CN1401004A - 在缺氧条件下改变生长和适应 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能产生适应低氧，即缺氧条件的能力的基因的核苷酸序列和相应氨基酸序列。这些序列被称为SH2A和SH2A样序列。还提供了包括这些序列的遗传结构和嵌合基因。可以用所述核苷酸和氨基酸序列转化细菌、酵母、真菌、动物和植物，以便调节SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。还提供了能表达SH2A或SH2A样基因的转基因植物、植物细胞和宿主细胞。还提供了用于调节培养的细胞在缺氧条件下的生长或存活的方法，以及用于改变生物细胞、组织或器官的生长响应的方法。另外，本发明提供了用于生产适应在缺氧条件下生长的植物的方法，用于提高植物抗涝性的方法，在植物中诱导赤霉素生物合成的方法以及调控植物细胞厌氧反应的方法。本发明的组合物和方法在园艺、农业、医学、发酵和细胞培养行业具有广泛用途。

Description

在缺氧条件下改变生长和适应
本申请的原始申请是申请日为2000年2月18日的美国临时申请流水号06/183572。
                         发明背景
深水水稻(Oryza sativa L.)植物特别适应忍受长时间地部分浸泡在水中。对低氧(缺氧)条件的适应包括厌氧基因的诱导，其中的某些基因编码能催化发酵途径的蛋白，在若干半水生植物中出现的另一种适应是幼小节间的快速生长，这使得植物能够通过将其某些叶子保持在上升的水面上而得以存活。节间的加速生长，是由于细胞分裂活性的增强和细胞伸长的增强而导致的，这些内容在文献中有充分报导(Kende，1987；Kende等，1993；Lorbiecke和Sauter，1998；Kende等，1998)。所述生长反应是由环境信号诱导的，并且是由若干植物激素相互作用介导的。
浸泡植物，会导致植物组织中乙烯浓度的提高，这是由于周围水所产生的物理滞留作用以及增强了的生物合成而导致的(Stunzi和Kende，1989；Raskin和Kende，1985)。乙烯能改变生长促进激素赤霉酸(GA)和顺-脱落酸(ABA)的比例，脱落酸是水稻节间中GA作用的有效的拮抗剂。降低ABA含量和提高GA含量，会导致组织对GA存在的响应的增强。
GA是节间中最终的生长促进激素(Raskin和Kende，1984)。施用乙烯和浸泡，能在3小时内将节间内部的ABA含量降低75％(Hoffmann-Benning和Kende，1992；Azuma等，1995)。与此同时，内源GA1含量增加4倍。浸泡诱导生长的延迟期为3-4小时(Hoffmann-Benning和Kende，1992)。
业已从遗传学上证实，一个基因座决定水稻的抗浸泡性(Setter等，1997)。到目前为止，该基因的克隆和鉴定一直是令人困惑的。本发明提供了来自不同生物的SH2基因和相应的SH2蛋白。本发明的SH2基因决定厌氧诱导的SH2蛋白的诱导，因此，一个最重要的基本机制是对缺氧条件的适应。调节细胞中SH2的表达和/或活性，使得细胞能在低氧的条件下生长。
本发明提供了包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述核苷酸序列与所述转基因植物或植物细胞的基因组不同源。
还提供了包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的转基因植物或植物细胞，其中，业已通过重组DNA方法，将所述核苷酸序列导入所述植物、植物部分或植物细胞。所述植物可能具有内源SH2A样基因，并且，可以通过重组DNA方法，将其它的内源SH2A样基因添加到所述植物、植物部分或植物细胞中。
还提供了含有SH2A或SH2A样蛋白的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述蛋白与所述植物、植物部分或植物细胞不同源。
含有SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的宿主细胞，其中，所述核苷酸序列与所述宿主细胞的基因组不同源，或者其中，所述核苷酸序列是通过重组DNA方法导入所述宿主细胞的。宿主细胞的例子包括细菌、酵母、真菌、昆虫、植物或动物细胞。在所述宿主细胞内，SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列相对指导该核苷酸序列表达的调控区而言，可以是正义或反义方向。
还提供了调节培养的细胞在缺氧条件下生长或存活的方法，该方法包括调节所述培养细胞中SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。本发明还提供了通过调节所述培养细胞中SH2A或SH2A样蛋白含量或活性来改变培养细胞的生长反应的方法。培养的细胞可以包括细菌、酵母、真菌、植物、哺乳动物或昆虫细胞。
本发明还提供了一种用于改变一种生物的细胞、组织或器官生长响应的方法，该方法包括调节所述生物的细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。还提供了一种用于改变植物细胞、组织或器官的生长响应的方法，该方法包括调节所述植物细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。例如，可以通过增强编码所述SH2A或SH2A样蛋白的核苷酸序列的转录来调控SH2A或SH2A样蛋白的含量。在植物上，转录的增强是通过使植物细胞、组织或器官接触乙烯利或乙烯诱导的。
还提供了一种用于生产适应在缺氧条件下生长的植物的方法，该方法包括用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。还提供了用于改善植物在低氧条件下存活的方法，该方法包括用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。
还提供了一种用于改善植物抗涝性的方法，该方法用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。
本发明还提供了用于诱导植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中赤霉素生物合成的方法。该方法包括调节所述植物细胞或原生质体中SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。类似地，本发明提供了用于诱导植物中赤霉素生物合成的方法，该方法包括调节所述植物细胞中SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。
还提供了一种调节植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中厌氧响应蛋白的方法，该方法包括调节SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性。例如，厌氧响应蛋白丙酮酸脱羧酶2就可以用这种方法调控。
本发明还提供了包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的遗传结构，所述基因可操作地连接于指导所述核苷酸序列表达的启动子序列上。例如，所述SH2A或SH2A样基因可以是cDNA或基因组序列。遗传结构上所包含的SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列相对启动子序列而言，可以是正义或反义方向的。以使SH2A或SH2A样基因表达沉默为目的的遗传结构，可以具有相对所述启动子序列而言为正义或反义方向的SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列(或其一个或几个片段)。
还提供了包括可操作地连接于异源编码序列上的SH2A或SH2A样基因启动子的嵌合基因结构。
本发明还提供了选自下列一组的编码SH2A样蛋白的分离的核酸：SEQID NO：5、7、9、11、13、15和17所示核酸序列。
另外，本发明提供了具有选自下列一组的氨基酸序列的分离的SH2A样蛋白：SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16和18所示氨基酸序列。
                     附图说明
图1A是深水水稻SH2A的Southern印迹分析。用HindIII(H)、BamHI(B)、ClaI(C)、PstI(P)或KpnI(K)消化基因组DNA，吸印，并在严格条件下用SH2A的3’专一性探针检测。分子长度标准物的位置在左侧标出。
图1B是深水水稻SH2B的Southern印迹分析。洗涤图1A的印迹，并在严格条件下用SH2B的3’专一性探针检测。
图1C是深水水稻SH2相关序列的Southern印迹分析。为了确定SH2相关序列的拷贝数量，对图1A和1B所示相同的印迹进行洗涤，并在低严格条件下用SH2A的完整长度的cDNA进行检测。
图2是来自植物、动物、真菌和细菌SH2-同系物的推测氨基酸序列的排比。将在50％或更多的上述序列中保守的氨基酸加阴影，短线表示为了优化排比而插入的缺口。在所有分析过的序列中保守的脯氨酸残基表示为[*]。不完整的序列表示为[#]。对于铜绿假单胞菌的mmsR蛋白来说，只示出了1-164号氨基酸。对于用[+]表示的序列来说，所确定的ESTs表示没有重复序列的SH2同系物的各种片段。
图3是表示SH2同系物氨基酸序列对之间关系的表。用genedoc程序将每一个序列与所有其它序列进行比较。第一个数字表示两个序列之间相同残基的百分比。括号里的数字表示两个序列之间相似或保守取代的百分比。加阴影的左侧上方1/4表示具有50％或更高序列相同性的序列。
图4表示SH2A和铜绿假单胞菌mmsR蛋白之间的同源片段的氨基酸序列的定位，亲水性分析和排比。在SH2A蛋白的示意图中示出了推测的核定位信号[NLS]的位置和推测的破坏框基序。
图5是用ClustalX程序由根据氨基酸序列比较得到的推测的完整长度SH2同系物的排比而产生的树状图。两种SH2同系物用粗字体表示。
图6A是在深水水稻植物的部分浸泡的组织中表达的SH2A、SH2B和丙酮酸脱羧酶2基因的Northern印迹分析。将深水水稻植物浸泡18小时。在所表示的时间点上从不定根、居间分生组织、伸长区和分化区分离总RNA，并分析SH2A、SH2B和丙酮酸脱羧酶2的表达。
图6B是深水水稻植物的部分浸泡的组织中的SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因的Northern印迹分析。将植物浸泡6小时，并分析居间分生组织和伸长区中SH2A和丙酮酸脱羧酶2的表达。
图7是分离的茎段上居间分生组织和伸长区中SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因表达的Northern印迹分析，所述茎段是用乙烯利(E)、GA3(GA)或NBD培养过的，并且包括幼小节间。在分离总RNA之后，分析居间分生组织和伸长区中SH2A和丙酮酸脱羧酶2表达。作为加样对照示出了溴化乙锭染色的RNA凝胶。
图8A是在从用150μM乙烯利处理6小时的茎段中分离的生长区中SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因表达的Northern印迹分析。用没培养过的茎段(C0)或在水中培养6小时的茎段(C6)作为对照。在所标明的时间点上分离总RNA，并分析SH2A和丙酮酸脱羧酶2的基因表达。
图8B是在用不同浓度的乙烯利处理过的分离的茎段的居间分生组织中SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因表达的Northern印迹分析。茎段在没有(C)或有标明浓度的乙烯利的烧杯中培养2.5小时。分离总RNA，并分析SH2A和丙酮酸脱羧酶2的基因表达。
图9A是在有蛋白合成抑制剂环已酰亚胺(CHX)的条件下用或不用150μM乙烯利处理的分离的茎段的居间分生组织中SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因表达的Northern印迹分析。用所标明浓度的CHX水溶液培养茎段3小时。
图9B是用不同浓度的CHX处理过3小时的分离的茎段居间分生组织中SH2A和丙酮酸脱羧酶2基因表达的Northern印迹分析。对照茎段(C)在水中培养3小时。
图10是来自拟南芥的三种SH2A样基因的启动子区上的顺式因子的示意图。
                        发明详述
根据本发明，业已发现，来自水稻的被称为SH2A的基因与植物适应低氧，即缺氧条件的能力相关。另外，业已发现，SH2A的基因产物属于一个高度保守的蛋白家族，该蛋白家族普遍存在于真核生物中。
与浸泡相关的缺氧条件是难以确定的，因为它是浸泡条件、边界层效应和植物组织代谢共同作用的结果。在大多数情况下，洪水氧气浓度通常低于空气饱和度(即缺氧)。尤其是在夜间，可能完全缺乏氧气，即无氧而不是缺氧条件。即使是在氧气饱和的洪水中，在浸泡的植物组织中也会存在无氧核心(Setter等，1997及其所引用的参考文献)。在本文中，“缺氧条件”表示包括无氧条件的任何条件，以及氧气亚饱和，即相对空气的任何条件。在大多数情况下，缺氧或亚饱和条件是暂时的。
本发明提供了来自水稻的SH2A基因和相应的SH2A蛋白。本发明还提供了来自各种生物的SH2A样基因和SH2A同系物。在本文中，术语“SH2A样基因”和“SH2A或SH2A样基因”表示来自水稻以外的生物的基因，它相当于水稻中的SH2A基因，这表现为具有同源核苷酸序列。术语“SH2A样蛋白”和“SH2A同系物”表示除水稻以外的生物中与SH2A同源的蛋白，表现为具有同源氨基酸序列，并且起着在缺氧条件下适应和/或生长的作用。本发明涉及SH2A及其衍生物、同系物和功能类似物。本文所使用的术语“SH2A或SH2A样蛋白”包括所有这样的同源或异源衍生物、同系物和功能类似物。SH2A和SH2A样遗传序列和相应的蛋白可以与特定的细胞同源，即天然存在于该细胞中，或者与所述细胞异源，即该遗传序列或蛋白可以从来自不同生物的来源导入所述细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种用于调控细胞在缺氧条件下生长或存活的方法。该方法包括调节生物细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。所述SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性的调节，使得所述生物的细胞、组织或器官能适应缺氧条件。在一种实施方案中，所述生物是动物。特别优选的是属于哺乳动物的生物的细胞、组织或器官。可以给培养中的动物细胞使用SH2A同系物或SH2A刺激物，以便调节细胞在缺氧条件下的生长和存活。还可以给活体内处在缺氧部位的细胞使用SH2A同系物或SH2A刺激物。因此，可以给中风或心脏病患者服用足于减轻缺氧的临床效应的有效量的SH2A同系物或SH2A刺激物。在来自体内的基因治疗方法中，用SH2A样基因转化人体细胞，以便超量表达SH2A同系物，并将转化的细胞移植到患者体内，优选移植到缺氧部位。用于调节动物，优选哺乳动物细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性的方法，还可用于治疗或减轻其它与缺氧相关的疾病。动物，优选哺乳动物上的上述缺氧症状可能出现在，并且包括以逐渐纤维化为特征的晚期肾病(Norman等，1999)、心肌缺血(Sinusas，1999)、肝硬化(Maruyama等，1994)、高海拔肾病和其它与海拔相关的疾病(Wiedman和Tabin，1999)。窒息的新生儿特别易患缺氧，尤其是缺氧性缺血大脑损伤(Gucuyener等1999)。动物、优选哺乳动物的缺氧条件可以出现在由肿瘤入侵、肿瘤转移和死亡所导致的微环境中。实体瘤的特征是新生血管化和糖酵解的加强，以及缺氧诱导型转录因子的超量表达(Zhong等，1999)。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于调节肿瘤细胞中SH2A或SH2A样蛋白含量和/或活性的方法。所述方法包括给培养中的动物，优选哺乳动物细胞使用，例如显性负SH2A同系物或服用，例如，SH2A刺激物，以便降低细胞在缺氧条件下的生长和存活。还可以给活体内的缺氧部位的细胞使用SH2A同系物或SH2A刺激物。可以给癌症患者服用有效量的SH2A同系物或SH2A刺激物，其用量足于减弱癌变肿瘤细胞的生长。在来自活体基因的治疗方法中，将诸如编码显性负SH2A样蛋白的SH2A样基因用于转化人体细胞，以便超量表达SH2A同系物，并将转化的细胞移植到癌症患者体内，优选移植到肿瘤发生部位。优选地，所述哺乳动物是人，而SH2A样基因和相应的基因产物分别具有SEQ ID NO：13和14所示的核苷酸序列和氨基酸序列。转化人体细胞的方法以及能在人体细胞中起作用的启动子序列在文献中是众所周知的。
为了克服与水淹相关的有限的气体扩散，水稻植物可以根据栽培品种的不同以两种方式中的任一种作出反应：变得抗浸泡或者伸长以便逃脱浸泡。在快速水淹条件下伸长是不利的，因为一旦水位降低，较高的植株就会倒伏。不过，在水稻生长在或漂浮在深水中的地方，伸长是理想的。当通过喷洒paclobutrazol(赤霉素生物合成抑制剂)抑制伸长响应时，抗浸泡栽培种的幼苗存活能力大大增强。抗浸泡是通过以有效的醇发酵作为能量生产机制而实现的(Setter等1997，及其所引用的文献)。浸泡条件不仅会导致缺氧，而且还会导致乙烯的积累，乙烯的积累又会改变植物激素GA和ABA的比例。对拟南芥SH2A样基因的启动子区所做的分析(参见图10/例7)证实，启动子因子能对由浸泡所导致的一种或几种改变(缺氧、乙烯、GA、ABA)作出反应。
通过产生抗浸泡能力或通过伸长反应来适应缺氧并克服缺氧的不利影响，都会明显影响谷物的产量。另外，增加了的种子体积以及因此而增加了的碳水化合物含量，是水稻幼苗抗浸泡的一个重要因素(Setter等1997)。
在本发明的另一方面，提供了一种改变植物细胞、组织或器官的生长响应的方法，该方法包括调节植物中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。对SH2A或SH2A样蛋白的含量或活性的调节，可以在植物植株大小和/或结构和/或产量方面改变细胞、组织或器官的生长。调节SH2A或SH2A同系物的含量或活性可以在基因水平上进行，即通过用SH2A或SH2A样基因或用编码针对所述SH2A或SH2A样基因的RNA的核酶的基因转化植物。所述SH2A或SH2A样基因可用于沿正义或反义方向转化植物细胞。为了实现细胞生长的改变，例如，增强或减弱植物茎的伸长，可以用正义方向的SH2A或SH2A样基因转化植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分(例如，胚胎、子房、花粉、根、茎的部分、下胚轴、分生组织等)或植物器官。可以沿正义方向使用SH2A或SH2A样基因，以便导致共抑制，或者沿反义方向转化植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官，以便由此再生的植物表现出，例如，植物茎伸长的增强或减弱。在用编码以SH2A或SH2A样基因的RNA为目标的核酶的基因转化的植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官所再生的植物上可以获得类似地效果。另外，还可以通过诱变在基因水平上实现对SH2A或SH2A同系物含量或活性的调控，例如，通过T-DNA或转座子插入或通过披露于以下文献中的基因沉默方法：WO98/36083、WO98/53083、WO99/15682或WO99/53050。以使SH2A或SH2A样基因表达沉默为目的的遗传结构，可以具有SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列(或其一个或几个片段)，该核苷酸序列相对启动子序列为正义和/或反义方向。
还可以通过给细胞使用或使细胞接触SH2A、SH2A同系物或SH2A刺激物，在蛋白质水平上实现对SH2A或SH2A样蛋白含量或活性的调控。例如，这种应用方法特别适用于动物和植物细胞的细胞和组织培养物。还可以通过免疫调节，即在宿主细胞中表达对SH2A或SH2A样蛋白专一的抗体，介导对SH2A或SH2A样蛋白含量或活性的调控。所述抗体包括‘植物抗体’、单链抗体、IgG抗体、Fab片段和重链骆驼抗体。
对SH2A和SH2A样蛋白序列进行更严格的检查发现，大部分(参见图2和4)含有一个核定位序列(NLS：KRXR，在水稻SH2A上为64-67号残基)，某些含有破坏框基序(RX2LX2-3N，在水稻SH2A上为145-152号残基)。NLSs是正常情况下存在于细胞质中的蛋白的特征，它在受到诸如促分裂剂或胁迫的特殊信号影响时，会转运到细胞核中，并在所述细胞核中起作用。所述蛋白包括转录因子以及细胞周期蛋白。其它含有NLSs的蛋白起着运载工具的作用，将本身不具有NLSs的蛋白运送到需要它的细胞核中，即所谓的背负式运输机制。在一种(通常是调控)蛋白中，破坏框基序的存在是这种蛋白快速转化的标志，这是随时限制该蛋白活性的一种有效机制。预计，SH2A和SH2A样蛋白在细胞核中起作用，因此与细胞核加工有关。所述加工包括调控基因转录(例如，直接作为转录因子或间接作为转录因子的运载工具)以及调控细胞周期。在动物中，缺氧能调节细胞周期，即在促细胞分裂剂活化的细胞中，缺氧能通过抑制有丝分裂细胞周期蛋白A和B的合成诱导生长抑制状态(Naldini和Carraro1999)。缺氧还能提高细胞周期蛋白决定型激酶抑制剂p21(WAFL/cipl)的含量(Zaman等，1999)。很多动物细胞周期蛋白在植物中都有它的对应体(有关植物细胞周期的综述参见Mironov等1999)，在抗浸泡植物中缺氧很有可能能抑制植物细胞周期，但在浸泡植物的伸长反应中能增强植物细胞周期。因此，不排除SH2A和SH2A样蛋白发挥基因转录调节物和/或细胞周期调节物的作用。可以按以下方法设想SH2A和SH2A样蛋白作为细胞周期调节物的潜在作用。正如上文对水稻所做的讨论，植物能以两种方式中的任一种对浸泡诱导的缺氧作出反应：表现出抗性或表现出伸长(即浸泡易感性)。
在第一种模式中，SH2A和SH2A样蛋白能发挥细胞周期控制基因或细胞周期控制蛋白的负调节物的作用。在抗浸泡植物中，由缺氧诱导的信号连锁反应能导致SH2A和SH2A样基因的表达增强。其结果是，能阻断细胞周期，并且不会发生伸长。在表现出伸长的浸泡易感植物中，所述缺氧诱导的信号连锁反应的关键成分的缺乏，会抑制SH2A和SH2A样蛋白的积累。结果，不会阻断细胞周期，而是随后增强，例如，由于降低了SH2A和SH2A样mRNA稳定性或者由于在开始生长期间稀释了SH2A和SH2A样蛋白，导致快速伸长反应。
在第二种模式中，SH2A和SH2A样蛋白能够发挥细胞周期控制基因或细胞周期控制蛋白正调节物的作用。在这种情况下，所述细胞周期控制基因或细胞周期控制蛋白可以包括，例如，其它细胞周期控制基因或细胞周期控制蛋白的抑制剂。可以分别根据缺氧诱导的信号连锁反应的一种关键成分的存在或缺乏，解释不同的植物反应、抗浸泡性或伸长性。在这两种模式的任一种中，缺氧诱导的信号连锁反应的所述关键成分，可以由诸如水稻编码抗浸泡能力的主要基因座的基因编码(Xu和Mackill 1996)。
术语“细胞周期”表示与细胞生长和分裂相关，特别是与DNA复制和有丝分裂调控相关的周期性生物化学和结构事件。细胞周期包括被称为：G0、Gap1(G1)、DNA合成(S)、Gap2(G2)和有丝分裂(M)的时期。正常情况下，这四个时期是顺序发生的，不过，细胞周期还包括修饰过的周期，如核内有丝分裂、无细胞分裂、多倍性、多线性和核内再复制。
术语“细胞周期相互作用蛋白”、“细胞周期蛋白”或“细胞周期控制蛋白”，在这里表示这样的蛋白：它能对细胞周期产生控制或调节作用，或者为细胞周期所需要，或者是细胞、组织、器官或完整的生物和/或DNA复制的一部分。它还能与调控结合或者被细胞周期蛋白决定型激酶或其亚基调控。该术语还包括它的肽、多肽、片段、变体、同系物、等位基因或前体(例如，前原蛋白)。
John(1981)对细胞周期控制蛋白及其在调控真核生物细胞周期方面的作用进行了详细的综述，形成该综述的文章(Norbury和Nurse1992；Nurse1990：Ormord和Francis1993)以及形成该综述的文献(Doerner等1996；Elledge1996；Francis和Halford1995；Francis等1998；Hirt等1991；Mironov等1999)被收作本文参考。
术语“细胞周期控制基因”表示能对以下过程产生控制或为以下过程所需要的任何基因或其变体：染色体DNA合成和有丝分裂(前原期带、细胞核外被、纺锤体形成、染色体缩合、染色体分离、新核的形成、成膜体形成等)、减数分裂、细胞分裂、细胞生长和核内再复制。细胞周期控制基因同样是所有能对上述诸如CDKs、细胞周期蛋白、E2Fs、Rv、CKI、Cks的同系物产生控制作用的所有基因，并且，还可以是能干扰上述诸如细胞周期蛋白D、cdc25、Weel、Niml、MAP激酶等的任何基因。
更具体地讲，细胞周期控制基因是参与控制进入并通过S期的所有基因。所述基因包括，但不限于表达“细胞周期控制蛋白”的基因，如细胞周期蛋白决定型激酶(CDK)、细胞周期蛋白决定型激酶抑制剂(CKI)、细胞周期蛋白D、E和A，E2F和DP转录因子，口袋蛋白，CDC7/DBF4激酶，CDC6，MCM2-7，Orc蛋白，cdc45，SFC遍在蛋白连接酶的成分，PCNA，DNA聚合酶。
术语“细胞周期控制蛋白”包括细胞周期蛋白A、B、C、D和E，包括CYCA1；1，CYCA2；1，CYCA3；1，CYCB1；1，CYCB1；2，CYCB2；2，CYCD1；1，CYCD2；1，CYCD3；1，和CYCD4；1(Evans等1983；Francis等1998；Labbe等1989；Murray和Kirschner1989；Renaudin等1996；Soni等1995；Scrrell等1999；Swenson等1986)细胞周期蛋白决定型激酶抑制剂(CKI)蛋白，如ICK1(Wang等1997)，FL39、FL66、FL67(PCT/EP98/05895)，Sicl、Farl、Ruml，p21、p27、p57、p16、p15、p18、p19(Elledge1996；Pines1995)，p14和p14ARF；p13sucl或CKS1At(De Veylder等1997；Hayles和Nurse1986)和nim-1(Russell和Nurse1987a；Russell和Nurse1987b；Fantes1989；Russell和Nurse1986；Russell和Nurse1987a；Russell和Nurse1987b)Cdc2的同系物，如Cdc2MsB(Hirt等1993)，CdcMs激酶(Bogre等1997)，cdc2T14Y15磷酸酶，如Cdc25蛋白磷酸酶或p80-cdc25(Bell等1993；Elledge1996；Kumagai和Dunphy1991；Russell和Nurse1986)和Pyp3(Elledge1996)，cdc2蛋白激酶或p34cdc2(Colasanti等1991；Feiler和Jacobs1990；Hirt等1991；John等1989；Lee和Nurse1987；Nurse和Bissett1981；Ormrod和Francis1993)，cdc2a蛋白激酶(Hemerly等1993)，cdc2T14Y15激酶，如weel或p107weel(Elledge1996；Russell和Nurse1986；Russell和Nurse1987a；Russell和Nurse1987b；Sun等1999)，mikl(Lundgren等1991)和mytl(Elledge1996)；cdc2T161激酶，如Cak和Civ(Elledge1996)；cdc2T161磷酸酶，如Kap1(Elledge1996)；cdc28蛋白激酶或p34cdc28(Nasmyth1993；Reed等1985)，p40MO15(Fesquet等1993；Poon等1993)，chk1激酶(Zeng等1998)，cds1激酶(Zeng等1998)，与生长相关H1激酶(Labbe等1989；Lake和Salzman1972；Langan1978；Zeng等1998)，(Binarova等1998；Bogre等1999；Calderini等1998；Wilson等1999)公开的MAP激酶。
参与细胞周期蛋白D-介导的细胞从G0进入G1的其它细胞周期控制蛋白包括pRb(Xie等1996；Huntley等1998)，E2F，RIP，MCM7和潜在的pRb样蛋白p107和p130。
在一个或几个复制起点上形成预复制复合体的其它细胞周期控制蛋白，包括，但不限于ORC、CDC6、CDC14、RPA和MCM蛋白，或者参与调控该预复制复合体形成的蛋白包括，但不限于CDC7、DBF4和MBF蛋白。
在本文中，术语“细胞周期蛋白”和“细胞周期控制蛋白”包括参与任何其它细胞周期控制蛋白转化，或参与调控所述其它细胞周期控制蛋白的半衰期的任何一种或几种蛋白。术语“蛋白转化”包括会导致所述蛋白在物理学上或功能上被除去的所有生物化学修饰。所述修饰的例子有磷酸化、遍在化和蛋白水解，但并不局限于此。参与上述任何一种或几种其它细胞周期控制蛋白水解的特别优选的蛋白包括源于酵母的和源于动物的蛋白，Skp1，Skp2，Rub1，Cdc20，cullins，CDC23，CDC27，CDC16，及其源于植物的同系物(Cohen-Fix和Koshland1997；Hochstrasser1998；Krek1998；Lisztwan等1998)和Plesse等(Francis等1998)。
对于本发明来说，术语“细胞周期控制基因”包括参与细胞周期控制基因表达的转录调控的任何一种或几种基因，如转录因子和上游信号蛋白。但并不排除其它细胞周期控制基因。
在本文中，术语“细胞周期控制基因”还包括受诸如即时胁迫、养分、病原体的环境信号影响或受诸如动物促分裂剂或植物激素(生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉酸、脱落酸和甘蓝类固醇)的内在信号影响的任何细胞周期控制基因或其变体。
上文所述的SH2A或SH2A样蛋白对基因转录和/或细胞周期和/或细胞代谢的调控可以是蛋白-蛋白相互作用或蛋白-核酸相互作用的结果。因此，通过调节SH2A或SH2A样蛋白潜在作用目标的含量和/或活性，也能导致一种生物的细胞、组织或器官生长的间接改变。其中的SH2A或SH2A样蛋白作用目标的含量和/或活性受到调节的这种间接改变生物细胞、组织或器官生长的形式的优点是，例如，避免出现与调节SH2A或SH2A样蛋白含量和/或活性相关的不希望的多效效应。
用于鉴定SH2A或SH2A样蛋白的潜在的蛋白性质的目标的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括用SH2A或SH2A样蛋白作诱饵进行的酵母双杂交筛选，以及用抗SH2A或SH2A样蛋白的抗体进行免疫沉淀。鉴定的蛋白类目标可以包括内源调节物，例如，SH2A蛋白含量和/或活性或SH2A样蛋白和/或活性的抑制剂或激活剂。用于鉴定SH2A或SH2A样蛋白的潜在的核酸性质的目标的方法并不简单，但仍然可行。并且可以包括，例如，基因发现方法(即鉴定其表达受SH2A或SH2A样蛋白影响的基因)，随后，例如，对源于所发现基因的一组重叠的启动子片段进行凝胶迁移分析。所鉴定的核酸目标可以包括编码调节物的内源基因，例如，编码SH2A或SH2A样蛋白或SH2A或SH2A样蛋白活性的基因表达的增强剂或抑制剂。
因此，调节细胞在缺氧条件下的生长或存活，还可以通过调节与SH2A或SH2A样蛋白相互作用的蛋白或核酸的含量和/或活性而实现。通过调节生物细胞、组织或器官中所述蛋白和/或核酸序列的含量和/或活性，可以调节SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性和/或改变所述生物细胞、组织或器官对缺氧条件的适应能力。
用OMIGA2.0软件(牛津分子)和所提供的基序数据库进一步分析水稻SH2A氨基酸序列，发现了多个推测的磷酸化位点的存在：5个非重叠酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点，一个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点和4个(其中3个是非重叠的)酪氨酸(TYR)磷酸化位点。这些位点的位置在表1中示出。水稻SH2A蛋白上很多推测的磷酸化位点，在来自其它来源的SH2A样蛋白中也是保守的(参见图2)。因此，SH2A或SH2A样蛋白的生物学活性和/或对蛋白转化的导向，很有可能通过调控其磷酸化状态而进行调控。所述调控可以通过在不同的发育和/或环境条件下改变蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶的活性平衡而实现。因此，用可磷酸化的氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)定向取代不可磷酸化的氨基酸(如丙氨酸、丙氨酸、和苯丙氨酸)，可以产生突变形式的SH2A或SH2A样蛋白，它能产生组成型生物学活性或无活性和/或表现出增强的或降低的蛋白水解转化速度。因此，在本发明的另一方面，鉴定了突变型SH2A或SH2A样蛋白，其中，可磷酸化的氨基酸被换成了不可磷酸化的氨基酸。所述修饰过的SH2A或SH2A样蛋白在生物细胞、组织或器官中的表达，会导致SH2A或SH2A样蛋白的含量和/活性受到调节，并且能改变所述生物细胞、组织或器官对缺氧条件的适应性。优选增强细胞对缺氧条件的适应性。
表1：出现在水稻SH2A蛋白上的推测的磷酸化位点概览。共有基序为：对于酪蛋白激酶II(CK2)来说，有(S，T)-X(2)-(D，E)；对于蛋白激酶C(PKC)来说，有(S，T)-X(R，K)，而对于酪氨酸激酶(TYR)来说，有(R，K)-X(2，3)-(D，E)-X(2，3)-Y。
磷酸化位点    磷酸化位点的第    磷酸化位      共有磷酸化
的类型           一个残基       点的序列      基序吻合的百分比
CK2                 21            SEED           100
PKC                 49            SWR            100
TYR                 64          KRIREARGY        100
TYR                 65          RIREARGY         100
CK2                 73            SYVD           100
CK2                 94            SFFE           100
CK2                 102           TDEE           100
TYR                 107         RYCLEGSGY        100
TYR                 145         RFTLDTDNY        100
CK2                 189           SEGE           100
根据本发明，通过调节SH2A或SH2A同系物的含量或活性，可以调控植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的赤霉素生物合成。另外，根据本发明，通过调节SH2A或SH2A同系物的含量或活性，可以调控植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的厌氧响应蛋白。
对SH2A或SH2A样蛋白的含量和/活性的调节，可以包括用一个或几个SH2A样基因转化植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官。类似地，对SH2A表达水平或活性的调节，可以包括用一个或几个SH2A样基因转化动物的细胞、器官或胚胎。当然，可以用标准重组DNA方法转化细菌、酵母、真菌和其它生物。由于业已认识到SH2A样蛋白是普遍存在的蛋白，大多数(如果不是全部的话)生物的细胞都具有编码SH2A同系物的天然基因。因此，举例来说，可将一个或几个SH2A或SH2A样基因用于沿正义或反义方向转化所述生物，其结果是增强或减弱天然SH2A或SH2A样蛋白的表达。
因此，用于转化诸如动物或植物材料的编码SH2A样蛋白的核苷酸序列对特定植物或动物细胞来说，可以是异源(外源的)或是所述细胞所天然拥有的。所得到的转基因植物和动物细胞或其它生物细胞，可以含有与所述特定细胞的基因组不同源的SH2A样基因，并且包括与所述特定生物不同源的SH2A样蛋白，所得到的转基因植物或动物细胞或其它生物，还可以包括所述特定生物的基因组所天然拥有的SH2A样基因，但该基因是所述基因组所额外拥有的。另外，SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列，相对指导所述核苷酸序列表达的调控区而言可以是正义或反义方向的。可以用标准重组DNA方法给细胞增加天然的或异源的SH2A样基因。
可以通过让一种生物的细胞接触或者给这种细胞使用一种能与SH2A或SH2A样蛋白相互作用的化合物，即SH2A刺激物，调节SH2A或SH2A样蛋白的活性。可以通过增强或减弱SH2A或SH2A样蛋白的表达调节SH2A或SH2A样蛋白的含量。例如，通过沿正义方向增加SH2A编码序列，可以实现表达的增强。例如，通过沿反义方向增加编码序列、通过插入诱变或通过其它基因沉默方法，可以实现表达的减弱。通过使细胞接触或者给细胞或完整的植株或植物部分使用一种能诱导SH2A或SH2A样基因产物表达的化合物，可以进一步实现表达的增强。可以用乙烯和乙烯利增加SH2A或SH2A样基因的mRNA转录物的积累，并因此增强SH2A或SH2A同系物的表达。
本发明提供了来自水稻的SH2A基因，该基因包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，提供了另一个源于水稻的被称为SH2B的SH2A样基因，它包括SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明还涉及SH2A或SH2A样基因，与SEQ ID NO：1所示的序列相比，它具有一个或几个核苷酸的插入、缺失或取代，并且，该基因保留了产生对缺氧条件的适应性的特性。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的SH2A的分离的核酸。在另一个实施方案中，提供了一种编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的SH2B的分离的核酸。
本发明还提供了源于番茄、大豆、和棉花的植物的编码SH2A同系物的分离的核酸以及相应的氨基酸。源于番茄的第一种SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。相应的番茄SH2A同系物的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。源于番茄的第二种SH2A样基因的核苷酸序列如SEQID NO：7所示。源于番茄的第二种SH2A样基因的相应的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
源于大豆的SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。相应的大豆SH2A同系物的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。棉花SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，而相应的氨基酸序列如SEQ IDNO：12所示。
还提供了人、小鼠和斑马鱼SH2A样基因的核苷酸序列，以及相应的氨基酸序列。人SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。小鼠SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，而相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
斑马鱼的SH2A样基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
可以用众所周知的方法从一种生物的组织来源中分离SH2A蛋白或同系物。例如，可以按照Calderini等所披露的标准方法(1998，细胞科学杂志，111：3091-3100)，用合适的提取缓冲液制备蛋白提取物，并且，用一种抗体制备免疫沉淀的SH2A或SH2A样蛋白。例如，可以制备抗一种编码SH2A或SH2A样蛋白的一部分的合成肽的多克隆抗体。因此，可以用相当于SH2A样基因的3’区的合成肽，制备抗SH2A或SH2A样蛋白的抗体。例如，可以用相当于SH2A的496-867号核苷酸的肽制备抗体。还可以用相当于SH2A或SH2A同系物的91-118号氨基酸和133-161号氨基酸的肽(参见图2)制备抗体。然后可将所述抗体用于与来自植物的蛋白提取物进行的结合实验中，以便鉴定SH2A同系物。
另外，本发明涉及能专一性识别SH2A或SH2A样分子或其部分的抗体，即所述蛋白的专一性片段或表位。本发明的抗体可用于鉴定和分离来自不同生物的SH2A同系物。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体，以及抗体的片段，如Fab、Fv或scFv片段或重链骆驼抗体等。例如，单克隆抗体可以用最初由Kohler和Milstin(自然256，1975，495)和Galfre(酶学方法，73，1981，3)所披露的技术制备，该方法包括使小鼠骨髓瘤细胞与源于免疫过的哺乳动物的脾细胞融合。另外，可以用披露于以下文献中的方法获得抗上述肽的抗体或其片段：例如，Harlow和Lane，抗体，实验室手册，CHS出版社，冷泉港，1988。例如，所述抗体可用于本发明SH2A和SH2A样蛋白的免疫沉淀和免疫定位，以及用于监测所述蛋白的合成，例如，在重组宿主细胞和生物中的合成。上述蛋白、肽或其片段的抗体或其片段还可应用于试剂盒中，例如，用于癌症诊断的试剂盒中。例如，可以通过基于RIA-或ELISA的检测方法，检测肿瘤或肿瘤组织中SH2A或SH2A样蛋白含量的改变，包括在所述诊断试剂盒中所提供的所述抗体或其标记过的衍生物。在本发明的另一个实施方案中，诸如用于诊断癌症的试剂盒包括寡核苷酸引物，它可用于，例如，通过RT-PCR对目标SH2A或SH2A样mRNA进行专一性和定量扩增。所述mRNA含量的改变可以指示肿瘤或肿瘤组织的发展。
所述SH2A或SH2A样蛋白优选是从能表达本发明的SH2A或SH2A样编码序列的基因产物的重组生物中分离的。SH2A或SH2A样蛋白还可以是用披露于诸如以下文献中的标准方法从所述重组生物中分离并纯化的：Ausubel等，1987，当代分子生物学方法，Green出版联合体，纽约。
另外，根据本发明，提供了含有本发明分离的SH2A或SH2A样核苷酸序列的载体。例如，所述核苷酸序列可以包括完整的SH2A或SH2A样基因，即，包括编码序列和相关的5’和3’调控区，如启动子和终止序列的SH2A基因组序列。在所述序列上可能有或者没有内含子。在另一个实施方案中，所述载体包括可操作地与一种启动子连接的诸如cDNA的SH2A或SH2A样核苷酸序列，所述启动子能在宿主细胞中起作用，以便实现SH2A或SH2A样蛋白的表达。所述载体可以被称为遗传结构。在本文中，“基因”可以表示编码SH2A或SH2A同系物的、正义或反义方向的基因组序列、cDNA序列或合成的DNA序列。
在本发明的另一方面，提供了一种用于生产适应在低氧，即在缺氧条件下生长的宿主细胞。该方法包括用受一种能在宿主细胞中起作用的启动子控制的SH2A或SH2A样基因转化宿主细胞，并筛选SH2A或SH2A样基因的表达水平受到调控并因而适应在低氧条件下生长的转化体。所述SH2A或SH2A样基因可以由能在宿主细胞中复制或者整合到宿主细胞基因组中的载体携带。该方法特别适用于诸如单细胞生物，如用于烘烤或发酵行业的单细胞生物以及用于生产重组蛋白的单细胞生物。因此，通过用本发明的SH2A或SH2A样基因转化可以使细菌、真菌、酵母和动物细胞适应在缺氧条件下生长。可以通过用SH2A或SH2A样基因转化改变的细菌的例子包括，但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌、产液菌、和假单胞菌、乳杆菌、链霉菌、不动杆菌、柠檬酸杆菌和梭菌。可以通过用SH2A或SH2A样基因转化的酵母的例子包括，但不限于酵母属和裂殖酵母属、毕赤酵母属和克鲁维酵母属和假丝酵母属。可以变得适应在低氧条件下生长的真菌的例子包括曲霉菌、青霉菌和木霉菌。
可以通过用SH2A或SH2A样基因转化改变的动物/哺乳动物细胞的例子包括，但不限于杂交瘤细胞或永生化CHO细胞，例如，产生单克隆抗体。实际上，氧气供应是在通过培养的动物/哺乳动物细胞生产有用蛋白时的主要问题(Masuda等2000)。因此，SH2A或SH2A样基因的表达能改善所述培养细胞的存活。另外，SH2A或SH2A样基因的启动子可用于启动所述有用蛋白的表达，例如，由在低氧气浓度条件下培养的动物细胞表达。业已披露了使用另一种缺氧响应增强子的上述系统(Masuda等2000)。
还可以通过用本发明的SH2A或SH2A样基因转化哺乳动物、酵母或昆虫细胞，在诸如哺乳动物、酵母或昆虫细胞的宿主细胞中生产SH2A或SH2A同系物。转化哺乳动物、酵母或昆虫细胞的方法为本领域所公知。为了在哺乳动物、酵母或昆虫细胞中生产SH2A或SH2A样蛋白，用含有受能在哺乳动物、酵母或昆虫细胞中起作用的启动子控制的SH2A或SH2A样基因的载体转化所述细胞。所述载体可以被称为遗传结构。
在本发明的另一方面，提供了一种用于生产适应在低氧，即缺氧条件下生长的动物的方法。生产转基因动物的方法为本领域所公知，最常用的方法包括将所需要的DNA(在本发明中是SH2A或SH2A样核苷酸序列)注射到受精胚胎的前核中。将所述胚胎移植到养母体内，并在这里发育直到出生。组织专一性启动子可以普遍得到，并可以进行选择，以便表达SH2A或SH2A样核苷酸序列。其例子包括绵羊主要乳清蛋白β-乳球蛋白(BLG)基因，它是乳腺表达专一性的(Whitelaw等1991，转基因研究，1：3-13)，以及肌肉组织专有的小鼠肌酸激酶启动子(Frank等1995，临床研究杂志96：976-986)。为了在很多不同类型的细胞中表达，可以使用金属硫蛋白(MT)、胶原和各种病毒启动子。转基因动物在缺氧条件下表现出改善了的生长。
本发明的方法特别适用于植物组织培养、农业和园艺。因此，本发明还提供了生产适应在低氧条件下生长的植物的方法，并且包括用SH2A或SH2A样基因转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官，由此再生转基因植物，以及筛选在缺氧条件下的生长。转基因植物在低氧条件下具有改善了的生长，所述低氧条件如在排水较差的土壤中生长和水淹条件下出现的情况。
在本发明的另一方面，提供了一种生产在低氧条件下具有改善了的存活的植物细胞或植物原生质体的方法。该方法类似于改善植物在低氧条件下的存活的方法，所不同的是，不进行再生转基因植物的步骤。所述植物细胞可以用SH2A或SH2A样基因稳定地或瞬时地转化过。所述转化过的细胞可用于进一步生产其它蛋白产物，包括重组生产的蛋白。
本发明的另一方面提供了一种用于生产在低氧条件下具有改善了的存活的植物体细胞胚胎的方法。该方法类似于改善植物在低氧条件下存活的方法，所不同的是，收集转基因愈伤组织，并用于诱导体细胞胚胎发生。所述方法的优点包括提高批量生产体细胞胚胎的效率，例如，用油用棕榈生产，以及提高胶囊化体细胞胚胎的存活和发芽率。
因此，可以对植物细胞进行工程改造，以便控制SH2A或SH2A样基因在低氧气供应的条件下表达，以便能诱导能产生对缺氧条件的抗性的途径。SH2A或SH2A同系物的表达可以定向在易受水淹的根和其它植物部分，以便专门改善这些组织对缺氧的抗性。如果需要，由SH2A或SH2A样基因所产生的这种性状可以转入任何作物，并转入任何在园艺上重要的植物中。
除了本发明所提供的SEQ ID NO：1-18所示的核苷酸序列之外，在诸如EMBL和GenBank的遗传序列数据库中，还提供了可用于本发明方法的其它SH2A样基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。例如，在GenBank数据库中保藏号AI441185提供了大豆的第二种SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库中保藏号L38235中提供了甘蓝的SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库的保藏号AI649530中提供了玉米的SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库中保藏号AI054437提供冰晶松叶菊的SH2A样基因的核苷酸序列。在DDBJ数据库中保藏号AT000213提供了苹果SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库中保藏号AI813053提供了松树的SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库中保藏号AI727947提供了棉花的第二种SH2A样基因的核苷酸序列。在GenBank数据库中与拟南芥的四种SH2A样基因相关的四个保藏号N38691、N96935、T76549和AC002505分别与本文所披露的ATH1、ATH2、ATH4和ATH3基因相关。
根据本发明，业已发现ATH3是必需基因，正如ATH3剔除型所证实的(例16)。因为ATH3是必需基因，在除草剂筛选方法中可将其用作目标。
在本发明的一个方面，鉴定了ATH3基因产物的相互作用物，可将其用作植物生长调节剂或除草剂。鉴定ATH3基因产物的所述相互作用物的一种可行的方法包括用BIACore装置(Pharmacia)实时测定所述化合物和ATH3基因产物之间的相互作用。所述相互作用物优选是能够用作植物生长调节剂或除草剂的化学物质。这样，本发明还涉及使用通过上述方法被鉴定为植物生长调节剂或除草剂的分子的用途。根据另一个实施方案，本发明还涉及一种用于生产植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，该方法包括上述方法的步骤，并且，以合适的形式制备由上述步骤所获得的化合物，以便应用于农业或植物细胞或组织培养物。
来自GenBank数据库的保藏号AI417749提供了第二种人类SH2A样基因的核苷酸序列。来自DDBJ数据库的保藏号C82769提供了兔SH2A样基因的核苷酸序列。来自GenBank数据库的保藏号AI517276提供了果蝇属的SH2A样基因的核苷酸序列。来自EMBL数据库的保藏号Z68116、来自EMBL数据库的保藏号U80455、和来自EMBL数据库的保藏号U23173提供了秀丽新杆线虫的三种不同的SH2A样基因。
来自EMBL数据库的保藏号Z48613提供了酿酒酵母SH2A样基因的核苷酸序列。来自GenBank数据库的保藏号AA783142提供了Emericellanidulans的SH2A样基因的核苷酸序列。来自EMBL数据库的保藏号AL033388提供了粟酒裂殖酵母SH2A样基因的核苷酸序列。来自EMBL数据库的保藏号Z99111提供了枯草芽孢杆菌SH2A样基因的核苷酸序列。来自GenBank数据库的保藏号AE000766提供了Aquifx aeolicus的SH2A样基因的核苷酸序列。来自SWISS-PROT数据库的保藏号P28809提供了铜绿假单胞菌SH2A样基因的蛋白序列。
SH2A和SH2A样编码序列和基因组克隆可以通过用合适的探针筛选cDNA和基因组克隆获得。例如，一个SH2A基因组克隆是通过用本发明提供的水稻SH2A cDNA或其片段筛选基因组文库获得的。包括SH2A cDNA序列的寡核苷酸也可以作为探针。例如，可以使用含有SH2A核苷酸496-867的cDNA片段。
植物的SH2A同系物具有大约70-95％的相同氨基酸。因此，可以设计并合成基于一种或几种植物SH2A样基因的核苷酸序列的寡核苷酸探针，用于筛选cDNA和基因组文库，以便分离用于本发明的SH2A样基因。例如，可以使用相当于SH2A蛋白的99-118号和133-161号氨基酸的高度保守区的序列的寡核苷酸。
因此，还可以通过使用具有SEQ ID NO：1-18中任一种所示序列、包括SH2A或SH2A样基因的完整编码序列或SH2A样编码序列的一部分的基因作探针，并且与来自一种特定生物的核苷酸分子进行杂交，以便获得相当于SH2A或SH2A样基因的编码序列、启动子或3’终止序列的核酸分子。“杂交”表示所述核酸分子能在常规杂交条件下杂交，例如，Sambrook等所披露的，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，N.Y.。
例如，可以通过本领域众所周知的技术从cDNA或基因组文库中分离能与水稻SH2A cDNA(SEQ ID NO：1)或与SEQ ID NO：1-18所示任一种核苷酸序列或其部分杂交的核酸分子。例如，可用于通过筛选cDNA或基因组文库获得相当于本发明的SH2A和SH2A样基因的基因组DNA序列的方法披露于Sambrook等的著作中，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约，或者披露于众多被广泛使用的有关重组技术的实验室手册中的任一种里面。
本发明的SH2A或SH2A样基因，可以通过用限制性内切酶消化分离的SH2A或SH2A样基因组克隆而获得。因此，举例来说，将水稻SH2A基因(SEQ ID NO：1)的已知核苷酸或氨基酸序列与分离的、推测的SH2A样基因组克隆的核酸或推测的氨基酸序列进行排比，并对分离的SH2A或SH2A样基因组克隆的5’调控序列(即编码区翻译起始密码子上游的序列)、编码序列、和3’调控序列(即编码区翻译终止码子下游的序列)进行定位。
例如，可以通过体外诱变方法由具有多余的5’旁侧序列、多余的编码序列和/或多余的3’旁侧序列的基因组克隆制备SH2A或SH2A样基因。体外诱变有助于导入常见的限制位点。有多种商业化的试剂盒特别适用于这一用途，如T7-Gen体外诱变试剂盒(USB，Cleveland，OH)和快速改变定向诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)。另外，PCR引物可以被定义为能够指导包括启动子、编码序列和3’终止序列在内的SH2A或SH2A样基因的扩增。
用于本发明的SH2A或SH2A样基因不一定是从基因文库中分离的，但可以用任何方法制备，例如，包括化学合成、DNA复制、转录和逆转录。因此，在本文中，SH2A和SH2A样基因包括由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的序列。
用于本发明的，特别是用于制备和检测cDNA或基因组文库，对分离的克隆进行测序，进行缺失分析，构建表达载体，转化细胞并生长细胞等的通用方法为本领域所熟知，并且，披露这些方法的实验室手册可以广泛地获得。例如，Sambrook等，第二版，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约。
在真核生物中，普遍存在的SH2A和SH2A样基因产物的高度保守性，表明了一种进化上保守的功能。因此，可将任何SH2A或SH2A样基因用于本发明的方法。优选用现有的系统发育上最接近的SH2A样基因转化细胞。例如，优选用植物SH2A或SH2A样基因转化植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分和植物器官，所述基因如来自水稻的SH2A基因(SEQ IDNO：1)，来自拟南芥的ATH1(保藏号N38691)，ATH2(保藏号N96935)，ATH3(保藏号AC002505)，或ATH4(保藏号T76549)基因，或其它SH2A样基因，如番茄1(SEQ ID NO：5)，番茄2(SEQ ID NO：7)，大豆1(SEQ ID NO：9)，大豆2(保藏号AI441185)，棉花1(SEQ ID NO：11)，棉花2(保藏号AI727947)或从植物中分离的其它SH2A样和/或相应的基因组序列。
根据本发明，所述SH2A或SH2A样编码序列可相当于cDNA或基因组序列。当使用基因组SH2A或SH2A样基因时，如果必要，该基因可以改变，以便去掉或增加一个或几个内含子。另外，可以从所述基因组序列上去掉和/或在它上面添加信号序列。还可以在SH2A或SH2A样cDNA上添加信号序列和/或内含子。可将可能包括一个或几个内含子的SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列可操作地连接于来自相同的SH2A或SH2A样基因的启动子上，或者连接于来自另一种SH2A基因的启动子上。另外，所述SH2A或SH2A样核苷酸序列能够可操作地连接于能在植物细胞中起作用，但是与SH2A或SH2A样基因无关的启动子上。例如，能对缺氧条件作出反应的其它启动子的例子是一种合成的启动子，例如，它包括玉米Adh1基因的(Olive等1990)6AREs(ARE＝厌氧响应因子)的一个重复。
能够以组成型形式在植物细胞中发生作用的启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，苜蓿花叶病毒(AMV)启动子和强化甘露氨酸合成酶(MAC)启动子。业已对这些启动子作过充分的鉴定并可以普遍获得。可用于控制SH2基因表达的诱导型启动子的例子包括热激启动子，源于菠菜硝酸还原酶基因的硝酸诱导型启动子(Back等1991，植物分子生物学，19：9)，激素诱导型序列(例如，Yamagushi-Shinzaki.E等，1990，植物分子生物学，15：905，Kares等，1990，植物分子生物学，15：225)，以及光诱导型启动子，如RuBP羧化酶小亚基和LHCP基因家族。诱导型启动子的其它例子包括四环素诱导型启动子(Gatz等，1992，植物杂志，2：397)，糖皮质激素诱导型启动子(WO9938988)和披露于诸如EP0332104和WO9008826中的由化合物诱导的启动子。
还可以用组织专一性和发育调控启动子控制并调节SH2A或SH2A样基因的表达。其例子包括花粉专一性(A1bani等，1991，植物分子生物学，16：501；Twell等，1991，基因发育，5：496；Hamilton d.等，1992，植物分子生物学，18：211)；花专一性(van der Meer等，1990，植物分子生物学，15：95)，韧皮部专一性(De Witt.N.D.等，1991，细胞生物化学杂志增补本15A：69；Yang，N.-S.等，1990，美国科学院院报，87：4144)，根专一性(Depater，B.S.等，1992，植物分子生物学，18：161；Vanderzaal等，1991，植物分子生物学，16：983；Oppenheimer，D.G.等，1988，基因63：87)以及种子专一性启动子(Bustos，M.M.等，1991，EMBO J，10：1469；Stayton，M.，1991，澳大利亚植物生理学杂志，18：507)，包括披露于WO9903983中的κ羟化酶启动子。特别优选的启动子包括根专一性启动子，这样，SH2A或SH2A同系物的表达就能定向在植物根系中进行。在根系中定向进行SH2A或SH2A样基因表达，特别适用于提高适应性较差的植物对浸泡的抗性。所述根专一性启动子包括玉米根优势阳离子过氧化物酶基因的启动子(WO9856921)和甜菜储存根专一性基因的启动子，其转录活性在从有氧条件转变成厌氧条件时不会改变(WO9732027)。还可以使用本领域众所周知的分生组织专一性启动子(例如，披露于US5898096中)，以便将正义或反义方向的SH2A或SH2A样基因mRNA转录物定向到植物的分生组织部分。
本发明还涉及相当于SH2A和SH2A样基因的5’和3’调控区，包括它的启动子和终止区。因此，举例来说，SH2A的启动子可用于启动SH2A或SH2A样基因的表达，并用于启动其它异源序列，即与SH2A或SH2A样基因无关的编码序列的表达。所述5’调控区是在缺低氧气供应的条件下诱导的，因此，可用于在所述条件下启动多种不同编码序列的表达。另外，还可以通过用乙烯或其前体乙烯利处理进一步诱导SH2A或SH2A样基因启动子。
为了使SH2A或SH2A样基因进行调控表达，用含有能在植物中起作用的上述启动子的核酸序列转化植物，所述启动子可以包括可操作地与cDNA或基因组SH2A或SH2A样基因序列连接的SH2A或SH2A样基因启动子或其它启动子。通常，将所述核酸序列置于载体内，并可称之为遗传结构。SH2A或SH2A样基因还优选包括一个3’调控序列。当SH2A或SH2A样编码区可操作地连接于除了该编码序列5’上游天然存在的启动子之外的启动子上时，可将该核苷酸序列称为嵌合基因或嵌合基因结构。类似地，当SH2A或SH2A基因5’或3’样调控区可操作地连接于除了相应的SH2A或SH2A样基因的编码序列以外的编码序列上时，或者连接于一个完全无关的基因上时，还可将该核苷酸序列称为嵌合基因或嵌合基因结构。
植物的基因转移方法为本领域所熟知(Gelvin1998，Current Opin，Biotech，9：227)。可以通过Horsch等所披露的叶片转化-再生方法(1985，科学，227；1229-1231)将包括嵌合基因的SH2A或SH2A样基因导入植物。在本发明的范围内，还可以使用其它转化方法，如原生质体培养(Horsch等，1984，科学，223：496；DeBlock等，1984，EMBO J，2：2143；Barton等，1983，细胞，32：1033)和根转化(Valvekens等，1988，美国科学院院报，85：5536)。在一个优选实施方案中，用由农杆菌属衍生的载体转化植物，如由Klett等所披露的载体(1987，植物生理学年度综述，38：467)。所述转化载体包括二元载体、超二元载体、共整合载体和Ri衍生的载体，以及用于agrolistic转化的携带T-DNA的载体。可以用其它已知方法将本发明的嵌合基因插入植物细胞。所述其它方法包括biolistic方法(Klein等，1987，自然，327：70)，电穿孔、显微注射，化学诱导的DNA吸收，以及利用病毒或花粉作载体。
根据转化方法的需要，可以将SH2A或SH2A样基因或本发明的嵌合基因插入植物转化载体上，例如，由Bevan所披露的二元载体(1984，核酸研究，12：8711-8721)。植物转化载体可以通过改进根癌农杆菌的天然基因转移系统而得到。该天然系统包括大的Ti(肿瘤诱导)质粒，该质粒含有一个被称作T-DNA的大的片段，它被转移到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段vir区负责T-DNA的转移。T-DNA片段的旁侧是末端重复。在所述改进的二元载体上，去掉了所述肿瘤诱导基因，并且利用所述vir区的功能转移其旁侧为T-DNA边界序列的外源DNA。所述T-区还含有一个抗生素抗性的选择性标记，以及一个用于插入转移序列的多克隆位点。所述工程改造过的菌株被称为“解除武装的”根癌农杆菌菌株，并且，能够将其旁侧为T-区的序列高效转入植物的核基因组中。
用含有“解除武装的”外源DNA的根癌农杆菌接种表面消毒过的叶片和其它易感组织，培养若干天，然后转移到含有抗生素的培养基中。在含有合适的抗生素的培养基中长根之后，筛选转化过的芽，并且转移到土壤中。使转基因植物授粉，并收集来自这些植物的种子，并且在抗生素培养基上生长。
可以通过免疫学、组织化学、mRNA表达或活性测定，监测SH2A基因、SH2A样基因或本发明的嵌合基因结构在发育中的种子、幼苗和成熟的植株中的表达。为了测定SH2A样基因的表达，可以按例4所述方法进行Northern分析。当嵌合基因含有可操作地连接于除了SH2A或SH2A样基因之外的基因上时，用于测定该嵌合基因表达的方法的选择，取决于所述异源编码区的性质。例如，如果有合适的核苷酸探针的话，就可以用Northern分析评估转录。如果有由所述异源基因所编码的多肽的抗体的话，就可以用Western、RIA或ELISA分析和免疫组织化学定位评估所述多肽的生产和定位。
本发明的另一方面提供了含有本发明的SH2A、SH2A样基因和嵌合基因结构的转基因植物、后代、或这些植物的基本上衍生的品种。涉及到了单子叶植物和双子叶植物。在本文中，“基本上衍生的品种”是指这样的情况：(a)它主要源于原有的品种。(b)它不同于原有的品种，和(c)在所导入的转基因的表达方面，它与原有的品种基本上一致。
通过上述任何一种植物转化方法，用SH2A或SH2A样基因或嵌合基因结构转化植物细胞。转化过的植物细胞通常是愈伤组织培养物、叶片、外殖体或全植株形式的(通过Bechtold等的真空渗入方法，1993，C.R.Acad.Sci.Paris，316；1194-1199)，通过本领域技术人员所熟知的方法将其再生成完整的转基因植物(Horsh等，1985)。由于转化植物的后代和基本上衍生的品种，继承了所述嵌合基因，来自转化过的植物或其基本上衍生的品种的花粉、卵、种子、块茎或切穗，可用于保持所述转化品系或其基本上衍生的品种的性状。
本发明还包括来自能表达SH2A或SH2A样蛋白或含有SH2A或SH2A样嵌合基因结构的转基因植物的花。
下面的实施例对本发明作进一步的说明，但并非要以任何方式限定本发明。
                           例1
                   植物材料和培养条件
深水水稻(Oryza sativa L.，Pin Gaew56)是从国际水稻研究所(LosBanos，菲律宾)获得的。按照公开方法让植物生长12-14周(Sauter，1997)。所有实验是在25℃下，在生长箱中，在连续光照(200μE/m-2Ss-1)条件下进行的。为了进行浸泡实验，将全植株放入装有自来水的体积600升的塑料桶中，按公开方法进行(Lorbiecke和Sauter，1999)。将对照植物保留在同一个生长箱中。激素和抑制剂效应分析，是用切除的、含有最上面的生长效应节间的茎段进行的(Raskin和Kende，1984)。在装有25毫升水溶液的体积为150毫升的烧杯中培养茎段，所述水溶液含有所标明浓度的赤霉素A3(GA3)或激素前体乙烯利(2-氯乙烷磷酸，E)，或者烧杯中只装有水作为对照。对照茎段在水中培养0.5或3小时。对于乙烯利处理的茎段来说，在水中预培养0.5小时，然后添加乙烯利再培养2.5小时。
为了确保高湿度，将所述烧杯放入塑料筒中。按照公开方法(Lorbiecke和Sauter，1999)用浓度为50微升/升的气相2，5-降冰片二烯(二环[2.2.1.]七-2，5-双烯，NBD)抑制乙烯的作用。
为了抑制蛋白合成，用所标明浓度的环己酰亚胺的水溶液培养茎的切片3小时。当乙烯利与环己酰亚胺同时使用时，首先单独在环己酰亚胺溶液中将茎切片预培养30分钟，以确保在添加乙烯利到150μM浓度之前，抑制蛋白合成2.5小时。
                           例2
    水稻上浸泡诱导的早期响应基因的分子克隆和序列分析
在部分浸泡的深水水稻植物的不定根中鉴定浸泡诱导的基因，利用基于PCR的扣除杂交方法从水稻中分离浸泡诱导的早期响应基因(SH2)。按照Buchanan-Wollaston和Ainsworth(1997)披露的方法进行基于PCR的扣除杂交，用来自未浸泡过的深水水稻植物的第三节的不定根的mRNA合成的cDNA作为驱动群体，并且用来自部分浸泡了2小时的植物的cDNA作为目标群体。为了获得完整长度的cDNA，按照“DIG系统用户指南”(Boehringer Mannheim，德国)，使用洋地黄毒苷标记过的在基于PCR的扣除杂交中鉴定的373bp的cDNA-片段筛选深水水稻λ-ZAPII-cDNA文库(Sauter，1995)。从总共2×105个重组噬菌体中回收了6个强杂交噬菌斑。通过Sanger等的双脱氧核苷酸链终止方法(1977)，用ABI PRISM染料终止循环测序试剂盒(应用生物系统，Weisterstadt，德国)，从两端对含有最长的插入片段的克隆进行测序。最长的克隆被称为SH2A(gbAF050200)，含有872bp插入片段。SH2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。496-867号核苷酸之间的序列与用于文库筛选的cDNA片段相同。SH2A编码一个597bp的开放读框。推测的多肽长度为199个氨基酸，推测的分子量为23.6kDa。相应于SH2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。位于30-33号核苷酸之间的5’非翻译区上的框内终止密码子表明SH2A包括推测蛋白的完整编码区。
                            例3
                        计算机分析
从国家农业资源研究所(Tsukuba，日本)水稻基因组研究计划获得水稻EST-克隆S2993和S12166，并且通过Sanger等的双脱氧核苷酸链终止方法(1977)，用ABI PRISM染料终止循环测序试剂盒(应用生物系统，Weisterstadt，德国)，从两端进行测序。用DNasis 5.11程序(日立软件工程有限公司，1984，1991)分析DNA序列数据，并且实际上进行翻译。用BLAST2.0.3程序(Ausubel等，1997)在Swiss-Prot、TrEMBL(Bairoch和Apweiler，1998)EMBL(Stoesser等，1998)、GenBank(Benso等，1998)、DDBJ(Tateno等，1998)和PIR(Barker等，1998)数据库的实际输出中检索同系物。将鉴定的表示相同基因的ESTs进行in silico克隆，以便获得推测的开放读框的完整序列信息。用CLASTAL X1.64b程序运算序列排比(Thomson等，1997)，并且用GeneDoc2.1进行人工编辑(Nicholas和Nicholas，1997)。用CLASTAL X1.64b和Treeview1.31(Page，1996)进行系统发育分析。推测的SH2A二级结构来自用六种不同的预测程序运算的综合结果(Ito等，1997；White等，1994；Rost和Sander，1993，1994；Gilbert等，1987；Chou和Fasman，1978；Kneller等，1990)。只考虑在6个预测程序中有4个得出相似结果的片段。
数据库同源性检索鉴定了三个与SH2A相同的水稻EST，和代表SH2A的一个相近的序列同系物的四个EST。表示SH2A同系物S2993和S12166的EST中的两个是从水稻基因组研究计划获得的，并且进行了全面测序。被称为SH2B的S2993(gbAF068332)含有一个980bp的插入片段，和一个编码198个氨基酸的开放读框。一个框内终止密码子位于5’非翻译区。S12166与SH2B相同，所不同的是，在poly-A-尾巴前面有64个核苷酸的延长，表示另一种聚腺苷酸化的SH2B。
SH2A和SH2B编码区之间的核苷酸序列同源性为84％。在这两个克隆的5’-和3’-非翻译区之间没有发现明显的同源性。进一步分析发现，SH2A和SH2B是一种新类型的高度保守的蛋白的成员。对核苷酸和蛋白数据库进行计算机检索发现，SH2A的推测的开放读框与相当于其它植物、动物和真菌的多种EST的假设蛋白的推测的蛋白和推测的开放读框之间具有明显的同源性(图2)。通过分析EST和基因组序列在拟南芥上鉴定了4种转录的SH2同系物。另外，鉴定了来自其它双子叶植物的相近SH2同系物的EST。比较来自植物的SH2同系物的推测的完整长度序列，发现氨基酸相同性为57-92％(图3)。人同系物的推测的氨基酸序列与SH2A的相同性为50％，相似性为67％。推测的酿酒酵母和粟酒裂殖酵母蛋白与SH2A之间的氨基酸相同性分别为32和33％。大多数真核序列含有一个推测的核定位信号(KRXR，位于SH2A的64-67号位置)。包括SH2A和SH2B的某些序列含有一个R(X)2L(X)2，3N破坏框基序(Glotzer等，1991)。
当比较SH2A和源于枯草芽孢杆菌、Aquifex aeolicus和铜绿假单胞菌的三种细菌蛋白时，发现了比较弱的同源性(图2)。由mmsR编码的铜绿假单胞菌蛋白是甲基丙二酸半醛脱氢酶操纵子的正调节物(Steele等，1992)。mmsR被确定为阳性细菌转录调节物XylS/AraC家族的一员。大多数家族成员含有一个保守的DNA结合结构域，该结构域位于通过接头与非保守区连接的C-末端(Gallegos等，1997)。SH2A与mmsR之间的同源区位于mmsR的非保守结构域上。另外，对该区域进行的亲水性分析(Kyte和Doolittle，1982)发现了结构相似性(图4)。
比较进行排比的SH2-相关序列，确定最高程度的保守区在SH2A蛋白的91-118和133-161号氨基酸之间(图2)。133-161之间片段的特征是具有高含量的疏水性残基和推测的-螺旋，随后是两个推测的-折叠。在所有序列上有一个保守的脯氨酸残基(SH2A的P139)。源于植物、高等动物和人的SH2同系物的N-末端区非常相似，但是，在秀丽新杆线虫、真菌、和细菌的序列之间该区域的保守性比较低。这一结果体现在由现有的完整长度序列运算出来的系统发育关系上(图5)。
                         例4
              SH2A和SH2B的浸泡响应表达
为了测定浸泡决定型表达，通过RNA凝胶印迹杂交分析SH2A和SH2B的mRNA丰度。从来自在空气中生长的或部分浸泡的深水水稻植物的最嫩的节间的不同部分或第三节间的不定根中分离RNA。因此，使用位于第二节上方0-5毫米的最嫩的节间的组织切片，它含有位于第二节上方5-15毫米的居间分生组织，含有伸长区，以及位于第二节上方15-30毫米并且含有分化区的部分(Lorbieeke和Sauter，1997)。按照公开方法分离第三节的不定根(Lorbieeke和Sauter，1999)。立即在液氮中冷冻所述组织，并在-70℃下保存直至RNA提取。用TRIzol试剂(Gibco BRL)分离总RNA，并按照公开方法用4M氯化锂沉淀(Puissant和Houdebine，1990，Lorbieeke和Sauter，1997)。按照以前公开的方法分离RNA并进行Northern印迹杂交(Lorbieeke和Sauter，1998)。为了进行Northern印迹分析，通过在含有6％甲醛的1％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳分离20微克总RNA。按照Lorbieeke和Sauter(1998)的方法将RNA吸印到尼龙膜上(HybondN+；Amersham，Braunschweig，德国)。为了进行杂交，用‘Rediprime标记试剂盒’(Amersham，Braunschweig，德国)，用32P对覆盖SH2A(nt496-867)和SH2B(nt513-980)的3’-区的基因专一性cDNA片段进行随机引物法标记。杂交是在68℃下，在1％SDS、1M氯化钠、10％(w/v)葡聚糖硫酸酯和加热变性的鲑鱼精子DNA中进行一夜。在68℃下，用1×SSC(0.15M氯化钠，15mM柠檬酸钠，PH7.0)洗涤印迹一次，68℃下，用1×SSC、1％(w/v)SDS洗涤一次，每次洗涤10分钟(Sauter，1997)。
在分析的组织中瞬时诱导SH2A表达。最强的诱导出现在居间分生组织(IM)和最嫩的节间的伸长区(EZ)上(图6A)。在分化区和不定根中积累了比较少的转录物。在居间分生组织中在0-1小时，以及伸长区中在1-2小时，SH2A的mRNA丰度增加。在这两种组织中，最大mRNA丰度出现在浸泡后2小时(图6B)。在浸泡2-6小时之后，SH2A的mRNA转录物降低到对照水平。相反，用SH2B的基因专一性探针进行的Northern分析，在分析的时间点上没有在任何组织中发现mRNA丰度有明显改变(图6A)，表明该基因是组成型表达的。
在浸泡诱导过的水稻植物中，SH2A表达和关键的厌氧响应蛋白丙酮酸脱羧酶2的表达十分相似(图6A和图6B)。与SH2A基因表达类似，节间中丙酮酸脱羧酶2基因的表达是由乙烯调控的。不过，与SH2A不同的是，丙酮酸脱羧酶2不是早期响应基因。丙酮酸脱羧酶2的表达取决于蛋白合成(例6，图9)。以上结果表明，SH2A基因产物参与调控包括丙酮酸脱羧酶在内的厌氧响应蛋白，因此，必然会控制抗浸泡性或抗涝性。
                          例5
                SH2A和SH2B的基因组组构
按照公开方法从11周龄深水水稻最嫩的叶片中分离基因组DNA(Dellaporta等，1983)，用BamHI、ClaI、HindIII、KpnI或PstI消化5-6小时，并在1％(w/v)琼脂糖凝胶上通过电泳分离。将DNA毛细吸印到尼龙膜上(Hybond N+；Amersham，Braunschweig，德国)，并且在高严格条件下与基因专一性探针杂交，正如介绍Northern分析时所述(例4)。为了检测SH2-相关序列，在较低严格条件下用SH2A-cDNA作探针进行杂交。Southern分析是在类似于Northern分析的低严格条件下进行的(例4)，所不同的是，杂交和洗涤步骤是在55℃而不是68℃下进行的。为了检测SH2-相关序列，在较低严格条件下用SH2A-cDNA作探针进行杂交。用SH2A基因专一性探针对水稻基因组DNA进行Southern印迹分析，在用严格条件进行杂交和洗涤时，用5种不同的酶检测到了一条带(图1A)。用SH2B基因专一性探针，在用严格条件进行洗涤时，用4种不同的酶检测到了一条带，用PstI消化过的DNA检测到两条带(图1B)。在所述cDNA序列上不存在PstI限制位点，这表明在SH2B基因上存在至少一个内含子。以上结果表明，SH2A和SH2B在水稻基因组中是单拷贝基因。在低严格条件下，用完整SH2A-cDNA对相同的印迹进行Southern分析，几乎所有的可见条带都是用SH2A或SH2B基因专一性探针检测到的信号，这表明在水稻中没有其它相关的SH2同系物(图1)。
                       例6
                SH2A基因表达的诱导
为了分析SH2A基因的激素决定型表达，用不同的激素或抑制剂溶液处理包括最嫩的节间的分离的茎段2.5小时。从包括居间分生组织和伸长区的部位分离总RNA，并且分析SH2A转录物丰度(图8A)。在对照中，SH2A表达受到了轻度诱导，这可能是因为将所述组织从植株上切除所至。
用150μM乙烯利(2-氯乙烷磷酸)处理茎段，会导致SH2A转录物含量明显提高。当同时使用乙烯利和乙烯作用抑制剂——降冰片二烯时(使用浓度为50微升/升的气体)，SH2A转录物含量降低到对照水平(图7)。以上结果表明，SH2A基因是由乙烯调控的。与对照相比，用50μM GA3培养2.5小时之后，不会导致SH2A转录物含量提高。GA3与乙烯利组合或GA与降冰片二烯组合所得到的结果与没有GA3时类似(图7)。
为了确定乙烯利决定型SH2A表达形式，每隔一小时从用150μM乙烯利培养过的茎段的分生组织和伸长区分离总RNA。Northern印迹分析在两种组织中，在0-2小时之间发现了SH2A的mRNA增加(图8A)。在培养2小时之后检测到最大mRNA丰度。在2-6小时之间，mRNA含量降低到对照水平。比较用乙烯利处理过的分离的茎段和部分浸泡的完整植株(图6B)，分别在居间分生组织和伸长区中发现了类似形式的瞬时SH2A表达。
为了确定SH2A基因表达的剂量决定型响应，用不同浓度的乙烯利培养分离的茎段2.5小时。所使用的乙烯利浓度为0.015、0.15、1.5、15、和150μM。对从居间分生组织中分离的RNA进行的Nortern印迹分析发现，用少到1.5μM的乙烯利就能诱导SH2A转录物的积累(图8B)。在有环己酰亚胺(CHX)——一种已知的蛋白合成抑制剂的条件下，能诱导SH2A基因表达。这一发现证实，SH2A基因是在没有从头进行的蛋白合成的条件下诱导的。只用CHX处理茎段，也会导致SH2A转录物的积累(图9A)。这种现象经常出现在早期响应基因上，并且，被称为超级诱导。剂量响应试验发现，基因诱导需要20微克/毫升和更高浓度的环己酰亚胺。据报道，上述浓度能有效抑制蛋白合成，这可能表明正常情况下，SH2A基因表达是由一种不稳定蛋白抑制的(图9B)。
上述发现：(i)SH2A基因表达的时间过程(图6A和6B)；(ii)通过乙烯，而不是赤霉素调控转录(图7)；(iii)基因诱导定位在幼小组织内；和(iv)确定SH2A是早期相应调节物；表明了SH2A蛋白是调控赤霉素体内稳态的信号成分，它会导致水稻茎干内赤霉素含量改变。通过对赤霉素含量的影响，SH2A能改变水稻的生长响应。
                           例7
      拟南芥属SH2A样基因激素调控型基因表达的证据
对来自EMBL数据库的拟南芥ATH1(保藏号Z97336)、ATH2(保藏号Z97336)和来自GenBank数据库的ATH3(保藏号AC002505)这三个SH2A样基因的启动子区进行的序列分析，发现了若干顺式作用因子，业已在其它基因上证实了这些因子参与信号决定型基因调控(Dolferos等，1994；Gubler和Jacobson，1992；Gubler等，1995；Manjunath和Sachs，1997；Ohme-Takagi和Shinshi，1995；Olive等，1990)。在拟南芥属上鉴定的上述因子参与对厌氧生活、乙烯、GA或ABA作出响应。在图10中示出了来自拟南芥的三个SH2A样基因的启动子区的顺式因子的示意图。
                          例8
            在缺氧条件下分析酵母(酿酒酵母)
             和动物细胞中SH2A样基因的表达
在氧气调控的培养箱中，在含氧量正常的条件下(21％氧气，5％二氧化碳，75％氮气)和在不同氧气浓度下，在30℃下，在基本培养基中生长酵母细胞。
在含氧量正常的条件下，在增湿培养箱中，在30℃下，在补充了核糖核苷酸(Gibco，NY)和10％胎牛血清的最低基本α培养基中维持动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用能产生不同氧气浓度和平衡的氮气的氧气调控培养箱，在低氧气(10％、5％、2％氧气)条件下培养细胞。
在含氧量正常的条件下和缺氧条件下培养48小时之后，收集所述酵母细胞或CHO细胞，并分离总RNA。用针对相应SH2A样mRNA的标记过的探针通过Northern印迹或通过定量RT-PCR分析相应的SH2A样基因在不同氧气浓度下的表达形式。
                          例9
            通过基因破坏和超量表达调节酵母
        (酿酒酵母)SH2A样基因表达；分析缺氧抗性
为了获得剔除了SH2A样基因的突变型酵母，将诸如URA4的营养缺陷型标记克隆到酵母SH2A样基因的两个片段之间。所述片段是用两套引物通过PCR获得的，第一套引物用于扩增SH2A样基因的5’部分，第二套引物用于扩增SH2A样基因的3’部分。将所得到的用URA4破坏的SH2A样基因片段用于转化脲嘧啶原养型酵母菌株。筛选稳定的ura+转化体，即破坏的SH2A样基因与内源基因发生了同源重组的转化体，并通过PCR分析证实酵母SH2A基因同系物的破坏。
然后，通过在例8所述培养条件下测定相对相应的野生型酵母生长速度的生长速度，分析筛选的酵母菌株对缺氧的抗性。对缺氧的抗性不及野生型酵母的突变体，可以进一步用不同来源的SH2A样基因转化，以便分析剔除型酵母SH2A样基因的互补作用。
为了超量表达酵母SH2A基因同系物，将所述基因可操作的连接于诸如PGK-启动子的组成型启动子上，或连接于诸如ADH2-启动子的诱导型启动子上。将所得到的嵌合基因导入诸如2μ-质粒的能自主复制的质粒中。将携带所述嵌合的SH2A基因的质粒转入施加了适当选择的酵母中。在诱导所述嵌合的SH2A基因表达之后，如果必要，通过在例8所述培养条件下测定相对相应的未转化过的酵母生长速度的生长速度，分析转化过的酵母菌株对缺氧抗性的增强。
                         例10
       拟南芥SH2A-同源基因表达的调节：沿正义方向
    和反义方向(超量)表达拟南芥SH2A基因的转基因植物
按照花浸泡转化方法(Clough和Bent，植物杂志，16：735-743)和其它合适的转化方法，用根癌农杆菌转化拟南芥。根癌农杆菌所含有的植物转化载体具有携带下面任一种成分的T-DNA：
a)为了超量表达正义SH2A基因同系物：将诸如卡那霉素抗性标记的植物选择标记和拟南芥SH2A基因同系物可操作地连接于诸如CaMV35S的组成型启动子或组织专一性或组织优选性启动子上，以便实现SH2A的分生组织专一性表达；或
b)为了反义抑制SH2A基因同系物：将诸如卡那霉素抗性标记的选择标记和拟南芥SH2A基因同系物或其部分沿反义方向连接于组织专一性或组织优选性启动子上，对于SH2A来说，优选连接于分生组织专一性启动子上。
在开花期让筛选的转化过的拟南芥植株自花授粉，鉴定纯合的后代，并按照例15所披露的方法进一步分析。
                        例11
在转基因水稻中水稻SH2A和SH2B基因表达的超量表达和抑制
用根癌农杆菌转化源于水稻未成熟胚胎的胚胎发生愈伤组织(Hiei等，1994，植物杂志，6：271-282)。根癌农杆菌所含有的植物转化载体具有携带下面任一种成分的T-DNA：
a)为了超量表达正义SH2A或SH2B基因：将诸如nptII的植物选择标记和水稻SH2A和SH2B基因可操作地连接于组成型启动子上，或对于SH2A来说，优选连接于分生组织专一性启动子上；或
b)为了抑制SH2A和SH2B基因表达：将诸如nptII的植物选择标记和水稻SH2A和SH2B基因或其部分沿正义和反义方向连接于组成型启动子上，对于SH2A基因来说，优选连接于分生组织专一性启动子上。
可以用组成型启动子在所有组织中实现基因表达或抑制，或者用组织优选或组织专一性启动子只能在某些组织中实现基因表达或抑制，例如，对于SH2A来说，为分生组织。
让筛选的转化过的水稻植株自花授粉，鉴定纯单基因座转化体，以便进行表现型分析(例15)。
                          例12
    分析具有受调节的SH2A样基因表达的拟南芥对缺氧的抗性
通过评估其对水淹的抗性，分析在例10中获得的具有受调控的SH2A样基因同系物的纯合型拟南芥对缺氧的抗性。抗水淹的参数如下：
a)植物存活率
b)存活植物的大小
c)存活植物的水淹时间。
                       例13
   SH2A样基因在动物细胞中的超量表达和缺氧抗性分析
将人或小鼠SH2A基因同系物的编码序列克隆到诸如pcDNA3.1(In Vitrogen.CA.USA)的可选择的哺乳动物表达载体上，该载体含有巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子，用于高水平表达，并含有neo基因，用于筛选转染过的细胞。按照生产商的方法，利用脂转染胺(生命技术公司，MD，USA)将所得到的载体转染到CHO细胞(有关培养物的保持参见例8)中。挑选新霉素抗性菌落，并以5×104细胞的密度铺平板到24孔平板(Nunc.丹麦)上，在含氧量正常的条件下(参见例8)培养12小时，然后更新培养基。同时，在相同条件下接种未转化过的细胞并培养。
在更新培养基之后，在缺氧条件下(2％氧气)培养具有能表达SH2A基因同系物的转化过的细胞和未转化过的细胞不同的时间(48、72、96小时)。通过用台盼篮排除法和/或中性红吸收方法活性染色，评估在培养不同时间之后，不同细胞的存活率。用台盼篮(400毫克/升，用PBS配制)培养10分钟能使死亡的细胞染色，并可以通过显微镜观察。用中性红(56毫克/升，用PBS配制)培养2小时能使活的细胞染色。用PBS洗涤之后，用酸性乙醇(100mM乙酸钠，PH4，50％乙醇)裂解细胞，并通过在540nm处测定的吸收值定量被活的细胞吸收的染料的释放。
                         例14
      通过调节SH2A样基因表达调节厌氧响应基因表达
将表现出SH2A样基因调控表达的在缺氧条件下培养的酵母和浸泡的拟南芥植物(参见例9-10)分别与在缺氧条件下培养的野生型酵母和浸泡的野生型拟南芥植物进行比较，比较编码厌氧响应蛋白丙酮酸脱羧酶的基因的表达形式。
                            例15
           SH2A和SH2B基因或同系物表现出基因表达
       受到调节的水稻和拟南芥转基因植物的表现型分析
通过评估其对水淹的抗性，分析在例10和11中获得的具有受调控的SH2A或SH2B基因或同系物的转基因水稻和拟南芥植物对缺氧的抗性。抗水淹的参数如下：
a)植物存活率
b)存活植物的大小
c)存活植物的水淹时间。
与非转基因对照相比，用SH2A或SH2B转化过的植物表现出存活率提高和生物物质增加。
另外，还在正常生长条件下分析了一般的产量相关参数。
                         例16
          鉴定拟南芥ATH3基因上的转座子插入突变
按照基于PCR的方法，筛选插入ATH3基因的多种拟南芥En-1转座子插入突变(ZIGIA综合，Max-Planck-Institut fur zuchtungschung.Cologne.德国)，并鉴定了4个独立的品系。试图由这4个品系产生纯合的插入突变型，但是没有成功。以上结果表明，ATH3剔除型没有活性，因此，ATH3是拟南芥的必需基因。对拟南芥基因ATH1、ATH2H和ATH4进行了类似筛选。
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 R.罗尔比克(Lorbiecke，Rene)<120>在缺氧条件下改变生长和适应<130>CropDesign<140>PCT/IB01/00745<141>2001-08-17<150>US 60/183,572<151>2000-02-18<150>US 09/785,738<151>2001-02-16<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>872<212>DNA<213>水稻(Rice)<220><221>CDS<222>(69)..(668)<223><400>1agacgaacaa aaaacagaat ccatcgccat aatcgaaggt tcgctcttgc ttccaccccg     60caatccac atg gag aac gaa ttc cag gat ggt aag acg gag gtg ata gaa     110
     Met Glu Asn Glu Phe Gln Asp Gly Lys Thr Glu Val Ile Glu
     1               5                   10gca tgg tac atg gat gat age gaa gag gac cag agg ctt cct cat cac      158Ala Trp Tyr Met Asp Asp Ser Glu Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His15                  20                  25                  30cgc gaa ccc aaa gaa ttc att cct gtt gat aag ctt aca gaa cta gga      206Arg Glu Pro Lys Glu Phe Ile Pro Val Asp Lys Leu Thr Glu Leu Gly
            35                  40                  45gta atc agc tgg cgc cta aat cct gat aac tgg gag aat tgc gag aac      254Val Ile Ser Trp Arg Leu Asn Pro Asp Asn Trp Glu Asn Cys Glu Asn
        50                  55                  60ctg aag aga atc cgc gaa gcc aga ggt tac tct tat gtg gac att tgt      302Leu Lys Arg Ile Arg Glu Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Val Asp Ile Cys
    65                  70                  75gat gtg tgc cca gag aag ctg cca aat tat gaa act aag atc aag agt      350Asp Val Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Thr Lys Ile Lys Ser
80                  85                  90ttc ttt gaa gaa cac ctg cat acc gat gaa gaa ata cgc tat tgt ctt      398Phe Phe Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Leu95                  100                 105                 110gaa ggg agt gga tac ttt gat gtg aga gac caa aat gat cag tgg att      446Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Gln Asn Asp Gln Trp Ile
            115                 120                 125cgt ata gca ctg aag aaa gga ggc atg att gtt ctg cct gca ggg atg      494Arg Ile Ala Leu Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Met
        130                 135                 140tac cac cgc ttt acg ttg gac acc gac aac tat atc aag gca atg cga      542Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg
    145                 150                 155ctg ttt gtt ggc gat cct gtt tgg aca ccc tac aac cgt ccc cat gac      590Leu Phe Val Gly Asp Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp
160                 165                 170cat ctt cct gca aga aag gag ttt ttg gct aaa ctt ctc aag tca gaa      638His Leu Pro Ala Arg Lys Glu Phe Leu Ala Lys Leu Leu Lys Ser Glu175                 180                 185                 190ggt gaa aat caa gca gtt gaa ggc ttc tga gggttttgtt gggctcctgc        688Gly Glu Asn Gln Ala Val Glu Gly Phe
            195actgcggttc tatattcaac ctgaataaga tgtgctatag caatgtaaat ttagcacagt    748ggctatggtc gccactcacc aacttgaagt gaaagattta atgatttttg ttaattctta    808tgtatcaatc ggcatatagc atttccgaaa tgtgttttca ataaacagga gtcatgaagc    868tgaa                                                                 872<210>2<211>199<212>PRT<213>水稻(Rice)<400>2Met Glu Asn Glu Phe Gln Asp Gly Lys Thr Glu Val Ile Glu Ala Trp1               5                   10                  15Tyr Met Asp Asp Ser Glu Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu
        20                  25                  30Pro Lys Glu Phe Ile Pro Val Asp Lys Leu Thr Glu Leu Gly Val Ile
    35                  40                  45Ser Trp Arg Leu Asn Pro Asp Asn Trp Glu Asn Cys Glu Asn Leu Lys
50                  55                  60Arg Ile Arg Glu Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Val Asp Ile Cys Asp Val65                  70                  75                  80Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Thr Lys Ile Lys Ser Phe Phe
            85                  90                  95Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Leu Glu Gly
        100                 105                 110Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Gln Asn Asp Gln Trp Ile Arg Ile
    115                 120                 125Ala Leu Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Met Tyr His
130                 135                 140Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe145                 150                 155                 160Val Gly Asp Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu
            165                 170                 175Pro Ala Arg Lys Glu Phe Leu Ala Lys Leu Leu Lys Ser Glu Gly Glu
        180                 185                 190Asn Gln Ala Val Glu Gly Phe
    195<210>3<211>980<212>DNA<213>水稻(Rice)<220><221>CDS<222>(139)..(735)<223><400>3cggacgcgtg ggcagattgc gttgagctga agctgttcgt gtgactcttc tacaccttcc     60aggctatccg gaatcgggag ggtttcccaa taggaaagca actcaggact caggagcggc    120gtctgagagg tttcagag atg gag aac cag ttc cag gat ggc aag gag gag      171
                Met Glu Asn Gln Phe Gln Asp Gly Lys Glu Glu
                1               5                   10gtc atc gaa gct tgg tac atg gat gac agt gaa gag gac cag agg ctt      219Val Ile Glu Ala Trp Tyr Met Asp Asp Ser Glu Glu Asp Gln Arg Leu
        15                  20                  25cct cat cat cgt gag ccc aaa gaa ttc att cct ctt agc aaa ctt tca      267Pro His His Arg Glu Pro Lys Glu Phe Ile Pro Leu Ser Lys Leu Ser
    30                  35                  40gag tta gga ata tta agc tgg cgc ctg aat gct gat gac tgg gag aat      315Glu Leu Gly Ile Leu Ser Trp Arg Leu Asn Ala Asp Asp Trp Glu Asn
45                  50                  55gat gag aac ctc aag aaa atc cgt gag gcc agg gga tac tct tac atg      363Asp Glu Asn Leu Lys Lys Ile Arg Glu Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Met60                  65                  70                  75gat att tgt gat gtg tgt cca gaa aag ctg cca aac tat gag gct aag      411Asp Ile Cys Asp Val Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Ala Lys
            80                  85                  90ctg aaa aat ttc ttt gaa gaa cac ttg cat act gat gaa gag ata cgc      459Leu Lys Asn Phe Phe Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg
        95                  100                 105tat tgt ctt gag gga agt gga tac ttc gat gtc agg gac caa aat gat      507Tyr Cys Leu Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Gln Asn Asp
    110                 115                 120cag tgg atc cgt gta gca gtg aag aaa ggg ggc atg att gtt ttg cct      555Gln Trp Ile Arg Val Ala Val Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro
125                 130                 135gcg gga atg tat cac cgc ttc aca ttg gac agt gac aac tac atc aag      603Ala Gly Met Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Ser Asp Asn Tyr Ile Lys140                 145                 150                 155gca atg cgg ctc ttt gtg gga gag cct gtc tgg acg ccg tac aac cgt      651Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg
            160                 165                 170ccc cat gac cat ctg cca gct aga aag gag tat gtc gaa aaa att atc      699Pro His Asp His Leu Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Val Glu Lys Ile Ile
        175                 180                 185aac agg ggt gga act caa gct gtc gaa gct cgt taa aggcatatca           745Asn Arg Gly Gly Thr Gln Ala Val Glu Ala Arg
    190                 195agatgtgctt cctagttcgg tgttctgtta cactctacag atactgaata aactgtgcta    805tcagctgttg caatgggctc ctaccgacat cttacatcat ttggcagtat tttgcacaaa    865cccgcttaaa atctccctga aaatacgcac gtcaccatgt cagagtgttt atatacaata    925atgacacttc agtccacagt cagcaaggga ctaatgacaa aaaaaaaaaa aaaaa         980<210>4<211>198<212>PRT<213>水稻(Rice)<400>4Met Glu Asn Gln Phe Gln Asp Gly Lys Glu Glu Val Ile Glu Ala Trp1               5                   10                  15Tyr Met Asp Asp Ser Glu Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu
        20                  25                  30Pro Lys Glu Phe Ile Pro Leu Ser Lys Leu Ser Glu Leu Gly Ile Leu
    35                  40                  45Ser Trp Arg Leu Asn Ala Asp Asp Trp Glu Asn Asp Glu Asn Leu Lys
50                  55                  60Lys Ile Arg Glu Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Met Asp Ile Cys Asp Val65                  70                  75                  80Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Asn Phe Phe
            85                  90                  95Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Leu Glu Gly
        100                 105                 110Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Gln Asn Asp Gln Trp Ile Arg Val
    115                 120                 125Ala Val Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Met Tyr His
130                 135                 140Arg Phe Thr Leu Asp Ser Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe145                 150                 155                 160Val Gly Glu Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu
            165                 170                 175Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Val Glu Lys Ile Ile Asn Arg Gly Gly Thr
        180                 185                 190Gln Ala Val Glu Ala Arg
    195<210>5<211>774<212>DNA<213>番茄(Tomato)<220><221>CDS<222>(1)..(591)<223><400>5gca cca gat cca aga gag gat gtc ata cag gca tgg tac atg gat gac       48Ala Pro Asp Pro Arg Glu Asp Val Ile Gln Ala Trp Tyr Met Asp Asp1               5                   10                  15aac gat gag gac cag agg ctt cct cat cac cgt gag cca aag gaa ttt       96Asn Asp Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu Pro Lys Glu Phe
        20                  25                  30gtg tct ctt gac aag ctg gct gaa ctt gga gtg ctc agc tgg aga ctt      144Val Ser Leu Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu Ser Trp Arg Leu
    35                  40                  45gat gct gac aat tat gag act gat gag gag ttg aag aaa att cgg gaa      192Asp Ala Asp Asn Tyr Glu Thr Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ile Arg Glu
50                  55                  60gat cgt gga tat tca tac att gat ttc tgt gag gtt tgc cct gag aaa      240Asp Arg Gly Tyr Ser Tyr Ile Asp Phe Cys Glu Val Cys Pro Glu Lys65                  70                  75                  80cta ccg aat tac gag gag aaa atc aag aac ttt ttt gaa gaa cac ctg      288Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Asn Phe Phe Glu Glu His Leu
            85                  90                  95cac acc gac gag gag atc cgt tac gct gtt gca gga agt ggt tac ttt      336His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Ala Val Ala Gly Ser Gly Tyr Phe
        100                 105                 110gat gtc cgc gat gtg aat gag agc tgg att cgc gtc tgg gta aag aaa      384Asp Val Arg Asp Val Asn Glu Ser Trp Ile Arg Val Trp Val Lys Lys
    115                 120                 125ggt gga atg att gtt ctt cct gct gga atc tat cac cgc ttc acg ctt      432Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu
130                 135                 140gat tca agc aac tac att aag gca atg cgt ctc ttt gtt ggt gac cca      480Asp Ser Ser Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Asp Pro145                 150                 155                 160att tgg act cca tac aat cgt cca cat gat cat ctt ccc gca agg caa      528Ile Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu Pro Ala Arg Gln
            165                 170                 175gaa tat gtt gag acg ttt gtc aac gca gat ggc gct ggt cgt gct gtt      576Glu Tyr Val Glu Thr Phe Val Asn Ala Asp Gly Ala Gly Arg Ala Val
        180                 185                 190aat gct gct gct taa atcaactata ggagaggaat ttgaaatcgt actagattgt      631Asn Ala Ala Ala
    195aataaatatt accatatggt ggctttgctg ttcttgatgt gtgccttact aagcatgttt    691aatgttgtat tgtggcacta aataaatcac cccctatggg agattgattg tttatatgca    751agtggaattt attatgtgat ttt                                            774<210>6<211>196<212>PRT<213>番茄(Tomato)<400>6Ala Pro Asp Pro Arg Glu Asp Val Ile Gln Ala Trp Tyr Met Asp Asp1               5                   10                  15Asn Asp Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu Pro Lys Glu Phe
        20                  25                  30Val Ser Leu Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu Ser Trp Arg Leu
    35                  40                  45Asp Ala Asp Asn Tyr Glu Thr Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ile Arg Glu
50                  55                  60Asp Arg Gly Tyr Ser Tyr Ile Asp Phe Cys Glu Val Cys Pro Glu Lys65                  70                  75                  80Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Asn Phe Phe Glu Glu His Leu
            85                  90                  95His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Ala Val Ala Gly Ser Gly Tyr Phe
        100                 105                 110Asp Val Arg Asp Val Asn Glu Ser Trp Ile Arg Val Trp Val Lys Lys
    115                 120                 125Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu
130                 135                 140Asp Ser Ser Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Asp Pro145                 150                 155                 160Ile Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu Pro Ala Arg Gln
            165                 170                 175Glu Tyr Val Glu Thr Phe Val Asn Ala Asp Gly Ala Gly Arg Ala Val
        180                 185                 190Asn Ala Ala Ala
    195<210>7<211>603<212>DNA<213>番茄(Tomato)<220><221>CDS<222>(3)..(572)<223><400>7aa atg gca atc gag tgt aag gca tgg ttt atg gat gaa aat tca gaa        47Met Ala Ile Glu Cys Lys Ala Trp Phe Met Asp Glu Asn Ser Glu1               5                   10                  15gat cag cgg cta ccg cac cag aag aac cca ccg gag ttt gtt tca gtg       95Asp Gln Arg Leu Pro His Gln Lys Asn Pro Pro Glu Phe Val Ser Val
            20                  25                  30gag aaa tta gca gta atc gga gtt tta tac tgg aaa ttg aac cct aat      143Glu Lys Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Tyr Trp Lys Leu Asn Pro Asn
        35                  40                  45gat tac gag aac gat gaa gaa ttg aaa aaa att cgt caa agt aga ggc      191Asp Tyr Glu Asn Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ile Arg Gln Ser Arg Gly
    50                  55                  60tac agc tac atg gac ttg ctg gat ttg tgc cct gag aag gtg gat aac      239Tyr Ser Tyr Met Asp Leu Leu Asp Leu Cys Pro Glu Lys Val Asp Asn
65                  70                  75tat gag cag aag ttg aaa aat ttc tat acg gag cac ata cac gca gat      287Tyr Glu Gln Lys Leu Lys Asn Phe Tyr Thr Glu His Ile His Ala Asp80                  85                  90                  95gag gag ata cgt tac tgt ctg gaa ggg agt gga tat ttt gat gtg aga      335Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Leu Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg
            100                 105                 110gac aag gat gat cgc tgg att cgc atc tgg atg aag gcc ggt gat atg      383Asp Lys Asp Asp Arg Trp Ile Arg Ile Trp Met Lys Ala Gly Asp Met
        115                 120                 125att gtc ttg cct gct ggg att tac cac cgg ttc acc cta gat act gat      431Ile Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp
    130                 135                 140aac tat gtc aag ttg atg agg ttg ttt gtg gga gag ccg gtg tgg acg      479Asn Tyr Val Lys Leu Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr
145                 150                 155cct tac aat cga cca caa gaa gat cat cca gca agg aag gag tac atc      527Pro Tyr Asn Arg Pro Gln Glu Asp His Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Ile160                 165                 170                 175aag agt gtt act gaa aga gta gga gtg cct ctt aca gca cac taa          572Lys Ser Val Thr Glu Arg Val Gly Val Pro Leu Thr Ala His
            180                 185gacatatttg agctttacaa acctgagagt g                                   603<210>8<211>189<212>PRT<213>番茄(Tomato)<400>8Met Ala Ile Glu Cys Lys Ala Trp Phe Met Asp Glu Asn Ser Glu Asp1               5                   10                  15Gln Arg Leu Pro His Gln Lys Asn Pro Pro Glu Phe Val Ser Val Glu
        20                  25                  30Lys Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Tyr Trp Lys Leu Asn Pro Asn Asp
    35                  40                  45Tyr Glu Asn Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ile Arg Gln Ser Arg Gly Tyr
50                  55                  60Ser Tyr Met Asp Leu Leu Asp Leu Cys Pro Glu Lys Val Asp Asn Tyr65                  70                  75                  80Glu Gln Lys Leu Lys Asn Phe Tyr Thr Glu His Ile His Ala Asp Glu
            85                  90                  95Glu Ile Arg Tyr Cys Leu Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp
        100                 105                 110Lys Asp Asp Arg Trp Ile Arg Ile Trp Met Lys Ala Gly Asp Met Ile
    115                 120                 125Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp Asn
130                 135                 140Tyr Val Lys Leu Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr Pro145                 150                 155                 160Tyr Asn Arg Pro Gln Glu Asp His Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Ile Lys
            165                 170                 175Ser Val Thr Glu Arg Val Gly Val Pro Leu Thr Ala His
        180                 185<210>9<211>889<212>DNA<213>大豆(Soybean)<220><221>CDS<222>(32)..(634)<223><400>9cgaacccgtc gtagcagaaa aacttgtcac c atg gtt tct tcc gac aag gat        52
                               Met Val Ser Ser Asp Lys Asp
                               1               5cca cga gag gat gtc ctt caa gcc tgg tac atg gat gat agt gat gaa      100Pro Arg Glu Asp Val Leu Gln Ala Trp Tyr Met Asp Asp Ser Asp Glu
    10                  15                  20gat caa aga ctc ccc cac cac aaa gaa ccc aag gag ttt gtc tcg ttg      148Asp Gln Arg Leu Pro His His Lys Glu Pro Lys Glu Phe Val Ser Leu
25                  30                  35gac caa ctt gct gaa ctt gga gtc ctt agc tgg aaa cta gat gct gat      196Asp Gln Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu Ser Trp Lys Leu Asp Ala Asp40                  45                  50                  55aac cat gaa aat gat cca gag ctg aag aag att cgt gaa gag cgt ggt      244Asn His Glu Asn Asp Pro Glu Leu Lys Lys Ile Arg Glu Glu Arg Gly
            60                  65                  70tac acc tac atg gat gtt tgt gag gtc tgc cca gaa aag ttg cca aat      292Tyr Thr Tyr Met Asp Val Cys Glu Val Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn
        75                  80                  85tat gaa cag aaa atc aaa agc ttc ttt gaa gag cat ctt cac act gat      340Tyr Glu Gln Lys Ile Lys Ser Phe Phe Glu Glu His Leu His Thr Asp
    90                  95                  100gag gag atc cgc ttt tgt gct gct gga agt ggc tat ttt gat gtt agg      388Glu Glu Ile Arg Phe Cys Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg
105                 110                 115gat cgc aat gaa gct tgg att cgt gtg tgg gtc aag aaa gga gga atg      436Asp Arg Asn Glu Ala Trp Ile Arg Val Trp Val Lys Lys Gly Gly Met120                 125                 130                 135atc atc tta cct gcc gga att tat cat cgc ttt acg cta gat gag agc      484Ile Ile Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Glu Ser
            140                 145                 150aac tac att aag gct ttg cgt ttt ttt gtt ggt gag cca gtt tgg act      532Asn Tyr Ile Lys Ala Leu Arg Phe Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr
        155                 160                 165cca tac aat cgt cca aat gac cat ctc cct gca aga caa caa tat gtc      580Pro Tyr Asn Arg Pro Asn Asp His Leu Pro Ala Arg Gln Gln Tyr Val
    170                 175                 180aag gat ttt gtg gaa aag gat gtt agc agc cat gct gtt gat gcc acc      628Lys Asp Phe Val Glu Lys Asp Val Ser Ser His Ala Val Asp Ala Thr
185                 190                 195gcg taa gatctggttc tgcctaatca tagtaccaca tgaaaaggac caagactttg       684Ala200ttgctaaagt aaggtttgaa aaaaagaaaa taatggtgtc tttaaataaa gggtcctggc    744ttgttatgcc ttgatgtacc ctcgccagtg tttttgttgc ctgtccctgt ataaagattg    804cattgtatta ttattagaat tgggtacaga ataaacataa gcataagtta gcatgctgat    864gtatatttat gtaaaaaaaa ataaa                                          889<210>10<211>200<212>PRT<213>大豆(Soybean)<400>10Met Val Ser Ser Asp Lys Asp Pro Arg Glu Asp Val Leu Gln Ala Trp1               5                   10                  15Tyr Met Asp Asp Ser Asp Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Lys Glu
        20                  25                  30Pro Lys Glu Phe Val Ser Leu Asp Gln Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu
    35                  40                  45Ser Trp Lys Leu Asp Ala Asp Asn His Glu Asn Asp Pro Glu Leu Lys
50                  55                  60Lys Ile Arg Glu Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Met Asp Val Cys Glu Val65                  70                  75                  80Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Gln Lys Ile Lys Ser Phe Phe
            85                  90                  95Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Phe Cys Ala Ala Gly
        100                 105                 110Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Arg Asn Glu Ala Trp Ile Arg Val
    115                 120                 125Trp Val Lys Lys Gly Gly Met Ile Ile Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His
130                 135                 140Arg Phe Thr Leu Asp Glu Ser Asn Tyr Ile Lys Ala Leu Arg Phe Phe145                 150                 155                 160Val Gly Glu Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro Asn Asp His Leu
            165                 170                 175Pro Ala Arg Gln Gln Tyr Val Lys Asp Phe Val Glu Lys Asp Val Ser
        180                 185                 190Ser His Ala Val Asp Ala Thr Ala
    195                 200<210>11<211>933<212>DNA<213>棉花(Cotton)<220><221>CDS<222>(33)..(635)<223><400>11attttttttt aatttgacgg aaaaaaaaaa ct atg acc atg ggt tct gca gac       53
                                Met Thr Met Gly Ser Ala Asp
                                1               5aag agg gag gaa gtt att cag gca tgg tac atg gat gat agt gat gaa      101Lys Arg Glu Glu Val Ile Gln Ala Trp Tyr Met Asp Asp Ser Asp Glu
    10                  15                  20gat cag agg ctt cct cat cac cgt gaa cct aag gaa tat gta tcc ttg      149Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu Pro Lys Glu Tyr Val Ser Leu
25                  30                  35gat aaa ctt gct gag ctt gga gta ctc agc tgg cga ttg gat gct gat      197Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu Ser Trp Arg Leu Asp Ala Asp40                  45                  50                  55aac tat gaa aat gat gaa gag ttg aag aaa att cgt gaa gaa cga ggt      245Asn Tyr Glu Asn Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ile Arg Glu Glu Arg Gly
            60                  65                  70tac tcc tac atg gac ttc tgc gag gtt tgc cct gag aag ctt cca aat      293Tyr Ser Tyr Met Asp Phe Cys Glu Val Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn
        75                  80                  85tat gag gag aag ata aaa aat ttc ttc gaa gaa cat att cat act gat      341Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Asn Phe Phe Glu Glu His Ile His Thr Asp
    90                  95                  100gag gag atc cgt tac tgt gtg gca gga agt ggt tat ttt gat gta cgg      389Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Val Ala Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg
105                 110                 115gat cat aat gat aaa tgg att cgt gtg tgg gtg aag aaa gga ggc atg      437Asp His Asn Asp Lys Trp Ile Arg Val Trp Val Lys Lys Gly Gly Met120                 125                 130                 135ata gtt tta cct gct gga att tat cat cgc ttt act ctg gat aca gac      485Ile Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp
            140                 145                 150aac tat att aag gca atg cgg ctc ttt gtt ggt gat cca att tgg act      533Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Asp Pro Ile Trp Thr
        155                 160                 165ccg tac aat cgt ccg cac gat cat ctt cct gca agg aag gag tat atc      581Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Ile
    170                 175                 180aag aac ttt ttg cgg gag gaa ggt ggt ggc caa gcc gtt gat gct gcc      629Lys Asn Phe Leu Arg Glu Glu Gly Gly Gly Gln Ala Val Asp Ala Ala
185                 190                 195gca taa aatcaacatt catctggtgg tggccaagtc gttgatgctg ccgcataaaa       685Ala200tcagcattca tctctggtat cgtgtcttat aaaatatgaa accccggatt tgtggtaata    745aataagtcta ggcttgtctg cttttgatgc gtggatatgg atcgttatgg ttgttgcttg    805ctatatattg cctattccat atcgaaaatt cgcaaacttg ctatgtattt ctacatttta    865tgtgcttact accagattgg ctcttaataa tcaaagttta cataatatac atttcgtcga    925cgcggccg                                                           933<210>12<211>200<212>PRT<213>棉花(Cotton)<400>12Met Thr Met Gly Ser Ala Asp Lys Arg Glu Glu Val Ile Gln Ala Trp1               5                   10                  15Tyr Met Asp Asp Ser Asp Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu
        20                  25                  30Pro Lys Glu Tyr Val Ser Leu Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Leu
    35                  40                  45Ser Trp Arg Leu Asp Ala Asp Asn Tyr Glu Asn Asp Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60Lys Ile Arg Glu Glu Arg Gly Tyr Ser Tyr Met Asp Phe Cys Glu Val65                  70                  75                  80Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Asn Phe Phe
            85                  90                  95Glu Glu His Ile His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Val Ala Gly
        100                 105                 110Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp His Asn Asp Lys Trp Ile Arg Val
    115                 120                 125Trp Val Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His
130                 135                 140Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe145                 150                 155                 160Val Gly Asp Pro Ile Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu
            165                 170                 175Pro Ala Arg Lys Glu Tyr Ile Lys Asn Phe Leu Arg Glu Glu Gly Gly
        180                 185                 190Gly Gln Ala Val Asp Ala Ala Ala
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        20                  25                  30gcc cag tgc gct gga gca gct gcg cgg ctc ggg gtg ctc tac tgg aag      144Ala Gln Cys Ala Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Val Leu Tyr Trp Lys
    35                  40                  45ctg gat gct gac aaa tat gag aat gat cca gaa tta gaa aag atc cga      192Leu Asp Ala Asp Lys Tyr Glu Asn Asp Pro Glu Leu Glu Lys Ile Arg
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            85                  90                  95ttg cac ttg gac gat gag atc cgc tac atc ctg gat ggc agt ggg tac      336Leu His Leu Asp Asp Glu Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ser Gly Tyr
        100                 105                 110ttc gat gtg agg gac aag gag gac cag tgg atc cgg atc ttc atg gag      384Phe Asp Val Arg Asp Lys Glu Asp Gln Trp Ile Arg Ile Phe Met Glu
    115                 120                 125aag gga gac atg gtg acg ctc ccc gcg ggg atc tat cac cgc ttc acg      432Lys Gly Asp Met Val Thr Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr
130                 135                 140gtg gac gag aag aac tac acg aag gcc atg cgg ctg ttt gtg gga gaa      480Val Asp Glu Lys Asn Tyr Thr Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu145                 150                 155                 160ccg gtg tgg aca gcg tac aac cgg ccc gct gac cat ttt gaa gcc cgc      528Pro Val Trp Thr Ala Tyr Asn Arg Pro Ala Asp His Phe Glu Ala Arg
            165                 170                 175ggg cag tac gtg aaa ttt ctg gca cag acc gcc tag cagtgctgcc           574Gly Gln Tyr Val Lys Phe Leu Ala Gln Thr Ala
        180                 185tgggaactaa cacgtgcctc gtaaaggtcc ccaatgtaat gaactgagca gaaaattcaa    634tcaactttct ctttgctttt agaggatagc cttgaggtag attatctttc ctttgtaaga    694ttatttgatc agaatatttt gtaatgaaag gatctagaaa gcaacttgga agtgtaaaga    754gtcaccttca ttttctgtaa ctcaatcaag actggtgggt ccatggccct gtgttagttc    814attgcattca ggttgagtcc caaatgaaag tttcatctcc cgaaatgcag ttccttagat    874gcccatctgg acgtgaatgc cgcgcctgcg tgtaagaagg tgcaat                   920<210>14<211>187<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Arg Thr Arg His Pro His Cys Ala Ser Val Val Gln Ala Trp Tyr Met1               5                   10                  15Asp Asp Ala Pro Gly Thr Arg Gly Asn Pro Thr Ala Pro Thr Pro Ala
        20                  25                  30Ala Gln Cys Ala Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Val Leu Tyr Trp Lys
    35                  40                  45Leu Asp Ala Asp Lys Tyr Glu Asn Asp Pro Glu Leu Glu Lys Ile Arg
50                  55                  60Arg Glu Arg Asn Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ile Thr Ile Cys Lys Asp65                  70                  75                  80Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Met Phe Tyr Glu Glu His
            85                  90                  95Leu His Leu Asp Asp Glu Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ser Gly Tyr
        100                 105                 110Phe Asp Val Arg Asp Lys Glu Asp Gln Trp Ile Arg Ile Phe Met Glu
    115                 120                 125Lys Gly Asp Met Val Thr Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr
130                 135                 140Val Asp Glu Lys Asn Tyr Thr Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu145                 150                 155                 160Pro Val Trp Thr Ala Tyr Asn Arg Pro Ala Asp His Phe Glu Ala Arg
            165                 170                 175Gly Gln Tyr Val Lys Phe Leu Ala Gln Thr Ala
        180                 185<210>15<211>972<212>DNA<213>鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(17)..(556)<223><400>15agccgccgcc gccacc atg gtg cag gcc tgg tat atg gac gag tcc acc gcc     52
              Met Val Gln Ala Trp Tyr Met Asp Glu Ser Thr Ala
              1               5                   10gac ccg cgg aag ccc cac cgc gca cag ccc gac cgc ccc gtg agc ctg      100Asp Pro Arg Lys Pro His Arg Ala Gln Pro Asp Arg Pro Val Ser Leu
    15                  20                  25gag cag ctg cgc acg ctc gga gtg ctc tat tgg aag cta gat gct gac      148Glu Gln Leu Arg Thr Leu Gly Val Leu Tyr Trp Lys Leu Asp Ala Asp
30                  35                  40aag tat gag aac gat cca gaa cta gaa aag atc cgg aaa atg aga aac      196Lys Tyr Glu Asn Asp Pro Glu Leu Glu Lys Ile Arg Lys Met Arg Asn45                  50                  55                  60tac tcc tgg atg gac atc atc acc ata tgc aaa gat aca ctt ccc aat      244Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ile Thr Ile Cys Lys Asp Thr Leu Pro Asn
            65                  70                  75tac gag gag aag atc aag atg ttc ttt gag gaa cat ctg cat ctg gat      292Tyr Glu Glu Lys Ile Lys Met Phe Phe Glu Glu His Leu His Leu Asp
        80                  85                  90gag gag atc cgc tac atc ctg gag ggt agt ggg tac ttc gat gtc agg      340Glu Glu Ile Arg Tyr Ile Leu Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg
    95                  100                 105gac aag gag gac aag tgg atc cgg att tcc atg gag aag ggg gac atg      388Asp Lys Glu Asp Lys Trp Ile Arg Ile Ser Met Glu Lys Gly Asp Met
110                 115                 120att act ctt cct gcc ggc atc tat cac cgc ttc aca ctg gac gag aag      436Ile Thr Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Glu Lys125                 130                 135                 140aat tac gtg aag gcc atg cgg ctg ttt gtt gga gaa cct gtg tgg aca      484Asn Tyr Val Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr
            145                 150                 155cca tac aac cgg cca gct gac cat ttt gat gcc cgt gta cag tac atg      532Pro Tyr Asn Arg Pro Ala Asp His Phe Asp Ala Arg Val Gln Tyr Met
        160                 165                 170agt ttt ttg gaa gga aca gca tag cagtgctcct caaagagaaa actgcactgt     586Ser Phe Leu Glu Gly Thr Ala
    175gtgaatctcc tgctgtggta accgaatgga aagttgctca cttttctgct tttgtatttg    646aacttgaggc tagactagct ctctttgcta ggattgtgag atcagtgtct tttaaatgaa    706agcctctcta aaagtgagtt ttacatggaa gccacaaaaa tgtgaaaaag tgaccttaat    766tttccctaac tgtcaagact tagaggtata ggagccctgg attggtatgt gcattcatgc    826atggccaatc ttcatctccc agatctttag gtgtctgttg gtgtgaagct atgcctcctg    886caagagggca gttataacca gcacaactaa ccagatgacg tttttctcct ttgctgattg    946ttgagtgggg aagtggggtt gttgtt                                         972<210>16<211>179<212>PRT<213>鼠(Mus musculus)<400>16Met Val Gln Ala Trp Tyr Met Asp Glu Ser Thr Ala Asp Pro Arg Lys1               5                   10                  15Pro His Arg Ala Gln Pro Asp Arg Pro Val Ser Leu Glu Gln Leu Arg
        20                  25                  30Thr Leu Gly Val Leu Tyr Trp Lys Leu Asp Ala Asp Lys Tyr Glu Asn
    35                  40                  45Asp Pro Glu Leu Glu Lys Ile Arg Lys Met Arg Asn Tyr Ser Trp Met
50                  55                  60Asp Ile Ile Thr Ile Cys Lys Asp Thr Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Lys65                  70                  75                  80Ile Lys Met Phe Phe Glu Glu His Leu His Leu Asp Glu Glu Ile Arg
            85                  90                  95Tyr Ile Leu Glu Gly Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Lys Glu Asp
        100                 105                 110Lys Trp Ile Arg Ile Ser Met Glu Lys Gly Asp Met Ile Thr Leu Pro
    115                 120                 125Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Leu Asp Glu Lys Asn Tyr Val Lys
130                 135                 140Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg145                 150                 155                 160Pro Ala Asp His Phe Asp Ala Arg Val Gln Tyr Met Ser Phe Leu Glu
            165                 170                 175Gly Thr Ala<210>17<211>706<212>DNA<213>斑马鱼(Zebrafish)<220><221>CDS<222>(36)..(581)<223><220><221>misc_feature<222>(634)..(634)<223>n is unknown<220><221>misc_feature<222>(642)..(642)<223>n is unknown<400>17gtactgcgca tggagaccga accggactgt tcaag atg agt gtt ttc gag gca        53
                                   Met Ser Val Phe Glu Ala
                                   1               5tgg tac atg gat gaa gag tcc gga gag gac cag aga ctc ccg cac aaa      101Trp Tyr Met Asp Glu Glu Ser Gly Glu Asp Gln Arg Leu Pro His Lys
        10                  15                  20ctg agc ccg aat cag ccc gtc agc gtc cag cag ctg gag cac atc gga      149Leu Ser Pro Asn Gln Pro Val Ser Val Gln Gln Leu Glu His Ile Gly
    25                  30                  35gtc ttt cac tgg aag ctg aac gct gat atc tat gaa aat gac ccc gaa      197Val Phe His Trp Lys Leu Asn Ala Asp Ile Tyr Glu Asn Asp Pro Glu
40                  45                  50ctg cag aag atc cga gag gag aag ggt tat tcc ttt atg gac atc ata      245Leu Gln Lys Ile Arg Glu Glu Lys Gly Tyr Ser Phe Met Asp Ile Ile55                  60                  65                  70acc att cac ccg gac aaa ctg ccc gat tac caa aac aaa ctg aaa atg      293Thr Ile His Pro Asp Lys Leu Pro Asp Tyr Gln Asn Lys Leu Lys Met
            75                  80                  85ttt tac gaa gag cat ctc cac ctg gac gat gag atc cgt tat att ctg      341Phe Tyr Glu Glu His Leu His Leu Asp Asp Glu Ile Arg Tyr Ile Leu
        90                  95                  100gaa gga tcc tct tat ttt gat gtg cgg gac gaa ggc gac cgc tgg atc      389Glu Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Val Arg Asp Glu Gly Asp Arg Trp Ile
    105                 110                 115cga ata gcg gtg tct aaa ggc gac ctc atc act tta ccg gcc ggg att      437Arg Ile Ala Val Ser Lys Gly Asp Leu Ile Thr Leu Pro Ala Gly Ile
120                 125                 130tac cac aga ttc acc gtg gac gaa agc aac tac act aaa gcc atg cgt      485Tyr His Arg Phe Thr Val Asp Glu Ser Asn Tyr Thr Lys Ala Met Arg135                 140                 145                 150ctg ttc gtg ggt gaa ccc gtc tgg aag gcc tac aac cgt cca gcc gat      533Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Lys Ala Tyr Asn Arg Pro Ala Asp
            155                 160                 165gac ttt gac atc cgc aag gaa tac gtg aac tcg ctg gga agc tcc tga      581Asp Phe Asp Ile Arg Lys Glu Tyr Val Asn Ser Leu Gly Ser Ser
        170                 175                 180aatgcctgat gggattgatt tagtgctgag aatcagactc tgcggtgcct tanacagaca    641ngcagcaata gtagagctaa catgtcatta cttagtcatc aagacacacc tgatataaag    701attat                                                                706<210>18<211>181<212>PRT<213>斑马鱼(Zebrafish)<400>18Met Ser Val Phe Glu Ala Trp Tyr Met Asp Glu Glu Ser Gly Glu Asp1               5                   10                  15Gln Arg Leu Pro His Lys Leu Ser Pro Asn Gln Pro Val Ser Val Gln
        20                  25                  30Gln Leu Glu His Ile Gly Val Phe His Trp Lys Leu Asn Ala Asp Ile
    35                  40                  45Tyr Glu Asn Asp Pro Glu Leu Gln Lys Ile Arg Glu Glu Lys Gly Tyr
50                  55                  60Ser Phe Met Asp Ile Ile Thr Ile His Pro Asp Lys Leu Pro Asp Tyr65                  70                  75                  80Gln Asn Lys Leu Lys Met Phe Tyr Glu Glu His Leu His Leu Asp Asp
            85                  90                  95Glu Ile Arg Tyr Ile Leu Glu Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Val Arg Asp
        100                 105                 110Glu Gly Asp Arg Trp Ile Arg Ile Ala Val Ser Lys Gly Asp Leu Ile
    115                 120                 125Thr Leu Pro Ala Gly Ile Tyr His Arg Phe Thr Val Asp Glu Ser Asn
130                 135                 140Tyr Thr Lys Ala Met Arg Leu Phe Val Gly Glu Pro Val Trp Lys Ala145                 150                 155                 160Tyr Asn Arg Pro Ala Asp Asp Phe Asp Ile Arg Lys Glu Tyr Val Asn
            165                 170                 175Ser Leu Gly Ser Ser
        180

Claims (36)

1.一种包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的转基因植物、其基本上衍生的品种、植物部分或植物细胞，其中，所述核苷酸序列与所述转基因植物、其基本上衍生的品种、植物部分或植物细胞的基因组不同源。
2.一种包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的转基因植物、其基本上衍生的品种、植物部分或植物细胞，其中，业已通过重组DNA方法，将所述核苷酸序列导入所述转基因植物、植物部分或植物细胞。
3.一种含有SH2A或SH2A样蛋白的转基因植物、其基本上衍生的品种、植物部分或植物细胞，其中，所述SH2A或SH2A样蛋白与所述植物、其基本上衍生的品种、植物部分或植物细胞不同源。
4.一种用SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列转化的植物细胞或原生质体，其中，所述核苷酸序列与所述植物细胞或植物原生质体的基因组不同源。
5.如权利要求4的植物细胞或原生质体，其中，所述植物细胞被稳定地或瞬时地转化过。
6.一种含有SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的宿主细胞，其中，所述核苷酸序列与所述宿主细胞的基因组不同源，或者其中，所述核苷酸序列是通过重组DNA方法导入所述宿主细胞的。
7.如权利要求6的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是细菌、酵母、真菌、昆虫、植物、动物或人细胞。
8.如权利要求6的宿主细胞，其中，所述SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列相对指导该核苷酸序列表达的调控区而言，可以是正义或反义方向，或者其中，所述核苷酸序列包含在由一个调控区启动的基因沉默结构内。
9.一种调节培养的细胞在缺氧条件下生长或存活的方法，该方法包括调节所述培养细胞中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
10.一种改变培养细胞的生长反应的方法，该方法包括调节所述培养细胞中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
11.如权利要求9或10方法，其中，所述培养的细胞是细菌、酵母或真菌细胞。
12.如权利要求9或10方法，其中，所述培养的细胞是动物、人或昆虫细胞。
13.如权利要求9或10方法，其中，所述培养的细胞是植物细胞。
14.一种用于改变生物细胞、组织或器官生长响应的方法，该方法包括调节所述生物的细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
15.一种用于改变植物细胞、组织或器官的生长响应的方法，该方法包括调节所述植物细胞、组织或器官中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
16.如权利要求15的方法，其中，通过增强编码所述SH2A或SH2A样蛋白的核苷酸序列的转录来调控SH2A或SH2A样蛋白的含量。
17.如权利要求16的方法，其中，转录的增强是通过使植物细胞、组织或器官接触乙烯利或乙烯诱导的。
18.一种用于生产适应在缺氧条件下生长的植物的方法，该方法包括用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。
19.一种用于改善植物在低氧条件下存活的方法，该方法包括用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。
20.一种用于改善植物抗涝性方法，该方法用编码SH2A或SH2A样基因的序列转化植物细胞、花粉、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中的至少一种，并由此再生植物。
21.一种用于诱导植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中赤霉素生物合成的方法，该方法包括调节SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
22.一种用于诱导植物中赤霉素生物合成的方法，该方法调节所述植物细胞或一群细胞中SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
23.一种调节植物细胞、原生质体、外殖体、植物部分或植物器官中厌氧响应蛋白的方法，该方法包括调节SH2A或SH2A样蛋白的含量和/或活性。
24.如权利要求23的方法，其中，所述厌氧响应蛋白是丙酮酸脱羧酶2。
25.一种包括SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列的遗传结构，所述基因可操作地连接于指导所述核苷酸序列表达的启动子序列上。
26.如权利要求25的遗传结构，其中，所述SH2A或SH2A样基因是cDNA或基因组序列。
27.如权利要求25的遗传结构，其中，所述SH2A或SH2A样基因是合成序列。
28.如权利要求25-27中任一项的遗传结构，其中，所述SH2A或SH2A样基因的核苷酸序列相对启动子序列而言，可以是正义或反义方向的，或包含在基因沉默结构内。
29.一种嵌合基因结构，包括编码SH2A或SH2A样蛋白的基因，其中，所述基因受能在植物中起作用的启动子的控制。
30.一种嵌合基因结构，包括可操作地连接于异源编码序列上的SH2A或SH2A样基因启动子。
31.选自下列一组的编码SH2A样蛋白的分离的核酸：SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15和17所示核酸序列。
32.具有选自下列一组的氨基酸序列的分离的SH2A样蛋白：SEQ IDNO：6、8、10、12、14、16和18所示氨基酸序列。
33.来自权利要求1-3中任一项的转基因植物或基本上衍生的品种的花粉。
34.来自权利要求1-3中任一项的转基因植物或基本上衍生的品种的种子。
35.来自权利要求1-3中任一项的转基因植物或基本上衍生的品种的切穗。
36.来自权利要求1-3中任一项的转基因植物或基本上衍生的品种的花。
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