CN102234638B

CN102234638B - 修饰的玉米核糖体失活蛋白前体及其应用和蛋白纯化方法

Info

Publication number: CN102234638B
Application number: CN2010101597242A
Authority: CN
Inventors: 邵鹏柱; 郑永唐; 黄锦波; 罗嘉懿; 王睿睿; 麦雅丝
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS; Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS; Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN102234638A; HK1162192A1

Abstract

本申请提供修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其包含修饰的内部失活区域，其中，所述修饰的内部失活区域含有病毒蛋白酶酶切位点。本申请提供编码所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的多核苷酸、包含与起始载体可操作连接的所述多核苷酸的表达载体。本申请提供包含所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或表达载体的药物组合物及其应用。本申请还提供可穿膜蛋白，所述可穿膜蛋白由天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其核糖体失活活性形式及与其N端连接的穿膜肽构成。此外，本申请提供蛋白纯化方法。

Description

修饰的玉米核糖体失活蛋白前体及其应用和蛋白纯化方法

技术领域

本申请涉及修饰的蛋白、编码修饰的蛋白的多核苷酸、表达多核苷酸的载体及其应用、以及可穿膜蛋白。本申请还涉及蛋白纯化方法。

背景技术

核糖体失活蛋白(RIPs)是rRNA胺糖苷酶的一种，能水解真核细胞核糖体28S rRNA上的A-4324，从而阻遏延长因子EF-1或EF-2与核糖体的结合，抑制蛋白质的生物合成。RIPs分为I、II和III型。

RIPs具有很高的细胞毒性，可被开发为引产药、抗癌制剂(Abuharbeid S et al.Cytotoxicity of the novel anti-cancer drug rViscumindepends on HER-2 levels in SKOV-3 cells(新型抗癌药rViscumin在SKOV-3细胞中的细胞毒性依赖HER-2的水平)，Biochemical andBiophysical Research Communication.2004，Vol.321，No.2403-412.；Citores L et al.，Targeting cancer cells with transferrin conjugatescontaining the non-toxic type 2 ribosome-inactivating proteins nigrin B orebulin I(利用含非毒性二型核糖体失活蛋白nigrin B或ebulin I的运铁蛋白(Transferrin)偶联物靶向癌细胞).Cancer Letter.2002，Vol.184，No.1 29-35)。多种I和II型RIPs，如MAP30、GAP30、DAP30片段、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、蓖麻毒蛋白(Ricin)，均在体外和体内具有抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的活性(Lee-Huang S et al.Humanimmunodeficiency virus type(HIV-1)inhibition，DNA-binding，RNA-binding，and ribosome inactivating activities in the N-terminalsegments of the plant anti-HIV protein GAP31(植物抗HIV蛋白GAP31N端片段的HIV-1抑制、DNA结合、RNA结合和核糖体失活的活性)，Proceeding of the National Academy of Science USA(PNAS).1994，vol.91，No.25 12208-12212；Lee-Huang S，et al.A new class of anti-HIVagents：GAP31，DAPs 30 and 32.(新型抗HIV试剂：GAP31，DAP 30和DAP 32)，Federation of the Societies of Biochemistry and MolecularBiology(FEBS).1991，vol.291 139-144；Erice A et al，.Brief report：primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiencyvirus type 1.(简报：初次感染有zidovudine抗药性的HIV-1病毒)NewEngland Journal of Medicine.1993，vol.37 835-838.；Uckun FM et al.TXU(Anti-CD7)-pokeweed antiviral proteins as a potent inhibitor ofhuman immunodeficiency virus(TXU(抗CD7)-美洲商陆抗病毒蛋白作为人免疫缺陷病毒的强力抑制剂)Antimicrobial Agents andChemotherapy.1998，vol.42 383-388；Uckun FM et al.Toxicity，biological activity，and pharmacokinetics of TXU(Anti-CD7)-pokeweedantiviral protein in chimpanzees and adult patients infected with humanimmunodeficiency virus(TXU(抗CD7)-美洲商陆抗病毒蛋白在感染人免疫缺陷病毒的黑猩猩和成人患者中的毒性、生物活性和药物代谢动力)The Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics.1999，vol.291 1301-1307)。

发明内容

第一方面提供修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其包含修饰的内部失活区域，所述修饰的内部失活区域含有病毒蛋白酶酶切位点。

在一些实施方式中，所述修饰的内部失活区域长15-60个氨基酸，特别地长20-35个氨基酸，更为特别地长25个氨基酸。

在一些实施方式中，所述病毒选自逆转录病毒、慢病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、疱疹病毒、人类T淋巴球病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、人类肠病毒，特别地，所述病毒选自HIV-1和HIV-2。

在一些实施方式中，所述病毒蛋白酶酶切位点是一个或多个，特别地是2个。

在一些实施方式中，所述病毒蛋白酶酶切位点是一个，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

在一些实施方式中，所述病毒蛋白酶酶切位点是2个相同的酶切位点，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

在一些实施方式中，所述病毒蛋白酶酶切位点是2个不同的酶切位点，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任两种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任两种。

在一些实施方式中，所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体缺失天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的N端失活区域或C端失活区域，或同时缺失两者。

在一些实施方式中，所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的N端包含穿膜肽，所述穿膜肽选自图6所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列。

第二方面提供多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。

第三方面提供表达载体，所述表达载体包含与起始载体可操作连接的第二方面的多核苷酸。

在一些实施方式中，所述起始载体选自原核载体，例如pET系列载体；腺病毒系统，例如pAdEasy-1、pShuttle-CMV、pShuttle；腺相关病毒系统，例如pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ、pAAV-IRES-hrGFP、pCMV-MCS；逆病毒载体，例如pLNCX2、pQCXIH、pMSCVpuro、pLVTH；慢病毒载体，例如FUGW、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL、pLVX-DsRed-Monomer-N1、pLP1、pLP2、pLP VSV-G、pVSV-G；哺乳动物载体，例如pcDNA。

第四方面提供药物组合物，包括第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或者第三方面的表达载体，还包括药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包括治疗个体HIV感染的其它药剂，特别地，进一步包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂，更为特别地，所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)。

第五方面提供治疗个体病毒感染的方法，所述方法包括对所述个体施用第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、第三方面的表达载体或第四方面的药物组合物。

第六方面提供第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或第三方面的表达载体，在制备治疗个体病毒感染的药物中的用途。

在一些实施方式中，所述病毒感染选自逆转录病毒感染、慢病毒感染、鼻病毒感染、腺病毒感染、冠状病毒感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染、疱疹病毒感染、人类T淋巴球病毒感染、西尼罗病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人类肠道病毒感染，特别地，选自HIV-1感染和HIV-2感染。

第七方面提供第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或第三方面的表达载体，以及治疗个体HIV感染的其它药剂在制备治疗个体HIV感染的药物中的用途。

在一些实施方式中，所述HIV感染选自HIV-1感染和HIV-2感染。

在一些实施方式中，所述治疗个体HIV感染的其它药剂是核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂，特别地，所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)。

第八方面提供可穿膜蛋白，其由天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其核糖体失活活性形式及与其N端连接的穿膜肽构成。

在一些实施方式中，所述穿膜肽选自图6所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述可穿膜蛋白具有如SEQ ID NO：4或SEQID NO：5所示的序列。

第九方面提供蛋白纯化方法，包括：

(a)使用第一阳离子交换柱纯化包含所述蛋白的层析样品，其中，层析所用第一平衡液是50mM醋酸钠，100mM氯化钠，pH 5.5，第一洗脱液是50mM醋酸钠，600-850mM氯化钠，pH 5.5。

在一些实施方式中，所述蛋白是天然存在的玉米核糖体失活蛋白或其活性形式。

在另一些实施方式中，所述蛋白是第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。

在又一些实施方式中，所述蛋白是第八方面的可穿膜蛋白。

在一些实施方式中，所述第一阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-，特别地，所述第一阳离子交换柱是HiTrap SP FF。

在一些实施方式中，所述第一平衡液还包含1M-10M的、特别地8M的尿素。

在一些实施方式中，所述洗脱使用紫外监测。

在一些实施方式中，所述纯化方法还包括对步骤(a)的纯化产物脱盐的步骤，特别地，所述脱盐使用可商购的脱盐柱。

在一些实施方式中，所述纯化方法还包括：

(b)浓缩步骤(a)的纯化产物；和

(c)使用第二阳离子交换柱纯化步骤(b)的浓缩产物，其中，所用第二平衡液是50mM醋酸钠，100mM氯化钠，pH 5.5，第二洗脱液是50mM醋酸钠，600-850mM氯化钠，pH 5.5。

在某些实施方式中，其中所述浓缩使用超滤，特别地使用Amicon超滤离心过滤器10K。

在某些实施方式中，所述第二阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-，特别地，所述第二阳离子交换柱是HiTrap SP XL。

在某些实施方式中，所述第二平衡液还包含1M-10M的、特别地4M的尿素。

在某些实施方式中，所述步骤(c)中的洗脱使用紫外监测。

在某些实施方式中，所述纯化方法还包括对步骤(c)的纯化产物脱盐的步骤，特别地，所述脱盐使用可商购的脱盐柱。

应当理解，本申请的范围并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案等。

据此，本申请请求保护包括但不限于以下所列的发明：

1.修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其包含修饰的内部失活区域，所述修饰的内部失活区域含有病毒蛋白酶酶切位点。

2.如以上1所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述修饰的内部失活区域长15-60个氨基酸，优选地长20-35个氨基酸，更为优选地长25个氨基酸。

3.如以上1或2所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒选自逆转录病毒、慢病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、疱疹病毒、人类T淋巴球病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、人类肠病毒，优选地，所述病毒选自HIV-1和HIV-2。

4.如以上1-3中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是一个或多个，优选地是2个。

5.如以上1-4中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是一个，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

6.如以上1-4中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是2个相同的酶切位点，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

7.如以上1-4中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是2个不同的酶切位点，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任两种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任两种。

8.如以上1-7中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其缺失天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的N端失活区域或C端失活区域，或同时缺失两者。

9.如以上1-8中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其N端包含穿膜肽，所述穿膜肽选自图6所示的氨基酸序列。

10.如以上1-9中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列。

11.多核苷酸，所述多核苷酸编码以上1-10中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。

12.表达载体，所述表达载体包含与起始载体可操作连接的如以上11所述的多核苷酸。

13.如以上12所述的表达载体，其中所述起始载体选自原核载体，例如pET系列载体；腺病毒系统，例如pAdEasy-1、pShuttle-CMV、pShuttle；腺相关病毒系统，例如pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ、pAAV-IRES-hrGFP、pCMV-MCS；逆病毒载体，例如pLNCX2、pQCXIH、pMSCVpuro、pLVTH；慢病毒载体，例如FUGW、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL、pLVX-DsRed-Monomer-N1、pLP1、pLP2、pLP VSV-G、pVSV-G；哺乳动物载体，例如pcDNA。

14.药物组合物，包括以上1-10中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或者如以上12或13所述的表达载体，还包括药学上可接受的载体。

15.如以上14所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包括治疗个体HIV感染的其它药剂，优选地，进一步包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂，更为优选地，所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)。

16.如以上1-10中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或如以上12或13所述的表达载体，在制备治疗个体病毒感染的药物中的用途。

17.如以上16所述的用途，其中所述病毒感染选自逆转录病毒感染、慢病毒感染、鼻病毒感染、腺病毒感染、冠状病毒感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染、疱疹病毒感染、人类T淋巴球病毒感染、西尼罗病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人类肠道病毒感染，优选地，选自HIV-1感染和HIV-2感染。

18.如以上1-10中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或如以上12或13所述的表达载体，以及治疗个体HIV感染的其它药剂在制备治疗个体HIV感染的药物中的用途。

19.如以上18所述的用途，其中所述HIV感染选自HIV-1感染和HIV-2感染。

20.如以上18或19所述的用途，其中所述治疗个体HIV感染的其它药剂是核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂，优选地，所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)。

21.可穿膜蛋白，其由天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其核糖体失活活性形式及与其N端连接的穿膜肽构成。

22.如以上21所述的可穿膜蛋白，其中所述穿膜肽选自图6所示的氨基酸序列。

23.如以上21或22所述的可穿膜蛋白，其中所述可穿膜蛋白具有如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的序列。

24.蛋白纯化方法，包括：

25.如以上24所述的纯化方法，其中所述蛋白是天然存在的玉米核糖体失活蛋白或其活性形式。

26.如以上24所述的纯化方法，其中所述蛋白是如1-10中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。

27.如以上24所述的纯化方法，其中所述蛋白是如21-23中任一项所述的可穿膜蛋白。

28.如以上24-27中任一项所述的纯化方法，其中所述第一阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-，优选地，所述第一阳离子交换柱是HiTrap SP FF。

29.如以上28中任一项所述的纯化方法，其中所述第一平衡液还包含1M-10M的、优选地8M的尿素。

30.如以上24-29中任一项所述的纯化方法，其中所述洗脱使用紫外监测。

31.如以上24-30中任一项所述的纯化方法，还包括对步骤(a)的纯化产物脱盐的步骤，优选地，所述脱盐使用可商购的脱盐柱。

32.如以上24-30中任一项所述的纯化方法，所述纯化方法还包括：

(b)浓缩步骤(a)的纯化产物；和

33.如以上32所述的纯化方法，其中所述浓缩使用超滤，优选地使用Amicon超滤离心过滤器10K。

34.如以上32或33所述的纯化方法，其中所述第二阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-，优选地，所述第二阳离子交换柱是HiTrap SP XL。

35.如以上32-34中任一项所述的纯化方法，其中所述第二平衡液还包含1M-10M的、优选地4M的尿素。

36.如以上32-35中任一项所述的纯化方法，其中所述步骤(c)中的洗脱使用紫外监测。

37.如以上32-36中任一项所述的纯化方法，还包括对步骤(c)的纯化产物脱盐的步骤，优选地，所述脱盐使用可商购的脱盐柱。

附图说明

图1示出产生HIV-1活力病毒子(virion)所需的12个蛋白水解反应。

图2示出氨基酸的单字母和三字母缩写。

图3-图5示出图1中12个蛋白水解反应的HIV-1蛋白酶酶切位点，其中，MRCA代表最近共同先祖(Most Recent Common Ancestor)，而HXB2是HIV-1的一个毒株，同时，x表示任意氨基酸，↓代表切割位点。

图6示出穿膜肽的氨基酸序列及其来源。

图7是TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2的示意图。

图8示出纯化的TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2的15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

图9示出TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2对非HIV感染的C8166、急性HIV-1_IIIB感染的C8166、急性HIV-1_RF/V82F/I84V感染的C8166的细胞毒性，以及对合胞体、HIV p24抗原的抑制，其中，数据以平均值±标准偏差表示(三组独立实验n＝12)。

图10示出TAT-Pro和TAT-MOD对急性HIV-1_IIIB感染C8166细胞的抗HIV作用：(A)对合胞体的抑制，(B)对p24抗原的抑制；以及对急性HIV-1_RF/V82F/I84V感染C8166细胞的抗HIV作用：(C)对合胞体的抑制，(D)对p24抗原的抑制。数据以平均值±标准偏差表示(三组独立实验n＝12)，^***P＜0.001。

图11示出TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA 和TAT-Pro-HIV-p2对急性HIV-1_IIIB感染C8166细胞的抗HIV作用：(A)对合胞体的抑制，(B)对p24抗原的抑制。数据以平均值±标准偏差表示(三组独立实验n＝12)，^***P＜0.001。

图12示出TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2被HIV-1蛋白酶激活于(A)细胞外和(B)急性HIV-1_IIIB感染C8166细胞，其中图12B为以β-肌动蛋白为内标的Western印迹。

图13示出TAT-Pro和TAT-MOD的氨基酸序列，其中双下划线标示的11aa序列为TAT穿膜肽。

图14示出TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2的氨基酸序列，其中双下划线标示的11aa序列为TAT穿膜肽，而单下划线标示的25aa序列为修饰的内部失活区域，其含有HIV-1蛋白酶酶切序列。

具体实施方式

一方面，提供修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其包含修饰的内部失活区域，所述修饰的内部失活区域含有病毒蛋白酶酶切位点。

在本文中，术语“玉米核糖体失活蛋白前体”意指在玉米中天然存在的核糖体失活蛋白前体，其具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

玉米核糖体失活蛋白前体在玉米胚乳中累积，随后在发芽时，经加工形成由2条多肽组成的核糖体失活活性形式，即活性RIP。玉米核糖体失活蛋白被认为是一种III型RIP。

在玉米中，形成活性RIP的天然加工在于，移除如SEQ ID NO：1所示序列中以下位点的氨基酸：位点163-164和167-189；位点1-16和位点287-300。研究发现，移除位点163-164和167-189的氨基酸后，所述蛋白的核糖体失活活性增加数百倍，而仅移除位点1-16和/或位点287-300的氨基酸时，所述活性仅增加数倍(Amanda Nga-Sze Mak，et al.，Structure-function study of maize ribosome-inactivating protein：implicationsfor the internal inactivation region and the sole glutamate in the active site(玉米核糖体失活蛋白结构-功能研究：内部失活区域和活性位点单一谷氨酸的暗示)，Nucleic Acids Research，2007，Vol.35，No.18 6259-6267)。在本文中，将所述位点163-164和167-189称作“内部失活区域”或“天然存在的内部失活区域”，将所述位点1-16称作“N端失活区域”，将所述位点287-300称作“C端失活区域”。

在本文中，术语“修饰”意指对氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。本领域技术人员可以理解，可以利用本领域的常规方法，例如记载在Joe Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆实验指南)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；3rd edition(第三版)(January 15，2001)中的方法，进行氨基酸的取代、缺失和/或添加。换言之，在修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有确定的氨基酸序列的情况下，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体能够被容易地制备。

需要注意的是，术语“修饰”的使用意在更为清楚地描述蛋白的氨基酸序列，而并非限定蛋白的制备方法。本领域技术人员可以理解，除可以如上所述通过氨基酸的取代、缺失和/或添加制备修饰的蛋白之外，还可以使用诸如全序列合成的其它方法制备修饰的蛋白。

在一些实施方式中，所述修饰发生在天然存在的内部失活区域(从而形成本文所称“修饰的内部失活区域”)，以致该区域含有病毒蛋白酶酶切位点。

所述的、发生在天然存在的内部失活区域中的任一或任意多个氨基酸位点的取代、缺失和/或添加，可能会导致所述修饰的内部失活区域与天然存在的内部失活区域相比，具有改变的氨基酸序列长度。关于这种改变的范围，本领域技术人员可以理解，鉴于玉米核糖体失活蛋白前体的内部失活区域位于蛋白晶体结构表面[Amanda Nga-SzeMak，et al.，Structure-function study of maize ribosome-inactivating protein：implications for the internal inactivation region and the sole glutamate in theactive site(玉米核糖体失活蛋白结构-功能研究：内部失活区域和活性位点单一谷氨酸的暗示)，Nucleic Acids Research，2007，Vol.35，No.186259-6267)]，因而所述修饰的内部失活区域的氨基酸序列长度可以取较宽范围。在某些实施方式中，所述修饰的内部失活区域长15-60个氨基酸。在特定实施方式中，所述修饰的内部失活区域长20-35个氨基酸。在一实施方式中，所述修饰的内部失活区域长25个氨基酸。

天然存在的内部失活区域经修饰以致包含病毒蛋白酶酶切位点，所述位点是特异性切割氨基酸序列的蛋白酶的酶切位点。

在一些实施方式中，所述病毒选自逆转录病毒、慢病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、疱疹病毒、人类T淋巴球病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、人类肠病毒。在某些实施方式中，所述病毒选自HIV，特别地选自HIV-1和HIV-2亚型，更为特别地，选自HIV-1的M组、O组和N组。在某些实施方式中，所述病毒选自HXB2、HIV-1_IIIB和HIV-1_RF/V82F/I84V。在某些实施方式中，所述病毒是SIV。

在病毒是HIV的情况下，所述蛋白酶是HIV-1或HIV-2蛋白酶，其中HIV-1蛋白酶是99个氨基酸的天冬氨酸酶，酶切HIV Gag、Gag-Pol和Nef前体多蛋白(polyprotein)或蛋白。酶切产生的功能性蛋白产物为病毒组装及随后活性所必需。如图1所示，产生活力病毒子共需12个蛋白水解反应，其中的每一反应均发生在独特的酶切位点。所述酶切过程高度特异。

在病毒是SIV的情况下，所述蛋白酶是SIV蛋白酶，其酶切位点描述于Grant SK et al.Purification and biochemical characterization ofrecombinant simian immunodeficiency virus protease and comparison tohuman immunodeficiency virus type 1 protease(重组猿猴免疫缺陷病毒蛋白酶的纯化和生物化学表征，以及与人类免疫缺陷病毒I型蛋白酶的比较).Biochemistry，1991，Vol.30，8424-8434。SIV蛋白酶酶切位点的实例包括但不限于，GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK(↓代表切割位点)。

在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点由识别位点和切割位点构成，其中切割位点位于识别位点中或紧邻识别位点。所述酶切位点可以是一个或者多个、例如2个、3个、4个、5个或更多个。在含有多个酶切位点时，所述酶切位点可以是不同的，也可以是相同的。在所述酶切位点为多个时，其氨基酸序列在修饰的内部失活区域中可以是重叠的，然而，也可以是非重叠的，例如间隔一个或多个氨基酸。此外，在含有多个蛋白酶酶切位点时，所述酶切位点可以位于修饰的内部失活区域中的任一位置，特别地，可以位于修饰的内部失活区域的末端、例如两端。由于包含这样的酶切位点，所述修饰的内部失活区域可以被病毒蛋白酶酶切。并且，所述酶切并不必然导致所述修饰的内部失活区域的完全移除，而在玉米中，为形成活性RIP的酶切至少需完全移除天然存在的内部失活区域。在某些实施方式中，酶切仅移除修饰的内部失活区域中的一部分氨基酸序列，而余下部分分别保留在酶切产生的多个多肽中。在某些实施方式中，酶切甚至不会导致任何移除。

在特定实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是1个，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

在特定实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是相同的2个，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任一种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

在特定实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是不同的2个，并且选自图3至图5所示的HIV-1蛋白酶酶切位点中的任两种或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任两种。

在一实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是不同的2个，并且选自以下的任一组，其中，以下的每一组均由两种不同的酶切位点构成：

VSQNY↓PIVQN和TATIM↓MQRGN；VSQNY↓PIVQN和KARVL↓AEAMS；VSQNY↓PIVQN和STAIM↓MQKGN；VSQNY↓PIVQN和TSAIM↓MQRGN；VSQNY↓PIVQN和ERQAN↓FLGKI；VSQNY↓PIVQN和RPGNF↓LQSRP；VSQNY↓PIVQN和ERQAN↓FLREN；VSQNY↓PIVQN 和ENLAF↓QQGEA；VSQNY↓PIVQN和EDLAF↓LQGKA；VSQNY↓PIVQN和TSFSF↓PQITC；VSQNY↓PIVQN和VSFNF↓PQVTC；VSQNY↓PIVQN和CTLNF↓PISPI；VSQNY↓PIVQN和GAETF↓YVDGA；VSQNY↓PIVQN和IRKVL↓FLDGI；VSQNY↓PIVQN和PDCAW↓LEAQE；VSQNY↓PIVQN和AACAW↓LEAQE。

TATIM↓MQRGN和KARVL↓AEAMS；TATIM↓MQRGN和STAIM↓MQKGN；TATIM↓MQRGN和TSAIM↓MQRGN；TATIM↓MQRGN和ERQAN↓FLGKI；TATIM↓MQRGN和RPGNF↓LQSRP；TATIM↓MQRGN和ERQAN↓FLREN；TATIM↓MQRGN和ENLAF↓QQGEA；TATIM↓MQRGN和EDLAF↓LQGKA；TATIM↓MQRGN和TSFSF↓PQITC；TATIM↓MQRGN和VSFNF↓PQVTC；TATIM↓MQRGN和CTLNF↓PISPI；TATIM↓MQRGN和GAETF↓YVDGA；TATIM↓MQRGN和IRKVL↓FLDGI；TATIM↓MQRGN和PDCAW↓LEAQE；TATIM↓MQRGN和AACAW↓LEAQE。

KARVL↓AEAMS和STAIM↓MQKGN；KARVL↓AEAMS和TSAIM↓MQRGN；KARVL↓AEAMS和ERQAN↓FLGKI；KARVL↓AEAMS和RPGNF↓LQSRP；KARVL↓AEAMS和ERQAN↓FLREN；KARVL↓AEAMS和ENLAF↓QQGEA；KARVL↓AEAMS和EDLAF↓LQGKA；KARVL↓AEAMS和TSFSF↓PQITC；KARVL↓AEAMS和VSFNF↓PQVTC；KARVL↓AEAMS和CTLNF↓PISPI；KARVL↓AEAMS和GAETF↓YVDGA；KARVL↓AEAMS和IRKVL↓FLDGI；KARVL↓AEAMS和PDCAW↓LEAQE；KARVL↓AEAMS和AACAW↓LEAQE。

STAIM↓MQKGN和TSAIM↓MQRGN；STAIM↓MQKGN和ERQAN↓FLGKI；STAIM↓MQKGN和RPGNF↓LQSRP；STAIM↓MQKGN和ERQAN↓FLREN；STAIM↓MQKGN和ENLAF↓QQGEA；STAIM↓MQKGN和EDLAF↓LQGKA；STAIM↓MQKGN和TSFSF↓PQITC；STAIM↓MQKGN和VSFNF↓PQVTC；STAIM↓MQKGN和CTLNF↓PISPI；STAIM↓MQKGN和GAETF↓YVDGA；STAIM↓MQKGN和IRKVL↓FLDGI；STAIM↓MQKGN和PDCAW↓LEAQE；STAIM↓MQKGN和AACAW↓LEAQE。

TSAIM↓MQRGN和ERQAN↓FLGKI；TSAIM↓MQRGN和RPGNF↓LQSRP；TSAIM↓MQRGN和ERQAN↓FLREN；TSAIM↓MQRGN和ENLAF↓QQGEA；TSAIM↓MQRGN和EDLAF↓LQGKA；TSAIM↓MQRGN和TSFSF↓PQITC；TSAIM↓MQRGN和VSFNF↓PQVTC；TSAIM↓MQRGN和CTLNF↓PISPI；TSAIM↓MQRGN和GAETF↓YVDGA；TSAIM↓MQRGN和IRKVL↓FLDGI；TSAIM↓MQRGN和PDCAW↓LEAQE；TSAIM↓MQRGN和AACAW↓LEAQE。

ERQAN↓FLGKI和RPGNF↓LQSRP；ERQAN↓FLGKI和ERQAN↓FLREN；ERQAN↓FLGKI和ENLAF↓QQGEA；ERQAN↓FLGKI和EDLAF↓LQGKA；ERQAN↓FLGKI和TSFSF↓PQITC；ERQAN↓FLGKI和VSFNF↓PQVTC；ERQAN↓FLGKI和CTLNF↓PISPI；ERQAN↓FLGKI和GAETF↓YVDGA；ERQAN↓FLGKI和IRKVL↓FLDGI；ERQAN↓FLGKI和PDCAW↓LEAQE；ERQAN↓FLGKI和AACAW↓LEAQE。

RPGNF↓LQSRP和ERQAN↓FLREN；RPGNF↓LQSRP和ENLAF↓QQGEA；RPGNF↓LQSRP和EDLAF↓LQGKA；RPGNF↓LQSRP和TSFSF↓PQITC；RPGNF↓LQSRP和VSFNF↓PQVTC；RPGNF↓LQSRP和CTLNF↓PISPI；RPGNF↓LQSRP和GAETF↓YVDGA；RPGNF↓LQSRP和IRKVL↓FLDGI；RPGNF↓LQSRP和PDCAW↓LEAQE；RPGNF↓LQSRP和AACAW↓LEAQE。

ERQAN↓FLREN和ENLAF↓QQGEA；ERQAN↓FLREN和EDLAF↓LQGKA；ERQAN↓FLREN和TSFSF↓PQITC；ERQAN↓FLREN和VSFNF↓PQVTC；ERQAN↓FLREN和CTLNF↓PISPI；ERQAN↓FLREN和GAETF↓YVDGA；ERQAN↓FLREN和IRKVL↓FLDGI；ERQAN↓FLREN和PDCAW↓LEAQE；ERQAN↓FLREN和AACAW↓LEAQE。

ENLAF↓QQGEA和EDLAF↓LQGKA；ENLAF↓QQGEA和TSFSF↓PQITC；ENLAF↓QQGEA和VSFNF↓PQVTC；ENLAF↓QQGEA和CTLNF↓PISPI；ENLAF↓QQGEA和GAETF↓YVDGA；ENLAF↓QQGEA和IRKVL↓FLDGI；ENLAF↓QQGEA和PDCAW↓LEAQE；ENLAF↓QQGEA和AACAW↓LEAQE。

EDLAF↓LQGKA和TSFSF↓PQITC；EDLAF↓LQGKA和VSFNF↓PQVTC；EDLAF↓LQGKA和CTLNF↓PISPI；EDLAF↓LQGKA和GAETF↓YVDGA；EDLAF↓LQGKA和IRKVL↓FLDGI；EDLAF↓LQGKA和PDCAW↓LEAQE；EDLAF↓LQGKA和AACAW↓LEAQE。

TSFSF↓PQITC和VSFNF↓PQVTC；TSFSF↓PQITC和CTLNF↓PISPI；TSFSF↓PQITC和GAETF↓YVDGA；TSFSF↓PQITC和IRKVL↓FLDGI；TSFSF↓PQITC和PDCAW↓LEAQE；TSFSF↓PQITC和AACAW↓LEAQE。

VSFNF↓PQVTC和CTLNF↓PISPI；VSFNF↓PQVTC和GAETF↓YVDGA；VSFNF↓PQVTC和IRKVL↓FLDGI；VSFNF↓PQVTC和PDCAW↓LEAQE；VSFNF↓PQVTC和AACAW↓LEAQE。

CTLNF↓PISPI和GAETF↓YVDGA；CTLNF↓PISPI和IRKVL↓FLDGI；CTLNF↓PISPI和PDCAW↓LEAQE；CTLNF↓PISPI和AACAW↓LEAQE。

GAETF↓YVDGA和IRKVL↓FLDGI；GAETF↓YVDGA和PDCAW↓LEAQE；GAETF↓YVDGA和AACAW↓LEAQE。

IRKVL↓FLDGI和PDCAW↓LEAQE；IRKVL↓FLDGI和AACAW↓LEAQE。

在一实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是不同的2个，并且是PDCAW↓LEAQE和AACAW↓LEAQE。

GGNY↓PVQQ和ARLM↓AEAL；GGNY↓PVQQ和PFAA↓AQKR；GGNY↓PVQQ和PRNF↓PMAQ；GGNY↓PVQQ和GFAA↓PQFS；GGNY↓PVQQ和SLNL↓PIAK；GGNY↓PVQQ和EETY↓YTDG；GGNY↓PVQQ和RQVL↓FLEK。

ARLM↓AEAL和PFAA↓AQKR；ARLM↓AEAL和PRNF↓PMAQ；ARLM↓AEAL和GFAA↓PQFS；ARLM↓AEAL和SLNL↓PIAK；ARLM↓AEAL和EETY↓YTDG；ARLM↓AEAL和RQVL↓FLEK。

PFAA↓AQKR和PRNF↓PMAQ；PFAA↓AQKR和GFAA↓PQFS；PFAA↓AQKR和SLNL↓PIAK；PFAA↓AQKR和EETY↓YTDG；PFAA↓AQKR和RQVL↓FLEK。

PRNF↓PMAQ和GFAA↓PQFS；PRNF↓PMAQ和SLNL↓PIAK；PRNF↓PMAQ和EETY↓YTDG；PRNF↓PMAQ和RQVL↓FLEK。

GFAA↓PQFS和SLNL↓PIAK；GFAA↓PQFS和EETY↓YTDG；GFAA↓PQFS和RQVL↓FLEK。

SLNL↓PIAK和EETY↓YTDG；SLNL↓PIAK和RQVL↓FLEK。

在一实施方式中，在所述修饰的内部失活区域中，病毒蛋白酶酶切位点是不同的2个，并且是EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK。

如前所述，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体是对天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而获得的蛋白。在一些实施方式中，所述修饰发生在天然存在的内部失活区域，以致该区域含有病毒蛋白酶酶切位点。

然而，在另一些实施方式中，所述修饰还发生在天然存在的内部失活区域之外的、玉米核糖体失活蛋白前体的其它氨基酸位点。例如：

a)所述修饰还在于缺失天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的N端失活区域或C端失活区域，或同时缺失两者，从而进一步提高其核糖体失活活性形式的活性；和/或

b)所述修饰还在于使天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的N端包含穿膜肽，从而使其更为高效地进入细胞。在本文中，术语“穿膜肽”意指一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。穿膜肽多带有正电荷且富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。用于所述修饰的穿膜肽包括但不限于图6所示的穿膜肽；和/或

c)所述修饰还可以发生在这样的位点：尽管所述位点发生氨基酸的取代、缺失和/或添加，然而，核糖体失活活性形式仍能形成。在特定实施方式中，所述取代是本领域公认的同性质氨基酸的取代，例如，当待取代位点为酸性氨基酸时，取代使用另一酸性氨基酸。

如前所述，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体是对天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而获得的蛋白。在一实施方式中，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有如SEQ ID NO：2所示的序列。在另一实施方式中，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有如SEQ ID NO：3所示的序列。

如前所述，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体是对天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而获得的蛋白。在病毒所感染个体的细胞中存在所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的情况下，其内部失活区域发生酶切，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体转变为核糖体失活活性形式，抑制所述病毒的产生和/或在细胞间的传播。相反，在正常的、未受感染的细胞中，即使存在所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其内部失活区域也不会发生酶切，这些细胞不会受到伤害或受到较小伤害。在本文中，术语“个体”意指生物个体。所述的生物例如是动物、优选哺乳动物、更优选猿猴或人。在本文中，涉及“感染”的术语“病毒”意指含有可以酶切所述的“病毒蛋白酶酶切位点”的蛋白酶的病毒。

在某些实施方式中，在感染HIV-1或SIV的个体的细胞中存在所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。HIV-1蛋白酶或SIV蛋白酶酶切其内部失活区域，使所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体转变为活性RIP，抑制HIV-1或SIV的产生和/或其在细胞间的传播。例如，在所述受感染细胞中，合胞体(syncytium)和/或HIV-1 p24蛋白的形成被抑制。所述对合胞体和/或HIV p24蛋白的抑制作用通过Wang R.R.et al.Anti-HIV activities of compounds isolated from the medicinal plants Rhuschinensis(自药用植物盐肤木分离的化合物的抗HIV活性).2008Journal of Ethnopharmacology.Vol，117249-256所记载的方法、特别地如本申请实施例6和7所述的方法来测定。

在特定实施方式中，在感染HIV-1或SIV的个体的细胞中，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体与天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体相比，在合胞体和/或HIV-1 p24蛋白抑制作用上具有更高的活性。所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的活性例如是天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、150倍、200倍或更多，其中所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有上文具体列出的酶切位点或酶切位点的组合。

在优选的实施方式中，在感染HIV-1或SIV的个体的细胞中，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体与缺失SEQ ID NO：1中位点1-16、163-164、167-189、287-300氨基酸的玉米核糖体失活蛋白前体的截短形式相比，在合胞体和/或HIV-1 p24蛋白抑制作用上类似或相当。在更优选的实施方案中，所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的活性高于缺失SEQ ID NO：1中位点1-16、163-164、167-189、287-300氨基酸的玉米核糖体失活蛋白前体的截短形式的10％-100％或更多，例如，其中所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体具有上文具体列出的酶切位点或酶切位点的组合。

相反，在正常的、未感染HIV-1或SIV的个体的细胞中，即使存在所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其内部失活区域也不被酶切，因而对细胞无毒性或毒性较小。所述细胞毒性通过如Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application toproliferation and cytotoxicity assays(用于细胞生长和存活的快速比色测定法：应用于增殖和细胞毒性测定).1983.Journal of ImmunologicalMethods.Vol.65，Issues 1-255-63中所述的MTT比色法以及Wang R.R.et al.Anti-HIV activities of compounds isolated from the medicinal plantsRhus chinensis(自药用植物盐肤木分离的化合物的抗HIV活性).2008Journal of Ethnopharmacology.Vol，117 249-256中记载的方法、特别地如本申请实施例5所述的方法来测定。

本领域技术人员可以理解，可以利用本领域的常规方法，例如PCR(包括重叠PCR)、可商购的定点突变试剂盒或全序列合成来制备所述多核苷酸。

第三方面提供表达载体，其包含与起始载体可操作连接的第二方面的多核苷酸。

在本文中，术语“起始载体”意指不含待表达的目的多核苷酸的载体。在本文中，涉及多核苷酸与起始载体的术语“可操作连接”意指，所述连接使多核苷酸处于启动子控制下且位于正确的阅读框内，以致在适当的细胞中，所述多核苷酸可以被正确表达，产生其所编码的蛋白。

通常使用适当的、可商购的原核或真核载体充当起始载体。起始载体的实例包括但不限于，原核载体，例如pET系列载体(Merck KGaA，德国)；腺病毒系统，例如pAdEasy-1、pShuttle-CMV、pShuttle(StratageneInc.，CA，美国)；腺相关病毒系统，例如pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ、pAAV-IRES-hrGFP、pCMV-MCS(Stratagene Inc.，CA，美国)；逆病毒载体，例如pLNCX2、pQCXIH、pMSCVpuro(Clontech Laboratories，Inc.，CA，美国)、pLVTH(Addgene Inc.，MA，美国)；慢病毒载体，例如FUGW、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL(Addgene Inc.，MA，美国)、pLVX-DsRed-Monomer-N1(Clontech Laboratories，Inc.，CA，美国)、pLP1、pLP2、pLP VSV-G、pVSV-G(Invitrogen Corporation，CA，美国)；哺乳动物载体，例如pcDNA(Invitrogen Corporation，CA，美国)。

所述表达载体可以被转化/转染至原核或真核细胞，其中，转化后的原核细胞可以用于体外生产第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。转化/转染使用常规方法、例如记载在Joe Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，ColdSpring Harbor Laboratory Press；3rd edition(第三版)(January 15，2001)中的方法。

第四方面提供药物组合物，包括第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或第三方面的表达载体，还包括药学上可接受的载体。

本文所用术语“药学上可接受的载体”例如是与药物给药兼容的任何溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。

所述药物组合物的制备使用例如在美国药典以及类似参考文献中描述的标准方法。所述药物组合物可以以各种剂型存在，包括但不限于，混悬剂、乳剂、酊剂、醑剂、软膏剂、粉剂、胶囊剂、片剂、栓剂、微囊、微丸、脂质体、滴丸剂、膜剂、固体分散体。

在某些实施方式中，在所述修饰的内部失活区域包含HIV蛋白酶或SIV蛋白酶的酶切位点、和/或在所述表达载体表达这样的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体的情况下，所述药物组合物可以进一步包括，治疗个体HIV感染的其它药剂。所述其它药剂包括但不限于，核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和HIV蛋白酶抑制剂。所述NRTIs是合成HIV的DNA逆转录酶底物脱氧核苷酸的类似物，其在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争与HIV逆转录酶(RT)的结合，抑制RT的作用，阻碍HIV前病毒的合成。NRTIs的实例包括，拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)、阿巴卡韦(Abacavir，ABC)等。HIV蛋白酶抑制剂是带有环状结构的肽化合物，可竞争性或非竞争性抑制HIV蛋白酶活性。此外，HIV蛋白酶抑制剂还可以降低白介素-1β转换酶的表达，从而减少CD4细胞凋亡。HIV蛋白酶抑制剂的实例包括，沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)、洛匹那韦(lopinavir，LPV)等。

在一些实施方式中，所述病毒感染选自逆转录病毒感染、慢病毒感染、鼻病毒感染、腺病毒感染、冠状病毒感染、HIV感染、SIV感染、疱疹病毒感染、人类T淋巴球病毒感染、西尼罗病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人类肠病毒感染。在某些实施方式中，所述病毒感染选自HIV感染，特别地选自HIV-1和HIV-2亚型感染，更为特别地，选自HIV-1的M组、O组和N组感染。在某些实施方式中，所述病毒感染选自HXB2、HIV-1_IIIB和HIV-1_RF/V82F/I84V感染。在某些实施方式中，所述病毒感染是SIV感染。

所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、所述表达载体或所述药物组合物的施用可以通过例如肠胃外、吸入、局部或全身性给药。肠胃外给药例如静脉、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。吸入给药例如鼻内或口腔吸入给药。局部给药例如向表皮外部、口腔给药，以及向耳、眼和鼻中以及不显着进入血流的部位滴注给药。全身性给药例如口服、静脉、腹膜内或肌内给药。

所述施用使用治疗有效量的所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、所述表达载体或所述药物组合物。在本文中，术语“治疗有效量”意指足以诱发对受治个体的治疗性作用的量。治疗有效量的变化取决于给药途径、药学上可接受的载体以及与其它治疗剂或其它治疗性疗法的可能的联合应用。

所述修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、所述表达载体或所述药物组合物可以与治疗个体病毒感染的其它药剂或其它治疗性疗法联用。所述联用可以在同一时间或不同时间下进行。

在某些实施方式中，所述治疗个体病毒感染的其它药剂是治疗个体HIV感染的其它药剂，包括但不限于，核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和HIV蛋白酶抑制剂。所述NRTIs和HIV蛋白酶抑制剂及其实例如上所述。

第六方面提供第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或第三方面的表达载体在制备治疗个体病毒感染的药物中的用途。

在某些实施方式中，治疗个体病毒感染的药物是第四方面的药物组合物。

第七方面提供第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或第三方面的表达载体，以及治疗个体HIV感染的其它药剂，在制备治疗个体HIV感染的药物中的用途。所述HIV感染选自HIV-1和HIV-2感染。

在治疗个体HIV感染的药物中，所述的治疗个体HIV感染的其它药剂是治疗活性成分之一，其包括但不限于，核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和HIV蛋白酶抑制剂。所述NRTIs和HIV蛋白酶抑制剂及其实例如上所述。

第八方面提供可穿膜蛋白，所述可穿膜蛋白由天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其核糖体失活活性形式及与其N端连接的穿膜肽构成。

所述天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其核糖体失活活性形式在其N端连接穿膜肽，从而使其更为高效地进入细胞。所述连接可以利用融合表达而实现，也可以利用接头而实现。所连接的穿膜肽包括但不限于图6所示的穿膜肽。

在一实施方式中，所述可穿膜蛋白具有如SEQ ID NO：4所示的序列。在另一实施方式中，所述可穿膜蛋白具有如SEQ ID NO：5所示的序列。

第九方面提供蛋白纯化方法，包括：

层析样品包含待纯化蛋白以及诸如杂蛋白的杂质。在一些实施方式中，所述待纯化蛋白是天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体或其活性形式。在另一些实施方式中，所述待纯化蛋白是第一方面的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。在又一些实施方式中，所述待纯化蛋白是第八方面的可穿膜蛋白。所述层析样品可以是利用所述待纯化蛋白的制备方法所得产物。在一实施方式中，所述层析样品是表达所述待纯化蛋白的细胞的裂解液。

在一些实施方式中，第一阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-。在一实施方式中，第一阳离子交换柱是HiTrap SP FF(工作pH 3-11)(Amersham，GEHealthCare，美国)。

在某些实施方式中，所述第一平衡液还包含尿素，以促进所述待纯化蛋白的溶解，其中所用尿素为1-10M、特别地8M。

在进行第一阳离子交换层析时，使层析样品溶于第一平衡液，随后将其上样至第一阳离子交换柱。当层析样品是溶液时，在将其溶于第一平衡液后，离心，取上清；或者利用第一平衡液，进行缓冲液交换，所述缓冲液交换例如使用可商购的缓冲液交换柱。

洗脱流速为适于所述第一阳离子交换柱的流速，特别地是1ml/min或5ml/min。

在某些实施方式中，洗脱使用紫外监测。所述紫外监测使用280nm测定洗脱液总蛋白含量。当测定到较高浓度蛋白时，所收集洗脱液包含所述待纯化蛋白。

在一些实施方式中，在使用第一阳离子交换柱纯化后，还包括对步骤(a)的纯化产物脱盐的步骤。所述脱盐例如使用可商购的脱盐柱。

在另一些实施方式中，在使用第一阳离子交换柱纯化后，还包括：

(b)浓缩步骤(a)的纯化产物的步骤。所述浓缩例如使用超滤。在特定实施方式中，超滤使用例如Amicon超滤离心过滤器10K(Milipore，爱尔兰)。

在某些实施方式中，在所述浓缩步骤之后，还包括：

(c)使用第二阳离子交换柱纯化步骤(b)的浓缩产物，其中，所用第二平衡液是50mM醋酸钠，100mM氯化钠，pH 5.5。第二洗脱液是50mM醋酸钠，600-850mM氯化钠，pH 5.5。

在特定实施方式中，第二阳离子交换柱的介质是结合葡聚糖的高度交联的琼脂糖，阴离子是-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-。在一实施方式中，第二阳离子交换柱是HiTrap SP XL(工作pH 3-11)(Amersham，GEHealthCare，美国)。

所述第二平衡液还可以包含尿素，其中所用尿素是1M-10M，特别地4M。

在进行第二阳离子交换层析时，使步骤(b)的浓缩产物溶于第二平衡液，随后将其上样至第二阳离子交换柱。

使用第一阳离子交换层析中的紫外监测来监测洗脱，即所述紫外监测使用280nm测定洗脱液总蛋白含量。当测定到较高浓度蛋白时，所收集洗脱液包含所述待纯化蛋白。

某些实施方式中，在使用第二阳离子交换柱纯化后，还包括对步骤(c)的纯化产物脱盐的步骤。所述脱盐例如使用可商购的脱盐柱。

可以使用例如SDS-PAGE的检测方法，测定该纯化方法所纯化得到的蛋白的纯度。在使用SDS-PAGE的情况下，可以使用考马斯亮蓝染色或银染，进而对所纯化蛋白及其可能含有的杂质定量。在某些实施方式中，所得蛋白纯度是至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。

以下实施例意在阐述本发明的实施方式，而不应被理解为对发明范围的限定。

实施例

实施例1多核苷酸的获得

利用PCR[包括重叠PCR(overlapping PCR)]，以表1所列引物扩增编码如下蛋白的多核苷酸：

(a)命名为TAT-Pro的蛋白，其N端包含TAT穿膜肽，其余部分是天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的截短形式。所述蛋白具有如SEQ ID NO：4所示的序列；

(b)命名为TAT-MOD的蛋白，其为TAT-Pro的活性形式，缺失TAT-Pro的内部失活区域。所述蛋白具有如SEQ ID NO：5所示的序列；

(c)命名为TAT-Pro-HIV-MA的蛋白，与TAT-Pro相比，其内部失活区域包含HIV-1蛋白酶的MA/CA酶切位点VSQNY↓PIVQN。所述蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的序列；和

(d)命名为TAT-Pro-HIV-p2的蛋白，与TAT-Pro相比，其内部失活区域包含HIV-1蛋白酶的p2/NC酶切位点TATIM↓MQRGN。所述蛋白具有如SEQ ID NO：3所示的序列。

表1扩增引物

序列号	引物名	引物多核苷酸序列
			SEQ ID NO：6	TAT-Δ5aaMaize RIP-F	5’-GGAATTCCATATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTAAGTTCACTGAAATCTTCCCCGTG-3’
SEQ ID NO：7	Maize-RIP-R	5’-CGGGATCCTCAAGCCGCCGCAGTAGTTTG-3’
			SEQ ID NO：8	HIV-1MA/CA-F	5’-CCTATTGTTCAAAATATGCAGATGCCGGAGGTATCCCAGAACTAC-3’
SEQ ID NO：9	HIV-1MA/CA-R	5’-ATTTTGAACA ATAGGATAATTTTGACTAAC-3’
			SEQ ID NO：10	HIV-1p2/NC-F	5’-CTACTATTATGATGCAACGTGGTAATGCAACAATAATGATGCAGCGAGGAGCGGCTGACCCACAGGCC-3’
SEQ ID NO：11	HIV-1p2/NC-R	5’-ACGTTGCATCATAATAGTAGCGCCGCGCTGCATCATGATGGTGGCCTTCTTCTTCTTCGCCAG-3’

(在“TAT-Δ5aa”中，Δ5aa是缺失序列SEQ ID NO：1中位点2-6的氨基酸)

具体操作如下：

(1)PCR扩增编码蛋白TAT-Pro和TAT-MOD的多核苷酸

PCR反应溶液包括：

1ng编码天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的截短形式的多核苷酸，所述截短形式命名为[Δ1-16，Δ287-300]-Pro-RIP，其中，[Δ1-16，Δ287-300]表示缺失SEQ ID NO：1中位点1-16，287-300的氨基酸(参见Hey，Timothy D et al.Maize ribosome-inactivating protein(b32)：Homologs inrelated species，effects on maize ribosome，and modulation if activity bypro-peptide deletion.(玉米核糖体失活蛋白(b32)：相关品种的同源物，对玉米核糖体的影响和通过删除前肽来调节活性)Plant Physiology，1995 vol.107 1323-1332)，包含所述多核苷酸的载体由北卡罗来纳州立大学R.S.Boston教授提供；或

1ng多核苷酸，所述多核苷酸编码的蛋白与天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体相比，缺失SEQ ID NO：1中位点1-16，163-164，167-189和287-300的氨基酸，并且命名为[Δ1-16，Δ163-164，Δ167-189，Δ287-300]-Pro-RIP(参见Hey，Timothy D et al.Maizeribosome-inactivating protein(b32)：Homologs in related species，effectson maize ribosome，and modulation if activity by pro-peptide deletion.(玉米核糖体失活蛋白(b32)：相关品种的同源物，对玉米核糖体的影响和通过删除前肽来调节活性)Plant Physiology，1995 vol.107 1323-1332)，包含所述多核苷酸的载体由北卡罗来纳州立大学R.S.Boston教授提供；

5×HF缓冲溶液(Finnzymes)；

0.2mM dNTPs；

1μM如SEQ ID NO：6所示的引物和1μM如SEQ ID NO：7所示的引物；和

1个单位的Phusion Taq DNA聚合酶(Finnzymes)。

反应条件：94℃预处理5分钟；随后进行30个循环，循环条件是：94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，1分钟；最后，72℃，10分钟。

用DNA纯化试剂盒Viogene Gel/PCR DNA分离系统(VIOGENE-BIOTEK CORP.，美国)纯化PCR产物。

(2)PCR扩增编码TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2的多核苷酸第一回PCR：

反应溶液包括：

1ng编码[Δ1-16，Δ287-300]-Pro-RIP的多核苷酸；

5×HF缓冲溶液(Finnzymes)；

0.2mM dNTPs；

1μM如SEQ ID Nos：6，7，8，9所示的引物(用于扩增TAT-Pro-HIV-MA)，或

1μM如SEQ ID Nos：6，7，10，11所示的引物(用于扩增TAT-Pro-HIV-p2)；和

1个单位的Phusion Taq DNA聚合酶(Finnzymes)。

用DNA纯化试剂盒Viogene Gel/PCR DNA分离系统(VIOGENE-BIOTEK CORP.，美国)纯化第一回PCR产物。

第二回PCR：

反应溶液包括：

1ng纯化的第一回PCR产物；

5×HF缓冲溶液(Finnzymes)；

0.2mM dNTPs；

1μM如SEQ ID NO：6所示的引物和1μM如SEQ ID NO：7所示的引物；和

1个单位的Phusion Taq DNA聚合酶(Finnzymes)。

用DNA纯化试剂盒Viogene Gel/PCR DNA分离系统(VIOGENE-BIOTEK CORP.，美国)纯化第二回PCR产物。

实施例2表达载体的构建

用NdeI和BamHI(New England Biolabs Inc.，美国)酶切实施例1所得多核苷酸和pET3a载体(Merck KGaA，德国)。酶切后的片段与线性化载体用T4DNA连接酶(New England Biolabs Inc.，美国)连接。

如此，编码TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2的多核苷酸分别被克隆至pET3a。用质粒纯化试剂盒Rapid Plasmid Miniprep System(Marligen Bioscience，德国)纯化所得表达载体。经测序确证。所得表达载体分别命名为TAT-Pro-pET3a、TAT-MOD-pET3a、TAT-Pro-HIV-MA-pET3a和TAT-Pro-HIV-p2-pET3a。

实施例3蛋白表达及纯化

利用CaCl₂热激转化法(参见Joe Sambrook，et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，Cold Spring HarborLaboratory Press；3rd edition(第三版)(January 15，2001))，将TAT-Pro-pET3a、TAT-MOD-pET3a、TAT-Pro-HIV-MA-pET3a和TAT-Pro-HIV-p2-pET3a转化至大肠杆菌菌株C41(E.coli C41)(Novagen)中。

在37℃下，于LB培养基(配方参见Joe Sambrook，et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，Cold Spring HarborLaboratory Press；3rd edition(第三版)(January 15，2001))中，过夜培养转化后的E.coli C41。

取50ml上述培养菌液加入1L的LB培养液(含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃振荡培养至培养液OD 0.6-0.8。

加入0.4mM IPTG，于25℃振荡培养16小时。4℃下，1000rpm离心10分钟，收集菌体。

超声裂解菌体于溶液A(50mM醋酸钠，100mM氯化钠，8M尿素，pH 5.5)。4℃下，20,000rpm离心60分钟，收集上清。

对所收集上清进行阳离子交换层析：用溶液A平衡HiTrap SP FF柱(Amersham，GE HealthCare，美国)，流速为1ml/min，以溶液B(50mM醋酸钠，600-850mM氯化钠，pH 5.5)线性梯度洗脱，洗去杂蛋白，以紫外光监测洗脱过程和收集蛋白。

使用Amicon超滤离心过滤器10K(Milipore，爱尔兰)进行超滤。

对超滤产物进行阳离子交换层析：将超滤后的蛋白溶于溶液C(50mM醋酸钠，100mM氯化钠，4M尿素，pH 5.5)，用溶液C平衡HiTrapSP XL柱(Amersham，GE HealthCare，美国)，流速为1ml/min，以溶液B(50mM醋酸钠，600-850mM氯化钠，pH 5.5)线性梯度洗脱，洗去杂蛋白，以紫外光监测洗脱过程和收集蛋白。

最后，利用脱盐柱去除尿素，流速为4ml/min。

将纯化的TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2置于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10％甘油，pH 7.0，分装保存于-80℃。进行15％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，结果示于图8。利用凝胶分析仪(BIO-RAD)分析染色后的凝胶，纯化后蛋白分别具有大于95％的纯度。

实施例4病毒和病毒感染性滴定

HIV-1实验株HIV-1_IIIB和HIV-1_RF/V82F/I84V可以从NIH AIDS Research& Reference Reagent Program，USA购买。正常T淋巴细胞系C8166细胞可以从ATCC，Manassas，VA，USA购买。

按常规方法(如Dulbecco R(1988)in Virology，eds.Dulbecco R &Ginsberg HS(J.P.Lippincott，Philadelphia)，pp.22-25所述)，培养制备HIV-1病毒。按下述的常规方法滴定获得HIV-1_IIIB、HIV-1_RF/V82F/I84V滴度。所有涉及HIV操作的实验均在生物安全三级(BsL-3)实验室中按照国际和国家有关生物安全操作规程进行。

将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，每孔加入C8166细胞悬液50μl(3×10⁵/ml)，用RPMI-1640(Gibco)将每孔终体积补至200μl。在37℃，5％CO₂下培养。第3天补加新鲜RPMI-1640培养基100μl。第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导细胞病变效应(CPE)，所述效应的存在与否以每孔是否有合胞体形成来确定(Johnson et al.Bronchoalveolar lavage finding inpatients seropositive for the human immunodeficiency virus(HIV)(人类免疫缺陷病毒确诊病人的支气管肺泡灌洗发现)Chest，1990，Vol.97，1066-1071)。

将病毒小量分装于冻存管，-80℃保存。

实施例5细胞毒性实验

将100μl 4×10⁵/ml C8166细胞悬液与不同浓度的蛋白混合，每一浓度设三个重复孔，同时设置不含所述蛋白的对照孔。37℃、5％CO₂下培养细胞72小时。采用MTT比色法(如Mosmann T.Rapid colorimetricassay for cellular growth and survival：Application to proliferation andcytotoxicity assays(用于细胞生长和存活的快速比色测定法：应用于增殖和细胞毒性测定).1983.Journal of Immunological Methods.Vol.65，Issues 1-2 55-63所述)，检测所述蛋白的细胞毒性。测定细胞培养液的OD值，其中，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到IC₅₀值(50％细胞毒性浓度)，即对50％的C8166产生毒性时的蛋白浓度(参见Wang R.R.et al.Anti-HIV activities of compounds isolated from themedicinal plants Rhus chinensis(自药用植物盐肤木分离的化合物的抗HIV活性).2008 Journal of Ethnopharmacology.Vol，117 249-256)。

如上所述，测定并获得TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-p2和TAT-Pro-HIV-MA的细胞毒性，结果如图9所示。

实施例6致细胞病变效应(CPE)的抑制实验

将8×10⁵/ml C8166细胞以50μl/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释蛋白的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的HIV-1_IIIB或HIV-1_RF/V82F/I84V稀释上清，1300TCID₅₀/孔。设三个重复孔，同时设置不含蛋白的正常细胞对照孔，和以齐多夫定(AZT)为药物的阳性对照孔。

在37℃，5％CO₂下培养细胞3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。获得EC₅₀(50％有效浓度)，即抑制合胞体形成50％时的蛋白浓度(参见Wang R.R.et al.Anti-HIV activities of compounds isolatedfrom the medicinal plants Rhus chinensis(自药用植物盐肤木分离的化合物的抗HIV活性).2008 Journal of Ethnopharmacol.Vol，117249-256)。

如上所述，测定TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-p2和TAT-Pro-HIV-MA对HIV-1 CPE的抑制作用，结果如图9至图11所示。

实施例7ELISA方法测定HIV-1 p24抗原

1μg/孔Fc抗体(由昆明动物研究所郑永唐教授提供)4℃铺板过夜；5％脱脂奶粉37℃封板2小时；加入100μl/孔鼠抗p24单克隆抗体(由昆明动物研究所郑永唐教授提供)，37℃，1小时；加入100μl/孔裂解的感染HIV-1的细胞培养上清，37℃，2小时；加入100μl/孔1∶4000稀释的兔抗p24多克隆抗体(由昆明动物研究所郑永唐教授提供)，37℃，1小时；加入100μl/孔1∶3000稀释的羊抗兔IgG-HRP(购自华美生物工程公司，中国)，37℃，1小时；加入OPD底物反应液(由昆明动物研究所郑永唐教授提供)。10分钟后，2M硫酸终止反应。Elx800 ELISA仪(Bio-Tek Instruments，INC，USA)测定OD值，其中，测定波长490nm，参考波长630nm。计算出蛋白对HIV-1复制表达p24抗原的抑制率和EC₅₀，即抑制50％HIV-1p24抗原表达的蛋白浓度(参见Wang R.R.et al.Anti-HIV activities of compounds isolated fromthe medicinal plants Rhus chinensis (自药用植物盐肤木分离的化合物的抗HIV活性).2008 Journal of Ethnopharmacol.Vol，117 249-256)。

如上所述，测定并获得TAT-Pro、TAT-MOD、TAT-Pro-HIV-p2和TAT-Pro-HIV-MA对HIV-1 p24抗原表达的抑制作用，结果如图9至图11所示。

实施例8前体蛋白的活化

在细胞外，孵育TAT-Pro-HIV-p2和TAT-Pro-HIV-MA(100μM)与纯化的HIV-1蛋白酶(由香港中文大学生化系邵鹏柱教授提供)。

如图12A所示，TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2均能被激活，产生由2条多肽组成的活性RIP，其中，所述2条多肽分子量约为11kDa和17kDa。

另外，如图12B所示，在急性HIV-1IIIB感染的C8166细胞，TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2也能被成功激活。

实验证明TAT-Pro-HIV-MA和TAT-Pro-HIV-p2中包含HIV-1蛋白酶酶切序列中的10aa侧翼区，能成功于细胞外和HIV感染的细胞内被HIV-1蛋白酶酶切、活化。

对于本文中引用的参考文献，在此将其全部内容并入本文以成为本说明书的一部分。

上述对本发明的一般性描述和对具体实施方式的描述不应理解为是对本发明技术特征构成的限制。本领域所属技术人员根据本申请的公开，可以在不违背本发明构成要素的前提下，对上述一般性描述和/或具体实施方式(包括实施例)中的技术特征进行增加、减少或任意组合，形成属于本发明的其它的技术方案。

序列表

<110>香港中文大学

中国科学院昆明动物研究所

<120>修饰的玉米核糖体失活蛋白前体及其应用和蛋白纯化方法

<130>09C10712CN

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>267

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>1

Met Lys Phe Thr Glu Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala Asn Tyr Pro Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ile Ala Ser Val Arg Lys Asp Val Ile Lys His Cys Thr

20 25 30

Asp His Lys Gly Ile Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro Glu Lys Lys Val

35 40 45

Pro Glu Leu Trp Leu Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg Thr Ser Ser Ile

50 55 60

Thr Leu Ala Ile Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val Gly Phe Arg Thr

65 70 75 80

Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly Asp Thr His Leu

85 90 95

Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly Arg Tyr Gln Asp

100 105 110

Leu Ile Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met Gly Arg Ala Glu

115 120 125

Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys Lys Met Ala Thr

130 135 140

Leu Glu Glu Glu Glu Val Gln Met Gln Met Gln Met Pro Glu Ala Ala

145 150 155 160

Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser

165 170 175

Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn

180 185 190

Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val

195 200 205

Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile

210 215 220

Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala Val Ile Pro

225 230 235 240

Asp Met Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile

245 250 255

Val Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala

260 265

<210>2

<211>279

<212>PRT

<213>修饰的

<220>

<223>TAT-Pro-HIV-MA

<400>2

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Phe Thr Glu

1 5 10 15

Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asp Val Ile Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile

35 40 45

Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu

50 55 60

Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp

85 90 95

Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro

100 105 110

Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Thr Val Thr Met Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val

130 135 140

Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys Lys Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val

145 150 155 160

Gln Asn Met Gln Met Pro Glu Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln

165 170 175

Asn Ala Ala Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu

180 185 190

Val Val Met Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr

195 200 205

Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr

210 215 220

Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe

225 230 235 240

Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu

245 250 255

Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys

260 265 270

Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala

275

<210>3

<211>279

<212>PRT

<213>修饰的

<220>

<223>TAT-Pro-HIV-p2

<400>3

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Phe Thr Glu

1 5 10 15

Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asp Val Ile Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile

35 40 45

Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu

50 55 60

Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp

85 90 95

Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro

100 105 110

Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Thr Val Thr Met Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val

130 135 140

Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys Lys Thr Ala Thr Ile Met Met Gln Arg

145 150 155 160

Gly Asn Met Gln Met Pro Glu Thr Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly

165 170 175

Asn Ala Ala Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu

180 185 190

Val Val Met Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr

195 200 205

Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr

210 215 220

Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe

225 230 235 240

Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu

245 250 255

Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys

260 265 270

Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala

275

<210>4

<211>279

<212>PRT

<213>修饰的

<220>

<223>TAT-Pro

<400>4

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Phe Thr Glu

1 5 10 15

Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asp Val Ile Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile

35 40 45

Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu

50 55 60

Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp

85 90 95

Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro

100 105 110

Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Thr Val Thr Met Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val

130 135 140

Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu

145 150 155 160

Val Gln Met Gln Met Gln Met Pro Glu Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu

180 185 190

Val Val Met Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr

195 200 205

Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr

210 215 220

Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe

225 230 235 240

Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu

245 250 255

Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys

260 265 270

Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala

275

<210>5

<211>254

<212>PRT

<213>修饰的

<220>

<223>TAT-MOD

<400>5

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Phe Thr Glu

1 5 10 15

Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asp Val Ile Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile

35 40 45

Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu

50 55 60

Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp

85 90 95

Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro

100 105 110

Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Thr Val Thr Met Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val

130 135 140

Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys Lys Met Leu Glu Pro Gln Ala Asp Thr

145 150 155 160

Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly Leu Arg

165 170 175

Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His

180 185 190

Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys Trp Asp

195 200 205

Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala Val

210 215 220

Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala

225 230 235 240

Arg Ile Val Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala

245 250

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TAT-delta5aa Maize RIP-F

<400>6

ggaattccat atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtaagt tcactgaaat 60

cttccccgtg 70

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Maize-RIP-R

<400>7

cgggatcctc aagccgccgc agtagtttg 29

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>HIV-1MA/CA-F

<400>8

cctattgttc aaaatatgca gatgccggag gtatcccaga actac 45

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>HIV-1MA/CA-R

<400>9

attttgaaca ataggataat tttgactaac 30

<210>10

<211>68

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>HIV-1p2/NC-F

<400>10

ctactattat gatgcaacgt ggtaatgcaa caataatgatgcagcgagga gcggctgacc 60

cacaggcc

68

<210>11

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>HIV-1p2/NC-R

<400>11

acgttgcatc ataatagtag cgccgcgctg catcatgatg gtggccttct tcttcttcgc 60

cag 63

Claims

2.如权利要求1所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述修饰的内部失活区域长15-60个氨基酸。

3.如权利要求2所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述修饰的内部失活区域长20-35个氨基酸。

4.如权利要求2所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述修饰的内部失活区域长25个氨基酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒选自逆转录病毒、慢病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、疱疹病毒、人类T淋巴球病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、人类肠病毒。

6.如权利要求5所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，所述病毒选自HIV-1和HIV-2。

7.如权利要求1-6中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是一个或多个。

8.如权利要求7所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是2个。

9.如权利要求1-8中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是一个，并且选自VSQNY↓PIVQN，KARVL↓AEAMS，STAIM↓MQKGN，xxAIM↓MQKSN，TSAIM↓MQRGN，ERQAN↓FLGKI，RPGNF↓LQSRP，ERQAN↓FLREN，ENLAF↓QQGEA，ENLAF↓xQGEA，EDLAF↓LQGKA，TSFSF↓PQITC，xSFxF↓PQITC，VSFNF↓PQVTC，CTLNF↓PISPI，GAETF↓YVDGA，IRKVL↓FLDGI，PDCAW↓LEAQE，xDCAW↓LEAQE 和AACAW↓LEAQE中的任一种HIV-1蛋白酶酶切位点或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

10.如权利要求1-8中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是2个相同的酶切位点，并且选自VSQNY↓PIVQN，KARVL↓AEAMS，STAIM↓MQKGN，xxAIM↓MQKSN，TSAIM↓MQRGN，ERQAN↓FLGKI，RPGNF↓LQSRP，ERQAN↓FLREN，ENLAF↓QQGEA，ENLAF↓xQGEA，EDLAF↓LQGKA，TSFSF↓PQITC，xSFxF↓PQITC，VSFNF↓PQVTC，CTLNF↓PISPI，GAETF↓YVDGA，IRKVL↓FLDGI，PDCAW↓LEAQE，xDCAW↓LEAQE和AACAW↓LEAQE中的任一种HIV-1蛋白酶酶切位点或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任一种。

11.如权利要求1-8中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其中所述病毒蛋白酶酶切位点是2个不同的酶切位点，并且选自VSQNY↓PIVQN，KARVL↓AEAMS，STAIM↓MQKGN，xxAIM↓MQKSN，TSAIM↓MQRGN，ERQAN↓FLGKI，RPGNF↓LQSRP，ERQAN↓FLREN，ENLAF↓QQGEA，ENLAF↓xQGEA，EDLAF↓LQGKA，TSFSF↓PQITC，xSFxF↓PQITC，VSFNF↓PQVTC，CTLNF↓PISPI，GAETF↓YVDGA，IRKVL↓FLDGI，PDCAW↓LEAQE，xDCAW↓LEAQE和AACAW↓LEAQE中的任两种HIV-1蛋白酶酶切位点或选自GGNY↓PVQQ，ARLM↓AEAL，PFAA↓AQKR，PRNF↓PMAQ，GFAA↓PQFS，SLNL↓PIAK，EETY↓YTDG和RQVL↓FLEK中的任两种。

12.如权利要求1-11中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其缺失天然存在的玉米核糖体失活蛋白前体的N端失活区域或C端失活区域，或同时缺失两者。

13.如权利要求1-12中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其N端包含穿膜肽，所述穿膜肽选自以下氨基酸序列：RRRRRRR((Arg)₇)，YGRKKRRQRRR(TAT)，KLALKLALKALKAALKLA(MAP)，RQIKIWFQNRRMKWKK (Peneratin)，LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC)，GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV(MPG)和WILNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan)。

14.如权利要求1-13中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体，其序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

15.多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-14中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体。

16.表达载体，所述表达载体包含与起始载体可操作连接的权利要求15所述的多核苷酸。

17.如权利要求16所述的表达载体，其中所述起始载体选自原核载体、腺病毒系统、腺相关病毒系统、逆病毒载体、慢病毒载体和哺乳动物载体。

18.如权利要求17所述的表达载体，其中所述原核载体为pET系列载体。

19.如权利要求17所述的表达载体，其中所述腺病毒系统选自pAdEasy-1、pShuttle-CMV和pShuttle。

20.如权利要求17所述的表达载体，其中所述腺相关病毒系统选自pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ、pAAV-IRES-hrGFP和pCMV-MCS。

21.如权利要求17所述的表达载体，其中所述逆病毒载体选自pLNCX2、pQCXIH、pMSCVpuro和pLVTH。

22.如权利要求17所述的表达载体，其中所述慢病毒载体选自FUGW、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL、pLVX-DsRed-Monomer-N1、pLP1、pLP2、pLPVSV-G和pVSV-G。

23.如权利要求17所述的表达载体，其中所述哺乳动物载体为pcDNA。

24.药物组合物，包括权利要求1-14中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体或者权利要求16-23中任一项所述的表达载体，还包括药学上可接受的载体。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述病毒是HIV，所述药物组合物进一步包括治疗个体HIV感染的其它药剂。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述治疗个体HIV感染的其它药剂为核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂。

27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)

28.如权利要求1-14中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或如权利要求16-23中任一项所述的表达载体，在制备治疗个体病毒感染的药物中的用途。

29.如权利要求28所述的用途，其中所述病毒感染选自逆转录病毒感染、慢病毒感染、鼻病毒感染、腺病毒感染、冠状病毒感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染、疱疹病毒感染、人类T淋巴球病毒感染、西尼罗病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人类肠道病毒感染。

30.如权利要求29所述的用途，其中所述病毒感染选自HIV-1感染和HIV-2感染。

31.如权利要求1-14中任一项所述的修饰的玉米核糖体失活蛋白前体、或如权利要求16-23中任一项所述的表达载体，以及治疗个体HIV感染的其它药剂在制备治疗个体HIV感染的药物中的用途。

32.如权利要求31所述的用途，其中所述HIV感染选自HIV-1感染和HIV-2感染。

33.如权利要求31或32所述的用途，其中所述治疗个体HIV感染的其它药剂是核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和/或HIV蛋白酶抑制剂。

34.如权利要求33所述的用途，其中所述NRTIs选自拉米夫定(Lamivudine，3TC)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、去羟肌苷(Didanosine，ddI)、扎西他滨(Zalcitabine，d4T)、司坦夫定(Stavudine，d4T)和阿巴卡韦(Abacavir，ABC)，所述HIV蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)和洛匹那韦(lopinavir，LPV)。