CN115956503B - 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 - Google Patents
一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115956503B CN115956503B CN202211501864.2A CN202211501864A CN115956503B CN 115956503 B CN115956503 B CN 115956503B CN 202211501864 A CN202211501864 A CN 202211501864A CN 115956503 B CN115956503 B CN 115956503B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- culture
- medium
- embryo
- embryogenesis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 27
- 235000008706 Ilex latifolia Nutrition 0.000 title claims abstract description 25
- 244000078118 Ilex latifolia Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims description 29
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims description 11
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241000209035 Ilex Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 10
- 235000003325 Ilex Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 68
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 27
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 27
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 19
- 235000017879 Nasturtium officinale Nutrition 0.000 claims description 18
- 240000005407 Nasturtium officinale Species 0.000 claims description 18
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 15
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 11
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 10
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 claims description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 abstract description 15
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 235000021038 drupes Nutrition 0.000 description 5
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001110383 Ilex dabieshanensis Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- AVWRKZWQTYIKIY-UHFFFAOYSA-N urea-1-carboxylic acid Chemical compound NC(=O)NC(O)=O AVWRKZWQTYIKIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 vc10mg/L Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/40—Afforestation or reforestation
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种大别山冬青细胞悬浮系及其培养方法和应用，属于林木细胞工程领域。本发明利用大别山冬青胚性愈伤组织建立细胞悬浮系，然后进行体细胞胚诱导培养、体细胞胚的萌发和再生植株培养。本发明能有效解决现有固体诱导体胚发生和植株再生途径中愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，可将体胚发生频率最高提高20倍以上，很好解决了前期建立的大别山冬青体胚发生体系不完善而引起的体胚发生率低的问题，节约了时间和成本，为冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、高频同步的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系和工厂化育苗提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于林木细胞工程领域，更具体地说，涉及一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法。
背景技术
大别山冬青(Ilex dabieshanensis K.Yao&M.B.Deng)为冬青科冬青属常绿阔叶乔木，原产安徽、湖北等大别山地区及江西等地，1987年由江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)植物分类专家姚淦和邓懋彬发现并定名。大别山冬青叶色青翠，果实红艳，经冬不落，耐修剪，适应性强，叶片既是制作苦丁茶保健饮料的原料，还具消炎、降脂等药用保健功效，木材材质优良，可作家具贴面板等，是兼具观叶、观花、观果的优良园林绿化珍贵树种。同时，该树种具有极高观赏价值、茶用价值、药用价值的同时，还具有生长速度快，抗污染、防火性能突出，耐干旱瘠薄，病虫害少等独特的生态利用价值，是珍贵的特色经济树种。
目前大别山冬青大规模繁育主要采用播种和扦插方式，但由于其种子具有综合性休眠特征，一般发芽需2年以上时间，且发芽率低。扦插繁殖虽获得了比较稳定的技术体系，但是扦插繁殖受季节性限制很大，每年仅能在固定一段时间内进行扦插，不足以短期满足苗木市场的巨大需求。因此，有必要研究大别山冬青优良种质(品系)资源持续稳定，规模化无性扩繁技术。
植物细胞悬浮培养技术是重要的细胞离体培养技术，是指将植物细胞或小的细胞团悬浮于液体培养基中，并使细胞保持在良好分散状态下进行培养的技术。由于其分散性好，细胞或细胞团大小均匀，生长迅速，细胞状态可以相对保持一致等，与固体培养相比，植物悬浮培养能更全面地与营养物质相混合，能提供大量形态较均一的植物细胞，细胞增殖的速度比愈伤组织更快，在建立植物胚性材料的悬浮系的基础上，实现植株再生具有更高的繁殖效率，适宜大规模培养和工厂化生产，被广泛用于遗传学、生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及分子生物学等多个领域的研究。
本研究申请者前期利用固体培养基培养大别山冬青未成熟胚成功诱导了体细胞胚并实现了植株再生(一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，专利号：ZL202011472139.8)，但固体培养中存在胚性愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，影响了后续繁育及遗传改良的进程。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，包括以下步骤：
1)从大别山冬青未成熟果实中取出发育至子叶胚阶段的未成熟胚；
2)将未成熟子叶胚接种至固体诱导培养基中，诱导培养为胚性愈伤组织；
3)将胚性愈伤组织转入液体增殖培养基中，形成液体悬浮细胞系并进行增殖培养；
4)将步骤3)获得的悬浮细胞系转入预处理液体培养基中预培养处理；
5)将预处理的悬浮细胞系转移到体胚成熟固体培养基中培养产生成熟的子叶胚；
6)将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中培养萌发，直至长成完整的再生植株。
进一步地，步骤1)中，所述大别山冬青未成熟果实为自由授粉后5-6个月的果实。
进一步地，步骤2)中，固体诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2,4-D 0.5～2.0mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
进一步地，所述改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L。
进一步地，步骤3)中，胚性愈伤组织与液体培养基的比列为1:7-10(w/v)，液体增殖培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2,4-D 1.0～3.0mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
进一步地，步骤4)中，悬浮细胞与液体培养基的比列为1:7-10(v/v),液体预处理培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2～0.5mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+ZT1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L。
进一步地，步骤5)中，体胚成熟固体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+ABA 2.0～5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
进一步地，步骤6)中，体胚发育基本培养基的配方为：改良MS培养基+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L；
进一步地，步骤1)-5)中培养条件为，控温23～25℃，暗培养，其中步骤4和5中悬浮培养时，摇床转速为110-125转/min。步骤6中培养条件为控温23～25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明采用大别山冬青未成熟子叶胚诱导出的胚性愈伤组织，然后利用该胚性愈伤组织建立了细胞悬浮系，通过该大别山冬青胚性悬浮系进行体细胞胚诱导培养、体细胞胚的萌发和再生植株培养，可将体胚发生频率最高提高20倍以上，有效改善了现有固体诱导体胚发生和植株再生途径中愈伤组织增殖速率慢，体胚发生效率不高、体胚个体之间发育阶段不同步等问题，节约了时间和成本，为冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、高频同步的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系和工厂化育苗提供了技术支撑。
附图说明
图1为大别山冬青胚性愈伤组织图；
图2为悬浮培养1周的胚性细胞悬浮系图；
图3为预处理悬浮系转入体胚成熟固体培养基20天图；
图4为固体培养基诱导出胚率与液体悬浮系诱导出胚率比较图；
图5为体胚萌发成完整植株图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L。
实施例1
一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，步骤如下：
1、大别山冬青未成熟合子胚的准备
每年9月中旬采集一次大别山冬青优良单株上自由授粉约5个月后的果实(完全成熟需9-10个月)，迅速置于4℃条件下冷藏保存。取出果实，然后用力揉搓去掉果皮和果肉，挤出内部的小核果，然后在流水下冲洗3-5遍，不饱满核果会漂浮于水面，沉入水下为发育良好的核果。取发育良好的核果先经过75％乙醇浸泡60秒，然后用2.5％次氯酸钠溶液灭菌15-18分钟，最后用无菌水冲洗3遍，随后在无菌条件下中，在解剖镜下用无菌手术刀和镊子件下剥掉核果外面的硬质种皮，取出未成熟合子胚。
2、胚性愈伤组织的诱导
胚性愈伤组织起始诱导阶段基本培养基采用改良Murashige and Skoog(MS)培养基。在无菌条件下将未成熟合子胚接种至固体诱导培养基中，每培养皿接种10粒。暗培养，控温23℃，25天继代一次，经过2-3次继代后可诱导出胚性愈伤组织。20天左右即可诱导出愈伤组织(图1)，愈伤组织诱导率达100％。
诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L，pH调节为5.6-5.8。
3、悬浮培养建立
在无菌条件下，取步骤2获得的胚性愈伤组织4-6g放入250mL三角瓶中，用镊子轻轻压碎，以1:7(w/v)比例加入液体增殖培养基，暗培养，控温23-25℃，摇床转速为110-125转/min，每7天继代一次(图2)。
液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 0.8g/L+Vc10mg/L+蔗糖30g/L。
4、悬浮系细胞预处理
2周后将步骤3获得的悬浮细胞系倒入量筒中，待悬浮系细胞沉淀到底部后倒去上层液体培养基，保留下部约5mL悬浮细胞系，倒入250mL三角烧瓶中，然后加入7倍体积的预处理液体培养基，暗培养，控温23-25℃，摇床转速为110-125转/min，预培养处理3天。
液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L+CH0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
预处理目的是将胚性愈伤组织发育状态往体胚形成方向诱导。实验表明，不经过该预处理，下一步体胚成熟培养中基本不能进行体胚发生。
5、体胚成熟培养
将预处理的悬浮细胞系用5mL移液器转移到体胚成熟固体培养基表面滤纸上，每皿涂2mL预处理后悬浮细胞系，暗培养，控温23-25℃，培养25天至体胚发育成熟(图3)，经统计，每皿成熟体胚发生个数平均达到148个，远高于通过固体诱导培养成熟体胚的效率(图4)。
体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 2.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu 1g/L+Vc10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
6、体胚萌发
将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中，控温23-25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h，直至萌发长成完整的再生植株(图5)。
体胚萌发固体培养基为：改良MS培养基+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
实施例2
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率95％。
步骤3中按照1:9(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:9(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+ZT1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 3.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生个数平均132个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
实施例3
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率98％。
步骤3中按照1:10(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 3.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:10(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生平均个数112个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
实施例4
在实施例1的基础上，进行以下调整：
步骤2所用诱导胚性愈伤组织固体培养基：改良MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH(水解酪蛋白)0.6g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。愈伤组织诱导率达98％。
步骤3中按照1:10(w/v)比例加入液体增殖培养基，所用液体增殖培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30g/L。
步骤4中按照1:10(v/v)比例加入预处理液体培养基，液体预处理培养基：改良3/4MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+CH 0.8g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。
步骤5中所用体胚成熟固体培养基：改良3/4MS培养基+ABA 5.0mg/L+LH 0.5g/L+Glu1g/L+Vc 10mg/L+蔗糖50g/L+水晶洋菜3g/L。每皿成熟体胚发生平均个数88个。
其他各步骤和培养条件均同实施例1。
Claims (5)
1.一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从大别山冬青未成熟果实中取出发育至子叶胚阶段的未成熟胚；
2）将未成熟子叶胚接种至固体诱导培养基中，诱导培养为胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织转入液体增殖培养基中，形成液体悬浮细胞系并进行增殖培养；
4）将步骤3）获得的悬浮细胞系转入预处理液体培养基中预培养处理；
5）将预处理的悬浮细胞系转移到体胚成熟固体培养基中培养产生成熟的子叶胚；
6）将成熟的子叶胚转移到改良MS基本培养基中培养萌发，长成再生植株；
其中，所述改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 1000mg/L，K2SO4 200mg/L，(NH4)2SO4 200mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L；
其中，步骤3）中，胚性愈伤组织与液体增殖培养基的w/v比例为1:7-10，液体增殖培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2, 4-D 1.0~3.0 mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L+ CH 0.8g/L +Vc 10mg/L+蔗糖30 g/L；
其中，步骤4）中，悬浮细胞与预处理液体培养基的v/v比例为1:7-10，预处理液体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+2, 4-D 0.2~0.5mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L + ZT 1.0mg/L +CH 0.8g/L +Vc 10mg/L+蔗糖50 g/L；
其中，步骤5）中，体胚成熟固体培养基的配方为：改良3/4MS培养基+ABA 2.0~5.0 mg/L+LH 0. 5g/L+ Glu 0.5g/L + Vc 10mg/L+蔗糖50 g/L+水晶洋菜3g/L。
2.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤1）中，所述大别山冬青未成熟果实为自由授粉后5-6个月的果实。
3.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤2）中，固体诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2, 4-D 0.5~2.0 mg/L+6-BA 0.2~0.5mg/L+ CH 0.6g/L +Vc 10mg/L+蔗糖30 g/L+水晶洋菜3g/L。
4.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，其特征在于，步骤6）中，改良MS基本培养基的配方为：改良MS培养基+Vc 10 mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜3g/L。
5.根据权利要求1所述的大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法，步骤1）-5）中培养条件为，控温23~25℃，暗培养，其中步骤4）和5）中悬浮培养时，摇床转速为110-125转/min；步骤6）中培养条件为控温23~25℃，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211501864.2A CN115956503B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211501864.2A CN115956503B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115956503A CN115956503A (zh) | 2023-04-14 |
| CN115956503B true CN115956503B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=87360727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211501864.2A Active CN115956503B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115956503B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101112177A (zh) * | 2007-09-07 | 2008-01-30 | 南京林业大学 | 固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法 |
| CN102017896A (zh) * | 2010-11-15 | 2011-04-20 | 江苏省·中国科学院植物研究所 | 一种大别山冬青离体快繁的方法 |
| CN111134019A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-12 | 长江大学 | 一种齿叶冬青体细胞胚胎直接发生和植株再生的方法 |
| CN111134018A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-12 | 长江大学 | 一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法 |
| CN112616659A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-09 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003278632A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-05-04 | The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited | Plant alpha farnesene synthase and polynucleotides encoding same |
| MX356296B (es) * | 2011-12-28 | 2018-05-22 | Evogene Ltd | Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento de las plantas. |
-
2022
- 2022-11-28 CN CN202211501864.2A patent/CN115956503B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101112177A (zh) * | 2007-09-07 | 2008-01-30 | 南京林业大学 | 固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法 |
| CN102017896A (zh) * | 2010-11-15 | 2011-04-20 | 江苏省·中国科学院植物研究所 | 一种大别山冬青离体快繁的方法 |
| CN111134019A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-12 | 长江大学 | 一种齿叶冬青体细胞胚胎直接发生和植株再生的方法 |
| CN111134018A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-12 | 长江大学 | 一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法 |
| CN112616659A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-09 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115956503A (zh) | 2023-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boulay et al. | Development of somatic embryos from cell suspension cultures of Norway spruce (Picea abies Karst.) | |
| Lai et al. | Somatic embryogenesis in longan [Dimocarpus longan Lour.] | |
| Chu et al. | An improved anther culture method for obtaining higher frequency of pollen embryoids in Triticum aestivum L. | |
| CN102217540B (zh) | 一种中国石蒜的快速繁殖方法 | |
| CN110583482B (zh) | 一种落叶松针叶高效离体再生方法 | |
| CN102499086B (zh) | 一种刺槐的繁殖方法 | |
| Rao et al. | Differentiation ex ovulo of embryos and plantlets in stem tissue cultures of Tylophora indica | |
| YU et al. | Plant regeneration by callus-mediated protocorm-like body induction of Anthurium andraeanum Hort. | |
| CN105265316A (zh) | 一种葱属植物鳞茎盘快速繁殖方法 | |
| CN103053423B (zh) | 以花椰菜小孢子胚为外植体建立再生体系的方法 | |
| CN112715367B (zh) | 一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法 | |
| CN104094848B (zh) | 油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法 | |
| CN104396753A (zh) | 一种用精胺快速繁殖甘蔗组培苗的方法 | |
| CN115956503B (zh) | 一种大别山冬青胚性悬浮系建立与植株再生的方法 | |
| CN1157107C (zh) | 金钗石斛的快速繁殖方法 | |
| CN112616659B (zh) | 一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法 | |
| CN115191355A (zh) | 一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法 | |
| CN114788496A (zh) | 一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法 | |
| CN114431154A (zh) | 一种通过白牛槭休眠芽无性扩繁的方法 | |
| CN109937875B (zh) | 一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法 | |
| CN110896853B (zh) | 一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法 | |
| KR101636726B1 (ko) | 생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법 | |
| CN101790960B (zh) | 一种吴茱萸的组织培养法 | |
| CN116602212B (zh) | 芍药属植物离体培养和增殖方法及专用培养基 | |
| CN104719160B (zh) | 用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |