BR122020022852B1 - Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de semente e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta, e, construção de ácido nucléico isolada - Google Patents

Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de semente e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta, e, construção de ácido nucléico isolada Download PDF

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Abstract

Fornece polinucleotídeos isolados e construção de ácidos nucleicos que compreendem a uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°s: 1- 219, 367-5628, 9688-9700, e 97099752; e polipeptídeos isolados que compreendem uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80 % homólogo a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 220-366, 5629- 9400, 9701-9708, e 9753-9796; ainda fornecidas são as células transgênicas e plantas que expressam as mesmas e métodos para utilizar as mesmas para a produção elevada, taxa de crescimento, biomassa, energia, conteúdo de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade de fibra, eficiência do uso de nitrogênio, e/ou força abiótica de uma planta.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos que podem ser usados para aumentar a produção (por exemplo, produção de semente/grão, produção de óleo), eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de fertilizante, taxa de crescimento, energia, biomassa, conteúdo de óleo, produção de fibra, qualidade e/ou comprimento da fibra, tolerância da força abiótica e/ou eficiência do uso da água de uma planta e para gerar as plantas transgênicas com produção elevada, eficiência do uso de nitrogênio, taxa de crescimento, energia, biomassa, conteúdo de óleo, produção de fibra, qualidade e/ou comprimento da fibra, tolerância da força abiótica e/ou eficiência da água conforme comparado ao tipo selvagem ou plantas não transformadas.
[002] KWAA produção é afetada por vários fatores, como, o número e tamanho dos órgãos da planta, arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramificações), comprimento definida dos grãos, número de grãos cheios, energia (por exemplo, muda), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização da água, nutrientes (por exemplo, nitrogênio) e fertilizantes, e tolerância da força.
[003] Safras como, milho, arroz, trigo, canola e soja contam com metade da admissão calórica humana total, se através do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos carnívoros elevados nas sementes processadas ou forragem. Sementes são também uma fonte de açúcares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados nos processos industriais. A capacidade de aumentar a produção da planta, se através do aumento da taxa de acúmulo da matéria seca, modificando a celulose ou composição de lignina, aumentando a força do talo, ampliando o tamanho do meristema, mudando o padrão de ramificação da planta, levantamento das folhas, aumento na eficácia da fertilização, taxa de acúmulo da matéria seca melhorada, modificação do desenvolvimento da semente, preenchimento da semente melhorado ou aumentando o conteúdo de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações nos usos agrícolas e não agrícolas como na produção biotecnológica de farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.
[004] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era, e continua sendo, o uso dos nutrientes naturais, bem como de nutrientes sintéticos (fertilizantes). Deste modo, os fertilizantes são o combustível por trás da "revolução verde", diretamente responsáveis pelo aumento excepcional do rendimento das culturas nos últimos 40 anos e considerados como a despesa geral número um da agricultura. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio(K)], o nitrogênio frequentemente atua como elemento limitador da taxa no crescimento da planta e todas as áreas de cultura têm uma dependência fundamental dos fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio. O nitrogênio normalmente precisa ser reposto todo ano, particularmente para os cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Por exemplo, fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio, tal como o nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, tipicamente correspondem a 40% dos custos associados às culturas, tais como o milho e o trigo.
[005] O nitrogênio é um macronutriente essencial para a planta, responsável pela biossíntese de ácidos nucleicos e aminoácidos, grupos prostéticos, hormonas da planta, defesas químicas da planta, etc. Além disso, o nitrogênio frequentemente atua como um elemento limitador da taxa de crescimento da planta e todas as culturas de campo possuem uma dependência fundamental de nitrogênio inorgânico. Deste modo, o nitrogênio é translocado para o broto, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta, e, por conseguinte, até que floresça. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o volume de seu nitrogênio orgânico durante o período da germinação do grão, e até que floresça. Uma vez que a fertilização da planta ocorre, os grãos começam a se formarem e a se tornarem o receptáculo principal do nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser, então, redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram como compartimentos de armazenagem até a formação do grão.
[006] Como o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido às culturas em crescimento duas ou três vezes durante a época de crescimento. Além disso, a baixa eficiência no uso do nitrogênio (NUE i nitrogen use efficiency) das principais culturas (por exemplo, na faixa de somente 30-70%) afeta de modo negativo as despesas de investimento do fazendeiro por conta do excesso de fertilizante aplicado. Além disso, os usos excessivos e ineficientes de fertilizantes são os principais fatores responsáveis por problemas ambientais, tais como eutrofização das águas subterrâneas, de lagos, rios e mares e poluição por nitrato em água potável, o que pode causar metemoglobinemia, poluição por fosfato, poluição atmosférica e similares. Contudo, a despeito do impacto negativo dos fertilizantes no meio ambiente e dos limites de uso de fertilizantes que foram controlados por lei em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente, a fim de apoiar a produção de alimentos e de fibras devido ao rápido crescimento populacional e aos recursos limitados da terra. Por exemplo, estima-se que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizantes a base de nitrogênio sejam utilizadas em todo o mundo por ano.
[007] O aumento da eficiência no uso de nitrogênio pelas plantas deve viabilizar o cultivo das culturas com um investimento mais baixo em fertilizantes, ou, alternativamente, o cultivo em solos de qualidade inferior e, assim, ter um impacto econômico significativo tanto nos sistemas desenvolvidos de agricultura quanto nos sistemas em desenvolvimento.
[008] O aprimoramento genérico da eficiência no uso de fertilizantes (FUE 1 fertilizer use efficiency) nas plantas pode ser gerado ou através da reprodução tradicional ou por engenharia genética.
[009] Tentativas de geração de plantas com FUE melhorada foram descritas no N° de Pedido de Patente Americano 20020046419, de Choo, et al.; N° de Pedido de Patente Americano 2005010879, de Edgerton et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20060179511, de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Piant Sci. 9:597-605).
[0010] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:7833-8) descreve plantas transgênicas Dofl que apresentam um crescimento melhorado sob condições de baixo nível de nitrogênio.
[0011] O N° de Patente Americano 6.084.153, de Good et al. divulga o uso de um promotor sensível ao estresse para controlar a expressão da Alanina Aminotransferase (AlaAT 1 Alanine Amine Transferase) e das plantas de canola transgênica com resistência à seca e deficiência de nitrogênio melhorada quando comparadas às plantas de controle.
[0012] O crescimento contínuo da população mundial e o déficit de disponibilidade de terra cultivável para a agricultura afetam o rendimento das plantas e dos produtos relacionados às plantas. A escassez global no suprimento de água, a desertificação, as condições de estresse abiótico (ABS 1 abiotic stress) (p.ex., salinidade, seca, inundação, temperatura subaproveitada e poluição química tóxica) e/ou o nitrogênio limitado e as fontes de fertilizantes causam danos substanciais às plantações agrícolas, tais como alterações principais no metabolismo da planta, morte celular e diminuição no crescimento da planta e na produtividade da cultura.
[0013] A seca é um fenômeno gradual que envolve períodos de tempo anormalmente seco que duram o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios, como danos à cultura, diminuição do suprimento de água e aumento da susceptibilidade a diversas doenças.
[0014] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, p.ex., trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as planta resulta tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico (semelhante ao estresse causado pela seca), quanto do efeito do excesso de íons de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. Dessa forma, a salinação dos solos que são utilizados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente em regiões que dependem principalmente da agricultura e é piorada pela utilização e fertilização excessivas e pela falta de água, tipicamente causada pela mudança climática e pelas demandas da população crescente.
[0015] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrosa da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, p.ex., as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. O dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, p.ex., temperaturas baixas, mas acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, o milho e o algodão. O dano típico causado pelo frio inclui o emurchecimento, a necrosa, a clorosa ou perda de íons das membranas celulares. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho.
[0016] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz, particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta mostre as mudanças em sua arquitetura e o metabolismo melhorado, também, sob outras condições.
[0017] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permitem o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente, aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.
[0018] Estudos demonstraram que adaptações da planta a condições ambientais adversas são traços genéticos complexos de natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras de horticulturas utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora da produção e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.
[0019] O trigo (Triticum spp) é a colheita mais amplamente cultivada e fornece um quinto das calorias totais da população do mundo. A melhoria futura do trigo deverá atender o desafio considerável do aumento na produção para alimentar uma população mundial estimada em 9 bilhões até 2050, associada à ameaça da mudança climática para produtividade da colheita. Desde os anos 60, aumentos na produtividade foram alcançados como resultado da adoção em grande escala de tecnologias da Revolução verde. Essas foram principalmente alcançadas por desviarem adaptações utilizadas anteriormente para crescimento longo do caule para aumentar o tamanho do grão de espigas. Portanto, as linhas de trigo pós-revolução verde têm estatura mais curta que está associada ao índice de colheita mais alto. No entanto, o índice de colheita de trigo está abordando agora um platô e grandes aumentos adicionais no índice de colheita são improváveis de serem alcançados com base somente na abordagem de reprodução. Ferramentas de biotecnologia, tal como a engenharia genética, apontaram que a introdução da nova variação genética no trigo pode oferecer uma solução alternativa. Além disso, as abordagens biotecnológicas têm o potencial para complementar a reprodução através da redução do tempo gasto para produzir cultivares com características melhoradas. No entanto, apesar do tremendo potencial para melhoria do trigo através das abordagens de biotecnologia, o tamanho e complexidade do genoma do trigo são obstáculos desafiadores no caminho para rota comercial do trigo transgênico.
[0020] A Patente NorteAmericana N° 7.238.862 (Allison et al.) revela uma transformação melhorada e sistema de regeneração para o trigo, para produção eficiente e confiável de plantas férteis com qualidade agronômicas melhoradas.
[0021] A publicação WO N° 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas deste modo.
[0022] A publicação WO N° 2004/111183 divulga sequências de nucleotídeos para regular a expressão do gene em tricomas e estruturas de plantas e métodos utilizando os mesmos.
[0023] A publicação WO N° 2004/081173 divulga novas sequências e estruturas regulatórias derivadas da planta e métodos de utilização de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotídeo exógeno nas plantas.
[0024] A publicação WO N° 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método de uso dos mesmos, a fim de aumentar a qualidade das fibras, a produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras.
[0025] A publicação WO N° 2007/049275 revela polipeptídeos isolados, polinucleotídeos que codificam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse abiótico da planta e biomassa.
[0026] A publicação WO N° 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas e plantas geradas desse modo.
[0027] A publicação WO N° 2008/122980 revela estruturas de genes e métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa de plantas.
[0028] A publicação WO N° 2008/075364 revela polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos mesmos.
[0029] A publicação WO N° 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico/abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.
[0030] A publicação WO N° 2009/141824 revela polinucleotídeos isolados e métodos para uso dos mesmos para aumentar a utilidade da planta.
[0031] A publicação WO N° 2009/013750 revela genes, estruturas e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e / ou produção em plantas geradas desse modo.
[0032] A publicação WO N° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.
[0033] A publicação WO N° 2010/076756 divulga polinucleotídeos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0034] A publicação W02010/100595 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.
[0035] A publicação WO N° 2010/049897 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.
[0036] A publicação W02010/143138 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.
[0037] A publicação WO N° 2011/080674 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.
[0038] A publicação W02011/015985 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0039] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% idêntico à ID SEQ. N° [Identificação de Sequência N°]: 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 ou 9796, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.
[0040] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 ou 9796, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.
[0041] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 273, 220-272, 274-366, 5629-9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.
[0042] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntico à ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 ou 9752, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.
[0043] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico
[0044] selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 ou 9752, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.
[0045] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno, o qual compreende uma sequência de ácido nucleico, a qual é, pelo menos, 80% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 176, 1-175, 177-219, 367-5628, 9688-9700, 97099751 e 9752, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.
[0046] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à sequência de aminoácido estabelecida na ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 97019708, 9753-9795 ou 9796, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.
[0047] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[0048] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.
[0049] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[0050] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[0051] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à ID SEQ. N° 220-366, 56299399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 ou 9796, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.
[0052] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[0053] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção, ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.
[0054] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.
[0055] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgênica compreendendo a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, ou a célula de planta de algumas aplicações da invenção.
[0056] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 97539795 e 9796.
[0057] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[0058] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 97099751 e 9752.
[0059] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 97019708, 9753-9795 e 9796.
[0060] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula da planta forma parte de uma planta.
[0061] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em estresse abiótico.
[0062] De acordo com algumas aplicações da invenção, o estresse abiótico é selecionado de um grupo consistindo de salinidade, estresse asmático, seca, privação de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação W.
[0063] De acordo com algumas aplicações da invenção, a produção compreende a produção de semente ou produção de óleo.
[0064] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob condições limitastes de nitrogênio.
[0065] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.
[0066] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é trigo.
[0067] De acordo com algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno é realizado utilizando um promotor de trigo.
[0068] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é adequado para expressão em uma planta de trigo.
[0069] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor de trigo compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 9811, 9806, 9807, 9804, 9805, 9812, 9813, 9809, 9810, 9406, 9409, 9407, 9408, 9797, 9418, 9799, 9800, 9801, 9808, e 9803.
[0070] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de cultivo de uma cultura, o método compreendendo a semeadura de sementes e / ou o plantio de mudas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas seleccionadas a partir de, pelo menos, uma característica seleccionada a partir do grupo consistindo em: aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desse modo, a colheita.
[0071] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem de base genética idêntica.
[0072] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.
[0073] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é cultivada sob condições de cultivo idênticas.
[0074] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual a invenção refere-se. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste das aplicações da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o quadro reivindicatório da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitastes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0075] Algumas aplicações da invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência específica aos desenhos em detalhes, enfatiza-se que as particularidades mostradas são exemplares e para os propósitos de discussão ilustrativa das aplicações da invenção. Nesse sentido, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as aplicações da invenção podem ser praticadas.
[0076] Nos desenhos: A Fig. 1 é uma ilustração esquemática de um plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 9405) e o GUSintron (pQYN_6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron).
[0077] A Fig. 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 9405) (pQFN, pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB [right border] - borda direita do T-DNA; LB [left border] - borda esquerda do T-DNA; MCS [multiple cloning site]- Local de clonagem múltipla; RE [restriction enzyme] - qualquer enzima de restrição; NOS pro [nopaline synthase promoter] = promotor da nopalina sintase; NPT- II [neomycin phosphotransferase] = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter [nopaline synthase terminator] = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no MCS do vetor pQFNc.
[0078] As Figs. 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas de forma exógena expressando o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figs. 3C-D) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação Fig. 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Fig. 3B - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de Agar, cultivadas sob condições altamente osmóticas (PEG 15%). Fig. 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Fig. 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.
[0079] A Fig. 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa_RP, ID SEQ. N° 9417) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação). As sequências do polinucleotídeo isolado, de acordo com algumas aplicações da presente invenção, foram clonadas no MCS do vetor.
[0080] A Fig. 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN (5714 bp).
[0081] A Fig. 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN (5967 bp).
[0082] A Fig. 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN (8004 bp).
[0083] A Fig. 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQXNc, que é um plasmídeo binário modificado pGI utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II = gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; sinal de Poli-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (ID SEQ. N° 9401). As sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.
DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0084] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a métodos para aumentar a produção, biomassa, vigor, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), eficiência no uso de água, produção de fibra e/ou qualidade de uma planta, tal como uma planta de trigo e para plantas transgênicas com aumento de produção, biomassa, vigor, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), eficiência no uso de água, produção de fibra e/ou qualidade, conforme comparado às plantas não- transformadas.
[0085] Antes de explicar, pelo menos, uma aplicação da invenção detalhadamente, deve-se compreender que a invenção não está, necessariamente, limitada nesta aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.
[0086] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, teor de óleo, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0087] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar os polinucleotídeos que aumentam a produção (p.ex., produção de semente, produção de óleo, teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta. Genes que afetam o traço de interesse foram identificados com base nos perfis de expressão de genes de diversos Sorgos, Milhos, Cevadas, Brachypodium, Milho Painço e Soja, acessos, variedades e tecidos, homologia com genes conhecidos por afetar o traço de interesse e utilizando perfil de expressão digital em tecidos e condições específicas (Tabelas 1-52, Exemplos 111). Os polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos (p.ex., ortólogos) tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 53, Exemplo 12). Os genes identificados foram clonados (Exemplo 13, Tabela 54) e transformados em agrobacterium (Exemplo 14) para a geração de plantas transgênicas (p.ex., Arabidopsis transgênica, Brachypodium ou plantas de trigo) transformadas com os genes identificados e com seus homólogos (Exemplos 15-17). Plantas transgênicas sobre-expressando os polinucleotídeos identificados foram avaliadas para desempenho da planta em estufa (Exemplos 18 e 19) e experimentos de cultura de tecido (Exemplo 20). De modo geral, esses resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção para aumentar a produção (incluindo produção de óleo, produção de semente e teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção e/ou qualidade de fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0088] Assim, de acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido uma método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar na planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homólogo à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, aumentado, desse modo, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0089] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da planta" refere-se ao montante (p.ex., conforme determinado por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por plantas ou por estação de crescimento. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.
[0090] É importante observar que a produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; qualidade da semente ou grão; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (p.ex., sementes ou partes vegetais da planta); número de flores (florzinhas) por panícula (expressado como uma proporção do número de sementes preenchidos sobre o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de crescimento (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos coletáveis (p.ex., sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [como aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhoria das propriedades físicas (p.ex., elasticidade)].
[0091] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção de semente" refere-se ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (p.ex., comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento do produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.
[0092] O termo "semente" (também referido como "grão" ou "núcleo"), conforme utilizado aqui, refere-se a uma planta embri8nica pequena confinada em uma cobertura chamada de revestimento de semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.
[0093] A expressão "teor de óleo", conforme utilizada aqui, refere-se à quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal) e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a porção vegetal).
[0094] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (p.ex., semente, parte vegetal), bem como a massa ou tamanho do tecido de produção de óleo por planta ou por período de crescimento.
[0095] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando a produção, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.
[0096] Conforme utilizada aqui, a expressão "biomassa da planta" refere-se à quantidade (p.ex., medida em gramas de tecido secado pelo ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período de cultivo, que também pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita), biomassa vegetal, raízes e sementes.
[0097] Conforme utilizada aqui, a expressão "taxa de crescimento" refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medido em cm2 por dia).
[0098] Conforme utilizada aqui, a expressão "vigor da planta" refere- se à quantidade (medida pelo peso) ou tecido produzido pela planta em um determinado período. Portanto o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por período de cultivo ou por área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.
[0099] Melhorar o vigor precoce é um objetivo importante de modernos programas de reprodução de arroz em cultivares de arroz temperado e tropical. Raízes longas são importantes para fixação adequada do solo em arroz pré-germinado. Quando o arroz é diretamente semeado em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com vigor. Onde a semeadura de perfuração é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para bom surgimento das mudas. A habilidade de projetar vigor precoce nas plantas seria de grande importância na agricultura. P.ex., baixo vigor precoce tem sido uma limitação na introdução do milho (Zea mays L.) híbrido com base no germoplasma do Cinturão do Milho na Atlântica Europeia.
[00100] Deve-se observar que uma produção de planta pode ser determinada sob estresse (p.ex., estresse abiótico, condições limitastes de nitrogênio) e/ou condições de não estresse (normal).
[00101] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições de não estresse" refere-se às condições de crescimento (p.ex., água, temperatura, ciclos claro-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente tal como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão além das condições climáticas diárias e outras abióticas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento ideal, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio em seu ciclo de vida (p.ex., em uma planta de cultura da semente para uma planta madura e de volta para a semente novamente). Os técnicos no assunto estão cientes das condições normais do solo e climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta cesse o crescimento sem a capacidade de retomar o crescimento.
[00102] A expressão "estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambiental subótimas como, p.ex., salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperatura baixa ou elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação W. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.
[00103] A expressão "tolerância ao estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.
[00104] As plantas são submetidas a uma gama de desafios ambientais. Diversos desses, incluindo estresse salino, estresse osmótico geral, estresse árido e estresse de congelamento, têm a habilidade de impactar a planta total e disponibilidade de água celular. Não é de surpreender, então, as respostas da planta a essa coleção de estresses são relacionados. Zhu (2002) Ann. Rev. Planta Biol. 53: 247-273 et al. Observe que "a maioria dos estudos na sinalização de estresse hídrico focou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e estiagem estão intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem". Muitos exemplos de respostas similares e caminhos para esse conjunto de estresses foram documentados. For exemplo, os fatores de transcrição de CBF demonstraram condicionamento de resistência ao sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Em Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma proteína cinase dependente do cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses de estiagem e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A cinase induzida por estresse também demonstraram fosforilar um fator de transcrição, provavelmente alterando sua atividade, embora os níveis transcritos do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. Similarmente, Saijo et al. demonstraram que uma proteína cinase dependente de calmodulina induzida por sal/estiagem de arroz (OsCDPK7) conferiu tolerância elevada ao sal e estiagem para o arroz quando superexpressa (Saijo et al. (2000) Planta J. 23: 319327).
[00105] A exposição à desidratação evoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, p.ex., Yelenosky (1989) Planta Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz tolerância de congelamento (vide, p.ex., Siminovitch et al. (1982) Planta Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatação fria, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, p.ex., área de superfície reduzida, ou produção de óleo ou cera da superfície. Em outro exemplo, o teor de soluto elevado da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, asmático e similares, portanto provendo uma melhor tolerância aos estresses acima.
[00106] Será entendido que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também serão envolvidos em resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos. Certamente, aos caminhos de resistência estão relacionados, não idênticos e portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Não obstante, se uma resistência de condições de gene a um desses estresses, estaria evidente ao especialista na técnica o teste para resistência a esses estresses relacionados. Os métodos de avaliação da resistência ao estresse também São fornecidos na seção de Exemplos a seguir.
[00107] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso da água (WUE 1 water use efficiency)" refere-se ao nível de matéria orgânica produzido por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação à utilização de água da planta, p.ex., a biomassa produzida por transpiração unitária.
[00108] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de fertilizante" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de um ou mais minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.
[00109] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de fertilizante" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.
[00110] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de nitrogênio (NUE)" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.
[00111] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., concentração) de nitrogênio (isto é, amônia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.
[00112] A NUE e FUE melhorada da planta são traduzidas no campo em quantidade semelhantes de colheita da produção, enquanto implementam menos fertilizantes, ou produções melhoradas adquiridas pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NUE ou FUE melhorada tem um efeito direto na produção de planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas aplicações da invenção afetam positivamente a produção de planta, produção de semente e biomassa de planta. Além disso, o benefício da NUE melhorada de planta certamente melhorará a qualidade da cultura e constituintes bioquímicos da semente tais como produção de proteína e produção de óleo.
[00113] Deve-se observar que um ABST melhorado conferirá às plantas vigor melhorado também em condições de não estresse, resultando em culturas que possuem biomassa e/ou produção melhorada, p.ex., fibras alongadas para a indústria de algodão, teor de óleo mais alto.
[00114] O termo "fibra" é normalmente inclusivo de células de condução de parede espessa, tais como vasos e traqueídeos e para fibrilar agregados de muitas células de fibra individual. Por isso, o termo "fibra" refere-se a (a) células de condução e não condução de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxylary, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras dos caules, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras).
[00115] Exemplos de planta que produz fibra, incluem, entre outros, culturas agrícolas tais como algodão, árvore de seda de algodão (Paina, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, winterfat, balsa, quenafe, rosala, juta, sisal abaca, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (p.ex., sisal).
[00116] Conforme utilizada aqui, a expressão "qualidade da fibra" refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que é agricolamente desejado, ou requerido na indústria de fibra (também descrito adiante). Exemplos de tais parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento da unidade, proporção de maturidade e uniformidade (também descrito adiante).
[00117] A qualidade da fibra de algodão (gaze) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e delicadeza da fibra. Consequentemente, a qualidade da gaze é considerada mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.
[00118] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da fibra" refere-se à quantidade ou qualidade das fibras produzidas da planta que produz fibra.
[00119] Conforme utilizado aqui, o termo "aumento" refere-se a, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 3%, pelo menos, cerca de 4%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% de aumento na produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta comparada a uma planta nativa ou planta do tipo selvagem [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, p.ex., um planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições (p.ex., idênticas) de crescimento].
[00120] A expressão "expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno", conforme utilizada aqui, refere-se à regulação ascendente do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta, introduzindo o polinucleotídeo exógeno em uma planta ou célula da planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme também descrito logo abaixo.
[00121] Conforme utilizado aqui, "expressar" refere-se à expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível de polipeptídeo.
[00122] Conforme utilizada aqui, a expressão "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência de ácido nucleico heterólogo que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (p.ex., uma sequência de ácido nucleico de espécies diferentes, p.ex., uma espécie de planta diferente) ou na qual a superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA ribonucleic acid) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve-se observar que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta.
[00123] O termo "endógeno", conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.
[00124] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consiste das ID SEQ. N° 220-366, 56299399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[00125] As sequências homólogas incluem ambas as sequências, ortólogas e parálogas. O termo "parálogo" refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie conduzindo aos genes parálogos. O termo "ortólogo" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral.
[00126] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledônias é a realização de uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito através de uma primeira explosão, envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer base de dados da sequência, tal como a base de dados do NCBI publicamente disponível que pode ser encontrada em: http://www [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web 1 Protocolo de Transferência de Hipertexto:Rede Mundial de Computadores / Internet] (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria detonada novamente, p.ex., os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível em NCBI. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências de comprimento total dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então detonadas de volta (segunda explosão) contra as sequências do organismo das quais a sequência de interesse é derivada. Os resultados das primeira e segunda explosões são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de união vizinha (http://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda na visualização do agrupamento.
[00127] A homologia (p.ex., percentual de homologia, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia que calcule o alinhamento de sequência em pares.
[00128] A identidade (p.ex., percentual de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [NCBI 1 Centro Nacional de Informação de Biotecnologia], tal como utilizando parâmetros padrões.
[00129] De acordo com algumas aplicações da invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.
[00130] De acordo com algumas aplicações da invenção, o termo "homologia" ou "homólogo" refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácidos para uma ou mais sequências de ácido nucleico.
[00131] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.
[00132] O grau de homologia ou de identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinado usando várias ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Na sequência há uma descrição não limitante de tais ferramentas, que podem ser utilizadas juntamente com algumas aplicações da invenção.
[00133] O alinhamento global em pares foi definido por S. B. Needleman e C. D. Wunsch, "A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequence of two proteins" Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48).
[00134] Por exemplo, ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar com outras sequências polipeptídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado para encontrar o alinhamento ideal (incluindo as lacunas) de duas sequências juntamente com seus comprimentos totais - um "Alinhamento global". Os parâmetros padrões para o algoritmo de Needleman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluem: gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.
[00135] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros utilizados com a ferramenta EMBOSS-6.0.1 (para a comparação proteína- proteína) incluem: gapopen=8; gapextend=2; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.
[00136] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00137] Ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar a sequências polinucleotídicas, o algoritmo OneModel FramePlus (Halperin, E., Faigler,S. e Gill-More,R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequentes. Bioinformatics, 15, 867-873) (disponível em http://www(ponto)biocceleration(ponto)com/Products(ponto)htm 1) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões: model=frame+_p2n.model mode=local.
[00138] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros usados com o algoritmo OneModel FramePlus são model=frame+_p2n.model, mode=qglobal.
[00139] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo OneModel FramePlus é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00140] Ao começar com uma sequência polinucleotídica e comparar com outras sequências polinucleotídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.l de Needleman-Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões. (EMBOSS-6.0.l) gapopen=l0; gapextend=0.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.
[00141] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros usados com o algoritmo EMBOSS-6.0.l de Needleman-Wunsch são gapopen=10; gapextend=0.2; datafile= EDNAFULL; brief=YES.
[00142] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo EMBOSS-6.0.l de Needleman-Wunsch para a comparação de polinucleotídeos com polinucleotídeos é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00143] De acordo com algumas aplicações, as determinações do grau de homologia requerem adicionalmente o emprego do algoritmo de SmithWaterman (para a comparação proteína-proteína ou comparação nucleotídeo- nucleotídeo).
[00144] Os parâmetros padrões para o algoritmo GenCore 6.0 SmithWaterman incluem: modelo =sw.model.
[00145] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo de SmithWaterman é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00146] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia global é realizada sobre as sequências pré-selecionadas por homologia local para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 60% de identidade sobre 60% do comprimento da sequência) antes da realização da homologia global para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 80% de homologia global sobre toda a sequência). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionadas usando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn agindo como filtros para o primeiro estágio e a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento Estrutura+algorítmico para o segundo estágio. A identidade local (alinhamentos Blast) é definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências, porque é utilizada tão somente como um filtro para a fase de alinhamento global. Nesta aplicação específica (quando a identidade local é utilizada) a filtragem padrão do pacote Blast não é utilizada (estabelecendo o parâmetro "-F F").
[00147] No segundo estágio, os homólogos são definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica principal.
[00148] De acordo com algumas aplicações da invenção, duas formas distintas para a descoberta do alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou nucleotídica são utilizadas: Entre duas proteínas (seguindo o filtro blastp):
[00149] Algoritmo EMBOSS-6.0.l de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões listadas aqui: Qualificadores padrões (Obrigatórios): [-asequence] sequência
[00150] Nome do arquivo da sequência e formato opcional, ou referência (entrada EUA). [-bsequence] seqall
[00151] Nome do arquivo da(s) sequência(s) e formato opcional, ou referência (entrada EUA).
[00152] -gapopen flutuante [10,0 para qualquer sequência]. A penalidade da lacuna aberta é uma classificação tomada quando uma lacuna é criada. O melhor valor depende a escolha da matriz de comparação. O valor padrão pressupõe que você está usando a matriz EBLOSUM62 para as sequências de proteína e a matriz EDNAFULL para as sequências nucleotídicas. (número de vírgula flutuante de 1,0 a 100,0) -gapextend flutuante [0,5 para qualquer sequência]. A penalidade pela extensão da lacuna, é adicionada à penalidade da lacuna padrão para cada base ou resíduo na lacuna. Esta é o tempo pelo qual a lacuna é penalizada. Normalmente Espera-se poucas lacunas grandes e não muitas lacunas pequenas, assim a penalidade sobre a extensão da lacuna deveria ser menor que a penalidade da lacuna. Uma exceção se dá quando uma ou mais sequências são lidas sozinhas com possíveis erros de sequência em cujo caso você esperaria muitas lacunas de base simples. Pode-se obter este resultado estabelecendo a penalidade por lacuna aberta para zero (ou muito baixa) e usando a penalidade de extensão da lacuna para controlar a classificação da lacuna. (número de vírgula flutuante de 0,0 a 10,0). [-outfile] alinhamento [*.needle] Nome do arquivo de alinhamento de saída Qualificadores Adicionais (Opcional):
[00153] -datafile matrixf [EBLOSUM62 para proteína, EDNAFULL para DNA]. Este é um arquivo de matriz de classificação utilizado ao comparar as sequências. Por padrão, este é o arquivo 'EBLOSUM621 (para proteínas) ou o arquivo 'EDNAFULL' (para sequências nucleicas) Estes arquivos são encontrados no diretório 'data' da instalação EMBOSS. Qualificadores Avançados (Espontâneos):
[00154] [no]brief booleano [Y] Breve identidade e similaridade. Qualificadores Associados:
[00155] "-asequence" Qualificadores Associados.
[00156] sbeginl inteiro Inicia a sequência a ser utilizada.
[00157] sendl inteiro Finaliza a sequência a ser utilizada.
[00158] sreversel booleano Reverso (se DNA).
[00159] saskl booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter.
[00160] -snucleotidel booleano A
[00161] sequência é nucleotídica.
[00162] sproteínal booleano A sequência é de proteína.
[00163] slowerl booleano Faz minúsculas.
[00164] supperl booleano Faz maiúsculas.
[00165] sformatl cadeia Formato de sequência de entrada.
[00166] -sdbnamel cadeia Nome da
[00167] base de dados.
[00168] sidl cadeia Nome da entrada.
[00169] ufol cadeia Recursos UFO.
[00170] fformatl cadeia
[00171] Formato dos Recursos.
[00172] -fopenfilel cadeia Nome
[00173] do arquivo dos recursos. "-bsequence" Qualificadores Associados.
[00174] sbegin2 inteiro Inicia cada sequência a ser utilizada.
[00175] send2 inteiro Finaliza cada sequência a ser utilizada.
[00176] -sreverse2 booleano Reverso (se DNA).
[00177] -sask2 booleano Pede
[00178] para iniciar/finalizar/reverter.
[00179] -snucleotide2 booleano A
[00180] sequência é nucleotídica.
[00181] -sproteína2 booleano A sequência é de proteína.
[00182] slower2 booleano Faz minúsculas.
[00183] supper2 booleano Faz maiúsculas.
[00184] sformat2 cadeia Formato de sequência de entrada.
[00185] -sdbname2 cadeia Nome
[00186] da base de dados.
[00187] sid2 cadeia Nome da entrada.
[00188] -ufo2 cadeia Recursos UFO.
[00189] fformat2 cadeia Formato dos Recursos.
[00190] fopenfile2 cadeia Nome do arquivo dos recursos.
[00191] "-outfile" Qualificadores Associados.
[00192] -aformat3 cadeia Formato dos Alinhamentos.
[00193] -aextension3 cadeia Extensão do nome do arquivo.
[00194] -adirectory3 cadeia Diretório de Saída.
[00195] aname3 cadeia Nome do arquivo de base.
[00196] -awidth3 inteiro Largura do alinhamento.
[00197] aaccshow3 booleano Mostra o número de acesso no cabeçalho.
[00198] adesshow3 booleano Mostra a descrição no cabeçalho.
[00199] ausashow3 booleano Mostra o USA completo no alinhamento.
[00200] alinhamento. aglobal3 booleano Mostra a sequência completa no Qualificadores Gerais:
[00201] -auto booleano Desliga as solicitações.
[00202] padrãos.
[00203] stdout booleano Escreve o primeiro arquivo para a saída filtro booleano Lê o primeiro arquivo a partir da entrada padrão, escreve o primeiro arquivo para a saída padrão.
[00204] -Opções booleano
[00205] Solicita os valores padrão e adicionais.
[00206] debug booleano
[00207] Escreve a saída de depuração do programa
[00208] .dbg
[00209] verbose booleano Registra algumas/todas as opções de linha de comando.
[00210] help booleano Registra as opções de linha de comando. Maiores informações sobre os qualificadores associados e gerais podem ser encontradas com - help -verbose.
[00211] -warning booleano Registra as advertências.
[00212] error booleano Registra os erros.
[00213] fatal booleano Registra os erros fatais.
[00214] die booleano Registra as mensagens de expiração do programa.
[00215] 2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (seguindo o filtro rblastn) Aplicação de GenCore 6.0 OneModel utilizando a estrutura+algoritmo com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal -q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões: Uso: om -mode1=<modelfname> [- q=]query [-db=]database [options].
[00216] -model=<model fname>
[00217] Especifica o modelo que quer executar. Todos os modelos fornecidos pela Compugen estão localizados no diretório $CGNROOT/models/.
[00218] Parâmetros válidos de linha de comando:
[00219] -dev=<dev narre> Seleciona o dispositivo a ser utilizado pela aplicação.
[00220] Os dispositivos válidos são: bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAME_N2P, e modelos FRAME P2N).
[00221] xlg - BioXL/G (válido para todos os modelos, exceto XSW).
[00222] xlp - BioXL/P (válido para SW, FRAME+_N2P, e modelos FRAME P2N).
[00223] xlp - BioXL/H (válido para SW, FRAME+ N2P, e modelos FRAME P2N).
[00224] soft - Dispositivo do software (para todos os modelos).
[00225] -q=<query> Define o conjunto de consultas. As consultas podem ser um arquivo de sequência ou uma referencia à base de dados.
[00226] Você pode especificar uma consulta pelo nome ou por número de acesso. O formato é detectado automaticamente.
[00227] Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -qfmt Se uma consulta não for especificada, o programa solicita uma.
[00228] Se o conjunto de consultas for uma referência à base de dados, um arquivo de saída é produzido para cada sequência na consulta.
[00229] db=<database narre> Escolha o conjunto de base de dados. O conjunto de base de dados pode ser um arquivo de sequência ou uma referência à base de dados. O formato da base de dados é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -dfmt.
[00230] qacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma consulta for especificada usando os números de acesso.
[00231] dacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma base de dados for especificada usando os números de acesso. -dfmt/-qfmt=<format_type>
[00232] Escolhe o tipo do formato da base de dados/consulta.
[00233] Os formatos possíveis são:
[00234] fasta - fasta com o tipo de sequência autodetectada.
[00235] fastap - sequência de proteína fasta.
[00236] fastan - sequência nucleica fasta.
[00237] gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.
[00238] gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.
[00239] gcg9seqp - sequência de proteína de formato gcg9.
[00240] gcg9seqn - sequência nucleica de formato gcg9.
[00241] nbrf - sequência nbrf, o tipo é autodetectado.
[00242] nbrfp - sequência de proteína
[00243] nbrf.
[00244] nbrfn - sequência nucleica nbrf.
[00245] embl - formato embl e
[00246] swissprot.
[00247] genbank - formato genbank (nucleico).
[00248] blast - formato blast.
[00249] nbrf_gcg - sequência nbrf_gcg, o tipo é autodetectado.
[00250] nbrf_gcgp - sequência de proteína nbrf-gcg.
[00251] nbrf_gcgn - sequência nucleica nbrf-gcg.
[00252] raw - sequência raw ascii, o tipo é autodetectado.
[00253] rawp - sequência de proteína raw ascii.
[00254] rawn - sequência nucleica raw
[00255] ascii.
[00256] pir - formato pir codata, o tipo é autodetectado.
[00257] Profile - perfil gcg (válido somente para -qfmt em SW, XSW, FRAME P2N e FRAME+ P2N).
[00258] out=<outfname> O nome do arquivo de saída.
[00259] suffix=<name> O sufixo do nome do arquivo de saída.
[00260] gapop=<n> Penalidade sobre a abertura de lacuna. Este parâmetro não é válido para a FRAME+.
[00261] Para a FrameSearch o padrão é 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0.
[00262] gapext=<n> Penalidade por extensão de lacuna. Este parâmetro não é válido para FRAME+.
[00263] Para a FrameSearch o padrão é 4,0. Para outros modelos: o padrão para as pesquisas de proteína é 0,05 e o padrão para as pesquisas nucleicas é 1,0.
[00264] qgapop=<n> A penalidade pela abertura de uma lacuna na sequência de consultas. O padrão é 10,0. Válido para XSW.
[00265] qgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna na sequência de questões. O padrão é 0,05. Válido para XSW.
[00266] -start=<n> A posição na sequência de consulta para iniciar a pesquisa.
[00267] -end=<n> A posição na sequência de consulta para interromper a pesquisa.
[00268] -qtrans Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta nucleica contra uma base de dados de proteína.
[00269] A consulta nucleica é traduzida para seis estruturas de leitura e um resultado é fornecido para cada estrutura.
[00270] Válido para o SW e XSW.
[00271] Nota: as opções "- qtrans" e "-dtrans" são mutuamente exclusivas.
[00272] -matrix=<matrix file> Especifica a matriz de comparação a ser utilizada
[00273] na pesquisa. A matriz deve estar em formato BLAST. Se o arquivo da matriz não for localizado em $CGNROOT/tabl es/matrix, especifique o caminho completo como o valor do -matrix parameter.
[00274] -trans=<transtab narre> Tabela de tradução. A localização padrão para a tabela é $CGNROOT/tables/trans.
[00275] -onestrand Restringe a pesquisa para somente a vertente superior da consulta/base de dados da sequência nucleica.
[00276] padrão é 50.
[00277] -list=<n> O tamanho máximo da lista de acertos de saída. O -docalign=<n> O número das linhas de documentação precedente a cada alinhamento. O padrão é 10.
[00278] -thr score=<score name> A classificação que coloca um limite à exibição dos resultados. Classificações menores que o valor mínimo de -thr min ou maiores que o valor -thr max _ não são mostradas. As opções válidas são: qualidade.
[00279] Escore.
[00280] Escore.
[00281] -thr max=<n> O limite mais alto da classificação. Resultados maiores que MEN o valor -thr _max
[00282] não são mostrados.
[00283] -thr min=<n> O menor limite da classificação. Resultados menores que o valor -thr _min
[00284] não são mostrados.
[00285] de saída. -align=<n> O número de alinhamentos registrados no arquivo
[00286] -noalign Não exibe o alinhamento. Nota: os parâmetros "- align" e "-noalign" são mutuamente exclusivos.
[00287] -outfmt=<format name> Especifica o tipo de formato de saída. O formato padrão é PFS. Os valores possíveis são:
[00288] PFS - Formato de texto PFS
[00289] FASTA - formato de texto FASTA
[00290] BLAST - formato de texto BLAST
[00291] -nonorm Não realiza a normalização da classificação.
[00292] -norm=<normname>
[00293] Especifique o método de normalização. As opções válidas são:
[00294] log -
[00295] normalização do algoritmo.
[00296] std -
[00297] normalização padrão.
[00298] stat - Método estatístico de Ervilharson
[00299] Nota: os parâmetros "-nonorm" e "-norm" não podem ser utilizados juntos.
[00300] Nota: Parâmetros -xgapop, -xgapext, -fgapop, -fgapext, - ygapop, -ygapext, -delop e -delext se aplicam somente a FRAME+.
[00301] -xgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 12,0.
[00302] -xgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 4,0.
[00303] -ygapop---<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 12,0.
[00304] -ygapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 4,0.
[00305] -fgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 6,0.
[00306] -fgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 7,0.
[00307] -delop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 6,0.
[00308] -delext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 7,0.
[00309] -silent Nenhuma saída para a tela é produzida.
[00310] -host=<host narre> O nome do organizador sobre o qual o servidor funciona. Por padrão, a aplicação usa um organizador específico no arquivo $CGNROOT/cgnhosts.
[00311] -wait Não acesse o segundo plano quando o dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para o pseudodispositivo Parseq ou Soft.
[00312] -batch Execute o trabalho em segundo plano. Quando esta opção for específica, o arquivo "$CGNROOT/defaults/batch.defaults" é utilizado para escolher o comando batch. Se o arquivo não existir, o comando "at now" é utilizado para executar o trabalho.
[00313] Nota: Os parâmetros "-batch" e "-wait" são mutuamente exclusivos.
[00314] -version Imprime o número de versão do software.
[00315] -help Exibe esta mensagem de ajuda. Para ajuda mais específica digite: "om -model=<model _fname> -help".
[00316] De acordo com algumas aplicações, a homologia é uma homologia local ou uma identidade local.
[00317] As ferramentas de algoritmo local incluem, mas não são limitadas ao software BlastP, BlastN, BlastX ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), FASTA e o algoritmo de Smith-Waterman.
[00318] Uma pesquisa tblastn permite a comparação entre uma sequência de proteína e as traduções de seis estruturas de uma base de dados de nucleotídeos. Pode ser uma maneira bastante produtiva de encontrar regiões codificadas de proteína homóloga em sequências de nucleotídeos não anotadas, tais como as etiquetas de sequências expressas [EST's I expressed sequence tags] e projetos de registros do genoma [HTG 1 draft genome records], localizados nas bases de dados BLAST est e htgs, respectivamente.
[00319] Os parâmetros padrões para o blastp incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: e-5; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.
[00320] Ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluem, mas não são limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceituai de seis estruturas de uma sequência de consultas de nucleotídeos (ambas as vertentes) contra uma base de dados de sequência de proteína. Os parâmetros padrões incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.
[00321] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistente de ID SEQ N°: 220-366, 56299399, 9400, 97019708, 9753-9795 e 9796.
[00322] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 220-366, 56299399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio) e/ou estresse abiótico de uma planta.
[00323] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 97019708, 9753-9795 ou 9796.
[00324] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, o método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta é efetuado expressando dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.
[00325] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou estresse abiótico da planta De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. N° 220366, 5629-9399, 9400, 97019708, 9753-9795 ou 9796.
[00326] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[00327] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00328] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 3675627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[00329] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 96889700, 9709-9751 ou 9752.
[00330] Conforme utilizado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou uma sequência polinucleotídeo composta (p.ex., uma combinação das sequências acima).
[00331] O termo "isolado(a)" refere-se a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, p.ex., de uma célula da planta.
[00332] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo complementar" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro utilizando a transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Essa sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de DNA dependente de DNA.
[00333] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência genômica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, dessa forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.
[00334] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo composta" refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. A sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpostas entre si. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinais entrelaçados preservadas. Essas sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão cis-atuantes.
[00335] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.
[00336] A expressão "otimização de códons" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que aborde a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou que ocorra naturalmente tenha sido modificado a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. Tipicamente, a sequência de nucleotídeo é examinada no nível do DNA e na região de codificação otimizada para expressão na espécie vegetal determinada utilizando qualquer procedimento adequado, p.ex., conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão de utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado descobrindo primeiramente o quadrado do desvio proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do quadrado do desvio médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon n no gene e interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de utilização de códons de genes altamente expressos de dicotiledôneas está compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc AcID's Res. 17:477-498).
[00337] Um método para otimizar a sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização preferido do códon para um tipo de célula de planta particular é baseado na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, de Tabelas de otimização de códons como aquelas disponíveis online na Base de Dados de utilização de Códons através do banco de DNA do NIAS (Nacional Institute of Agrobiological Sciences 1 Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (http://www (ponto) kazusa (ponto) ou (ponto) jp/codon/). A Base de Dados de utilização de Códons contém tabelas de utilização de códons para diversas espécies diferentes, com cada Tabela de utilização de códons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.
[00338] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos de cada aminoácido em uma espécie particular (p.ex., arroz), uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente codificando uma proteína de interesse para ter o códon otimizado para aquela espécie de planta particular. Isso é efetuado substituindo os códons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos em uniões potencialmente úteis (terminais 5' e 3' para adicionar o peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que possam ser utilizados para cortar e reunir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeo que possam afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.
[00339] A sequência de nucleotídeo codificador que ocorre naturalmente pode, já, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponda a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa podem compreender a determinação quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativo, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificado pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização do códon da planta desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificado seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou nativo. A estrutura de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, p.ex., no Pedido de Patente PCT (Patent Cooperation Treaty Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes) 93/07278.
[00340] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificador.
[00341] Conforme utilizada aqui, a expressão "RNA não codificador" refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos dessas moléculas de RNA não codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antisenso, um pré- miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).
[00342] Exemplos não limitantes de polinucleotídeos de RNA não codificador são apresentados nas ID SEQ. N° 921, 1425, 1938, 1939, 2110, 2208, 2257, 2296, 2297, 2309, 2445, 2729, 2844, 2918, 3306, 3310-3312, 3414, 3655-3657, 3834-3835, 3841, 3849, 3880-3881, 3892, 3902, 5070 e 5493.
[00343] Exemplos não limitantes de polinucleotídeos de RNA não codificador são apresentados na ID SEQ. N° 921, 1425, 1938, 1939, 2110, 2208, 2257, 2296, 2297, 2309, 2445, 2729, 2844, 2918, 3306, 3310-3312, 3414, 3655-3657, 3834-3835, 3841, 3849, 38803881, 3892, 3902, 5070 e 5493.
[00344] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[00345] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N°s:1-219, 3675627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou estresse abiótico da planta.
[00346] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é, pelo menos, cerca de 80 %, pelo menos, cerca de 81 %, pelo menos, cerca de 82 %, pelo menos, cerca de 83 %, pelo menos, cerca de 84 %, pelo menos, cerca de 85 %, pelo menos, cerca de 86 %, pelo menos, cerca de 87 %, pelo menos, cerca de 88 %, pelo menos, cerca de 89 %, pelo menos, cerca de 90 %, pelo menos, cerca de 91 %, pelo menos, cerca de 92 %, pelo menos, cerca de 93 %, pelo menos, cerca de 93 %, pelo menos, cerca de 94 %, pelo menos, cerca de 95 %, pelo menos, cerca de 96 %, pelo menos, cerca de 97 %, pelo menos, cerca de 98 %, pelo menos, cerca de 99 %, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. NOs: 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[00347] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 96889700, 9709-9751 e 9752.
[00348] Conforme utilizado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou sequências de polinucleotídeo compostas (p.ex., uma combinação das sequências acima).
[00349] Dessa forma, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima, fragmentos delas, sequências hibridizantes encontradas nelas, sequências homólogas delas, sequências codificando polipeptídeos semelhantes com diferentes utilizações de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações, como exclusão, introdução ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ocorrendo naturalmente ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.
[00350] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 96889700, 9709-9751 e 9752.
[00351] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a produção, produção de semente, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
[00352] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752.
[00353] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 96889700, 9709-9751 e 9752.
[00354] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[00355] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção da semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso de nitrogênio), tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
[00356] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[00357] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[00358] A invenção fornece um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N' 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 ou 9796.
[00359] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos é selecionado do grupo que consiste da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[00360] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo é estabelecido pelas ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796.
[00361] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e de polipeptídeos apresentando mutações, como exclusões, introduções ou substituições de um ou mais aminoácidos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.
[00362] O termo "planta", conforme utilizado aqui, abrange planta integrais, ancestrais e progênies das plantas e partes da planta, incluindo as sementes, os brotos, os caules, as raízes (incluindo os tubérculos) e células, tecidos e órgãos da planta. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as monocotiledôneas e as dicotiledôneas, incluindo uma forragem ou leguminosa forrageira, planta ornamental, cultura alimentar, árvore ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Buchá frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata,
[00363] Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lótus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp.,
[00364] Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinífera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenouras, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilhas, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma cultura forrageira. Alternativamente, algas e outras não-Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.
[00365] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de cultura como o arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, choupo e algodão.
[00366] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é trigo.
[00367] Exemplos não limitantes de espécies de trigo que podem ser utilizadas de acordo com algumas aplicações da invenção incluem Faller, Bobwhite, Mc Neal, Anshlag, KWS Aurum, KWS Scirocco e Azhurnaya.
[00368] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.
[00369] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta monocotiledônia.
[00370] De acordo com algumas aplicações da invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.
[00371] De acordo com algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é afetada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.
[00372] De acordo com algumas aplicações da invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma estrutura de ácido nucleico na célula da planta que inclua o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações da invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de abordagens de transformação adequadas são apresentadas abaixo.
[00373] Conforme mencionado, a estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações da invenção, compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado da invenção.
[00374] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.
[00375] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "operacionalmente ligada" a uma sequência reguladora (p.ex., o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.
[00376] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que fica a montante do sítio da inicial transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (p.ex., qual porção de uma planta) e/ou quando (p.ex., em que estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.
[00377] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.
[00378] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor heterólogo" refere-se a um promotor de uma espécie diferente ou da mesma espécie, mas de um lócus de gene diferente, a partir da sequência de plinucleotídeo isolado.
[00379] Qualquer sequência adequada de promotor pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico do tecido ou induzível ao estresse abiótico.
[00380] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é um promotor de trigo (ou seja, um promotor que é adequado para expressão em plantas de trigo).
[00381] Promotores adequados para expressão em trigo incluem, mas não se limitam a promotor SPA de trigo (ID SEQ. N° 9811; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997, que é totalmente incorporado aqui por referência), trigo LMW [ID SEQ. N° 9806 (promotor mais longo LMW) e ID SEQ. N° 9807 (promotor LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 9804 (promotor mais longo glutenina-1 trigo LMW) e ID SEQ. N° 9805 (Promotor glutenina- 1 trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180; Furtado et al., 2009 Plant Biotechnology Journal 7:240-253, cada um é completamente incorporado aqui por referência] trigo alfa, beta e gama gliadinas [p.ex., SEQ ID NO: 9812 (trigo alfa gliadina, genoma B, promotor); ID SEQ. N° 9813 (trigo gama gliadina promotor); EMBO 3:1490-15, 1984, que é totalmente incorporado aqui por referência] trigo TdPR60 [ID SEQ. N° 9890 (trigo TdPR60 promotor mais longo) ou ID SEQ. N° 9810 (promotor do trigo TdPR60); Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009, que é totalmente incorporado aqui por referência], promotor do milho Ubl [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N°9406); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N°9409); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz activa 1 (ID SEQ. N°9407; Mc Elroy et al. 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163171, que é totalmente incorporado aqui por referência), e arroz GOS2 [ID SEQ. N° 9408 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 9797 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al. Plant J. 1992 ; 2: 837-44, que é totalmente incorporado aqui por referência), Arabidopsis Phol [ID SEQ. N° 9418 (Arabidopsis Phol Promotor); Hamburger et al., Plant Cell. 2002 ; 14: 889-902, que é totalmente incorporado aqui por referência), promotores ExpansinB, p.ex., arroz ExpB5 [ID SEQ. N°9799 (promotor mais longo do arroz ExpB5) e SEQ ID NO: 9800 (promotor do arroz ExpB5) e Cevada ExpBl [ID SEQ. N° 9801 (promotor da cevada ExpB1), Won et al. Mol Cells. 2010; 30:369-76, que é totalmente incorporado aqui por referência), cevada SS2 (sacarose síntase 2) [(ID SEQ. N° 9808), Guerin and Carbonero, Plant Physiology May 1997 vol. 114 no. 1 55-62, que é totalmente incorporado aqui por referência], e arroz PG5a [ID SEQ. N°9803, US 7,700,835, Nakase et al., Plant Mol Biol. 32:621-30, 1996, que é totalmente incorporado aqui por referência].
[00382] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [ID SEQ. N° 9401 (Promotor CaMV 35S (QFNC)); ID SEQ. N° 9402 (PJJ 35S de Brachypodium); ID SEQ. N° 9403 (Promtor CaMV 35S (OLD)) (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985)], promotor Arabidopsis At6669 (ID SEQ. N° 9404 (Promotor Arabidopsis At6669 (OLD)); ver Publicação PCT No. W004081173A2 ou o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 9405 (Promotor Arabidopsis At6669 (NOVO)); Promotor do milho Ubl [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 9406); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 9409); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N° 9407, McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456462, 1997); arroz GOS2 [ID SEQ. N° 9408 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 9797 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al., Plant J Nov;2(6):837-44, 1992]; promotor RBCS (ID SEQ. N°9410); Ciclofilina do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histone H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Americanas N°: 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.
[00383] Promotores específicos de tecido adequados incluem, mas não se limitam a promotores específicos de folha [p.ex., AT5G06690 (Thioredoxin) (expressão elevada, ID SEQ. N° 9411), AT5G61520 (AtSTP3) (expressão rebaixada, ID SEQ. N° 9412) descrito em Buttner et al 2000 Plant, Cell and Environment 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12:255265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:9586-9590, 1993; bem como o promotor Arabidopsis STP3 (AT5G61520) (Buttner et al., Plant, Cell and Environment 23:175-184, 2000)], promotores preferidos de semente [p.ex., Napin (originados da Brassica napus, sendo caracterizado por uma atividade promotora específica de semente; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journai 1 (4): 301-309; ID SEQ. N°: 9413 (Promotor Brassica napus NAPIN) a partir dos genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), arroz PGSa (ID SEQ. N° 9803; US 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes Arabidopsis BAN (AT1G61720) (ID SEQ. N° 9414, US 2009/0031450 Al), desenvolvimento tardio de sementes Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) (ID SEQ. N° 9415 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor mais longo) ou 9802 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor)) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), Albumina de castanha do Brasil (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (ID SEQ. N°9811; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [p.ex., trigo LMW (ID SEQ. N° 9806 (Trigo LMW Promotor mais longo), e ID SEQ. N° 9807 (promotor de trigo LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 9804 (promotor mais longo glutenina-1 de trigo LMW) e ID SEQ. N° 9805 (Promotor glutenina-1 de trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo alfa, beta e gama gliadinas (ID SEQ. N° 9812 (promotor alfa gliadina de trigo (genoma B)); ID SEQ. N° 9813 (promotor gama gliadina de trigo); EMBO 3:1409-15, 1984), promotor ltrl da cevada, cevada Bl, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), cevada DOF (hena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (ID SEQ. N° 9808 (Promotor Cevada SS2); Guerin and Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), trigo TdPR60 [ID SEQ. N°9809 (trigo TdPR60 promotor mais longo) ou ID SEQ. N°9810 (promotor de trigo TdPR60); Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009, que é totalmente incorporado aqui por referência], cevada D-hordeína (D-Hor) e B-hordeína (B-Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry and Alessandro Pellegrineschi (2009)], promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), arroz prolamina NRP33, arroz-globulina Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998), arroz alfa- globulina REB/OHP-1 (Nakase et al.
[00384] Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose de arroz PP (Trans Res 6:157-68, 1997) , família do gene de milho ESR (Plant J 12:23546, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos embrionários [p.ex., arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), arroz oleosina (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores de flor específicos [p.ex., AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen. Genet. 217:240-245; 1989), Arabidopsis apetala-3 (Tilly et al., Development. 125:1647-57, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, AP1) (ID SEQ. N°: 9416 (Arabidopsis (AT1G69120) APETALA 1)) (Hempel et al., Development 124:3845-3853, 1997)], e promotor de raiz [p.ex., o promotor ROOTP [ID SEQ. N°: 9417]; arroz ExpB5 (ID SEQ. N°9800 (Promotor de arroz ExpB5); ou ID SEQ. N° 9799 (Promotor mais longo de arroz ExpB5)) e promotores de cevada ExpBl (ID SEQ. N°9801) (Won et al. Mol. Cells 30: 369-376, 2010); promotor Arabidopsis ATTPS- CIN (AT3G25820) (ID SEQ. N° 9798; Chen et al., Plant Phys 135:1956-66, 2004); promotor Arabidopsis Phoi (ID SEQ. N°: 9418, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889-902, 2002), que também é ligeiramente induzida por estresse].
[00385] Promotores induzíveis pelo estresse abiótico incluem, mas não se limitam a promotores induzíveis pelo sal, como o RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis pela seca, como o gene promotor rabl7 (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), o gene promotor rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:12851295, 1997 e o gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis pelo calor como o promotor hsp80 do tomate (Patente Norte-Americana N° 5.187.267).
[00386] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreenda um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) quanto pode ser compatível com a propagação nas células. A estrutura de acordo com a presente invenção pode ser, p.ex., um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.
[00387] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ser utilizado para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço transitório.
[00388] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos, tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).
[00389] Os métodos do princípio de causa da integração estável de DNA exógeno em DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) A transferência genética mediada pelo Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.
[00390] (ii) Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA nos protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923- 926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de partículas de fibras de vidro ou carboneto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido caloso, Patente Norte-Americana N' 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715- 719.
[00391] O sistema Agrobacterium inclui a utilização de vetores plasmidiais que contenham segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega do Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que oferece uma boa fonte para o início da diferenciação de toda a planta. Vide, p.ex., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega do Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de dicotiledôneas transgênicas.
[00392] Existem vários métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é injetado de forma mecânica diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como os cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos vegetais.
[00393] Após a transformação estável, a propagação vegetal é realizada. O método mais comum de propagação vegetal é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, no entanto, apresenta a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas normas Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos da planta transgênica matriz. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que proporciona a reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.
[00394] A micropropagação é um processo de cultivo de plantas de nova geração a partir de um pedaço de tecido que tenha sido retirado de uma planta matriz selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que tenham o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas à planta original e apresentam todas as suas características. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.
[00395] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de cultivo entre os estágios. Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura tecidual inicial; estágio dois, multiplicação da cultura tecidual; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quarto, cultura e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura tecidual inicial, a cultura tecidual é estabelecida e certificada como sendo livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura tecidual inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são dividas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradativamente aumentada de forma que ela possa ser cultivada no ambiente natural.
[00396] De acordo com algumas aplicações da invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitórias de células de folhas, de células meristemáticas ou de toda a planta.
[00397] A transformação transitória pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção virai utilizando vírus modificados de plantas.
[00398] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem o CaMV, o vírus mosaico do tabaco (TMV ( tabaco mosaic virus), vírus mosaico do bromo (BMV 1 brome mosaic virus) e o vírus mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV beam common mosaic vírus). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Japonês Publicado N° 6314693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172189 (1988). As partículas pseudovirais para utilização na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.
[00399] De acordo com algumas aplicações da invenção, o vírus utilizado para transformação transitória é avirulento e, dessa forma, é incapaz de causar sintomas graves como a taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento da folha, amarelamento, estrias, formação de vesículas, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, p.ex., por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).
[00400] Cepas virais adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, p.ex., da Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC 1 American Type Culture Collection) ou pelo isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, conforme descrito, p.ex., por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Acredita-se que rapidamente, os tecidos de uma planta infectada contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em uma solução tampão (p.ex., solução tampão fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.
[00401] A estrutura de vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não-viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:7376; e Patente Norte-Americana N° 5.316.931.
[00402] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao vírus propriamente dito. Alternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor viral desejado com o DNA estranho. Então, o vírus pode ser extraído do plasmídeo. Se o vírus for um vírus do DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral que é, então, replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá capsular o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e introduzido em um plasmídeo. Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as estruturas. Então, o vírus de RNA é produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA viral.
[00403] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral de uma planta é fornecido, no qual a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência foi excluída de um polinucleotídeo viral, uma proteína de revestimento viral não nativa da planta codificando a sequência e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da proteína de revestimento não nativa que codifica a sequência, capaz de se expressar no hospedeiro da planta, no envoltório do polinucleotídeo viral recombinante da planta e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta, foi introduzido. Alternativamente o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela introdução da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de forma que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou de expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar uns com ou outros e com os promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas (estranhas) podem ser introduzidas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou o promotor subgenômico viral nativo e o promotor subgenômico viral não nativo da planta, se houver mais de uma sequência de polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.
[00404] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na primeira aplicação, exceto que a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência é colocada adjacente a um dos promotores genômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.
[00405] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido, no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi(ram) inserido(s) no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos introduzidos são capazes de transcrever ou de expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinar uns com ou outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativas podem ser introduzidas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir o produto desejado.
[00406] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na terceira aplicação, de forma que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa seja substituída por uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.
[00407] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta para produzir um vírus da planta recombinante. O polinucleotídeo viral recombinante da planta ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.
[00408] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Principies e Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.
[00409] Além do exposto acima, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo, dessa forma, a expressão de cloroplasto.
[00410] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células das plantas são tratadas quimicamente de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente uma. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma a serem integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável que serve, pelos procedimentos de seleção sequencial, para verificar se todas ou se substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto, após essa seleção, incluirão o polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte- Americanas N° 4.945.050 e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Dessa forma, um polipeptídeo pode ser produzindo pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se integra à membrana interna do cloroplasto.
[00411] Uma vez que os processos que aumentam a produção, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, taxa de crescimento, biomassa, vigor, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes que agem aditivamente ou em sinergia (vide, p.ex., em Quesda et al., Planta Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também prevê a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma planta hospedeira única para, desta forma, alcançar efeito superior no teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[00412] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se múltiplas estruturas de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.
[00413] De forma alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se, em uma única célula da planta, uma única estrutura de ácido nucleico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Essa estrutura pode ser desenhada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotídeo exógeno. A fim de permitir a cotradução dos polipeptídeos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônica, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas através de uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES ( internai ribosome entry site) que facilita a tradução das sequência de polinucleotídeo posicionadas a jusante da sequência do IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto no terminal 5' que tem o cap quanto nas duas sequências internas do IRES da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os diferentes polipeptídeos na célula. Alternativamente, a estrutura pode incluir diversas sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.
[00414] A célula da planta transformada com a estrutura, incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.
[00415] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes estruturas de ácido nucleico, incluindo polinucleotídeos exógenos diferentes, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.
[00416] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.
[00417] Exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (p.ex., inundação, encharcamento), etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação UV.
[00418] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em condições limitantes do fertilizante (p.ex., condições limitantes de nitrogênio). Os exemplos não limitantes incluem o crescimento da planta nos solos com baixo teor de nitrogênio (40-50% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais), ou mesmo em deficiência de nitrogênio severa (0 a 10% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais).
[00419] Dessa forma, a invenção abrange plantas que expressam de forma exógena o(s) polinucleotideo(s), as estruturas de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptídeo(s) da invenção.
[00420] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou de toda a planta, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipeptídeo, Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA 1 enzyme-linked immuno sorbent assay), radioimunoensaios (RIA radio-immuno-assays), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e outros métodos semelhantes.
[00421] Métodos para determinar o nível do RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno na planta são bem conhecidos na técnica e incluem, p.ex., análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR 1 reverse transcription polymerase chain reaction) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ para RNA.
[00422] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitados em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MAS marker assisted selection), na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (p.ex., biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizantes). Os dados do ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição
[00423] (RFLP restriction fragment length polymorphism), microsatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP single nucleotide polymorphism), impressão genética (DFP DNA fingerprinting) , polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP amplified fragment length polymorphism), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA.
[00424] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (p.ex., um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de um traço bioquímico (p.ex., um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; p.ex., isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (p.ex., (raças patogênicas ou biotipos de insetos baseados no patógeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).
[00425] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de forma segura e eficiente em termos de custo.
[00426] Linhagens vegetais que expressam de forma exógena o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são tríadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço desejado da planta.
[00427] Portanto, de acordo com uma aplicação adicional da presente invenção, é fornecido um método de avaliação de um traço de uma planta, o método compreendendo: (a) expressar em uma planta ou em uma parte respectiva a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção; e (b) avaliar um traço de uma planta em comparação com uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (p.ex, não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando, deste modo, o traço da planta.
[00428] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80 96, pelo menos, cerca de 81 %, pelo menos, cerca de 82 %, pelo menos, cerca de 83 96, pelo menos, cerca de 84 96, pelo menos, cerca de 85 96, pelo menos, cerca de 86 %, pelo menos, cerca de 87 %, pelo menos, cerca de 88 %, pelo menos, cerca de 89 96, pelo menos, cerca de 90 %, pelo menos, cerca de 91 96, pelo menos, cerca de 92 %, pelo menos, cerca de 93 96, pelo menos, cerca de 94 96, pelo menos, cerca de 95 96, pelo menos, cerca de 96 %, pelo menos, cerca de 97 %, pelo menos, cerca de 98 96, pelo menos, cerca de 99 %, ou, digamos, 100 % homólogo à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 e 9796, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, assim, a colheita.
[00429] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 e 9752, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo assim a colheita De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para cultivo de uma colheita, compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com os polinucleotídeos exógenos da invenção, por exemplo, os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade em comparação com uma planta não transformada.
[00430] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipetídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N° 220-366, 5629-9399, 9400, 9701-9708, 9753-9795 ou 9796, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento de tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação com uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.
[00431] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N' 1-219, 367-5627, 5628, 9688-9700, 9709-9751 ou 9752, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento de tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação com uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.
[00432] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, conforme detalhado abaixo e na seção Exemplos a seguir.
[00433] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como privação de água, temperatura subótima (baixa temperatura, temperatura elevada), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse causada pelo sal, estresse osmótico, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação W.
[00434] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que plantas transgênicas com tolerância a concentrações elevadas de sal apresentem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em condições com níveis elevados de sal. O estresse por sal pode ser efetuado de muitas maneiras como, p.ex., irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (p.ex., solução de Hoagland), ou submetendo as plantas à cultura em meio de crescimento hiperosmótico [p.ex., meio de Murashige-Skoog (meio MS) a 50%]. Como diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou variedade específica da planta, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para conhecer as diretrizes com relação à concentração apropriada, consulte, Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002 e a referência lá contida).
[00435] Por exemplo, o teste de tolerância à salinidade pode ser realizado irrigando as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (p.ex., 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaC1) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão regular do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são, frequentemente, monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos apareçam nas plantas do tipo selvagem. Dessa forma, a aparência fenotípica externa, o grau de emurchecimento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progênie da produção são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas.
[00436] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não estão limitados ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem maior biomassa do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.
[00437] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios com cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era específico do cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos de germinação sob estresse salino e osmótico, o meio é suplementado, p.ex., com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaC1 ou com 100 mM, 200 mM NaC1, 400 mM de manitol.
[00438] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevida à planta depois de privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol não-iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar em plantas por 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 50 mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento do crescimento, então, tanto as plantas de controle quanto as transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmida e seca), a produção e pelas taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração.
[00439] Inversamente, telas secas com base no solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. Sementes de plantas Arabdopsis de controle, ou de outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido depois que a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente para melhorar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem emurchecimento grave. As plantas recebem água novamente depois de obter uma fração significativa das plantas de controle exigindo emurchecimento grave. As plantas são classificadas em comparação com os controles em relação a cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a reirrigação.
[00440] Tolerância ao estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período de resfriamento, resultando no retardamento do crescimento e em outros fenótipos, são comparados entre as plantas tanto de controle quanto transgênicas, medindo o peso da planta (úmida e seca) e comparando as taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração, o tamanho da planta, a produção e parâmetros semelhantes.
[00441] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é alcançada expondo as plantas a temperaturas acima de 34°C por um determinado período. A tolerância da planta é examinada depois de transferir as plantas de volta para 22°C para recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem ao estresse por calor.
[00442] Eficiência no uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW 1 fresh weight) é registrado imediatamente; então, as folhas são colocadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW 1 turgid weight) é registrado. O peso seco (DW 1 dry weight) total é registrado depois da secagem das folhas a 60°C a um peso constante. O teor relativo de água (RWC relative water content) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I:
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[00443] Eficiência no uso de fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas foram cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, por exemplo, em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci EUA. 2004; 101:7833-8), o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos, o teor de óleo, etc. Semelhantemente, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Dessa forma, a eficiência no uso de nitrogênio (NUE), a eficiência da utilização do fosfato (PUE 1 phosphate use efficiency) e a eficiência da utilização de potássio (KUE ( potassium use efficiency) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de se desenvolverem sob condições de restrição de nutrientes.
[00444] Eficiência no uso de nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (p.ex., plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. Então, as plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou do grão/semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes na utilização do nitrogênio.
[00445] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio utilizando plântulas - O ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low-nitrogen conditions" Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7833-7838). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: O meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Ágar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Estruturas para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para estruturas nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisadas. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite- se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter são utilizadas como controle.
[00446] Determinação do nitrogênio - O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter o N orgânico em NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111-113), a redução mediada de Cd-modificada de NO3- a NO; (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.
[00447] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação ao percentual de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma maneira. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é o meio MS a 50% (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497), o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00448] A germinação também é verificada em condições desfavoráveis como o frio (incubação a temperaturas inferiores a 10°C ao invés de 22°C) ou utilizando soluções para inibição da semente que contenham concentrações elevadas de um osmólito como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaC1).
[00449] O efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, a produção e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.
[00450] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento como a área de folha, o comprimento das fibras, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e parâmetros semelhantes por período.
[00451] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. Por exemplo, as imagens das plantas cultivadas em estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença da área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.
[00452] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por período (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha).
[00453] A Taxa de Crescimento da Área pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II:
Figure img0002
Taxa de Crescimento da Área = Coeficiente de regressão da área ao longo do ciclo de tempo.
[00454] Assim, as unidades da taxa de crescimento da área são expressas em cm2/dia e as unidades da taxa de crescimento do comprimento e diâmetro são expressas em cm/dia.
[00455] Produção de semente - A avaliação do produção de semente por planta pode ser realizada medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, o número) de sementes secas produzidas e colhidas de 816 plantas e dividido pelo número de plantas.
[00456] Por exemplo, as sementes totais de 8-16 plantas podem ser coletadas e pesadas utilizando, p.ex., uma balança analítica, e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O produção de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma maneira levando em consideração a área de cultivo determinada para uma única planta. O aumento do produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas capazes de serem cultivadas em uma determinada área.
[00457] Além disso, a produção de semente pode ser determinado através do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e, então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.
[00458] O Peso de 1000 Sementes pode ser calculado utilizando a Fórmula III: Fórmula III:
Figure img0003
[00459] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando a Fórmula IV. Fórmula IV:
Figure img0004
[00460] Concentração de proteína no grão - O teor de proteína no grão (g de proteína no grão 111-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g de N do 111-2) multiplicado pela taxa de conversão de N/proteína de k5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a relação do teor de proteína no grão por massa unitária do grão (g de proteína no grão kg' do grão).
[00461] Comprimento da fibra - O comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHM ( upper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual (http://www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).
[00462] De acordo com algumas aplicações da invenção, o aumento da produção de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão Conforme mencionado, o aumento da produção da planta pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento da produção de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00463] De modo semelhante, o aumento da produção da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteínas pro semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00464] O aumento da produção da canola pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00465] O aumento da produção do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00466] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetal da planta. Brevemente, os lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (p.ex., semente) moendo o tecido da planta na presença de solventes específicos (p.ex., hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR 1 nuclear magnetic resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, p.ex., Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Online)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NI near infrared), que utiliza a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no W0/2001/023884, que é baseado na extração de óleo com solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz para a corrente de gás e nas partículas de óleo, que forma uma luz refletida detectável.
[00467] Dessa forma, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de culturas comercialmente desejadas (p.ex., biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou de um órgão reprodutor como o número de sementes ou a biomassa da semente).
[00468] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.
[00469] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta).
[00470] O óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria- prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria-prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.
[00471] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.
[00472] MON De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetal (o óleo da porção vegetal da planta).
[00473] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula de planta forma uma parte da planta.
[00474] De acordo com outra aplicação da presente invenção, é fornecido um alimento ou ração, compreendendo as plantas ou uma parte respectiva da presente invenção.
[00475] Conforme utilizado aqui, o termo "aproximadamente" refere- se a ± 10%.
[00476] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "apresentando" e suas conjugações significam "incluindo, mas não se limitando a".
[00477] O termo "consiste de" significa "incluindo e limitado(a) a".
[00478] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicado.
[00479] Conforme utilizada aqui, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural, exceto se o contexto claramente especificar o contrário. P.ex., o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas deles.
[00480] Ao longo do presente pedido, várias aplicações dessa invenção podem ser apresentadas em formato variado. Deve-se compreender que a descrição em formato variado é meramente para conveniência e brevidade e não deverá ser considerada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Portanto, a descrição de uma variedade deve ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Ppor exemplo, a descrição de uma variação como a de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente revelado subvariações como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela variação, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.
[00481] Sempre que uma variação numérica for indicada no presente documento, isso significa incluir qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/varia de" um primeiro número indicado "a" a um segundo número indicado são utilizada aqui intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais e integrais entre eles.
[00482] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidas, ou prontamente desenvolvidas a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.
[00483] Deve-se observar que determinadas características da invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, várias características da invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou da forma apropriada em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.
[00484] Várias aplicações e aspectos da presente invenção são delineados acima e, conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.
EXEMPLOS
[00485] Agora faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações da invenção de forma não limitante.
[00486] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas minuciosamente na literatura. Vide, p.ex., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et ai., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definidas nas Patentes Norte-Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, vide, p.ex., as Patentes Norte- Americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262;3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074;4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Proteína Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são apresentadas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos descritos nessas obras sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui por referência.MÉTODOS
EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL.
[00487] Extração de RNA - Tecidos cultivados em diversas condições de crescimento (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid.469]. Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostradas. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio líquido e ressuspensos em 500 ffil de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 ãl de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. O RNA foi eluído em 30 Ml de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA EUA). Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação do conjunto da expressão.
[00488] Análise de correlação foi realizada para genes selecionados, de acordo com algumas aplicações da invenção, nos quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como "eixo X" para a correlação com o transcriptoma do tecido que foi utilizado como "eixo Y". Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação "R", utilizando a correlação de Ervilharson junto de um valor-p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão de gene em um determinado tecido e um desempenho fenotípico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotípica (p.ex., aumento na produção, taxa de crescimento, eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico e semelhantes).
EXEMPLO 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA PARA IDENTIFICAÇÃO DOS GENES QUE AUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO, PRODUÇÃO E TRAÇOS AGRONÔMICOS IMPORTANTES EM PLANTAS.
[00489] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos cuja expressão respectiva em plantas pode aumentar a tolerância ao estresse abiótico (ABST abiotic stress tolerance), eficiência no uso da água (WUE), produção, produção de fibra, qualidade da fibra, teor de óleo, taxa de crescimento, vigor, biomassa, eficiência no uso do nitrogênio (NUE), eficiência no uso do fertilizante (FUE), tal como eficiência no uso do nitrogênio (NUE) e eficiência no uso da água (WUE), de uma planta.
[00490] Todo os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeos utilizados aqui foram originados a partir das bases de dados disponíveis publicamente ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (p.ex., cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de planta foram introduzidos em uma base de dados abrangente, única. Outras informações na expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas
[00491] Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR, versão 6 (http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/)]; Genoma de arroz [estrutura IRGSP 4.0 (http://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]; Choupo [Populus trichocarpa, liberação 1.1 de JGI (liberação conjunta v1.0) (http://www (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]; Brachypodium [conjunto 4x JGI, http://www (ponto) brachypodium (ponto) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, versão Glyma0 (http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (http://www (ponto) genoscope (ponto) ens (ponto) fir /H; Mamona [TIGR/J, Instituto Craig Venter, conjunto 4x [(http://msc (ponto) jevi (ponto) org/r_communis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; 8. Genoma parcialmente montado de Milho [http ://milhosequence (ponto) org/]; Sequências expressas de EST e mENA foram extraídas das seguintes bases de dados:
[00492] Versões GenBank154, 157, 160, 161, 164, 165, 166 e 168 (http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/ dbEST/); RefSeq (Http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/); TAIR (Http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/); Bases de dados de proteínas e caminhos
[00493] Uniprot [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/].
[00494] AraCyc [http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp].
[00495] ENZYME [http://expasy (ponto) org/enzyme/]. Os conjuntos de dadosde microarranjos foram baixados de:
[00496] GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
[00497] TAIR (http://www.Arabidopsis.org/).
[00498] Dados de microarranjo de propriedade exclusiva (W02008/122980 e seção de Exemplos abaixo). Informações de QTL e SNPs
[00499] Gramene [http://www (ponto) gramene (ponto) org/qt1/].
[00500] Panzea [http://www (ponto) panzea (ponto) org/index (ponto) html].
[00501] Conjunto da Base de Dados - foi elaborado para constituir uma base de dados ampla, rica, detalhada, confiável e fácil de analisar, compreendendo sequências genômicas de mRNA, EST's, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bem como dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTL's e outras informações relevantes.
[00502] O conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de aprimoramento, estruturação, anotação genético e ferramentas de análise que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genético(a) permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcritos antisenso, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [vide, p.ex., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002] e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.
[00503] Conjunto genético e agrupamento .EST - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, Brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antisenso.
[00504] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponíveis, o software de agrupamento "expressed LEADS" foi aplicado.
[00505] Anotação genética - Genes e proteínas previstos foram anotados, conforme segue: A busca Blast [http://blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] com relação a todas as sequências UniProt da planta [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/] foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrito putativo foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteína prevista do transcrito. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpron.
[00506] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear os transcritos previstos com os caminhos da AraCyc.
[00507] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo de comparação [http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.
[00508] Perfil da expressão genética - Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenótipos.
[00509] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para ABST, aumento da produção, taxa de crecimento, vigor, biomassa, teor de óleo, WUE, NUE e FUE de uma planta.
[00510] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta (p.ex., o tecido/órgão no qual o gene é expresso), o estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de ESTs nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse indicando uma expressão especializada.
[00511] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosaquencing) em: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica com base na abundância relativa de EST's nos dados foi realizada pelo pirosaquenciamento 454 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. O pirosaquenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (ESTs) que se agruparam em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [http://www (ponto) icugi (ponto) org/] confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento. Padrões de expressão de genes selecionados ajustaram bem seus dados de qRT-PCR.
EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO, NUE E ABST MEDIDOS EM CAMPOS UTILIZANDO MICROARRANjOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K.
[00512] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo de planta e o nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de sorgo, produzida pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis of expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 17 diferentes híbridos de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
1. CORRELAÇÃO DE VARIEDADES DE SORGO CULTIVADAS SOB CONDIÇÕES REGULARES DE CULTIVO, CONDIÇÕES GRAVES DE SECA E CONDIÇÕES DE BAIXO NITROGÊNIO. Procedimentos Experimentais
[00513] 17 variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte: 1. Condições regulares de cultivo: as plantas de sorgo foram cultivadas em campo, utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação que incluíram 370 m3 de água por dunam (ou seja, 1000 m2) durante todo o período de cultivo, e fertilização de 14 unidades de URAN° a 21% (Solução de Fertilizante de Nitrogênio; PCS Sales, Northbrook, IL, EUA) (condições normais de cultivo).
[00514] 2. Condições de Seca: sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas em condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, por volta do estágio V8 (oito folhas verdes são totalmente expandidas, inicialização não iniciada ainda). Nesse ponto, a irrigação foi interrompida, e estresse de seca severa foi desenvolvido.
[00515] 3. Condições defertilização de baixo nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de cultivo regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes da floração.
[00516] Tecidos de Sorgo analisados - todos os 10 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Os tecidos [folha, meristema da flor e flor] das plantas cultivados sob condições normais, grave estresse de seca e condições de baixo nitrogênio foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo em experimentos de campo
Figure img0005
[00517] Tabela 1: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo de 1-9.
[00518] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área Média do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Amostras de -200 grãos cada foram pesadas, fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00519] Comprimento Médio do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00520] Área Média da Cabeça (cm2) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da 'cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de 'Cabeças'.
[00521] Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da 'Cabeça' (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'cabeças'.
[00522] [0()444] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área de semente e comprimento de semente foram salvos para arquivos de texto e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS).
[00523] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou pela medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00524] Peso Total da Semente por Cabeça (g) - No final do experimento ('Cabeças' da planta), as cabeças dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total dos grãos de 5 cabeças foi dividido por 5.
[00525] Cabeça FW por grama da Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas), o total de cabeças e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (g.) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total de cabeças (Cabeça FW /Planta g. com base no lote) e para 5 cabeças (Cabeça FW /Planta g. com base em 5 plantas).
[00526] Altura da Planta - As plantas foram caracterizadas com relação à altura durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação à sua altura utilizando uma fita de medição. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.
[00527] Número de folhas da planta - As plantas foram caracterizadas com relação ao número de folhas durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folhas contando todas as folhas de 03 plantas selecionadas por lote.
[00528] Taxa de Crescimento - foi calculada utilizando as Fórmulas V e VI. Fómula V:
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Fómula VI:
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[00529] SPAD O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.
[00530] Peso fresco vegetal e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescências estava seca), toda a inflorescência e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso da biomassa e cabeças de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de cabeças.
[00531] Peso fresco = peso total da porção vegetal acima do solo (excluindo as raízes) após secagem a 70°C em forno por 48 horas.
[00532] Índice de Colheita (111 Harvest Index) (Sorgo) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmulas VII. Fórmulas VII:
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[00533] O Índice de Colheita do Sorgo* (* quando as plantas não foram secadas) foi calculado utilizando a Fórmula VIII, conforme segue: Fórmula VIII:
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[00534] O peso seco total das cabeças e suas respectivas biomassas de planta foram medidos no dia da colheita. O peso das cabeças foi, então, dividido pela soma dos pesos das cabeças e plantas.
[00535] Os parâmetros de dados coletados foram resumidos na Tabela 2 abaixo: Tabela 2 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)
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Figure img0012
[00536] Tabela 2. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). "DW" = Peso Seco; (51)" = Média de cinco inflorescências; "FW" = Peso Fresco; "g." = gramas; "cm" = centímetro; "SPAD" = níveis de clorofila
Resultados Experimentais Condição normal de cultivo (dos parâmetros 1 a 55).
[00537] 16 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e ca<racterizadas por 55 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 3-8 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 1) e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 3 Acessos de Sorgo e parametros medidos sob condições normais de crescimento.
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[00538] Tabela 3: São fornecidos os parâmetros medidos sob condições de irrigação a 50% de acessos de Sorgo (ID de Semente), de acordo com os números do ID de Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 2 acima). Tabela 4 Acessos de Sorgo e parametros adicionais medidos sob condições normais de crescimento.
Figure img0014
[00539] Tabela 4: São fornecidos os parâmetros medidos sob condições de irrigação a 50% de acessos de Sorgo (ID de Semente) , de acordo com os números do ID de Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 2 acima). Tabela 5 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico de manutenção do desempenho sob condições de seca em variedades de sorgo
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[00540] Tabela 5: Correlações (R) entre o nível de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID de Corr." - ID do conjunto de correlação, de acordo com os parâmetros relacionados da Tabela 2 acima. "Conj. de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E NUE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 44K
[00541] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de milho. A fim de definir correlaçãoes entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção e NUE, várias características de plantas de 12 diferentes híbridos de milho foram analizadas. Entre eles, 10 híbridos abrangendo a variância observada foram selecionados pana análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analizada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Correlação de híbridos de milho através de ecotipos cultivados sob condições de cultivo regulares.
Procedimentos Experimentais.
[00542] 12 híbridos de milho foram cultivados em 3 lotes repetidos, em campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção e NUE, os 12 híbridos diferentes de milho foram analisados. Dentre elas, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisando utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00543] Tecidos de Milho analisados - Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados de acordo com cada tratamento. Os tecidos de planta [Folha bandeira, Meristema da flor, Grão, Sabugo e Entrenó] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme resumido na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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[00544] Tabela 6: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho.
[00545] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital:
[00546] Área do Grão (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00547] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00548] M5()41 Área da Espiga (cm2) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00549] Comprimento e Largura da Espiga (cm) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00550] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00551] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00552] Peso Normalizado do Grão por planta (gr.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 6 espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de espigas lote (com base na unidade) . No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00553] FW da Espiga (gr.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para total (FW da Espiga por lote) e para 6 (FW da Espiga por planta).
[00554] [Mn Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.
[00555] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o período de cultivo em 5 vezes no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas por seu número de folha contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.
[00556] K05121 A taxa de crescimento do número de folhas foi calculada utilizando a Fórmula VI, conforme indicado acima (Taxa de crescimento do número de folhas da planta = Coeficiente de regressão do número de folhas da planta ao longo do curso do tempo). Fórmula IX Taxa de Crescimento as área vegetal. Taxa de crescimento da área vegetal = Coeficiente de regressão da área vegetal da planta ao longo do curso do tempo.
[00557] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote. Os dados foram tirados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS ( days post sowing).
[00558] Peso Seco por planta - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.
[00559] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70eC em uma câmara de secagem por 48 horas.
[00560] Índice de Colheita (HI) (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula X.
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[00561] Porcentual Preenchido da Espiga (R5] - foi calculado como a porcentagem da área da Espiga com grãos fora da espiga total.
[00562] Diâmetro do sabugo (cm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.
[00563] Número de Fileira do Núcleo por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.
Resultados Eperimentais
[00564] 12 diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros (Tabela 7). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 89) e uma análise de correção subsequente foi realizada. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 7 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)
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[00565] Tabela 7. São fornecidos os parâmetros correlacionados do Milho (vetores). "FW" = Peso Fresco; "g." = gramas; "LAI" = índice de área da folha; "cm" = centímetro; "SPAD" = níveis de clorofila.
Resultados Eperimentais
[00566] Seis acessos de milho foram cultivados e caracterizados com relação aos parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos na Tabela 8 abaixo. Uma correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma para todos os conjuntos ou para subconjuntos de linhas foi feita através da unidade de bioinformática e os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 8 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais de cultivo.
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[00567] Tabela 8. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 9 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico de manutenção do desempenho sob condições de seca em linhas de milho
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[00568] Tabela 9: Correlações (R) entre o nível de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID de Corr." - ID do conjunto de correlação, de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 7 acima. "Conj. de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K
[00569] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. O oligonucleotídeo de arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de milho projetados com base nos dados de bancos de dados públicos (Exemplo 1). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de plantas de 12 diferentes híbridos de milho foram analisados. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
Procedimentos experimentais
[00570] 12 plantas híbridas foram cultivadas em campo sob condições normais de cultivo. Cinco tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento, incluindo Espiga (floração - R1), folha (floração - R1), Grão da folha da parte basal da espiga e Grão da parte distal da espiga que representam diferentes características da planta foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito nos "MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 10 abaixo. Tabela 10 Tecidos utilizados para Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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[00571] Tabela 10: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Milho (1-8).
[00572] Os parâmetros a seguir foram coletados: Área do Grão (cie) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00573] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos e/ou largura do grão (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00574] Área da Espiga (24312) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de espigas.
[00575] Comprimento da Espiga e Largura Espiga (cm) - No final do período de cultivo, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e a largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foram divididos pelo número de espigas.
[00576] O sistema de processamento de imagem utilizado consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, Java com base no software de processamento de imagem, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard 1 Padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída do processamento de imagem para a área de semente e comprimento de semente foram salvos como arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00577] Os parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 6 plantas por lote ou pela medição dos parâmetros através de todas as plantas dentro do lote.
[00578] Peso Normalizado do Grão por planta (g) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. Seis espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso do grão foi normalizado utilizando umidade relativa a 0%. O peso médio normalizado do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão normalizado pelo número total de espigas por lote (com base na unidade). No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00579] Espiga FW (g) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (g.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para total (Espiga FW por lote) e para 6 (Espiga FW por planta).
[00580] Altura da Planta e Altura da Espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo da bandeira do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.
[00581] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o período de cultivo em 5 vezes no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas por seu número de folha contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.
[00582] Taxa de Crescimento - foi calculada utilizando um coeficiente de regressão de mudança do número de folhas ao longo de um período de tempo.
[00583] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote. Os dados foram tirados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS).
[00584] Peso seco por planta - No final do experimento, quando todo o material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado, pesado e dividido pelo número de plantas.
[00585] Diâmetro da espiga [mal- O diâmetro da espiga na metade da espiga foi medido utilizando uma régua.
[00586] Diâmetro do sabugo (cm] - O diâmetro do sabugo sem os grãos foi medido utilizando uma régua.
[00587] Número de fileira do núcleo por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. A média de 6 espigas por lote foi calculada. Tabela 11 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)
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[00588] Tabela 11: São fornecidos os parâmetros correlacionados
[00589] ao Milho (vetores). "DW" = Peso Seco; "FW" = Peso Fresco; "g." = gramas; "cm" = centímetro; "SPAD" = níveis de clorofila. "TP2" = período de tempo 2; "TP5" = período de tempo 5.
Resultados experimentais
[00590] Doze acessos de milho foram cultivados e caracterizados com relação aos parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 12-13 abaixo. A correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma para todos os conjuntos ou subconjuntos de linhas foi feita através da unidade de bioinformática e os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 12 Parâmetros medidos em Híbridos de Milho
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[00591] Tabela 12: São fornecidos os parâmetros medidos sob condições normais de cultivo de acessos de milho, de acordo com os números do ID de Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 16 acima). Tabela 13 Parâmetros Medidos em Parâmetros Adicionais de Híbridos de Milho
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[00592] Tabela 13: São fornecidos os parâmetros medidos sob condições normais de cultivo de acessos de milho, de acordo com os números do ID de Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 16 acima). Tabela 14 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico da manutenção de desempenho em .condições de seca em linhas de milho
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Tabela 14: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 11 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 44K
[00593] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade comparando entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido por Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 47,500 genes de cevada e transcrições. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, várias características de planta de 25 acessos de Cevada diferentes foram analisadas no campo em condições normais de crescimento. Dentre elas, 13 acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisado utilizando o teste de correlação Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].
Procedimentos experimentais
[00594] Tecidos de Cevada analisados - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [meristema, flor, surgimento de espiga, bandeira de folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 15 abaixo. Tabela 15 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada
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[00595] Tabela 15: São fornecidos os conjuntos de .expressão de transcriptoma de Cevada
[00596] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 25 acessos de Cevada em 4 lotes repetitivos (denominados A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por lote, foram cultivadas na estufa. As plantas foram fenotipadas diariamente de acordo
[00597] com o descritor padrão de cevada (Tabela 16, abaixo). A colheita foi realizada enquanto 50% das espigas estavam secas para evitar a liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas quanto à parte vegetal e espigas, uma delas, 5 espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para análise adicional de grãos, como medida de tamanho, contagem de grãos por espiga e de produção de grãos por espiga. Todo o material foi seco em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Tabela 16 Descritores padrões da cevada.
Figure img0045
[00598] Tabela 16. Descritores padrões de cevada.
[00599] Grão por espiga - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. O total de grãos a partir de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. O grão médio por espiga foi calculado dividindo o número total de grãos pelo número de espigas.
[00600] Tamanho médio do grão (cm) - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. O total de grãos a partir de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi digitalizado e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de imagem digital. A digitalização de grão foi feito utilizando um digitalizador Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisados com software Image J. O tamanho médio do grão foi calculado dividindo o tamanho total do grão pelo número total de grãos.
[00601] Peso médio do grão (mg) - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. O total de grãos a partir de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado e pesado. O peso médio foi calculado dividindo o peso total pelo número total de grãos.
[00602] Produção de Grão por espiga (g) - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O total de grãos a partir de 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. A produção de grão foi calculada dividindo o peso total pelo número de espiga.
[00603] Análise de comprimento da espiga - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando fita métrica, excluindo as arestas.
[00604] Análise de número da espiga - No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. As espigas por planta foram contadas.
[00605] Classificação do hábito de cultivo - Na fase 10 de cultivo (surgimento), cada uma das plantas foi classificada por sua natureza de hábito de cultivo. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.
[00606] Pilosidade das folhas basais - Na fase 5 de cultivo (bainha da folha fortemente erguida, final do perfilho) cada uma das plantas foi classificada quanto à pilosidade natural da folha antes da última. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.
[00607] Altura da planta - Na fase de colheitas (50% das espigas estavam secas) cada uma das plantas foi medida quanto a sua altura, utilizando fita métrica. Altura foi medida a partir do nível do solo até o topo mais distante da espiga excluindo as arestas
[00608] Dias para floração - Cada uma das plantas foi monitorada com relação à data de floração. Os dias para floração foram calculados a partir da data de semeadura até a data de floração.
[00609] Pigmentação do caule - Na fase 10 de cultivo (surgimento), cada uma das plantas foi classificada quanto à cor de caule. A escala que foi utilizada foi 1 para verde até 5 para púrpura total.
[00610] Peso seco vegetal e produção da espiga- No final do experimento (50% das espigas estavam secas) todas as espigas e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-D foi coletadas. O peso da biomassa e espigas de cada unidade foi separado, medido e divido pelo número de plantas.
[00611] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70^C em uma câmara de secagem por 48 horas; Produção de espiga por planta = peso total da espiga por planta (g) após secagem a 30eC em estufa por 48 horas; Índice de Colheita (para cevada) - O índice de colheita é calculado utilizando a Fórmula XI.
[00612] Fórmula XI: Índice de Colheita = Peso seco médio da espiga por planta/ (Peso seco vegetal médio por planta + Peso seco médio da Espiga por planta) Tabela 17 Parãmetros correlacionados à Cevada (vetores)
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[00613] Tabela 17. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada.
Resultados experimentais
[00614] 13 acessos diferentes de Cevada foram cultivados e caracterizados por 13 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 18 e 19 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 15) e os parâmetros médios (Tabela 18 e 19) foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 18 Parâmetros medidos dos IDs de correlação nos acessos de Cevada
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[00615] Tabela 18. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nos acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação apresentadas na Tabela 17. Tabela 19 Acessos de cevada, parâmetros adicionais medidos
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[00616] Tabela 19. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos nos acessos de Cevada de acordo com as identificações de correlação apresentadas na Tabela 17. Tabela 20 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico da manutenção de desempenho em condições de seca das variedades de cevada
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Figure img0050
[00617] Tabela 20. Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 17 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" - coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE CEVADA 60K
[00618] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies [Http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca
[00619] de 60.000 de genes e transcrições de Cevada. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados à produção e vigor, foram analisadas várias características das plantas de 15 acessos de cevada diferentes. Entre eles, 10 acessos abrangendo a variação observada foram selecionados para análise da expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
Correlação de variedades de Cevada cultivadas sob condições de cultivo regular e de seca. Procedimentos experimentais
[00620] Tecidos de Cevada analisados - Quatro tecidos [folha, meristema, espiga e ponta da raiz] em dois estágios de desenvolvimento, representando diferentes características da planta foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para cada tipo de tecido, as informações de expressão do microarranjo receberam um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 21 abaixo. Tabela 21 Conjuntos de expressão do transcriptoma da Cevada
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[00621] Tabela 21: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada.
[00622] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção da Cevada - 15 acessos de Cevada em 5 blocos repetitivos, cada um contendo 5 plantas por lote, foram cultivados em estufas com rede. Foram aplicados dois tratamentos diferentes: as plantas foram fertilizadas regularmente e regadas durante o cultivo da planta até a colheita (conforme recomendado para o cultivo comercial) ou sob estresse devido à seca. As plantas foram fenotipadas diariamente após o descritor padrão de cevada (Tabela 22, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto todas as espigas estavam secas. Todo o material foi seco em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características de sementes (peso e tamanho) utilizando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido no Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e disponível gratuitamente na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS).
[00623] Número de grãos - O número total de grãos de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. O número de grãos por unidade foi contado.
[00624] Peso do grão (g.) - No final do estudo, todas as espigas dos lotes foram colhidas. O total de grãos de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi contado e ponderado. A produção de grãos foi calculada por unidade.
[00625] Análise do comprimento e largura da espiga No final do estudo, o comprimento e a largura das cinco espigas escolhidas por planta foram medidos utilizando fita métrica excluindo as aristas.
[00626] Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.
[00627] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida quanto a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo mais distante da espiga excluindo as aristas em dois pontos de tempo na fase de crescimento Vegetal (30 dias após a semeadura) e na colheita.
[00628] Data de início do desenvolvimento - Cada uma das plantas foi monitorada com relação à data de floração. A data de início de desenvolvimento foi calculada a partir da semeadura até o surgimento de 50% das espigas.
[00629] Peso da espiga - O peso da biomassa e das espigas de cada unidade foi separado, medido e dividido pelo número de plantas.
[00630] Peso Seco = peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) após secagem a 70° C na estufa durante 48 horas em dois pontos de tempo na fase de crescimento Vegetal (30 dias após a semeadura) e na colheita.
[00631] Peso seco da raiz - peso total da parte da raiz enterrada após a secagem a 70oC em estufa por 48 horas na colheita.
[00632] Proporção Raiz/Broto A Proporção Raiz/Broto foi calculada utilizando a Fórmula XII.
[00633] Fórmula XII: Proporção Raiz/Broto = peso total da raiz na colheita /peso total da parte vegetal acima do solo na colheita.
[00634] Número total de perfilhos - todos os perfilhos foram contados por unidade em dois pontos de tempo na fase de crescimento Vegetal (30 dias após a semeadura) e na colheita.
[00635] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila do tipo Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folhas jovens plenamente desenvolvidas. Três medições por folha foram tomadas por unidade.
[00636] FW da Raiz (g.), comprimento da raiz (cm) e número de raízes laterais - 3 plantas por unidade foram selecionadas para a medição do peso da raiz, comprimento de raiz e para a contagem do número de raízes laterais formadas.
[00637] FW do Broto - o peso de 3 plantas por lote foi registrado em diferentes pontos de tempo.
[00638] Teor relativo de água - O peso fresco (PF) de três folhas de três plantas de cada um dos diferentes ID da semente é registrado de imediato, em seguida, as folhas são embebidas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. O peso seco total (DW) foi registrado, após secagem das folhas, a 60°C a um peso constante. O teor relativo de água (RWC) foi calculado de acordo com a Fórmula I (RWC = [(FW -DW) / (TW - DW)] x 100), conforme descrito acima.
[00639] Índice de Colheita (para a cevada) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XI acima [Peso seco médio da espiga por planta/ (Peso seco vegetal médio por planta + Peso seco médio da espiga por planta).
[00640] Taxa de crescimento: A taxa de crescimento (GR 1 growth rate) da Altura da Planta (Fórmula V acima), SPAD (Fórmula XIII abaixo) e número de perfilhos (Fórmula XIV abaixo) foi calculada com as fórmulas indicadas.
[00641] Fórmula XIII: Taxa de crescimento de SPAD = Coeficiente de regressão de medidas do SPAD ao longo do tempo.
[00642] Fórmula XIV: Taxa de crescimento do Número de perfilhos = Coeficiente de regressão do Número de perfilhos ao longo do tempo. Tabela 22 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores)
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[00643] Tabela 22: São fornecidos os parâmetros .correlacionados à Cevada
Resultados Experimentais
[00644] Quinze diferentes acessos de Cevada foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 23 e 24 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 21) e os parâmetros médios (Tabelas 23-24) foram conduzidos. Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 23 Parâmetros medidos dos ID's de correlação em acessos de Cevada
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[00645] Tabela 23: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação apresentadas na Tabela 22 acima. Tabela 24 Parâmetros medidos
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[00646] Tabela 24: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação apresentadas na Tabela 22 acima. Tabela 25 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico da manutenção de desempenho em condições de seca em
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Figure img0056
[00647] Tabela 25: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 11 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO QUANDO CULTIVADO EM CONDIÇÕES NORMAIS UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K
[00648] Correlação de híbridos de milho e seus homólogos cultivados em condições normais - 50 Híbridos de milho e suas 14 linhas relacionadas foram cultivados em 5 lotes repetidos, no campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, os 50 híbridos diferentes de milho e seus 14 milhos relacionados foram analisados e foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisado utilizando o teste de correlação Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].
[00649] Tecidos de milho analisados - Todo o total de 64 linhas de milho selecionadas foram amostradas. Os tecidos da planta [folhas, caule, caule alongando entrenós, meristema feminino] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 26 abaixo. Tabela 26 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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[00650] Tabela 26: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
[00651] Os parâmetros a seguir foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00652] Peso do grão por planta (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes foram coletadas. 6 espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número de espigas totais por lote (com base na unidade). No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00653] Peso da Espiga por planta (g.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada.
[00654] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.
[00655] Peso Seco Médio - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes foi coletado.
[00656] Largura do sabugo (cm] - A largura do sabugo sem grãos foi medida utilizando um paquímetro.
[00657] Matéria seca total = peso total da parte vegetal acima da terra (incluindo as espigas, excluindo as raízes).
[00658] Espiga Preenchida/Integral - foi calculado como o comprimento da Espiga com grãos fora da espiga total.
[00659] Número de Fileira da Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.
[00660] Largura do caule (cm] - O diâmetro do caule foi medido no entrenó localizado abaixo da espiga principal. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.
[00661] Índice de área da folha (LAI / leaf area index] = área total de folha de todas as plantas em um lote. A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar.
[00662] Peso de 1000 grãos - No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram coletadas e medidas e o peso de 1000 foi calculado.
[00663] Crescimento da altura da planta: a taxa de crescimento (GR) da Altura da Planta foi calculada utilizando a Fórmula V (descrita acima).
[00664] Crescimento da folha: a taxa de crescimento (GR) do número da folha foi calculada utilizando a Fórmula VI (descrita acima).
[00665] Índice de Colheita = O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula X acima [Peso seco médio do grão por Espiga / (Peso seco vegetal médio por Espiga + Peso seco médio da Espiga)].
[00666] Data de início do desenvolvimento - Cada uma das plantas foi monitorada com relação à data de floração. A data de início do desenvolvimento foi calculada a partir da data de semeadura até 50% da floração das plantas macho.
[00667] Número de dias para nascimento do cabelo Cada um dos lotes foi monitorado com relação à data de nascimento do cabelo. O número de dias até o nascimento do cabelo foi calculado a partir da data de semeadura até o surgimento de 50% das espigas.
[00668] Número de nós - o número de nós foi calculado a partir da planta total.
[00669] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando sistema de formação de imagem digital.
[00670] Área do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00671] Comprimento do Grão e Largura do Grão (mm) No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00672] Perímetro do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00673] Área da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00674] Área do Grão Preenchido da Espiga (cm2) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão preenchido da espiga foi área da espiga com grãos fora da área da espiga total e foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00675] Comprimento, largura e perímetro da Espiga (cm) - No final do período de cultivo, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento, largura e perímetro da espiga foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00676] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Tabela 27 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)
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Tabela 27: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Milho
[00677] As Tabelas 28 a 35 fornecem os parâmetros medidos. Tabela 28 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
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[00678] Tabela 28: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 29 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
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[00679] Tabela 29: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 30 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
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Figure img0063
[00680] Tabela 30: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 31 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
Figure img0064
Figure img0065
[00681] Tabela 31: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem-se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 32 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
Figure img0066
[00682] Tabela 32: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem-se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 33 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
Figure img0067
[00683] Tabela 33: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 34 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
Figure img0068
[00684] Tabela 34: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem-se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 35 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
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[00685] Tabela 34: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem-se àqueles descritos na Tabela 27 acima [Parãmetros correlacionados ao Milho (vetores)]. Tabela 36 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico da manutenção de desempenho em condições de seca em variedades de milho
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[00686] Tabela 36: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 11 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE BRACHYPODIUM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANjOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE BRACHYPODIUM 60K
[00687] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de brachypodium, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto)com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de brachypodium. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, foram analisadas várias características das plantas de 24 acessos de brachypodium diferentes. Entre eles, 22 acessos abrangendo a variação observada foram selecionados para análise da expressão do RNA e análise de hibridização genômica comparativa (CGH I comparative genomic hybridization).
[00688] A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00689] Análises de correlação adicionais foram feitas comparando o fenótipo da planta e o número de cópia do gene. A correlação entre os níveis de sinal de hibridização do número de cópia normalizado e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
Procedimentos experimentais
[00690] Tecidos de Brachypodium analisados - dois tecidos [folha e espiga] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para cada tipo de tecido, as informações de expressão de microarranjo receberam um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 37 a seguir. Tabela 37 Conjuntos de expressão de transcriptoma de brachypodium.
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[00691] Tabela 37: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de brachypodium sob condições normais.
[00692] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção de brachypodium - 14 acessos de brachypodium foram cultivados em 4-6 unidades repetitivas (8 plantas por unidade), em uma estufa. O protocolo de cultivo se deu conforme segue: as sementes de brachypodium foram semeadas em unidades e plantadas sob condições normais. As plantas foram continuamente fenotipadas durante o período de crescimento e na colheita (Tabela 38 abaixo). O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet [Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS).
[00693] No final do período de cultivo, os grãos foram separados das espigas e os seguintes parâmetros foram medidos, utilizando o sistema de imagem digital e coletados.
[00694] Número de perfilhos - todos os perfilhos foram contados por planta na colheita (média por unidade).
[00695] Número de Cabeças - No final do estudo, as cabeças foram colhidas a partir de cada lote e foram contadas.
[00696] Peso Total dos Grãos por unidade (g) - No final do estudo ("Cabeças" da planta) as cabeças das unidades foram colhidas, debulhadas e os grãos foram pesados. Ademais, o peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por unidade (com base na unidade).
[00697] Maior número de espiguetas - O maior número de espiguetas por cabeça foi calculado por planta (média por unidade).
[00698] Número médio de espiguetas - O número médio de espiguetas por cabeça foi calculado por planta (média por unidade).
[00699] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida quanto à altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até a base da espiga da maior espiga na colheita.
[00700] Peso das espiguetas (g)- O peso da biomassa e das espigas de cada unidade foi separado, medido pela unidade.
[00701] Peso médio da cabeça - calculado dividindo o peso da espigueta pelo número da cabeça (g)
[00702] Índice de Colheita - o índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XV. Fórmula XV: Índice de Colheita (brachypodium) = Peso médio do grão / peso seco médio (vegetal + espigueta) por planta.
[00703] Índice de Espiguetas - O índice de Espiguetas é calculado utilizando a Fórmula XVI. Fórmula XVI: Índice de Espiguetas = Peso médio das Espiguetas por planta/ (Peso seco médio vegetal por planta mais peso médio de espiguetas por planta).
[00704] Número percentual de cabeças com espiguetas - O número de cabeças com mais de uma espigueta por planta foi contado e o percentual a partir de todas as cabeças por planta foi calculado.
[00705] Matéria seca total por lote - Calculada como parte vegetal acima do solo, mais todo o peso seco de espiguetas por lote.
[00706] Peso de 1000 grãos - No final do estudo, todos os grãos de todos os lotes foram recolhidos e pesados e o peso de 1000 foram calculados.
[00707] Os seguintes parâmetros foram coletados por meio de sistema de imagem digital:
[00708] No final do período de cultivo, os grãos foram separados das espigas e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados.
[00709] (i) Área Média de Grãos (cm2) - Uma amostra de - 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00710] (ii)Perimetro, largura e comprimento Médio de Grãos (cm) - Uma amostra de - 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e dividida pelo número de grãos.
[00711] O sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 com base em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet em Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em baixa compressão em formato JPEG. Em seguida, os dados de saída do processamento de imagem para a área de semente e o comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS). Tabela 38 Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)
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[00712] Tabela 38: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao brachypodium
Resultados Experimentais
[00713] 25 diferentes acessos de Brachypodium foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 39-40 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 39 Parâmetros medidos dos ID's de correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais
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[00714] Tabela 39: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem-se àqueles descritos na Tabela 38 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 40 Parâmetros medidos dos ID's de correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais
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5 4 80 8 0 2 7 3 6 3 2
[00715] Tabela 40: Os ID's de Correlação: 1, 2, 3, 4, 5, ...etc. referem- se àqueles descritos na Tabela 38 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 41 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico da manutenção de desempenho em condições de seca em eco tipos de Brachypodium
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[00716] Tabela 41: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 11 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO-PAINÇO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO-PAINÇO 60K
[00717] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho-painço, produzido pela Agilent Technologies [Http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de milho-painço. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados à produção e ao vigor, foram analisadas várias características das 15 plantas de acessos de milho-painço diferentes. Entre eles, 11 acessos abrangendo a variação observada foram selecionados para análise da expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
Procedimentos experimentais
[00718] Tecidos de milho-painço analisados - três tecidos em diferentes fases de desenvolvimento [folha, flor e caule] que representam diferentes características das plantas, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para cada tipo de tecido, as informações de expressão de microarranjo receberam um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 42 abaixo. Tabela 42 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições normais
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[00719] Tabela 42: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições normais.
[00720] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção de milho painço - 14 acessos de milho-painço em 5 lotes repetitivos, no campo. Sementes de milho-painço foram semeadas em solo e cultivadas em condição normal no campo. As plantas foram continuamente fenotipadas durante o período de crescimento e na colheita (Tabela 44-45 abaixo). O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet [Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS).
[00721] Os seguintes parâmetros foram coletados por meio de sistema de imagem digital: No final do período de cultivo, os grãos foram separados das "Cabeças" da Planta e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados.
[00722] Área Média de Grãos (r1772) - Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00723] Comprimento Médio e largura dos Grãos (cm) - Uma amostra de - 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e dividida pelo número de grãos.
[00724] Ao final do período de cultivo, 14 "Cabeças" foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo.
[00725] Área Média da Cabeça (cm2) A "Cabeça" foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de "Cabeças".
[00726] Comprimento Médio das "Cabeças" (zum) O comprimento da "Cabeça" (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de "Cabeças".
[00727] O sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 com base em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet em Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em baixa compressão em formato JPEG. Em seguida, os dados de saída do processamento de imagem para a área de semente e o comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS).
[00728] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 5 plantas por lote ou medindo o parâmetro em todas as plantas do lote.
[00729] Peso Total do Grão (g.) - No final do estudo ("Cabeças" da planta) as cabeças dos lotes foram colhidas, debulhadas e os grãos foram pesados. Além disso, o peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por lote (com base no lote).
[00730] Peso das cabeças e número de cabeças - No final do estudo, as cabeças foram colhidas de cada lote e foram contadas e pesadas (kg).
[00731] Biomassa na colheita - No final do estudo, o material vegetal dos lotes foi pesado.
[00732] Peso Seco = peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) após secagem a 70° C na estufa durante 48 horas na colheita.
[00733] Matéria seca total por lote - Calculada como parte vegetal acima do solo, mais todo o peso seco das cabeças por lote.
[00734] Número (N°) de dias para a antese Calculado como o número de dias a partir da semeadura até 50% do lote chegar à antese.
[00735] Manutenção do desempenho sob condições de seca: representa a taxa para um parâmetro específico de resultados de condição de Seca dividido pelos resultados de condições Normais (manutenção do fenótipo sob seca comparado às condições normais).
[00736] Os parâmetros de dados coletados foram resumidos na Tabela 43 abaixo: Tabela 43 Parâmetros correlacionados ao milho painço (vetores)
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[00737] Tabela 43: São fornecidos os parâmetros coletados de milho- painço
Resultados Experimentais
[00738] 14 diferentes acessos de milho-painço foram cultivados e caracterizados por parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 44 e 45 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 44 Parâmetros medidos das ID's de correlação em acessos de milho-painço sob condições normais
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[00739] Tabela 44. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 45 Parâmetros adicionais medidos das ID's de correlação em acessos de milho painço sob condições normais
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[00740] Tabela 45. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 46 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições de seca em variedades de milho painço
Figure img0086
[00741] Tabela 46: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela 11 acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p.
EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SOJA (GLYCINE MAX) E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS DE PRODUÇÃO UTILIZANDO MICROARRANjOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE B. SOJA 44K
[00742] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Soja, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 42.000 genes e transcritos de Soja. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com os componentes de produção ou parâmetros relacionados à arquitetura da planta ou parâmetros relacionados ao vigor da planta, várias características da planta de 29 variedades diferentes de Glycine max foram analisadas e 12 variedades foram, ainda, utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
Correlação dos níveis de expressão de genes de Glycine max com características fenotipicas através do Ecotipo. Procedimentos experimentais
[00743] 29 variedades de Soja foram cultivadas em três lotes repetitivos, no campo. Em resumo, o protocolo de cultivo foi conforme segue: as sementes de soja foram semeadas no solo e cultivadas em condições normais até a colheita. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de produção ou parâmetros relacionados à arquitetura da planta ou parâmetros relacionados ao vigor, 12 variedades diferentes de soja (foras as 29 variedades) foram analisadas e utilizadas para análises de expressão de gene. A análise foi realizada em dois períodos de tempo predeterminados: no conjunto da vagem (quando as vagens da soja são formadas) e no momento da colheita (quando as vagens da soja estão prontas para colheita, com sementes maduras).
Tecidos analisados da Soja
[00744] Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou estrutura da planta ou parâmetros relacionados ao vigor, 12 variedades diferentes de Soja (de 29 variedades) foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de RNA. A análise foi realizada em dois períodos de tempo pré- determinados: no conjunto da vagem (quando as vagens da soja são formadas) e no momento da colheita (quando as vagens da soja estão prontas para colheita, com sementes maduras). Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme resumido na Tabela 47 abaixo. Tabela 47 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Soja
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[00745] Tabela 47. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Soja
[00746] Extração de RNA - Todas as 12 variedades de soja selecionadas foram amostradas de acordo com o tratamento. Os tecidos da planta [folha, raiz, caule, vagem, meristema apical, botões de flor] cultivados em condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído nos estágios indicados (p.ex., antes da floração, na floração, no conjunto de vagem), conforme descrito acima.
[00747] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: Diâmetro da base do ramo principal [mm] no conjunto de vagem - o diâmetro da base do ramo principal (diâmetro com base), média de três plantas por lote.
[00748] Peso fresco [g/planta] no conjunto de vagem - peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) antes de secar no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00749] Peso seco [g/planta] no conjunto de vagem peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) após secar a 70eC em forno por 48 horas no conjunto da vagem, média de três plantas por lote.
[00750] Número total de nós com vagens nos ramos laterais [valor/planta] - contagem dos nós que contêm vagens em ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00751] Número de ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00752] Peso total dos ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00753] Peso total das vagens no caule principal no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00754] Número total de nós no caule principal [valor/planta] - contagem do número de nós no caule principal começando do primeiro nó acima do solo, média de três plantas por lote.
[00755] Número total de vagens com 1 semente nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 1 semente em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00756] Número Total de vagens com 2 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 2 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00757] Número total de vagens com 3 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem (valor/planta] contagem do número de vagens contendo 3 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00758] Número total de vagens com 4 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 4 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00759] Número total de vagens com 1 semente no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 1 semente no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00760] Número total de vagens com 2 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 2 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00761] Número total de vagens com 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00762] Número total de vagens com 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] contagem do número de vagens contendo 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00763] Número total de sementes por planta no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de sementes nos ramos laterais e caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00764] Número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00765] Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00766] Altura da planta no conjunto de vagem [coa/planta] - comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00767] Altura da planta na colheita (cm/planta] comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal na colheita, média de três plantas por lote.
[00768] Peso total de vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00769] Proporção do número de vagens por nó no caule principal no conjunto de vagem - calculada na fórmula XVII, média de três plantas por lote.
[00770] Fórmula XVII: Número total de vagens no caule principal /Número total de nós no caule principal, média de três plantas por lote.
[00771] Proporção do número total de sementes no caule principal para o número de sementes nos ramos laterais - calculada na fórmula XVIII, média de três plantas por lote.
[00772] Fórmula XVIII: Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem/ Número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.
[00773] Peso total das vagens por planta no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais e caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.
[00774] Dias até 50% da floração [dias] - número de dias até 50% da floração para cada lote.
[00775] Dias até 100% da floração [dias] - número de dias até 100% da floração para cada lote.
[00776] Maturidade [dias] - medida como 95% das vagens em um lote amadureceram (se tornaram 100% marrons). Queda atrasada da folha e caules verdes não são considerados na atribuição de maturidade. Os testes são observados 3 dias por semana, dia sim, dia não, para maturidade. A data da maturidade, isto é, a data que 95% das vagens alcançaram a cor final. A maturidade é expressa em dias após 31 de agosto [de acordo com a definição aceita de maturidade nos Estados Unidos, Lista de Descritores para SOJA, http://www (ponto) ars-grin (ponto) gov/cgi-bin/npgs/html/desclist (ponto) pl? 51].
[00777] Qualidade da Semente (classificada 1-51 medida na colheita, uma estimativa visual com base em várias centenas de sementes. O parâmetro é classificado de acordo com as pontuações a seguir, considerando a quantidade e o grau de enrugamento, revestimento com defeito (rachaduras), sem esverdeado e mofado ou outro pigmento. Classificação é 1-muito bom, 2- bom, 3-razoável, 4-pobre, 5-muito pobre.
[00778] Depósito [classificado 1-5] - é classificada na maturidade por lote de acordo com as pontuações a seguir: 1-maioria das plantas em um lote é erigido, 2-todas as plantas inclinando-se ligeiramente ou algumas plantas para baixo, 3-todas as plantas inclinando-se moderadamente, ou 25% a 50% para baixo, 4-todas as plantas inclinando-se consideravelmente, ou 50% a 80% para baixo, 5-a maioria das plantas para planta. Nota: pontuação intermediária tal como 1,5 é aceitável.
[00779] Tamanho da Semente [g] - peso de 1000 sementes por lote normalizado para 13% de umidade, medido na colheita.
[00780] Peso total das sementes por planta (g/planta] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado) como peso em gramas de sementes limpas ajustadas para 13% de umidade e divididas pelo número total de plantas em duas fileiras internas de um lote podado.
[00781] Produção na colheita [alqueire/hectare] calculada na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado) como peso em gramas de sementes limpas, ajustadas para 13% de umidade, e, então, expressas como alqueires por acre.
[00782] Média de sementes do ramo lateral por vagem [número] - Calcular o número de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem e dividir pelo número do número total de vagens com sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.
[00783] Média de sementes do caule principal por vagem [número] - Calcular o número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem e dividir pelo número do número total de vagens com sementes no caule principal no conjunto de vagem.
[00784] Comprimento médio do entrenó do caule principal (cm] - Calcular a altura da planta no conjunto de vagem e dividir pelo número total de nós no caule principal no conjunto de vagem.
[00785] Número total de vargens com sementes no caule principal [número] - contar todas as vagens contendo sementes no caule principal nos conjuntos de vagens.
[00786] Número total de vagens com sementes nos ramos laterais [número] - contar todas as vagens contendo sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.
[00787] Número total de vagens por planta no conjunto de vagem [número] - contar as vagens no caule principal e ramos laterais no conjunto de vagem.
[00788] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 48, abaixo. Tabela 48
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[00789] Tabela 48: São fornecidos os parâmetros correlacionados à soja. "DW" = peso seco;
Resultados experimentais
[00790] Doze acessos diferentes de Soja foram cultivados e caracterizados por 33 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 49-50 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 49 Parâmetros medidos nas variedades da Soja (linhas 1-6)
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[00791] Tabela 49: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de soja (linha) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 50 Parâmetros medidos nas variedades da Soja (linhas 7-12)
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[00792] Tabela 50: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de soja (linha) em condições de crescimento normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 51 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico da manutenção de desempenho em condições normais através das variedades de soja
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[00793] Tabela 51: Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. "ID. de Corr. "- ID de Conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados da Tabela acima. "Conjunto de Exp." - Conjunto de Expressão. "R" = coeficiente de correlação de Pearson; "P" = valor p
EXEMPLO 11 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE PODEM SER UTILIZADOS PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO E OUTROS TRAÇOS AGRÍCOLAS VANTAJOSOS.
[00794] No geral, 99 genes (ID SEQ. N°: 1-219 para polinucleotídeos e ID SEQ. N°:: 220-366 para polipeptídeos) foram identificados como tendo um grande impacto na produção de planta, taxa de crescimento, vigor, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante quando a expressão respectiva é aumentada em plantas. Os genes identificados, seus polinucleotídeos curados e sequências de polipeptídeos, bem como suas sequências atualizadas, de acordo com a base de dados GenBank, são resumidos na Tabela 52, abaixo. Tabela 52 Genes identificados para aumentar a produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de água e eficiência no uso de fertilizante de uma planta
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[00795] Tabela 52: São fornecidos os genes identificados (genes principais ID SEQ. N° 1-99, polipeptídeos principais: ID SEQ. N°s: 220-318), suas notas, organismos e identificadores de sequência de polinucleotídeo e polipeptídeo. Também são fornecidas as variantes de polinucleotídeos ID SEQ. N°: 100124 e seus polipeptídeos codificados e os polinucleotídeos clonados ID SEQ. N°:: 125-219 e seus polipeptídeos codificados. "polin." = polinucleotídeo; "polip." = polipeptídeo.
EXEMPLO 12 IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM A PRODUÇÃO, PRODUÇÃO DA FIBRA, QUALIDADE DA FIBRA, TAXA DE CRESCIMENTO, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, VIGOR, ABST, E/OU NUE DE UMA PLANTA.
[00796] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações do genoma completo. Os ortólogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização, e os últimos são relacionados por eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos decorrentes de eventos de duplicação antiga tendem a ter divergido na função enquanto verdadeiros ortólogos são mais propensos a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo.
[00797] Para investigação e identificação adicionais de ortólogos putativos dos genes que afetam a produção da planta, a produção de óleo, o teor de óleo, a produção de sementes, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a produção de fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estrese abiótico, e a eficiência do uso de fertilizantes, eficiência no uso de genes (FUE) e/ou nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas usando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica [BLAST 1 Basic Local Alignment Search Tool]. Sequências suficientemente semelhantes fora tentativamente agrupadas. Estes ortólogos putativos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como uma representação das relações evolutivas entre os táxons biológicos. Grupos ortólogos putativos foram analisados quanto a sua concordância com o filograma e, em casos de divergências, esses grupos ortólogos foram divididos adequadamente.
[00798] Dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos personalizadas, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão semelhante, através do desenvolvimento com regulação para cima na fase específica, como na fase de estocagem de grãos) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão similar em seus órgãos com regulação para cima em órgãos específicos, como a semente). As anotações de todos os ESTs agrupadas a um gene foram analisadas estatisticamente por comparação da sua frequência no conjunto em relação a sua abundância na base de dados, permitindo a estrutura de um perfil de expressão numérica e gráfica de tal gene, o que é denominado "digital expression". A lógica de utilizar estes dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e expressão fenotípica baseia-se na suposição de que os verdadeiros ortólogos tendem a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo. Estes métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações sobre as semelhanças funcionais entre dois genes homólogos, semelhanças no nível da sequência de aminoácidos - idênticos nos domínios proteicos e similaridade em perfis de expressão.
[00799] A pesquisa e a identificação de genes homólogos envolve o rastreio de informação de sequência disponível, por exemplo, em bases de dados públicas, tais como a Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ 1 DNA Database of Japan), Genbank, e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório de Biologia Nuclear (EMBL 1
[00800] Euroervilhan Molecular Biology Laboratory) ou suas versões ou a base de dados MIPS. Um número de diferentes algoritmos de pesquisa têm sido desenvolvidos, incluindo, mas não se limitando ao conjunto de programas referidos como programas de BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas projetadas para consultas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e a comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística de similaridade entre as duas sequências. O software para a realização de análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Outros destes tipos de software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. A GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimizam o número de lacunas.
[00801] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família e genes. A análise de uma família de gene pode ser realizada usando a análise de similaridade de sequência. Para realizar esta análise pode-se usar programas padrão para alinhamentos múltiplos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de Neighbor-Joining das proteínas homólogas dos genes nesta invenção pode ser usada para fornecer uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada usando um programa de alinhamento conforme descrito abaixo. Espera-se que outras plantas tenham um gene funcional semelhante (ortólogo) ou de uma família de genes semelhantes e tais genes fornecerão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção Exemplos de outras plantas estão incluídos aqui, mas não se limitando a, cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Milho (Zea mays), Algodão (Gossypium), Canola (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum) e Trigo (Triticum aestivum).
[00802] As análises acima mencionadas para uma homologia de sequência podem ser realizadas em uma sequência de comprimento total, mas podem também ser baseadas em uma comparação de certas regiões tais como os domínios conservados. A identificação de tais domínios, também seria boa dentro do âmbito do especialista na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível para computador dos ácidos nucleicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações publicamente disponíveis sobre os domínios de proteínas, motivos conservados e caixas Esta informação está disponível na base de dados PRODOM (http://www (ponto) biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (ponto) html), PIR (http://pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/) ou Pfam (http://www (ponto) sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequências desenvolvidos para pesquisa de motivo podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionados acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não estão limitados a, MEME, SIGNALSCAN, e GENESCAN.
[00803] Um especialista na técnica pode utilizar as sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídios, proteínas e enzimas que têm substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções em relação à proteína não modificada em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante à proteína não modificada a partir da qual são derivadas. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (modificações conservadoras, tais como hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar uma estrutura ou quebrar estruturas helicoidais ou estruturas de 3 folhas). Tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Os homólogos de um aminoácido englobam ácidos nucleicos com substituição de nucleotídeo, deleções e/ou inserções em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante ao ácido nucleico não modificado a partir da qual são derivadas.
[00804] Os polinucleotídeos e polipeptídeos com uma homologia significativa aos genes identificados descritos na Tabela 1 (Exemplo 1, acima) foram identificados a partir das bases de dados, utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para a primeira fase, e a agulha (pacote EMBOSS) ou alinhamento FRAME+ algoritmo para a segunda fase. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi usada (estabelecendo o parâmetro "-F E").
[00805] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica genética principal.
[00806] Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou de nucleotídeos foram utilizadas nesta aplicação.
1. Entre duas proteínas (após o filtro blastp):
[00807] Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.
2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (após o filtro rblastn):
[00808] Aplicativo GenCore 6.0 OneModel, utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal -q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.
[00809] As sequências de polipeptídeos de consulta foram as ID SEQ N° 220-366 e 9701-9708 (que são codificadas pelos polinucleotídeos da ID SEQ N° 1-219 e 9688-9693, apresentadas na Tabela 52, acima), e as sequências ortólogas e homólogas identificadas tendo, pelo menos, 80% da identidade da sequência global são fornecidas na Tabela 53, abaixo. Espera-se que estes genes homólogos aumentem a produção da planta, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ ou NUE de uma planta. Tabela 53 Homólogos dos genes/polipeptideos identificados para aumentar a produção, produção da fibra, qualidade da fibra, taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso da água e/ou eficiência no uso de fertilizantes de uma planta
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[00810] Tabela 53: São fornecidos polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos dos genes para aumentar a produção (p.ex., produção de óleo, produção de sementes, produção e/ou qualidade da fibra), taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso da água e/ou eficiência no uso de fertilizantes de genes de uma planta que são listadas na Tabela 52 acima. A homologia foi calculada como % de identidade sobre as sequências de alinhamento. As sequências de consultas foram as sequências de polinucleotídeos da ID SEQ N°: 1219 e 9688-9693; e polipeptídeos da ID SEQ N°: 220-366 e 9701-9708e as sequências em questão são sequências de proteínas identificadas na base de dados com base na identidade global superior a 80%, com relação às sequências de tradução previstas das sequências de nucleotídeos de consulta ou para as sequências de polipeptídicos. "Nucl." = polinucleotídeo; "polip." = polipeptídeo; "Algor." = algoritmo (utilizado para alinhamento e determinação de sequência do porcentual de homologia); "Hom." - homologia; "iden." - identidade.
[00811] O resultado da abordagem genômica funcional descrita aqui é um conjunto de genes com estimativas elevadas de melhoria da produção e/ou outros traços agrícolas importantes, como a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção e/ou qualidade da fibra, biomassa, taxa de crescimento, tolerância ao estrese abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso da água e eficiência no uso de fertilizantes de uma planta, aumentando sua expressão. Embora cada gene seja estimado para ter seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais de um gene forneça um efeito aditivo ou sinérgico sobre a produção da planta e/ou outras produções de desempenhos agrícolas importantes. Ao alterar a expressão de cada gene descrito aqui, o gene sozinho ou o conjunto de genes aumenta a produção global e/ou outros traços agrícolas importantes e, deste modo, espera-se aumentar a produtividade agrícola.
EXPRESSÃO DA PLANTA.
[00812] Para validar seu papel no aumento da produção, teor de óleo, produção da semente, biomassa, taxa de crescimento, produção da fibra, qualidade da fibra, ABST, NUE e/ou vigor da planta, os genes selecionados foram superexpressos nas plantas, conforme segue.
Estratégia de Clonagem
[00813] Os genes selecionados a partir daqueles listados nos Exemplos 1-12 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta de comprimento total (ORF 1 open reading frame) foi primeiro identificado. No caso de grupos ORF-EST e em alguns casos já publicados, as sequências de mRNA foram analisadas para identificar o quadro de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de planta. Para clonar os cDNAs de comprimento total, transcrição reversa (RT 1 reverse transcription) seguida pela reação de cadeia polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, flores, síliquas ou outros tecidos da planta, crescendo em condições normais e diferentes. O RNA total foi extraído conforme descrito no "MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA" acima. A produção de cDNA e amplificação de PCR foi realizada utilizando protocolos padrão descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Os produtos de PCR são purificados utilizando kit de purificação de PCR (Qiagen). No caso onde a sequência de codificação total não foi Os produtos de RACE foram clonados em vetor de cópia alto seguido pelo sequenciamento ou diretamente sequenciado. A informação do procedimento de RACE foi utilizada para clonagem de ORF de comprimento total dos genes correspondentes.
[00814] No caso do DNA genômico ser clonado, os genes foram amplificados por PCR direto em DNA genômico extraído do tecido da folha utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104).
[00815] Normalmente, 2 conjuntos de iniciadores foram sintetizados para a amplificação de cada gene de um cDNA ou uma sequência genômica; um conjunto externo dos iniciadores e um conjunto interno (iniciadores de PCR aninhados). Quando necessário (p.ex., quando a primeira reação de PCR não resulta em um produto satisfatório para sequenciamento), um iniciador adicional (ou dois) dos iniciadores de PCR aninhados foi utilizado.
[00816] Para facilitar a clonagem das sequências genômicas de cDNAs, uma extensão de 8-12 bp foi adicionado ao 5' de cada iniciador. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local não existe na sequência de cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores diretos e reversos foram projetados, de modo que o cDNA digerido foi inserido na formação do sentido no vetor binário utilizado para transformação.
[00817] Os produtos PCR foram digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc.), de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia alta pUC19 (New England BioLabs Inc], ou em plasmídeos originando desse realizado utilizando um sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 através da digestão com endonucleases de restrição apropriados. Os produtos digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando enzima ligase T4 DNA (Roche, Suíça).
[00818] Os plasmídeos de cópia alta contendo os genes clonados foram digeridos com as endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com os locais projetados nos iniciadores e clonados em vetores binários.
[00819] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas por um fornecedor comercial GeneArt [http://www (ponto) geneart (ponto) com/]. O DNA sintético foi projetado em sílica. Os locais de enzimas de restrição adequadas foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para permitir clonagem posterior no vetor binário pQFNc ou outro vetor binário solicitado a jusante do promotor At6669 (ID SEQ N° 9405). Vetores binários utilizados para clonagem: O plasmídeo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético originando de vetor de plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-4811) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, n° de acesso U12640). pGI (pBXYN) foi similar ao pPI, mas o gene original na coluna vertebral, o gene GUS, é substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (ID SEQ N° 9419) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). pGI foi utilizado no passado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente no controle do (Figura 2), pQFNc (Figura 2) ou pQYN 6669 (Figura 1)] são versões modificadas do vetor pGI no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, assim o gene e seu promotor correspondente estão próximos à borda direita e o gene NPTII está próximo à borda esquerda.
[00820] At6669, a sequência do promotor Arabidopsis thaliana (ID SEQ N° 9405) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante dos genes clonados, seguido pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário das colônias E. coli positivas, conforme descrito acima.
[00821] As colônias foram analisadas por PCR utilizando os iniciadores que cobrem a inserção, que são projetados para abranger o promotor e o gene introduzido. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados. Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são fornecidos na Tabela 54 abaixo. Tabela 54 Genes clonados em plasmídeos com alto número de cópias
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[00822] Tabela 54. "Polin." - Polinucleotídeo; "Polip." - polipeptideo. Para clonagem de cada gene, pelo menos 2 iniciadores foram utilizados: Diretos (Fwd) ou Reversos (Rev). Em alguns casos, 4 iniciadores foram utilizados: Diretos externos (EF 1 external forward), reversos externos (ER 1 external reverse), diretos aninhados (NF 1 nested forward) ou reversos aninhados (NR 1 nested reverse). As sequências dos iniciadores utilizadas para clonagem dos genes são fornecidas na listagem de sequência. Os genes foram clonados a partir do mesmo organismo, conforme identificado na lista de genes fornecida na Tabela 52 acima, exceto para os genes que foram sinteticamente produzidos pela GeneArt.
VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO GENES PUTATIVOS
[00823] Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 13 acima foram utilizados para transformar as células Agrobacterium. Uma estrutura binária adicional foi utilizada como controle negativo, contendo um vetor vazio que carrega o promotor At6669 e o marcador de seleção.
[00824] Para transformação em plantas Arabidopsis, os vetores binários foram introduzidos em células competentes de Agrobacterium tumefaciens GV301, GV303 ou LB4404 (cerca de 109 células/mL), por eletroporação.
[00825] Para transformação em Brachypodium, os vetores binários foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens AGL1.
[00826] A eletroporação foi realizada utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm de cadinhos (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas foram cultivadas em meio líquido LB a 283C por 3 horas, então colocadas sobre ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para cepas Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepa Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28°C por 48 horas. As colônias Abrobacterium, que são desenvolvidas nos meios seletivos, foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores projetados para abranger a sequência inserida no plasmídeo pPI. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados, conforme descrito no Exemplo 13 acima, para verificar se as sequências de nucleotídeo corretas foram devidamente introduzidas nas células Agrobacterium.
EXEMPLO 15 PRODUÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS TRANSGÊNICAS QUE EXPRESSAM OS GENES SELECIONADOS, DE ACORDO COM ALGUMAS APLICAÇÕES DA INVENÇÃO
[00827] var Columbia (plantas To) foram transformadas, de acordo com o procedimento de Imersão Floral [Clough SJ, Bent AF. (1998), Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J.
[00828] 16(6): 735-43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000), Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium- Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Method. Plant Physiol, Julho 2000, Vol. 123, pp. 895-904], com pequenas modificações. Em resumo, as plantas To Arabidopsis thaliana Columbia (Co10) foram semeadas em lotes de 250 ml, preenchidas com mistura de cultivo com base em turfa úmida. Os lotes foram cobertos com folhas de alumínio e uma redoma de plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então, descobertos e incubados em uma câmara de cultivo a 18-24°C em 16/8 horas de ciclos claro/escuro. As plantas To estavam prontas para transformação seis dias antes da antese.
[00829] Colônias únicas de Agrobacterium carregando os vetores binários que alojam os genes de produção foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28t por 48 horas sob agitação vigorosa e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os peletes compreendendo as células Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação contendo meio de cultura de concentração média (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044 pM de benzilamino purina (Sigma); 112 pg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); 5% de sacarose e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada com pH de 5,7.
[00830] A transformação de plantas To foi realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o em uma bandeja de plástico, então coberta com redoma plástica limpa para manter umidade e foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então cobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até as síliquas ficarem marrons e secas. As sementes, então, foram colhidas a partir das plantas e mantidas à temperatura ambiente até a semeadura.
[00831] Para geração de plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, as sementes coletadas das plantas To transgênicas foram esterilizadas na superfície por imersão em 70% de etanol por 1 minuto, seguido por imersão em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície foram totalmente lavadas em água estéril destilada e, então, colocadas nas placas de cultura contendo meio de cultura de concentração média Murashige-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar de planta; 50 mM de canamicina e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4@C por 48 horas, então, transferidas a uma sala de cultivo a 25 por uma semana adicional de incubação. As plantas T1 Arabidopsis vitais foram transferidas para as placas de cultura fresca por outra semana de incubação. Seguindo a incubação, as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e das placas de cultura e plantadas na mistura de cultivo contida em lotes de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa para maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e crescidas para maturidade como as plantas T2 nas
EXEMPLO 16 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS BRACHYPODIUM DISTACHYON COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO
[00832] Semelhante à planta modelo Arabidopsis, a Brachypodium distachyon tem diversas características que a recomendam como planta modelo para estudos genômicos funcionais, especialmente nas gramas. Os traços que o tornam um modelo ideal incluem seu pequeno genoma (-355 Mbp), pequena estatura física, um ciclo de vida curto, e poucos requisitos de crescimento. Brachypodium está relacionada à espécie de grão de cereal principal, porém é entendida como sendo mais intimamente relacionada à Triticeae (trigo, cevada) que outros cereais. Brachypodium, com seus acessos de poliploidia, pode servir como um modelo ideal para esses grãos (cujo tamanho genômico e complexidade são uma grande barreira à melhoria biotecnológica).
[00833] Calos embriogênicos de Brachypodium distachyon foram transformados utilizando o procedimento descrito por Vogel e Hill (2008) (transformação mediada por agrobacterium com alta eficiência de linha pura de Brachypodium distachyon Bd21-3. Plant Cell Rep 27:471-478) e por Vain et al (2008) (transformação mediada por Agrobacterium de Brachypodium distachyon de grama temperada (genótipo Bd21) para mutagênese insercional de T-DNA. Plant Biotechnology J 6: 32:621-30, 1996, que é totalmente incorporado aqui por referência, com algumas pequenas modificações.
[00834] Resumidamente, calos embriogênicos compactos foram derivados de embriões imaturos de acesso Bd21-3 de Brachypodium distachyon, uma linha pura diplóide. Embriões imaturos adequados em forma de sino e com tamanho de -0,3 mm, foram transferidos para placas em meio MIC (de indução de calos) + catálogo: C3036). Um litro (1 L) de meio MIC foi preparado através da adição dos seguintes componentes ao volume final de 1 litro de água (H20): LS+ 4,4 gramas de vitaminas (Duchefa, número do catálogo: L0230); 30 gramas de sacarose (Duchefa, número do catálogo: S0809); 2 gramas de Fitagel (SIGMA, número do catálogo: P8169). Após duas semanas em cultura, os calos embriogênicos foram fragmentados em 4 a 6 pedaços cada, e transferidos para placas em meio MIC com ácido 2,4- diclorofenoxiacético e CuSO4.5H20. Duas semanas depois, os calos foram fragmentados e transferidos para placas novamente (não mais que 25 calos por placa). Em 4 semanas em cultura, os calos estavam prontos para infecção por Agrobacterium.
[00835] Colônias únicas de agrobacterium portando os vetores binários abrigando os genes de produção foram cultivadas em uma placa de meio MGL contendo 50 mg/1 (miligramas por litro) de canamicina, 50 mg/1 de carbenicilina e acetosyringone 200 pM (micromolar) final. Um litro (1 L) de meio MGL foi preparado através da adição dos seguintes componentes ao volume final de 1 litro de água (H20): 2,5 gramas de Extrato de leveduras (HIMEDIA, número do catálogo: RM027), 5 gramas de Triptona (Duchefa, número do catálogo: T1332), 5 gramas de NaCl 5 (BioLab, número do catálogo: 19030591), 204 miligramas de MgSO4x7H2O (SIGMA, número do catálogo: M1880), 5 gramas de D-Manitol (Duchefa, número do catálogo: D0803), 250 miligramas de KH2PO4 (Duchefa, número do catálogo: P0574), 1,2 gramas de ácido glutâmico (Duchefa, número do catálogo: G0707). Após 24 horas a 28@C, a camada de agrobacterium que foi raspada da placa foi ressuspensa em 40 ml de meio MS (contendo acetosyringone 200 &I), e colocada em um agitador a 220 rpm por 45 minutos em uma agrobacterium diluída foi dispensada em cada uma das placas contendo calos embriônicos e incubados por 5 minutos de inoculação em uma capela de fluxo laminar em temperatura ambiente. Então, a suspensão foi completamente removida das placas, os pedaços de calos foram escolhidos em um filtro em uma placa Petri seca, onde eles foram secos por dessecação por vários minutos. Os calos secos foram então transferidos para as placas (25 pedaços por placa) em um filtro húmido com 750 ul de meio MS, onde eles foram co-cultivados com agrobacterium por 2 dias a 25pC no escuro.
[00836] A seleção de calos transformados foi feita em placas contendo 30 ml de meio MIC + ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,5 mg/l) CuSO4.51-120 (0,6 mg/l) + ticarcilina dissódica (400 mg/l) + meio de sulfato de Higromicina (40 mg/l), que foram cultivados por 2 semanas no escuro. Os calos sobreviventes foram então transferidos ao meio fresco, onde eles foram cultivados por 2 semanas adicionais. Quatro semanas após a transformação, os calos foram transferidos a um meio de indução de brotações (MIB) (Linsmaier and Skoog Physiol. Plantarum, 18:100, 1965, que é totalmente incorporado aqui por referência)+ 6-Benzilaminopurina ribosídeo (1 mg/l) + IAA (0,25 mg/l) + CuSO4 (0,6 mg/l) + ácido ascórbico (20 mg/l) + Tic (200 mg/l) + HM (40 mg/l), onde brotações de plantas To começam a regenerar durante 2 semanas a 25® em um fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 horas no escuro. As brotações regeneradas foram transferidas ao meio de maturação que consiste de Nitsch [sais Nitsch e 2,18 g/1 de vitaminas + 15 g/1 de sacarose pH 5,8 + 0,2% de fitagel] +acido Naftaleno Acético (2 mg/1) + Ácido Indol-3-Acético (1 mg/l), onde eles regeneram raízes em 2 a 3 semanas.
[00837] Plantas To transgênicas regeneradas foram cultivadas em a 10C até semeadura. Para a geração de plantas transgênicas T1 e T2 que abrigam os genes transformados, as sementes esterilizadas por superfície foram coletadas das plantas transgênicas To e colocadas em bandejas com mistura de semeadura contendo 0,3 ml/L de seleção BASTA com 60 mg/L de ingrediente ativo DL-Fosfinotricina. As bandejas de semeadura foram incubadas a 40t por 72 horas e, então, transferidas a um ambiente de crescimento a 253C para um adicional de 10-12 dias de incubação. As plantas brachypodium T1 vitais foram transferidas para mistura de crescimento em lotes de validação que foram colocados na estufa, onde elas foram cultivadas para maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram germinadas e cultivadas para maturidade como plantas T2 nas mesmas condições, conforme descrito para plantas T1.
EXEMPLO 17 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS TRITICUM AESTIVUM COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO
[00838] Os calos embriogênicos de Triticum aestivum foram transformados utilizando o procedimento descrito na Patente Americana N° 7238862, que é totalmente incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em resumo, os embriões imaturos do trico cv Bobwhite foram isolados da cariopse imatura (espiguetas de trigo) 12 a 15 dias após a polinação, e cultivadas em meio M7 por 4 a 6 dias. Os embriões sem calos embriogênicos foram selecionados para inoculação por agrobacterium.
[00839] A Agrobacterium é cultivada em meio sólido a 28© por 3 dias e, então, a 230C por 1 dia. A Agrobacterium foi, então, diretamente coletada no meio sólido, diluída com 1/10 meio CM4C [sais basais MS com vitaminas, sacarose, ágar e 30630121-1 (759995)] e usadas para inoculação. Explantes foram incubados com a suspensão de célula da agrobacterium ressuspensa e lavada. A inoculação era realizada normalmente em uma temperatura de 24& - 26C, de cerca de 1 minuto a cerca de 3 horas. Após o período de inoculação, os embriões imaturos inoculados foram colocados em placas com papel filtro Whatman N° 1 húmido com 200 a de água estéril, 20-50 embriões X4/placa. As placas foram colocadas em parafilm e incubadas no escuro, 24-26 por 2-3 dias. Após os 3 dias de co-cultivação, os embriões imaturos pré-cultivados infectados por agrobacterium (PCIE) e os calos embriogênicos foram transferidos para meio CM4C suplementado com 500 mg/L de carbenicilina e cultivados por cerca de sete dias para seleção e regeneração da planta. Esse meio de "atraso" também pode contém glifosato (0,02 mM). Esses explantes de embriões imaturos pré-cultivos infectados formaram calos embriogênicos nesse meio.
[00840] Os explantes foram, então, transferidos ao meio de seleção CM4C com 2mM de glifosato e 500 mg/L de carbenicilina por uma semana no escuro. Todos os calos foram transferidos para o meio MMS0.2C (1 X sais MS e vitaminas, 1,95 g/L MES, 0,2 mg/L 2,4-D, e 40 g/L de maltose, pH 5,6, solidificado por 2 g/L Gelrite; após auto-clavação, adicionando 100 mg/L de ácido ascórbico) suplementado com 0,1 mM de glifosato e 250 mg/L de carbenicilina (primeiro meio de regeneração) para um adicional de duas semanas de seleção com condições de iluminação de cerca de 80 pE. Manchas verdes ou brotações formadas no final desse período de cultura. Todos os calos embriogênicos foram transferidos para o segundo meio de regeneração MMSOC suplementado com 500 mg/L de carbenicilina e 0,02 mM de glifosato. Esses tecidos foram transferidos tecidos de calos embriogênicos a qualquer momento durante o período de cultura. Uma vez que o sistema de raiz foi estabelecido, as plantas foram transferidas para o solo e, subsequentemente, examinadas. Todas as plantas originadas dos mesmos embriões imaturos pré-cultivados infectados ou calos foram consideradas como "irmãs" do mesmo evento transgênico.
EXEMPLO 18 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA (Ensaios GH -SM).
[00841] Ensaio 1: Biomassa da planta para produção de semente e taxa de crescimento da planta em condições normais da estufa Esse ensaio acompanha o plantio e produção de semente, a formação de biomassa e o cultivo das plantas da área de roseta cultivadas na estufa nas condições de cultivo não limitantes de nitrogênio. As sementes transgênicas Arabidopsis foram semeadas em meio ágar suplementado com meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram então transplantadas para 1,7 bandeja preenchida com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um solução contendo nitrogênio inorgânico a 6 mM na forma de KNO3 com KH2PO4 a 1 mM, MgSO4 a 1 mM, CaC12 a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes ficarem maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa da planta restante (o tecido acima do solo) também foi colhida, e pesada imediatamente ou seguindo a secagem no forno a 50°C por 24 horas.
[00842] Cada estrutura foi validada em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, floração, produção de semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (HI - produção de semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem gene nenhum, no mesmo promotor foram utilizadas como controle.
[00843] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.
[00844] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que inclui 4 unidades de luz (lâmpadas de 4 x 150 Watts) foi utilizado para capturar as imagens das amostras de planta.
[00845] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do 1° dia após o transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar as imagens das plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.
[00846] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de estatística análise (instituto SAS).
[00847] Análise da Folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram e são calculados, incluindo número da folha, área de roseta, diâmetro da roseta, e área foliar da lâmina.
[00848] Taxa de crescimento vegetal: a (GR) do número de folha [Fórmula VI (descrita acima)], área de roseta [Fórmula XIX abaixo], cobertura de lote (Fórmula XX abaixo) e índice de colheita [Fórmula IV acima] foi calculada com as fórmulas indicadas. Fórmula XIX: Taxa de crescimento da área da roseta = coeficiente de regressão da área da roseta ao longo do tempo.
[00849] Fórmula XX: GR da cobertura de lote Taxa de crescimento da cobertura de lote = Coeficiente de regressão da cobertura de lote ao longo do tempo.
[00850] Fórmula XXIV: Taxa de crescimento (GR) do diâmetro da roseta - Coeficiente de regressão do diâmetro da roseta ao longo do tempo.
[00851] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00852] 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada lote.
[00853] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo raízes) após secar a 30 em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (g);
[00854] Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g).
[00855] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento, todas as sementes de cada lote foram coletadas. As sementes de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n- Hexano (Cat N° 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio a 50 °C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00856] Análise de comprimento de Síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 siliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As siliquas escolhidas foram de cor verde-amarela e foram coletadas a partir das partes inferiores de um caule de planta cultivado. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua. transformação independente testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando Teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).
Resultados experimentais:
[00857] As Tabelas 55-59 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estruturas de genes utilizando os Ensaios GH - SM.
[00858] Os genes listados nas Tabelas 55-59 melhoraram o desempenho da planta quando cultivada condições normais. Esses genes produziram plantas grandes com uma área fotossintética grande, número de folha, biomassa (peso seco, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura do lote, área da lâmina foliar), taxa de crescimento (por ex., do número da folha, cobertura do lote e diâmetro de roseta), área relativa da lâmina, produção (por ex., índice de colheita, produção de semente, peso de 1000 sementes), bem como emergência de inflorescência. Os genes foram clonados na regulação de um promotor constitutivo At6669 (ID SEQ. N° 9405). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 55 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00859] Tabela 55. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 56 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00860] Tabela 56. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 57 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotorAt6669
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[00861] Tabela 57. "CONT." - Controle; "méd.- - Média; Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 58 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00862] Tabela 58. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = -% de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 59 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00863] Tabela 59. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.
EXEMPLO 19 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA ATÉ PENEIRAÇÃO (Ensaios GH SB)
[00864] Ensaio 2: Melhora do desempenho da planta medida até o estágio de penetração: biomassa da planta e taxa de crescimento da planta em condições normais da estufa (Ensaios GH -SB) - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e a área de roseta de crescimento de plantas cultivadas na estufa em condições normais de cultivo. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meio transplantadas para bandejas de 1,7 litro preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um a solução contendo nitrogênio inorgânico a 6 mM na forma de KNO3 com KlfgW,Ia 1 mM, MgSO4 a 1 mM CaC12 a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até o estágio de peneiração. A biomassa da planta (o tecido acima da terra) foi pesada indiretamente após colher a roseta (peso fresco da planta (FWU). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 50 ãe por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [DU]).
[00865] Cada estrutura foi validada em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformando por um vetor vazio carregando o promotor 35S e o marcador selecionável foi utilizado como controle.
[00866] As plantas foram analisadas por seu tamanho total, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado para controlar as plantas cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor foram utilizadas como controle.
[00867] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.
[00868] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em um câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de comprimento focal de 55 rala (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui 4 O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias começando do dia 1 após transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas eram de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.
[00869] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/l. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JREG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).
[00870] Análise da Folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram e são calculados, incluindo o número da folha, área de roseta, diâmetro da roseta, e área da lâmina foliar.
[00871] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativa (GR) do número de folha (Fórmula IX, descrita acima), área da roseta (Fórmula XIX descrita acima) e cobertura de lote (Fórmula XX, descrita abaixo) foi calculada utilizando as fórmulas indicadas. para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50 Ot em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes da prensagem para determinar o peso seco da planta
[00872] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).
Resultados Experimentais:
[00873] As Tabelas 60-62 resumem os fenótipos observados das plantas transgénicas expressando as estruturas de genes utilizando os Ensaios GH -SB.
[00874] Os genes listados nas Tabelas 60-62 melhoraram o desempenho da planta quando cultivados em condições normais. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética maior, biomassa (peso fresco, peso seco, número de folhas, diâmetro da roseta e área de roseta) e taxa de crescimento. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor At6669 constitutivo (ID SEQ. N° 9405). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 60 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00875] Tabela 60. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 61 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00876] Tabela 61. "CONT.' - Controle; "Méd." - Média; "% Aum.' = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 62 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00877] Tabela 62. "CONT." - Controle; "méd.- - Média; "% Aum." = i. de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.
UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO [PLANTAS T2 E T1 DE CULTURA DE TECIDO E ENSAIOS TC -T2 E TC-T1]
[00878] Sementes esterilizadas de superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio Múrashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8 de planta áqar como agente de solidificação] na presença de Canamicina (utilizada como um agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4 ãe e então cultivadas a 25 Ot em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Nesse ponto do tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas Amara placas contendo meio de MS (N a 15 mM). Para experimentos realizados nas linhas T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transqênico, e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção pelo menos quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Para experimentos realizados nas linhas 2!/, cada placa continha 5 mudas de 5 eventos transgénicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) foram plantadas. No total, para linhas T1, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (transformadas com um vetor vazio contendo o marcador de seleção ou gene repórter GUS sob o controle do mesmo promotor) utilizada no mesmo experimento.
[00879] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades encerrados em placas de áqar.
[00880] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 - 4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (vide, p.ex., as imagens nas Figs. 3A-F). Um sistema de análise imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/1. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Meqa Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photoqraphic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).
[00881] Análise das mudas - Utilizando a análise digital, os dados das mudas foram calculados, incluindo área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz.
[00882] A taxa de crescimento para os vários parâmetros de muda foi calculada de acordo com as fórmulas XXI (área foliar GR, abaixo), XXII (cobertura de raiz GR, descrita abaixo) e XXIII (comprimento da raiz GR, abaixo). Fórmula XXI: Taxa de crescimento da área foliar = Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do tempo. Fórmula XXII: Taxa de crescimento da cobertura de raiz = Coeficiente de regressão da cobertura de raiz ao longo do tempo
[00883] Fórmula XXIII: No final do experimento, os brotos foram removidos do meio e pesados para a determinação do peso fresco da planta. Os brotos foram então secados por 24 horas a 600, e pesados novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. Os pesos fresco e seco são fornecidos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada comparando a cobertura da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotos sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta em condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido em acúmulo de biomassa, em condições ideais, foi determinado comparando o peso seco e fresco das plantas e daquele das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS no mesmo promotor). A partir de cada estrutura criada, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em replicados.
[00884] Análises Estatísticas - Para identificar os genes que conferem vigor da planta significativamente melhorada ou arquitetura de raiz ampliada, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento do gene sobre um controle, os dados foram analisados através do teste t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados se p S. 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).
Resultados Experimentais: os Ensaios TC -T2.
[00885] Os genes apresentados na Tabela 63 mostraram uma melhora significativa, uma vez que produziram uma biomassa de planta maior (peso seco e fresco da planta) em geração T2 quando cultivados em condições normais de cultivo, comparado às plantas de controle. Os genes foram clonados na regulação de um promotor constitutivo (At6669, ID SEQ. N' 9105).
[00886] A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Os resultados obtidos nesses experimentos secundários também foram significativamente positivos. Tabela 63 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00887] Tabela 63. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "-% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.
[00888] Os genes apresentados nas Tabelas 64-65 mostram uma melhora significativa no desempenho da planta, uma vez que eles produziram uma biomassa de folha maior (área foliar) e biomassa de raiz (comprimento de raiz e cobertura da raiz) (Tabela 64) e uma taxa de crescimento maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 65) quando cultivados condições normais de cultivo, comparado às plantas de controle. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem biomassa de folha maior têm melhor habilidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados na regulação de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. O evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 64 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00889] Tabela 64. "CONT." - Controle; "Méd.' - Média; "% Aum.' = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 65 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor
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[00890] Tabela 65. "CONT." - Controle; "méd." - Média; "% Aum.' = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.
Resultados das plantas T1
[00891] As Tabelas 66-68 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estrututras de gene utilizando os Ensaios TC - Ti. desenvolvimento da raiz, uma vez que exibiram um aumento de biomassa (peso seco e fresco) (Tabela 66), produziram uma biomassa de raiz e folha maior (área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) (Tabela 67) e uma taxa de crescimento maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 68) quando cultivados em condições normais de cultivo, comparado às plantas de controle. As plantas que produzem uma biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver a quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem a biomassa da folha maior têm melhor habilidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669; ID SEQ. N° 9405). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. O evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 66 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor
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[00892] Tabela 66. “CONT”. - Controle; “Mad.”- - Média; “& Awm.” Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00893] Tabela 67. "CONT." - Controle; %Méd." - Média; "% Aum.' = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Tabela 68 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00894] Tabela 67. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01.
[00895] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, ela destina-se a abranger todas essas alternativas, modificações e variações que recaem no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.
[00896] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo estão incorporados em sua totalidade por referência no referido relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente pedido de patente não presente invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (15)

1. Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de semente e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta, o método sendo caracterizado por superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido pela: (i) SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, (ii) SEQ ID NO: 65, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou (iii) SEQ ID NO: 5586, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 9363, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 9363, aumentando assim a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de semente e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio da planta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido por: (i) SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou (ii) SEQ ID NO: 65, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NOs: 187, 65 e 5586.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 187 e 65.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor heterólogo não nativamente associado com o referido polinucleotídeo.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta é trigo.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido promotor heterólogo é um promotor constitutivo.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido promotor compreende a sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9811, 9806, 9807, 9804, 9805, 9812, 9813, 9809, 9810, 9406, 9409, 9407, 9408, 9797, 9418, 9799, 9800, 9801, 9808 e 9803.
10. Construção de ácido nucleico isolada caracterizada por um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos como definida pela: (i) SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, (ii) SEQ ID NO: 65, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou (iii) SEQ ID NO: 5586, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 9363, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 9363, e um promotor heterólogo não associado nativamente ao referido polinucleotídeo para direcionar a transcrição da referida sequência de ácidos nucleicos em uma célula vegetal.
11. Construção de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é conforme estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou (ii) SEQ ID NO: 65, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 284.
12. Construção de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 187, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356, ou sequências degeneradas da mesma que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 356.
13. Construção de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 187, 65 e 5586.
14. Construção de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 187 e 65.
15. Construção de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o referido promotor tem a sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9811, 9806, 9807, 9804, 9805, 9812, 9813, 9809, 9810, 9406 , 9409, 9407, 9408, 9797, 9418, 9799, 9800, 9801, 9808 e 9803.
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