CN115956503B - 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大别山冬青细胞悬浮系及其培养方法和应用，属于林木细胞工程领域。本发明利用大别山冬青胚性愈伤组织建立细胞悬浮系，然后进行体细胞胚诱导培养、体细胞胚的萌发和再生植株培养。本发明能有效解决现有固体诱导体胚发生和植株再生途径中愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，可将体胚发生频率最高提高20倍以上，很好解决了前期建立的大别山冬青体胚发生体系不完善而引起的体胚发生率低的问题，节约了时间和成本，为冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、高频同步的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系和工厂化育苗提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于林木细胞工程领域，更具体地说，涉及一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法。
背景技术
大别山冬青(Ilex dabieshanensis K.Yao&M.B.Deng)为冬青科冬青属常绿阔叶乔木，原产安徽、湖北等大别山地区及江西等地，1987年由江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)植物分类专家姚淦和邓懋彬发现并定名。大别山冬青叶色青翠，果实红艳，经冬不落，耐修剪，适应性强，叶片既是制作苦丁茶保健饮料的原料，还具消炎、降脂等药用保健功效，木材材质优良，可作家具贴面板等，是兼具观叶、观花、观果的优良园林绿化珍贵树种。同时，该树种具有极高观赏价值、茶用价值、药用价值的同时，还具有生长速度快，抗污染、防火性能突出，耐干旱瘠薄，病虫害少等独特的生态利用价值，是珍贵的特色经济树种。
目前大别山冬青大规模繁育主要采用播种和扦插方式，但由于其种子具有综合性休眠特征，一般发芽需2年以上时间，且发芽率低。扦插繁殖虽获得了比较稳定的技术体系，但是扦插繁殖受季节性限制很大，每年仅能在固定一段时间内进行扦插，不足以短期满足苗木市场的巨大需求。因此，有必要研究大别山冬青优良种质(品系)资源持续稳定，规模化无性扩繁技术。
植物细胞悬浮培养技术是重要的细胞离体培养技术，是指将植物细胞或小的细胞团悬浮于液体培养基中，并使细胞保持在良好分散状态下进行培养的技术。由于其分散性好，细胞或细胞团大小均匀，生长迅速，细胞状态可以相对保持一致等，与固体培养相比，植物悬浮培养能更全面地与营养物质相混合，能提供大量形态较均一的植物细胞，细胞增殖的速度比愈伤组织更快，在建立植物胚性材料的悬浮系的基础上，实现植株再生具有更高的繁殖效率，适宜大规模培养和工厂化生产，被广泛用于遗传学、生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及分子生物学等多个领域的研究。
本研究申请者前期利用固体培养基培养大别山冬青未成熟胚成功诱导了体细胞胚并实现了植株再生(一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，专利号：ZL202011472139.8)，但固体培养中存在胚性愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，影响了后续繁育及遗传改良的进程。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，包括以下步骤：
1)从大别山冬青未成熟果实中取出发育至子叶胚阶段的未成熟胚；
2)将未成熟子叶胚接种至固体诱导培养基中，诱导培养为胚性愈伤组织；
3)将胚性愈伤组织转入液体增殖培养基中，形成液体悬浮细胞系并进行增殖培养；
4)将步骤3)获得的悬浮细胞系转入预处理液体培养基中预培养处理；
5)将预处理的悬浮细胞系转移到体胚成熟固体培养基中培养产生成熟的子叶胚；
6)将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中培养萌发，直至长成完整的再生植株。
进一步地，步骤1)中，所述大别山冬青未成熟果实为自由授粉后5-6个月的果实。
进一步地，步骤2)中，固体诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2,4-D 0.5～2.0mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
进一步地，所述改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L。
进一步地，步骤3)中，胚性愈伤组织与液体培养基的比列为1:7-10(w/v)，液体增殖培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2,4-D 1.0～3.0mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
进一步地，步骤4)中，悬浮细胞与液体培养基的比列为1:7-10(v/v),液体预处理培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2～0.5mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+ZT1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L。
进一步地，步骤5)中，体胚成熟固体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+ABA 2.0～5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
进一步地，步骤6)中，体胚发育基本培养基的配方为：改良MS培养基+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L；
进一步地，步骤1)-5)中培养条件为，控温23～25℃，暗培养，其中步骤4和5中悬浮培养时，摇床转速为110-125转/min。步骤6中培养条件为控温23～25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明采用大别山冬青未成熟子叶胚诱导出的胚性愈伤组织，然后利用该胚性愈伤组织建立了细胞悬浮系，通过该大别山冬青胚性悬浮系进行体细胞胚诱导培养、体细胞胚的萌发和再生植株培养，可将体胚发生频率最高提高20倍以上，有效改善了现有固体诱导体胚发生和植株再生途径中愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，节约了时间和成本，为冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、高频同步的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系和工厂化育苗提供了技术支撑。
附图说明
图1为大别山冬青胚性愈伤组织图；
图2为悬浮培养1周的胚性细胞悬浮系图；
图3为预处理悬浮系转入体胚成熟固体培养基20天图；
图4为固体培养基诱导出胚率与液体悬浮系诱导出胚率比较图；
图5为体胚萌发成完整植株图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L。
实施例1
一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，步骤如下：
1、大别山冬青未成熟合子胚的准备
每年9月中旬采集一次大别山冬青优良单株上自由授粉约5个月后的果实(完全成熟需9-10个月)，迅速置于4℃条件下冷藏保存。取出果实，然后用力揉搓去掉果皮和果肉，挤出内部的小核果，然后在流水下冲洗3-5遍，不饱满核果会漂浮于水面，沉入水下为发育良好的核果。取发育良好的核果先经过75％乙醇浸泡60秒，然后用2.5％次氯酸钠溶液灭菌15-18分钟，最后用无菌水冲洗3遍，随后在无菌条件下中，在解剖镜下用无菌手术刀和镊子件下剥掉核果外面的硬质种皮，取出未成熟合子胚。
2、胚性愈伤组织的诱导
胚性愈伤组织起始诱导阶段基本培养基采用改良Murashige and Skoog(MS)培养基。在无菌条件下将未成熟合子胚接种至固体诱导培养基中，每培养皿接种10粒。暗培养，控温23℃，25天继代一次，经过2-3次继代后可诱导出胚性愈伤组织。20天左右即可诱导出愈伤组织(图1)，愈伤组织诱导率达100％。
诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L，pH调节为5.6-5.8。
3、悬浮培养建立
在无菌条件下，取步骤2获得的胚性愈伤组织4-6g放入250mL三角瓶中，用镊子轻轻压碎，以1:7(w/v)比例加入液体增殖培养基，暗培养，控温23-25℃，摇床转速为110-125转/min，每7天继代一次(图2)。
液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 0.8g/L+Vc10mg/L+蔗糖30g/L。
4、悬浮系细胞预处理
2周后将步骤3获得的悬浮细胞系倒入量筒中，待悬浮系细胞沉淀到底部后倒去上层液体培养基，保留下部约5mL悬浮细胞系，倒入250mL三角烧瓶中，然后加入7倍体积的预处理液体培养基，暗培养，控温23-25℃，摇床转速为110-125转/min，预培养处理3天。
液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
预处理目的是将胚性愈伤组织发育状态往体胚形成方向诱导。实验表明，不经过该预处理，下一步体胚成熟培养中基本不能进行体胚发生。
5、体胚成熟培养
将预处理的悬浮细胞系用5mL移液器转移到体胚成熟固体培养基表面滤纸上，每皿涂2mL预处理后悬浮细胞系，暗培养，控温23-25℃，培养25天至体胚发育成熟(图3)，经统计，每皿成熟体胚发生个数平均达到148个，远高于通过固体诱导培养成熟体胚的效率(图4)。
体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 2.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu 1g/L+Vc10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
6、体胚萌发
将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中，控温23-25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h，直至萌发长成完整的再生植株(图5)。
体胚萌发固体培养基为：改良MS培养基+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
实施例2
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率95％。
步骤3中按照1:9(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:9(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+ZT1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 3.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生个数平均132个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
实施例3
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率98％。
步骤3中按照1:10(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 3.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:10(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生平均个数112个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
实施例4
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率达98％。
步骤3中按照1:10(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:10(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生平均个数88个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
Claims (5)
1.一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从大别山冬青未成熟果实中取出发育至子叶胚阶段的未成熟胚；
2）将未成熟子叶胚接种至固体诱导培养基中，诱导培养为胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织转入液体增殖培养基中，形成液体悬浮细胞系并进行增殖培养；
4）将步骤3）获得的悬浮细胞系转入预处理液体培养基中预培养处理；
5）将预处理的悬浮细胞系转移到体胚成熟固体培养基中培养产生成熟的子叶胚；
6）将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中培养萌发，长成再生植株；
其中，所述改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L；
其中，步骤3）中，胚性愈伤组织与液体增殖培养基的w/v比例为1:7-10，液体增殖培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2, 4-D 1.0~3.0 mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L+ CH 0.8g/L +Vc 10mg/L+蔗糖30 g/L；
其中，步骤4）中，悬浮细胞与预处理液体培养基的v/v比例为1:7-10，预处理液体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2, 4-D 0.2~0.5mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L + ZT 1.0mg/L +CH 0.8g/L +Vc 10mg/L+蔗糖50 g/L；
其中，步骤5）中，体胚成熟固体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+ABA 2.0~5.0 mg/L+LH 0. 5g/L+ Glu 0.5g/L + Vc 10mg/L+蔗糖50 g/L+水晶洋菜3g/L。
2.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤1）中，所述大别山冬青未成熟果实为自由授粉后5-6个月的果实。
3.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤2）中，固体诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2, 4-D 0.5~2.0 mg/L+6-BA 0.2~0.5mg/L+ CH 0.6g/L +Vc 10mg/L+蔗糖30 g/L+水晶洋菜3g/L。
4.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤6）中，改良MS基本培养基的配方为：改良MS培养基+Vc 10 mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
5.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，步骤1）-5）中培养条件为，控温23~25℃，暗培养，其中步骤4）和5）中悬浮培养时，摇床转速为110-125转/min；步骤6）中培养条件为控温23~25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h。
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