CN110684088A

CN110684088A - 蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用

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Publication number: CN110684088A
Application number: CN201810721970.9A
Authority: CN
Inventors: 邓馨; 刘杨
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: CN110684088B

Abstract

本发明公开了蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用。本发明从玉米中克隆得到一个与抗旱相关的ZmbZIPa3基因。将ZmbZIPa3基因在拟南芥中过表达发现，ZmbZIPa3基因可增加拟南芥植株的根长，提高拟南芥的耐旱性；将ZmbZIPa3基因在玉米中过表达发现，ZmbZIPa3基因可增加玉米植株的根长，提高其耐旱性，同时增加玉米植株的叶宽和穗数。通过实验表明：ZmbZIPa3基因可能通过影响玉米的生长发育，进而提高玉米耐旱性及产量。本发明对于提高植物耐旱性及产量、构建优良转基因植物品种具有重要意义。

Description

蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用。

背景技术

全球有二分之一的土地面积属于干旱或半干旱地区，我国干旱面积也达一半以上，干旱是制约植物的生长发育及产量的主要因素之一。而植物为了对抗干旱也在进化过程中产生了多种机制，以减少其对水分的消耗同时调节其在逆境条件下的生长状况。因此，研究植物的耐旱性及植物耐旱的分子响应机制，具有提高植物的耐旱性，增加各种农作物的产量的实际意义。

玉米作为一种世界范围内普遍种植的粮食作物，不仅用于人类及动植物食用，在制药及其他工业领域也多有应用。由于其产量受干旱影响较大，因此提高其抗旱性及其产量一直以来是人们所研究的重点。对玉米耐旱性分子机理及其产量的研究有助于更好的了解植物的抗旱机制，一方面可以通过分子标记筛选抗旱性更强，产量更高的品系，另一方面也可以通过转基因技术获取耐旱性更强，产量更高的株系用于农业生产，从而提高玉米产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何促进植物生长发育，提高植物的耐逆性和产量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于玉米(Zea mays L.)的ZmbZIPa3蛋白质的新用途。

本发明提供了ZmbZIPa3蛋白质在如下1)-14)任一中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)调控植物生长发育；

3)调控植物产量；

4)调控植物根系生长；

5)调控植物叶宽；

6)调控植物抗旱能力的生理指标；

7)调控植物存活率；

8)调控植物萎蔫率；

9)调控植物光合作用；

10)调控植物果实数量；

11)调控植物花期性状；

12)培育转基因植物；

13)作为分子标记筛选抗旱植物品种；

14)植物育种；

所述ZmbZIPa3蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由161个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质ZmbZIPa3，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质ZmbZIPa3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质ZmbZIPa3的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与ZmbZIPa3蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与ZmbZIPa3蛋白质相关的生物材料在如下1)-14)任一中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)调控植物生长发育；

3)调控植物产量；

4)调控植物根系生长；

5)调控植物叶宽；

6)调控植物抗旱能力的生理指标；

7)调控植物存活率；

8)调控植物萎蔫率；

9)调控植物光合作用；

10)调控植物果实数量；

11)调控植物花期性状；

12)培育转基因植物；

13)作为分子标记筛选抗旱植物品种；

14)植物育种；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmbZIPa3蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ZmbZIPa3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmbZIPa3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmbZIPa3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmbZIPa3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmbZIPa3且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，A2)所述的含有编码ZmbZIPa3的核酸分子的表达盒(ZmbZIPa3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmbZIPa3的DNA，该DNA不但可包括启动ZmbZIPa3转录的启动子，还可包括终止ZmbZIPa3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子和豌豆rbcS E9终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述ZmbZIPa3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体为将上述ZmbZIPa3基因插入pLEELA载体或pU130载体中得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述耐逆性为耐旱性；所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；

所述调控植物抗旱能力的生理指标体现为在干旱条件下调控植物存活率和/或萎蔫率和/或光合作用；

所述调控植物生长发育或调控植物产量体现在调控植物根系生长、存活率、萎蔫率、叶宽、光合作用、果实数量和花期性状。所述调控植物根系生长、存活率、萎蔫率、叶宽、光合作用、果实数量和花期性状具体体现在如下任一一种：增加植物根长，增加植物叶宽，提高植物结穗数量，延迟植物开花时间，提高植物逆境条件下存活率和植物叶绿素荧光fv/fm，降低植物逆境条件下萎蔫率。

所述作为分子标记筛选抗旱植物品种的方法是根据植物材料中ZmbZIPa3基因或ZmbZIPa3蛋白质表达水平的差异筛选抗旱植物品种和/或株系：ZmbZIPa3基因或ZmbZIPa3蛋白质表达水平高的植物材料的抗旱性高于ZmbZIPa3基因或ZmbZIPa3蛋白质表达水平低的植物材料(ZmbZIPa3基因表达量越高，植物材料的抗旱性越高)。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。所述单子叶植物具体可为玉米；所述玉米具体可为玉米C01植株(属PB群)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的培育转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期区别于所述受体植物。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种改变植物耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期的方法。

本发明提供的改变植物耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期的方法包括提高受体植物中ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性，得到耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期优化的植物的步骤。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性。

所述转基因植物的耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期区别于所述受体植物体现在如下(1)-(7)中任一种：(1)转基因植物的耐旱性高于受体植物；(2)转基因植物的总根系发育优于受体植物；(3)转基因植物的存活率高于受体植物；(4)转基因植物的萎蔫率低于受体植物；(5)转基因植物的叶宽大于受体植物；(6)转基因植物的果实数量多于受体植物；(7)转基因植物的开花时间迟于受体植物。

所述耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期优化的植物为耐逆性提高和/或根长增长和/或存活率提高和/或萎蔫率降低和/或叶宽增长和/或果实数量提高和/或开花时间延迟的植物。

上述方法中，所述提高受体植物中ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmbZIPa3蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将ZmbZIPa3蛋白质的编码基因导入受体植物。

在本发明的一个实施方式中，ZmbZIPa3蛋白质的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有ZmbZIPa3蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pLeela35SS::ZmbZIPa3导入受体植物中。所述重组载体pLeela 35SS::ZmbZIPa3为将含有ZmbZIPa3蛋白质的编码基因的DNA片段(序列3)通过同源重组的方法重组至pLEELA载体中，且保持pLEELA载体的其他序列不变后得到的载体。

在本发明的另一个实施方式中，ZmbZIPa3蛋白质的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有ZmbZIPa3蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pU13035SS::ZmbZIPa3导入受体植物中。所述重组载体pU130 35SS::ZmbZIPa3为将ZmbZIPa3基因表达盒(序列4)插入pU130载体的HindⅢ酶切位点间，且保持pU130载体的其他序列不变得到的重组表达载体。

上述方法中，所述ZmbZIPa3蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmbZIPa3基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。所述单子叶植物具体可为玉米；所述玉米具体可为玉米C01植株(属PB群)。

本发明从玉米中克隆得到一个与抗旱相关的ZmbZIPa3基因。将ZmbZIPa3基因在拟南芥中过表达发现，ZmbZIPa3基因可增加拟南芥植株的根长，提高拟南芥的耐旱性；将ZmbZIPa3基因在玉米中过表达发现，ZmbZIPa3基因可增加玉米植株的根长，提高其耐旱性，同时增加玉米植株的叶宽和穗数。通过实验表明：ZmbZIPa3基因可能通过影响玉米的生长发育，进而提高玉米耐旱性及产量。本发明对于提高植物耐旱性及产量、构建优良转基因植物品种具有重要意义。

附图说明

图1为利用RT-PCR技术检测ZmbZIPa3基因在野生型拟南芥(Col-0)及转ZmbZIPa3拟南芥中的表达情况。

图2为转ZmbZIPa3拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)的主根生长表型及主根根长统计结果。

图3为转ZmbZIPa3拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)的抗旱表型及复水后存活率和叶绿素荧光fv/fm统计结果。

图4为转ZmbZIPa3拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)同一生长时期的抽薹表型。

图5为转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米中的ZmbZIPa3相对表达量。

图6为转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米的三叶一心期叶宽表型。

图7为转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米的V1期根系表型及主根根长统计结果。

图8为转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米的抗旱表型及萎蔫率统计结果。

图9为转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米的穗表型及结穗数统计结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pENTR/D-TOPO载体是Invitrogen公司的产品。

下述实施例中的pLEELA载体是Invitrogen公司的产品。

下述实施例中的pU130载体记载于文献“Development of Novel Glyphosate-Tolerant Japonica Rice Lines:A Step Toward Commercial Release.Cui Y,etal.Front.Plant Sci.(2016)7:1218”中，公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；公众也可从中国种子集团有限公司生命科学技术中心获得。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens strainGV3101)：记载于文献“Binary Agrobacterium vectors for plant transformation,MBevanin,Nucleic Acids Research(1984)12(22):8711-8721”中，公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的野生型拟南芥Col-0记载于文献“Arabidopsis,a usefulweed.Meyerowitz EM,Cell(1989):263-270”中，公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、蛋白ZmbZIPa3及其编码基因的获得

1、cDNA的获得

提取三叶一心期玉米(B73自交系)的总RNA，将其反转录为cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

F:5'-CACCAAGCAGCAGCTAGAAAGTAG-3'；

R:5'-CACACAGCACAAGTCCAACAACC-3'。

3、PCR产物的测序

对步骤2获得的PCR产物进行测序。测序结果表明：PCR产物包含大小为486bp的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为ZmbZIPa3基因。ZmbZIPa3基因编码的蛋白的命名为ZmbZIPa3蛋白，ZmbZIPa3蛋白由161个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如序列2所示。

实施例2、转ZmbZIPa3拟南芥的获得及其表型分析

一、转ZmbZIPa3拟南芥的获得

1、重组表达载体的获得

(1)以实施例1步骤1获得的cDNA为模板，采用实施例1中的引物F和引物R进行PCR扩增，得到PCR产物(序列3第21-741位)。该PCR产物包含序列1自5′端第1-486位核苷酸所示的ZmbZIPa3基因。

(2)利用Gateway方法将步骤(1)获得的PCR产物连入中间载体pENTR/D-TOPO中，然后通过同源重组的方法利用Invitrogen公司的Gateway@Enzyme Mix将PCR产物重组至pLEELA载体中，构建得到pLeela 35SS::ZmbZIPa3过表达载体。具体方法参照说明书中的详细步骤。

(3)将pLeela 35SS::ZmbZIPa3过表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR验证，并测序。

测序结果表明：pLeela 35SS::ZmbZIPa3过表达载体为将序列3所示的DNA分子重组至pLEELA载体中得到的载体。其中，序列3第150-635位所示的DNA分子为ZmbZIPa3基因CDS序列。pLEELA载体中成功连入ZmbZIPa3基因。pLeela35SS::ZmbZIPa3过表达载体表达ZmbZIPa3蛋白。

2、重组菌的获得

利用电击法将pLeela 35SS::ZmbZIPa3过表达载体转入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌GV3101/pLeela 35SS::ZmbZIPa3，菌落PCR鉴定后扩大培养。

3、转基因拟南芥的获得

采用拟南芥浸花法(具体步骤参考文献“Clough SJ,Bent AF(1998).Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16,735-743”中的方法)用步骤2得到的重组农杆菌GV3101/pLeela35SS::ZmbZIPa3侵染拟南芥Col-0，得到T₀代转基因拟南芥种子。然后将得到的T₀代转基因拟南芥种子置于含有10μg/mL草胺磷的1/2MS固体培养基上进行阳性苗的筛选，将具有抗性的阳性苗移至培养间培养(培养条件如下：温度22℃，16h光照/8小时黑暗)，得到T₁代转基因拟南芥种子。再将T₁代转基因拟南芥种子置于含有10μg/mL草胺磷的1/2MS培养基固体上培养，选取成活率为3/4(即分离比为3:1)的T₁代成活苗于培养间培养，收获T₂代转基因拟南芥种子。最后将T₂代转基因拟南芥种子置于含有10μg/mL草胺磷的1/2MS固体培养基中，将全部成活的T₂代成活苗移至培养间培养，得到T₃代转基因拟南芥种子(即为纯合株系)，经过培养得到T₃代转基因拟南芥。

4、转基因拟南芥的鉴定

选取步骤3得到的T₃代转基因拟南芥纯合株系(OE 4-6、OE 6-2和OE 8-3)和野生型拟南芥Col-0，分别提取3个转基因株系和Col-0的叶片总RNA，以此为模板，利用引物RT-ZmbZIPa3-F和引物RT-ZmbZIPa3-R以及引物18S-F和引物18S-R(18S基因为内参基因)进行RT-PCR扩增，并进行电泳分析，从而对ZmbZIPa3基因在转基因拟南芥中的表达量进行分析。引物序列如下：

RT-ZmbZIPa3-F：5’-CTCTTCTCCATCTCCACGCT-3’；

RT-ZmbZIPa3-R：5’-CTCCCGGTTCCTCATCATC-3’；

18S-F：5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’；

18S-R：5’-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’。

结果如图1所示，从图中可以看出：野生型拟南芥(WT)中无目的条带，转基因拟南芥OE 4-6、OE 6-2和OE 8-3中均有目的条带，且亮度为OE 6-2>OE 8-3>OE4-6。说明OE 4-6、OE 6-2和OE 8-3均为阳性转ZmbZIPa3拟南芥纯合株系，且ZmbZIPa3基因表达量为OE 6-2>OE 8-3>OE 4-6。

二、转ZmbZIPa3拟南芥的表型分析

植物材料如下：野生型拟南芥Col-0(WT)、T₃代阳性转ZmbZIPa3拟南芥OE 4-6、OE6-2和OE 8-3。

1、先用75％乙醇对植物材料种子处理1min，然后用10％次氯酸钠消毒15min，再用灭菌蒸馏水清洗5遍后于4℃低温处理3天。低温处理后将种子点播于1/2MS固体培养基上，置于22±3℃、50％湿度、16h光照/8h黑暗条件下培养，观察生长表型并统计根长。

结果如图2所示，在培养基中生长8天的幼苗已出现根长不一致表型，根长长度为：OE 6-2>OE 8-3>OE 4-6>WT(统计超过30棵幼苗，发现根长不一致表型显著)，与拟南芥转基因株系中目的基因表达量趋势一致，说明ZmbZIPa3可促进拟南芥的主根生长。

2、取步骤1培养的拟南芥幼苗，选取大小一致的拟南芥转移至土壤中(将营养土：蛭石＝1:2装入八孔穴盘，每穴装土80g，用6L水浸土，充分浸泡4h后倾到多余的水；每穴移苗16株，每4穴为一组，分别为WT、OE 4-6、OE 6-2和OE 8-3)，用保鲜膜保湿，置于22℃，16h光照/8小时黑暗培养，5天后掀膜后继续培养10天，开始进行分组干旱处理。干旱组在停止浇水10天，28天时进行表型观察并照相，随即复水三天观察表型并拍照，同时统计存活率；对照组进行正常浇水，保证其正常生长，于正常浇水10天，28天时观察表型并照相。同时于干旱过程中选取干旱24天为时间点进行叶绿素荧光检测。叶绿素荧光检测的具体步骤参见文献“A rapid,non-invasive procedure for quantitative assessment of droughtsurvival using chlorophyll fluorescence,Plant Methods(2008)4:27”中的方法。

结果如图3所示，A为拟南芥干旱处理10天、28天及复水3天的表型观察结果；B为拟南芥干旱处理28天存活率统计结果；C为拟南芥干旱处理24天的叶绿素荧光fv/fm的测量结果。结果表明，干旱处理10天后观察，对照组及干旱组中野生型拟南芥和转ZmbZIPa3拟南芥幼苗生长基本一致。而在干旱处理24天后测量植物的叶绿素荧光数据发现，对照组中野生型拟南芥和转ZmbZIPa3拟南芥fv/fm基本一致为0.82左右，但干旱组中野生型拟南芥fv/fm显著下降，其幅度明显大于转ZmbZIPa3拟南芥，转ZmbZIPa3拟南芥OE 6-2的fv/fm在干旱处理后基本没有改变，fv/fm数据统计结果分别为OE 6-2：0.843；OE 8-3：0.78；OE 4-6：0.72；WT：0.69；其fv/fm大小为OE 6-2>OE 8-3>OE 4-6>WT，与ZmbZIPa3基因表达量一致，说明ZmbZIPa3基因可在植物干旱过程中保持植物的光系统正常运作。进一步观察干旱处理28天后复水3天的拟南芥植株发现，野生型拟南芥均已死亡，而OE 6-2、OE 8-3和OE 4-6的存活率分别为94％、87％和50％，其存活率大小为OE 6-2>OE 8-3>OE 4-6>WT，此趋势也与ZmbZIPa3基因表达量一致，说明ZmbZIPa3基因过表达植株的抗旱性明显优于野生型拟南芥。

综上所述，说明ZmbZIPa3是与植物抗旱相关的蛋白。

3、同步骤2中对照组植物培养方法培养植物材料WT、OE 4-6、OE 6-2和OE 8-3，观察生长表型并统计拍照。

结果如图4所示，土壤中生长15天的植株已出现抽薹时间不一致表型，统计超过50棵幼苗，发现抽薹期不一致表型显著，说明ZmbZIPa3可延迟拟南芥开花时间。

实施例3、转ZmbZIPa3玉米的获得及其表型分析

一、转ZmbZIPa3玉米的获得

1、重组表达载体的获得

(1)以实施例2中的pLeela 35SS::ZmbZIPa3过表达载体为模板，采用引物F2和引物R2进行PCR扩增，得到ZmbZIPa3基因表达盒。引物序列如下：

F2：5'-CCCAAGCTTGGGTTCCCGCCTTCGGTTTGG-3'；

R2：5'-CCCAAGCTTGGGCCTTGCTCGTCGGTGATGTA-3'。

ZmbZIPa3基因表达盒依次包含pLeela载体上的启动子35SS、ZmbZIPa3基因CDS区即序列表中序列1自5′端第1-486位核苷酸所示的DNA序列和终止子PA35S。ZmbZIPa3基因表达盒的核苷酸序列如序列4所示。

(2)利用HindⅢ(TAKARA)单酶切的方法将ZmbZIPa3基因表达盒插入pU130载体中，构建得到pU130 35SS::ZmbZIPa3过表达载体。

(3)将pU130 35SS::ZmbZIPa3过表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR验证并测序。

测序结果表明：pU130 35SS::ZmbZIPa3过表达载体为将序列4所示的ZmbZIPa3基因表达盒插入pU130载体的HindⅢ酶切位点间，且保持pU130载体的其他序列不变得到的重组表达载体。pU130 35SS::ZmbZIPa3过表达载体表达ZmbZIPa3蛋白。

2、转基因玉米的获得

将测序正确的pU130 35SS::ZmbZIPa3质粒委托中国种子集团有限公司生命科学技术中心进行玉米转化，受体玉米植株为C01植株(属PB群)(购自中国种子集团有限公司生命科学技术中心)。最终得到T1代转ZmbZIPa3玉米，该T1代转ZmbZIPa3玉米为转ZmbZIPa3玉米与其受体野生型玉米测交得到的玉米种子，基因型为Aa：aa＝1：1。

3、转基因玉米的鉴定

将鉴定为T1代Aa的玉米种子进行ZmbZIPa3基因表达量测定。具体步骤如下：分别提取三叶一心期转ZmbZIPa3玉米和野生型玉米叶片的总RNA，以此为模板，利用引物RT-ZmbZIPa3-F和引物RT-ZmbZIPa3-R以及引物18S-F和引物18S-R(18S基因为内参基因)进行实时定量PCR(real-time PCR)扩增，从而对ZmbZIPa3基因在转ZmbZIPa3玉米中的表达量进行分析(引物序列与实施例2中一致)。

结果如图5所示，以野生型玉米(WT)中ZmbZIPa3基因的表达量为基准1，转ZmbZIPa3玉米中ZmbZIPa3基因表达量均大于野生型，分别为229A011b：3.674335；224A015a：4.452845；545A013a：2.920878；224A005a：21.50992；229A002b：1.40944；545A017a：2.318548；224A003a：398.9175；224A001a：160.2144。选取T1代阳性转ZmbZIPa3玉米株系224A003a、224A001a、224A005a和229A011b进行后续实验。

二、转ZmbZIPa3玉米的表型分析

植物材料如下：野生型玉米C01(属PB群)植株(WT)及阳性T1代转ZmbZIPa3玉米株系224A003a、224A001a、224A005a和229A011b。

1、选取大小一致的野生型和T1代转ZmbZIPa3玉米种子置于土壤(营养土：蛭石＝1:2)中在16h光照/8h黑暗的温室中培养，正常培养至三叶一心期，选取植株的第二片叶进行观察并拍照。

结果如图6所示，从图中可以看出：叶宽大小为224A003a>224A001a>224A005a>WT，其叶宽与ZmbZIPa3基因表达量呈正相关，说明ZmbZIPa3基因可促进玉米的叶宽加大。

2、选取大小一致的植物材料种子，利用水培方式在16h光照/8h黑暗条件下培养，观察生长表型并拍照。

结果如图7所示，从图中可以看出：生长8天的幼苗已出现根长不一致表型，根长为224A003a>224A001a>229A011b>WT，与ZmbZIPa3基因表达量趋势一致，说明ZmbZIPa3基因可促进玉米的根系发育。

3、将土壤(营养土：蛭石＝1:1)装入培养盒(35×30×10cm)中，每盒装土4.5kg，选取大小一致的植物材料种子，将其埋入各个培养盒的土壤中进行正常生长，然后将正常生长的三叶一心期玉米进行干旱处理：干旱组在停止浇水20天时(此时干旱组土壤含水量为0)，统计干旱组植物萎蔫率(萎蔫率(％)＝(该株系萎蔫苗数/该株系总苗数)×100％，以植株叶片出现缺水卷缩折叠作为判断整株苗萎蔫的标准)并拍照；对照组进行正常浇水，保证其正常生长，也于同期统计对照组植物萎蔫率并拍照。

结果如图8所示。结果表明，玉米ZmbZIPa3过表达株系的生长状态均优于野生型，说明ZmbZIPa3可提高玉米植株抗旱的能力。

4、将植物材料种子于5月1日栽种于土壤中，并于8月16日观察生长表型、拍照。

结果如图9所示，从图中可以看出：ZmbZIPa3基因过表达株系具有多穗表型，在茎杆中间叶腋间发育形成两个果穗，最先形成的果穗被第二个果穗挤压，使其同玉米茎杆之间的角度变大，甚至角度大于90度。同时过表达玉米的每个茎杆中间叶腋间都有明显的果穗形成，因此说明ZmbZIPa3可促使玉米植株呈多穗表型。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggcggcca actaccacca ctaccagatg gcggtgcacg cggcggcggc ggcggcggcg 60

tggaggaggg agccggacag cccgcagctg agcttcgtga gcgggtgcag ctccctcttc 120

tccatctcca cgctgcagga cgacgacgac gaccgagccg ccgccgtcgt catcgccgcc 180

ggccacgcgc tgccctccac gcccgtctcg ctcgcgggct tcgtcggcga cgaggtcgac 240

atggaggtgc agcaggccag cggcgacgat cggaggagca tcaggatgat gaggaaccgg 300

gagtccgcgc tccgctccag ggccaggaag agggcatacg tggagaacct ggagaaagag 360

gttcgccggc tagtggatga caacttgaag ctcaagaagc agtgcaaaga gctgaaacgg 420

gaggtagcgg cactggtcct cccaaccaag agctcacttc ggagaacctc atccacccaa 480

ttctga 486

<210>2

<211>161

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Ala Ala Asn Tyr His His Tyr Gln Met Ala Val His Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Trp Arg Arg Glu Pro Asp Ser Pro Gln Leu Ser Phe

20 25 30

Val Ser Gly Cys Ser Ser Leu Phe Ser Ile Ser Thr Leu Gln Asp Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Arg Ala Ala Ala Val Val Ile Ala Ala Gly His Ala Leu

50 55 60

Pro Ser Thr Pro Val Ser Leu Ala Gly Phe Val Gly Asp Glu Val Asp

65 70 75 80

Met Glu Val Gln Gln Ala Ser Gly Asp Asp Arg Arg Ser Ile Arg Met

85 90 95

Met Arg Asn Arg Glu Ser Ala Leu Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ala

100 105 110

Tyr Val Glu Asn Leu Glu Lys Glu Val Arg Arg Leu Val Asp Asp Asn

115 120 125

Leu Lys Leu Lys Lys Gln Cys Lys Glu Leu Lys Arg Glu Val Ala Ala

130 135 140

Leu Val Leu Pro Thr Lys Ser Ser Leu Arg Arg Thr Ser Ser Thr Gln

145 150 155 160

Phe

<210>3

<211>766

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

ggctccgcgg ccgccccctt caccaagcag cagctagaaa gtagaggaag caccactacg 60

attacatata tccaagccaa gcgccctagc ttgctggtgt tgttggtgct ccggccggcc 120

ctctctcgtc tccttactag ctacccgtca tggcggccaa ctaccaccac taccagatgg 180

cggtgcacgc ggcggcggcg gcggcggcgt ggaggaggga gccggacagc ccgcagctga 240

gcttcgtgag cgggtgcagc tccctcttct ccatctccac gctgcaggac gacgacgacg 300

accgagccgc cgccgtcgtc atcgccgccg gccacgcgct gccctccacg cccgtctcgc 360

tcgcgggctt cgtcggcgac gaggtcgaca tggaggtgca gcaggccagc ggcgacgatc 420

ggaggagcat caggatgatg aggaaccggg agtccgcgct ccgctccagg gccaggaaga 480

gggcatacgt ggagaacctg gagaaagagg ttcgccggct agtggatgac aacttgaagc 540

tcaagaagca gtgcaaagag ctgaaacggg aggtagcggc actggtcctc ccaaccaaga 600

gctcacttcg gagaacctca tccacccaat tctgaagggg cgaagggaaa tgaaatatat 660

agatttatat atttggtggt agcagtagca gtacaaagtt aagatcgaga aggaatatgg 720

ttgttggact tgtgctgtgt gaagggtggg cgcgccgacc cagctt 766

<210>4

<211>2348

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

aagcttgggt tcccgccttc ggtttgggcg cgcccggttc agaagaccag agggctattg 60

agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 120

gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg aagatggctt ctacaaatgc catcattgcg 180

ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctaccgacag tggtcccaaa gatggacccc 240

cacccacgag gaacatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 300

attgatgtga tacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac 360

agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat cgggaaacct 420

cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag aaaaggaaga 480

tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctac 540

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt 600

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 660

cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 720

ggagaggacc tcgagaaaga ggatccacct gaggcctccg ttccatgggc tagaagcttc 780

tcctcctctg ctaacgtaag cctctctgtt ttttttctct gtttcttttg aaatgaatcc 840

aattagtgat gataatctgt gtttgatgta tcattgattt aacatcttga caatgaatcg 900

tgatcggaag tgataaagtt atgggtcaac ggtttcaaag agagagaaag acttttagag 960

tcaactctcg actctttctt aattatgtta ttgctatttg tctcttttct tgaagtctga 1020

acaattcttg ggattgtttt gcaggttcta gcttctccaa ccacaggaat tcatcgcccg 1080

ggactgggtt atcacaagtt tgtacaaaaa agcaggctcc gcggccgccc ccttcaccaa 1140

gcagcagcta gaaagtagag gaagcaccac tacgattaca tatatccaag ccaagcgccc 1200

tagcttgctg gtgttgttgg tgctccggcc ggccctctct cgtctcctta ctagctaccc 1260

gtcatggcgg ccaactacca ccactaccag atggcggtgc acgcggcggc ggcggcggcg 1320

gcgtggagga gggagccgga cagcccgcag ctgagcttcg tgagcgggtg cagctccctc 1380

ttctccatct ccacgctgca ggacgacgac gacgaccgag ccgccgccgt cgtcatcgcc 1440

gccggccacg cgctgccctc cacgcccgtc tcgctcgcgg gcttcgtcgg cgacgaggtc 1500

gacatggagg tgcagcaggc cagcggcgac gatcggagga gcatcaggat gatgaggaac 1560

cgggagtccg cgctccgctc cagggccagg aagagggcat acgtggagaa cctggagaaa 1620

gaggttcgcc ggctagtgga tgacaacttg aagctcaaga agcagtgcaa agagctgaaa 1680

cgggaggtag cggcactggt cctcccaacc aagagctcac ttcggagaac ctcatccacc 1740

caattctgaa ggggcgaagg gaaatgaaat atatagattt atatatttgg tggtagcagt 1800

agcagtacaa agttaagatc gagaaggaat atggttgttg gacttgtgct gtgtgaaggg 1860

tgggcgcgcc gacccagctt tcttgtacaa agtggtgata acttccgatc gattctagac 1920

tagttctaga gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctctatttt 1980

tctccagaat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt atagggtttc 2040

gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct 2100

atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga ccgggcggcc gccaccgcgg 2160

tggaggggga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga 2220

tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataatcgg atatttaaaa 2280

gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgt acatcaccga cgagcaaggc 2340

ccaagctt 2348

Claims

1.ZmbZIPa3蛋白质在如下1)-14)任一中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)调控植物生长发育；

3)调控植物产量；

4)调控植物根系生长；

5)调控植物叶宽；

6)调控植物抗旱能力的生理指标；

7)调控植物存活率；

8)调控植物萎蔫率；

9)调控植物光合作用；

10)调控植物果实数量；

11)调控植物花期性状；

12)培育转基因植物；

13)作为分子标记筛选抗旱植物品种；

14)植物育种；

所述ZmbZIPa3蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质相关的生物材料在如下1)-14)任一中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)调控植物生长发育；

3)调控植物产量；

4)调控植物根系生长；

5)调控植物叶宽；

6)调控植物抗旱能力的生理指标；

7)调控植物存活率；

8)调控植物萎蔫率；

9)调控植物光合作用；

10)调控植物果实数量；

11)调控植物花期性状；

12)培育转基因植物；

13)作为分子标记筛选抗旱植物品种；

14)植物育种；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmbZIPa3蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第280-1878位所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性；

或，所述调控植物抗旱能力的生理指标体现为在干旱条件下调控植物存活率和/或萎蔫率和/或光合作用；

或，所述调控植物光合作用体现为提高植物叶绿素荧光fv/fm；

或，所述调控植物花期性状体现为延迟植物开花时间；

或，所述育种的目的为选育生长发育性状优良且产量高的植物。

5.一种培育转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期区别于所述受体植物。

6.一种改变植物耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性，得到耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期优化的植物的步骤。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性。

8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性和/或根长和/或存活率和/或萎蔫率和/或叶宽和/或果实数量和/或花期区别于所述受体植物体现在如下(1)-(7)中任一种：

(1)转基因植物的耐旱性高于受体植物；

(2)转基因植物的总根系发育优于受体植物；

(3)转基因植物的存活率高于受体植物；

(4)转基因植物的萎蔫率低于受体植物；

(5)转基因植物的叶宽大于受体植物；

(6)转基因植物的果实数量多于受体植物；

(7)转基因植物的开花时间迟于受体植物。

9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1中所述的ZmbZIPa3蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述ZmbZIPa3蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。