CN101817875A - 一种水稻不定根突出控制基因OsDARE1及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻不定根突出控制基因OsDARE1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了该基因的用途：用于构建转基因水稻。本发明的OsDARE1具有控制水稻不定根发育的功能。

Description

一种水稻不定根突出控制基因OsDARE1及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻OsDARE1(defective in adventitious root emergence)基因的cDNA序列，转基因互补功能实验鉴定该基因控制不定根及植株的发育。

背景技术

从土壤中吸收水分和营养以及锚定是植物根系的两大基本功能；正确的根形态建成对于执行其两大基本功能是必不可少的，而水稻作为研究根系的第二大模式植物，有着更加重要的农业生产意义。全世界有25亿人以水稻作为主要的粮食，全球约有9％的可用耕地用于种植水稻。水稻占人均能量消耗的21％和人均蛋白摄入的15％。相比拟南芥，水稻的主根仅在植株生长的早期发挥作用，而后的生命过程依赖胚后发生的不定根来执行根系的两大基本功能。

水稻属于单子叶禾本科作物，其根系构型为须根系。在种子根发生2到3天后，不定根开始发生。禾本科作物中，不定根在茎上相对比较固定的结构发生，水稻鞘叶节以上各节位，从下位节依次向上位节发生不定根。不定根还会被称为茎生根(shoot-borne root)、冠根(crown root)或者支持根(brace root)(Hochholdinger et al.，2004；Hochholdinger andZimmermann，2008)。

水稻不定根原基来自于根茎结合部邻近维管束的中柱鞘最内层的分生细胞，这些分生细胞通过1到2次的平周分裂形成了原基起始细胞；原基起始细胞的内层细胞通过垂周和平周分裂形成表皮-内皮层、中柱起始细胞，而外层细胞主要通过垂周分裂形成根冠起始细胞；表皮-内皮层通过平周分裂形成表皮和内皮层，根冠以及中柱的起始细胞通过垂周和平周分裂增大组织；内皮层细胞通过一系列不对称得平周分裂形成若干层皮层细胞；根冠起始细胞通过平周分裂形成轴柱，中柱起始细胞则继续通过垂周和平周分裂形成一个圆顶型的结构，在这圆顶型结构中木质部已经清晰可见，与此同时，维管束的细胞逐渐分化成熟，这个时期根形态已清晰可见；初现睨端的原基细胞开始伸长及液泡化；最终，不定根原基突破表皮成为成熟的不定根(Itoh et al.，2005)。

分子水平的研究远不及组织形态学的研究，到目前为止，仅有四个突变体报道影响不定根的发生发育。CRL1/ARL1和CRL4/GNOM1的突变都在不定根原基起始阶段产生缺陷，这两个突变体分别与生长素的信号和转运相关(Inukai et al.，2001；Inukai et al.，2005；Liu etal.，2005；Kitomi et al.，2008；Liu et al.，2009)。WOX11的突变导致不定根原基大量减少，该突变体参与生长素和细胞分裂素信号，并且在不定根发育过程中调控RR2基因的表达(Zhao et al.，2009)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有控制水稻不定根发育的功能的基因及其编码的蛋白质、以及该基因的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻不定根控制基因OsDARE1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻不定根控制基因OsDARE1编码的蛋白质的改进：该蛋白质还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蛋白质的基因：该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

作为本发明的基因的改进：该基因还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻。

本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含上述核酸的转基因植物细胞。

本发明提供了一种用OsDARE1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列的基因片段的载体。

发明人首先通过EMS处理的Kasalath突变体库筛选到水稻不定根缺陷突变体Osdare1，并且克隆了控制不定根发育的OsDARE1基因。DARE1与动物和拟南芥中的CAND1(cullin-associated and neddylation-disassociated)同源性最高。在动物研究中，CAND1蛋白选择性的与未被NEDD8修饰的CUL1结合从而参与泛素连接酶SCF复合体的聚集和解离(Liu et al.，2002；Zheng et al.，2002；Oshikawa et al.，2003)。在拟南芥研究中，该基因突变导致植株矮小、结实率下降、叶脉简化以及对多种植物激素响应异常，但早期的根系生长未受影响，AtCAND1也同样与未被RUB修饰的CUL1互作而调节SCF复合体的聚集和解离(Cheng et al.，2004；Chuang et al.，2004；Feng et al.，2004；Alonso-Peral et al.，2006)。

本发明是首次发现OsDARE1具有控制水稻不定根发育的功能，由于不定根的正常发生发育对维持水稻生长发育以及高产稳产是必不可少的，因此本发明在分子育种中存在较大的应用潜力。

文中提及的参考文献具体如下：

Alonso-Peral，M.M.，Candela，H.，del Pozo，J.C.，Martinez-Laborda，A.，Ponce，M.R.，Micol，J.L.(2006)The HVE/CAND1 gene is required for the early patterning of leaf venationinArabidopsis.Development，133：3755-3766.(基因是拟南芥叶脉形成早期必须的发育，133：3755-3766)。

Cheng，Y.，Dai，X.，Zhao，Y.(2004)AtCAND 1，a HEAT-repeat protein that participates inauxin signaling in Arabidopsis.Plant Physiol，135：1020-1026.(拟南芥AtCAND1编码一个HEAT重复蛋白并且参与生长素信号途径.植物生理，135：1020-1026.)。

Chuang，H.W.，Zhang，W.，Gray，W.M.(2004)Arabidopsis ETA2，an apparent orthologof the human cullin-interacting protein CAND1，is required for auxin responses mediated by theSCF(TIR1)ubiquitin ligase.Plant Cell，16：1883-1897.(拟南芥ETA2基因是人的CAND1的同源基因，通过泛素连接酶复合体SCF(TIR)参与生长素响应.植物细胞，16：1883-1897)。

Feng，S.，Shen，Y.，Sullivan，J.A.，Rubio，V.，Xiong，Y.，Sun，T.P.，Deng，X.W.(2004)Arabidopsis CAND1，an unmodified CUL1-interacting protein，is involved in multipledevelopmental pathways controlled by ubiquitin/proteasome-mediated protein Degradation.Plant Cell，16：1870-82.(拟南芥的CAND1通过与泛素降解途径中未被修饰的CUL1互作参与多条生长发育途径.植物细胞，16：1870-82.)。

Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1994)Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J.6：271-282.(通过农杆菌介导法高效转化水稻及T-DNA边界序列的分析.植物杂志.6：271-282.)。

Hochholdinger，F.，Park，W.J.，Sauer，M.，Woll，K.(2004)From weeds to crops：geneticanalysis ofroot development in cereals.Trends Plant Sci，9：42-48.(从草到作物根系发育的遗传分析.植物学进展，9：42-48.)。

Hochholdinger，F.，Zimmermann，R.(2008)Conserved and diverse mechanisms in rootdevelopment.Curr Opin Plant Biol，11：70-4.(根系发育的保守性及其多样性机制.植物生物学新观点.11：70-4.)。

Inukai，Y.，Miwa，M.，Nagato，Y.，Kitano，H.，Yamauchi，A.(2001)Characterization ofRice Mutants Deficient in the Formation of Crown Roots.Breeding Science，51：123-129.(水稻不定根缺陷突变体的鉴定.育种科学.51：123-129.)。

Inukai，Y.，Sakamoto，T.，Ueguchi-Tanaka，M.，Shibata，Y.，Gomi，K.，Umemura，I.，Hasegawa，Y.，Ashikari，M.，Kitano，H.，Matsuoka，M.(2005)Crown rootless1，which isessential for crown root formation in rice，is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR inauxin signaling.Plant Cell，17：1387-1396.(作为生长素响应因子下游靶基因参与生长素信号途径控制不定根形成.植物细胞.17：1387-1396.)。

Itoh，J.，Nonomura，K.，Ikeda，K.，Yamaki，S.，Inukai，Y.，Yamagishi，H.，Kitano，H.，Nagato，Y.(2005)Rice plant development：from zygote to spikelet.Plant Cell Physiol，46：23-47.(水稻植物发育：从受精卵到开花的发育过程.植物细胞生理.46：23-47.)。

Kitomi，Y.，Ogawa，A.，Kitano，H.，Inukai，Y.(2008)CRL4regulates crown rootformation through auxin transport in rice.Plant Root，2：19-28.(水稻的CRL4通过调控生长素转运调控不定根形成.植物根系.2：19-28.)

Liu，H.，Wang，S.，Yu，X.，Yu，J.，He，X.，Zhang，S.，Shou，H.，Wu，P.(2005)ARL1，aLOB-domain protein required for adventitious root formation in rice.Plant J，43：147-56.(ARL1编码一个LOB结构域的蛋白，是水稻不定根形成所必需的.植物杂志.43：147-56.)

Liu，J.，Furukawa，M.，Matsumoto，T.，Xiong，Y.(2002)NEDD8modification of CUL1dissociates p120(CAND1)，an inhibitor of CUL1-SKP1binding and SCF ligases.Mol Cell，10：1511-1518.((2002)CUL1蛋白的NEDD8修饰会使CUL1-SKP1的结合和SCF连接酶抑制子p120(CAND1)从中解离出来.分子细胞.10：1511-1518.)

Liu，S.，Wang，J.，Wang，L.，Wang，X.，Xue，Y.，Wu，P.，Shou，H.(2009)Adventitiousroot formation in rice requires OsGNOM1 and is mediated by the OsPINs family.Cell Res，19：1110-1119.((2009)OsGNOM1通过OsPINs家族调控水稻不定根的形成.细胞研究.19：1110-1119)。

Oshikawa，K.，Matsumoto，M.，Yada，M.，Kamura，T.，Hatakeyama，S.，Nakayama，K.I.(2003)Preferential interaction of TIP 120A with Cull that is not modified by NEDD8and notassociated with Skp1.Biochem Biophys Res Commun，303：1209-1216.((2003)TIP120A优先和未被NEDD8修饰及未与Skp1互作的Cul1互作.生物化学生物物理研究通讯.303：1209-1216.)。

Zhao，Y.，Hu，Y.，Dai，M.，Huang，L.，Zhou，D.X.(2009)The WUSCHEL-RelatedHomeobox Gene WOX 11Is Required to Activate Shoot-Borne Crown Root Development inRice.Plant Cell，21：736-748.((2009)WUSCHEL相关同源盒基因WOX11是激活水稻茎生不定根发育所必须的.植物细胞.21：736-748)。

Zheng，J.，Yang，X.，Harrell，J.M.，Ryzhikov，S.，Shim，E.H.，Lykke-Andersen，K.，Wei，N.，Sun，H.，Kobayashi，R.，Zhang，H.(2002)CAND1 binds to unneddylated CUL1 andregulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.Mol Cell，10：1519-1526.((2002)CAND1通过与未被NEDD修饰的CUL1互作从而调节泛素连接酶E3复合体SCF的形成.分子细胞.10：1519-1526.)。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。

图1是水稻不定根缺陷突变体Osdare1的表型图；

图1中，a为水稻营养液培养7天的生长情况，左边为野生型(Kas)，右边为突变体(Osdare1)，bar＝2cm；b、c分别为野生型和突变体的根茎结合部细节图，bar＝1mm；d、e分别为野生型和突变体生长两天时鞘叶节不定根原基的生长情况，bar＝50μm；f、g分别为野生型和突变体中完整的不定根原基；

图2是OsDARE1基因在水稻第2染色体上的定位图和dCAPs验证图；

图2中，a是OsDARE1的精细定位结果；b是OsDARE1基因结构；c是突变位点的dCAPS验证；

图3是功能互补实验图；

图3中，a为回复转基因苗生长7天的情况，左一为突变体，右一、二分别为两个独立株系的回复转基因苗，bar＝2cm；b为对a图中的植株进行dCAPs分析；c为对a图中的植株进行southern检测。

图4是回复载体pCAMBIA1300的结构示意图。

具体实施方式

从本实验室发展的EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的籼稻(Oryza Sativa L.ssp indica)地方品种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻不定根发育缺陷突变体Osdare1，该突变体是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体(图1a、b、c)。组织切片分析，发现不定根原基数目没有减少，相比野生型发育无明显迟缓(图1d、e)。不定根原基能分化成典型根结构，仅在不定根原基突破表皮时受阻(图1f、g)。

为了分离OsDARE1基因，本发明采用基因图位克隆方法。首先创建了一个F₂定位群体，由Osdare1的杂合子为母本，野生型粳稻Nipponbare为父本杂交获得的F₂中的隐性个体组成。并利用SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记对OsDARE1位点进行初步定位。定位结果表明，OsDARE1初步定位在第2染色体短臂介于RM1075和RM12507两个标记之间。通过对RM1075和RM12507两个标记之间的BAC序列分析，发展新的STS(Sequence Tagged Site)标记将OsDARE1精确定位于BACOSJNBb0085K21上STS1和RM12521标记之间，该区间大小为26kb(图2a)。我们对该区间的候选基因进行测序分析，发现突变体和野生型的CAND1基因的ORF存在差异，在突变体中，该基因的ORF第533个碱基的T突变成了A(图2b)，从而导致翻译过程提前终止，该点突变已得到dCAPs验证(图2c)。

为了进一步证明突变体突变表型是由OsDARE1的突变引起的。我们对突变体进行了转基因回复验证。利用实验室现有的Kasalath基因组BAC文库，利用特异引物筛选包含全长OsDARE1基因组的BAC克隆，抽提该克隆质粒后经不完全酶切获得包含启动子、编码区以及3’非翻译区的完整的OsDARE1基因组序列(图3a)，该序列被克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300中。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化杂合子愈伤，经T₁代以及T2代转基因苗的遗传分离规律可知转化了OsDARE1的突变体表型回复(图3b、c)。Southern杂交检测证明这两个回复株系为独立的转基因株系(图3d)。上述结果证明了该突变体的确是由于OsDARE1的突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。

上述结果表明，我们克隆的水稻OsDARE1基因具有一定的应用价值，可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、突变体的筛选和表型

以EMS诱变的Kasalath突变体库为突变体筛选对象，M₂种子用蒸馏水冲洗干净，0.6％稀HNO₃破休眠处理16hr，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液(培养液配方为国际水稻所标准配方)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22℃(昼/夜)左右、光照12小时条件下，培养7天，以不定根构型(包括长度、数量等)的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个无不定根的突变体(图1a、b、c)。经过组织学水平的分析发现该突变体不定根原基发育正常，仅在不定根突出时产生缺陷(图1d、e、f、g)，因此该突变体命名为Osdare1(defective in adventitious root emergence 1)。

实施例2、基因定位

F₂定位群体是由杂合子(OsDARE1/Osdare1)和粳稻品种Nipponbare杂交获得的，总共鉴定出186个不定根缺陷表型的F₂个体，采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约2cm水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1.5ml的离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中。每个SSR和STS反应用2μl DNA样品。

在OsDARE1基因的初步定位试验中，对30个F₂个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在7％的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性。

在精细定位OsDARE1基因时，对由186F₂个体组成的群体进行STS分析。根据分子标记RM1075和RM12527之间的日本晴BAC序列和公布的9311序列以及Kasalath BAC末端序列，设计了2个STS分子标记(STS1，STS2)，引物序列为：

STS1U-5’ACTATGAATCAAATGATAGG 3’，STS 1L-5’GATGAGGGTTTTTATTACT 3’；

STS2U-5’TCCTGACCCACATGTCATTG 3’，STS2L-5’CCAGAAAATAAACGGATT 3’。

利用这2个STS分子标记对186个F₂个体进行连锁分析。

实施例3、基因预测和序列分析

根据精细定位的结果，OsDARE1基因位于BAC克隆OSJNBb0085K21上STS2标记附近26kb范围之内(图2a)。根据TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因预测分析，该区间有4个基因。以Kasalath野生型和Osdare1突变体cDNA为模板对候选的4个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现CAND1基因起始密码子ATG后第533bp处的碱基T突变成了A，导致翻译提前终止(图2b、c)。

实施例4，突变体中OsDARE1基因的功能互补验证。

根据OsDARE1基因的序列信息，设计扩增启动子和cDNA的引物，引物序列如下(加下划线的为酶切位点)：

OsDARE1U-5’AAAAcccgggATGGCAAACATGAACATAACCAC 3’

OsDARE1L-5’AAAAgtcgacTTACTCGCTGCGCACCG 3’

OsDARE1promU-5’AAAAagtactAAGCAGTTAGACATTAACCTGTGACA 3’

OsDARE1promL-5’AAAAagtactTTTAGCTAAACCGTATCCAAAAGTCC 3’

分别以Kasalath基因组和Kasalath cDNA为模板扩增OsDARE1基因的启动子以及ORF(Open Reading Frame)序列(即SEQ ID NO：1)，先将扩增的OsDARE1的ORF片段经SmaI和SalI双酶切后与同样经SmaI和SalI双酶切的pCAMBIA1300载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序其序列正确后进行SmaI单酶切和去磷酸化。再将OsDARE1的启动子片段经ScaI单酶切后与前面SmaI单酶切和去磷酸化的载体片段连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取正向阳性克隆，测序验证。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到杂合子OsDARE1/Osdare1中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。该转基因植株中分离的Osdare1突变体表型回复成野生型，说明Osdare1的表型确实是由OsDARE1突变引起的。

该水稻不定根控制基因OsDARE1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

为了检测这两个回复的转基因株系是不是独立株系，进行了Southern杂交检测，剪取叶片按CTAB法提取总DNA，用HindIII酶切后，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，转移到尼龙膜上，用600bp潮霉素基因片段作为探针，使用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒进行探针的标记和杂交检测，结果如图3d，从而证明：这两个转基因株系是独立的转基因株系。

实施例5、水稻转基因

农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。具体过程如下：

水稻成熟胚愈伤组织的准备：

水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中，用70％酒精消毒2min；

倒去酒精，加入25％(v/v)NaClO溶液消毒30min；

倒去NaClO溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min；

倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，种子平放于籼稻成熟胚诱导培养基中，28℃暗培养10天；

在超净工作台上打开培养皿，用镊子将芽和胚乳去掉，留下胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则)，移入籼稻继代培养基中，28℃暗培养5-10天。

农杆菌的培养：

挑取农杆菌单克隆或吸取所保农杆菌菌液100μl于5ml YEP(含50mg/L Kan和50mg/LStr)培养液中，28℃，250rpm振荡培养12-36h至菌液OD600饱和；

从上述饱和的菌液中吸取500μl于30ml YEP含50mg/L Kan和50mg/L Str培养液中，28℃，250rpm振荡培养12-16h至菌液OD600＝0.8-1.5。

共培养及抗性愈伤的筛选：

取培养好的菌液15ml于50ml离心管中，4℃，4000rmp，离心10min，去上清；

用含200μmol/L As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.7；

将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌悬浮液，振荡培养30min；

将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30min；

然后将愈伤组织置于放有一层滤纸的共培养基上；

25℃暗培养2.5天后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡；

再用含250mg/L羧苄青霉素钠的无菌水清洗1-2遍；

最后置于无菌滤纸上沥干2小时；

将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天；

将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素选择培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养14天，此时抗性愈伤组织长出。

抗性愈伤的分化及成苗：

挑取从同一愈伤来的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)；

分化培养30天左右愈伤组织会分化出小苗，当小苗长至3-5cm左右，转入生根培养基中，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)。

转基因苗的锻炼和移栽：

生根14天后，将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，在培养室炼苗2-3天；

洗去琼脂，转入水稻营养液中培养2周，将获得的转基因阳性苗移入大田或盆栽，收种。

所得转基因植株包含SEQ ID NO：1所示序列，并且使得Osdare1不定根以及植株表型回复成野生型。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

atggcaaaca tgaacataac caccatcttg gagaagatga cagggaaaga taaggactac     60

agatatatgg caacttcaga tttgcttagc gaattgaaca aagagggctt caaagctgac    120

caagacatcg agccaaagtt gactactacc gttcttcaac aactggaaga tgcttcagga    180

gatgtctctg gtttagctgt taaatgcttg gctccacttg tcaagaaggt tggtgaggat    240

agggtggtgg agatgaccaa cattctttgt gataagttac tcaatggaaa ggaccaacat    300

cgagacactg ctagtattgc tctgaagaca atcattgtgg aagttacgac aacatcactt    360

gctgaaaaga ttttggtgtc tcttgcccca cagctaatca agggcgccac tgctggaaaa    420

agtgcggaag tgaaatgcga gtgccttgat atattggggg atgtacttca tagatttggc    480

aacttgatca caaaagatca tgatagtatg ctcactgcct tgttatccca gttgagctct    540

aaccaagcaa gtgttaggaa aaagtctatt tcttgcattg catcacttgc tgcatgtctg    600

tctgatgatt tattagccaa ggcaactttt gaggttgtcc agttgcttaa aaatagaagt    660

gcaaagtctg aaattgcccg aacaaatatc cagatgattg gcgctctaag tcgctcggtt    720

ggataccgtt ttgggccaca ccttgctgaa gctgttcctt tgctcataaa ctattgtaca    780

agtgcatcgg aaaatgatga agagctccgt gaatacagct tgcaggccct cgagagtttt    840

atgctgaggt gtccaagaga tatatctcca tattgtgagg gtattttaaa tcttgcattg    900

gaatatataa gctatgatcc aaatttcact gatagcatgg aggaggacac tgatgatgag    960

gctcaggatg aggaagatga tgatgagagc gcaaatgaat acacagatga tgaggatgca   1020

agctggaaag tccggagggc ttcagcaaag tgcttatctg caattatagt atctcgtcct   1080

gaaatgttgt ctaagatgta tctggaggct tgtccaaagt taatcgaacg gtttagggaa   1140

agagaggaaa atgtaaagat ggacatcttt aacacattta ttgagttgtt acgccaaact   1200

ggtaacatga caaaaggaca aggtgacatt gatgagtcta gccctagatg gttgctgaaa   1260

caagaagtac ctaaggttgt caaatccatc aataggcagt tgcgtgaaaa atcaatcaag   1320

acaaaggttg gagcattctc tgtattgaag gagcttgttg ttgtactgcc agactgtctt   1380

gctgatcata ttgggtcact tgttcctggg attgagaagg ctttgaatga taagtcatct   1440

acctccaacc tgaagattga agcccttgta tttacaagac ttgttatggc ttcacattcc   1500

ccagctgtgt ttcatccata catacaggcc ctttctggcc caatattgtc tgctattgga   1560

gacagatatt acaaagtcac cgctgaggct ttaagagtct gtggagagct agttcgtgta   1620

cttcgtccaa attttgaggc acgcactcta gattacaggc catatattgg tccaatctat    1680

aaggctatct tggcccgctt ggcaaatcag gatcaggatc aggaagttaa agagtgtgcc    1740

atatcttgca tgagccttgt ggtattcacg tttggtgatg gtctccaaag ggaactgccg    1800

gcatgccttc ccattcttgt tgatagaatg ggtaatgaaa taactagact tacagcagtt    1860

aaggcgtttg cagtgattgc taaatcacct cttcgcattg atctttcgtg tgtcctagac    1920

catgtcattt ctgagctcac ggctttcctt cgaaaggcaa acagagctct aaggcaggct    1980

acattgggaa cactaaattc tcttgttgtt gcgtatggtg gtcaaattgg atcctcctct    2040

tatgaaacta ttattgctga actttctacg ctcattagtg acatggattt gcatatgact    2100

gctcttgcgc tggaactttg ttgcacgatc atggtcgata gaaaatccat ccaaaatgtt    2160

ggtcttgcag tgaggtacaa ggttttgccc caggccctta ttttgatcag gagtgctctc    2220

ttgcaagggc aggcactaca ggcactgcag agattttttg cttcactggt ccagtctgca    2280

aatacaagct ttgacacttt gttggattct cttatttcta ctgctaaacc atcgcagtca    2340

ggtggacttg ccaaacaagc attgtcttcc attgcacagt gtgttgctgt gttgtgctta    2400

gcagctgggg atcagaagtg tgcctcaact attgaaatgc ttaaaggcat tttaaaagat    2460

gacagcgcta ctaattctgc taaacagcac atggccttgt tatgtttggg agaaattgga    2520

agaaggaagg acctcagcaa tcatgctcaa attgagaata ttgtcattga gtcatttcag    2580

tcaccttttg aggagatcaa atctgcagcg tcatatgctc tcggaaacat tgctgttgga    2640

aatttatcga agtatttgcc ttttatcttg aatcagattg acaaccaaca gaagaaacag    2700

tatctattgc ttcattcact gaaagaggta attgcacggc agtctgttga ccatactggc    2760

cagagtgagc tccaggattc aaacattgag aagattttgg cattgctctt taatcactgt    2820

gaaagtgagg aggaaggagt tcggaatgta gttgcagaat gcttaggcaa aattgctctg    2880

attgaaccta ggaaattaat ccctgctcta aaggaacgca catctagtcc tgctgcaaac    2940

acaagagcta cagttgccat tgctataaaa tattcaattg ttgaacggcc tggaaaaata    3000

gatgaaatta tgtactccga gatttctacc ttcctgatgt tgattaaaga cagtgacagg    3060

cacgtgaggc gtgcagctgt gctggccttg agtacagctg cccacaacaa gccaaatttg    3120

attaagggtc ttcttcctga attattgcct cttttgtatg accaaactgt tgttaagcaa    3180

gaattgatca gaacagttga ccttgggcct ttcaagcatg ttgtggacga tggtcttgaa    3240

ctcaggaaag ctgcctttga atgtgtggat acattgctgg atagctgtct tgatcaagtg    3300

aacccatcat catttatcgt tcctttcctc ttatctggtt taggtgatca ttatgatgta    3360

aaaatgcctt gccatctgat tctctcaaag ctagcagaca agtgcccttc tgctgttctg    3420

gcagttttgg actcattagt tgaccccatt gagaaaacta taaatcacaa acccaagggc    3480

gatgcagtga agcaagaggt tgatcgcaat gaagacatga ttcgaagtgc tcttcgagca    3540

atcgctgctc taagccgcat aagtggtaat gattacagca tgaggttcaa gaatctgatg    3600

aacaagataa tggcctcacc tccgcttgct gacaagtaca actcggtgcg cagcgagtaa    3660

 

SEQ ID NO：2

Met Ala Asn Met Asn Ile Thr Thr Ile Leu Glu Lys Met Thr Gly

Lys Asp Lys Asp Tyr Arg Tyr Met Ala Thr Ser Asp Leu Leu Ser

Glu Leu Asn Lys Glu Gly Phe Lys Ala Asp Gln Asp Ile Glu Pro

Lys Leu Thr Thr Thr Val Leu Gln Gln Leu Glu Asp Ala Ser Gly

Asp Val Ser Gly Leu Ala Val Lys Cys Leu Ala Pro Leu Val Lys

Lys Val Gly Glu Asp Arg Val Val Glu Met Thr Asn Ile Leu Cys

Asp Lys Leu Leu Asn Gly Lys Asp Gln His Arg Asp Thr Ala Ser

Ile Ala Leu Lys Thr Ile Ile Val Glu Val Thr Thr Thr Ser Leu

Ala Glu Lys Ile Leu Val Ser Leu Ala Pro Gln Leu Ile Lys Gly

Ala Thr Ala Gly Lys Ser Ala Glu Val Lys Cys Glu Cys Leu Asp

Ile Leu Gly Asp Val Leu His Arg Phe Gly Asn Leu Ile Thr Lys

Asp His Asp Ser Met Leu Thr Ala Leu Leu Ser Gln Leu Ser Ser

Asn Gln Ala Ser Val Arg Lys Lys Ser Ile Ser Cys Ile Ala Ser

Leu Ala Ala Cys Leu Ser Asp Asp Leu Leu Ala Lys Ala Thr Phe

Glu Val Val Gln Leu Leu Lys Asn Arg Ser Ala Lys Ser Glu Ile

Ala Arg Thr Asn Ile Gln Met Ile Gly Ala Leu Ser Arg Ser Val

Gly Tyr Arg Phe Gly Pro His Leu Ala Glu Ala Val Pro Leu Leu

Ile Asn Tyr Cys Thr Ser Ala Ser Glu Asn Asp Glu Glu Leu Arg

Glu Tyr Ser Leu Gln Ala Leu Glu Ser Phe Met Leu Arg Cys Pro

Arg Asp Ile Ser Pro Tyr Cys Glu Gly Ile Leu Asn Leu Ala Leu

Glu Tyr Ile Ser Tyr Asp Pro Asn Phe Thr Asp Ser Met Glu Glu

Asp Thr Asp Asp Glu Ala Gln Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Ser

Ala Asn Glu Tyr Thr Asp Asp Glu Asp Ala Ser Trp Lys Val Arg

Arg Ala Ser Ala Lys Cys Leu Ser Ala Ile Ile Val Ser Arg Pro

Glu Met Leu Ser Lys Met Tyr Leu Glu Ala Cys Pro Lys Leu Ile

Glu Arg Phe Arg Glu Arg Glu Glu Asn Val Lys Met Asp Ile Phe

Asn Thr Phe Ile Glu Leu Leu Arg Gln Thr Gly Asn Met Thr Lys

Gly Gln Gly Asp Ile Asp Glu Ser Ser Pro Arg Trp Leu Leu Lys

Gln Glu Val Pro Lys Val Val Lys Ser Ile Asn Arg Gln Leu Arg

Glu Lys Ser Ile Lys Thr Lys Val Gly Ala Phe Ser Val Leu Lys

Glu Leu Val Val Val Leu Pro Asp Cys Leu Ala Asp His Ile Gly

Ser Leu Val Pro Gly Ile Glu Lys Ala Leu Asn Asp Lys Ser Ser

Thr Ser Asn Leu Lys Ile Glu Ala Leu Val Phe Thr Arg Leu Val

Met Ala Ser His Ser Pro Ala Val Phe His Pro Tyr Ile Gln Ala

Leu Ser Gly Pro Ile Leu Ser Ala Ile Gly Asp Arg Tyr Tyr Lys

Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Val Cys Gly Glu Leu Val Arg Val

Leu Arg Pro Asn Phe Glu Ala Arg Thr Leu Asp Tyr Arg Pro Tyr

Ile Gly Pro Ile Tyr Lys Ala Ile Leu Ala Arg Leu Ala Asn Gln

Asp Gln Asp Gln Glu Val Lys Glu Cys Ala Ile Ser Cys Met Ser

Leu Val Val Phe Thr Phe Gly Asp Gly Leu Gln Arg Glu Leu Pro

Ala Cys Leu Pro Ile Leu Val Asp Arg Met Gly Asn Glu Ile Thr

Arg Leu Thr Ala Val Lys Ala Phe Ala Val Ile Ala Lys Ser Pro

Leu Arg Ile Asp Leu Ser Cys Val Leu Asp His Val Ile Ser Glu

Leu Thr Ala Phe Leu Arg Lys Ala Asn Arg Ala Leu Arg Gln Ala

Thr Leu Gly Thr Leu Asn Ser Leu Val Val Ala Tyr Gly Gly Gln

Ile Gly Ser Ser Ser Tyr Glu Thr Ile Ile Ala Glu Leu Ser Thr

Leu Ile Ser Asp Met Asp Leu His Met Thr Ala Leu Ala Leu Glu

Leu Cys Cys Thr Ile Met Val Asp Arg Lys Ser Ile Gln Asn Val

Gly Leu Ala Val Arg Tyr Lys Val Leu Pro Gln Ala Leu Ile Leu

Ile Arg Ser Ala Leu Leu Gln Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Gln

Arg Phe Phe Ala Ser Leu Val Gln Ser Ala Asn Thr Ser Phe Asp

Thr Leu Leu Asp Ser Leu Ile Ser Thr Ala Lys Pro Ser Gln Ser

Gly Gly Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ser Ser Ile Ala Gln Cys Val

Ala Val Leu Cys Leu Ala Ala Gly Asp Gln Lys Cys Ala Ser Thr

Ile Glu Met Leu Lys Gly Ile Leu Lys Asp Asp Ser Ala Thr Asn

Ser Ala Lys Gln His Met Ala Leu Leu Cys Leu Gly Glu Ile Gly

Arg Arg Lys Asp Leu Ser Asn His Ala Gln Ile Glu Asn Ile Val

Ile Glu Ser Phe Gln Ser Pro Phe Glu Glu Ile Lys Ser Ala Ala

Ser Tyr Ala Leu Gly Asn Ile Ala Val Gly Asn Leu Ser Lys Tyr

Leu Pro Phe Ile Leu Asn Gln Ile Asp Asn Gln Gln Lys Lys Gln

Tyr Leu Leu Leu His Ser Leu Lys Glu Val Ile Ala Arg Gln Ser

Val Asp His Thr Gly Gln Ser Glu Leu Gln Asp Ser Asn Ile Glu

Lys Ile Leu Ala Leu Leu Phe Asn His Cys Glu Ser Glu Glu Glu

Gly Val Arg Asn Val Val Ala Glu Cys Leu Gly Lys Ile Ala Leu

Ile Glu Pro Arg Lys Leu Ile Pro Ala Leu Lys Glu Arg Thr Ser

Ser Pro Ala Ala Asn Thr Arg Ala Thr Val Ala Ile Ala Ile Lys

Tyr Ser Ile Val Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asp Glu Ile Met Tyr

Ser Glu Ile Ser Thr Phe Leu Met Leu Ile Lys Asp Ser Asp Arg

His Val Arg Arg Ala Ala Val Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ala His

Asn Lys Pro Asn Leu Ile Lys Gly Leu Leu Pro Glu Leu Leu Pro

Leu Leu Tyr Asp Gln Thr Val Val Lys Gln Glu Leu Ile Arg Thr

Val Asp Leu Gly Pro Phe Lys His Val Val Asp Asp Gly Leu Glu

Leu Arg Lys Ala Ala Phe Glu Cys Val Asp Thr Leu Leu Asp Ser

Cys Leu Asp Gln Val Asn Pro Ser Ser Phe Ile Val Pro Phe Leu

Leu Ser Gly Leu Gly Asp His Tyr Asp Val Lys Met Pro Cys His

Leu Ile Leu Ser Lys Leu Ala Asp Lys Cys Pro Ser Ala Val Leu

Ala Val Leu Asp Ser Leu Val Asp Pro Ile Glu Lys Thr Ile Asn

His Lys Pro Lys Gly Asp Ala Val Lys Gln Glu Val Asp Arg Asn

Glu Asp Met Ile Arg Ser Ala Leu Arg Ala Ile Ala Ala Leu Ser

Arg Ile Ser Gly Asn Asp Tyr Ser Met Arg Phe Lys Asn Leu Met

Asn Lys Ile Met Ala Ser Pro Pro Leu Ala Asp Lys Tyr Asn Ser

Val Arg Ser Glu ter(终止密码子)

Claims (6)

1.一种水稻不定根突出控制基因OsDARE1编码的蛋白质，其特征是：该蛋白质具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的水稻不定根突出控制基因OsDARE1编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

3.一种编码如权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征是：所述基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征是：所述基因还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

5.如权利要求3或4所述的基因的用途，其特征是：用于构建转基因水稻。

6.一种转基因植物细胞，其特征是：为包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞。

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