plant Cell, 9; 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)1, promotores específicos de endosperma [p.ex., trigo LMW (ID SEQ. N* 10552 {Trigo LMW Promotor mais longo), e ID SEQ. N° 10553 (promoter de trigo LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. NT 10552 (promotor mats longo gluteniπa-1 de trigo LMW) e ID SEQ. Nα 10553 (Promoter gluteπina-1 de trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo alia, beta e gama gliadinas (ID SEQ. 10556 (promotor alfa gliadina de trigo (genoma B) ) ; ID SEQ. N° 10557 (promoter gama gliadina de trigo) ; EMBO 3:1409-15, 1984), promotor Itrl da cevada, cevada 01, C, D hordeina (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:34355, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (ID SEQ. N* 10569 (Promotor Cevada SS2); Guerin and Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), trigo TarpSO Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:61-98, 2009, cevada D-hordefna (D-Hor) e B-hordeina (B- Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry and ALessandro Pellegrineschi (2009)], promotor sintético (Vicente- Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), arroz prolamina NRF33, arroz-globulina Glb-1 (Wu et al. Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998}, arroz alfa-globulina REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 5L3-S22, 1997), ADP-glicose de arroz PP (Trans Res 6:157-68, 1997), familia do gene de milho ESR (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos embrionários (p.ex., arroz OSHI (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma- Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), arroz oleosina (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores de flor específicos Ep.ex., AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol, 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen. Genet. 217:240- 245; 1989), Arabidopsis apetala-3 (Tilly et al,, Development. 125:1647-57, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, API) (ID SEQ. N°: 10583 (Arabidopsis (AT1G69120) APETALA 1)) (Hempel et al., Development 124:3845-3853, 1997)], e promotor de raiz [p.ex., o promotor ROOTP [ID SEQ. N°: 10594]; arroz ExpB5 (ID SEQ. N° 10567 (Promotor de arroz ExpBS); ou ID SEQ. N’ 10566 (Promotor mais longo de arroz ExpB5)) e promotores de cevada ExpBl (ID SEQ. N° 10568} (Won et al. Mol, Cells 30: 369-376, 2010); promotor Arabidopsis ATTPS-CIN (AT3G25820) (ID SEQ. Nβ 10585; Chen et al., Plant Phys 135:1956-66, 2004); promotor Arabidopsis Phol (ID SEQ. N°: 10565, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889-902, 2002), que também é ligeiramente induzida por estresse].

[00232] Promotores induziveis pelo estresse abiótico incluem, mas nào se limitam a promotores induziveis pelo sal, como o RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induziveis pela seca, como o gene promotor rabl7 (Pia et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), o gene promotor rab28 do milho (Busk et. al,, Plant J. 11:1285-1295, 1997 e o gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induziveis pelo calor como o promotor hsp80 do tomate (Patente Norte- Americana N° 5.187.267),

[00233] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreenda um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) quanto pode ser compatível com a propagação nas células. A estrutura de acordo com a presente invenção pode ser, p.ex., um plasmideo, um bacmideo, um fagemídeo, um cosmideo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00234] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ser utilizada para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotideo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotideo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço transitório.

[00235] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos, tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00236] Os métodos do principio de causa da integração estável de DNA exógeno em DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais:

[00237] A transferência genética mediada pelo Agrobacteriujii: Klee et al. (1987) Annu, Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, 3. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

[00238] Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA nos protoplastos, Toriyama, K. et al. (19B8) Bio/Technclogy 6:1072-1074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923- 926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de partículas de fibras de vidro ou carboneto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido caloso, Patente Norte-Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EDA 9C/55β (1996) 63:715- 719.

[00239] O sistema Agrabacterium inclui a utilização de vetores plasmidiais que contenham segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega do Agrobacterium, Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que oferece uma boa fonte para o inicio da diferenciação de toda a planta. Vide, p.ex., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht <1989) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega do Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobaaterium é especialmente viável na criação de dicotiledóneas transgênicas.

[00240] Existem vários métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporaçãOT OS ptotcplastôs sào brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA ê injetado de forma mecânica díretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas, No bombardeamento de microparticulas, o DNA é absorvido em microprojéteis como os cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungsténio e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos vegetais.

[00241] Após a transformação estável, a propagação vegetal é realizada. O método mais comum de propagação vegetal é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, no entanto, apresenta a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas normas Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos da planta transgénico arranjo. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que proporciona a reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.

[00242] A micropropagação é um processo de cultivo de plantas de nova geração a partir de um pedaço de tecido que tenha sido retirado de uma planto arranjo selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que tenham o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas à planta original e apresentam todas as suas características. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.

[00243] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de cultivo entre os estágios. Dessa forna, o processo de niicropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura tecidual inicial,- estágio dois, multiplicação da cultura tecidual,’ estágio três, diferenciação e formação da planta,- e estágio quarto, cultura e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura tecidual inicial, a cultura tecidual é estabelecida e certificada como sendo livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura Lecidual inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são dividas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas á luz ê gradativamente aumentada de forma que ela possa ser cultivada no ambiente natural.

[00244] De acordo com algumas aplicações da invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitórias de células de folhas, de células meristemáticas ou de toda a planta.

[00245] A transformação transitória pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção virai utilizando virus modificados do plantas.

[00246] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação de hospedeiros da plantas incluem o CaMV, o vírus mosaico do tabaco (TMV I tabaco mosaic virus), vírus mosaico do bromo [BMV I brome mosaic vírus) e o vírus mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV | beam common mosaic virus) . A. transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente Norte- Americana Na 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Japonês Publicado N° 63- 14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV) ; e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172- 189 (1988). As partículas pseudovirais para utilização na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.

[00247] De acordo com algumas aplicações da invenção, o vírus utilizado para transformação transitória é avirulento e, dessa forma, é incapaz de causar sintomas graves como a taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento da folha, amare lamento, estrias, formação de vesículas, formação de tumor e corrosão. Dm vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, p.ex., por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00248] Cepas virais adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, p.ex., da Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC I American Type Culture Collection) ou pelo isolamento de plantas infectadas. 0 isolamento de virus de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, conforme descrito, p.ex., por Foster e Tatlor, Eds. "Flant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance {Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1990. Acredita-se que rapidamente, os tecidos de uma planta infectada contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em uma solução tampão (p.ex., solução tampão fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[00249] A estrutura de vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotideo exógeno nào-viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al.. Virology (1989) 1’72:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1997) 6:307-311; French et al. Science £1986) 231:1294- 1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Patente Norte-Americana Nα 5.316.931.

[00250] Quando o virus é um virus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao vírus propriamente dito. ALternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmideo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor virai desejado com o DNA estranho. Então, o vírus pode ser extraído do plasmideo. Se o vírus for um vírus do DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA virai que é, então, replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirão a proteína de revestimento que irã encapsular o DNA virai. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e introduzido em um plasmídeo* Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as estruturas. Então, o vírus de RNA é produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA virai.

[00251] Em uma aplicação, um polinucleotideo virai de uma planta é fornecido, no qual a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência foi excluída de um polinucleotideo virai, uma proteína de revestimento virai não nativa da planta codificando a sequência e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da proteína de revestimento não nativa que codifica a sequência, capaz de se expressar no hospedeiro da planta, no envoltório do polinucleotideo virai recombinante da planta e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotideo virai recombinante da planta, foi introduzido. ALternativamente o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela introdução da sequência de polinucleotideo não nativo dentro dele, de forma que uma proteína seja produzida. 0 polinucleotideo virai recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenõmicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou de expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotideos no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar uns com ou outros e com os promotores subgenõmicos nativos. Sequências de polinucleotideo não nativas (estranhas) podem ser introduzidas adjacentes ao promotor subgenômico virai nativo da planta ou o promotor subgenômico viral nativo e o promotor subgenômico virai não nativo da planta, se houver mais de uma sequência de polinucleotideo for incluída. As sequências de polinucleotideo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00252] Em uma segunda aplicação, um polinucleotideo viral recombinante da planta é fornecido, como na primeira aplicação, exceto que a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência é colocada adjacente a um dos promotores genômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.

[00253] Em uma terceira aplicação, um polinucleotideo virai de planta recombinante é fornecido, no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi(ram) inserido(s) no polinucleotideo virai. Os promotores subgenômicos não nativos introduzidos são capazes de transcrever ou de expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinar uns com ou outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotideo não nativas podem ser introduzidas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir o produto desejado.

[00254] Em uma quarta aplicação, um polinucleotideo virai recombinante da planta é fornecido. como na terceira aplicação, de forma que a sequência codificadora da proteina de revestimento nativa seja substituída por uma sequência codificadora da proteina de revestimento nâo nativa.

[00255] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotideo viral recombinants da planta para produzir um vírus da planta recombinante. O polinucleotideo virai recombinante da planta ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotideo virai recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de genets} estranho(s) (polinucleotideo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteina desejada.

[00256] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance [Methods in Molecular Biology (Humana Pr) , Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Principles e Techniques in Plant Virology", Van Nostrand- Reinhold, New York.

[00257] Além do exposto acima, o polinucleotideo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo, dessa forma, a expressão de cloroplasto.

[00258] Uma técnica para introduzir sequências d® polinucleotideo exógeno no genoma dos cloxoplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células das plantas são tratadas quimicamente de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente uma. Então, o polinucleotideo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotideo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotldeos exógenos são selecionados de forma a serem integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, o polinucleotideo exógeno inclui, Além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotideo que é derivada do genoma do cloroplasto, Além disso, o polinucleotideo exógeno inclui um marcador selecionável que serve, pelos procedimentos de seleção sequencial, para verificar se todas ou se substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto, após essa seleção, incluirão o polinucleotideo exóqeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte-Americanas N° 4.545.050 e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Dessa forma, um polipeptideo pode ser produzindo pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se integra à membrana interna do cloroplasto.

[00259] Uma vez que os processos que aumentam a produção, produção de semente, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou produção de tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes que agem aditivamente ou em sinergia (vide, p.ex., em Quesda et al., Planta Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também prevê a expressão de uma pluralidade de polinucleotideos exógenos em uma planta hospedeira única para, desLa forma, alcançar efeito superior no teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00260] A expressão de uma pluralidade de polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se múltiplas estruturas de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotideo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00261] De forma alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo- se, em uma única célula da planta, uma única estrutura de ácido nucleico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotideos exógenos. Essa estrutura pode ser desenhada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrÓnico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotideo exógeno. A fim de permitir a cotradução dos polipeptideos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônica, as sequências de polinucleotideos podem ser interligadas através de uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES | internal ribosome entry site) que facilita a tradução da sequência de polinucleotideo posicionadas a jusante da sequência do IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptideos descritos acima será traduzida tanto no terminal 5' que tem o cap quanto nas duas sequências internas do IRES da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os diferentes polipeptideos na célula* ALternativamente, a estrutura pode incluir diversas sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotideo exógeno diferente.

[00262] A célula da planta transformada com a estrutura, incluindo uma pluralidade de polinucleotideos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00263] ALternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes estruturas de ácido nucleico, incluindo polinucleotideos exógenos diferentes, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progénie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.

[00264] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta expressando o polinucleotideo exógeno sob estresse abiótico.

[00265] Exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (p.ex., inundação, encharcamento), etiolaçào, baixa temperatura (p.ex., estresse por frio), alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação uv.

[00266] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotideo exógeno em condições limitantes do fertilizante (p.ex., condições limitantes de nitrogénio). Os exemplos não limitantes incluem o crescimento da planta nos solos com baixo teor de nitrogênio (40-50% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais), ou mesmo em deficiência de nitrogênio severa (0 a 10% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais).

[00267] Dessa forma, a invenção abrange plantas que expressam de forma exógena o(s) polinucleotideo(s), as estruturas de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptideo(s) da invenção.

[00268] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou de toda a planta, o nivel do polipeptideo codificado pelo polinucleotideo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipeptideo, Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA I enzyme- linked immuno sorbent assay}, radioimunoensaios (RIA | radio-immuno-assays), imunohistoquimica, imunocitoquimica, imunofluorescência e outros métodos semelhantes.

[00269] Métodos para determinar o nível do RNA transcrito do polinucleotideo exógeno na planta são bem conhecidos na técnica e incluem, p.ex., análise de Northern blotf análise de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR | reverse transcription polymerase chain reaction} (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ para RNA.

[00270] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitados em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotideos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MAS | marker assisted selection}, na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (p.ex., biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizantes). Os dados do ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP | restriction fragment length polymorphism) , microsatélites e polimorfismo de nucleotideo único (SNP I single nucleotide polymorphism), impressão genética (DFp | DNA fingerprinting), polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP I amplified fragment length polymorphism}, polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptideo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA*

[00271] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (p.ex., um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz) ; seleção de um traço bioquímico (p.ex., um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; p.ex., isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (p.ex., (raças patogênicas ou biotipos de insetos com bases no patôgeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).

[00272] Os polinucleotideos e polipeptideos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de forma segura e eficiente em termos de custo.

[00273] Linhagens vegetais que expressam de forma exógena o polinucleotideo ou o polipeptideo da invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço desejado da planta.

[00274] Portanto, de acordo com uma aplicação adicional da presente invenção, é fornecido um método de avaliação de um traço de uma planta, o método compreendendo: (a) expressar em uma planta ou em uma parte respectiva a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção; e (b) avaliar um traço de uma planta em comparação a uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (p.ex., não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando, deste modo, o traço da planta.

[00275] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, cerca de 80 %, pelo menos, cerca de 81 %, pelo menos, cerca de 82 %, pelo menos, cerca de 83 %, pelo menos, cerca de 84 %, pelo menos, cerca < ie 85 %, pelo menos, cerca de 86 %, pelo menos, cerca de 87 %, pelo menos, cerca de 88 %, pelo menos, cerca de 89 %, pelo menos, cerca de 90 %, pelo menos, cerca de 91 %, pelo menos. cerca de 92 %, pelo menos, cerca de 93 %, pelo menos, cerca de 94 %, pelo menos, cerca de 95 %, pelo menos. cerca de 96 %, pelo menos, cerca de 97 %, pelo menos. cerca de 9B %, pelo menos, cerca de 99 % , ou. digamos, 100 % homólogo à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ, «° 574- 930, 6266-8621 e 8623 “10550, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), aumento do teor de óleo, aumento da produção. aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, assim, a colheita.

[00276] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotideo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucléico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucléico selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. 1-573 e 931-6265, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio), aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.

[00277] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produção de um colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta transformada com um polinucleotideo exógeno pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N°: 1-573 e 931-626, caracterizado pela planta da colheita ser derivada de plantas selecionadas para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta tipo selvagem da mesma espécie, a qual é cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta da colheita tendo o aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita.

[00278] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produção de um colheita compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta transformada com um polinucleotideo exógeno codificando um polipeptideo pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por ex. 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N°! 574-930, 6266-8621 e 8623-10550, caracterizado pela planta da colheita ser derivada de plantas selecionadas para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta tipo selvagem da mesma espécie, a qual é cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta da colheita tendo o aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita.

[00279] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para cultivo de uma colheita, compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com os polinucleotideos exógenos da invenção, por exemplo, os polinucleotideos que codificam o polipeptideo de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da qualidade ou produção da fibra, em comparação a uma planta não transformada.

[00280] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polipeptideo definido nas ID SEQ. N° 574-930, 6266-8621, 8623-10549 ou 10550, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da qualidade ou produção da fibra e aumento do teor de óleo, em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00281] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotideo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polipeptideo definido nas ID SEQ. Nq 1-573, 931-6264 ou 6265, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da qualidade ou produção da fibra e aumento do teor de óleo, em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00282] 0 efeito do transgene (o polinucleotideo exógeno que codifica o polipeptideo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, conforme detalhado abaixo e na seção Exemplos a seguir.

[00283] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas [tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como privação de água, temperatura subótima (baixa temperatura, temperatura elevada), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse causada pelo sal, estresse osmótico, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00284] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que plantas transgênicas com tolerância a concentrações elevadas de sal apresentem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em condições com niveis elevados de sal. 0 estresse por sal pode ser efetuado de muitas maneiras como, p.ex., irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (p.ex., solução de Hoagland), ou submetendo as plantas à cultura em meio de crescimento hiperosmótico [p.ex., meio de Murashige-Skoog [meio MS) a 50%]. Como diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância ã salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características especificas do cultivar ou variedade específica da planta, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para conhecer as diretrizes com relação á concentração apropriada, consulte, Bernstein e Kafkafi, .Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002 e a referência lá contida).

[00285] Por exemplo, o teste de tolerância á salinidade pode ser realizado irrigando as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (p.ex., 50 mM, 100 mM, 200 mM, 4 00 mM de NaCl) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão regular do sal. Após a exposição â condição de estresse, as plantas são, frequentemente, monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos apareçam nas plantas do tipo selvagem. Dessa forma, a aparência fenotípica externa, o grau de emurchecimento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progénie da produção são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas.

[00286] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não estão limitados ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem maior biomassa do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00287] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios com cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era especifico do cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos de germinação sob estresse salino e osmótico, o meio é suplementado, p.ex., com 50 mH, 100 mN, 200 mN de NaCl ou com 100 mH, 200 mM NaCl, 400 mM de manitol.

[00288] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os gene? que conferem melhor sobrevida à planta depois de privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol nâo-iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar em plantas por 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 50 mN de sorbitol. O tratamento causa retardamento do crescimento, então, tanto as plantas de controle quanto as transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmida e seca), a produção e pelas taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração.

[00289] Inversamente, telas secas com base no solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotldeos detalhados acima. Sementes de plantas Arabdopsis de controle, ou de outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptideo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. 0 estresse à seca é obtido depois que a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente para melhorar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem emurchecirnento grave. As plantas recebem água novamente depois de obter uma fração significativa das plantas de controle exigindo emurchecirnento grave. As plantas são classificadas em comparação com os controles em relação a cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a reirrigação.

[00290] Tolerância ao estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, plantas maduras [25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período de resfriamento, resultando no retardamento do crescimento e em outros fenótipos, são comparados entre as plantas tanto de controle quanto transgênicas, medindo o peso da planta (úmida e seca) e comparando as taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração, o tamanho da planta, a produção e parâmetros semelhantes.

[00291] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é alcançada expondo as plantas a temperaturas acima de 34°C por um determinado periodo. A tolerância da planta é examinada depois de transferir as plantas de volta para 22°C para recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênlcas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem ao estresse por calor.

[00292] Eficiência no uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. 0 peso fresco (FW I fresh weight:) é registrado imediatamente; então, as folhas são colocadas por 9 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW I turgid weight) é registrado. O peso seco (DW I dry weight) total é registrado depois da secagem das folhas a 60QC a um peso constante. O teor relativo de água (RWC I relative water content) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Fórmula I RWC = [(FW - DW) / (TW - DW)] X 100

[00293] Eficiência no uso de fertilizante Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas foram cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, por exemplo, em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci EUA. 2004; 101:7833-8. As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos, o teor de óleo, etc. Semelhantemente, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente os mesmos parâmetros medidos sâo os mesmos listados acima. Dessa forma, a eficiência no uso de nitrogênio (NUE), a eficiência no uso de fosfato (PUE I phosphate use efficiency) e a eficiência no uso de potássio (KUE I potassium use efficiency) sâo avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de se desenvolverem sob condições de restrição de nutrientes.

[00294] Eficiência no uso de nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (p.ex., plantas Arabidopsis) sâo mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada) . Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. Então, as plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteina do broto e/ou do grão/semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácídos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes na utilização do nitrogênio.

[00295] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio utilizando plãntulas - O ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("’Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low- nitrogen conditions" Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7033- 7038). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: 0 meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNOa) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu- se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Agar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Estruturas para as quais somente sementes TI estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para estruturas nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisados. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite-se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele periodo. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter são utilizadas como controle,

[00296] Determinação do nitrogênio - O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter o N orgânico em NOj- (Purcell e King 1996 Argon, J. 88:111- 113), a redução mediada de Cd* modificada de NOr a NOz" (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm em relação a uma curva padrão de NaNOi. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00297] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação ao percentual de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma maneira. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. 0 meio basal é o meio MS a 50% (Murashíge e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473- 4 97) .

[00298] A germinação também é verificada em condições desfavoráveis como o frio (incubação a temperaturas inferiores a 10°C ao invés de 22°C) ou utilizando soluções para inibição da semente que contenham concentrações elevadas de um osmólito como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mH, 500 mM de NaCl).

[00299] O efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, a produção e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.

[00300] Vigor da planta - 0 vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento como a área de folha, o comprimento das fibras, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e parâmetros semelhantes por periodo.

[00301] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. Por exemplo, as imagens das plantas cultivadas em estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença da área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00302] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por periodo (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha},

[00303] A Area de Crescimento Relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II, Fórmula II; Área da Taxa de Crescimento Relativo = Coeficiente de regressão da área ao longo do tempo.

[00304] Assim, a taxa da área de crescimento relativo é expressa em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento do comprimento é expressa em unidades de 1/dia.

[00305] Produção de semente - A avaliação da produção de semente por planta pode ser realizada medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, o número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e dividido pelo número de plantas.

[00306] Por exemplo, as sementes totais de 8-16 plantas podem ser coletadas e pesadas utilizando, p.ex,, uma balança analítica, e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção de semente por área de cultivo pode ser calculada da mesma maneira levando em consideração a área de cultivo determinada para uma única planta. 0 aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas capazes de serem cultivadas em uma determinada área.

[00307] Além disso, a produção de semente pode ser determinada através do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e, então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.

[00308] 0 Peso de 1000 Sementes pode ser calculado utilizando a Fórmula III: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra / peso da amostra X 1000

[00309] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando a Fórmula IV. Fórmula IV; índice de colheita = Produção médio da semente por planta / Peso seco médio.

[00310] Concentração de proteína no grão - O teor de proteína no grão (g de proteína no grão nr2) é estimado como o produto da massa do grão N (g de lí do nr2) multiplicado pela taxa de conversão de N/proteina de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a relação do teor de proteína no grão por massa unitária do grão (g de proteína no grão kg-1 do grão).

[00311] Comprimento da fibra - 0 comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHM I upper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. 0 fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual (http://www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00312] De acordo com algumas aplicações da invenção, o aumento da produção de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão

[00313] Conforme mencionado, o aumento da produção da planta pode ser determinado por vários parâmetros* Por exemplo, o aumento da produção de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panicula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros* Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada*

[00314] De modo semelhante, o aumento da produção da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor da proteínas por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00315] O aumento da produção da canola pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00316] 0 aumento da produção do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00317] Teor de óleo - 0 teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetal da planta. Brevemente, os lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (p.ex., semente) moendo o tecido da planta na presença de solventes específicos (p.ex., hexano ou éter de petróleo} e extraindo o óleo em um extrator continuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR I nuclear magnetic resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado liquido da amostra [Vide, p.ex., Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Onlinha)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NI I near infrared} , que utiliza a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no W0/2001/023884, que é com base na extração de óleo com solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz para a corrente de gás e nas partículas de óleo, que forma uma luz refletida detectável.

[00318] Dessa forma, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de culturas comercialmente desejadas (p.ex., biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou de um órgão reprodutor como o número de sementes ou a biomassa da semente),

[00319] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.

[00320] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta),

[00321] O óleo vegetal (incluindo c óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edivel, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria- prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.

[00322] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[00323] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetal (o óleo da porção vegetal da planta).

[00324] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula de planta forma uma parte da planta.

[00325] De acordo com outra aplicação da presente invenção, é fornecido um alimento ou ração, compreendendo as plantas ou uma parte respectiva da presente invenção.

[00326] Conforme utilizado aqui, o termo "aproximadamente" refere-se a + 10%.

[00327] Os termos *compreende"t "compreendendo", "inclui", "incluindo", "apresentando" e suas conjugações significam "incluindo, mas não se limitando a".

[00328] 0 termo "consistindo de" significa "incluindo e limitado(a) a".

[00329] 0 termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicado,

[00330] Conforme utilizada aqui, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural, exceto se o contexto claramente especificar o contrário. P.ex., o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas deles,

[00331] Ao longo do presente pedido, várias aplicações dessa invenção podem ser apresentadas em formato variado. Deve-se compreender que a descrição em formato variado é meramente para conveniência e brevidade e não deverá ser considerada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Portanto, a descrição de uma variedade deve ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Por exemplo, a descrição de uma variação como a de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente revelado subvariações como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5/ de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc,, bem como números individuais dentro daquela variação, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.

[00332] Sempre que uma variação numérica for indicada no presente documento, isso significa incluir qualquer numeral citado {fracionai ou integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/varia de" um primeiro número indicado "a" a um segundo número indicado são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais e integrais entre eles.

[00333] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidas, ou prontamente desenvolvidas a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00334] Deve-se observar que determinadas características da invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, várias características da invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinaçâo adequada ou da forma apropriada em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[00335] Várias aplicações e aspectos da presente invenção são delineados acima e, conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00336] Agora faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações da invenção de forma não limitante.

[00337] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas minuciosamente na literatura. Vide, p.ex., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols, 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definidas nas Patentes Norte-Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Ceil Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology**, W. H. Freeman and Co., New York (1980) ; imunoeπsaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, vide, p.ex., as Patentes Norte-Americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ; "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCI? Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Proteina Purification and Characteriration - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ; todos os quais são incorporados por referência como se totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais sâo apresentadas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos descritos nessas obras sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui por referência.

MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL.

[00338] Extração de RNA — Tecidos cultivados em diversas condições de crescimento (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen (http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid=469]- Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostradas. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio liquido e ressuspensos em 500 μl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 μl de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. O RNA foi eluído em 30 μl de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA EUA) . Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação do conjunto da expressão.

[00339] Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados, de acordo com algumas aplicações da invenção, nos quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como "eixo X" para a correlação com o transcriptoma do tecido que foi utilizado como "eixo Y". Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação "R", utilizando a correlação de Ervilharson junto de um valor-p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (RJ entre os níveis de uma expressão de gene em um determinado tecido e um desempenho fenotipico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre O gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotipica (p.ex., aumento na produção, taxa de crescimento, eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico e semelhantes).

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE MELHORAM A PRODUÇÀO E TRAÇOS AGRÍCOLAS IMPORTANTES EM PLANTAS

[00340] Os presentes inventores identificaram polinucleotldeos cuja expressão respectiva em plantas podem, aumentar a produção, produção de fibra, qualidade da fibra, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico (ABST), eficiência no uso de fertilizantes (FUE), tal como eficiência no uso de nitrogênio (NU£) e eficiência no uso de água (WUE) de uma planta, conforme segue,

[00341] Todos os conjuntos de dados da sequência de nucleotideos utilizados agui foram originados das bases de dados disponíveis publicamente ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de planta foram introduzidos em uma base de dados abrangente e única. Outras informações na expressão de gene, anotação de proteina, enzimas e caminhos também foram incorporadas.

[00342] As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas - Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR, versão 6 (http://www {ponto] arabidopsis (ponto} org/)]; - Genoma de arroz [produção IRGSP 4.0 (http://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]; Choupo [Populus trichocarpa, liberação 1.1 de JGI (liberação conjunta vl.O) (http://www (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]; Brachypodium [conjunto JGI 4x, http://www (ponto) brachpodium (ponto) org)]; - Soja [DOE-JGI SCP, versão GlymaO (http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; - Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (http://www (ponto) genoscope (ponto) ens (ponto) fir /)]; - Mamona [TIGR/J, Instituto Craig Venter, conjunto 4x [(http://msc (ponto) jevi (ponto) org/rcommunis]; - Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Genoma parcialmente constituído do Milho (http://maizesequence (ponto) org/];

[00343] Sequências expressas de EST e mRNA foram extraídas das seguintes bases de dados: - GenBank (http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/dbEST/J; - RefSeq (Http://www (ponto) πcbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/J; - TAIR (Http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/j ;

[00344] Rases de dados de proteínas e caminhos - Uniprot [http://www (ponto) uniprot [ponto) org/]. - AraCyc (http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jspj. - ENZYME [http://expasy (ponto) org/enzyme/J,

[00345] Os conjuntos de dados de tnicroarraπ jos foram baixados de: - GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) - TAIR (http://www.arabidopsis.org/). - Dados de microarranjos de propriedade exclusiva (Veja, WO2Q03/1229S0) e Exemplos 2-9 abaixo.

[00346] Informações de QTL e SNPs - Gramene [http://www (ponto) gramene (ponto) org/qtl/]. - Panzea [http://www (ponto) pan∑ea (ponto) org/index (ponto) html] .

[00347] Montagem da Base de Dados - foi realizada para construir uma base de dados ampla, rica, anotada, confiável e fácil de analisar compreendendo sequências gcnõmicas de mRNA, ESTs, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bem como dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTLs e outras informações relevantes.

[00348] O conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de análise, aprimoramento, estruturação e anotação genética que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genética permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcrições antissenso, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade cientifica {vide, por exemplo, "widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of ALu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1289-91; "Computationa1 analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002] e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.

[00349] Agrupamento de EST e genético - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica [arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antissenso.

[00350] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponíveis, o software de agrupamento "expressed LEADS" foi aplicado.

[00351] Anotação genética - Genes e proteínas previstos foram anotados como segue; A busca de comparação de sequências [http://blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] contra todos os UniProt da planta [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/} foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrição putativa foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteina prevista da transcrição. As proteinas previstas foram analisadas pelo InterPro [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/].

[00352] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear as transcrições previstas com os caminhos da AraCyc.

[00353] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas, utilizando o algoritmo de comparação [http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.

[00354] Perfil da expressão genética Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenõtipos.

[00355] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para produção.

[00356] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento, de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência, compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta [por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso) , o estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de ESTs nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.

[00357] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis of the Melon Fruit Transcriptoπte Based On 454 Pyrosequeπcing) em: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica com base na abundância relativa de ESTs nos dados foi realizada pelo pi rosequenciamento 4 54 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. 0 pirosequenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences} de amostras de cDNA não-normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (ESTs) que se agruparam em 67,477 unigenes (32.357 singletons e 35-120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [http://www (ponto) icugi (ponto) org/1 confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento, Padrões de expressão de genes selecionados se encaixaram bem em seus dados de qRT-PCR.

[00358] No geral, 242 genes (ID SEQ, N’ 1-573 para polinuclectídeos; ID SEQ. Ne 574-930 para polipeptideos) foram identificados como tendo um maior impacto na produção dá planta, produção da fibra, qualidade da fibra, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e/ou eficiência no uso de fertilizantes quando a expressão respectiva é aumentada em plantas. Os genes identifiçados, suas sequências de polipeptideos e polinucleotldeos curados, suas sequências atualizadas de acordo com o banco de dados Genbank e as sequências das proteinas e genes clonados foram resumidos na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 — Genes identificados para aumento da produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizantes de uma planta.

Tabela 1: São fornecidos os genes identificados, sua anotação, organismo e identificadores de sequência de polinucleotideos e polipeptideos. "Polin." = polinucleotideo; "polip." = polipeptideo.

EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM A PRODUÇÃO, PRODUÇÃO DA FIBRA, QUALIDADE DA FIBRA, TAXA DE CRESCIMENTO, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, VIGOR, ABST E/OU NUE DE UMA PLANTA.

[00359] Os conceitos de ortOlogia e paralogia foram recentemente aplicados às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações do genoma completo. Os ortòlogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos; O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização e os últimos são relacionados por eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos decorrentes de eventos de duplicação antiga tendem a ter divergido na função enquanto verdadeiros ortólogos são mais propensos a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo.

[00360] Para investigação e identificação adicionais de ortólogos putativos dos genes que afetam a produção da planta (p.ex., produção de fibra, qualidade da fibra, produção de óleo), teor de óleo, produção de semente, taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico e eficiência no uso de fertilizantes (FUE) e/ou eficiência no usa do nitrogênio de uma planta, todas as sequências foram alinhadas utilizando a Ferramenta de Pesquisa de ALinhamβnto Local Básica [BLAST I Basic Local ALignment Search Tool]. Sequências suficientemente semelhantes foram teπtativameπte agrupadas. Estes oztólogos putativos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como uma representação das relações evolutivas entre os táxons biológicos. Grupos ortólogoa putativos foram analisados quanto a sua concordância com o filograma e, em casos de divergências, esses grupos ortôlogos foram divididos adaquadamente.

[00361] Dados de expressão foram analisados e as bibliotecas E5T foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos personalizadas, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão semelhante, através do desenvolvimento com regulação ascendente na fase especifica, como na fase de estocagem de grãosj e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão similar em seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, como a semente), As anotações de todos os ESTs agrupadas a um gene foram analisadas estatisticamente por comparação da sua frequência no conjunto em relação a sua abundância na base de dados, permitindo a estrutura de um perfil de expressão numérica e gráfica de tal gene, o que é denominado "expressão digital [digital expression]". A lógica de utilizar estes dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotipica de QTLs, SNPs e expressão fenotipica baseia-se na suposição de que os verdadeiros ortôlogos tendem a reter a funçào idêntica ao longo do tempo evolutivo. Estes métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações sobre as semelhanças funcionais entre dois genes homólogos, semelhanças no nivel da sequência de aminoácidos - idênticos nos domínios proteicos e similaridade em perfis de expressão,

[00362] A pesquisa e identificação de genes homólogos envolve o rastreio de informação de sequência disponível, por exemplo, em bases de dados públicas, tais como à Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ | DNA Database of Japan}, Genbank e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório de Biologia Nuclear (EMEL I European Molecular Biology Laboratory} ou suas versões ou a base de dados MIPS. Um número de diferentes algoritmos de pesquisa tem sido desenvolvido, incluindo, mas não se limitando ao conjunto de programas referidos como programas de BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotideos (0LASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas projetadas para consultas de sequência de proteína (BLAST? e TBLASTN} {Coulson, Trends in Biotechnology: 76-RO, 1394; Birreπ et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e a comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística de similaridade entre as duas sequências. O software para a realização de análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Outros destes tipos de software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. A GAP usa o algoritmo de Needleman and Wuπsch (J. Mol. Biol. 49: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimizam o número de lacunas.

[00363] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família genética. A análise de uma familia genética pode ser realizada utilizando a análise de similaridade de sequência. Para realizar esta análise pode-se utilizar programas padrões para alinhamentos múltiplos, por exemplo, o Clustal W. Uma árvore de Agrupamento de Vizinhos [Neighbor Joining) das proteínas homólogas aos genes na presente invenção pode ser utilizada para fornecer uma visáo geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada usando um programa de alinhamento conforme descrito abaixo. Espera-se que outras plantas tenham um gene funcional semelhante (ortologo) ou de uma familia de genes semelhantes e tais genes fornecerão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros ca família podem ser úteis nos métodos da presente invenção. Exemplos de outras plantas inlcuem, mas não se limitando a cevada (Hordewn vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Milho (Zea mays), ALgodão (Gossypium), Canola (Brassica napus}, Arroz (Oryza sativa), Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor) , Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus). Tomate (Lycopersicon esculencum) e Trigo (Triticun aestivum),

[00364] As análises acima mencionadas para uma homologia de sequência podem ser realizadas em uma sequência de comprimento total, mas podem também basear-se em uma comparação de certas regiões, tais como os domínios conservados. A identificação de tais domínios também seria boa dentro do âmbito de conhecimento de um especialista na técnica e envolvería, por exemplo, um formato legível para computador dos ácidos nucleicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e c uso de informações publicamente disponíveis sobre os domínios de proteínas, motivos conservados e caixas Esta informação está disponível na base de dados PMKjOM (http://www (ponto) biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsrn/dbbrowser/protocol/prodomqry (ponto) htnl), PIR (http://pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/J ou Pfam (http://www (ponto) sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/), Programa? de análise de sequências desenvolvidos para pesquisa de motivo podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionados acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não estão limitados a, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.

[00365] Um especialista na técnica pode utilizar as sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína englobam peptideos, oligopeptídeos, polipeptídios, proteínas e enzimas que têm substituições de aminoácidos, delações e/ou inserções em relação ã proteína não modificada em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante à proteína não modificada a partir da qual são cerivadas. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (modificações conservadoras, tais antigenicidade, propensão para formar uma estrutura ou quebrar estruturas helicoidais ou estruturas de 3 folhas). Tabelas de substituição conservative são bera conhecidas na técnica (vide, p.ex., Creighton (1964) Proteins. W.H. Freeman and Company}, Os homólogos de um aminoácido englobam ácidos nucleicos com substituição de nucleotídeo, delações e/ou inserções em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante ao ácido nucleico não modificado a partir da qual são derivadas.

[00366] Os polinucleotldeos e polipeptideos com uma homologia significativa aos genes identificados descritos na Tabela 1 (Exemplo 1, acima) foram identificados a partir das bases de dados, utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para a primeira fase e a agulha (pacote EMBOSS) ou alinhamento FRAME+ algoritmo para a segunda fase. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi usada (estabelecendo o parâmetro "-F F").

[00367] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base na identidade global de, pelo menos, 00% para a sequência polipeptidica genética principal.

[00368] Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou de nucleotídeos foram utilizadas neste pedido.

[00369] Entre duas proteínas (após o filtro blaatp):

[00370] ALgoritma EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=9 gapextend=2, 0 restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00371] Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotidica (após o filtro rblastn):

[00372] Aplicativo GenCore 6.0 OneModel, utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model-frame+ p2π.model mode^qglobal -q=protein.sequence - db= nucleotide. sequence. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00373] As sequências de polipeptideos de consulta foram as ID SEQ N0: 574-530 (que sâo codificadas pelos polinucleotideos da ID SEQ N°: 1-573, apresentadas na Tabela 1, acima) e as sequências ortólogas e homólogas identificadas tendo, pelo menos, 90% da identidade da sequência global sâo fornecidas na Tabela 2, abaixo. Espera-se que estes genes homólogos aumentem a produção, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta.

Tabela 2 - Homólogos dos genes/polipeptídeos identificados para aumento da produção, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta. Tabela 2: São fornecidos polipeptideos e polinucleotldeos homólogos dos genes para aumento dos genes de produção (p.ex., produção de óleo, produção de semente, produção e/ou qualidade da fibra), teor de óleo, taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta listados na Tabela 1 acima.

[00374] A homologia foi calculada como % de identidade sobre as sequências de alinhamento. As sequências de consultas foram as sequências de polinucleotldeos da ID SEQ N°: 1-573 e as sequências de polipeptideos da ID SEQ N’: 574-930 e as sequências abordadas foram sequências de proteínas identificadas na base de dados com base em uma identidade global maior que 80% com relação às sequências traduzidas previstas das sequências de nucleotideos da pesquisa ou das sequências de polipeptideos. "P.N." = polinucleotideo; "P.P." = polipeptideo; "Algor." = algoritmo (utilizado para alinhamento de sequência e determinação de homologia percentual); "Horn." - homologia; "Ident." = identidade.

[00375] 0 resultado da abordagem genômica funcional descrita aqui é um conjunto de genes com estimativas elevadas de melhoria da produção e/ou outros traços agrícolas importantes, tais como taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção e/ou qualidade da fibra, biomassa, taxa de crescimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta, aumentando sua expressão.

[00376] Embora estime-se que cada gene tenha seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais de um gene forneça um efeito aditivo ou sinérgico sobre o desempenho de produção e/ou outros traços agrícolas importantes. Ao alterar a expressão de cada gene descrito aqui, o gene sozinho ou o conjunto de genes aumenta a produção global e/ou outros traços agrícolas importantes e, deste modo, espera-se aumentar a produtividade agrícola.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 4 4K

[00377] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies (http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 47.500 genes e transcrições de cevada. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados â produção ou vigor, várias características de planta de 25 acessos de Cevada diferentes foram analisadas. Dentre elas, 13 acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisado utilizando o teste de correlação Pearson (http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos experimentais

[00378] Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [meristema, flor, espiga em inicialização, caule, folha bandeira], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÂTICA EM GERAL".

[00379] Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada

Tabela 3: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Cevada.

[00380] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 13 acessos de Cevada em 4 blocos repetitivos (chamados A, B, C e D) , cada um contendo 4 plantas por lote, foram cultivadas em estufa com rede. As plantas foram fenotipadas em uma base diária de acordo com o descritor padrão de cevada (Tabela 4, abaixo) A colheita foi realizada enquanto 50% das espigas foram secadas para evitar a liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas para a parte vegetal e espigas, delas, 5 espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para análise adicionai de grâo, tal como medição do tamanho, contagem do grão por espiga e de produção de grão por espiga. Todo o material foi secado no forno e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho), utilizando varredura e análise de imagem. 0 sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P4 3,0 Ghz) e um programa de domínio público - Imaged 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java)# o qual foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS). Tabela 4 - Descritores padrão da cevada

Tabela 4.

[00381] No final do experimento (50% das espigas foram secadas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas e as medições a seguir foram realizadas: (i) Grãos por espiga - 0 número total de grãos das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. 0 grão médio por espiga foi calculado dividindo o número total do grão pelo número de espigas. (ii) Tamanho médio do grão (cm) - Os grãos totais das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foram digitalizados e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de formação de imagem digital. A digitalização de grão foi feita utilizando o digitalizador Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisados com software Imagem J. O tamanho médio do grão foi calculado dividindo o tamanho total do grão pelo número total do grão. (iii) Peso médio do grão (mgr) - Os grãos totais das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foram contados e pesados. O peso médio foi calculado dividindo o peso total pelo número total do grão, (iv) Produção de grão por espiga (gr) - Os grãos totais das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foram pesados. A produção de grão foi calculada dividindo o peso total pelo número de espiga, (v) Análise do comprimento da espiga - As cincos espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando fita métrica, excluindo as arestas. (vi) Análise do número da espiga - As espigas por planta foram contadas.

[00382] Parâmetros adicionais foram medidos, conforme segue:

[00383] Pontuação de hábito de cultivo - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada com relação a sua natureza de hábito de cultivo. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.

[00384] Pilosidade de folhas basais - No estágio de cultivo 5 (revestimento da folha fortemente ereta; final do perfilhamento) , cada uma das plantas foi pontuada com relação à natureza de pilosidade da folha antes da última. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.

[00385] Altura da planta - No estágio da colheita (50% das espigas foram secadas), cada uma das plantas foi medida com relação à altura, utilizando fita métrica. A altura foi medida do nível do solo ao topo da espiga mais longa excluindo as arestas

[003861 Dias até a floração - Cada uma das plantas foi monitorada com relação à data de floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data de semeadura até a data da floração.

[00387] Pigmentação do caule - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada com relação à cor do caule. A escala que foi utilizada foi 1 para verde até 5 para roxo total.

[00388] Peso seco vegetal e produção de espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secadas), todas as espigas e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-D são coletados. 0 peso da biomassa e das espigas de cada unidade foi separado, medido e divido pelo número de plantas.

[00389] Peso seco = peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raizes) após secar a 70°C no forno por 48 horas;

[00390] Produção de espiga por planta = peso total da espiga por planta (g) após secar a 30’C no forno por 48 horas. Tabela 5 - Parâmetros correlacionados â Cevada (vetores)

Tabela 5. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada (vetores).

Resultados experimentais

[00391] 13 diferentes acessos de Cevada foram cultivados e caracterizados com relação a 13 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 6 e 7 abaixo. A subsequente análise de correlação entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma (Tabela 3) e os parâmetros médios foi conduzida. Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados (Tabela 8 abaixo). Tabela 6 - Parâmetros medidos de IDs de correlação nos acessos de Cevada

Tabela 6* São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nos acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação (vide Tabela 5). Tabela 7 - Acessos de cevada, parâmetros adicionais medidos

Tabela 7. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nos acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação (vide Tabela 5). Tabela 8 - Correlação entre o nivel de expressão dos polinucleotideos selecionados da invenção e seus homólogos nos tecidos específicos ou estágios de desenvolvimento e o desempenho fenotípico através de acessos de Cevada.

Tabela 8. Sâo fornecidas as correlações (R) e os valores-p (P) entre os niveis de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos ou estágios de desenvolvimento (Conjuntos de expressão) e o desempenho fenotipico em várias produções (produção de semente, produção de óleo, teor de óleo) biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor [Vetor (Vet.) de correlação (Cor.) Expressão (Exp.)J Vetor Cor. - vetor de correlação especificado nas Tabelas 5, 6 e 7; Conjunto de Exp. = conjunto de expressão especificado na Tabela 3.

EXEMPLO -4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÁO DE ALTA PRODUTIVIDADE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS A PRODUÇÃO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS 44K

[00392] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis thaliana, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetados com base nos dados da base de dados T1GR ATUI v.5 e base de dados Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de biomassa, produção ou vigor, várias características da planta de 15 ecotipos diferentes Arabidopsis foram analisadas. Dentre elas, nove ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de corrrelação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos Experimentais

[00393] Tecidos Analisados de Arabidopsis - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo, raiz, folha, flor em antese, semente em 5 dias após a floração (DAF I days after flowering) e semente em 12 DAF, representando diferentes caracteristicas de planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito anteriormente em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE B10INFORMÁTICA EM GERAL". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 9 abaixo. Tabela 9 - Tecidos utilizados dos conjuntos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 9: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis (1-5). DAF = dias após floração.

[00394] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor - Oito dos nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (nomeados A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por lote. As plantas foram cultivadas em uma estufa em condições controladas em 22eC e fertilizante N:P:K (20:20:20; proporções em peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K) ] foi adicionado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados através do estágio de semeadura das plantas cultivadas em uma cultura de tecido em placas de ágar transparente de cultivo vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pela formação de imagem digital.

[00395] Formação de Imagem Digital em Cultura de Tecido - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi utilizado para capturar imagens de brotos cortados em placas de ágar quadradas. O sistema de aquisição de imagem consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (lâmpadas de 4x150 Watts) e localizada em uma sala escura.

[00396] Formação de Imagem Digital em Estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera anexada a uma lente de 24 mm de comprimento focal (Canon série EF), colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar as imagens de plantas cortadas maiores em banheiras brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As banheiras brancas eram de forma quadrada com medições de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, as banheiras foram colocadas no pé da montagem de ferro, evitando a luz solar direta e fundição de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.

[00397] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - Imaged 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos [U.S National Institutes of Health] e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2046 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia I Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS) .

[00398] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3 a 4 plantas representativas foram escolhidas de cada lote dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como área total da folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lamina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00399] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento das raizes foi documentado (vide exemplos nas Figs. 3A-F) . A taxa de crescimento das raizes foi calculada de acordo com a Fórmula V. Fórmula V: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do tempo.

[00400] Análise da taxa de crescimento vegetal - foi calculada de acordo com a Fórmula VI. A análise foi finalizada com a aparência de plantas sobrepostas. Fórmula VI: Area da taxa de crescimento relativo vegetal = Coeficiente de regressão da área vegetal ao longo do tempo.

[00401] Para comparação entre ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado peio número de folhas verdadeiras. Nos casos onde as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes [por exemplo, no dia 10 e no dia 13}, apenas a maior amostra foi escolhida e adicionada à comparação de Anova.

[00402] Análise de sementes em siliquas - No dia 70, 15 a 17 siliquas foram coletados a partir de cada lote nos blocos D e E. Os siliquas escolhidos eram de cor marrom clara, mas ainda intacta. Os siliquas foram abertos na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro, uma Fig. digital de alta resolução foi tirada para cada lote. Utilizando as imagens, o número de sementes por sillqua foi determinado.

[00403] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A~C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 grama foi medido para cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja d vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00404] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A-C foram coletadas. As sementes de Columbia de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat N° O80951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 boras em calor médio de 50 °C. Uma vez que a extração tenha finalizado, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 *C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingier's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00405] Análise de comprimento de síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 siliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostrados no bloco A. Os siliquas escolhidos eram da cor verde-amarelo e foram coletados a partir de partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento do siliqua.

[00406] Peso seco e produção de semente - No dia 60 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30 °C em uma câmara de secagem. 0 peso da biomassa e semente de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo raizes) após secar a 30 °C em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (g).

[00407] Produção de óleo - A produção de óleo foi calculada utilizando a Fórmula VII. Fórmula VII: Produção de óleo de semente ~ Produção de semente por planta (g.) 4 % de Óleo na semente.

[00408] índice de colheita (semente) - 0 índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (descrita acima): índice de colheita = produção média de semente por planta/ Peso seco médio.

Resultados Experimentais

[00409] Nove diferentes ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizado com relação a 18 parâmetros (nomeados como vetores). Tabela 10 - Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 10. São fornecidos os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (ID de Correlação N’ 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); g = grama(s); mg = miligrama(s).

[00410] Os valores caracterizados são resumidos nas Tabelas 11 e 12 abaixo. Tabela 11 - Parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis

Tabela 11: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 3 = Produção de sementes por planta (grama) ; 7 = Produção de óleo por planta (mg) ; 6 = % de óleo por semente; 12 = Peso de 1000 sementes (g) ; 4 » Matéria seca por planta (g) ; 2 = índice de colheita; 5 = Área total da folha por planta (cm2) ; 1 ~ Sementes por síliqua; 18 = Comprimento da síliqua (cm); 13 = Taxa de crescimento vegetal (cm2/dia) até que as folhas estejam em sobreposição; 8 = Crescimento relativo da raiz (cm/dia) (dia 13); 9 - Comprimento da raiz no dia 1 (cm) ; 10 » Comprimento da raiz no dia 13 (cm); 11 = Peso fresco por planta (g) na fase de florescimento; 14. - Comprimento da lâmina (cm); 15 ■ Largura da lâmina (cm); 16 « Comprimento/largura da folha; 17 - Circularidade da lâmina. Tabela 12 - Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em acessos de Arabidopsis

Tabela 12: São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [folha, flor, semente e raiz; Conjuntos de expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento [Vetor de correlação (corr.)] sob condições de estresse ou condições normais em acessos de Arabidopsis. P = valor p.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÁO DE ALTA PRODUTIVIDADE SOB CONDIÇÕES LIMITANTES DE NITROGÊNIO E NORMAIS UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ARABIDOPSIS 4 4K

[00411] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage-50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de produção, NUE ou vigor, várias características de planta de 14 ecotipos diferentes de Arabidopsis foram analisadas. Dentre elas, dez ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos experimentais

[00412] Dois tecidos de plantas [folhas e caules] crescendo em dois diferentes níveis de fertilização de nitrogênio (Nitrogênio a 1,5 mW ou Nitrogênio a 6 mM) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BJOINFORMATICA EM GERAL". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 13 abaixo. Tabela 13 - Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 13: São fornecidos os número de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis.

[00413] Avaliação de parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Arabidopsis sob diferentes niveis de fertilização de nitrogênio - 10 acessos de Arabidopsis em 2 lotes repetitivos, cada um contendo 8 plantas por lote, foram cultivados na estufa. 0 protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte; sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos Eppendorf contendo meio de sal basal Murashige-Skoog x 0,5 e cultivadas a 23°C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas no escuto por 10 dias. Então, mudas de tamanhos similares foram cuidadosamente transferidas para potes preenchidos com uma mistura de perlita e turfa em uma proporção de 1:1. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo nitrogênio inorgânico a 1,5 mH na forma de KNOj, suplementado com CaClz a 2 mH, KH2PO4 a 1,25 mH, MgSO< al,50 mH, KC1 a 5 mH, H3BO3 a 0,01 mM e microelementos, enquanto condições normais de irrigação (condições normais de nitrogênio) foram alcançados aplicando uma solução de nitrogênio inorgânico a 6 mM também na forma de KNO3, suplementado com CaClj a 2 mM, KH2PO< a 1,25 mM, MgSOí a 1,50 mM, H3BO3 a 0,01 mM e microelementos. Para seguir o crescimento da planta, bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitantes de nitrogênio foram iniciadas e subsequentemente a cada 3 dias por cerca de mais 15 dias. A área de planta de roseta foi então determinada a partir das fotos digitais. 0 software Imaged foi utilizado para quantificar o tamanho da planta das fotos digitais [http://rsb (ponto) info (ponto) nih (ponto) gov/ij/J utilizando scripts proprietários projetados para analisar o tamanho da área de roseta de plantas individuais como uma função de tempo. O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de dominio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet (http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos para arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00414] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 14 abaixo. Tabela 14 - Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 14 São fornecidos os parâmetros corre acionados de Arabidopsis (vetores). = Nitrogênio nas concentrações anotadas; "g" - gramas; "SPAD" = niveis de clorofila; "t50" = tempo onde 50% das plantas floresceram; "g/ unidade de SPAD" = biomassa da planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida por SPAD. "DW" ■ Peso Seco da Planta; ”FW" - Peso Fresco da Planta; "nível N /DW" - nível de nitrogênio da planta medido na unidade SPAD por biomassa de planta [g] ; "DW/ nivel N" ~ biomassa da planta por planta [g]/ unidade SPAD; Area de roseta (medida utilizando análise digital); Cobertura de oampo no dia indicado [%] (calculada dividindo a área de planta total pela área de lote total); área de lâmina foliar no dia indicado [cm2] (medida utilizando análise digital); RGR (taxa de crescimento relativa) da Área de roseta no dia indicado [cm3/dia] ; t50 floração [dia] (o dia no qual 50% da planta floresceu); produção de semente/ área de roseta no dia 10 [g/cma] (calculada); produção de semente/lãmina foliar [g/cm2] (calculada); produção de semente/ nível N [g/unidade SPAD] (calculada).

[00415] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção e NUE - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada contendo 8 plantas por lote, em uma estufa com condições de temperatura controladas por cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com concentração diferente de nitrogênio conforme descrito acima dependendo no tratamento aplicado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pela formação de imagem digital.

[00416] Formação de Imagem Digital - Ensaio na Estufa

[00417] Um sistema de aquisição de imagem, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 400D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon, série EF-S) colocada am uma montagem de alumínio personalizada, foi utilizado para capturar imagens de plantas plantadas em containers dentro de uma estufa controlada pelo ambiente. O processo de captura de imagem é repetido a cada 2 e 3 dias começando no dia 9 a 12 até o dia 16 a 19 (respectivamente) a partir do transplante.

[00418] O sistema de processamento de imagem que foi utilizado é descrito no Exemplo 2 acima. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3988x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem foram salvos para arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS) .

[00419] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da lâmina foliar, cobertura de campo, diâmetro de roseta e área de roseta.

[00420] Área da taxa de crescimento relativa: A área da taxa de crescimento relativa da roseta e das folhas foi calculada de acordo com as Fórmulas VIII e IX, respectivamente. Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo da área de roseta = Coeficiente de regressão da área de roseta ao longo do tempo. Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo do número da folha da planta « Coeficiente de regressão do número da folha da planta ao longo do tempo.

[00421] Produção de semente e peso de 1000 sementes - No final do experimento, todas as sementes de lotes foram coletadas e pesadas a fim de medir a produção de semente por planta em termos do peso de semente total por planta (g). Para o cálculo de peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 grama foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

100422] Peso seco e produção de semente - No final do experimento, a planta foi colhida e deixada secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesadas e divididas pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raizes) após secagem a 30 °C em uma câmara de secagem.

[00423] índice de Colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima [índice de colheita = produção média de semente por planta/ peso seco médio).

[00424] Tso dias para floração - Cada uma das repetições foi monitorada para a data da floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data da semeadura até 50 % dos lotes floridos.

[00425] Nível de nitrogênio na planta - O teor de clorofila das folhas é um bom indicador do estado do nitrogênio na planta uma vez que o grau de verdor da folha está altamontc correlacionado a esse parâmetro. 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote. Com base nessa medição, os parâmetros tais como a proporção entre produção de semente por unidade de nitrogênio [produção de semente/ nivel N » produção de semente por planta [g] / unidade SPAD], planta DW por unidade de nitrogênio [DWZ nível N = biomassa da planta por planta [g]/ unidade SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [N nível/DW- unidade SPAD / biomassa de planta por planta (g)] foram calculados.

[00426] Porcentagem de redução na produção de semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas em condições limitantes de nitrogênio comparado à produção de semente produzida em níveis normais de nitrogênio expressos em porcentagens (%).

Resultados Experimentais

[00427] 10 diferentes acessos de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivados e caracterizados com relação a 34 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabela 15 abaixo). A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 13) e os parâmetros médios foi conduzida. Tabela 15 - Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis

Tabela 15: Sâo fornecidos os parâmetros medidos sob vários tratamentos em vários ecotipos (acessos de Arabidopsis). Tabela 16 - Correlação entre o nível de expressão de genes selecionadas de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de estresse abiótico em acessos de Arabidopsis

Tabela 16. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou caules; conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Vetor de correlação (Cor.)) em condições de estresse ou condições normais através em acessos de Arabidopsis. P = Valor P.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇAO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS A AEST UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K

[00428] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de sorgo, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. 0 oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 44,000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção, ABST e NÜE, várias características de planta de 17 híbridos diferentes de sorgo foram analisadas. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00429] Correlação de variedades de sorgo através de ecotipos cultivados sob condições regulares de cultivo, condições graves de seca e condições de baixo nitrogênio.

Procedimentos experimentais

[00430] 17 variedades de sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetidos, em campo. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue;

[00431] Condições regulares de cultivo: as plantas de sorgo foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (370 litros por metro, fertilização de 14 unidades de 21% de ureia por período de cultivo inteiro).

[00432] Condições de seca: sementes de sorgo foram semeadas em solo e cultivadas em condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, por volta do estágio V8 (oitos folhas verdes são totalmente expandidas, inicialização não iniciada ainda). Nesse ponto, a irrigação foi interrompida, e o estresse de estiagem grave foi desenvolvido.

[00433] Condições de fertilização de baixo nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de cultivo regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes da floração.

[00434] Tecidos de sorgo analisados Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados por cada tratamento. Tecidos [Folha bandeira, meristema da Flor e Flor] das plantas cultivadas sob condições normais, estresse de estiagem grave e condições de baixo nitrogênio foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 17 abaixo. Tabela 17 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo

Tabela 17 : São fornecidos os conj untos de expressão de transcriptoma de sorgo de 1-9. Folha bandeira = a folha abaixo da flor; Merist.ema de flor = Meristema apical após iniciação da panícula; Flor = a flor no dia da antese. Os conjuntos de expressão 3, 6, e 9 são das plantas cultivadas sob condições normais; os conjuntos de expressão 2, 5 e 8 são das plantas cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio; os conjuntos de expressão 1, 4 e 7 são das plantas cultivadas sob condições de seca.

[00435] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de formação de imagem digital:

[00436] No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta e os parâmetros a seguir foram medidos e coletados:

[00437] Area Média do Grão [cmz) - Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00438] Proporção Média Inferior e Superior da Área do Grão, Largura, diâmetro e perímetro - Projeção do grão da área, largura, diâmetro e perímetro foram extraídos das imagens digitais utilizando o pacote de fonte aberta imagej (nihj. Os dados de semente foram analisados em níveis médios de lote, conforme segue:

[00439] Média de todas as sementes. Média da fração superior de 20% - contendo fração superior de 20% das sementes. - Média da fração inferior de 20% - contendo fração inferior de 20% das sementes.

[00440] Adicionalmente, a proporção entre cada fração e a média do lote foi calculada para cada um dos parâmetros de dados.

[00441] No final do período de cultivo, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. (i) Area Média da Cabeça (cm2) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de ‘Cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de ‘Cabeças'. (lí) Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 ‘Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. 0 comprimento da ’Cabeça' (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'Cabeças'. (iii) Largura Média da Cabeça (cm) - No final do periodo de cultivo, 5 ’Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A largura de ’Cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de ’Cabeças'. (iv) Largura Média da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 ’Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O perímetro da ’Cabeça' foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de ’Cabeças'.

[00442] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto} nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em uir. formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de salda de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos como arquivos de textos e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00443] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.

[00444] Peso Total do Grão/Cabeça (g) (produção do grão) - No final do experimento, as cabeças ('Cabeças' da planta) dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. 0 peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de cabeças totais por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total dos grãos de 5 cabeças foi dividido por 5.

[00445] FW da Cabeça/ grama da Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas) o total de cabeças e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (g) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total (FW da Cabeça/ g da planta com base no lote} e para 5 (FW da Cabeça/ g da planta com base nas 5 plantas).

[00446] Altura da Planta - As plantas foram caracterizadas com relação à altura durante o período de cultivo em 5 pontos temporais. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação à altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do solo ao topo da folha mais longa.

[00447] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.

[00448] Peso Fresco Vegetal e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescência estava seca), toda a inflorescéncia e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso da biomassa e Cabeças de cada lote foi separado, medido e divido pelo número de Cabeças.

[00449] Biomassa da Planta (Peso fresco) - No final do experimento (quando a inflorescéncia estava seca), todo o material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado. A biomassa das plantas sem a inflorescéncia foi medida e divido pelo número de Plantas.

[00450] FW das Cabeças/(FW das Cabeças + FW das Plantas) - O peso fresco total das cabeças e sua respectiva biomassa de planta foram medidos no dia da colheita. 0 peso daa cabeças foi dividido pela soma doa pesos de cabaças e plantas.

Resultados experimentais

[00451] 17 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e caracterizadas para diferentes parâmetros: A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 15-20) e uma análise de correção subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 17) e QS parâmetros médios, foi realizada (Tabela 21) . Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 18 - Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 18. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores) , = gramas,- "SPAD" = Níveis de clorofila; "FW" » Peso fresco da Planta; ''normal" ” condições de cultivo padrão. Tabela 19 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo

Tabela 19: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros {conforme descrito acima) medidos nos acessos de Sorgo [ecotipo) em condições normais, de baixo nitrogênio e da seca, As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 20 - Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo

Tabela 20: Sàq fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Sorgo (ecotipo) em condições normais, de baixo nitrogênio e de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 21 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições normais ou condições de estresse abiótico através dos acessos de Sorgo

Tabela 21. São fornecidas as correlações (R) entre cs niveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos (Folha bandeira, Meristema de Flor, caule, e Flor; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições de estresse ou condições normais através de acessos de Sorgo. P = valor p. II. Correlação de variedades de Sorgo através de ecotipos cultivados sob estresse de salinidade ou condições de estresse

[00452] Parâmetros relacionados ao vigor do Sorgo sob 100 mM de NaCl e baixa temperatura (10 + 2’C) - Dez variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa cora rede em condições semi-hidropõnicas. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue: As sementes do sorgo foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculite e turfa em uma proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas à solução de alta salinidade (100 mM de NaCl além da solução de Hoagland completa), baixa temperatura (10 ± 2eC na presença de solução de Hoagland completa) ou em solução de cultivo normal [solução de Hoagland Completa em 28 ± 2DC] .

[00453] A solução completa de Hoagland consiste de: KNOj - 0,808 gramas/litro, MgSO< - 0,12 gramas/litro, KHjPO« - 0,172 gramas/litro e 0,01 % (volume/volume) de microelementos de 'Super coratin' (Ferro-EDDHA [etilenodiamina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxifenilacetico)]- 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8] .

[00454] Todas as 10 variedades de Sorgo selecionadas foram amostradas por cada tratamento. Dois tecidos [folhas e raizes] cultivando em 100 mM de NaCl, baixa temperatura (10 ± 2’0 ou sob condições normais (Hoagland completa em uma temperatura entre 28 ± 2°C) foram amostrados e o RNA foi extraido, conforme descrito acima em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE B10INFORMÁTICA EM GERAL". Tabela 22 - Conjuntos de expressão de transcriptoma do Sorgo

Tabela 22: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo. Condições frias = 10± 2“C; NaCl = 100 mM de NaCl,* baixo nitrogênio =1,2 mM de Nitrogênio; condições normais = 16 mM de Nitrogênio.

Resultados experimentais

[00455] 10 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e caracterizadas para os parâmetros a seguir: "Número de Folha Normal" = número de folha por planta sob condições normais (média de cinco plantas) ; "Altura da Planta Normal" = altura da planta sob condições normais (média de cinco plantas); "DW da Raiz 100 mM de NaCl" - peso seco da raiz por planta sob condições de salinidade (média de cinco plantas); A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 24 abaixo, A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 25). Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 23 - Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 23: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores) . Condições frias = 1Q ± 2°C; NaCl = 100 mH de NaCl; baixo nitrogénio “1,2 mM de Nitrogênio; condições normais = 16 mM de Nitrogênio* Tabela 24 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo

Tabela 24: São fornecidos os parâmetros medidos sob condições de 100 mM de NaCl e baixa temperatura (8-10*0 de acessos de Sorgo (ID de Semente) de acordo com os números do ID de Correlação (descritos na Tabela 23 acima). Tabela 25 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em raízes e o desempenho fenotipico em condições normais ou condições de estresse abiótico através dos acessos de Sorgo

Tabela 25. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp.)J e o desempenho fenctipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação)] em condições de estresse abiótico (salinidade) ou condições normais através de acessos de Sorgo. Cor. - Vetor de correlação conforme descrito acima (Tabela 23) . P = valor p.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO €0K

[00456] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade, utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Milho, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. 0 oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60K genes e transcrições de milho, projetados de acordo com dados da base de dados pública (Exemplo 1). Para definir as correlações e ntre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de produção, biomassa ou vigor, várias características de planta de 12 híbridos de Milho diferentes foram analisadas. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson (http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos experimentais

[00457] Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo Espiga (floração - Rl) , folha (floração “RI), Grão da Folha da parte basal da espiga e Grão da espiga distai, representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito em “MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL". Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme resumido na Tabela 26 abaixo. Tabela 26 - Tecidos utilizados para os Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho

Tabela 26: São fornecidos os números de identic ficação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Milho.

Os parâmetros a seguir foram coletados:

[00458] Área do Grão (cm2) - No final do periodo de cultivo, os grãos foram separados da espiga- Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00459] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura do grão (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00460] Área da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00461] Comprimento da Espiga e Largura da Espiga (cm) -No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de espigas.

[00462] Preenchido por Toda a Espiga - foi calculado como o comprimento da espiga com grãos fora da espiga total.

[00463] Percentual de Espiga Preenchida - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. 0 Percentual do grão da espiga preenchida foi a espiga com grãos fora da espiga total e foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de Espigas.

[00464] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http:7/rsbweb (ponto) nih [ponto] gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3096x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão [padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos como arquivos de textos e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS) .

[00465] Parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.

[00466] Peso Normalizado do Grão por planta (g), medição do parâmetro de produção - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. Seis espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso do grão foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%. G peso médio do grão normalizado por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão normalizado pelo número total de espigas por lote (com base no lote) . No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por Ê.

[00467] Peso fresco (FW) da Espiga (g) - No finai do experimento, (quando as espigas foram colhidas) o total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As espigas das plantas (total e 6) foram pesadas (g) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para total (FW da Espiga por lote) e para 6 (FW da Espiga por planta).

[00468] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho, A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.

[00469] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas com relação ao número de folha durante o período de cultivo em 5 pontos temporais. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folha/ contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote,

[00470] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando o coeficiente de regressão da alteração do número da folha ao longo do tempo,

[00471] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote. Os dados foram obtidos após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS),

[00472] Peso seco por planta - No final do experimento^ quando todo c material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado, pesada e divido pelo número de plantas.

[00473] Diâmetro da espiga [cm] - O diâmetro da espiga no meio da espiga foi medido utilizando uma régua.

[00474] Diâmetro do sabugo [cm] - Q diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00475] Número de Fileiras do Núcleo por Espiga - 0 número de fileiras em cada espiga foi contado. A média de 6 espigas por lote foi calculada.

[00476] índice de área da folha [LAI I Leaf area index] = área total de folha de todas as plantas em um lote. A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar.

[00477] Produção/LAI [kg] - é a proporção entre as produções de grão totais e o índice da área de folha total. Tabela 27 - Parâmetros correlacionados ao milho (vetores)

Tabela 27.

[00478] Doze variedades de milho foram cultivadas e caracterizadas por parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 28-29 abaixe. A correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma para todos ou subconjuntos de linhas foi feita pela unidade bioinformática e os resultados foram integrados à base de dados {Tabela 30 abaixo). Tabela 28 - Parâmetros medidos em Híbrido de Milho

Tabela 20. Tabela 29 - Parâmetros medidos em parâmetros adicionais de Híbrido de Milho

Tabela 29 Tabela 30 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais através das variedades de milho

Tabela 30. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos tConjuntos de expressão (Exp.)l e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação 5 (Cor.)}] em condições normais através de variedades de milho. P = valor p.

EXEMPLO 8 PRODUÇÁO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 60K

[00479] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies [http;//www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879] . O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60K genes e transcrições de Cevada. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, várias características de planta de 15 acessos de Cevada diferentes foram analisadas. Dentre elas, 10 acessos englobando a variação 20 observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http: //www (ponto) davidmlane (ponto) com/ hyperstat/A34739 (ponto) htmlj.

Procedimentos experimentais

[00480] Tecidos de Cevada analisados - Quatro tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [folha, meristema, ponta da raiz e raiz adventícia], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu am ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 31 e 32 abaixo. Tabela 31 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada (conjunto 1)

Tabela 31 Tabela 32 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada (conjunto 2)

Tabela 32

[00481] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 15 acessos de Cevada em 5 lotes repetitivos, cada um contendo 5 plantas por lote, foram cultivados na estufa com rede. Três tratamentos diferentes foram aplicados: as plantas foram fertilizadas e regadas regularmente durante o cultivo da planta até a colheita (conforme recomendado para o cultivo comercial) ou com baixo Nitrogénio (80% menos Nitrogênio) ou sob estresse devido â seca. As plantas foram fenotipadas em uma base diária, seguindo o descritor padrão de cevada (Tabelas 33 e 34, abaixo). A colheita foi realizada enquanto todas as espigas eram secadas. Todo o material foi seco no forno e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS) .

[00482] Número de grãos - 0 número total de grãos de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. Número de grãos por lote foi contato.

[00483] Peso do grão [gj - No final do experimento, todas as espigas dos lotes foram coletadas. Os grãos totais de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foram pesados. A produção de grão foi calculada por lote.

[00484] Análise do comprimento e largura da espiga - NQ final do experimento, O comprimento e largura das cinco espigas escolhidas por planta foram medida utilizando fita métrica, excluindo as aristas.

[00485] Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.

[00486] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida com relação à sua altura, utilizando fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da espiga mais longa excluindo as aristas em dois pontos temporais no cultivo vegetal [30 dias após semeadura} e na colheita.

[00487] Peso da espiga — O peso da biomassa e das espigas de cada lote foi separado, medido e divido pelo número de plantas.

[00488] Peso seco - peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secar a 7CPC no forno por 48 horas em dois pontos temporais no Cultivo vegetal (30 dias apôs semeadura) e na colheita.

[00469] Peso seco da raiz - peso total da parte da raiz abaixo do solo após secar a 70aC no forno por 43 horas na colheita,

[00490] proporção Raiz/Broto - A proporção Raiz/Broto foi calculada utilizando a Fórmula X-

[00491] Fórmula X: Proporção Raiz/Broto = peso total da raiz na colheita/peso total da parte vegetal acima do solo na colheita (RBíH/BlH)).

[00492] ND Total de Perfilhos - todos os perfilhas foram contados por lote em dois pontos temporais no Cultivo vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita,

[00493] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.

[00494] FW da raiz (g), comprimento da raiz (cm) e N* de raizes laterais - 3 plantas por lote foram selecionadas para medição do peso da raiz, comprimento da raiz e para contagem do número de raízes laterais formadas.

[00495] FW do Broto - o peso de 3 plantas por lote fui registrado em diferentes pontos temporais.

[00496] Teor relativo de água - O peso fresco (FW) de três folhas de três plantas cada de ID diferente de semente foi registrado de imediato; em seguida, as folhas foram embebidas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. 0 peso seco total (DW) foi registrado após secar as folhas a 60*C a um peso constante. O teor relativo da água (RWCJ foi calculado de acordo com a Fórmula 1 acima.

[00497] índice de Colheita (para cevada) - 0 Índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XI. Fórmula XI: índice de Colheita = Peso médio do grão por planta/ (Peso seco vegetal médio por planta + peso médio do grão por planta),

[00498] Taxa de crescimento relativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) da Altura da Planta, SPAD e número de perfilhas foi calculada, conforme segue: Fórmula XII: Taxa de crescimento relativo da altura da planta = coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do tempo. Fórmula XIII’. Taxa de crescimento relativo de SPAD = coeficiente de regressão das medidas de SPAD ao longo do t empo. Fórmula XIV; Taxa de crescimento relativo do número de perfilhos = coeficiente de regressão do Número de perfilhes ao longo do tempo. Tabela 33 - Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores para conjunto 1)

Tabela 33. Sâo fornecidos os parâmetros correlacionados ã Cevada. TP diz respeito ao ponto temporal; DW = peso seco; FW - peso fresco; Baixo N = Baixo Nitrogênio. Tabela 34 - Parâmetros correlacionados A Cevada (vetores para conjunto 2)

Tabela 34. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada. TP diz respeito ac ponto temporal; DW = peso seco; FW = peso fresco; Baixo N = Baixo Nitrogênio.

Resultados experimentais

[00499] 15 acessos diferentes de Cevada foram cultivados e caracterizados com relação à diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estào resumidos nas Tabelas 3S-37 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 38-39}, A seguir, os resultados foram integrados á base de dados. Tabela 35 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de Cevada (conjunto 1)

Tabela 35. Tabela 36 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de Cevada {conjunto 2)

Tabela 36. Tabela 37 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de Cevada (conjunto 2) - linhas adicionais

Tabela 37. Tabela 38 - Correlação entra o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições da baixo nitrogênio, normais ou condições de estresse devido à seca através dos acessos de Cevada (conjunto 1)

Tabela 38 Sáo fornecidas as correlações (R) entre 05 niveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp.)J e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/óu vigor (vetor de Correlação 10 (Cor.))] em condições normais, de baixo nitrogénio e seca através de variedades de cevada. P - valor p. Tabela 39 - Correlação entre o nivel de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo nitrogênio, normais ou condições de estresse devido ã seca através dos acessos de Cevada (conjunto 2)

Tabela 39. Sâo fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp.}] e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação 10 (Cor.))] em condições normais# de baixo nitrogênio e seca através de variedades de cevada. P = valor p.

EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE BRACHYPODIUM E ANÁLISE DE CORRELAÇÁO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE BRACHYPODIUM fiOK

[00500] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando entre o fenótipo da planta e o nivel de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de brachypodium, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=5O079]. O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60K genes e transcrições de brachypodium. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados â produção ou vigor, várias características de planta de 24 acessos de brachypodium diferentes foram analisadas. Dentre elas, 22 acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA e análise de hibridizaçào genômica comparativa (CGH I comparative genomic hybridization).

[00501] A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson (http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) htral].

[00502] Uma análise de correlação adicional foi feita pela comparação do fenótipo da planta e o número de cópia do gene. A correlação entre o sinal de hibridização do número de cópia normalizado e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html[.

Procedimentos experimentais

[00503] Tecidos de Brachypodium Analisados - dois tecidos [folha e espiga] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 40 abaixo. Tabela 40 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Brachypodium

Tabela 40. Do ID de Conjunto N° 1, a amostra foi utilizada para extrair o DNA; do ID de Conjunto N* 2 e 3, as amostras foram utilizadas para extrair o RNA.

[00504] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção de Brachypodium - 24 acessos de Brachypodium foram cultivados em 4-6 lotes repetitivos (8 plantas por lote), em uma estufa. 0 protocolo de cultivo foi como segue: sementes de brachypodium foram semeadas em lotes e cultivadas em condições normais. As plantas foram fenotipadas de forma contínua durante o período de cultivo e na colheita (Tabela 42-43 abaixo). 0 sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/J. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00505] No final do período de cultivo, os grãos foram separados das espigas e cs parâmetros a seguir foram medidos e utilizando o sistema de formação de imagem digital e coletados:

[00506] Números de perfilhos - todos os perfilhes foram contados por planta na colheita (média por lote) .

[00507] Número de cabeça - No final do experimento, as cabeças foram colhidas de cada lote e foram contadas.

[00508] Peso Total dos Grãos por lote (g) - No final do experimento, as cabeças ('Cabeças* da planta) dos lotes foram coletadas, as cabeças foram debulhadas e os grãos foram pesados. Além disso, o peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de cabeças totais por lote (com base no lote).

[00509] Maior número de espiguetas - 0 maior número de espigueta por cabeça foi calculado por planta (média por lote).

[00510] Número médio de espiguetas - 0 número médio de espiguetas por cabeça foi calculado por late.

[00511] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida com relação ã sua altura, utilizando fita métrica. A altura foi medida do nível do solo à base da espiga da espiga mais longa na colheita.

[00512] Peso das espiguetas (g) - 0 peso da biomassa e das espigas de cada lote foi separado, medido por lote.

[00513] Peso Médio da Cabeça - calculado dividindo o peso das espiguetas pelo número de cabeça (g).

[00514] índice de Colheita - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XI [conforme descrito acima).

[00515] índice de Espiguetas - 0 índice de espiguetas foi calculado utilizando a Fórmula XV.

[00516] Fórmula XV: índice de Espiguetas = Peso Médio das Espiguetas por planta/ (Peso seco vegetal médio por planta mais Peso Médio das Espiguetas por planta)

[00517] Número Percentual de cabeças com Espiguetas - 0 número de cabeças com mais de uma espigueta por planta foi calculado e o percentual de todas as cabeças por planta foi calculado.

[00518] Matéria seca total por lote - calculada como parte vegetal acima do solo, mais todo O peso seco da espigueta por lote.

[00519] Peso de 1000 gràos - No final do experimento, todos os grãos de todos os lotes foram coletados e medidos e o peso de 1000 foi calculado.

[00520] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando sistema de formação de imagem digital:

[00521] No final do periodo de cultivo, os grãos foram separados das espigas e os parâmetros a seguir foram medidos e coletados: (i) Área Média do Grão (c/m3) - Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos. (ii) Comprimento Médio do Grão, perímetro e largura (cm) - Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos /ou largura do grão (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00522] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - Imaged 1.37, Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http;//rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de IQ Meqa Pixels (3089x2552 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos como arquivos de textos e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS) . Tabela 41 - Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)

Tabela 41. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao brachypodiuπ). IDs de Correlação 1-21 são idênticos aos IDs de Correlação 26-46, respectivameπte, e os IDs de Correlação 23-25 são idênticos aos IDs de Correlação 47-49, respectivamente

Resultados experimentais

[00523] 24 acessos diferentes de Brachypadíuiü foram cultivados e caracterizados com relação à diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média pata cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 42-43 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptomas e os parâmetros médios (Tabela 44} foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 42 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais

Tabela 42. Os ID's de Correlações: 1, 2, 3, 4, 5...etc. se referem àqueles descritos na Tabela 41 acima [parâmetros correlacionados ao Srachypodium (vetores)]. Tabela 43 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais

Tabela 43. Os ID's de Correlações: 1, 2, 3, 4, 5...etc. se referem àqueles descritos na Tabela 41 acima [parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]* Tabela 44 - Correlação entre o nivel de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico em condições normais através das variedades de brachypodium

Tabela 44. São "ornec Ldas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação (Cor.))) em condições normais através de variedades de brachypodium. P = valor p.

EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO PAINÇO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO PAINÇO 60K

[00524] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho painço, produzido pela Agilent Technologies [Http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=5O079].

[00525] O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60K de genes e transcrições de milho painço. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, várias características de planta de 15 acessos de milho painço diferentes foram analisadas. Dentre elas, 11 acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA.

[00526] A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) htnl}.

Procedimentos experimentais

[00527] Tecidos de milho painço analisados - três tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [folha, flor e caule], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 45 abaixo. Tabela 45 - Conjuntos de expressão de transcriptona de milho painço Canjuntos de Expressão 10 de Conjunto

Tabela 45.

[00528] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção de milho painço - 14 acessos de miho painço foram cultivados em 5 lotes repetitivos, no campo. Sementes de miho painço foram semeadas no solo e cultivadas em condições normais no campo. As plantas foram fenotipadas de forma continua durante o período de cultivo e na colheita (Tabela 47-48 abaixo). O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - Imaged 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) níh (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00529] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando sistema de formação de imagem digital:

[00530] No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta e os parâmetros a seguir foram medidos e coletados: (i) Área Média do Grão (cm2) - Uma amostra de '200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos. (ii) Comprimento Médio do Grão e largura (cm) - Uma amestra de '-200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos e largura do grão (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00531] No final do periodo de cultivo, 14 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. (i) Área Média da Cabeça (cm2} - A Área de 'Cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo numero de 'Cabeças'. (ii) Comprimento Médio da Cabeça {mm} - O comprimento da 'Cabeça' (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'Cabeças' .

[00532] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público * Imaged 1.37, Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3680x2552 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos como arquivos de textos e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS) .

[00533] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote*

[00534] Peso Total do Grão (g) - No final do experimento, as cabeças ( 'Cabeças' da planta) dos lotes foram coletadas, debulhadas e os grãos foram pesados. Além disso, o peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de cabeças totais por lote (com base no lote).

[00535] Peso da cabeça e número de cabeça - No final do experimento, as cabeças foram colhidas de cada lote e foram contadas e pesadas (kg) .

[00536] Biomassa na colheita - No final do experimento, o material vegetal dos lotes foi pesado.

[00537] Peso seco = peso total da parte vegetal acima dc solo (excluindo raí zes) após secar a 70 °C no forno por 48 horas na colheita;

[00538] Matéria seca total por lote * calculada como parte vegetal acima do solo, mais todo o peso seco das cabeças por lote.

[00539] Número de dias para antese - Calculado como o número de dias a partir da semeadura até 50% do lote chegar na antese. Tabela. 46 - Parâmetros correlacionados ao milho painço (vetores)

Tabela 46. Sâc fornecidos os parâmetros correlacionados ao milho painço.

Resultados experimentais

[00540] 14 acessos diferentes de milho painço foram cultivados e caracterizados com relação à diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JM? e os valores estão resumidos nas Tabelas 47-48 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médias foi conduzida (Tabela 49) . Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 47 - Parâmetros medidos dos IDs de correlação em acessos de milho painço sob condições normais

Tabela 47; Os ID's de Correlação: 1, 2t 3, 4, 5...etc. se referem àqueles descritos na Tabela 4 6 acima [parâmetros correlacionados ao milho painço (vetores)]. Tabela 48 - Parâmetros medidos dos acessos de milho painço sotj condições normais

Tabela 48: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5...etc. se referem àqueles descritos na Tabela 46 acima [parâmetros correlacionados ao milho painço (vetores)]. Tabela 49 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico em condições normais através das variedades de milho painço

Tabela 49. São fornecidas as correlações <R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação (Cor.)}] em condições normais, de baixo nitrogênio e seca através de variedades de painço. P - valor p.

EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SOJA (GLYCINE MAX) E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SOJA 4 4K

[00541] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Soja, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50S79] . O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 42,000 genes e transcrições de Soja. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou estrutura da planta ou parâmetros relacionados ao vigor da planta, as 29 variedades diferentes de Glycine max foram analisadas e 12 variedades foram, ainda, utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson.

[00542] Correlação dos níveis de expressão dos genes de Glycine max com características fenctipicas através do ecotipo.

Procedimentos experimentais

[00543] 29 variedades de Soja foram cultivadas em três lotes repetitivos, em cantpo. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue: Sementes de Soja foram semeadas no solo e cultivadas sob condições normais até a colheita. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou estrutura da planta ou parâmetros relacionados ao vigor, as 12 variedades diferentes de Soja (de 29 variedades} foram analisadas e usadas para análise de expressão de gene. A análise foi realizada em dois períodos de tempo pré-determinados: no conjunto da vagem (quando as vagens da soja são formadas] e no momento da colheita (quando 25 vagens da soja estão prontas para colheita, com sementes maduras), Tabela 50 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de Soja

Tabela 50.

[00544] Extração de RNA - Todas as 12 variedades de Soja selecionadas foram amostradas por tratamento- Tecidos de planta [folha, raiz- Caule. Vagem, Meristema apical. Botões de flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. 0$ parâmetros de dados coletados foram conforme segue;

[00545] Diâmetro da base do ramo principal (mm] no conjunto da vagem - diâmetro da base da média do ramo principal (diâmetro da base) de três plantas por lote.

[00546] Peso fresco [g/planta] no conjunto de vagem - peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo as raizes) antes de secar no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00547] Peso seco [g/planta] no conjunto de vagem - peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo as raizes) apôs secar em 7O0C no forno por 48 horas no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00548] Número total de nós com vagens nos ramos laterais [valor/planta] - contagem dos nós que contêm vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00549] Número de ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem de ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote,

[00550] Peso total de ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00551] Peso total de vagens no caule principal no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00552] Número total de nós no caule principal [valor/planta] - contagem do número de nós no caule principal começando do primeiro nó acima do solo, média de três plantas por lote.

[00553] Número total de vagens com 1 semente nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00554] Número total de vagens com 2 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00555] Número total de vagens com 3 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00556] Número total de vagens com 4 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00557] Número total de vagens com 1 semente no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por Lote.

[00558] Número total de vagens com 2 sementes nc caule principal nc conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00559] Número total de vagens com 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00560] Número total de vagens com 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de très plantas por lote.

[00561] Número total de sementes por planta no conjunto de vagem [valor/planta) - contagem do número de sementes nos ramos laterais e caule principal na conjunta de vagem, média de três plantas por lote.

[00562] Número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00563] Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lota.

[00564] Altura da Planta no conjunto de vagem [cm/planta] - comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal o conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00565] Altura da Planta na colheita [cm/pXanta] - comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal na colheita, média de três plantas por lote.

[00566] Peso total de vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nús ramos laterais nO cônjdnto de vagem, média de três plantas por lote.

[00567] Proporção do número de vagens por nó no caule principal no conjunto de vagem - calculada na fórmula XVI, média de três plantas por lote. Fórmula XVI: Número total de vagens no caule principal / Número total de nós no caule principal, média de três plantas por lote.

[00568] Proporçéo do número total de sementes nos caule principal com relação ao número de sementes nos ramos Laterais - calculada na fórmula XVII, média de três plantas por lote. Fórmula XVII: Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem/ Número Total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.

[00569] Peso total de vagens por planta no conjunto de vagem [g/planta) - peso de todas as vagens nos ramos laterais e caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[0057O] Dias até 50% da floração [dias] - número de dias até 50% da floração para cada lote,

[00571] Dias até 100% da floração [dias] ~ número de dias até 100% da floração para cada lote.

[00572] Maturidade [dias] - medida como 95% das vagens em um lote que amadureceram (se tornaram 100% marrons}, A queda atrasada da folha e caules verdes não são considerados na atribuição de maturidade. Os testes são observados 3 dias por semana, dia sim, dia não, para maturidade. A data de maturidade é a data em que 95% das vagens alcançaram a cor final, A maturidade é expressa em dias após 31 de agosto [de acordo com a definição aceita de maturidade nos Estados Unidos, Lista de Descritores para SOJA, http://www (ponto) ars-grin (ponto) gov/cgi- bin/npgs/html/desclist (ponto) pl?51J.

[00573] Qualidade da semente [classificada de 1 a 5] - medida na colheita; uma estimativa visual com base em várias centenas de sementes, O parâmetro é classificado de acordo com as pontuações a seguir, considerando a quantidade e o grau de enrrugamento, revestimento com defeito (rachaduras), sem esverdeado, e mofado ou outro pigmento. Classificação é 1-muito bom, 2-bom, 3-razoável, 4-fraca, 5-muito frada,

[00574] Depósito [classificado de 1 a 5] - é classificado na maturidade por lote de acordo com as pontuações a seguir: 1-a maioria das plantas em um lote está ereta; 2 -todas as plantas inciinando-se ligeiramente ou algumas plantas para baixo; 3 - todas as plantas se inclinando moderadamente, ou 25% a 50% para baixo; 4 - todas ag plantas inclinando-se consideravelmente, ou 50% a 80^ para baixo; 5 - a maioria das plantas está para baixo. Nota: uma pontuação intermediária, tal como 1,5, é aceitável.

[00575] Tamanho da semente [gj - peso de 1000 sementes por lote normalizado a 13% de umidade, medido na colheita.

[00576] Peso total de sementes por planta [g/planta] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado} como peso em gramas ou sementes limpas ajustadas a 13% de umidade e dividido pelo número total de plantas em duas fileiras internas de um lote podado.

[00577] Produção na colheita [ alqueire/hectare] - calculada na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado) como peso em gramas ou sementes limpas, ajustadas a 13% de umidade e, então, expressas como alqueires por acre.

Resultados experimentais

[00578] Doze variedades diferentes de Soja, linhas 1 a 12, foram cultivadas e caracterizadas com relação a 34 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 52-53 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida (Tabela 54) . Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 51 - Parâmetros correlacionados a Soja (vetores)

Tabela 51. Tabela 52 - Parâmetros medidos nas variedades da Soja (linhas 1-6}

Tabela 52. Tabela 53 - Parâmetros medidos nas variedades da Soja (linhas 7-12)

Tabela 53, Tabela 54 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições normais através das variedades de soja

Tabela 54. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp) j e o desempenhe fenotípico [produção, biomassa, e estrutura da planta (Vetor de Correlação (Cor.))] 5 sob condições normais através de variedades da soja. P = valor p.

EXEMPLO 12 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TOMATE 44K

[00579] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre fenótipos relacionados à NUE e expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de tomate, produzida pela Agilent Technologies [http://www (ponto] chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage^50B79], 0 oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de tomate. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção, NUE e ABST, várias características da planta de 18 diferentes variedades de tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades englobando a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA* A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00580] Correlação de variedades de tomate através de ecotipos cultivados sob condições de crescimento regular, com baixo Nitrogênio e em seca.

Procedimentos Experimentais:

[00581] 10 variedades de tomate foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por lote, cultivado em estufa com rede. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi conforme segue:

[00582] Condições de cultivo regular: variedades de tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m3 de água por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate).

[00583] Condições de fertilização de baixo nitrogênio: variedades de tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m2 por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate) até o estágio de floração. Nesse momento, a fertilização com nitrogênio foi interrompida.

[00584] Estresse por seca: uma variedade de tomate foi cultivada sob condições normais (4-6 Litros/m2 por dia) até o estágio de floração- Nesse momento, a irrigação foi reduzida a 50% comparado às condições normais. As plantas foram fenotipadas em uma base diária, seguindo o descritor padrão de tomate (Tabela 12) . A colheita foi conduzida enquanto 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros) . As plantas foram separadas para a parte vegetal e frutos, deles, 2 nós foram analisados para parâmetros adicionais de inflorescencência tais como tamanho, número de flores, e preso de inflorescência. O peso fresco de todo material vegetal foi medido. Os frutos foram separados por cor (vermelho vs. verde) a de acordo com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JWP de análise estatística (instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados sâo resumidos nas Tabelas 13-15, aqui abaixo.

[00585] Tecidos de tomate analisados * Dois tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima* Por conveniência, cada tipo de tecido da informação da expressão do microarranjo recebeu um 10 de Conjunto, conforme resumido na Tabela 55 abaixo. Tabela 55 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de tomate

Tabela 11: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do tomate.

[00586] A Tabela 56 fornece os parâmetros correlacionados ao tomate (Vetores) . A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 57-55 abaixo. A análise de correlação subsequente foi conduzida (Tabela 60}. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 56 - Parâmetros correlacionados ao tomate (vetores)

Tabela 56- São fornecidos cs parâmetros correlacionadas do tomate. "g" = gramas; "FW" = peso fresco; "NUE" = eficiência no uso de nitrogênio; "RWC" ■ teor relativo da água; "NUpE" = eficiência na absorção de nitrogênio; "SPAD" = níveis de clorofila; "Hl" = Índice de colheita (peso vegetal dividido na produção); "SLA" = área foliar especifica (área foliar dividida pela peso seco da folha), Tratamento no parêntese,

[00587] Peso do fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. Os frutos totais foram contados e pesados. O peso médio dos frutos foi calculada dividindo o peso total do fruto pelo número de frutos.

[00588] Peso vegetal da planta (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos}3, todas as plantas dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidas. O peso fresco foi medido (gramas).

[00589] Peso de inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelho)]t duas inflorescências dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidas. 0 peso da inflorescência (g) e número de flores por inflorescência foram contados.

[00590] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinada utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmante desenvolvida. Três medições por folha foram por lote.

[00591] Eficiência no uso da água (WUE) — pode ser terminada como a biomassa produzida por transpiração da unidade- Para analisar a WUE, o teor de água relativo ã folha foi medido em plantas de controle a transgênicas. 0 peso fresco (FW) foi imediatamente registrado; então, as folhas foram encharcadas por 9 horas em água destilada à temperatura ambiente no escuro, e o peso inchado (TW) foi registrado. 0 peso seco total (DW) foi registrado apôs secar as folhas a 60 °C em um peso constante. 0 teor de água relativo (RWC) foi calculado, de acordo com a Fórmula I a seguir [(FW - DW/TW - DW) x 100], conforme descrito acima.

[00592] As plantas que mantiveram um teor de água relativo (RWC) alto comparado às linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas que exibiram um teor de água relativa reduzido. Resultados Experimentais Tabela 57 - Parâmetros medidos em acessos de tomate (linhas 1-6)

Tabela 57. Tabela 58 - Parâmetros medidos em acessos de tomate (linhas 7-12)

Tabela 58. Tabela 59 - Parâmetros medidos era acessos de tomate (linhas 13 18)

Tabela 59: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de tomate (ID de Semente) em todas as condições de cultivo* As condições de cultivo sào especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 60 - Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o dese mpenho fenotipíco sob condições normais e condições de estresse através dos ecotipos de tomate

Tabela 60, São fornecidas as correlações (R) entre os genes de melhoramento da produção dos níveis de expressão e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (Exp}] e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de correlação (Cor.)J sob condições normais através de ecotipos de tomate. P = Valor P

EXEMPLO 13 PRÕDUÇÁO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS A PRODUÇAO, NUE E ABST MEDIDOS SOB CONDIÇÕES SEMI- HIDROPÔNICAS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K

[00593] Parâmetros relacionados ao vigor do Milho sob condições de baixo nitrogênio, 100 mM de NaCl, baixa temperatura (10 ± 2’C) e condições normais de cultivo - Doze híbridos de Milho foram cultivados em 5 lotes repetitivos, cada um contendo 7 plantas, em uma estufa com rede sob condições setni-hidropônicas. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue; As sementes do milho foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculite e turfa em uma proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas à solução de alta salinidade (100 mM de NaCl, além da solução completa de Hoaglandl , baixa temperatura (10 ± na presença da solução completa de Hoagland), solução da baixo nitrogénio (a quantidade de nitrogênio total foi reduzida em 90% da solução completa de Hoagland (isto é, a uma concentração final de 10% da solução completa de Hoagland, quantidade final de 1,6 mM N) ou em solução de cultivo Normal (solução completa de Hoagland, contendo solução de 16 mM N, ent 28 ± 2°C) . As plantas foram cultivadas em 28 ± 2βC,

[00594] A solução completa de Hoagland consiste de: KNO3 - 0,008 gramas/litro, MgSO^ - 0,12 gramas/litto, KH2PO4 - 0,136 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de mi crofiletnântOs de 'Super ccratina' (Ferro^EDDHA [etiIenodiamina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxifenilacetico))- 40,5 gramas/Litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro}, c pH da solução deve ser de 6,5 - 6.8b

[00595] Tecidos de Milho analisados - Dez híbridos de Milho selecionados foram amostrados com relação à cada tratamento. Dois tecidos [folhas e ponta da raiz], cultivados em 100 mM de NaCl, baixa temperatura (10 + 2°C), baixo nitrogénio (1,6 mN N) ou sob condições normais, foram amostrados em um estágio vegetal (V4-5) e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 61-64 abaixo. Tabela 61 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições semi-hidropônicas

Tabela 61: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições normais. Tabela 62 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições semi-hidropônicas

Tabela 62: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições frias. Tabela 63 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições semi-hidropônicas

Tabela 63: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições de baixo nitrogênio com nitrogénio a l,6Mm. Tabela 64 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições semi-hidropônicas

Tabela 64: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho em 100 mM de NaCl.

Resultados experimentais

[00596] 10 híbridos diferentes de milho foram cultivados e caracterizados em estágio vegetal (V4-S) com relação aos seguintes parâmetros^ "DW das Folhas" =■ peso seco das folhas por planta (média de cinco plantas); "crescimento da Altura da Planta" = foi calculado como coeficiente de regressão da altura da planta [cm] ao longo do tempo (média de cinco plantas) ,* "DW da Raiz" - peso seco da raiz por planta, todo o tecido vegetal acima do solo (média de quatro plantas); "DW do Broto" - peso seco do broto por planta, todo tecido vegetal acima do solo (média de quatro plantas] após secar a 70°C no forno por 48 horas; " ETí do Broto" - peso fresco do broto por planta, todo tecido vegetal acima do solo (média de quatro plantas); "SPAD" - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 30 dias apôs a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada e os valores estão resumidos nas Tabelas 66-73 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 74-77}, Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 65 - Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)

Tabela 65: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Milho Tabela 66 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob ondições de cultivo de baixo nitrogênio

Tabela 66; São fornecidos os valores de cada Um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 67 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo de baixo nitrogênio

Tabela 67: SSc fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho ÍID de Semente) sob condições de baixo nitrogênio- As condições de cultivo sâo especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 68 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo a 100 mH de NaCl.

Tabela 68: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros {conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de cultivo a 100 mH de NaCl. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 69 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo a 100 mM de NaCl.

Tabela 69: São fornecidos os valores de cada um dos oaràmetfos (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de cultivo a 100 mM de NaCl, As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 70 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições frias de cultivo.

Tabela 70: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições frias de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 71 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições frias de cultiva.

Tabela 71: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições frias de cultivo. As condições de cultivo sào especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 72 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo regular.

Tabela 72; Sâo fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima} medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 73 - Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo regular.

Tabela 73; São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 74 - Correlação entre o nivel de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais através dos acessos de milho.

Tabela 74. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão {Exp)] e c desempenho fenotipico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou viger [Vetor de correlação |cor.|] sob condições normais através de acessos de Milho. P = valor p. Tabela 75 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições de baixo nitrogênio através dos acessos dc milho.

Tabela 75. São fornecidas as correlações (R) entre oaníveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raizes; Conjuntos de expressão (Exp)) e o desempenho fenotípicc em vários componentes de biomassat taxa de crescimento e/ou Vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições de baixo nitrogênio através de acessos de Milho. P = valor p. Tabela 76 - Correlação entre o nlvei de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições frias através dos acessos de milho.

Tabela 76, São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor da correlação (cor.)] sob condições frias (10 ± Í^C) através de acessos de Milho, P = valor p. Tabela 77 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenhe? fenotípicc sob condições de salinidade através dos acessos de milho.

Tabela 77, São fornecidas as correlações (R) entre os niveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raizes; Conjuntos de expressão (Exp}1 e o desempenho fenotípico em vários componentes de biomassat taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições de salinidade (100 mM de NaCl] através de acessos d.e Milho. P = valor p.

EXEMPLO 14 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANALISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 60K

[00597] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotideo de sorgo, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. {ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) aspTlPage-50879). O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60,000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com os parâmetros relacionados ao vigor, várias características de planta de 10 híbridos diferentes de sorgo foram analisadas. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos experimentais

[00598] Correlação das variedades do Sorgo através dos ecotipos cultivados sob temperatura de 30"C ou I4’C sob condições de luz baixa (100 μE) ou luz alta (250 μE) .

[00599] Tecidos de sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados com relação à cada tratamento. Os tecidos da folha cultivados sob 30*C e luz baixa (100 μE nr2 seg’1) , l<αC e luz baixa (100 μE nr® seg-1) 30°C e luz alta (250 μ£ HT2 seg' !) 14aC e luz alta (250 μE jir2 seg-1) foram amostrados em estágio vegetal de quatro-cinco folhas e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 70 abaixo. Tabela 78 - Conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo em experimentos de campo

Tabela 19: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo,

[00600] Os parâmetros a seguir foram coletados ou por amostragem de 8 a 10 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote,

[00601] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando o coeficiente de regressão do peso seco vegetal ao longo do tempo.

[00602] Número de folhas - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o periodo de cultivo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folha, contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00603] FW do Broto - peso fresco do broto por planta, medição de todo o tecido vegetal acima do solo.

[00604] DW do Broto - peso seco do broto por planta, medição de todo o tecido vegetal acima do solo após secar a 70°C no forno por 48 horas.

[00605] A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada e os valores estão resumidos nas Tabelas 80-03 abaixo. A análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 84-87). Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 79 - Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 79. São fornecidos PS parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). Tabela 80 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob 14 °C e luz baixa (100 μE ar* seg'1) .

Tabela 80 - São fornecidos os valores de cada uru dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob 14°C e luz baixa ((100 μE m"2 seg' Tabela 81 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob 30°C e luz baixa (100 μE m-2 see-1)

Tabela 81: São Cornecidcs os valores de cac a um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente} sob 30°C e luz baixa ((100 μE m-2 seg-1) Tabela 82 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob 30“c e luz alta (250 μE m-2 see-1).

Tabela 82: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito aoima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob 30°C e luz alta: (250μE m*3 seg' H. Tabela 83 - Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob 14"C e luz alta (250 μE rn'2 see-1) .

Tabela 83: Sâo fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob 14DC e luz alta (2S0μE nra seg'1) : Tabela 64 - Correlação entre o nivel de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho Êenotípico sob 14 °C e condiç&es de luz baixa (lOOμE m"3 seg !) através dos acessos de Sorgo.

Tabela 84. Sãa fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob 14®C e condições de luz baixa (lOOμE nr2 seg1) através de 5 acessos de sorgo. P = valor p. Tabela 85 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob 30oC e condições de luz baixa (lOOpE m2 seg'1) através dos acessos de Sorgo.

Tabela 85. Sâo fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotipico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação [cor.)] sob 30°C e condições de luz baixa (lOOpE m'! seg"1) através de acessos de sorgo, P - valer p. Tabela 86 - 20 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob 30 °C e condições de luz alta [250pE m'2 seg'1) através dos acessos de Sorgo.

Tabela 86. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotipico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob SO^C e condições de luz alta (250μE nr3 seg'1) através de acessos de sorgo. P " valor p. Tabela 87 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob 14 °C e condições de luz alta (250μE m‘: seg"1) através dos acessos de Sorgo.

Tabela 87. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raizes; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob 14 DC e condições de luz alta (250μ£ m-2 seg-1) através de acessos de sorgo. P = valor p.

EXEMPLO 15 FRODUÇÂQ DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÁO □E ALTA PRODUTIVIDADE QUANDO CULTIVADO SOE CONDIÇÕES NORMAIS E DE DESFOLHAMENTO UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K

[00606] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, 05 presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Milho, produzido pela Agilent Technologies [http;//www (ponto) chem. (ponto) agílent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. 0 oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 60K de genes e transcrições de Milho, projetados de acorda cam dados da base de dados Pública (Exemplo 1) . Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e o$ parâmetros relacionados aos componentes de produção, biomassa ou vigor, várias características de planta de 13 híbridos de Milho diferentes foram analisadas sob condições normais e de desfolhamento. Os mesmos híbridos foram submetidos à análise de expressão de RNA, A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Procedimentos experimentais

[00607] 13 híbridos de milho foram cultivados em 6 lotes repetidos, no campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação. Após desenvolver cabelo do milho, 3 lotes em cada linha híbrida se submeteram ao tratamento de desfolhamento. No tratamento, todas as folhas acima da espiga foram removidas. Após o tratamento, todas as plantas foram cultivadas de acordo com a mesma fertilização comercial e protocolos de irrigação.

[00608] Três tecidos no estágio de desenvolvimento de floração (R1), incluindo folha (floração - Rl), caule (floração -RI) e floração do itieristema (floração -RI), representando características diferentes da planta, foram amostrados a partir de plantas tratadas e não tratadas. 0 RNA foi extraído, conforme descrito em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela GB-89 abaixo» Tabela 88 - Tecidos usados para conjuntos de expressão de transcriptoma de milho (sob condições normais)

Tabela 88: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Milho. Tabela 89 - Tecidos usados para Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho (sob condições de desfolhamento)

Tabela 89: São fornecidos os números de identificação ÇID) de cada um dos conjuntos de expressão de Milho.

[00609] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gõv/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3880x2592 pixels} e armazenadas era um formato JPEG de baixa compressão (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia), Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos como arquivos de textos e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00610] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando sistema de formação de imagem digital.

[00611] Peso de 1000 grãos - No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram colhidas e pesadas e o peso de 1000 foi calculado.

[00612] Area da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00613] Comprimento da Espiga e Largura da Espiga (cm) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00614] Area do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00615] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura do grào (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos,

[00616] Perímetro do Grão (cm) - No final do periodo de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de '200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00617] Area do Grão Preenchido da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00618] Preenchido por Toda a Espiga - foi calculado como o comprimento da Espiga com grãos fora da espiga total.

[00619] Parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.

[00620] Largura do Sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.

[00621] Peso médio da Espiga [kg] - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes foram colhidas. As espigas foram pesadas e a espiga média por planta foi calculada. 0 peso do grão foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%.

[00622] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas com relação ã altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas com relação ã sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.

[00623] Número de Fileira da Espiga - O número de fileiras por espiga foi contado.

[00624} Peso fresco da espiga por planta (GF) - Durante o período de preenchimento do grão [GF I grain filling} e total, 6 espigas selecionadas por Lote foram colhidas separadamente. As espigas foram pesadas e o peso médio da espiga por planta foi calculado.

[00625] Peso seco das espigas - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas), o total e 6 espigas selecionadas por lotes foram colhidas e pesadas. O peso da espiga foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%.

[00626] Peso frasco das espigas - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas)t o total e 6 espigas selecionadas por lotes foram colhidas e pesadas.

[00627] Espigas por planta - o número de espigas por planta foi contado.

[00629] Peso dos grãos (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. As espigas de 6 plantas de cada lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados.

[00629] Peso seco dos grãos (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. As espigas de 6 plantas de cada lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados. O peso do grão foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo 0%-

[00630] Peso dos grãos por espiga (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. 5 espigas de cada lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de espigas.

[00631] Área das folhas por planta em GF e HD [LAI, índice de área da folha] - Área total da folha de 6 plantas em um lote; seu parâmetro foi medido em dois pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD I heading) e durante o período de preenchimento do grão (GF). A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar em dois pontos temporais no curso do experimento; durante o período de preenchimento do grão e no estágio de florescimento (VT).

[00632] Peso fresco das folhas em GF e HD - Este parâmetro foi medido em dois pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o periodo de preenchimento do grâo (GF). As folhas usadas para medição do LAI foram pesadas.

[00633] Peso fresco do caule inferior em GF, HD e H - Este parâmetro foi medido em três pontos temporais durante □ curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o periodo de preenchimento do grão (GE) e na colheita (H I harvest). Entrenós inferiores de# pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta, e pesados, O peso médio do entrenó por planta foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de plantas.

[00634] Comprimento do caule inferior em GF, HD e H - Este parâmetro foi medido em três pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o período de preenchimento do grão (GF) e na colheita (H). Entrenós inferiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seu comprimento foi pesado utilizando uma régua. O comprimento médio do entrenó por planta foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de plantas.

[00635] Largura do caule inferior em GF# HD e H - Este parâmetro foi medido em três pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD} e durante o periodo de preenchimento do grão (GF) e na colheita (H). Entrenós inferiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seu diâmetro foi medido utilizando um calibre. A largura média do entrenó por planta foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de plantas.

[00636] Crescimento da Altura da Planta - a taxa de crescimento relativo (RGR) da altura da planta foi calculada, conforme descrito na Fórmula XII acima, pelo coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do tempo.

[00637] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote. Os dados foram tirados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS I dias post sowing).

[00638] Peso fresco do caule em GF e HD - Este parâmetro foi medido em dois pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o período de preenchimento do grão (GF). Os caules das plantas usadas para medição do LAI foram pesados.

[00639] Matéria seca total - A matéria seca total foi calculada, conforme segue: Formula XVIII - Peso da espiga normalizado por planta + peso seco vegetal.

[00640] Peso fresco do caule superior em GF, HD e H - Este parâmetro foi medido em três pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o período de preenchimento do grão (GF) e na colheita (H). Entrenós superiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e pesados. O peso médio do entrenó por planta foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de plantas.

[00641] Comprimento do caule superior em GF, HD e H - Este parâmetro foi medido em três pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (HD) e durante o período de preenchimento do grão (GF) e na colheita (H). Entrenós superiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seu comprimento foi medido utilizando uma régua. 0 comprimento médio do entrenó por planta foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de plantas.

[00642] Largura do caule superior em GF, HD e H (mm) - Este parâmetro foi medido em trÊs pontos temporais durante o curso do experimento; no florescimento (RD) e durante o período de preenchimento do grão (GF) e na colheita (H). Entrenós superiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seu diâmetro foi medido utilizando um calibre. A largura média do entrenó por planta foi calculada dividindo o peso total do grão pelo número de plantas. Peso seco vegetal (kg.) = peso total da parte vegetal de 6 plantas (acima do solo, excluindo raízes) após secar a 70"C no forno por 48 horas pelo número de plantas,

[00643] Peso fresco vegetal (kg.) “ peso total da parte vegetal de 6 plantas (acima do solo, excluindo raízes).

[00644] Número do nó - os nós no caule foram contados na fase de florescimento do desenvolvimento da planta. Tabela 90 - Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores) sob condições normais e de desfolhamento

Tabela 90.

[00645] Treze variedades de milho foram cultivadas e caracterizadas por parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 91-94 abaixo. A correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma para todos ou subconjuntos de linhas foi feita pela unidade bioinforirática e os resultados foram integrados à base de dados (Tabela 95 e 96 abaixo). Tabela 91 - Parâmetros medidos em híbrido de Milho sob condições normais.

Tabela 91. Tabela 92 - Parâmetros medidos em híbrido de Milho sob condições norma i s, 1 iílhaS adicionais de milho

Tabela 92. Tabela 93 - Parâmetros medidos em híbrida de Milho sob desfolhamento

Tabela 93. Tabela 94 - Parâmetros medidos em híbrido de Milho sob desfolhamento, linhas adicionais de milho

Tabela 94.

[00646] As Tabelas 95 e 96 abaixo fornecem as correlações (RI ontre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de Correlação (Cor.))J sob condições normais e de desfolhamento através de variedades de milho. P = valor p. Tabela 95 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições normais através das variedades de milho

Tabela 95, Tabela 96 - Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico em desfolhamento normal através das variedades de milho.

Tabela 96.

EXEMPLO 16 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DA PLANTA

[00647] Para validar seu papel no aumento da produção, os genes selecionados foram superexpressos nas plantas, conforme segue.

Estratégia de Clonagem

[00648] Os genes selecionados a partir daqueles apresentados nos Exemplos 1-14 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, os quadros de leitura aberta de comprimento total (ORFs I open reading frame) foram identificados. Os grupos EST e, em alguns casos, as sequências de mRNA, foram analisados para identificar o quadro de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de planta.

[00649] A fim de clonar os cDNAs de comprimento total, uma transcrição reversa {RT I reverse transcription) seguida pela reação de cadeia polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, raízes ou outros tecidos da planta, cultivados sob condições de estresse ou normais/límitantes.

[00650] A extração total de RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram realizadas utilizando protocolos padrões descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2" Ed. Frio Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos dos especialista na técnica. Os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen).

[00651] Geralmente, 2 conjuntos de iniciadores foram preparados para a amplificação de cada gene, via PCR aninhados (se necessário). Ambos os conjuntos de iniciadores foram utilizados para amplificçâo no cDNA. No caso de nenhum produto ser obtido, uma reação de PCR aninhada foi realizada. 0 PCR aninhado foi realizado pela amplificação do gene utilizando iniciadores externos e, em seguida, utilizando o produto de PCR produzido como um modelo para uma segunda reação de PCR, onde o conjunto interno de iniciadores foi utilizada.

[00652] De modo alternativo, um ou dois dos iniciadores internos foi(ram) utilizado(s) para amplificação de 25 genes, ambos na primeira e segunda reações de PCR (significando que apenas 2-3 iniciadores foram designados para um gene), Para facilitar a clonagem adicional de cDNAs, uma extensão de 8-12 pares de base (bp I base pairs) foi adicionada ao 5' de cada iniciador interno. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local de restrição não existe na sequência de cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores direto e reversos foram projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na direção do sentido no vetor binário utilizado para transformação.

[00653] Os produtos de PCR foram digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc.), de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto de PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia alto pUClθ (New England BioLabs Inc.}, ou em plasmideos originados desse vetor. Em alguns casos, o produto de PCR nâo digerido foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) ou no pJETl.2 (Kit de Clonagem CloneJET PCR, Thermo Scientific) ou diretamente no vetor binário. Os produtos digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando uma enzina de ligase 74 DNA (Roche, Suiça).

[00654] 0 sequenciamento dos genes inseridos foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 (p.ex., pQFNc) e o terminador NOS (ID SEQ N°; 10586) através de digestão com endonucleases de restrição apropriados.

[00655] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas via GeneArt (Life Technologies) [http://www (ponto) geneart (ponto) com/]. 0 DNA sintético foi projetado em sílica. Os locais de enzimas de restriçào adequados foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para permitir clonagem posterior no vetor binário desejado.

[00656] Vetores Binários - O vetor plasmídeo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético originado do vetor de plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acesso GenBank N° U47295; nucleotídeos 4658-4811) no local de restrição ffiπdlll do vetor binário pβllθl.3 (Clontech, Acesso GenBank Nô U12640). 0 pGI é similar ao pPI, mas o gene original na coluna vertebral é o gene GUS-Intron e não o GUS.

[00657] 0 vetor pGI modificado [p.ex., pQFN, pQFNc, pQYN_6669, pQNaRP, pQFYN 25 ou pQXNc] é uma versão modificada do vetor pGI, no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, de modo que o gene e seu promotor correspondente estejam próximos à borda direita e o gene NPTII esteja próximo à borda esquerda.

[00658] 0 At6669, a nova sequência do promotor Arabidopsis thaliana (ID SEQ N°: 10575), foi inserido no vetor binário pGI modificado, a montante dos genes clonados, seguido pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário das colônias E. coli positivas, conforme descrito acima. As colônias foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores que cobrem a inserção, que são projetados para abranger o promotor e o gene introduzido. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00659] Nos casos em que DNA genômico foi clonado, os genes foram amplificados por PCR direto no DNA genômico extraido do tecido foliar, utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. N° 69104). Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são fornecidos na Tabela 97 abaixo. Tabela 97 - Clonagem de genes de algumas aplicações da invenção

Tabela 97: São fornecidos os identifícadores de sequência dos genes clonados, os iniciadores utilizados, os nomes dos genes, os vetores utilizados para a clonagem e as espécies de plantas a partir das quais os genes foram clonados. 5

EXEMPLO 17 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS AGROBACTERIUM TUNEFACTENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO GENES PUTATIVOS

[00660] Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 16 acima foi utilizado para transformar as células Agrobacteríum. Uma estrutura binária adicional foi utilizada como controle negativo, contendo um vetor vazio carregando o promotor At6669.

[00661] Os vetores binários foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens GV301, ou em células competentes LB4404 {cerca de 10& células/mL}, por eletropcraçâo. A eletroporaçâo foi realizada utilizando um eletroporadαr MicroPulser {Biorad), 0,2 cm de cadinhos (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas foram cultivadas em meio líquido LB a 28aC por 3 horas e, então, colocadas sobre ágar LB suplementado com gentamicins [50 mg/L; para cepas Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepa Agrobacterinm LB44O4) e canamicina (50 mg/L) a 28°C por 48 horas. As colônias Abrobacterium, que foram desenvolvidas nos meios seletivos, foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores projetados para abranger a sequência inserida no plasmideo pPI. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados, conforme descrito no Exemplo 16 acima, para verificar se as sequências corretas de nucleotídeo foram devidamente introduzidas nas células Agrobacterium.

EXEMPLO 18 PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS ARABIDOPSIS QUE EXPRESSAM OS GENES SELECIONADOS, DE ACORDO COM ALGUMAS APLICAÇÕES DA INVENÇAO Materiais e Métodos Experimentais

[00662] Transformação da planta Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas TQ) foram transformadas, de acordo com o procedimento de Imersão Floral [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-media ted transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Os tecidos reprodutivos fêmeas foram os alvos primários da transformação mediada por Agrobacterium pelo método de imersão floral de Arabidopsis. Plant Physiol. 123(3): 895-904] com modificação menores. Em suma, as plantas Arabidopsis thaliana Columbia (ColO) To foram cultivadas em vasos de 250 ml preenchidos com mistura de cultivo baseada em turfa úmida. Os vasos foram cobertos com folha de alumínio e uma redoma de plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então, descorbertos e incubados em uma câmara de cultivo a 1B-24°C durante 16/8 horas de ciclos claro/escuro. As plantas To estavam prontas para transformação seis dias antes da antese.

[00663] As colônias simples de Agrobacterium,. carregando os vetores binários que abrigam os genes de produção foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) de gentamicina (50mg/L). As culturas foram incubadas a 28°C por 48 horas em agitação vigorosa e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os peletes, compreendendo células Agrobacterium, foram ressuspensos em um meio de transformação que continham metade da força (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); benzilamino purina a 0,044 μM (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 Gambourg [Sigma); 5 % de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada no pH de 5,7.

[00664] A transformação de plantas To foi realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o tecido de planta acima do selo é submerso por 3-5 segundos. Cada planta To inoculada foi imedialamente colocada em uma bandeja de plástico, então, coberta com redoma plástica limpa para manter umidade e foi mantida no escuro â temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então Cobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até as siliquas ficarem marrons e secas, então as sementes foram colhidas a partir das plantas e mantidas ã temperatura ambiente até a semeadura.

[00665] Para geração de plantas transgênicas Ti e Ts abrigando os genes, as sementes coletadas das plantas Tn transgênicas foram esterilizadas na superficie por imersão em 70% de etanol por 1 minuto, seguido por imersão em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superficie foram totalmente lavadas em água estéril destilada e então colocadas nas placas de cultura contendo metade da força Murashig-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8 % de planta ágar; canamicina a 50 mM; e carbenicilina a 200 mM (Duchefa), As placas de cultura foram incubadas a 4*C por 48 horas, então transferidas a uma sala de cultivo a 25^0 por uma semana adicional de incubação. As plantas Ti Arabidopsis vital foram transferidas para as placas de cultura fresca por outra semana de incubação. Seguindo a incubação, as plantas Ti foram removidas das placas de cultura e plantadas na mistura de cultivo contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas para cultivo em uma estufa para maturidade. As sementes colhidas das plantas Ti foram cultivadas e crescidas para maturidade como as plantas Tj nas mesmas condições conforme utilizadas para cultura e crescimento das plantas Ti.

EXEMPLO 19 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMALS EM ENSAIOS DE ESTUFA (Ensaios GH -SM)

[00666] Ensaio 1: Produção de semente, biomassa da planta e taxa de crescimento da planta sob condições normais de estufa — Esse ensaio segue a produção de semente, a formação de biomassa e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas na estufa sob condições de cultivo não limitantes de nitrogênio. As sementes de Arabidopsis Transgénica foram semeadas em meios de ágar suplementado com M de meio MS e agente de seleção (Canamicina), As sementes transgênicas T. foram, então, transplantadas para 1,7 bandejas preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um solução contendo nitrogênio inorgânico a 6 jfiM na forma de KNOj com KHIPOÍ a 1 mM, MgSOí a 1 mM, CaCla a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes ficarem maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa da planta restante {o tecido acima do solo) também foi colhida, e pesada imediatamente ou seguindo a secagem no forno a 50°C por 24 horas.

[00667] Cada estrutura foi validada em sua geração Ta. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada com um vetor vazio carregando o promotor At6669 (ID SEQ. Ne; 10575) e o marcador selecionável foi utilizado como controle.

[00668] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, tempo de floração, produção de semente, peso de 1000 sementes, matéria seca e índice de colheita (Hl - produção de semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo nas mesmas condições (por ex., idênticas). As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem gene nenhum, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.

[00669] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados de cada estrutura.

[00670] Formação de imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lampãda de 4 x 150 Watts) foi utilizada para capturar imagens das amostras de plantas.

[00671] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmara, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi usada para capturar as imagens de plantas maiores vistas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição de sombras.

[00672] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal {processador Intel F4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - Imaged 1.39, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb [ponto] nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (30θS x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00673] Análise de folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da roseta, o diâmetro de roseta e a área da lâmina foliar.

[00674] Taxa de crescimento vegetal: A Taxa de crescimento relativo (RGR) do número da folha [Fórmula IX (descrita acima)], área da roseta (Fórmula VIII acima), cobertura do lote (Fórmula XIX abaixo) e índice de colheita (Fórmula IV acima) foi calculada com as formulas indicadas. Fórmula XIX: Cobertura do lote RGR. Taxa de crescimento relativo da cobertura de lote coeficiente de regressão da cobertura do lote ao longo do tempo.

[00675] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00676] Peso seco e produção de semente - Por volta do dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30°C em uma câmara de secagem. O peso da biomassa e sementes de cada lote foi medido e divido pelo número de plantas em cada lote.

[00677] Peso seco = peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo as raízes) apôs secar a 30°C em uma câmara de secagem.

[00678] Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (gr).

[00679] Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g).

[00680] Porcentagem de óleo em sementes - No final do experimento, todas as sementes de cada lote sâo coletadas. As sementes de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat No. 080951 Biolab Ltd.) são usadas como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio a 50°C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35’0 e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingier's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibraçào para a RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras foi determinado utilizando o RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra - Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00681] Análise de comprimento de Síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 siliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As siliquas escolhidas foram de cor verde-amarela e foram coletadas a partir das partes inferiores de um caule de planta cultivado. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da siliqua.

[00682] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independente testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste-t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1, O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

[00683] As Tabelas 98-102 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas que expressam de forma exógena as estruturas do gene, utilizando os ensaios de maturação da semente (GH-SM) sob condições normais, A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 98 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 98. "CONT." - Controle; "Méd. ", - Média; "% Aum. ", = % de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<O,1. Tabela 99 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação dq promotor At6669.

Tabela 99, "CONT.' - Control Le; "M éd.". - Média; ' Aum.", - % de aumento; "Val-p" - valor p; 1- p<0,1 Tabela 100 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 100. "CONT." - Controle; "Méd.'\ - Média; "% Aum.", « % de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<0/l. Tabela 101 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 101; "CONT." - Controle; "Méd. - Média; "% Aum.", = % de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<0,l. Tabela 102 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 102: "CONT." - Controle; "Méd.'\ - Média; "% Aum.", - % de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<0,l,

[00684] Os resultados apresentados nas Tabelas 98-102 mostram que a expressão exógena dos genes de algumas aplicações da invenção resulta no aumento da biomassa, taxa de crescimento, produção e vigor de uma planta, se comparado às plantas de controle (p.ex., plantas não transformadas ou plantas transformadas com um vetor vazio de controle) cultivadas nas mesmas condições, p.ex., condições idênticas.

EXEMPLO 20 AVALIAÇAO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SO0 CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA ATÉ O FLORESCIMENTO (Ensaios GH -SM)

[00685] Ensaio 2: Melhoria do desempenho da planta medido até o estágio de florescimento: biomassa da planta e taxa de crescimento da planta sob condições normais da estufa (Ensaios GH -S&) - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e crescimento da área de roseta de plantas cultivadas na estufa sob condições normais de cultivo. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meios de ágar suplementado com h de meio MS e agente de seleção (Canamicina). As sementes transgênicas Ta foram, então, transplantadas para 1,7 bandejas preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um solução contendo nitrogênio inorgânico a 6 mM na forma de KNOa com KH2PO4 a 1 mM, MgSOí a 1 mH, CaClj a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até o estágio de florescimento. A biomassa de planta (o tecido acima do solo) foi pesada indiretamente após colher a roseta (peso fresco da planta [FW]). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 50°C por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [DW]).

[00686] Cada estrutura foi validada em sua geração Ta. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada com um vetor vazio carregando o promotor At6669 (ID SEQ. N°; 10575) e o marcador selecionável foi utilizado como controle.

[00687] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, peso seco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem gene nenhum, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.

[00688] 0 experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados de cada estrutura.

[00689] Formação de imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital {Canon EOS 300D) anexada com uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lampâda de 4 x ISO Watts) foi utilizada para capturar imagens das amostras de plantas.

[00690] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmara, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi usada para capturar as imagens de plantas maiores vistas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição de sombras.

[00691] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de dominio público - Imaged 1.39, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto] nih (ponto} gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (388S x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida/ os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00692] Análise de folha - Utilizando a análise digitai, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da roseta, o diâmetro de roseta e a área da lâmina foliar.

[00693] Taxa de crescimento vegetal: a Taxa de crescimento relativo (RGR) do número da folha (Fórmula IX, descrita acima), área de roseta (Fórmula VIII descrita acima) e cobertura de lote (Fórmula XIX, descrita acima) foram calculados utilizando as fórmulas indicadas.

[00694] Peso seco e fresco da planta - Por volta do dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50aC em uma câmara de secagem por cerca de 49 horas antes da prensagem para determinar o peso seco da planta (DW).

[00695] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independente testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste-t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. 0 pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados experimentais

[00696] As Tabelas 103-105 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estruturas de genes utilizando os Ensaios GH - SM.

[00697] os genes listados nas Tabelas 103105 melhoraram o desempenho da planta quando cultivada em condições normais. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotosintêtíca maior, biomassa (peso fresco, peso seco, número da folha, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura do lote) Taxa de crescimento relativo, área de lâmina relativa e área de peciolo relativa, conforme comparados às plantas de controle (por ex., plantas não-transformadas ou plantas transformadas com um vetor “’vazio") que foram cultivadas em condições idênticas. Os genes foram clonados na regulação de um promotor constitutivo At6669 (ID SEQ. N°: 10575). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. 0 evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 103 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 103. "CONT." - Controle; "Méd.", - Média; "% Aum/, = % de aumento; “Val-p" - valor p; L- p<0rl. Tabela 104- Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 104. "CONT Controle; ' 'Méd.* lédia; "% / \UTTl. " = % de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<0,l. Tabela 105 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 105. "CONT." - Controle; "Méd.", - Média; "I Aum.", = í de aumento; "Val-p" - valor p; L- p<0fl.

EXEMPLO 21 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÈNICA SOB CONDIÇÕES NORMAIS UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO [PLANTAS T2 E T1 DE CULTURA DE TECIDO E ENSAIOS TC -T2 E TC-T1]

[00698] Sementea de superfície esterilizada foram semeadas em melo basal [50% de meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,6 % de planta ágar como agente de solidificação] na presença de Canamicina (utilizada como um agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4 °C e então cultivadas a 25&C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias, Nesse periodo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosaraente transferidas para placas contendo 4 de meio de MS (15 mM N) . Para experimentos realizados nas linhas Ti, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgènico, e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotideo da invenção, pelo menos, quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Para experimentos realizados nas linhas Ti, cada placa continha 5 mudas de 5 eventos transgênicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) foram plantadas. No total, para linhas Ti, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam os polinucleotideos da invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (transformadas com um vetor vazio contendo o marcador de seleção ou gene repórter GÜS sob o controle do mesmo promotor) utilizada no mesmo experimento.

[00699] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada 4 x 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para capturar imagens de brotos encerrados em placas de ágar.

[00700] O processo de captura de Imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (vide, p.ex., as imagens nas Figs. 3A-F). Um sistema de análise imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3688 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00701] Análise das mudas - Utilizando a análise digital, os dados das mudas foram calculados, incluindo área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz.

[00702] A taxa de crescimento relativo para os vários parâmetros de muda foi calculada, de acordo com as fórmulas XX (RGR da área foliar, abaixo) , V (RGR da cobertura de raiz, descrita acima) e XXI (RGR do comprimento da raiz, abaixo). Fórmula XX: Taxa de crescimento relativo da área foliar = Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do tempo. Fórmula XXI: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz » Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do tempo.

[00703] No final do experimento, os brotos foram removidos do meio e pesados para a determinação do peso fresco da planta- Os brotos foram, então, secados por 24 horas a 60“C e pesados novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. Os pesos fresco e seco são fornecidos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada, comparando a cobertura da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz entre cada par de fotos sequenciais e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta em condições ideais. Simílarmente, o efeito do gene introduzido em acúmulo de biomassa, em condições ideais, foi determinado, comparando o peso seco e 5 16/55& fresco das plantas e aqueles das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor), A partir de cada estrutura criada, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em replicados.

[00704] Análises Estatísticas - Para identificar os genes que conferem vigor da planta signíficatívamente melhorado ou arquitetura de raiz ampliada, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle, Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Para avaliar c efeito de um evento do gene sobre um controle, os dados foram analisados através do Teste-t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados significances se p £0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, instituto SAS inc., Cary, NC, EUA),

Resultados Experimentais:

[00705] As Tabelas 106 a 108 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estruturas de gene utilizando os Ensaios TC -T2,

[00706] Os genes apresentados na Tabela 106 mostraram uma melhora significativa, uma vez que produziram uma biomassa de planta maior (peso seco e frasco da planta) em geração Ta quando cultivados em condições normais de cultivo, comparado As plantas de controle. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669, ID SEQ, N4 10575).

[00707] A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Os resultados obtidos nesses experimentos secundários também foram significativamente positivos. Tabela 106 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 106 1'CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.

[00708] Os genes apresentados nas Tabelas 107 e 108 mostram uma melhora significativa no desempenho da planta, uma vez que produziram uma biomassa de folha maior (área foliar) e biomassa de raiz (comprimento de raiz e cobertura da raiz) (Tabela 107’ e uma taxa de crescimento maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 108) quando cultivados sob condições normais de cultivo, comparado às plantas de controle. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem biomassa de folha maior têm melhor capacidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669; ID SEQ. N°105T5). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 107 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulaçáo do promotor AtGÉ69.

Tabela 106 "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<OfQl, Tabela 108 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At 6 669.

Tabela 108. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.

Resultados das plantas T1

[00709] As Tabelas 109 a 111 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas que expressam as estrututras de gene utilizando os Ensaios TC - TI.

[00710] Os genes apresentados nas Tabelas 109 a 111 mostraram urna melhora significativa na biCniasSa da planta e desenvolvimento da raiz, uma vez que exibiram □m aumento de biomassa [peso seco e fresco, Tabela 109) , produziram uma biomassa de raiz e folha maior (área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) (Tabela 110) e uma taxa de crescimento maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 111) quando cultivados em condições normais de cultivo, comparado às plantas de controle. As plantas que produzem biomassa de raiz maior tém melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem biomassa da folha maior tém melhor capacidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669; ID SEQ. N“10575). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido, Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. O evento com valor p < 0, 1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 109 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor AtÊ669.

Tabela 109 "CONT." - Controle; * Méd." - Média; "í Aum." “ % de aumento; wval-p." - valor p. L- p<0,01 Tabela 110 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo 1 normais sob regulação do promotor At6669.

Tabela 110- "CONT J' - Controle; "Méd." - Média; "i A um.*- = % de aumento; "Val-p.* - valor p, L- p<0,01. Tabela 111 - Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo normais sob regulação do promotor At6É69.

Tabela 111. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.

[00711] Esses resultados demonstram que os polinucleotldeos da invenção são capazes de melhorar a produção e traços agrícolas importantes, valiosos e adicionais, tais como aumente da biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, produção, vigor e produção e/ou qualidade da fibra,. Assim, as plantas transformadas que exibiram um peso fresco e seco melhorado demonstraram a capacidade do gene de melhorar a biomassa, um traço chave de culturas para forragem e produtividade da planta; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria da produção de semente demonstraram a capacidade dos genes de melhorar a produtividade da planta; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria de cobertura do lote e diâmetro de roseta demonstraram a capacidade dos genes de melhorar a resistência à seca da planta, uma vez que reduzem a perda de água do solo por simples evaporação e reduzem a competição com ervas daninhas; consequentemente, reduz a necessidade de utilizar herbicidas para controlar as ervas daninhas. As plantas transformadas que exibiram uma melhoria da taxa de crescimento relativa de vários órgãos (folha e raiz} demonstraram a capacidade do gene de promover o crescimento da planta e, consequentemente, encurtam o periodo de crescimento necessário e/ou alternativamente melhoram a utilização dos nutrientes disponíveis e água que levam ap aumento de produtividade da terra; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria do número de ófgáo, conforme demonstrado pelo parâmetro do número da folha, demonstraram um potencial para melhorar a produção de biomassa, importante para culturas de forragem e melhoram a produtividade da planta; As plantas transformadas que exibiram comprimento de raiz e cobertura aumentados demonstraram a capacidade do gene de melhorar a resistência à seca e melhor utilização de fertilizantes, uma vez que as raizes podem alcançar um volume de solo maior; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria da área relativa do pecíolo da folha e área da lâmina foliar demonstraram a capacidade dos genes de lidar com resultados de intensidades de luz limitadas a partir do aumento das densidades de população de planta e, consequentemente, uma melhoria na produtividade da terra,

[00712] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com aplicações especificas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, ela destina-se a abarcar todas essas respectivas alternativas, modificações e variações que recaem no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00713] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descritivo estão incorporados aqui em sua totalidade por referência no referido relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente foi específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente pedido de patente não deverá ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior á presente invenção. Na medida em que OS títulos da seção são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes. LEGENDA DAS FIGURAS Figuras 1 e 2 TI - Borda esquerda T2 - Borda direita T3 - Promotor da nopalina sintase T4 - Gene da neomicina fosfotransferase T5 - Termínad&r da nopalina sintase T6 - Sinal de poliadenilação A T7 - Local de clonagem múltipla TB - Enzima de restrição T9 “ Gene repórter da GU5 (sequência codificadora e intron) TIO - ?qyn_6669 TU - pQFN,pQFNc Figura 3A T12 - Condições normais Figura 3C T13 - Estresse osmótico (15% PEG) Figura 3E T14 - Condições de limitação de nitrogênio Figura 4 TI - Borda esquerda T2 - Borda direita 73 - Promotor da nopalina sintase 74 - Gene da neomícina fosfotransferase 75 - Terminador da nopalina sintase 76 - Sinal de políadenilaçâo A T7 - Local de clonagem múltipla 78 - Enzima de restrição T15 - Promotor de Raiz TI6 - pQNa^RP Figura 5 TI - Borda esquerda 72 - Borda direita 74 - Gene da neomícina fosfotransferase 75 - Terminador da nopalina sintase T6 - Sinal de poliadenilaçâo A T9 - Gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron) 717 - Local invertido T1S - Promotor do NOS 719 - Quadro de leitura aberta T20 - 2’ intron (IV2) do gene ST-XS1 T21 - DMA invertido 728 - Pqyn Tdna ver comp 5714bp Figura 6 71 - Borda esquerda 72 - Borda direita 74 - Gene da neomicina fosfotransferase T5 - Terminador da nopalina sintase T6 - Sinai da poliadertilação A TÍ7- Local invertido TIB - Promoter da nopalina sintase T19 - Quadro de leitura aberta T21 - tDNA invertido T22 - Inserir cassete T23 - Promotor do cid506 6669 T29 - Pqfn S967 bp Figura 7 TI - Borda esquerda T2 - Borda direita T4 - Gene de fosfotransferase de neomicina T5 “ Terminador da nopalina sintase T6 - Sinal de poiiadenilação A T9- Gene reporter da GUS (sequência codificadora e intron) T17 - Local invertido TI8 - Promotor do NOS T19 - Quadro de leitura aberta T20 - 2* intron (IV2) do gene ST-LS1 T21 - tDNA invertido T22 - Inserir cassete T23 - Promotor do cid506 6669 T2S - Inserir GUS+NOSTer T30 “ Pqfyn 0004 bp Figura 8 TI - Borda esquerda T2 - Borda direita T3 - Promotor da nopalina sintase T4 “ Gene de fosfotransferase de neomicina T5 - Terminador de sintase de nopalina T6 - Sinai de poliadenilação A T7 - Local de clonagem múltipla T8 - Enzima de restrição T31 - pQXNc

Claims

1. Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, o método sendo caracterizado por superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido pela: (i) SEQ ID NO: 552, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, (ii) SEQ ID NO: 232, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 805, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 805, (iii) SEQ ID NO: 5815 ou 5816, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou (iv) SEQ ID NO: 5818 ou 5819, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10178 ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10178, aumentando, deste modo, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é estabelecido por: (i) SEQ ID NO: 552, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, (ii) SEQ ID NO: 5815 ou 5816, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou (iii) SEQ ID NO: 5818 ou 5819, que codificam o polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 10178 ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 10178.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideo é do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 552, 232, 5815, 5816, 5818 e 5819.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor heterólogo não nativamente associado ao referido polinucleotídeo, para direcionar a transcrição do referido polinucleotídeo exógeno em uma célula vegetal.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 552, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922.

6. Construção de ácido nucleico isolado, caracterizada por um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido pela: (i) SEQ ID NO: 552, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, (ii) SEQ ID NO: 232, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 805, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 805, (iii) SEQ ID NO: 5815 ou 5816, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, (iv) SEQ ID NO: 5818 ou 5819, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10178 ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10178, e um promotor heterólogo não nativamente associado com o referido polinucletídeo para direcionar a transcrição da referida sequência de ácido nucleico em uma célula vegetal.

7. Construção de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela: (i) SEQ ID NO: 552, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, (ii) SEQ ID NO: 5815 ou 5816, que codificam o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 10176, ou (iii) SEQ ID NO: 5818 ou 5819, que codificam o polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 10178 ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 10178.

8. Construção de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 552, 232, 5815, 5816, 5818 e 5819.

9. Construção de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 552, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 922.