CN117467680A - 一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的应用，涉及基因工程技术领域。包括作为正调控因子在如下(1)‑(5)至少一项中的应用：(1)提高番茄果实的平均大小和重量；(2)提高番茄坐果数目；(3)提高番茄果实产量；(4)提高番茄植株的株高；(5)提高番茄果实的糖含量。本发明通过构建含LecRLK45基因的植物重组过表达载体，并将其转入番茄后得到较野生型有显著高表达的转基因番茄。转基因番茄比野生型植株果实坐果数目显著增多，果实大小和重量显著增加，果实糖含量显著增加。与传统育种方法相比，本发明高效并可稳定遗传地提高了番茄果实的产量和果实的糖含量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的应用。
背景技术
番茄富含抗氧化物质、维生素和多种矿物质，具有丰富的营养价值，是世界上种植最广泛的园艺作物之一，也是广受大众所喜爱的重要蔬菜和水果。番茄果实大小和品质是影响番茄商品价值的关键因素，但传统的育种方法周期长且效果不确定。近年来，随着基因工程的迅速发展和技术的日臻完善，转基因技术在培育优良作物品种方面展示了巨大的潜力。分子标记辅助育种、转基因育种、基因编辑育种等现代分子育种方法的引入为提高番茄的育种效率提供了有效途径。番茄果实的大小和品质均是数量性状遗传，被多个数量性状位点或者基因调控。在目前的研究中，已经鉴定出一些影响番茄果实大小和品质的基因，但依然需要鉴定出更多影响番茄果实大小和品质的基因，以满足番茄多基因聚合育种的需求。此外，能够同时改变番茄果实大小和品质的基因比较少见。本研究通过基因工程的方法，增加了LecRLK45基因在番茄中的表达，获得了基因过表达型的转基因番茄，番茄果实的大小、重量、坐果数目和糖含量发生了显著变化。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的应用。
为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
提供一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45作为正调控基因在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述番茄基因LecRLK45的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及除SEQ ID NO.1以外的编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。
一种番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45作为正调控因子在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
含有番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因的重组表达载体、转基因细胞系或者工程菌在如下(1)-(5)项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述含有番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种同时提高番茄果实产量和品质的方法，使番茄中番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因过量表达。
进一步的，所述使番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因过表达的具体步骤包括：通过外源转入番茄LecRLK45基因；或者上调番茄基因组中原有的LecRLK45基因的表达。
一种培育高产和优质番茄品种的方法，将番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因转入番茄野生型植株中，获得LecRLK45基因过量表达且稳定遗传的番茄植株。
进一步的，将番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因转入野生型番茄中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌浸染法或基因枪法。
本发明的有益效果为：
本发明通过在番茄中过表达凝集素类受体蛋白激酶基因LecRLK45，并构建含LecRLK45基因的植物重组表达载体，将该载体转入番茄后所得转基因番茄阳性植株中LecRLK45基因较非转基因植株有显著更高的表达。转基因番茄植物明显比野生型植株更加健壮，果实大小、重量以及坐果数目显著增加，果实糖含量显著增加。与传统育种方法相比，本发明采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地提高了番茄果实的产量和果实的糖含量，为番茄产量和果实品质改良做出了积极的探索，具有良好的市场前景和经济价值。
附图说明
图1为不同番茄株系在结果期的实物对比图；
图2为不同番茄株系中LecRLK45基因表达量直方对比图；
图3为不同番茄株系在结果期的株高直方对比图；
图4为不同番茄株系果实红熟期实物对比图；
图5为不同番茄株系果实表型特征直方对比图；
图6为不同番茄株系果实糖含量直方对比图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1基因的扩增与克隆
根据番茄凝集素类受体蛋白激酶LecRLK45的cDNA序列为克隆模板，设计引物克隆番茄LecRLK45基因的全长CDS序列，同时根据中间载体8GWN在引物的两端引入同源重组片段，设计上游引物RK16-F，其序列为5'-atacttccaactagtgcggccgcgaaatgtctcctctctttg-3'；设计下游引物RK16-R，其序列为5'-atggtcatcccgggacctgcaggtcgacccatttcgatggtg-3'；
使用RNA提取试剂盒(Reagent)提取番茄叶片总RNA，使用cDNA合成试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)合成得到番茄凝集素类受体蛋白激酶LecRLK45的cDNA序列，以该cDNA为克隆模板，对克隆模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH2O 16.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、25mM MgCl2 2.5μL、dNTP(10μM)1.0μL、100μM的上、下游引物各0.5μL、cDNA模板1.0μL、PrimeSTAR高保真DNA聚合酶0.25μL，共25μL；PCR反应程序为：98℃预变性3分钟；然后98℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃后延伸5分钟。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，扩增获得约2600bp的目的条带，然后将扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化，将纯化的LecRLK45基因全长片段与8GWN载体通过同源重组酶(/>IIOne Step Cloning Kit-C112)进行连接，获得重组质粒8GWN::35S-LecRLK45-GFP。再将上述质粒转化DH5α大肠杆菌后，鉴定阳性克隆，并委托生工生物工程股份有限公司进行测序。结果显示，LecRLK45基因全长为2556bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2LecRLK45基因的重组表达载体的构建
使用Gateway重组克隆技术将实施例1得到的8GWN::35S-LecRLK45-GFP质粒与K303空质粒进行LR克隆，具体步骤包括如下：
20uL的反应体系中，加入8GWN::35S-LecRLK45-GFP质粒150ng、K303空质粒150ng、5×LR Clonase Reaction Buffer 4uL、LR Clonase enzyme mix 4uL、TE缓冲液加至20uL，混匀后25度60min，完成后加入2uL蛋白酶K溶液于37℃保持10min终止反应。然后取5uL反应产物转化DH5α大肠杆菌后，鉴定阳性克隆，并挑选单菌落扩大培养后提取质粒，委托生工生物工程股份有限公司进行测序，如果序列正确即证明K303::35S-LecRLK45-GFP载体构建成功。
实施例3CRISPR-Ca9基因编辑载体的构建
使用CRISPR-P2.0设计工具(http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)分析LecRLK45基因的靶向位点并设计sgRNA，并将其与Cas9VL载体连接，然后导入DH5α大肠杆菌中，挑选阳性单克隆测序验证sgRNA是否与Cas9VL载体连接成功。sgRNA序列如下：RK45-F：5'-aacgcgaacgatccctcacc-3'；RK45-R：5'-ggtgagggatcgttcgcgtt-3'。
实施例4将CRISPR-Ca9基因编辑载体和重组质粒载体K303::35S-LecRLK 45-GFP转化番茄子叶
(1)构建重组表达菌株：取5uL实施例2和实施例3中制备得到的质粒转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，在含有质量分数为1.5％的琼脂、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(pH7.2)中涂板，28±1℃黑暗条件下倒置培养2-3天至长出单菌落，挑取3-5个单菌落做菌落PCR。对K303::35S-LecRLK45-GFP载体用上游引物K303F和下游引物RK-C16-pR进行检测；
K303::35S-LecRLK45-GFP质粒的检测引物序列如下：
上游引物K303F的序列为：5'-cgtcttgcgcactgatttga-3'；
下游引物RK-SC16R的序列为：5'-agtccatagatggttcgtcg-3'；
CRISPR-Ca9基因编辑载体检测引物序列如下：
Cas-F：5'-tggaggaggataaaaagcacgag-3'；
Cas-R：5'-cgataagattaccaaacaggccg-3'；
反应体系为：ddH2O 5.5μL、2×PCR Mix 10μL、10μM的上、下游引物各2μL、菌液0.5μL，反应条件为95度预变性3min，95度变性15s，55度退火30s，72度延伸30s，循环数为25个，72度终延伸5min。
选择阳性菌落用含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基(pH7.2)，在28±1℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD600为1.8-2.0，然后28±1℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3％的蔗糖、pH为5.8的MS培养基100mL重悬，制得农杆菌工程菌液。
(2)用体积分数为75％的酒精浸泡番茄种子1min，无菌水冲洗6次；再用1％(有效氯浓度)的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；无菌水浸泡种子4h，播种于MS固体培养基上，光照培养箱27℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养直至子叶展平，切取已展平的子叶即得普通番茄外植体。
将普通番茄外植体的子叶切下，放置在为3％(w/w)的蔗糖、0.8％(w/w)的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，25℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)预培养1d后置于实施例4制备得到的农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，放回质量分数为3％的蔗糖、质量分数为1％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，在28±1℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3％的蔗糖、质量分数为1％的琼脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1mg/L玉米素、200mg/L替卡西林钠克拉维酸钾、120mg/L阿莫西林钠克拉维酸钾和100mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1℃、光周期16h/d、光照强度3000-5000lx条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽。
将长3-4cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3％的蔗糖、质量分数为1％的琼脂、200mg/L替卡西林钠克拉维酸钾、120mg/L阿莫西林钠克拉维酸钾和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1℃、光周期16h/d、光照强度3000-5000lx条件下培养至生根，即得转基因番茄植株。
实施例5过表达转基因番茄和突变体番茄的筛选
1.过表达转基因番茄阳性植株筛选
提取转基因番茄和野生型番茄的基因组DNA，通过PCR检测LecRLK45基因是否转入番茄植株中。根据载体K303::35S-LecRLK45-GFP中的基因序列，设计如下特异检测引物：
35SF：5'-atgacgcacaatcccactatccttc-3'；
SC16R：5'-agtccatagatggttcgtcg-3'。
20μL的PCR反应体系为：PCR Mix 10μL、5μM的上、下游引物各1μL、模板1.0μL，加ddH2O至20μL。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为35个，72℃终延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，阳性转基因番茄植株的PCR产物在600bp位置出现目标条带。
2.LecRLK45纯合突变体番茄筛选
分别取突变体番茄植株和野生型番茄植株，提取基因组DNA。先用CRISPR-Ca9基因编辑载体检测载体是否已经转入番茄中，检测引物序列如下：
Cas-F：5'-tggaggaggataaaaagcacgag-3'；
Cas-R：5'-cgataagattaccaaacaggccg-3'；
检测方法同实施实例4中CRISPR-Ca9基因编辑载体检测的方法。
再根据LecRLK45基因序列，设计如下番茄突变位点检测引物，检测基因编辑阳性植株番茄LecRLK45基因是否发生突变：
TCRLK45-F：5'-acaccaggtaacaattccaat-3'；
TCRLK45-R：5'-tcctcatacatccacttgaa-3'；
PCR反应体系为：2x Taq PCR Mix 250uL、10uM引物各5uL、基因组模板10ng，用无菌水调至50uL体积。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为35个，72℃终延伸5min，PCR产物片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，出现860bp左右目标条带，然后将PCR产物送测序，检测LecRLK45基因组序列是否发生改变。若发生改变，再重新设计引物扩增突变位点的序列后连接到8GWN载体上进行单克隆测序(方法如实施例1中所述)，再次确认突变发生的类型。再将杂合突变番茄植株经过2代筛选，即可得纯合不含CRISPR-Cas9外源载体的纯合突变体番茄。
3.qPCR检测LecRLK45基因在转基因番茄阳性植株中的表达
根据LecRLK45基因序列和番茄内参基因SlActin序列，设计如下引物：
qRKC45-F：5'-acaagactgaagcaggtccttactt-3；
qRKC45-R：5'-ctgtccaaggtccgctattccaat-3'；
qActin-F：5'-tgggtgtgcctttctgaatg-3'；
qActin-R：5'-gctaagaacgatggacctaatg-3'。
分别取转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株的幼叶，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qRKC45-F和qRKC45-R，qActin-F和qActin-R为引物进行qPCR，检测LecRLK45基因在转基因番茄阳性植株中的表达量，结果如图2所示。
由图2可知，过表达转基因番茄植株(OE-13、OE-15)中LecRLK45基因表达量发生了显著改变。
实施例8过表达转基因番茄阳性植株的表型分析
将野生番茄植株(WT)、实施例5制备的转基因番茄阳性植株(OE-13、OE-15)和实施例6制备的纯合突变体番茄植株(rk45-1、rk45-2)的按常规方法培育至结果，拍摄得到如图1所示的植株实物图，每种植株随机挑选10株；统计得到如图3所示的株高对比直方图；接着继续培养至果实成熟，采集每株植株的红熟期果实，拍摄得到如图4所示的果实实物对比图；统计单个番茄果实的平均重量、单个番茄果实的平均直径、单株番茄平均坐果数目以及单株番茄的果实平均产量得到如图5所示的植株果实表型特征直方对比图，由图4和图5可知，过表达转基因番茄(OE-13、OE-15)的株高、果实大小、单个果实的平均重量和单株果实产量均有显著增加，而突变体植株(rk45-1、rk45-2)则与此完全相反，表明增加LecRLK45基因的表达能够显著提高果实产量。
进一步测量果实的总糖、葡萄糖、蔗糖和果糖含量得到如图6所示的糖含量直方对比图，由图6可知，过表达转基因番茄(OE-13、OE-15)的糖含量显著升高，突变体番茄(rk45-1、rk45-2)的糖含量显著降低，表明LecRLK45基因能够显著提高果实的糖含量，改善果实品质。
综上可知，LecRLK45基因过表达番茄的果实产量和品质均具有显著提升，对番茄产量和品质育种具有显著的经济价值。
Claims (7)
1.一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45作为正调控基因在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述番茄基因LecRLK45的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及除SEQ ID NO.1以外的编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。
2.一种采用权利要求1所述基因编码得到的番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45作为正调控因子在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的重组表达载体、转基因细胞系或者工程菌在如下(1)-(5)项中的应用：
(1)提高番茄果实的平均大小和重量；
(2)提高番茄坐果数目；
(3)提高番茄果实产量；
(4)提高番茄植株的株高；
(5)提高番茄果实的糖含量；
所述含有番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的利用番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK27同时提高番茄果实产量和糖含量的方法，其特征在于，使番茄中番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因相对于野生型番茄过量表达。
5.根据权利要求4所述的利用番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK27同时提高番茄果实产量和糖含量的方法，其特征在于，所述使番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45过量表达的具体步骤包括：通过外源转入番茄LecRLK45基因；或者上调番茄基因组中原有的LecRLK45基因的表达。
6.根据权利要求1所述的利用番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK27同时提高番茄果实产量和糖含量的方法，其特征在于，将番茄凝集素受体样蛋白激酶LecRLK45基因转入番茄野生型植株中，获得LecRLK45基因过量表达且稳定遗传的番茄植株。
7.根据权利要求6所述的利用番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK27同时提高番茄果实产量和糖含量的方法，其特征在于，将番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45转入野生型番茄中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌浸染法或基因枪法。
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