CN114410603B - 水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用 - Google Patents

水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进植物对高环境温度的适应性响应的方法，将TOGR3基因或其同源基因，或包含TOGR3基因或其同源基因的载体或宿主细胞转化到植物细胞或组织中并培育，获得具有优良的高环境温度适应性响应的植物。其中TOGR3基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:6，其编码具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的蛋白质。通过本发明的方法，提高了植物对高环境温度适应性的响应，并可获得具有优良的高环境温度适应性响应的植物。

Description

水稻高环境温度适应性响应控制基因TOGR3及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种促进水稻高环境温度适应性响应的基因TOGR3(Thermotolerant Growth Required3)，该基因的编码蛋白和功能类似物，及包含该基因的核苷酸序列的载体和含有该基因核苷酸序列或该载体的宿主细胞。本发明还提供利用所述促进水稻高环境温度适应性响应的基因TOGR3培育能够在高环境温度下正常响应和生长的水稻品种的方法。
背景技术
自然界中，植物的生长处在一个变化的环境温度范围内，我们通常会以日均温、日最高温和日最低温等参数来统计和衡量这一变量。环境温度的波动直接影响土壤表面和土壤周围空气的温度，进而影响植物形态的改变(Casal and Balasubramanian,2019)。在拟南芥中，环境温度的升高促使下胚轴加速生长，以保护子叶远离温度较高的土壤；并且其叶柄伸长、叶片间距加大，形成较为松散的结构，这些形态的变化有利于植株散热，降低植物表面温度，以适应环境温度的升高(Quint et al.,2016)。由此，研究者将植物在低于热胁迫温度条件下，形态和结构随环境温度的升高而做出的这一系列适应性变化统称为热形态建成。除了正常范围内的温度，极端温度也会给植物的生长发育造成严重的影响。尤其对作物而言，高温胁迫和低温胁迫均会造成产量的急剧减少，甚至造成植株的死亡(Qu et al.,2013)。
植物在漫长的进化过程中产生了很多响应环境温度变化的分子机制。Ma等人通过对籼稻品种93-11和粳稻品种日本晴近等基因系的数量性状位点(QTLs)研究发现，在人工驯化过程中，粳稻品种中包含有SNP2的COLD1(Chilling-tolerance divergence1)等位基因被筛选出来。COLD1编码一个跨膜蛋白，COLD1jap表达量的升高能够增强水稻对低温胁迫的耐受性。COLD1的单核苷酸多态性位点SNPjap/ind能够增强G蛋白α亚基RGA1的GTP酶的活性。随后，COLD1与RGA1的互作激活Ca2+通道，引起Ca2+的内流。钙调蛋白结合的转录激活子与CBF家族基因的启动子结合，激活这些基因的转录响应低温胁迫(Ma et al.,2015)。前人通过对非洲稻CG14和亚洲栽培稻武运粳近等基因系的QTL进行研究，发现CG14中编码26S蛋白酶体α2亚基的基因OgTT1(Thermo-tolerance1)，表达量显著高于武运粳(WYJ)中的等位基因OsTT1，并且在热激5小时后，NIL(CG14)中TT1的表达量显著提高，远高于NIL(WYJ)中TT1的表达量。CG14与WYJ中TT1存在SNP，且造成了氨基酸的变化，CG14中26S蛋白酶体具有更高的蛋白降解活性，能够快速降解体内由于高温环境所积累的泛素化蛋白，增强水稻对热胁迫的耐受性，使得水稻在开花期和灌浆期遇到高温仍能保持相对较高的结实率(Li etal.,2015)。在细胞核中，HSF(heat shock transcription factor)家族转录因子在植物响应热胁迫过程中发挥着重要作用，它们能够激活HSP以及其他热胁迫相关基因的表达，响应高温环境。核仁也参与了生物体对环境温度的响应。研究显示，在水稻中，定位于核仁的蛋白TOGR1(Thermotolerant Growth Required1)能够促进水稻对高环境温度的响应。TOGR1编码一个含有DEAD-box结构域的RNA解旋酶，其表达量和活性均随环境温度的升高而增加。TOGR1的突变不影响水稻在较低环境温度下的生长，但在高环境温度下突变体togr1-1不能够正常生长。通过进一步研究发现，突变形式togr1-1蛋白不能进入到细胞核并募集SSU，从而使rRNA的生物合成在高温下失去了保护，导致pre-rRNA加工和初级代谢的紊乱，抑制了植物的生长。此外，水稻不同品种的株高与TOGR1表达量呈正相关，TOGR1的过表达植株促进水稻对高温胁迫的耐受性(Wang et al.,2016)。因此，植物对环境温度变化的感知和响应的机制存在多重途径调控，然而目前为止关于水稻对正常环境温度适应性响应的机制知之甚少。
本发明鉴定了水稻耐热因子TOGR3编码水稻26S蛋白酶体β4亚基，该基因的正常表达保证了水稻对高环境温度的适应性，从而保证植物在高环境温度下正常生长。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种促进植物高环境温度适应性响应的关键因子，为培育具有优良的环境温度适应性的植物品种提供基因资源。
本发明人在研究水稻高环境温度响应缺陷的突变体togr3-1的过程中发现，当togr3-1种植于较低环境温度(例如，12月份至次年4月份种植于海南)下时，其形态特征与野生型非常接近；而当生长于较高环境温度(例如，5-9月份种植于北京)下时，突变体生长明显受到抑制，呈现出矮杆多分蘖的卷叶表型。在于人工培养箱中严格控制光照条件下，设置不同的温度，进一步确认了togr3-1的环境温度敏感表型。在此基础上，本发明人鉴定了水稻的高环境温度适应性响应基因TOGR3，该基因编码水稻26S蛋白酶体的β4亚基。
蛋白酶体以不同的形式广泛存在于生物体中。其中最简单的形式存在于细菌中，它由两个环状的HslV核心亚基组成，并且连接着Clp/HSP100亚家族的HslU所组成的环状ATP酶。这个复合体对于细菌在正常条件下生长并不是必需的，但是在受到热胁迫时会诱导表达。古生菌中存在着由核心亚基组成的四个环状结构形成的蛋白酶体(20S蛋白酶体)，并且该蛋白酶体与AAA亚家族的环状ATP酶相互作用。在嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)中，蛋白酶体对于该古生菌在热胁迫条件下的生长是必需的，但是它的缺失不影响嗜酸热原体在正常条件下的生长。最复杂的蛋白酶体形式存在于真核生物中，由一个20S核心颗粒和位于其两端的两个19S核心颗粒组成26S蛋白酶体。26S蛋白酶体是依赖泛素进行蛋白降解的核心蛋白酶，是真核细胞生存所必需的。它以游离的形式存在于细胞质中，或附着在内质网上，也存在于细胞核中，主要参与清除变性蛋白、信号转导、转录、细胞周期和细胞凋亡，但在真核生物中关于蛋白酶体和环境温度关系的研究还比较少(Zwickland Baumeister,2002)。
本发明鉴定的水稻26S蛋白酶体的β4亚基TOGR3/PBD1参与了水稻对高环境温度的适应性响应，该基因的正常表达和活性保证了水稻在高环境温度下的正常响应和生长。
在第一方面，本发明人鉴定了植物的高环境温度适应性响应调控基因TOGR3，所述基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白，或编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
其中SEQ ID No.2所示的蛋白由212个氨基酸组成。
所述调控植物对高环境温度适应性的基因TOGR3为分离的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述调控植物对高环境温度适应性的基因TOGR3为SEQ ID No.1(gDNA)或SEQID No.6(cDNA)所示的核苷酸序列。并且，本领域技术人员应该理解，在较广的意义上，所述控制植物对高环境温度适应性的基因TOGR3可以为与SEQ ID No.1或SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有90％以上、优选99％以上的同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。
其中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列由2469个碱基组成。
在第二方面，本发明提供了由第一方面所述的控制植物高环境温度适应性的基因TOGR3编码的蛋白，所述蛋白为下述(a)或(b)：
(a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。
在一个优选的实施方案中，由第一方面所述的控制植物对高环境温度适应性的基因TOGR3编码的蛋白是一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的调控植物高环境温度适应性的基因TOGR3的重组载体。
优选地，所述重组载体包含的外源核苷酸片段编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。更优选地，所述重组载体包含的外源核苷酸片段如SEQ ID No.1或SEQ ID No.6所示。
所述重组载体中还可以包含增强子，以增加插入的核苷酸片段的表达。优选地，所述重组载体为重组表达载体。
在一个实施方案中，用于构建所述重组载体的质粒可以选自，不限于pCAMBIA1300。
可以通过将所述重组载体转化或转染到细胞中而得到包含所述重组载体的宿主细胞，以进一步用于扩增表达载体、表达所述蛋白或得到转基因植株等应用。用于转化或转染的细胞可以选自，但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，真菌细胞，例如酵母细胞或农杆菌细胞，或植物细胞，例如水稻细胞，等等。
在第四方面，本发明提供控制植物高环境温度适应性的基因TOGR3在培育能够在高环境温度下正常响应和生长的植物品种中的用途。
在第五方面，本发明提供一种培育能够在高环境温度下正常响应和生长的植物品种的方法，所述方法包括在植物中过表达调控植物高环境温度适应性的基因TOGR3。基因TOGR3的过表达可以通过下述实现：用TOGR3基因或包含TOGR3基因的重组载体或宿主细胞转化或转染植物的细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
TOGR3基因的转化或转染可以通过农杆菌介导法进行。
本领域的研究人员应该明确，利用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明提供的TOGR3基因导入植物细胞，或者对TOGR3基因的前导序列进行改造从而改变TOGR3的表达量，比如插入增强元件，可获得对高环境温度适应性响应改变的细胞系及植株。
本发明的TOGR3基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可以加上适当的增强启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可以对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(比如潮霉素基因)。携带有本发明TOGR3基因的表达载体可以通过使用农杆菌侵染转化植物。
本发明的基因对培育具有优良高环境温度适应性响应的植物品种提供了理论基础。当本发明的基因被用于改良植物对高环境温度的适应性响应时，可采用以下方法：(1)将本发明的TOGR3基因克隆到植物转化载体中；(2)将所构建的植物转化载体转化可再生的植物组织或器官并使本发明的基因在转化组织中表达；(3)将被转化的组织或器官培养成植株。
依据第五方面的方法，可以培育出能够在高环境温度下优良响应和生长的植物品种。
综上所述，本发明提供以下实施方案：
1.一种促进植物对高环境温度适应性响应的方法，其特征在于，将TOGR3基因或其同源基因，或包含TOGR3基因或其同源基因的载体或宿主细胞转化到植物细胞或组织中并培育，获得具有优良的高环境温度适应性响应的植物。
2.根据项目1所述的方法，其中，所述TOGR3基因为编码高环境温度适应性相关蛋白的基因；其中，所述高环境温度适应性相关蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.根据项目1或2所述的方法，其中，所述TOGR3基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所示的DNA序列。
4.根据项目1所述的方法，其中，所述载体为植物表达载体，例如pCAMBIA1300。
5.根据项目1所述的方法，其中，所述载体还包含增强子。
6.根据项目1所述的方法，其中，所述宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞或植物细胞。
7.根据项目1所述的方法，其中，所述转化是通过农杆菌介导法或基因枪法进行的。
8.根据项目1所述的方法，其中所述植物为禾本科植物。
9.根据项目8所述的方法，其中所述植物为水稻。
10.TOGR3基因在培育具有优良的高环境温度适应性响应的植物中的用途。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，
其中：
图1.togr3-1与野生型中花11的表型比较。
(A)野生型ZH11、togr3-1分别种植于北京(左)和海南(右)的成熟植株的表型。(B)左、右两幅柱形图统计了这2个株系的株高。北京种植时间从6月至10月，海南种植时间从12月至次年4月。数据表示为平均数±标准误，n＝24株。利用双尾检验进行显著性差异分析。*，p<0.05；**，p<0.01；ns，无显著性差异。图中的标尺：10cm。
图2.不同温度下togr3-1与野生型ZH11的幼苗生长。
(A)野生型和togr3-1在35℃/30℃和25℃/20℃下的苗期表型。(B)野生型和togr3-1在(A)中的幼苗长度比较。数据表示为平均数±标准误，图中，n＝24株。利用双尾检验进行显著性差异分析。*，p<0.05；**，p<0.01；ns，无显著性差异。图中的标尺：10cm。
图3.TOGR3的基因定位及候选基因的确定。
图4.TOGR3基因功能互补及过表达载体。(A)TOGR3的基因功能互补载体。(B)TOGR3的过表达载体。
图5.TOGR3基因功能互补实验验证。(A)WT、togr3-1和互补材料p TOGR3::TOGR3分别种植于北京和海南的田间表型。(B)WT、togr3-1和互补材料分别种植于北京和海南的田间植株株高统计。数据表示为平均数±标准误，图中，n＝24株。利用双尾检验进行显著性差异分析。**，p<0.01；*，p<0.05；ns，无显著性差异。图中的标尺：10厘米。
图6.TOGR3基因互补和过表达水稻植株与野生型比较。(A)WT、togr3-1、互补材料pTOGR3::TOGR3和过表达材料p35S::TOGR3-3xFlag在35℃/30℃培养箱中的幼苗表型。(B)WT、togr3-1、互补材料pTOGR3::TOGR3和过表达材料p35S::TOGR3-3xFlag在35℃/30℃培养箱中的幼苗长度比较。数据表示为平均数±标准误，图(B)中，n＝9株。利用双尾检验进行显著性差异分析。**，p<0.01；*，p<0.05；ns，无显著性差异。图中的标尺：10厘米。
图7.TOGR3基因等位株系和过表达水稻植株与野生型比较。(A)WT、togr3-1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术所得到的等位突变体togr3-2和过表达材料p35S::TOGR3分别种植于北京和海南的田间表型。(B)测序峰图显示了野生型和转基因株系的分子鉴定结果。(C)柱形图显示野生型和转基因株系成熟植株株高的统计分析。数据表示为平均数±标准误，图中，n＝24株。利用双尾检验进行显著性差异分析。**，p<0.01；*，p<0.05；ns，无显著性差异。图中的标尺：10cm。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例1.水稻高环境温度适应性响应控制基因的分离与遗传分析本发明人研究的水稻高环境温度响应缺陷的突变体togr3-1来自粳稻品种ZH11的EMS诱变后代。其中突变体togr3-1可以通过将野生型ZH11TOGR3基因的CDS序列第197位T突变为C导致相应蛋白中第66位Leu突变为Pro而获得。当togr3-1种植于较低环境温度(例如，12月份至次年4月份种植于海南)下时，其株高与野生型较为接近；而当生长于较高环境温度(例如，5-9月份种植于北京)下时，突变体株高明显矮化。在严格控制光照条件下，于人工培养箱中设置不同的温度，进一步确认了togr3-1的环境温度敏感表型。以togr3-1为母本野生型ZH11为父本进行杂交，所有F1均表现正常，在F2分离群体中，正常的和矮化单株的分离比例在统计学上符合3:1(1161：378)。遗传分析的结果说明togr3-1受隐性单基因控制。
控制水稻高环境温度适应性响应基因TOGR3的图位克隆
为了克隆TOGR3，将togr3-1与南京6号(Oryza sativa L.indica)(常规市售可得)进行杂交获得F1，利用F1的自交后代构建F2分离群体，对其中625株隐性个体(高环境温度下极度生长缺陷的个体)进行取样作为定位群体。首先利用有多态性的分子标记对取样群体进行检测，找到与目标性状连锁的分子标记。将togr3-1与中花11(Oryza sativaL.japonica)(常规市售品种)进行杂交获得F1，利用F1的自交后代构建F2分离群体，对其中60株隐性个体(高环境温度下极度生长缺陷的个体)进行取样进行重测序。对最后的定位区间分段扩增并测序确认突变基因及位点。根据Rice Genome Annotation Project网站的注释信息，候选突变基因包含3个外显子，2个内含子，CDS区域全长为639bp，共编码212个氨基酸。在togr3-1中，CDS第197位T突变为C导致第66位Leu突变为Pro。
TOGR3基因的功能验证
利用pCAMBIA1300质粒(购自CAMBIA公司)构建互补载体(图4，构建方法见实施例2)，利用农杆菌侵染的方法进行转基因实验，来验证图位克隆的结果。结果表明本发明鉴定到了能使togr3-1突变体恢复正常功能的蛋白，证明本发明正确克隆了TOGR3基因。氨基酸序列分析表明TOGR3是T1家族的蛋白，该蛋白属于26S蛋白酶体核心颗粒中β环的亚基。
本发明通过图位克隆的方法克隆了水稻控制高环境温度适应性响应的基因TOGR3。对该基因的相关研究，为水稻的分子设计育种和培育具有优良环境温度适应性响应的水稻新品种提供了理论基础。
实施例2.TOGR3的互补载体构建和水稻转化
从野生型中花11中将TOGR3的完整基因,其为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列(包括基因自身启动子区域)用DNA聚合酶进行PCR扩增，然后酶切连接到pCAMBIA1300质粒(购自CAMBIA公司)的多克隆位点处，获得互补载体。
将上述构建好的互补载体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，利用卡那霉素筛选阳性克隆。提取质粒并进行测序鉴定，得到克隆载体中TOGR3序列完全无误的阳性克隆，然后将该阳性克隆的质粒电转化EHA105农杆菌感受态细胞(参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版经常规方法制备)。接下来将转化成功的克隆利用农杆菌侵染的方法以togr3-1为受体进行转基因操作，获得阳性植株pTOGR3::TOGR3。
转基因操作方法如下：
(1)对转基因受体水稻品种利用脱米机去壳，挑选饱满有光泽且无褶皱的米粒，用70％乙醇浸泡10分钟，然后用30％NaClO(原液有效氯10％，加0.1％的Tween20)浸泡15分钟，然后弃液体，并用移液器吸干净残液。如果是togr3-1的种子，由于更容易染菌，因此30％NaClO的处理时间延长至25分钟。
(2)利用无菌水于超净工作台中对消毒过的种子清洗3遍。如果是togr3-1的种子，清洗10遍。
(3)再次用30％NaClO(原液有效氯10％，不加Tween20)浸泡15分钟，然后弃掉液体，并用移液器吸干净残液。
(4)利用无菌水于超净工作台中对消毒过的种子清洗3遍。如果是togr3-1的种子，清洗10遍。
(5)清洗过的种子用灭过菌的镊子夹到滤纸上吸干表面水分，然后接种到N6D培养基上(N6D大量，50ml/L；N6D微量，5ml/L；MS有机，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2mg/L；水解酪蛋白(CH)，0.3g/L；L-proline，2.878g/L；蔗糖，30g/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)，于32℃持续光照条件下培养一周到两周，期间及时的清理染菌的种子防止菌的传播扩散。
(6)将携带目标载体的EHA105农杆菌菌株在带有相应抗性的YEB固体培养基(牛肉膏，5g/L；酵母抽提物，1g/L；胰蛋白胨，5g/L；蔗糖，5g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；琼脂糖，15g/L)上于28℃避光培养3天。然后挑选单菌落于5mL带有相应抗性的YEB液体培养基中，28℃和220rpm条件下培养约24小时。按1:100的比例将农杆菌菌液接种于50mL AAM培养基中(AAM大量，50ml/L；AAM微量，5ml/L；AAM有机，5ml/L；AAM氨基酸，100ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；蔗糖，68.5g/L；葡萄糖，36g/L；CH，0.5g/L；Acetosyringone，20mg/L；pH 5.2)，过夜培养，直至OD600为0.1。
(7)将诱导的状态良好的水稻愈伤浸泡于农杆菌菌液中1分钟，然后用镊子取出置于无菌滤纸上吸取多余菌液。
(8)在N6-As培养基上(N6D大量，50ml/L；N6D微量，5ml/L；MS有机，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；2,4-D，2mg/L；CH，0.3g/L；蔗糖，30g/L；葡萄糖，10g/L；Phytagel，3g/L；Acetosyringone，20mg/L；pH 5.2)预先垫一张浸湿AAM培养基的滤纸，然后将愈伤转移到滤纸上摆好。
(9)将培养皿用封口膜封好，置于25℃暗培养3天。
(10)将共培养后的愈伤用无菌水冲洗1遍，然后用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗5遍，接下来在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中浸泡20分钟，然后弃去液体，接下来在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中再次浸泡20分钟。
(11)将愈伤取出置于滤纸上吸干水分，然后将其在含50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素的N6D培养基(N6DS)上摆整齐，置于32℃全光照条件下筛选两周。愈伤筛选步骤重复一次，即第一次筛选结束后将长势良好的愈伤转移到新的N6DS筛选培养基上(N6D大量，50ml/L；N6D微量，5ml/L；MS有机，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；2,4-D，2mg/L；CH，0.3g/L；L-proline，2.878g/L；蔗糖，30g/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)再培养两周。
(12)将生长旺盛的分化愈伤(很明显的会长出大量新的颗粒愈伤)转移到含50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素的RE再生培养基(MS大量，50ml/L；MS微量，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；RE有机，5ml/L；蔗糖，30g/L；Sorbitol，30g/L；CH，2g/L；NAA，0.02mg/L；Kinetin，2mg/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)上，置于32℃全光照条件下培养，每两周更换一次培养基。在RE再生培养基上生长3-4周后会发现部分愈伤变绿并分化出幼苗。
(13)用镊子将分化出的幼苗小心转移到不加抗生素的1/2MS培养基(MS大量，25ml/L；MS微量，2.5ml/L；Fe-EDTA，2.5ml/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)上，待长至10cm后去除培养基并浸泡于无菌水中3天，然后移栽至大田。
表1农杆菌侵染法转化水稻相关的培养基
实施例3.TOGR3互补转基因植株的表型分析
为检验转基因对水稻响应高环境温度的影响，将实施例2转基因实验得到的阳性植株pTOGR3::TOGR3与中花11(野生型)和togr3-1同时期分别种植于北京和海南，成熟期的植株形态如图5所示，表明转基因植株生长速度得到了恢复(图5)。
这一结果说明了图位克隆的结果无误，TOGR3是参与水稻对高环境温度响应的关键基因。
实施例4.TOGR3过表达载体构建和水稻转化
从野生型ZH11中克隆TOGR3的cDNA，然后与3×Flag(SEQ ID No.3)依次酶切连接到pBWA(V)HS(购自Biovector公司)的多克隆位点处，构建过表达载体，pBWA(V)HS在多克隆位点处带有35S基因的启动子，可驱动TOGR3与3×Flag的融合蛋白的过表达。
将上述构建好的过表达载体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，利用卡那霉素筛选阳性克隆。提取质粒并进行测序鉴定，得到克隆载体中TOGR3的cDNA与3×Flag序列(SEQID No.3)完全无误的阳性克隆，然后将该阳性克隆的质粒电转化EHA105感受态细胞(参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版经常规方法制备)。接下来将转化成功的克隆利用农杆菌侵染的方法以togr3-1为受体进行转基因操作。转基因操作方法如实施例2所述。
实施例5.TOGR3过表达转基因植株的表型分析
为检验TOGR3过表达对水稻响应高环境温度的影响，将实施例2和4转基因实验得到的阳性植株即互补材料pTOGR3::TOGR3和过表达材料p35S::TOGR3-3xFlag与同时期野生型和togr3-1幼苗进行温度处理，于培养箱中35℃-12小时光照，35℃-12小时黑暗。培养2周后的植株形态如图6所示，互补材料pTOGR3::TOGR3和过表达材料p35S::TOGR3-3xFlag的植株生长速度要快于野生型ZH11。
这一结果说明TOGR3在调控水稻对高环境温度响应的过程中起着正向的作用。
实施例6.TOGR3等位株系和过表达转基因植株的表型分析
为了进一步验证基因TOGR3对水稻株高的影响，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了togr3-1的等位突变株系togr3-2。具体操作如下：
1、构建CRISPR/Cas载体(百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒Cat#BGK03)
(1)设计gRNA靶点序列。选择靶点序列为GGTGGCCGCCGACACATCGGCGG(下划线的CGG为PAM序列)，按照下列合成Oligo。
UP:5’-TGTGTGGGTGGCCGCCGACACATCGG(SEQ ID NO:4)
LOW:5’-AAACCCGATGTGTCGGCGGCCACCCA(SEQ ID NO:5)
(2)制备Oligo二聚体。将合成的Oligo加水溶解至10μm，按下列反应体系混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃(推荐采用PCR仪)
(3)将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时。
(4)转化大肠杆菌。取5μl反应液加到至少50μl的感受态细胞中，混匀后冰浴静置30分钟(期间切勿晃动，严格保持静置)；轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；加入500μl SOB/LB培养基(配方如下:2％胰蛋白胨,0.5％酵母提取物,10mM NaCl,2.5mMKCl,10mM MgCl2,10mM MgS04)，37℃200rpm培养1小时；取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
2、挑取单克隆，提取质粒并进行测序鉴定，得到目的基因的CRISPR/Cas载体，然后将该克隆的质粒电转化EHA105感受态细胞(参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版经常规方法制备)。接下来将转化成功的克隆利用农杆菌侵染的方法以ZH11为受体进行转基因操作并培育，获得等位突变株系togr3-2。转基因操作方法如实施例2所述。
如图3所示，togr3-2中TOGR3基因的CDS序列第199bp至204bp的6个碱基缺失，造成了Tyr67和Gln68两个氨基酸的缺失。将隐性纯合的突变体togr3-2、实施例4转基因实验得到的阳性植株p35S::TOGR3、野生型和togr3-1种植于北京和海南，结果如图7所示，togr3-2突变体的株高显著低于野生型ZH11，约为ZH11的35％，显示togr3-2相对于togr3-1是一个表型较为严重的等位突变。这些结果进一步表明TOGR3基因促进水稻株高的增长。
结论：
水稻是我国最为重要的粮食作物之一，其正常的对环境温度的适应性响应是正常生长发育和成熟的基础。本发明克隆了调控水稻对高环境温度适应性的关键因子，为通过水稻基因工程和分子育种改良水稻对环境温度的适应性提供了重要的指导。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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Claims (8)

1.一种促进水稻对高环境温度适应性响应的方法，其特征在于，将TOGR3基因，或包含TOGR3基因的载体或宿主细胞转化到植物细胞或组织中并培育，获得具有优良的高环境温度适应性响应的植物；
其中，所述TOGR3基因为编码高环境温度适应性相关蛋白的基因；其中，所述高环境温度适应性相关蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TOGR3基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所示的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体为植物表达载体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体为pCAMBIA1300。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体还包含增强子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、或农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转化是通过农杆菌介导法或基因枪法进行的。
8.TOGR3基因在培育具有优良的高环境温度适应性响应的水稻中的用途；
其中，所述TOGR3基因为编码高环境温度适应性相关蛋白的基因；其中，所述高环境温度适应性相关蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
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