BR122020021867B1 - método de aumento do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso do nitrogênio de uma planta, e, construção de ácido nucléico - Google Patents

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Abstract

São providos polipeptídeos isolados compreendendo a sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 ou 772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771, os polinucleotídeos isolados compreendendo a sequência de Ácido nucleico pelo menos 80% idêntica às SEQ ID NOs: 18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ TD NO:756 ou 762, e polinucleotídeos isolados selecionados do grupo consistindo. nas SEQ ID NOs: 779-792 e métodos de utilização destes para aumentar o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogénio de uma. planta.

Description

Dividido do PI0908666-8, depositado em 21/05/2009 CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção, em algumas de suas configurações,refere-se a polipeptídeos, polinucleotídeos que os codifica, plantas transgênícas que o expressam e métodos de produção e utilização destes, e, mais particularmente, porém não exclusivamente, a métodos para aumento do rendimento da planta, rendimento de óleo, rendimento de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tear de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio.
[002] As condições de estresse abiótico, tais como salinidade,estiagem, cheias, temperatura subideal e poluição química tóxica, causam danos substanciais às plantas agrícolas. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para se proteger dessas condições. No entanto, se a gravidade e a duração dessas condições de estresse forem muito grandes, os efeitos sobre o desenvolvimento, o crescimento e o rendimento da maioria das plantas agrícolas são profundos. Além disso, a maioria das plantas agrícolas são altamente susceptíveis ao estresse abiótico (ASS) e, portanto, necessitam de condições ideais de crescimento para que se tenha rendimentos agrícolas comerciais. A exposição continua ao estresse causa alterações importantes no metabolismo da planta, o que por fim leva à morte celular e, consequentemente, a perdas de rendimento.
[003] A escassez mundial no fornecimento de água é um dos mais graves problemas agrícolas que afetam o crescimento da planta e o rendimento dos cultivos. São feitos esforços para minimizar os efeitos nocivos da desertificação e da salinização das terras aráveis do mundo. Assim, as empresas Agbiotech tentam criar novas variedades de cultivo que sejam tolerantes aos diferentes estresses abióticos, focando principalmente o desenvolvimento de novas variedades que possam tolerar a escassez de água por períodos mais prolongados.
[004] Os nutrientes (macro e micronutrientes) em quantidade abaixo da ideal afetam o crescimento e o desenvolvimento planta durante todo o seu ciclo de vida. Um dos macronutrientes essenciais para a planta é o nitrogênio. O nitrogênio é responsável pela biossintese de aminoácidos e ácidos nucleicos, grupos protéticos, hormônios de plantas, defesas químicas das plantas, e similares. 0 nitrogênio é geralmente um elemento de limitação da velocidade de crescimento da planta e todos os cultivos em campo têm uma dependência fundamental de fertilizantes nitrogenosos inorgânicos. Uma vez que o fertilizante é rapidamente retirado da maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido aos cultivos em crescimento duas ou três vezes durante a estação de crescimento. Outros macronutrientes importantes são o fósforo (P) e o potássio (K), que têm uma correlação direta com o rendimento e a tolerância geral da planta.
[005] Óleos vegetais ou de sementes são a principal fonte de energia e nutrição na dieta humana e animal. São também utilizados na produção industrial, por exemplo, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos à base de plantas representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fôsseis atualmente utilizados são recursos finitos e estão sendo gradualmente exauridos, cultivos de biomassa de rápido crescimento podem ser utilizados como combustíveis alternativos ou para estoques de energia para processos industriais e podem reduzir a dependência dos fornecimentos de energia fóssil. No entanto, o principal gargalo para aumentar o consumo de óleos à base de plantas como biocombustível é o preço do óleo, que ainda é mais alto que o combustível fóssil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) eia (dot) doe (dot) gov/oiaf/analysispaper/biodiesel/; Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) njbiz (dot)com/weekly_article.asp?aID=19755147 (dot) 6122555 (dot) 957931 (dot) 7393254 (dot) 4337383 (dot) 561&aID2=73678].
[006] Além disso, a taxa de produção de óleos à base de plantas é limitada pela disponibilidade de solo agrícola e água. Assim, o aumento dos rendimentos de óleos á base de plantas a partir da mesma área de cultivo pode superar eficientemente a escassez de espaço para produção e pode, ao mesmo tempo, aumentar os preços do óleo vegetal.
[007] Estudos visando o aumento dos rendimentos de óleos à base de plantas dão ênfase à identificação de genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como nos genes capazes de aumentar os rendimentos da planta e da semente em plantas transgênicas.
[008] Os genes conhecidos por estarem envolvidos no aumento dos rendimentos de óleos à base de plantas incluem aqueles que participam na síntese ou no sequestro de ácido graxo, por exemplo, a desaturase [ou seja, DELTA6, DELTA12 ou aci l -ACP (Ssi2; Fonte de Informação Arabidopsis (TAIR; Hypertext Transfer Protocolo://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/), TAIR No. AT2G43710)], OleosinA (TAIR No. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR No. AT2G29980), e vários fatores e ativadores de transcrição, tais como Lecl [TAIR No. AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26;93(7):1195205], Lec2 [TAIR No. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEES Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIE No. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wril [TATE No. AT3G54320, Cernac and penning, 2004. Plant J. 40 (4) : 575-85] .
[009] Zabrouskov V., et al., 2002 (Physiol Plant. 116:172-185) descrevem um aumento na fração lipídica total por regulação ascendente do retículo endoplasmático (FAD3) e desaturases de ácido graxo plastidal (FAD7) em batata.
[0010] Wang HW et al., 2007 (Plant J. 52:716-29. Epub 2007 Sep 18) descrevem um aumento no teor de ácidos graxos totais e lipídeos em sementes de planta por superexpressão dos fatores de transcrição GmDof4 e GmDof11.
[0011] Vigeolas H, et al. [Planta Biotechnol J. 2007, 5(3):431-41] e o Pedido de Patente Norte-Americana No. 20060168684 revelam um aumento no teor de óleo de semente em óleo-semente de nabo (Brassica napus L.) por superexpressão de uma levedura glicerol-3-fosfato desidrogenase sob o controle de um promotor específico de semente.
[0012] Katavic V, et al., 2000 (Biochem Soc Trans. 28:935-7) descrevem o uso de genes de Arabidopsis FAE1 e levedura SLC1-1 para aprimoramentos em ácido erúcico e teor de óleo em semente de nabo.
[0013] O Pedido de Patente Norte-Americana No. 20080076179 revela um ácido nucleico de musgo isolado que codifica uma proteína de metabolismo de lipidios (LMP) e plantas transgênicas que o expressam com maiores níveis de lipidios.
[0014] O Pedido de Patente Norte-Americana No. 20060206961 revela um método de aumento do teor de óleo em plantas (a saber, em sementes de planta), pela expressão do polipeptídeo Ypr140w na planta.
[0015] O Pedido de Patente Norte-Americana No. 20060174373 revela um método de aumento do teor de óleo em plantas pela expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína de intensificação de síntese (TEP) de triacilgliceróis (TAG) na planta.
[0016] Os Pedidos de Patente Norte-Americana Nos. 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943, revelam plantas transgênicas com melhor eficiência no uso de nitrogênio e que podem ser utilizadas para a conversão em combustível ou estoque químicos industriais.
[0017] A WO2004/104162 ensina as sequências de polinucleotídeo e os métodos de utilização destas para aumentar a tolerância de uma planta aos estresses abióticos e/ou para aumentar a biomassa de uma planta.
[0018] A W02007/020638 ensina as sequências de polinucleotídeo e os métodos de utilização destas para aumentar a tolerância de uma planta aos estresses abióticos e/ou para aumentar a biomassa, o vigor e/ou o rendimento de uma planta.
[0019] A W02008/122890 ensina as sequências de polinucleotídeo e os métodos de utilização destas para aumentar o teor de óleo, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento e/ou o vigor de uma planta.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0020] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica as SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0021] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 e 763, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0022] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiático e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a transformação da planta com um polinucleotídeo exógeno capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica ã SEQ ID NO:17 ou 673, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0023] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a transformação da planta com um polinucleotídeo exógeno capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão da sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:17 ou 673, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0024] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de produção de óleo, compreendendo: (a) provisão da planta de acordo com o método da invenção; e (b) extração do óleo da planta; produzindo, assim, o óleo.
[0025] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica ás SEQ ID NOs:18, 116, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[0026] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 e 763.
[0027] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:17 ou 673.
[0028] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão da sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:17 ou 673.
[0029] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga A sequência de aminoácido definida nas SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[0030] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 e 772.
[0031] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão ou atividade de um polipeptídeo pelo menos 80% homólogo ao polipeptídeo definido pela SEQ ID NO:67.
[0032] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de realizar a regulação descendente do nível de expressão ou atividade do polipeptídeo definido pela SEQ ID NO:67.
[0033] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[0034] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga ã SEQ ID NO:68, 5166, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 ou 772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO:765 ou 771.
[0035] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 e 772.
[0036] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma construção de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:779-792 e a sequência de polinucleotídeo heterólogo, onde a sequência de ácido nucleico é capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[0037] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo é um gene repórter.
[0038] De acordo com algumas configurações da invenção, a regulação da expressão do polinucleotídeo heterólogo está em uma forma específica ao tecido.
[0039] De acordo com algumas configurações da invenção, a regulação da expressão do polinucleotídeo heterólogo está em uma forma especifica ao estágio de desenvolvimento.
[0040] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-l6, 19-50, 101-378, 657672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[0041] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo codifica uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga às SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[0042] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, da construção de ácido nucleico da reivindicação 17, onde o polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica às SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0043] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, da construção de ácido nucleico da reivindicação 17, onde o polinucleotídeo heterólogo codifica uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga às SEQ ID NOs:68, 5166, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0044] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma célula de planta que expressa exogenamente o polinucleotídeo da invenção, ou a construção de ácido nucleico da invenção.
[0045] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é provida uma célula de planta que expressa exogenamente o polipeptádio da invenção.
[0046] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucleico é conforme definida na SEQ ID NO: 18, 1-16, 19-50, l01-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 ou 763.
[0047] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo consiste na sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 e 763.
[0048] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga A SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 ou 772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[0049] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 e 772.
[0050] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula de planta faz parte de uma planta.
[0051] De acordo com algumas configurações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.
[0052] De acordo com algumas configurações da invenção, o estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo em salinidade, estiagem, privação de água, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e radiação UV.
[0053] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de co-supressão, um polinucleotídeo antisense, um polinucleotídeo de interferência de RNA ou um polinucleotídeo de ribozima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0054] Algumas configurações da invenção são aqui descritas, somente por meio de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência especifica agora aos desenhos detalhadamente, é salientado que os detalhes mostrados são exemplificativos e para fins de discussão ilustrativa das configurações da invenção. Nesse sentido, a descrição feita com os desenhos deixa evidente aos técnicos no assunto como as configurações da invenção pode ser colocadas em pratica.
[0055] Nos desenhos: as figuras lA-D são imagens digitais de folhas que ilustram os parâmetros de folhas. A Figura lA - comprimento da folha (o comprimento da folha é representado pela seta); Figura 16 - comprimento laminar (o comprimento laminar é representado pela seta); Figura 1C - área laminar (a área laminar é representada pela elipse branca); Figura 1D - largura laminar (a largura laminar é representada pela seta). A circularidade do limbo foi calculada como a largura laminar dividida pelo comprimento laminar.
[0056] as figuras 2A-B são imagens que ilustram a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas cultivadas em placas de ágar transparentes. Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de agar transparentes por 17 dias e as placas foram fotografadas a cada 2 dias começando no dia 7. A Figura 2A 6 uma imagem de uma fotografia de plantas feita após 12 dias em placas de ágar. A Figura 2B é uma imagem da análise da raiz na qual o comprimento medido da raiz é representado por uma seta vermelha.
[0057] a figura 3 é uma ilustração esquemática do plasmídio binário pGI utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; H - enzima de restrição Hindlll; X -enzima de restrição XbaI; B - enzima de restrição BamHI; S - enzima de restrição Sall; Sm - enzima de restrição SmaI; R-I - enzima de restrição EcoRI; Sc - SacI/SstI/Ec1136II; (números) - Comprimento em pares de base; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador nopalina sintase; sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron). As sequências de polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção foram clonadas no vetor durante a substituição do gene repórter GUSintron.
DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0058] A presente invenção, em algumas de suas configurações, refere-se a polipeptídeos e polinucleotídeos isolados que os codifica e, mais particularmente, porém não exclusivamente, a métodos de utilização destes para aumentar o teor de óleo, a taxa de crescimento, o rendimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0059] Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção detalhadamente, deve ficar entendido que a invenção não é necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes definidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou realizada de várias formas.
[0060] Ao resumir a presente invenção à prática, os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o teor de óleo, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0061] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que aumentam o rendimento (por exemplo, o rendimento de semente, o rendimento de óleo e o teor de óleo), a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta. Os genes que afetam o atributo de interesse foram identificados com base nos perfis de expressão de genes de vários ecotipos e tecidos Arabidopsis, homologia com genes conhecidos por afetar o atributo de interesse e utilizando perfil de expressão digital em tecidos e condições específicas (Tabelas 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11, Exemplos 1 e 3). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 2, Exemplo 2). Plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos identificados exibem maior rendimento de semente (a saber, peso de 1000 sementes), rendimento de óleo (a saber, percentual de óleo na semente), biomassa (a saber, matéria seca), índice de colheita, taxa de crescimento, área da roseta, tolerância ao estresse abiótico (a saber, para condições de estiagem) e eficiência no uso de nitrogênio (Tabelas 22, 23, 24, 25, 26 e 27; Exemplos 5 e 7; Tabelas 28-30, Exemplo 8). Além disso, os presentes inventores revelaram que os polinucleotídeos que reduzem o nível de expressão e/ou a atividade de certos produtos genéticos (a saber, o gene BDL127; SEQ ID NO:17 ou 673) podem aumentar o rendimento (a saber, rendimento de semente), a biomassa e/ou a taxa de crescimento em plantas (Tabelas 31-36; Exemplo 9). Conforme ainda mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores revelaram novas sequências de promotor que podem ser utilizadas para expressar o gene de interesse de forma especifica ao tecido e/ou específica ao estágio de desenvolvimento (Tabelas 16, 17, 18, 19, 20 e 21, Exemplo 6). Juntos, esses resultados sugerem o uso dos polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiático e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0062] Assim, de acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica às SEQ ID NOs:18, 116, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762, aumentando assim o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0063] A frase "teor de óleo", conforme aqui utilizada, refere-se a quantidade de lipídeos em um determinado órgão de planta, tanto as sementes (teor de óleo da semente) ou a parte vegetativa da planta (teor de óleo vegetativo) e é tipicamente expressa como percentual de peso seco (10% umidade de sementes) ou peso úmido (para a parte vegetativa).
[0064] Deve ser observado que o teor de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca de um tecido (por exemplo, semente, parte vegetativa), bem como a massa ou o tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de crescimento.
[0065] Em uma configuração, o aumento do teor de óleo da planta pode ser realizado aumentando-se o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta que compreende oleo por período de crescimento. Assim, o maior teor de óleo de uma planta pode ser obtido aumentado-se o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.
[0066] Conforme aqui utilizada, a frase "rendimento da planta" refere- se à quantidade (conforme determinada por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecido produzido por planta ou por estação de cultivo. Portanto, o maior rendimento poderia afetar o benefício econômico que se pode obter a partir da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.
[0067] Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser afetado por vários parâmetros incluindo, entre outros, a biomassa da planta; o vigor da planta; a taxa de crescimento; o rendimento de semente; o rendimento de óleo; o teor de óleo, amido e/ou proteína nos órgãos colhidos (por exemplo, sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (botões) por panícula (expressa como a proporção entre o número de sementes preenchidas e o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; numero de plantas por área de cultivo (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e divisão de carbono (a distribuição/alocação de carbono em uma planta); resistência à sombra; número de órgãos colhíveis (por exemplo, sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [por exemplo, aumento do diâmetro, espessura ou melhora das propriedades físicas do talo (por exemplo, elasticidade)].
[0068] Conforme aqui utilizada, a frase "biomassa da planta" refere-se â quantidade (medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em uma estação de cultivo, que poderia também determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes desta, por exemplo, partes acima do solo (colhíveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.
[0069] Conforme aqui utilizada, a frase "taxa de crescimento" refere- se ao aumento do tamanho do órgão da planta no decorrer do tempo (pode ser medida em cm2 ao dia).
[0070] Conforme aqui utilizada, a frase "vigor da planta" refere-se ã quantidade (medida por peso) de tecido produzido pela planta em um determinado tempo. Portanto, o aumento do vigor poderia determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por época de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor precoce (semente e/ou muda) resulta com a melhora da estrutura do campo.
[0071] Conforme aqui utilizada, a frase "rendimento de semente" refere-se ao número ou peso das sementes por planta, sementes por vagem, ou por área de cultivo ou ao peso de uma (nica semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, o rendimento de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (por exemplo, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), numero de sementes (preenchidas) e taxa de preenchimento de semente e por teor de óleo da semente. Portanto, o aumento do rendimento de semente por planta poderia afetar o beneficio econômico que se pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento do rendimento de semente por área de cultivo pode ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas cultivadas na mesma determinada área.
[0072] O termo "semente" (também denominada "grão" ou "cerne"), conforme aqui utilizado, refere-se a uma pequena planta embrionária protegida por uma cobertura denominada revestimento de semente (geralmente com algum alimento estocado), o produto do óvulo maduro de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta-mãe.
[0073] Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser determinado sob estresse (por exemplo, estresse abiótico, condições de limitação de nitrogênio) ou condições sem estresse (normais).
[0074] Conforme aqui utilizada, a frase "condições sem estresse" refere-se às condições de crescimento (por exemplo, Água, temperatura, ciclos de luz-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente, por exemplo, nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que permitem o metabolismo normal, o crescimento, a reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida (desde a semente até a planta matura e de volta à semente). Deve ser observado que embora as condições sem estresse possam incluir algumas pequenas variações em relação às condições ideais (que variam de um tipo/espêcie de uma planta para outra), essas variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.
[0075] A frase "estresse abiótico", conforme aqui utilizada, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Assim, o estresse abiótico pode ser induzido por condições crescimento ambiental sub-ideais, por exemplo, salinidade, privação de água, cheias, geadas, baixa ou alta temperatura, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou radiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.
[0076] A frase "tolerância ao estresse abiótico", conforme aqui utilizada, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.
[0077] Conforme aqui utilizada, a frase "eficiência no uso de nitrogênio (NUE)" refere-se ao (s) processa (s) metabólico (s) que leva (m) a um aumento do rendimento da planta, da biomassa, do vigor, da taxa de crescimento e da tolerância ao estresse abiótico por unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, dispersão, absorção, acúmulo, relocação (na planta) e uso de nitrogênio absorvido pela planta.
[0078] Conforme aqui utilizada, a frase "condições de limitação de nitrogênio" refere-se As condições de crescimento que incluem um nível (por exemplo, concentração) de nitrogênio (por exemplo, amônio ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal, crescimento, reprodução e/ou viabilidade da planta.
[0079] Conforme aqui utilizado, o termo "aumento" refere-se ao aumento de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, no teor de óleo, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta em comparação a uma planta nativa, por exemplo, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, ou seja, uma planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento).
[0080] Conforme aqui utilizada, a frase "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência heteróloga de ácido nucleico que pode não ser naturalmente expresso na planta ou cuja superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de forma estável ou temporária, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve ser observado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência endógena de ácido nucleico da planta.
[0081] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 116, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[0082] A identidade (ou seja, a homologia percentual) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information (NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão.
[0083] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que o polinucleotídeo exógeno não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[0084] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é definido pela SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 ou 763.
[0085] Em configurações exemplores, o polinucleotídeo exógeno não é o polinucleotídeo definido pela SEQ ID NO:807 ou 808.
[0086] Conforme aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de fita única ou dupla-fita de ácido nucleico que ê isolada e provida na forma de uma sequência de RNA, uma sequência complementar de polinucleotídeo (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotfdio e/ou sequências compostas de polinucleotídeo (por exemplo, uma combinação destes acima).
[0087] O termo "isolado(a)" refere-se pelo menos a parcialmente separado(a) do ambiente natural, por exemplo, de uma célula de planta.
[0088] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência complementar de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente do RNA. Essa sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando uma DNA polimerase dependente do DNA.
[0089] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência genõmica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, assim, representa uma parte contígua de um cromossomo.
[0090] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência composta de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência, que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrânicas que se interpõem entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, inclusive de outros genes, e tipicamente incluirão sequências de sinal de splicing conservadas. Essas sequências intrônicas podem ainda incluir elementos reguladores de expressão de ação cis.
[0091] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoãcido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga â sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[0092] A homologia (a saber, homologia percentual) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information (NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão, ao iniciar a partir de uma sequência polipeptidica; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via o NCBI), por exemplo utilizando parâmetros padrão, que compara os produtos de translação conceptual de seis quadros de uma sequência de fila de nucleotídeo (ambas as fitas) contra uma base de dados de sequência protéica.
[0093] As sequências homólogas incluem tanto sequências ortólogas como parálogas. O termo "parálogas" refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie que leva a genes parálogos. O termo "ortólogos" refere-se a genes homólogos em diferentes organismos devido ã relação ancestral.
[0094] A opção de identificar ortólogos em espécies monocotiledóneas é pela realização de uma busca de blast reciproco. Isto pode ser realizado por um primeiro blast envolvendo o blasting da sequência de interesse contra qualquer base de dados de sequência, por exemplo, a base de dados NCBI disponível ao público que pode ser encontrada em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse sofreria um blasting contra, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza sativa Nipponbare disponível na NCEI. Os resultados do blast podem ser filtrados. As sequências de comprimento total de qualquer um dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então submetidas a um blasting reverso (segundo blast) contra as sequências do organismo do qual a sequência de interesse ê derivada. Os resultados do primeiro e segundo blasts são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultante na maior pontuação (melhor opção) no primeiro blast identificar no segundo blast a sequência de fila (a sequência original de interesse) como a melhor opção. Utilizando a mesma justificativa, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o program ClustalW pode ser utilizado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/Tools/clustalw2/index (dot) html], seguido de uma árvore de junção de vizinhos (Hypertext Transfer Protocol://en (dot) wikipedia (dot) org/wiki/Neighbor-joining) que a ajuda a visualizar o clustering.
[0095] Em uma configuração exemplor, o polinucleotídeo exógeno não codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 809-852.
[0096] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácido definida pela SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 ou 772.
[0097] A sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos não limitativos de sequências de ácido nucleico otimizadas são providas nas SEQ ID NOs:663 (BDL-113), 675 (BDL-129), 676 (BDL-130), 680 (BDL-134), 683 (BDL-137), 684 (BDL-139) e 685 (BDL-141) que codificam polipeptídeo otimizado compreendendo uma sequência de aminoácidos definida pelas SEQ ID NOs:57, 69, 712, 74, 77, 78 e 79. Exemplos dessas modificações de sequência incluem, entre outras, um conteúdo de G/C alterado para se aproximar mais intimamente do que é tipicamente encontrado na espécie de planta de interesse, e a remoção de códons atipicamente encontrados na espécie de planta comumente denominada como otimização códon.
[0098] A frase "otimização de códon" refere-se ã seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento deste que se aproxima do uso do códon dentro de uma planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucleico otimizado refere- se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificada para utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro de uma planta. A sequência de nucleotídeo é tipicamente analisada ao nível do DNA e a região de codificação otimizada para expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Neste método, o desvio padrão do uso do códon, uma medida do desvio do uso do códon, pode ser calculado primeiramente encontrando-se o desvio proporcional quadrado do uso de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de planta altamente expressos, seguido de um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1N[(Xn - Yn)/Yn]2/N, onde Xn refere-se A frequência de uso do códon n em genes de planta altamente expressos, onde Yn refere-se A frequência de uso do códon n no gene de interesse e N refere- se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela do uso de códon a partir de genes altamente expressos de plantas dicotiledóneas é compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).
[0099] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico de acordo com o uso de códon preferido para um tipo de célula de planta em particular é baseado no uso direto, sem a realização de quaisquer cálculos estatísticos adicionais, das Tabelas de otimização de códon, como aquelas providas on-line na base de dados de uso de códon do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) or (dot) jp/codon/). A base de dados de uso de códon contém tabelas de uso de códon para diversas espécies diferentes, onde cada tabela de uso de códon foi estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.
[00100] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie em particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural que codifica uma proteína de interesse pode ser o códon otimizado para aquela espécie de planta em particular. Isso é afetado pela substituição de códons que podem ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com códons correspondentes, com relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos sítios em junções potencialmente üteis (terminações 5' e 3' para adicionar peptidio de sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequência de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.
[00101] A sequência de nucleotídeo de codificação de ocorrência natural já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta em particular. Portanto, a otimização de códon da sequência nativa de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência nativa de nucleotídeo, não são estatisticamente favorecidos em relação a uma planta em particular, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códon da planta em particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência modificada de nucleotídeo pode ser totalmente ou parcialmente otimizada para uso de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência modificada de nucleotídeo seja produzida em um nível mais elevado que a proteína codificada pelo gene correspondente de ocorrência natural ou nativo. A construção de genes sintéticos por meio da alteração do uso de códon é descrita, por exemplo, no pedido de patente PCT 93/07278.
[00102] Assim, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima; seus fragmentos, sequências hibridizáveis com estas, sequências homólogas a estas, sequências que codificam polipeptídeos similares com uso de códon diferente, sequências alteradas caracterizadas por mutações, tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.
[00103] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca. de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724741 e 755763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[00104] De acordo com algumas figurações da invenção, o polinucleotídeo isolado compreende a sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 e 763.
[00105] De acordo com algumas figurações da invenção, o polinucleotídeo isolado é definido pela SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757--761 ou 763.
[00106] Em configurações exemplores, o polinucleotídeo isolado não é o polinucleotídeo definido pela SEQ ID NO:807 ou 808.
[00107] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um palipeptídio que compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379656, 707-715, 720-723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[00108] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 e 772.
[00109] A invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 e 764-772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[00110] Em uma configuração exemplor, o polipeptídeo não é o polipeptídeo definido pela SEQ ID NO: 809-851 ou 852.
[00111] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 e 772.
[00112] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo 6 definido pela SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 ou 772.
[00113] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos e polipeptídeos descritos acima tendo mutações, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.
[00114] O termo '"planta", conforme aqui utilizado, abrange plantas totais, ancestrais e progênie de plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), bem como células, tecidos e órgãos de plantas. A planta pode estar em qualquer forma, inclusive culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem â superfamilia Viridiplantae, em particular plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas, incluindo uma forrageira ou legume forrageiro, planta ornamental, cultivo de alimento, árvore, ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus tocara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis lapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve-de-folha, linhaça, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora espaguete, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, semente de colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e um cultivo de forragem. Alternativamente, algas e outras espécies não Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.
[00115] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de cultivo, por exemplo, arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosos (feijão, ervilha), linhaça, lupino, semente de colza, tabaco, álamo e algodão.
[00116] A expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro de uma planta pode ser realizada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida da geração de uma planta madura a partir das células transformadas e do cultivo da planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro de uma planta madura.
[00117] De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é realizada pela introdução, na célula de planta, de uma construção de ácido nucleico que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas configurações da invenção e pelo menos um promotor da transcrição direta do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula de planta). Mais detalhes de abordagens adequadas de transformação são mostradas abaixo.
[00118] De acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[00119] Conforme aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que fica acima do sitio de inicio de transcrição de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (ou seja, em que parte de uma planta) e/ou quando (ou seja, em qual estágio ou condição no ciclo de vida de um organismo) o gene é expresso.
[00120] Qualquer sequência promotora adequada pode ser utilizada pela construção de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, o promotor um promotor constitutivo, um promotor especifico de tecido ou um promotor que induz o estresse abiótico.
[00121] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, promotor de CaMV 358 (SEQ ID NO:777; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor de Arabidopsis At6669 (SEQ ID N0:775; vide Publicação PCT No. WO04081173A2); Ubi 1 de milho (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al . , Plant Cell 2:163171, 1990) ; pEMU (Last et al . , Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et a1., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et a1, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histona de milho H3 (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Retina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Synthetic Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Norte-americanas Nos. 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.
[00122] Promotores adequados específicos do tecido incluem, entre outros, promotores específicos de folhas [conforme descrito, por exemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos de semente [por exemplo, de genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Brazil Nut albumin (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), Trigo SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [por exemplo, trigo LMW e HMW, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b e g do trigo (EMB03:1409-15, 1984), promotor de ltrl da cevada, hordeína 21, C, D da cevada (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), Cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente- Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 do arroz, - globulina Glb-1 do arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfaglobulina REB/OHP-1 do arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucose PP do arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), família de gene ESR do milho (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embrião [por exemplo, OSH1 de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:25771, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flor [por exemplo, AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala- 3).
[00123] Promotores adequados que induzem o estresse abiótico incluem, entre outros, promotores induziveis de sal, tais como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induziveis de estiagem, tais como o promotor do gene rabl7 do milho (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259- 266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induziveis de calor, tais como promotor de hsp80 de tomate (Patente Norte-americana No. 5,187,267).
[00124] Conforme acima mencionado e ainda descrito no Exemplo 6 da seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores revelaram novas sequências promotoras (sequências reguladoras de ácido nucleico) que podem ser utilizadas para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta.
[00125] Assim, de acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provida uma construção de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:779-792 e a sequência de polinucleotídeo heterólogo, onde a sequência de ácido nucleico é capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00126] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo está operacionalmente ligado ã sequência reguladora de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:779-792.
[00127] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência reguladora de ácido nucleico da invenção varia, em termos de comprimento, de aproximadamente 500 nucleotídeos a aproximadamente 4000 nucleotídeos e inclui uma ou mais regiões de sequência que são capazes de reconhecer e ligar a RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição de ação trans) envolvidas na transcrição.
[00128] A sequência de codificação de ácido nucleico está "operacionalmente ligada" a uma sequência reguladora caso a sequência reguladora seja capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência de codificação ligada a ele. De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência reguladora está posicionada 1-500 bp acima do códon ATG da sequência de codificação de ácido nucleico, embora seja apreciado que as sequências reguladoras também podem exercer seu efeito quando posicionadas em outro lugar em relação a sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, dentro de um íntron) .
[00129] Como é claramente ilustrado na seção de Exemplos a seguir, as novas sequências reguladoras de ácido nucleico da invenção são capazes de regular a expressão de uma sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, um gene repórter, por exemplo, GUS, luciferase) operacionalmente ligada a elas (vide o Exemplo 6 da seção de Exemplos a seguir).
[00130] De acordo com algumas configurações da invenção, as sequências reguladoras de ácido nucleico da invenção regulam a expressão do polinucleotídeo heterólogo de uma forma específica ao tecido.
[00131] De acordo com algumas configurações da invenção, as sequências reguladoras de ácido nucleico da invenção regulam a expressão do polinucleotídeo heterólogo de uma forma específica ao estágio de desenvolvimento.
[00132] De acordo com algumas configurações da invenção, as sequências reguladoras de ácido nucleico da invenção são modificadas para criar variações nas sequências da molécula, por exemplo, para intensificar suas atividades de promoção, utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, modificação de DNA baseada em PCR ou técnicas de mutagênese de DNA padrão ou por síntese química dos polinucleotídeos modificados.
[00133] Assim, as sequências reguladoras de ácido nucleico definidas nas SEQ ID NOs:779792 podem ser truncadas ou deletadas e ainda manter a capacidade de direcionar a transcrição de uma sequência de DNA heteróloga operacionalmente ligada. 0 comprimento mínimo de uma região promotora pode ser determinado removendo-se sistematicamente as sequências das terminações 5' e 3' do polinucleotídeo isolado por meio de métodos padrão conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, a remoção de fragmentos de enzima de restrição ou a digestão com nucleases. Consequentemente, quaisquer fragmentos, partes ou regiões de sequência das sequências promotoras de polinucleotídeo reveladas na invenção podem ser utilizados como sequências reguladoras. Será apreciado que as sequências modificadas (coutadas, truncadas e similares) podem adquirir diferentes propriedades de transcrição, tais como a direção de diferente padrão de expressão de gene em comparação ao elemento não modificado.
[00134] Opcionalmente, as sequências definidas nas SEQ ID NOs:779- 792 podem ser modificadas, por exemplo, para expressão em uma gama de sistemas de planta. Em outra abordagem, novos promotores híbridos podem ser projetados ou geneticamente modificados por meio de vários métodos. Muitos promotores contêm sequências ascendentes que ativam, intensificam ou definem a potência e/ou a especificidade do promotor, conforme descrito, por exemplo, por Atchison [Ann. Rev. Cell 2i01. 4:127 (1988)]. Genes T- DNA, por exemplo, contêm caixas "TATA" que definem o sítio de início da transcrição e outros elementos ascendentes localizados acima do sítio de início da transcrição modulam níveis de transcrição [Gelvin In: Transgenic plants (Kung, S.-D. e Us, R., Eds, San Diego: Academic Press, pp.49-87, (1988)). Outro promotor quimérico combinou um trimer do ativador de octopina sintase (OCS) para o ativador da manopina sintase (mas) mais o promotor e relatou um aumento na expressão de um gene repórter [Min Ni et al. The Plant Journal 7:661 (1995)]. As sequências reguladoras ascendentes das sequências promotoras de polinucleotídeo da invenção podem ser utilizadas para a construção desses promotores quiméricos ou híbridos. Métodos para a construção de promotores variantes incluem, entre outros, a combinação de elementos de controle de diferentes promotores ou partes ou regiões de duplicação de um promotor (vide, por exemplo, Patentes Norte- americanas Nos. 5,110,732 e 5,097,025). Os técnicos no assunto estão familiarizados com as condições específicas e com os procedimentos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídios, etc.), geração de organismos recombinantes e a triagem e isolamento de genes, [vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989); Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, (1995); Birren et al., Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997); volume 2, Detecting Genes, (1998); volume 3, Cloning Systems, (1999); e volume 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, N.Y].
[00135] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo, que ê regulado pela sequência reguladora de ácido nucleico da invenção (a saber, SEQ ID NO:779-791 ou 792), compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%., pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762.
[00136] De acordo com algumas configurações de invenção, o polinucleotídeo heterólogo codifica uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 ou 772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771.
[00137] De acordo com algumas configurações, o polinucleotídeo heterólogo não codifica a sequência de aminoácido definida pela SEQ ID NO: 809-851 ou 852.
[00138] De acordo com algumas configurações, o polinucleotídeo heterólogo não compreende a sequência de ácido nucleico definida pela SEQ ID NO:807 ou 808.
[00139] Assim, de acordo com algumas configurações da invenção, o método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta é realizado pela expressão, dentro de uma planta, de uma construção de ácido nucleico da invenção que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupa consistindo nas SEQ ID NOs:779-792 e uma sequência de polinucleotídeo heterólogo que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica às SEQ ID NOs:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657672, 674-706, 716-719, 724-741 e 755-763, contanto que a sequência de ácido nucleico não seja conforme definida pela SEQ ID NO:756 ou 762, onde a sequência de ácido nucleico é capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00140] De acordo com algumas configurações da invenção, o método de aumento do teor de óleo, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta ê realizado pela expressão, dentro de uma planta, de uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:779-792 e uma sequência de polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga â SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742754, 764-771 ou 772, contanto que a sequência de aminoácido não seja conforme definida pela SEQ ID NO: 765 ou 771, onde a sequência de ácido nucleico é capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00141] A construção de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ainda incluir um marcador selecionável adequado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas configurações da invenção, a construção de ácido nucleico utilizada é um vetor-ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a construção compreende um marcador selecionâvel adequado e uma origem de replicação) e pode ser compatível com a propagação em células. A construção de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmidio, um bacemidio, a fagemidio, um cosmidio, um Pago, um vírus ou um cromossomo artificial.
[00142] A construção de ácido nucleico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar as células de planta de forma estável ou temporária. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e, dessa forma, representa uma característica estável e herdada. Na transformação temporária, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, porém não é integrado no genoma e, dessa forma. representa uma característica temporária.
[00143] Há vários métodos de introdução de genes estranhos tanto em plantas monocotiledôneas como dicotiledóneas (Potrykus, I. Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274- 276).
[00144] Os métodos básicos para realizar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobactéria: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Captação direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo os métodos para captação direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. captação de DNA induzida por rápido choque elétrico de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células de planta ou tecidos por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; fibras de vidro ou transformação de whisker com carbeto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido de calos, Patente Norte-americana No. 5,464,765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinativo, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA (1986) 83:715719.
[00145] O sistema de agrobactéria inclui o uso de vetores de plasmidio que contêm segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie de planta e do sistema de liberação da agrobactéria. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que ofereça uma boa fonte para o início de toda a diferenciação da planta. Vide, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de liberação de agrobactéria em combinação com infiltração á vácuo. 0 sistema de agrobactéria é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.
[00146] Há vários métodos de transferência direta de DNA em células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são rapidamente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de microparticuças, o DNA é adsorvido em microprojéteis, por exemplo, cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.
[00147] Após a transformação estável, é realizada a propagação da planta. O método mais comum de propagação de planta é por semente. A regeneração por propagação de semente, no entanto, tem uma deficiência. Devido ã heterozigosidade, há uma ausência de uniformidade no cultivo, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com suas próprias características específicas. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada tenha as características idênticas e as características da planta transgênica precursora. Portanto, é preferido que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que provê uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.
[00148] A micropropagação é um processo de crescimento de plantas de nova geração a partir de um único pedaço de tecido que foi retirado de uma planta precursora selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas tendo o tecido preferido que expressa a proteína de fusão. As plantas de nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas e possuem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.
[00149] A micropropagação ê um procedimento de múltiplos estágios que exige a alteração do meio de cultura ou das condições de crescimento entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura inicial do tecido; estágio dois, multiplicação da cultura do tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quatro, cultura e endurecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é definida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em pequenas plantas individuais. No estágio quatro, as pequenas plantas individuais transformadas são transferidas para uma estufa para endurecimento onde a tolerância das plantas â luz aumenta gradualmente, de modo que possa ser cultivada no ambiente natural.
[00150] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação temporária de células de folha, células meristemáticas ou toda a planta.
[00151] A transformação temporária pode ser realizada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de planta modificados.
[00152] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus de planta descrito na Patente Norte-americana 4,855,237 (vírus do 3 mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Pedido Japonês Publicado No. 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al.,Communications in Molecular Biology; Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritos na WO 87/06261.
[00153] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para as transformações temporárias é não virulento e, assim, incapaz de causar graves sintomas, tais como menor taxa de crescimento, mosaico, manchas em anel, enrolamento da folha, amarelamento, aparecimento de listras, formação de erupções, formação de tumor e formação de furos. Um vírus não virulento adequado pode ser um vírus não virulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser realizada utilizando-se métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese orientada conforme descrito, por exemplo, por Kurihara and Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).
[00154] Cepas adequadas de vírus podem ser obtidas de fontes disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de planta infectada pode ser realizado por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Foster and Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Resumidamente, os tecidos de uma planta infectada que supostamente contenha uma alta concentração de vírus adequados, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flores, são triturados em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada pelo vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.
[00155] A construção dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e na Patente Norte-americana 5,316,931.
[00156] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídio bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode ser então extraído do plasmídio. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e translação desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídio. O plasmídio é então utilizado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídio e pela translação dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que fazem a encapsidação do RNA viral.
[00157] Em uma configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta no qual a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídeo viral, e foi inserida uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa, capaz de realizar a expressão no hospedeiro da planta, o empacotamento do polinucleotídeo viral de planta recombinante, e de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídeo não nativo em seu interior, de modo que uma proteína seja produzida. a polinucleotídeo viral de planta recombinante pode canter um ou mais promotores subgenômicos adicionais não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeo no hospedeiro da planta e incapaz de realizar a recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativos (estranhos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou aos promotores subgenômicos virais nativos e não nativos da planta caso mais que uma sequência de polinucleotídeo seja incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativo são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para gerar os produtos desejados.
[00158] Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é provido como na primeira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00159] Em uma terceira configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante no qual o gene da proteína de revestimento nativa está adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de realizar recombinação entre si e com promotores subgenâmicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos de planta, de modo que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores subgenômicos para gerar o produto desejado.
[00160] Em uma quarta configuração, ê provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na terceira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00161] Os vetores virais são encapsidados pela proteína de revestimentos codificada pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral de planta recombinante ou vírus de planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras adequadas. O polinucleotídeo viral de planta recombinante é capaz de realizar a replicação no hospedeiro, a difusão sistêmica no hospedeiro e a transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.
[00162] As técnicas de inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.
[00163] Além do que foi acima exposto, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, permitindo assim a expressão do cloroplasto.
[00164] É conhecida uma técnica de introdução de sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células de planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados de modo a serem integráveis no genoma do cloroplasto por recombinação homóloga, o que é facilmente realizado por enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um estiramento de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve, por meio de procedimentos de seleção sequencial, para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto após essa seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes referentes a esta técnica são encontrados nas Patentes Norte-americanas Nos. 4,945,050; e 5,693,507 que são aqui incorporadas por referência. Um polipeptídeo pode, então, ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e se integrar á membrana interna do cloroplasto.
[00165] Uma vez que os processos que aumentam o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta podem envolver múltiplos genes que atuam aditivamente ou em sinergia (vide, por exemplo, Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também se refere à expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para assim atingir um efeito superior sobre o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio.
[00166] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela co-introdução de múltiplas construções de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula de planta. A célula transformada pode ser então regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descrito acima.
[00167] Alternativamente, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela co- introdução, em uma única célula de planta. de uma única construção de ácido nucléico, incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes. Essa construção pode ser projetada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico que inclui todas as diferentes sequências de polinucleotídeo exógeno. Para permitir a co-translação dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser interligadas por uma sequência de sitio de entrada de ribossomo interno (IRES) que facilita a translação de sequências de polinucleotídeo posicionadas abaixo da sequência IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto da terminação 5' fechada como das duas sequências IRES internas da molécula de RNA policistrônico para assim produzir, na célula, diferentes polipeptídeos. Alternativamente, a construção pode incluir várias sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.
[00168] A células de planta transformada com a construção que inclui diversos polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.
[00169] Alternativamente, a expressão dos diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela introdução de diferentes construções de ácido nucleico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em diversas plantas. As plantas regeneradas transformadas podem ser então submetidas a cross-breeding e a progênie resultante é selecionada para ter características de maior tolerância ao estresse abiótico, crescimento, biomassa, rendimento, vigor e/ou eficiência no uso de nitrogênio utilizando técnicas convencionais de cruzamento de plantas.
[00170] Conforme acima mencionado e ainda descrito no Exemplo 9 da seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores revelaram que a regulação descendente do nível de expressão do produto de gene BDL127 (a saber, os polinucleotídeos definidos pela SEQ ID NO:17 ou 673 ; ou o polipeptídeo definido pela SEQ ID NO: 67) e/ou do homólogo deste, pode ser utilizada para aumentar o rendimento (por exemplo, o rendimento de semente), o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, a ABST e/ou a NUE em uma planta.
[00171] Em alguns casos, a superexpressão do polinucleotídeo exógeno dentro de uma planta pode resultar no silenciamento do polinucleotídeo endógeno (que é homólogo do polinucleotídeo exógeno), provavelmente por interferência de RNA ou por mecanismos de co-supressão. Para testar o efeito da regulação descendente do(s) polinucleotídeo(s) da invenção sobre a característica desejada da planta (por exemplo, o rendimento da planta, o teor de óleo, a biomassa, o vigor, a ABST ou a NUE), vãrios métodos de regulação descendente e agentes podem ser utilizados.
[00172] A regulação descendente (silenciamento de gene) do produto de transcrição ou translação de um gene endógeno, por exemplo, BDL127, pode ser realizada por métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, co-supressão, supressão antisense, interferência de RNA e polinucleotídeo de moléculas de ribozima, alteração da estrutura do promotor, remoção ou criação de sítios de ligação de fator de transcrição ou expressão sob diferentes promotores. Diretrizes para realizar esses métodos são providas abaixo.
[00173] Co-supressão (supressão sense) - A inibição do gene endógeno pode ser realizada por co-supressão, utilizando uma molécula de RNA (ou um vetor de expressão que a codifica) que é a orientação sense em relação â direção de transcrição do gene endógeno. 0 polinucleotídeo utilizado para a co-supressão pode corresponder a toda ou a parte da sequência que codifica o polipeptídeo endógeno e/ou a toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' da transcrição endógena; pode ser também um RNA não poliadenilado; um RNA que não possui uma estrutura 5' cap; ou um RNA que contêm um in.tron não conectável. Em algumas configurações, o polinucleotídeo utilizado para a co-supressão é projetado para eliminar o códon inicial do polinucleotídeo endógeno, de modo que nenhum produto de proteína será traduzido. No entanto, assim como a supressão antisense, a eficiência supressora é aumentada conforme a especificidade da hibridização é aumentada, ou seja, conforme a sequência introduzida é prolongada e/ou conforme a similaridade da sequência entre a sequência introduzida e o gene endógeno é aumentada. Para mais detalhes, vide os Pedidos de Patente Norte-americana Nos. 20050172364 e 5,231,020, que são aqui incorporados na Integra por referência.
[00174] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotldio exógeno compreende uma sequência não traduzível de ácido nucleico, ou seja, uma sequência compreendendo um ou mais códons de parada pré-maduros ou mutações nonsense, por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-americana 5,583,021.
[00175] De acordo com algumas configurações da invenção, a regulação descendente do gene endógeno é realizada utilizando um vetor de expressão amplicon que compreende uma sequência derivada de vírus de planta que contém todo ou parte do gene alvo, porêm geralmente nem todos os genes do vírus nativo. As sequências virais presentes no produto de transcrição do vetor de expressão permitem que o produto de transcrição direcione sua própria replicação. As transcrições produzidas pelo amplicon podem ser tanto sense como antisense em relação à sequência alvo [vide, por exemplo, Angell and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684; Angell and Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362, e a Patente Norte-americana 6,646,805, individualmente aqui incorporados por referência].
[00176] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência não traduzível de ácido nucleico, por exemplo, uma sequência compreendendo um ou mais códons de parada pré-maduros, ou mutações nonsense, por exemplo, conforme descritas na Patente Norte-americana 5,583,021.
[00177] Supressão antisense - A supressão antisense pode ser realizada utilizando um polinucleotídeo antisense ou um vetor de expressão projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte do RNA mensageiro (mRNA) que codifica o polipeptídeo endógeno e/ou a toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' do gene endógeno. A superexpressão da molécula de RNA antisense pode resultar em expressão reduzida do gene nativo (endógeno). O polinucleotídeo antisense pode ser totalmente complementar à sequência alvo (ou seja, 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ou parcialmente complementar à sequência alvo (ou seja, menos que 100% idêntica, por exemplo, menos que 90%, menos que 80% idêntica ao complemento da sequência alvo). A supressão antisense pode ser utilizada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta (vide, por exemplo, a Patente Norte-americana 5,942,657). Além disso, partes dos nucleotídeos antisense podem ser utilizadas para interromper a expressão do gene alvo. De modo geral, podem ser utilizadas sequências de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos cerca de 200 nucleotídeos, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550, ou mais. Os métodos de utilização da supressão antisense para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e nas Patentes Norte-americanas Nos. 5,759,829 e 5,942,657, individualmente aqui incorporados por referência. A eficiência da supressão antisense pode ser aumentada incluindo- se uma região poli-dT no cassete de expressão em uma posição 3' para a sequência antisense e 5' do sinal de poliadenilação [Vide a Publicação de Patente Norte-americana No. 20020048814, aqui incorporada por referência].
[00178] Interferência do RNA - A interferência do RNA pode ser obtida utilizando-se um polinucleotídeo, que pode realizar anelação com ele próprio e formar um RNA de dupla fita tendo uma estrutura de tronco-loop (também denominada estrutura de grampo), ou utilizando dois polinucleotídeos, que formam um RNA de dupla fita.
[00179] Para a interferência do RNA em grampo (hpRNA), o vetor de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que se hibrideza para formar uma estrutura de grampo que compreende uma região de loop de fita simples e um tronco de par de base.
[00180] Em algumas configurações da invenção, a região de tronco de par de base da molécula de hpRNA determina a especificidade da interferência de RNA. Nessa configuração, a sequência sense da região do tronco de par de base pode corresponder a todo ou a parte do mRNA endógeno para sofrer regulação descendente, ou a uma parte de uma sequência promotora que controla a expressão do gene endógeno a ser inibido; e a sequência antisense da região do tronco de par de base é totalmente ou parcialmente complementar.
[00181] A sequência sense - Essas moléculas de hpRNA são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos, de uma forma herdada por gerações subsequentes de plantas [Vide, por exemplo, Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Pandolfini et al., BMC Biotechnology 3:7; Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140; e a Publicação de Patente Norte-americana No. 2003/0175965; individualmente aqui incorporados por referência].
[00182] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência sense do tronco de par de base varia de cerca de 10 nucleotídeos até cerca de 2.500 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, de cerca de 10 nucleotídeos até cerca de 500 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 15 nucleotídeos até cerca de 300 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 20 nucleotídeos até cerca de 100 nucleotídeos, por exemplo, ou de cerca de 25 nucleotídeos até cerca de 100 nucleotídeos.
[00183] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência antisense do tronco de par de base pode ter um comprimento menor, igual ou maior que o comprimento da sequência sense correspondente.
[00184] De acordo com algumas configurações da invenção, a parte de loop do hpRNA pode variar de cerca de 10 nucleotídeos até cerca de 500 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, de cerca de 15 nucleotídeos até cerca de 100 nucleotídeos, de cerca de 20 nucleotídeos até cerca de 300 nucleotídeos ou de cerca de 25 nucleotídeos até cerca de 400 nucleotídeos de comprimento.
[00185] De acordo com algumas configurações da invenção, a parte de loop do hpRNA pode incluir um íntron (ihpRNA), que é capaz de ser unido na célula hospedeira. O uso de um intron reduz o tamanho do loop na molécula do RNA em grampo após o splicing e, assim, aumenta a eficiência da interferência [Vide, por exemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407:319320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Helliwell and Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295; Brummell, et al. (2003) Plant J. 33:793-800; e as Publicações de Patente Norte-americana No. 2003/0180945; WO 98/53083; WO 99/32619; WO 98/36083; WO 99/53050; US 20040214330; US 20030180945; a Patente Norte-americana 5,034,323; a Patente Norte- americana 6,452,067; a Patente Norte-americana 6,777,588; a Patente Norte- americana 6,573,099 e a Patente Norte-americana 6,326,527; individualmente aqui incorporados por referência].
[00186] Em algumas configurações da invenção, a região de loop do RNA em grampo determina a especificidade da interferência de RNA a seu RNA endógeno alvo. Nesta configuração, a sequência de loop corresponde a todo ou a parte do RNA mensageiro endógeno do gene alvo. Vide, por exemplo, WO 02/00904; Mette, et al., (2000) EMBO d 19:5194-5201; Matzke, et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Devei. 11:221-227; Scheid, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:13659-13662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 99(4):16499-16506; Sijen, et al., Curr. Biol. (2001) 11:436-440), individualmente aqui incorporados por referência.
[00187] Para a interferência de RNA de dupla fita (dsRNA), as moléculas de RNA sense e antisense podem ser expressas na mesma célula a partir de um único vetor de expressão (que compreende sequências de ambas as fitas) ou a partir de dois vetores de expressão (cada um compreendendo uma sequência de uma das fitas). Os métodos de utilização de interferência de dsRNA para inibir a expressão de genes endógenos de planta são descritos em Waterhouse, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964; e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; individualmente aqui incorporados por referência.
[00188] De acordo com algumas configurações da invenção, a interferência de RNA é realizada utilizando-se um vetor de expressão projetado para expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene endógeno de micro RNAs (miRNA). Os micro RNAs (miRNAs) são agentes reguladores que consistem em aproximadamente 22 ribonucleotídeos e que são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos [Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263]. O gene miRNA codifica um RNA que forma uma estrutura de grampo contendo uma sequência de 22 nucleotídeos que é complementar ao gene endógeno alvo.
[00189] Ribozima - As moléculas de RNA catalíticas, as ribozimas, são projetadas para clivar transcrições de mRNA particulares, evitando assim a expressão de seus polipeptídeos codificados. As ribozimas clivam o mRNA em sequências de reconhecimento especificas do sítio. Por exemplo, as "ribozimas cabeça-de-martelo" (vide, por exemplo, a Patente Norte-americana 5,254,678) clivam os mRNAs em locais indicados por regiões de formação de flanco que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. A única exigência é que o RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeo 5'- UG-3'. As sequências da ribozima cabeça-demartelo podem ser embutidas em um RNA estável, por exemplo, um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência da clivagem in vivo [Perriman et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13):6175-6179; de Feyter and Gaudron Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Chapter 43, "Expressing Ribozymes in Plants", Edited by Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, N.J.; Patente Norte- americana 6,423,885]. As RNA endoribonucleases, como aquela encontrada na Tetrahymena thermophila também são ribozimas úteis (Patente Norte- americana 4,987,071).
[00190] Linhas de planta transformadas com qualquer uma das moléculas de regulação descendente conforme descritas acima são selecionadas para identificar aquelas que exibem a maior inibição do polinucleotídeo endógeno ou do polipeptídeo de interesse, e dessa forma, aumentam a característica desejada da planta (por exemplo, o rendimento, o teor de óleo, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a NUE e/ou a ABST).
[00191] Assim, a invenção abrange plantas que expressam exogenamente o(s) polinucleotídeo(s), as construções de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptídeo(s) da invenção. Uma vez expresso dentro de uma célula de planta ou em toda a planta, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente o polipeptídeo, Ensaio Imuno- Absorvente Ligado à Enzima (ELISA), radioimunoensaios (RIA), imunohistoquimica, imunocitoquimica, imunofluorescência e similares.
[00192] O nível de uma molécula de RNA de interesse na planta [por exemplo, o RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno da invenção ou do RNA endógeno que é visado pela molécula de regulação descendente da invenção] pode ser determinado utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, análise por Northern blot, análise por transcrição reversa-reação de cadeia de polimerase (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semi-quantitativa ou em tempo real) e hibridização de RNA-in situ.
[00193] O homólogo endógeno do polinucleotídeo exógeno ou do polipeptídeo da invenção, ou um fragmento do homólogo endógeno (a saber, íntrons ou regiões não traduzidas) na planta pode ser utilizado como um marcador para seleção auxiliada por marcador (MAS), na qual um marcador é utilizado para a seleção indireta de um determinante ou de determinantes genéticos de uma característica de interesse (por exemplo, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, rendimento, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio). Esses genes (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou ser ligados a sítios polimórficos ou marcadores genéticos no genoma, tais como polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP), microsatélites e polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP), impressão digital de DNA (DPP), polimorfismo do comprimento do fragmento amplificado (AFLP), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.
[00194] Exemplos seleções auxiliadas por marcador incluem, entre outras, a seleção de uma característica morfológica (por exemplo, um gene que afeta a forma, a cor, a esterilidade do macho ou a resistência, como a presença ou ausência aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de uma característica bioquímica (por exemplo, um gene que codifica uma proteína que pode ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de armazenamento); seleção de uma característica biológica (por exemplo, raças patogênicas ou biótipos de insetos com base na interação do patógeno hospedeiro ou do parasita hospedeiro, podem ser utilizadas como um marcador, uma vez que a constituição genética de um organismo pode afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).
[00195] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla faixa de plantas econômicas, de forma segura e barata.
[00196] As linhas de planta que expressam exogenamente o poiinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são selecionadas para identificar aquelas que demonstram o maior aumento da característica desejada da planta.
[00197] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo da invenção) ou da molécula de regulação descendente (por exemplo, molécula de interferência de RNA) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.
[00198] Tolerância ao estresse abiático - As plantas transformadas (ou seja, que expressam o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, por exemplo, privação de água, temperatura subideal (baixa temperatura, alta temperatura), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, a condição de estresse por sal, estresse osmótico, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e radiação UV.
[00199] Ensaio de tolerância â salinidade - Espera-se que as plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal demonstrem melhor germinação, vigor ou crescimento da muda com alta concentração de sal. O estresse por sal pode ser atingido de várias formas, por exemplo, por irrigação das plantas com uma solução hiperosmótica, pelo cultivo das plantas hidroponicamente em uma solução de crescimento hiperosmótica (por exemplo, solução de Hoagland), ou pelo cultivo das plantas em um meio de crescimento hiperosmótica [por exemplo, meio de Murashige-Skoog a 50% (meio MS)]. Uma vez que diferentes plantas variam consideravelmente em termos de sua tolerância â salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou da variedade de planta específica, de modo a impor um efeito ameno ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para obter diretrizes sobre a concentração apropriada, vide Bernstein and Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editors) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e suas referências).
[00200] Por exemplo, um teste de tolerância â salinidade pode ser realizado por meio da irrigação das plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão uniforme de sal. Após a exposição â condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até que efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais apareçam nas plantas do tipo selvagem. Assim, o aspecto fenotipico externo, o grau de definhamento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progênie resultante são comparados entre as plantas controle e as transgênicas. Os parâmetros quantitativos da tolerância medida incluem, entre outras, o peso médio úmido e seco, o peso das sementes resultantes, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que apresentam maior biomassa que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.
[00201] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo os ensaios de cloreto de sódio e manitol) são conduzidos para determinar se um fenótipo de estresse asmático era específico ao cloreto de sódio ou se era um fenótipo geral relacionado ao estresse osmótico. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ser mais tolerantes à estiagem e/ou ao congelamento. Para os experimentos de germinação com sal e estresse osmótico, o meio é complementado, por exemplo, com NaC1 50 mM, 100 mM, 200 mM ou com NaC1 100 mM, 200 mM e mannitol 400 mM.
[00202] Ensaio de tolerância à estiagem/ensaio Osmoticum - O ensaio de tolerância à estiagem é realizado para identificar os genes que conferem melhor sobrevida à planta após a privação aguda de âgua. Para analisar se as plantas transg6nicas são mais tolerantes a estiagem, é realizado um estresse asmático produzido pela presença de sorbitol ou polietilenoglicol (PEG 8000) no meio. As plantas controles e as transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de planta-agar por 10 dias; após esse período, as plantas são transferidas para placas contendo até PEG8000 1,5% ou 500 mM de sorbitol. As plantas são cultivadas por um período adicional de aproximadamente 10 dias. O tratamento leva ao retardo do crescimento, e então as plantas controle e as transgênicas são comparadas medindo-se o peso da planta (frasca e seca), o rendimento, e pelas taxas de crescimento.
[00203] Contrariamente, triagens de estiagem baseadas no solo são realizadas com plantas que superexpressam os polinucleotídeos detalhados acima. As sementes das plantas controles Arabidopsis ou de outras plantas transgênicas que superexpressam o polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse por estiagem é obtido depois que a irrigação é interrompida e pela colocação dos vasos em papel absorvente para aumentar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e as controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas controle desenvolve grave definhamento. As plantas são novamente águadas após a obtenção de uma fração significativa das plantas controle que apresenta grave definhamento. As plantas são classificadas comparando-se aos controles para cada um dos dois critérios: tolerância às condições de estiagem e recuperação (sobrevida) após a reidratação.
[00204] Tolerância ao estresse pelo frio - Para analisar o estresse pelo frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período frio, resultando no retardamento do crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas controle e as transgênicas, por meio da medição do peso da planta (úmido e seco), e comparando-se as taxas de crescimento medidas como tempo para o florescimento, tamanho da planta, rendimento, e similares.
[00205] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é atingida expondo-se as plantas a temperaturas acima de 34°C por um determinado período de tempo. A tolerância da planta ê analisada após a transferência das plantas de volta á condição de 22°C para recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas ao estresse pelo frio ou calor.
[00206] Teste de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes das plantas transgênicas que poderia completar o processo de germinação com o percentual de sementes de plantas controle que são tratadas da mesma forma. São consideradas condições normais, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é meio MS 50% (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).
[00207] A germinação é verificada também sob condições desfavoráveis, por exemplo, frio (incubação em temperaturas inferiores a 10°C em vez de 22°C) ou utilizando soluções de inibição de semente que contenham altas concentrações de um osmólito, por exemplo, sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou aplicando-se concentrações crescentes de sal (de NaC1 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM).
[00208] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo da invenção) ou a molécula de regulação descendente (a saber, a molécula de interferência de RNA) sobre a eficiência no uso de nitrogênio pode ser determinado utilizando-se métodos conhecidos.
[00209] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio utilizando pequenas plantas -Resumidamente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7 a 10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementado com um agente de seleção, são transferidas para duas condições de fertilização com nitrogênio: meio MS no qual a concentração combinada de nitrogênio (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (deficiência de nitrogênio). De modo geral, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento de um gene são transferidas para o meio. As plantas são cultivadas por mais 10 dias. Ao final do período de 10 dias, as plantas são retiradas da placa e imediatamente pesadas (peso fresco) e então secas por 24 e novamente pesadas (peso seco para posterior análise estatística). As plantas transgênicas são comparadas as plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas simuladas utilizadas como controle podem ser as plantas transgênicas que expressam o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas contendo somente o mesmo promotor, porém sem qualquer gene repórter.
[00210] Concentração protéica do grão - O teor de proteína do grão (g proteína do grão m-2) é calculado como o produto da massa do grão N (g grão N m-2) multiplicada pela razão de conversão de N/proteína de k-5,13 (Musgoe 1990, supra). A concentração protéica do grão é calculada como a proporção entre teor de proteína do grão por massa unitária do grão (g proteína do grão kg-1 grão).
[00211] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo da invenção) ou a molécula de regulação descendente (a saber, molécula de interferência de RNA) sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando-se métodos conhecidos.
[00212] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento, tais como a área foliar, o comprimento da fibra, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e similares por unidade de tempo.
[00213] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando-se análise digital de plantas em cultivo. Por exemplo, imagens de plantas cultivadas em estufa em base de canteiro podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença de área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.
[00214] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo-se a biomassa da planta produzidas, a área da roseta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por unidade de tempo (pode ser medida em cm2 por dia de área foliar).
[00215] A Área de crescimento relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula I. Fórmula I: Taxa da área de crescimento relativo = (Δ Área / Δt) * (1/ Área t0) Δt é o dia atual da imagem analisada subtraído do dia inicial (t- t0). Assim, a taxa da área de crescimento relativo está em unidades de 1/dia e o taxa de crescimento por comprimento está em unidades de 1/dia.
[00216] Rendimento de semente - A avaliação do rendimento de semente por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (ou seja, numérica) de sementes secas produzidas e colhidas de 8 a 16 plantas e dividida pelo número de plantas.
[00217] Por exemplo, o total de sementes de 8 a 16 plantas pode ser coletado, pesado utilizando, por exemplo, uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O rendimento de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma forma enquanto se leva em consideração a área de cultivo designada a uma única planta. O aumento do rendimento de semente por área de cultivo poderia ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas capazes de crescer em uma determinada área.
[00218] Além disso, o rendimento de semente pode ser determinado pelo peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e fotografadas. Cada amostra é pesada e então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.
[00219] O peso de 1000 sementes pode ser calculado utilizando-se a fórmula II: Fórmula II: Peso de 1000 Semente = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000
[00220] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando-se a Fórmula III. Fórmula III: Índice de Colheita=Rendimento médio de semente por planta/ Peso médio seco
[00221] Comprimento da fibra - O comprimento da fibra pode ser medido por fibrografia. O sistema de fibrografia foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". O comprimento médio da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. A fibrografia mede o comprimento em comprimentos amplos de um determinado ponto percentual (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) cottoninc (dot) com/ClassificationofCotton/?Pg=4# Length).
[00222] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da parte vegetativa da planta. Resumidamente, os lipídeos (óleo) podem ser extraídos da planta (por exemplo, a semente) por trituração do tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo} e extração do óleo em um extrator continuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando-se vários métodos conhecidos, tais como Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003021X (Print) 1558-9331 (Online)]; por Espectroscopia Próxima do Infravermelho (NI), que utiliza a absorção da energia quase no infravermelho (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito na WO/2001/023884, que ê baseado na extração de solvente de óleo, evaporação do solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo, e direcionamento de uma luz no fluxo de gas e de partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.
[00223] Assim, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover o rendimento de cultivos comercialmente desejados (por exemplo, a biomassa de órgão vegetativo tal como a madeira de álamo, ou órgão reprodutor, por exemplo diversas sementes ou biomassa de semente).
[00224] Quaisquer das plantas transgênicas conforme acima descritas ou partes destas podem ser processadas para produzir um alimento, refeição, proteína ou preparação de óleo, por exemplo, para animais ruminantes.
[00225] As plantas transgênicas conforme descritas acima, que apresentam maior teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo à base de plantas (por extração do óleo da planta).
[00226] O óleo ã base de plantas (incluindo o óleo de semente e/ou o óleo da parte vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção, pode ser combinado com uma variedade de outros componentes. Os componentes específicos incluidos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Exemplos de produtos incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos, e matéria-prima para processo de fermentação. Exemplos de produtos a serem incorporados ao óleo ã base de plantas incluem rações animais, alimentos para humanos, tais como, salgadinhos extrudados, pães, como agente ligante de alimentos, rações para aquicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas para praticantes de esportes, barras nutricionais, suplementos multivitaminicos, bebidas dietéticas e cereais.
[00227] De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.
[00228] De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de parte vegetativa.
[00229] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula da planta faz parte de uma planta.
[00230] Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de/aproximadamente" refere-se a ± 10%.
[00231] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui","incluindo", "tendo" e seus conjugados significam "incluindo, entre outros".
[00232] O termo "consistindo em" significa "incluindo exclusivamente".
[00233] O termo "consistindo essencialmente em" significa que a composição, o método ou a estrutura podem incluir outros componentes, etapas e/ou partes, porém somente se os componentes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicados.
[00234] Conforme aqui utilizado, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referencias no plural, a menos que o contexto claramente indique o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir diversos compostos, inclusive misturas destes.
[00235] Em todo este pedido, várias configurações desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa de variação. Deve ser entendido que a descrição no formato de faixa de variação é meramente para fins de conveniência e simplicidade e não deve ser considerada uma limitação inflexível do escopo da invenção. Assim, a descrição de uma faixa de variação deve ser considerada como tendo revelado especificamente todas as possíveis sub-faixas, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa de variação, por exemplo de 1 a 6, deve ser considerada como tendo especificamente revelado sub-faixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da faixa.
[00236] Sempre que uma faixa numérica for aqui indicada, significa que esta inclui qualquer numeral citado (fração ou integral) dentro da faixa indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicativo e um segundo número indicativo e "variando/varia de" um primeiro número indicativo "até" um segundo número indicativo, são aqui utilizadas de forma intercambiável e devem incluir o primeiro e o segundo número indicados e todas os números fracionados e integrais entre eles.
[00237] Conforme aqui utilizado, o termo "método" refere-se as maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, entre outras, aquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por técnicos das áreas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.
[00238] Ê apreciado que determinadas características da invenção, que são, para fins de clareza, descritas no contexto de configurações separadas, também podem ser providas em combinação em uma única configuração. Contrariamente, diversas características da invenção, que são, para simplificar, descritas no contexto de uma única configuração, também podem ser providas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada ou conforme adequado em qualquer outra configuração descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias configurações não devem ser consideradas características essenciais dessas configurações, a menos que a configuração seja inoperante sem esses elementos.
[00239] Várias configurações e aspectos da presente invenção conforme descritos acima e conforme reivindicados na seção de reivindicações abaixo, têm apoio experimental nos seguintes exemplos.
[00240] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui utilizados têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um técnico no assunto ao qual a invenção se refere. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritas possam ser utilizados na prática ou no teste de configurações da invenção, exemplos de métodos e/ou materiais são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo as definições, deverá prevalecer. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser necessariamente limitativos.
EXEMPLOS
[00241] Será feita agora referência aos seguintes exemplos que, acompanhados das descrições acima, ilustram algumas configurações da invenção de forma não limitativa.
[00242] De modo geral, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são completamente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme definidas nas Patentes Norte-americanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic e Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman e Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e na literatura científica, vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos aqui incorporados por referência como se fossem integralmente aqui definidos. Outras referências gerais são providas em todo este documento. Acredita-se que esses procedimentos sejam bem conhecidos na técnica e sejam providos para conveniência do leitor. Toda informação aqui contida é aqui incorporada por referência.
EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENE E PREDIÇÃO DO PAPEL DO GENE UTILIZANDO FERRAMENTAS DE BIOINFORMATICA
[00243] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos que podem aumentar o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, a tolerância ao estresse abiático, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou o vigor de uma planta, como segue.
[00244] Os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeo aqui utilizados foram de bases de dados disponíveis ao público ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, Cevada e Sorghum). Os dados de sequência de 100 diferentes espécies de planta foram introduzidos em uma única e abrangente base de dados. Outras informações sobre a expressão do gene, anotação de proteína, enzimas e vias também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas
[00245] Genoma Arabidopsis [TAIR genome version 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/)]; Genoma do arroz [IRGSP build 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (dot) dna (dot) affrc (dot) go (dot) 7plIRGSP/)]; Álamo [Populus trichocarpa release 1.1 from JGI (assembly release v1.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) genome (dot) jgi-psf (dot) org/)]; Brachypodium [JGI 4x assembly, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) brachpodium (dot) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, version Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Uva [French-Italian Public Consortium for Grapevine Genoma Characterization grapevine genoma (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) genoscope (dot) cns (dot) fr /) ] ;Feijão em fava [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly ((Hypertext Transfer Protocol://msc (dot) jcvi (dot) org/r_communis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, version Sbil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Genoma parcialmente montado do milho [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (dot) org/].
[00246] As sequências de EST e mRNA expressas foram extraídas das seguintes bases de dados: GenBank versões 154, 157, 160, 161, 164, 165, 166 e 168 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/dbEST/) ;RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/RefSeq/);TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/); Bases de dados de proteínas e vias
[00247] Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/].
[00248] AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/biocyc/index (dot) jsp].
[00249] ENZYME [Hypertext Transfer Protocol: //expasy (dot) org/ enzyme/] .
[00250] Os conjuntos de dados de micromatriz foram baixados de:
[00251] GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
[00252] TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).
[00253] Dados de micromatriz proprietária da Evogene (Vide W02008/122980 para Evogene e o Exemplo 3 abaixo.Informações de QTL e SNPs
[00254] Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) gramene (dot) org/qt1/].
[00255] Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) panzea (dot) org/index (dot) html ] .
[00256] Conjunto de base de dados - foi realizada para construir uma base de dados anotada ampla, rica, confiável e de fácil análise contendo sequências genómicas de mRNA, ESTs DNA disponíveis ao publico, dados de vários cultivos, bem como QTLs de dados de expressão de gene, anotação de proteína e vias, e outras informações relevantes.
[00257] O conjunto de base de dados compreende uma caixa de ferramentas de refinação, estruturação, anotação e análise de genes, permitindo a construção de uma base de dados personalizada para cada projeto de descoberta de gene. As ferramentas de refinação e estruturação de genes permite detectar, de forma confiável, variantes de conexão e transcrições antisense, gerar a compreensão de vários resultados fenotipicos em potencial de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD para análise do genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade cientifica [vide, por exemplo, "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002], e também demonstraram ser mais eficientes no genoma de planta.
[00258] Clustering de EST e montagem de gene - Para o clustering e a montagem de genes de organismos com dados disponíveis da sequência de genoma (arabidopsis, arroz, feijão em fava, uva, brachypodium, álamo, soja, sorgo), a versão LEADS genômica (GANG) foi empregada. Essa ferramenta permite um clustering mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura do gene, bem como eventos alternativos de splicing e transcrição anti-sense.
[00259] Para organismos sem dados completos de sequência de genoma disponíveis, o software de clustering "expressed LEADS" foi aplicado.
[00260] Anotação de gene - Os genes e proteínas previstos foram anotados como segue: foi realizada uma busca em blast [Hypertext Transfer Protocol://blast (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] contra todas as sequências de planta UniProt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/]. Quadros de leitura aberta de cada suposta transcrição foram analisados e ORF mais longo com maior número de homólogos foi selecionado como a proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas por InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/interpro/] .
[00261] Blast contra proteínas de AraCyc e bases de dados ENZYME foram utilizadas para mapear as transcrições previstas para via de AraCyc.
[00262] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando algoritmo de blast [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] para validar a precisão da sequência protéica prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.
[00263] Perfil de expressão de gene - Várias fontes de dados foram exploradas para o perfil de expressão de gene que combinou dados de micromatriz e perfil digital de expressão (vide abaixo). De acordo com o perfil de expressão de gene, a análise de correlação foi realizada para identificar genes que são co-regulados em -diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e que estão associados a diferentes fenótipos.
[00264] Conjuntos de dados de micromatriz disponíveis ao público foram baixadas dos sites da TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos dados de recurso mais importantes para identificar genes importantes para rendimento.
[00265] Um resumo de perfil de expressão digital foi compilado para cada cluster de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequência compreendendo o cluster. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe um perfil de expressão virtual com base nas sequências EST que formam o cluster do gene. A ferramenta provê o perfil de expressão de um cluster em termos de anatomia da planta (por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso), estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (provê as condições fisiológicas sob as quais um gene ê expresso, tais como estiagem, frio, infecção por patógenos, etc). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos diferentes clusters, a expressão digital provê um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um cluster ter um total de N ESTs para conter X ESTs de uma certa coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no cluster, b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas e relacionadas, c) o número total de ESTs disponíveis que representam a espécie. Assim, os clusters com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.
[00266] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) in: Planta & Animal Genomas XVII Conference, San Diego, CA. A análise transcriptómica, baseada na relativa abundância de EST em dados, foi realizada por pirosequenciamento 454 de cDNA representando mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de dupla-fita obtidas de dois genótipos, dois tecidos de fruta (polpa e casca) e quatro estágios de desenvolvimento foram sequenciados. O pirosequenciamento GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas resultaram em 1.150.657 tags de sequância expressos que se montaram em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos em comparação à base de dados Cucurbit Genomics [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) icugi (dot) org/] confirmou a precisão do sequenciamento e da montagem. Os padrões de expressão de genes selecionados corresponderam bem aos seus dados qRT- PCR.
[00267] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados a caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações de genoma total. Os ortólogos e os parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: Os primeiros evoluíram de um ancestral comum por especialização e os outros estão relacionados por eventos de duplicação. Assume-se que os parálogos resultantes de eventos de duplicação de ancestrais provavelmente divergiram em termos de função enquanto que os reais ortólogos são mais prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução.
[00268] Para identificar supostos ortólogos dos genes que afetam o rendimento da planta, o rendimento de óleo, o teor de óleo, o rendimento de semente, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a tolerância ao estresse abiático e/ou a eficiência no uso de nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas utilizando a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool [Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local]). Tentou-se agrupar as sequências suficientemente similares. Esses supostos ortólogos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como sendo uma representação das relações de evolução entre a taxa biológica. Os supostos grupos ortólogos foram analisados quanto â sua concordância com o filograma e em casos de desacordos esses grupos ortólogos foram devidamente quebrados. Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos padrão, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram perfil similar de expressão através do desenvolvimento com regulação ascendente em estágio específico, tal como o estágio de preenchimento da semente) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que apresentam perfil similar de expressão em todos os seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, tais como a semente). As anotações de todos os ESTs em cluster para um gene foram analisadas estatisticamente por comparação com sua frequência no cluster versus sua abundância na base de dados, permitindo a construção de um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é denominado "expressão digital". A justificativa de utilizar esses dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotipica de QTLs, SNPs e correlação de expressão de fenótipo é baseado na suposição de que ortólogos reais são prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução. Esses métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações em similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades no nível de sequência - aminoácidos idênticos nos domínios de proteína e similaridade em perfis de expressão.
[00269] No total, 50 genes foram identificados como tendo um impacto importante sobre o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico (ABST) e/ou a eficiência no uso de nitrogênio (NUE) quando expresso em uma planta. Os genes identificados, seu polinucleotídeo organizado e as sequências polipeptídicas, bem como suas sequências atualizadas de acordo com a base de dados Genbank são apresentados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Polinucleotídeos identificados que afetam o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
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[00270] Tabela 1: São apresentados os genes identificados, sua anotação, organismo e polinucleotídeo e identificadores de sequência polipeptidica. Observe que as SEQ ID NOs:716-719 e 724-741 são variantes dos polinucleotídeos identificados e as SEQ ID NOs:720-723 e 742-754 são variantes dos polipeptídeos identificados.
EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM O RENDIMENTO DE SEMENTE, 0 RENDIMENTO DE ÓLEO, A TAXA DE CRESCIMENTO, 0 TEOR DE ÓLEO, A SIOMASSA, O VIGOR, A AEST E/OU A NUE DE UMA PLANTA
[00271] A busca e identificação de genes homólogos envolve a triagem das informação de sequência disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, tais como a base de dados de DNA do Japão (DDSJ) , Genbank, e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) ou versões destas ou a base de dados MIPS. Diversos diferentes algoritmos de pesquisa foram desenvolvidos, incluindo entre outros, o conjunto de programas denominado programas BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetados para filas de sequência de nucleotídeo (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e dois projetados para filas de sequência protéica (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Esses métodos envolvem o alinhamento e a comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula a identidade de sequência percentual e realiza a análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização da análise BLAST está disponível ao público através do National Centre for Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia]. Outros softwares ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para descobrir o alinhamento de duas sequências completas que aumentam o número de correspondências e reduzem o número de gaps.
[00272] Esses genes homólogos podem pertencer à mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada utilizando a análise de similaridade da sequência. Para realizar essa análise, pode-se utilizar programas padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de junção de vizinhança das proteínas homólogas aos genes nesta invenção pode ser deleções e/ou inserções de nucleotidio em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e tendo atividade biológica e funcional similar às do ácido nucleico não modificado do qual são derivados.
[00273] Os genes identificados em base de dados de sequências disponíveis ao público por compartilharem alta homologia de sequência aos genes da arabidopsis aqui identificados, são resumidos na Tabela 2 abaixo. Os genes supostos a aumentar o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a ABST e/ou a NUE de uma planta foram identificados a partir das bases de dados utilizando o software BLAST (BLASTP e TBLASTN) e são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Polinucleotídeos e polipeptídeos homólogos
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[00274] Tabela 2: São apresentados polinucleotídeos e polipeptídeos que são homólogos aos polinucleotídeos ou polipeptídeos identificados da Tabela 1. Observe que as seguintes sequências polipeptídicas são 100o idênticas: A SEQ ID NO:201 é idêntica à SEQ ID NO:204; a SEQ ID NO:409 é idêntica à SEQ ID NO:410; a SEQ ID NO:411 é idêntica à SEQ ID NO:412; a SEQ ID NO:456 é idêntica à SEQ ID NO:463; a SEQ ID NO:458 é idêntica à SEQ ID NO:462; a SEQ ID NO:472 é idêntica à SEQ ID NO:474; a SEQ ID NO:479 é idêntica à SEQ ID NO:482; a SEQ ID NO:514 é idêntica à SEQ ID NO:516; a SEQ ID NO:522 é idêntica à SEQ ID NO:545; a SEQ ID NO:600 é idêntica à SEQ ID NO:604, 606 e 608; a SEQ ID NO:602 é idêntica à SEQ ID NO:607 e 609; a SEQ ID NO:610 é idêntica à SEQ ID NO:611; a SEQ ID NO:620 é idêntica ã SEQ ID NO:643; a SEQ ID NO:622 é idêntica à SEQ ID NO:630, 634, 650 e 65; a SEQ ID NO:629 é idêntica A SEQ ID NO:632; a SEQ ID NO:637 é idêntica à SEQ ID NO:640 e 641; a SEQ ID NO:644 é idêntica à SEQ ID NO:646; a SEQ ID NO:648 é idêntica à SEQ ID NO:649; a SEQ ID NO:650 é idêntica à SEQ ID NO:651; a SEQ ID NO:624 é idêntica à SEQ ID NO:625.
EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PRODUÇÃO UTILIZANDO A MICROMATRIZ INTEGRAL DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA DE ARABIDOPSIS 44K
[00275] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotido de Arabidopsis thaliana produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot)com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotido de matriz representa aproximadamente 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetadas com base nos dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e das bases de dados de Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e componentes de rendimento ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características de planta de 15 diferentes ecotipos de Arabidopsis foram analisados. Dentre eles, nove ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html].
[00276] Procedimentos experimentais Extração de RNA - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo a raiz, folha, flor em antese, semente 5 dias após o florescimento (DAF) e semente 12 DAF, representando diferentes características da planta, foram amostradas e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) invitrogen (dot) com/content (dot) cfm?pageid=459]. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu um Set ID conforme resumido na Tabela 3 abaixo.
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[00277] Tabela 3. São apresentados os conjuntos experimentais de transcriptom de Arabidopsis (A-E). DAF = dias após o florescimento.
[00278] Aproximadamente 30 a 50 mg de tecido foram retirados das amostras. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pistilo e cadinho em nitrogênio líquido e ressuspenso em 50011l de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100111 de clorofórmio foram adicionados, seguido de precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol 75%. 0 RNA foi aluído em 304 de água sem RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza com minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante.
[00279] Componente de rendimento e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor - oito de nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (a saber, A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por canteiro, foram cultivadas em estufa sob condições de controle a 22°C; adicionou-se 20:20:20 (razões de peso) de fertilizante de N:P:K [nitrogênio (N), fósforo P e potássio K]. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados durante o estágio de muda de plantas cultivadas em cultura do tecido em placas de agar transparentes com crescimento vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagem digital.
[00280] Imagem digital em cultura do tecido - Um sistema de captura de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluía 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para a captura de imagens de pequenas plantas semeadas em placas de &gar quadradas.
[00281] Imagem digital em estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera com uma lente de comprimento focal de 24 mm (Canon EF series), colocada em um cavalete de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores cerradas em vasos brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os vasos brancos tinham formato quadrado corn medidas de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.
[00282] Foi utilizado um sistema de análise de imagem que consistia em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem baseado em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padráo Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00283] Análise da folha - Utilizando análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número, a área, o perímetro, o comprimento e a largura da folha. No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de cada canteiro dos blocos A, E e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e introduzidas entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como, área total da folha, comprimento laminar etc.) foram calculados a partir das imagens (Figuras la-d). A circularidade do limbo foi calculada como a largura laminar dividida pelo comprimento laminar.
[00284] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de agar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 2 dias, começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento da raizes foi documentado (Figuras 2a-b). A taxa de crescimento foi calculada de acordo com a fórmula I conforme descrita acima [Taxa da área de crescimento relativo = (Δ Área / Δt) * (1/ Área t0)).
[00285] Análise da taxa de crescimento vegetativo - A taxa de crescimento foi calculada dividindo-se a área adicionada (Δ Área) pelo número de dias para cada intervalo (Δt). A análise foi concluída com o aparecimento de plantas sobrepostas. A taxa de crescimento foi calculada de acordo com a Fórmula IV. Fórmula IV: Taxa de crescimento - ΔÁrea / Δt.
[00286] Para comparação entre os ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas reais. No casos em que as plantas com B folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), somente a maior amostra foi escolhida e acrescentada ã comparação Anova.
[00287] Sementes em análise de síliquas - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletadas de cada canteiro nos blocos D e E. As síliquas escolhidas eram marrom claras, porém ainda intactas. As síliquas foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto digital em alta resolução foi tirada de cada canteiro. Utilizando as imagens, o número de sementes por síliqua foi determinado.
[00288] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as serventes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00289] Percentual de óleo nas sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Sementes Columbia de 3 canteiros foram misturadas e trituradas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como solvente. A extração foi realizada por 30 horas sob aquecimento médio de 50°C. Quando a extração estava concluída, o n- Hexano foi evaporado utilizando o evaporado a 35°C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator 'Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingier's) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a NMR de Baixa Ressonância. 0 teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinada utilizando a NMR de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00290] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada canteiro foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas era verde-amarelas e foram coletadas das partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.
[00291] Peso seco e rendimento de semente - No dia 80 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 30°C em uma câmara de secagem; rendimento de semente por planta = peso total da semente por planta (g) .
[00292] Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado utilizando a Fórmula V. Fórmula V: Rendimento de óleo da semente = Rendimento de semente por planta (g) * % de óleo na semente.
[00293] Índice de colheita - 0 indice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula III conforme descrito acima [índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta/peso médio seco] .
[00294] Resultados experimentais
[00295] Nove diferentes ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados para 18 parâmetros (nomeados como vetores). Os parâmetros de dados estão resumidos na Tabela 4 abaixo. Tabela 4 Parâmetros correlacionados da Arabidopsis (vetores)
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[00296] Tabela 4. São apresentados os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (IDs de correlação Nos. 1-18).
[00297] Os valores caracterizados estão resumidos nas Tabelas 5 e 6 abaixo.
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[00298] Tabela 5. São apresentados os parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: Rendimento de semente por planta (cm); rendimento de óleo por planta (mg); % óleo por semente; peso de 1000 sementes (g); matéria seca por planta (g); índice de colheita; área total da folha por planta (cm); sementes por síliqua; comprimento da síliqua (cm).
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[00299] Tabela 6. São apresentados os parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: crescimento vegetativo = taxa de crescimento vegetativo (cmz/dia) até 8 folhas reais; crescimento relativo da raiz = crescimento relativo da raiz (cm/dia); comprimento da raiz, dia 7 (cm); comprimento da raiz, dia 13 (cm); peso fresco por planta (g) no estágio de brotação; comprimento da lamina = comprimento da lamina (cm); Largura da lâmina = Largura da lâmina (cm); Largura/comprimento da folha; circularidade do limbo.
[00300] As Tabelas 7 a 9 abaixo apresentam os genes selecionados, os parâmetros caracterizados (que são utilizados como eixo x para correlação) e o transcriptom de tecido correlacionado com o valor de correlação (R, calculado utilizando a correlação de Pearson) . Tabela 7 Genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom
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[00301] Tabela 7. São apresentados os genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom. Vet. Corr. = Vetor de Correlação; Conj. Exp. = conjunto experimental. Tabela 8 Genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom
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[00302] Tabela 8. São apresentados os genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom. Vet. Corr. = Vetor de Correlação; Conj. Exp. = Conjunto Experimental. Tabela 9 Genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom
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[00303] Tabela 9. São apresentados os genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom. Vet. Corr. = Vetor de Correlação; Conj. Exp. = Conjunto Experimental.
[00304] As Tabelas 10 e 11 abaixo apresentam dados sobre o homólogo de genes selecionados, os parâmetros caracterizados (que são utilizados coma o eixo x para correlação) e o transcriptom de tecido correlacionado com o valor de correlação (R, calculado utilizando a correlação de Pearson). Tabela 10 Homólogos de genes selecionados de Arabidopsis e sua correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom
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[00305] Tabela 10. São apresentados os homólogos de genes selecionados de Arabidopsis e sia correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/oi componentes de vigor entre diferentes conjintos de transcriptom. Vet. Corr. = Vetor de Correlação; Conj. Exp. = Conjinto Experimental. Tabela 11 Homólogos de genes selecionados de Arabidopsis e sia correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/oi componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom
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[00306] Tabela 11. São apresentados homólogos de genes selecionados de Arabidopsis e sia correlação com o rendimento (rendimento de semente, rendimento de óleo, teor de óleo), biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptom. Vet. Corr. = Vetor de Correlação; Conj. Exp. = Conjunto Experimental.
EXEMPLO 4 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BTNÂRlOS PARA A EXPRESSÃO DA PLANTA
[00307] Para validar seu papel no aperfeiçoamento do teor de óleo, do rendimento da planta, do rendimento de semente, da biomassa, da taxa de crescimento, da ABST, da NUE e/ou do vigor, genes selecionados foram superexpressos em plantas, como segue.
Estratégia de clonagem
[00308] Os genes listados no Exemplo 1 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta (ORF) de comprimento total foi primeiro identificado. No caso de clusters ORF-EST e em alguns casos jâ publicados, as sequências de mRNA foram analisadas para identificar todo o quadro de leitura aberta por comparação dos resultados de vários algoritmos de translação a proteínas conhecidas de outra espécie de planta. Para clonar os cDNAs de comprimento total, a transcrição reversa (RT) seguida da reação em cadeia de polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído de folhas, flores, síliquas ou outros tecidos de plantar cultivadas sob condições normais. 0 RNA total foi extraído conforme descrito no Exemplo 2 acima. A produção de cDNA e a amplificação de PCR foram realizadas utilizando protocolos padrão descritos (Sambrook J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) e bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Os produtos da PCR foram purificados utilizando o kit de purificação por PCR (Qiagen). No caso em que toda a sequência de codificação não foi encontrada, o kit RACE da Ambion (RACE = _R_apid A ccess to cDNA E nds) foi utilizado para acessar toda a transcrição de cDNA do gene da amostra de RNA conforme descrito acima. 0 procedimento RACE foi realizado para os genes BDL-108 (SEQ ID NO:726), EDL-110 (SEQ ID NO:728) e BDL- 111 (SEQ ID NO:730) utilizando as sequências de primers listadas na Tabela 12 abaixo. Os produtos do RACE foram clonados em vetor de alta cópia seguido de sequenciamento. As informações do procedimento RACE foram utilizadas para clonagem de todo o comprimento ORF dos genes correspondentes. Tabela 12 Primers RACE utilizados para sequenciamento dos genes identificados da invenção
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[00309] Tabela 12. São apresentados os primers PCR utilizados para o sequenciamento RACE. Fwd = primer forward; Rev = primer reverso;
[00310] Caso o DNA genâmico tenha sido clonado, como no caso do gene BDL119, o gene foi amplificado por PCR direta em DNA genômico extraído do tecido de folha utilizando o kit DNPeasy (Qiagen Cat. No. 69104).
[00311] De modo geral, 2 conjuntos de primers foram sintetizados para a amplificação de cada gene de um cDNA ou de uma sequência genômica; um conjunto externo de primers e um conjunto interno (primers PCR em ninho). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação PCR não resultou em um produto satisfatório para o sequenciamento), outro primer (ou outros dois) dos primers PCR em ninho foram utilizados. A Tabela 13 abaixo apresenta primers utilizados para a clonagem de genes selecionados.
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[00312] Tabela 13. São apresentados os primers PCR utilizados para a clonagem dos genes descritos na Tabela 12 acima. Fwd primer forward; Rev - primer reverso; Em ninho = primer em ninho para PCR (primer interno); Externo - primer externo para PCR.
[00313] O sequenciamento dos produtos PCR amplificados foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Para facilitar a clonagem dos cDNAs/ sequências genâmicas, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada ao 5' de cada primer. A extensão do primer inclui um sitio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a). O sítio não existia na sequência de cDNA; e (b). Os sítios de restrição nos primers forward e reverso foram projetados de modo que o CDNA digerido seja inserido na formação sense no vetor binário utilizado para a transformação.
[00314] Os produtos da PCR foram digeridos com as endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com o projeto dos sítios nos primers (Tabela 13 acima) e clonados em vetores binários de acordo com a Tabela 14 abaixo. Os produtos do RACE foram sequenciados conforme descrito abaixo para BDL108, BDL 110 e BDL111. Tabela 14 Sítios de enzima de restrição sites utilizados para clonar os genes identificados em vetor binário
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[00315] Tabela 14.
[00316] Cada produto de PCR digetido foi inserido em um vetor de plasmidio pBlue-script KS de alta cópia [vetor de plasmidio pElue-script KS, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) stratagene (dot) com/manuals/212205 (dot) pdf] ou em plasmídios originados desses vetores. Nos casos em que o vetor de alta cópia pGXN (originado do pBlue-script KS) foi utilizado, o produto de PCR foi inserido acima do terminador NOS (SEQ ID NO:776) originado do vetor binário pBI 101.3 (Aquisição do GenBank No. U12640, nucleotídeos 4356 a 4693, SEQ ID NO:776) e abaixo do promotor 35S. Em outros casos (pKSJ_6669a), o promotor At6669 (SEQ ID NO:775) já foi clonado no pBluescript KS, de modo que o gene foi introduzido abaixo do promotor (Tabela 15 abaixo). Em todos os casos, após a confirmação da sequência dos genes clonados, o cDNA clonado acompanhado ou não do terminador NOS, foi introduzido no vetor binário pGI [pBXYN contendo o promotor 35S CaMV] de acordo com a Tabela 14 acima, por meio da digestão com uma endonuclease de restrição adequada. Em qualquer caso, a inserção foi seguida de uma cópia simples do terminador NOS (SEQ ID NO:776). Tabela 15 Genes clonados a partir das bibliotecas cDNA ou de DNA genómico em um plasmidio de número de alta cópia
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[00317] Tabela 15: Genes clonados e sintéticos são apresentados com os identificadores de sequência de seus polinucleotídeos e polipeptídeos. São também providos o organismo, o tecido e os vetores de clonagem de origem.
[00318] Os produtos digeridos e o vetor de plasmidio linearizado foram ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça). O plasmídio pPI foi construído pela inserção de uma sequência de sinal poli-(A) sintético, originário do vetor de plasmídio básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-4811) no sítio de restrição Hindill do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Acc. No. U12640). 0 pGI (Figura 3) é similar ao pPI, porém o gene original na backbone, o gene GUS, foi substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (SEQ ID NO:776) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). 0 pGI foi utilizado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 February 1985); SEQ ID NO:777.
[00319] As sequências de DNA selecionadas foram sintetizadas por um fornecedor comercial, a saber, GeneArt, GmbH [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) geneart (dot) com/)]. O DNA sintético é projetado em silico. Sítios de enzimas de restrição adequados foram adicionados as sequências clonadas na terminação 5' e na terminação 3' para permitir a posterior clonagem no pBXYN binário abaixo do promotor CaMV 35S (SEQ ID NO: 777).
[00320] Otimização de genes para expressão em plantas dicotiledôneas - Para otimizar a sequência de codificação (design in silica), foram utilizadas Tabelas de uso de códon calculadas a partir dos transcriptoms de planta [um exemplo dessas Tabelas pode ser encontrado na base de dados de uso de codon disponível online no endereço Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) ou (dot) jp/codon/]. As sequências de codificação otimizadas foram projetadas de modo que nenhuma alteração fosse introduzida na sequência de aminoácido codificada (de polipeptídeos selecionados da Tabela 1, Exemplo 1), enquanto o uso de códons era preferido para a expressão em plantas dicotiledôneas, principalmente Arabidopsis, tomate, canola e soja, enquanto se evita códons raros da Arabidopsis; bem como plantas monocotiledôneas, tais como o milho. Essas sequências otimizadas promovem melhor velocidade de translação e, portanto, maiores níveis de expressão de proteína. Os genes para os quais as sequências sintéticas (artificiais) otimizadas de cõdon foram preparadas são: BEL--113 (SEQ ID NO:663 polinucleotídeo, SEQ ID NO:57 polipeptídeo), BDL-127 (SEQ ID NO:673 polinucleotídeo, SEQ ID NO:67 polipeptídeo), BDL-129 (SEQ ID NO:675 polinucleotídeo, SEQ ID NO:69 polipeptídeo), BEL-130 (SEQ ID NO:676 polinucleotídeo, SEQ ID NO:712 polipeptídeo), RDL-134 (SEQ ID NO:680 polinucleotídeo, SEQ ID NO:74 polipeptídeo), BDL-137 (SEQ ID NO:683 polinucleotídeo, SEQ ID NO:77 polipeptídeo), BDL-139 (SEQ ID NO:684 polinucleotídeo, SEQ ID NO:78 polipeptídeo) , BDL-141 (SEQ ID NO:685 polinucleotídeo, SEQ ID NO:79 polipeptídeo).
[00321] Diversas sequências de polinucleotídeo dos genes selecionados foram clonadas abaixo do promotor CaMV 35S (SEQ ID NO:777), o promotor At6669 da Arabidopsis (SEQ ID NO:775) ou o promotor específico da semente de Napin (SEQ ID NO:778).
[00322] O promotor de Napin (SEQ ID NO:778), que se origina da Brassica napus, é caracterizado por uma atividade de promotor específica da semente [Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309]. O promotor de Napin foi amplificado por PCR direta em DNA genômico extraído do tecido de folha [utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104)] utilizando os seguintes primers de PCR: Napin F Hindlll 5'- ATAAGCTTATTGATTCCTTTAAAGACTTATGTT (SEQ ID NO:993) e Napin R Sall 5'- TCGTCGACGGGTGTATGTTTTTAATCTTGTTT (SEQ ID NO:994). Um exemplo de um gene clonado abaixo da sequência promotora de Napin é BDL65 (SEQ ID NO:700).
[00323] Para 9 genes, a saber, BDL52, BDL67, BDL95, BDL100, BDL108, BDL110, BDL111, BDL119 e BDL130, a translação de proteína da sequência de cDNA amplificada não correspondeu ã previsão de bioinformática inicial das sequências protéicas. As sequências polipeptidicas codificadas pelo clonado e seus identificadores de sequência são as seguintes: BDL52 (SEQ ID NO:713), BDL67 (SEQ ID NO:714), BDL95 (SEQ ID NO:715), BDL100 (SEQ ID NO:707), BDL108 (SEQ ID NO:708), BDL110 (SEQ ID NO:709), BDL111 (SEQ ID NO:710), BDL119 (SEQ ID NO:711) e BDL130 (SEQ ID NO:712). Observe que é previsto que o gene BDL119 é um RNA não codificador (ou seja, um RNA regulador). O polinucleotídeo BDL119 foi clonado a partir de um DNA genômico e o BDL119 cDNA é provido na SEQ ID NO:667.
EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS ARABIDOPSIS QUE EXPRESSAM OS POLINUCLEOTÍDEOS IDENTIFICADOS DA INVENÇÃO Materiais e Métodos Experimentais
[00324] Transformação da planta - A Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas To) foram transformadas de acordo com o procedimento Floral Dip [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6) : 735-43; and Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Female reproductive tissues are the primary targets of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123(3): 895904] com pequenas modificações. Resumidamente, as plantas Arabidopsis thaliana Columbia (Colo) To foram semeadas em vasos de 250 ml preenchidos com mix de crescimento úmido ã base de turfa. Os vasos foram cobertos com folha de papel alumínio e uma cobertura plástica, mantidos a 4°C por 3 a 4 dias, e então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24°C em ciclos de 16/8 horas de luz/escuro. As plantas Ta estavam prontas para a transformação seis dias antes da antese.
[00325] Colónias únicas de Agrobacterium carregando os vetores binários contendo os genes de óleo de semente foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L) . As culturas foram incubadas a 28°C por 48 horas sob vigorosa agitação e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os grânulos compreendendo células de Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação que continha meia potência (2,15 g/L) de Murashige-Skoog (Duchefa); benzilaminopurina 0,044 1.1M (Sigma); 112 pg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); sacarose a 5%; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água bidestilada em pH de 5,7.
[00326] A transformação de plantas To foi realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o tecido da planta acima do solo ficasse submerso por 3 a 5 segundos. Cada planta To inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja plástica, e então coberta com uma tampa de plástico transparente para manter a umidade e foi mantida no escuro em temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas em uma estufa por 3 a 5 semanas até que as síliquas estivessem marrons e secas, e então as sementes foram colhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiente até a semeadura.
[00327] Para gerar plantas transgénicas T1 e T2 contendo os genes, as sementes coletadas de plantas Ta transgênicas tiverem a superfície esterilizada por embebimento em etanol a 70% por 1 minuto, seguida do embebimento em hipoclorito de sódio a 5% e triton a 0,05% por 5 minutos. As sementes com superfície esterilizada foram totalmente lavadas em água destilada estéril e então colocadas em placas de cultura contendo meia potência de Murashig- Skoog (Duchefa); sacarose a 2%; ágar de planta a 0,8%; canamicina 50 mM; e carbenicilina 200 mM (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas e então transferidas para uma sala de crescimento a 25°C por mais uma semana de incubação. As plantas Arabidopsis T1 vitais foram transferidas para placas de cultura fresca para mais uma semana de incubação. Após a incubação, as plantas T1 foram retiradas das placas de cultura e plantadas em mix de crescimento contido em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa até a maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e cresceram até a maturidade assim como as plantas T2 sob as mesmas condições de cultivo e crescimento das plantas T1 .
EXEMPLO 6 IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS PROMOTORES
[00328] Os promotores constitutivos permitem a expressão continua de genes assim regulados através da planta. Um exemplo amplamente utilizado de um promotor constitutivo é o promotor CaMV35S de vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO:777).
[00329] Uma das exigências importantes de uma planta geneticamente modificada é a ativação do gene de interesse no tecido ou órgão correto e/ou no momento apropriado (por exemplo, um determinado estágio de desenvolvimento, sob certas condições ambientais). Por exemplo, para influenciar um único tecido, por exemplo, a semente, o gene de interesse pode ser induzido para expressão (ativado) e um certo estágio de desenvolvimento, por exemplo, a fertilização pré-embrião, a pós-fertilização, a embriogênese inicial ou tardia. Por exemplo, para melhorar o rendimento e/ou o teor de óleo de uma planta, a expressão do gene de interesse pode ser regulada por um promotor tendo um padrão de expressão apropriado para o desenvolvimento da semente. Assim, a combinação de um gene alvo com promotores específicos, por exemplo, o promotor específico do desenvolvimento (por exemplo, semente, carpelo, caule, muda) pode aumentar o efeito desejado do gene (ou seja, aumentar o rendimento e/ou o teor de óleo) e pode evitar a influência indesejada do gene sobre outros processos biológicos em outros tecidos, por exemplo, a estrutura celular ou a arquitetura da planta.
[00330] Os presentes inventores isolaram e validaram os novos promotores específicos de desenvolvimento de diferentes estágios de desenvolvimento da planta e/ou dos tecidos da planta, tendo diferentes níveis de expressão do gene. A descrição a seguir resume o processo de seleção e clonagem dos novos promotores de Arabidopsis.
[00331] Clonagem e análise de promotores - Os novos promotores de Arabidopsis da invenção foram selecionados com base no perfil de expressão dos genes nativos posicionados abaixo (3') das sequências promotoras (vide a Tabela 16 abaixo). Tabela 16 Perfil de expressão com base na análise de micromatriz
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[00332] Tabela 16. São apresentados os resultados de um perfil de expressão de micromatriz de genes (Aquisições do GenBank NOs.) posicionados em 3' dos promotores identificados. São mostrados a especificidade do tecido dos promotores e os níveis normalizados de expressão de cada gene no tecido específico.
[00333] A Tabela 17 abaixo provê os identificadores de sequência dos novos promotores da invenção com os identificadores de sequência dos genes e os polipeptídeos codificados então posicionados abaixo dos novos promotores da invenção. Tabela 17 Identificação de novos promotores
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[00334] Tabela 17. São apresentados os promotores identificados, seu comprimento e os identificadores de sequência com os genes encontrados abaixo dos promotores.
[00335] Construção do promotor: construção de ácido nucleico de fusão GUS para análise do padrão de expressão dos promotores identificados - Para clonagem de cada uma das sequências promotoras, são projetados dois conjuntos de primers que abrangem as sequência promotoras previstas. A sequência curta do promotor foi amplificada utilizando uma sequência de primer 3' selecionada próxima do códon inicial da sequência de codificação do gene abaixo (localizado abaixo das sequências promotoras) e uma sequência de primer 5' selecionada a partir da sequência abaixo do gene superior adjacente. A longa sequência do promotor estava utilizando uma sequência de primer 3' selecionada a partir do início da região não traduzida (5'UTR) do gene abaixo do promotor e uma sequência de primer 5' localizada 3 kb acima do primer 3' (Vide a Tabela 18 abaixo). Cada uma das sequências promotoras foi fundida de forma translacional à sequência de codificação GUS (um gene repórter).
[00336] Todas as sequências foram amplificadas por PCR. Os produtos da PCR foram purificados utilizando o kit de purificação Mini Elute PCR (Qiagen) e o sequenciamento dos produtos amplificados da PCR foi realizada utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Para facilitar a clonagem das sequências promotoras, uma extensão de 8 a 12 bp foi adicionada ao 5' de cada primer. A extensão do primer inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição são selecionados utilizando dois parâmetros: a.) o sítio não existe na sequência promotora. b.) os sítios de restrição nos primers forward e reverso são projetados de modo que o DNA genômico digerido seja inserido na formação sense no vetor binário utilizado para a transformação. Por exemplo, o vetor de plasmídio pGI foi construído pela inserção de uma sequência de sinal poli-(A) sintético, originária do vetor de plasmídio básico pGL3 (Promega, Acc. No. U47295; bp 46584811) no sítio de restrição HindIll do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Ace. No. U12640) e do gene GUS-Íntron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). Outro vetor de plasmídio utilizado para a clonagem foi o pMBLArt (Gleave AP. Plant Mol Biol. 1992 Dec;20(6):1203-7).
[00337] Os produtos da PCR digeridos foram primeiro subclonados no pBlue-script KS [(originário do vetor de plasmídio pBlue-script KS www.stratagene.com/manuals/212205.pdf)] seguido da clonagem no vetor binário pGI com o gene GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990) e o terminador NOS originário do vetor binário pBI 101.3 (Aquisição GenBank No. U12640; GI:529333 nucleotídeos 4356 a 4693, SEQ ID NO:776). Alguns dos produtos da PCR eram primeiro pBlue-script KS subclonados [(originários do vetor de plasmídio pBlue-script KS www.stratagene.com/manuals/212205.pdf)] com o gene GUS- Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990) e o terminador NOS originário do vetor binário pBI 101.3 seguido da clonagem de todo o cassete no vetor binário pMBLArt (de acordo com a Tabela 19). 0 produto da PCR digerido e o vetor de plasrnidio linearizado foram ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça). Os primers utilizados para a clonagem são mostrados na Tabela 18. Tabela 18 Primers utilizados para a clonagem dos novos promotores
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[00338] Tabela 18.
[00339] A Tabela 19 abaixo apresenta os vetores de clonagem utilizados para clonar cada um dos promotores identificados.
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[00340] Tabela 19: São apresentadas as designações de promotor (identificadores de sequência são mostrados na Tabela 17 acima) e os vetores utilizados para sua clonagem. "V" indica que o promotor foi clonado no vetor mencionado.
[00341] As construçdes foram transformadas em plantas Arabidopsis conforme descrito no Exemplo 5 acima e a análise da expressão baseada no monitoramento do nível de expressão do gene GUS (coloração GUS) foi realizada essencialmente conforme descrito em Jefferson RA. et. al. 1987 EMBO J 6 (13), 3901-3907; e Meissner et. al. 2000 Plant Journal 22 (3), 265274.
[00342] O nível de coloração GUS foi determinado de acordo com a intensidade da cor azul. A Tabela 20 abaixo mostra o nível de coloração da coloração GUS.
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[00343] Tabela 20: O índice de intensidade da cor azul.
[00344] A Tabela 21 abaixo descreve o padrão de expressão dos promotores clonados.
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[00345] Tabela 21. "pM" ou "pMBL" refere-se ao vetor binário pMBLArt que inclui o promotor CaMV35S (SEQ ID NO:777). "Y" ou "GI" refere-se ao intron GUS. "N" refere-se ao terminador NOS. pMBL_GI serve como controle positivo. PrBDL40 = SEQ ID NO:779 (L) ; PrBDL39 = SEQ ID NO: 789 (L)) ; PrBDL35 = SEQ ID NO:791 (L)
[00346] Esses resultados demonstram que os novos promotores da invenção são capazes de direcionar a expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira em um tecido especifico e/ou de forma específica ao estágio de desenvolvimento.
EXEMPLO 7 DESEMPENHO APRIMORADO DA PLANTA TRANSGÊNICA
[00347] Para analisar o efeito da expressão dos polinucleotídeos isolados em plantas, as plantas foram cultivadas em vasos com uma quantidade adequada de nutrientes e água. As plantas foram analisadas quanto ao seu tamanho total, taxa de crescimento, tempo até a emergência da inflorescéncia (brotação) e florescimento, rendimento de semente, peso de 1000 sementes, matéria seca e índice de colheita [(HI) rendimento de semente/matéria seca]. O desempenho das plantas transgênicas é comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas simuladas com um vetor vazio ou que expressa o gene repórter uidA (GUS-fntron) sob o mesmo promotor foram utilizadas como controle.
[00348] Os parâmetros foram medidos conforme descrito no Exemplo 3 acima.
[00349] Análises etatísticas - Dados sobre a taxa de crescimento da planta, área da planta, tempo até o broto, tempo até a flor, peso de 1000 sementes, rendimento de semente, rendimento de óleo, matéria seca e índice de colheita área, foram analisados utilizando o teste t. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados do mix de eventos de transformação ou de eventos independentes foram analisados. Para a análise gene versus controle, o teste t foi aplicado, utilizando significância de p < 0,1. 0 pacote de software estatístico JMP foi utilizado (versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) .
Resultados experimentais
[00350] As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram testadas quanto a diversas características comercialmente desejadas. A Tabela 22 provê os parâmetros medidos em um ensaio de cultura de tecido (os resultados são apresentados na Tabela 23).
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[00351] Tabela 22. RGR = taxa de crescimento relativo.
[00352] Análise de plantas no ensaio de cultura de tecido - A Tabela 23 abaixo ilustra as analises de rendimento de semente em plantas que superexpressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação dos promotores constitutivos 35S (SEQ ID N0:777) ou At6669 (SEQ ID NO:775). Nos casos em que um determinado evento aparece mais que uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes.
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[00353] Tabela 23. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média é maior que "1", o efeito de expressão exógena do gene é um aumento da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima;"Ev" = evento.
[00354] Ensaios em estufa - As tabelas 25, 26 e 27 representam experimentos que foram realizados utilizando ensaios em estufa. A Tabela 24 especifica os parâmetros que foram medidos nos ensaios em estufa e que sao apresentados nas Tabelas 25, 26 e 27. Nos casos em que um determinado evento aparece mais que urna vez, o evento foi testado em diversos experimentos independentes .
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[00355] Tabela 24.
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[00356] Tabela 25. "P" = Valor-P; "Av" = Proporção entre as medias do evento e controle. Note-se que quando a proporção media ó maior que "1" o efeito da expressão exógena do gene sofre um aumento do traço desejado; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na tabela 24 acima; "Ev" = evento.
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[00357] Tabela 26
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[00358] Tabela 27
EXEMPLO 8 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DA PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES DE ESTRESSE ABIÔTICO E DEFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO EM ENSAIO DE CULTURA DE TECIDO
[00359] Ensaio 1: Crescimento da planta sob estresse osmótico [poli(etilenoglicol) (PEG)] sob condições de cultura do tecido - Uma das consequência da estiagem é a indução do estresse osmótico na área em volta das raízes; portanto, em muitos estudos científicas, PEG (por exemplo, PEG8000 1,5%) é utilizado para simular as condições osmóticas de estresse semelhantes ã alta osmolaridade encontrada durante o estresse por estiagem.
[00360] As sementes com superfície esterilizada foram cultivadas em meio basal [meio de Murashige-Skoog 50% (MS) complementado com ágar da planta a 0,8% como agente solidificante] na presença de canamicina (para seleção somente de plantas transgênicas). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e então cultivadas a 25°C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Neste ponto de tempo, mudas escolhidas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo PEG 1,5%: meio MS 0,5 ou condições normais de crescimento (meio MS 0,5). Cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicatas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos independentes de transformação foram analisados de cada construção. As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.
[00361] Ensaio 2: Crescimento da planta com deficiência de nitrogênio sob condições de cultura do tecido - Os presentes inventores descobriram que o ensaio de eficiência no uso de nitrogênio (NUE) é relevante para a avaliação dos genes candidatos ABST, uma vez que a deficiência de nitrogênio estimula o alongamento da raiz, o aumento da cobertura da raiz e permite a detecção do potencial da planta em gerar um melhor sistema de raízes sob condições de estiagem. Além disso, há indicações na literatura de que os mecanismos biológicos da NUE e a tolerância à estiagem estão ligados (Wesley et al., 2002 Journal of Experiment Botany Vol 53, No.366, pp. 1325) .
[00362] As sementes com superfície esterilizada foram semeadas em meio basal [meio MurashigeSkoog (MS) a 50% suplementado com &gar de planta a 0,8% como agente de solidificação] na presença de canamicina (para seleção somente de plantas transgênicas). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e então cultivadas a 25°C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Neste ponto de tempo, mudas escolhidas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para placas com condições de limitação de nitrogênio: meio MS 0,5 no qual a nitrogênio combinada de concentração (NH4NO3 e KNO3) é de 0,75 mM (condições deficientes em nitrogênio). Cada placa contém 5 mudas do mesmo evento, e 3 a 4 diferentes placas (replicatas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro eventos independentes de transformação foram analisados de cada construção. As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas controle (vetor vazio ou repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.
[00363] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que incluía 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para a captura de imagens de pequenas plantas semeadas em placas de &gar quadradas.
[00364] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 a 5 dias, começando no dia 1 até o dia 10-15 (vide, por exemplo, as imagens nas Figuras 2A-B) .
[00365] Foi utilizado um sistema de análise de imagem que consistia em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 (programa de processamento de imagem baseado em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00366] Análise da muda - Por meio de análise digital, os dados da muda foram calculados, incluindo a área foliar, a cobertura de raiz e o comprimento da raiz.
[00367] A taxa de crescimento relativo para os diversos parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes Fórmulas. Fórmula VI: Taxa de crescimento relativo da área foliar = (Δ área da roseta / Δt) * (1/ área da roseta t1) .
[00368] A área da roseta é o intervalo entre a área atual da roseta (medida em t2) e a área da roseta medida no dia anterior (Área t1) .
[00369] Δt pe o intervalo de tempo (t2-t1r em dias) entre o dia atual da imagem analisada (t2) e o dia anterior (t1).
[00370] Assim, a taxa de crescimento relativo da área foliar está em unidade de 1/dia. Fórmula VII:Taxa de crescimento relativo de cobertura da raiz = (Δ área de cobertura da raiz / Δt) * (1/ área de cobertura da raiz t1) . Δ área de cobertura da raiz é o intervalo entre a área de cobertura da raiz atual (medida em t2) e a área de cobertura da raiz medida no dia anterior (Área t1). Lt ê o intervalo de tempo (t2-t1, em dias) entre o dia atual da imagem analisada (t2) e o dia anterior (t1).
[00371] Assim, a taxa de crescimento relativo da área de cobertura da raiz está em undiade de 1/dia. Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = (Δ comprimento da raiz / Δt) * (1/ comprimento da raiz ti) Δ comprimento da raiz ê o intervalo entre o comprimento atual da raiz (medido em t2) e o comprimento da raiz medido no dia anterior (Área t1) Δt é o intervalo de tempo (t2-t1, em dias) entre o dia atual da imagem analisada (t2) e o dia anterior (t1).
[00372] Assim, a taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz está em unidade de 1/dia.
[00373] Ao final do experimento, as pequenas plantas foram retiradas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As pequenas plantas foram então secas por 24 horas a 60°C e novamente pesadas para medição do peso seco da planta para posterior análise estatística. A taxa de crescimento foi determinada comparando-se a cobertura de área foliar, a cobertura da raiz e o comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolve o efeito do gene introduzido no vigor da plantar sob estresse osmático, bem como sob condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob estresse osmótico, bem como sob condições ideais, foi determinado comparando-se o peso seco e o peso fresco das plantas com aqueles das plantas controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada construção criada, 3 a 5 eventos independentes de transformação foram examinados em replicatas.
[00374] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abidticos ou maior arquitetura de raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados com aqueles obtidos das plantas controle. Para identificar os genes e construçóes com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene em relação a um controle, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor de p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos se p -< 0,1. 0 pacote de software estatístico JMP foi utilizado (versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
[00375] Resultados experimentais - As sequências de polinucleotídeo da invenção foram testadas quanto a diversas características comercialmente desejadas. A Tabela 28 provê os parâmetros medidos em um ensaio de cultura de tecido (os resultados são apresentados nas Tabelas 29 e 30). Nos casos em que um determinado evento aparece mais que uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes.
Figure img0074
[00376] Tabela 28.
Figure img0075
Figure img0076
Figure img0077
[00377] Tabela 29. São apresentados os parâmetros de crescimento e biomassa de plantas transgênicas vs. plantas controle, conforme medidos em ensaio de cultura de tecido com PEG 1,5%. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for maior que "1", o efeito da expressão exógena do gene é um aumento da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 28 acima; "Ev" = evento. "p.n." = polinucleotídeo.
Figure img0078
Figure img0079
Figure img0080
[00378] Tabela 30. São apresentados os parâmetros de crescimento e biomassa de plantas transgénicas vs. plantas controle, conforme medidos em ensaio de cultura de tecido com concentração de nitrogênio de 0,75 mM_ "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for maior que "1", o efeito da expressão exógena do gene é um aumento da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 28 acima; "Ev" = evento.
EXEMPLO 9 MELHORANDO AS CARACTERÍSTICAS DE INTERESSE DESEJADAS EM PLANTAS TRANSGÊNICAS CULTIVADAS SOB CONDIÇÕES NORMAIS POR REDUÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE
[00379] As plantas transgênicas que expressam exogenamente o gene BDL127 (SEQ ID NO:673) foram analisadas quanto a diversas características comercialmente desejadas sob normal condições.
[00380] Para analisar o efeito da expressão do polinucleotídeo exógeno BDL127 em plantas transgênicas, as plantas foram cultivadas em vasos com uma quantidade adequada de nutrientes e água. As plantas foram avaliadas utilizando vários parâmetros quanta ao tamanho total (biomassa), estrutura (arquitetura da planta), taxa de crescimento relativo, tempo até a emergência da inflorescência (brotação) e florescimento, rendimento de semente, peso de 1000 sementes, matéria seca, teor de óleo e índice de colheita [(HI) rendimento de semente/matéria seca]. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas simuladas com um vetor vazio ou que expressa o gene repórter uidA (GUS-Intron) sob o mesmo promotor foram utilizadas como controle.
[00381] Os parâmetros foram medidos conforme descrito no Exemplo 3 acima.
[00382] Análises estatísticas - Todos os parâmetros, incluindo os dados de taxa de crescimento da planta, área da planta, biomassa, arquitetura da planta, tempo até a brotação, tempo até o florescimento, peso de 1000 sementes, rendimento de semente, rendimento de óleo, matéria seca e índice de colheita área, foram analisados utilizando o teste t. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados do mix de eventos de transformação ou de eventos independentes foram analisados. Para a análise gene versus controle, o teste t foi aplicado, utilizando limiar de significância de p < 0,1. Resultados experimentais
[00383] As sequências de polinucleotídeo da invenção foram testadas quanto a diversas características comercialmente desejadas. A Tabela 22 apresenta os parâmetros medidos em uma cultura de tecido e ensaios em estufa (os resultados são apresentados nas Tabelas 31 e 32). Nos casos em que um determinado evento aparece mais que uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes.
[00384] Análise de plantas em ensaio de cultura de tecido - A Tabela 31 abaixo ilustra análises de plantas transgênicas que superexpressam o polinucleotídeo BDL127 da invenção sob a regulação do promotor constitutivo 35S (SEQ ID N0:777).
Figure img0081
[00385] Tabela 31. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for menor que "1", o efeito da expressão exógena do gene é uma redução da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima; "Ev" = evento.
[00386] Ensaios em estufa - As Tabelas 33-36 representam experimentos que foram realizados utilizando ensaios em estufa. A Tabela 32 especifica os parâmetros que foram medidos nos ensaios em estufa e que são apresentados nas Tabelas 33-36. Nos casos em que um determinado evento aparece mais que uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes.
Figure img0082
[00387] Tabela 32.
Figure img0083
[00388] Tabela 33. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for menor que "1", o efeito da expressão exógena do gene é uma redução da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima; "Ev" = evento.
Figure img0084
[00389] Tabela 34. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for menor que "1", o efeito da expressão exógena do gene é uma redução da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima; "Ev" = evento.
Figure img0085
[00390] Tabela 35. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for menor que "1", o efeito da expressão exógena do gene é uma redução da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima; "Ev" = evento.
Figure img0086
[00391] Tabela 36. "P" = valor de P; "Av" = razão entre as médias de evento e controle. Observe que quando a razão média for menor que "1", o efeito da expressão exógena do gene é uma redução da característica desejada; "Par" = Parâmetro de acordo com os parâmetros listados na Tabela 22 acima; "Ev" = evento.
[00392] Esses resultados demonstram que a transformação de plantas com o gene BDL127 resulta na redução do rendimento, do rendimento de semente, da biomassa e da taxa de crescimento e, assim, os agentes que fazem a regulação descendente do nível de expressão do gene BDL127 em plantas, por exemplo, agentes de co-supressão, supressão antisense, interferência de RNA, remodelamento da estrutura do promotor e/ou ribozima, podem aumentar o rendimento, o rendimento de semente, a biomassa e a taxa de crescimento de uma planta.
[00393] Os genes aqui identificados melhoram o rendimento da planta em geral, e mais especificamente o rendimento de óleo, o rendimento de semente, o teor de óleo, a taxa de crescimento da planta, a biomassa da planta, as medidas da raiz, a ABST, a NUE e o vigor da planta. O resultado do método de bioinformática aqui descrito é um conjunto de genes altamente previsto para melhorar o rendimento (o rendimento de semente, o rendimento e o teor de óleo, a biomassa) e/ou outros rendimentos agronômicos importantes pela modificação de sua expressão. Embora seja previsto que cada gene tenha seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais que um gene proporcione um efeito aditivo ou sinergistico sobre o rendimento da planta, a taxa de crescimento da planta, as medidas da raiz, a ABST, a NUE, o vigor da planta e/ou o desempenho de outros rendimentos agronómicos importantes. A alteração da expressão de cada gene aqui descrito sozinho ou de um conjunto de genes juntos aumenta o rendimento total da taxa de crescimento da planta, as medidas da raiz, a ABST, a NUE, e/ou o vigor da planta.
[00394] Embora a invenção tenha sido descrita com configurações especificas desta, é evidente que várias alternativas, modificações e variações serão evidentes aos técnicos no assunto. Assim, é objetivo abranger todas essas alternativas, modificações e variações que estão dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.
[00395] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporadas na íntegra por referência na especificação, da mesma forma como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência nesta aplicação não deve ser considerada uma admissão de que a referida referência está disponível como técnica anterior á presente invenção. Até o ponto em que são utilizados, os cabeçalhos de seção não devem ser considerados como necessariamente limitativos.
Conteúdo do CD-ROM
[00396] Segue o conteúdo em arquivo do CD-ROM anexo ao presente e depositado com o pedido. As informações em arquivo são fornecidas como: File name/byte size/date of creation/operating system/machine format. CD-ROM1 (1 arquivo da SEQUENCE LISTINGV[LISTAGEM DE SEQUENCIAS)): 1. 45731 ST25.txt"/ 1,886,208 bytes/21 May 2009/ Microsoft Windows XP Professional/ PC.
Legenda da s Figuras
[00397] Figura 1A
[00398] A) O comprimento da folha é representado pela seta Figura 1B
[00399] B) O comprimento laminar é representado pela seta Figura 1C
[00400] C) A elipse branca representa a área laminar Figura 1D
[00401] D) A largura laminar é representada pela seta Figura 3
[00402] E) Sinal Poli-A
[00403] F) Intron GUS

Claims (16)

1. Método de aumento do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, da tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso do nitrogênio de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender a superexpressão dentro da planta de um polinucleotídeo definido pela sequência de ácido nucleico conforme estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 702, ou 46, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 96, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (ii) SEQ ID NO: 311, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 589, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (iii) SEQ ID NO: 312, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 590, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (iv) SEQ ID NO: 313, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 591, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (v) SEQ ID NO: 314, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 592, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo quando comparado com uma planta nativa da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, aumentando assim o rendimento, taxa de crescimento, a biomassa, vigor, a tolerância ao stress abiótico e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, , caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é definido por uma sequência de ácido nucleico como estabelecida pela SEQ ID NO: 702, 46, 311, 312, 313 ou 314.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é definido pela sequência de ácido nucleico como estabelecida pela SEQ ID NO: 702 ou 46, que codifica o polipeptídeo como estabelecido pela SEQ ID NO: 96, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é definido pela sequência de ácido nucleico como estabelecida pela SEQ ID NO: 702 ou 46.
5. Método de acodo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender o crescimento da planta que superexpressa referido polinucleotídeo sob a referida condição stress abiótico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo para dirigir a transcrição da referida sequência de ácido nucléico numa célula hospedeira.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 779-792.
9. Construção de ácido nucleico caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo isolado definido por uma sequência de ácido nucleicocomo defininda pela (i) SEQ ID NO: 702, ou 46, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 96, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (ii) SEQ ID NO: 311, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 589, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (iii) SEQ ID NO: 312, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 590, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (iv) SEQ ID NO: 313, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 591, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, (v) SEQ ID NO: 314, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 592, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo, e um promotor heterólogo não nativamente associado com dito polinucleotídeo para dirigir a transcrição da referida sequência de ácido nucleico numa célula de planta.
10. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é definido pela sequência de ácido nucleico como estabelecida pela SEQ ID NO: 702, 46, 311, 312, 313 ou 314.
11. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é caracterizado pela sequência de ácido nucleico conforme estabelecido por SEQ ID NO: 702, ou 46, que codifica o polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 96, ou sequências degeneradas que codificam referido polipeptídeo.
12. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é caracterizado pela sequência de ácido nucleico conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 702 ou 46.
13. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor constitutivo.
14. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor induzível por estresse abiótico.
15. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor tecido-específico.
16. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que dito promotor é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID Nos: 779-792.
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