ES2296914T3 - Farmacos de serpina para el tratamiento de la infeccion por vih y metodo de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Uso de una ATIII seleccionada del grupo de (a) antitrombina modificada de 43 kDa; (b) R-antitrombina; (c) S-antitrombina que puede obtenerse mediante la unión de heparina a L-antitrombina; (d) antitrombina pre-latente; y (e) una combinación de las mismas, que opcionalmente puede pretratarse mediante el contacto con elastasa, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección viral por un virus seleccionado de entre VIH, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV y CMV.

Description

Fármacos de serpina para el tratamiento de la infección por VIH y método de uso de los mismos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un tratamiento antiviral usando una serpina específica que inhibe la serina proteasa y se une a heparina.

Antecedentes de la invención

Piepkorn M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151: 327-332 (1988); Sudhalter J. et al., Journal of Biological Chemistry, 264: 6892-6897 (1989); Horner A. A., Biochemical Journal, 266: 553-560 (1990) y el documento EP-A 0048898 describen una cromatografía usando heparina y antitrombina III.

Delvos U et al., Thrombosis and Hemostasis, 57: 87-91 (1987), se refiere a la antitrombina III en un estudio comparativo de dos mecanismos anticoagulantes.

El retrovirus humano, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), una enfermedad incurable en la que el sistema inmune del cuerpo se derrumba y deja a la víctima vulnerable frente a infecciones oportunistas, por ejemplo, neumonía y ciertos cánceres, por ejemplo, el sarcoma de Kaposi. El SIDA es un grave problema de salud mundial. El Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre VIH/SIDA (ONUSIDA) estima que actualmente hay en todo el mundo más de 34 millones de personas que viven con el VIH o SIDA, y aproximadamente 28,1 millones de los individuos infectados residen en regiones empobrecidas del África subsahariana. En Estados Unidos, una de cada 250 personas está infectada con el VIH o tiene SIDA. Desde el comienzo de la epidemia, el SIDA ha matado a cerca de 19 millones de personas en todo el mundo, incluyendo a aproximadamente 425.000 estadounidenses. El SIDA ha reemplazado a la malaria y a la tuberculosis como la enfermedad infecciosa en adultos de mayor mortalidad en el mundo y es la cuarta principal causa de muerte en el mundo.

Todavía no existe una cura para el SIDA. Existe, sin embargo un armamento de fármacos antirretrovirales que evitan que se reproduzca el VIH y haga estragos en el sistema inmune del cuerpo. Son fármacos de dicha clase los inhibidores de la transcriptasa inversa, por ejemplo, abacavir, delaviridina, didanosina, efavirenz, lamivudina, nevirapina, estavudina, zalcitabina y zidovudina, que atacan a una enzima del VIH denominada transcriptasa inversa. Otra clase de fármacos son los inhibidores de proteasa, por ejemplo, amprenavir, indinavir, nelfinavir, ritonavir y saquinavir, que inhiben la enzima proteasa del VIH. Introducidos por primera vez en 1995, estos inhibidores de la proteasa se usan ampliamente para el tratamiento de la infección por VIH, solos o junto con otros fármacos antirretrovirales. Actualmente, aproximadamente 251.000 de los 350.000 pacientes estimados que reciben tratamiento para la infección por VIH en estados unidos toman al menos un inhibidor de proteasa.

La terapia de fármacos antirretrovirales altamente activa (HAART) es una terapia anti-VIH muy usada que implica regímenes de triple fármaco que contienen un inhibidor de la proteasa, que pueden suprimir completamente la replicación viral (Stephenson, JAMA, 277: 614-6 (1997)). No obstante, se ha menospreciado la persistencia de VIH latente en el cuerpo. Actualmente, se reconoce que existe un reservorio de VIH en posiblemente de decenas de miles a millones de linfocitos T "de memoria" en reposo de larga vida (CD4), en los que se integra el genoma del VIH dentro del ADN propio de las células (Stephenson, JAMA, 279: 641-2 (1998)). Este conjunto de células infectadas de manera latente se establece probablemente durante la infección primaria.

Con frecuencia dicha terapia de combinación es solamente parcialmente eficaz, y se desconoce cuánta supresión viral es necesaria para conseguir un beneficio virológico, inmunológico y clínico duradero (Deeks, JAMA, 286: 224-6 (2001)). Los fármacos anti-VIH son muy tóxicos y pueden causar graves efectos secundarios, incluyendo lesiones cardiacas, insuficiencia renal y osteoporosis. El uso prolongado de inhibidores de la proteasa se ha relacionado con el desgaste periférico acompañado de depósitos anormales de grasa corporal. Otras manifestaciones de alteraciones metabólicas asociadas con inhibidores de la proteasa incluyen niveles aumentados de triglicéridos y colesterol, pancreatitis, aterosclerosis y resistencia a insulina (Carr et al., LANCET, 351: 1881-3 (1998)). La eficacia de la terapia anti-VIH actual está limitada además por la complejidad de los regímenes, la carga de píldoras y las interacciones fármaco-fármaco. La conformidad con los efectos tóxicos de los fármacos antirretrovirales hacen de la terapia de combinación de por vida una perspectiva difícil y muchos pacientes no pueden tolerar un tratamiento prolongado con HAART. Existe la necesidad urgente de otras terapias antivirales debido a la escasa adhesión a los regímenes de terapia de combinación, que ha conducido a la aparición de cepas de VIH resistentes a fármacos. Otros fármacos pueden mejorar la conformidad mediante una reducción sustancial de la "carga de píldoras" diaria y la simplificación de las complicadas directrices dietéticas asociadas con el uso de inhibidores de la proteasa actuales.

El virus del VIH entra en el cuerpo de un individuo infectado y vive y se replica principalmente en los glóbulos blancos. Por lo tanto, el sello de la infección por VIH, es una disminución de las células denominadas T auxiliares o células CD4 del sistema inmune. El mecanismo molecular de la entrada del VIH en las células implica interacciones específicas entre las glicoproteínas de la envuelta viral (env) y dos proteínas celulares diana, CD4 y un receptor de quimiocinas. El tropismo celular del VIH está determinado por la especificidad de la env por un receptor de quimiocinas en particular (Steinberger et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. 97: 805-10 (2000)). Los virus con tropismo por la línea celular T (T-trópicos) (virus X4) requieren el receptor de quimiocinas CXR4 para su entrada. Los virus con tropismo por macrófagos (M-trópicos) (virus R5) usan CCR5 para su entrada (Berger et al., NATURE, 391: 240 (1998)). El tropismo T está relacionado con diversos aspectos del SIDA, incluyendo la demencia del SIDA, y puede ser importante en la diseminación del virus por todo el cuerpo y servir como reservorio del virus en el
cuerpo.

Las células T CD8^{+} secretan un factor o factores solubles capaces de inhibir las cepas trópicas tanto R5 como X4 del VIH y se piensa que desempeñan un papel crítico in vivo en la defensa antiviral del hospedador (Garizino-Demo et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., 96: 111986-91 (1999)). Estos factores inhibidores incluyen quimiocinas CC (Cocchi et al., SCIENCE, 270: 1811-5 (1995); Horuk et al., J. BIOL. CHEM., 273: 386-91 (1998); Pal et al., SCIENCE, 278: 695-8 (1997)), que se unen al correceptor CCR5 e inhiben la entrada de virus R5 en las células (Garizino-Dermo et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA., 96: 111986-91 (1999), Liu et al., CELL, 86: 367-77 (1996); Samson et al., NATURE, 382: 722-5 (1996); Scarlatti et al., NAT. MED., 3: 1259-65 (1997)), así como el factor o factores solubles peor caracterizados producidos por células T CD8+ y denominados factor o factores antivirales de células T CD8^{+} (en lo sucesivo CAF), capaces de inhibir VIH tanto R5 como X4 (Walter et al., SCIENCE, 234: 1563-6 (1986); Chen et al., AIDS RES. HUM. RETROVIRUSES, 9: 1079-86 (1993); Mackewicz et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., 92: 2308-12 (1995); Mackewicz et al., J. GEN. VIROL., 81 Parte 5: 1261- 4 (2000); Leith et al., AIDS, 11: 575-80 (1997); Le Borgne et al., J. VIROL., 74: 4456-64 (2000); Tomaras et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 97: 3503-8 (2000)). No obstante, estas quimiocinas CC no constituyen toda la actividad antiviral de CAF liberada por estas células, particularmente ya que CAF puede inhibir la replicación de cepas X4 de VIH que usan CXCR4 y no CCR5 como correceptor. La identidad del factor o factores liberados de células T CD8^{+} capaces de inhibir a VIH X4 se desconoce todavía.

Sumario de la invención

La invención proporciona un uso de una antitrombina III específica (ATIII), como se define adicionalmente en la reivindicación 1, así como composiciones que comprenden una serpina sustancialmente purificada que son útiles en métodos para el tratamiento y la prevención de la infección por VIH. Además, la invención proporciona anticuerpos y kits útiles en la detección, tratamiento y prevención de la infección por VIH.

La presente invención proporciona un método para inhibir la infectividad del VIH mediante el contacto de un virión de VIH con una composición, que comprende una preparación sustancialmente purificada de una serpina o un análogo de la misma. La composición se incuba con el virión durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la infectividad del VIH. La serpina es una antitrombina específica (ATIII) y puede pretratarse químicamente o enzimáticamente, por ejemplo, con un pretratamiento con elastasa. La serpina puede ser de origen bovino o de origen humano. En una realización preferida, la serpina, o un análogo de la misma, inhibe la serina proteasa y se une a heparina. En una realización más preferida, se usa una forma modificada de 43 kDa de la antitrombina III (en lo sucesivo, mATIII), de sobrenadantes de células T CD8^{+} activadas, como un factor inhibidor del VIH capaz de inhibir la replicación de VIH tanto R5 como X4. En una realización más preferida, la composición comprende ATIII de 43 kDa (en lo sucesivo, mATIII), R-ATIII, S-ATIII o una combinación de las mismas.

La composición de serpina puede usarse en un método para disminuir la infectividad del VIH, si está presente, en una muestra biológica, mediante el contacto de la muestra biológica, con una cantidad de serpina suficiente para disminuir la infectividad del VIH en la muestra biológica. En una realización preferida, las muestras biológicas se ponen en contacto con la serpina a una concentración de al menos aproximadamente 2 U/ml en el volumen final de muestra biológica. Las muestras biológicas que pueden tratarse por una infección por VIH incluyen, pero sin limitación, sangre, plasma, suero, semen, secreciones cervicales, saliva, orina, leche materna y líquidos amnióticos.

La presente invención proporciona además un sistema de purificación compuesto por una serpina asociada con una superficie en el que la serpina es capaz de inhibir la infectividad del VIH. Se proporciona en la presente invención un método para inhibir la infectividad del VIH en el que se pone en contacto un virión de VIH con una composición, que tiene una superficie que comprende una serpina sustancialmente purificada asociada con la superficie, durante una cantidad de tiempo suficiente para inhibir la infectividad del VIH. En particular, la serpina puede asociarse con una perla, microplaca, columna o matriz. Este y otros objetos de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención que se proporciona a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entenderá adicionalmente a partir de la siguiente descripción con respecto a las figuras, en la que:

La Figura 1 detalla miembros de la superfamilia de proteínas serpina. Esta tabla se modificó a partir de: Irving et al., GENOME RESEARCH 10: 1845-64 (2000).

La Figura 2 detalla los datos analíticos usados para identificar a mATIII como un inhibidor soluble del VIH secretado por células T CD8^{+}. El panel 2A es un cromatograma de HPLC C4 del inhibidor del VIH sustancialmente purificado mATIII. El panel 2B es un gel SDS-PAGE teñido con plata del inhibidor del VIH sustancialmente purificado mATIII. El panel 2C es una tabla de la secuencia proteica parcial del inhibidor del VIH, obtenida mediante la digestión con tripsina en gel de la banda proteica inhibidora del VIH del SDS-PAGE, la elución de los péptidos inhibidores resultantes derivados del VIH y espectrometría de masas en tándem por nano-electropulverización.

La Figura 3 demuestra el efecto antiviral de ATIII bovina purificada sobre el VIH. El panel 3A es un gel SDS-PAGE teñido con plata de R-ATIII (tratada con elastasa porcina; carril 1) y S-ATIII (sin digerir, carril 2) usadas para los ensayos de inhibición del VIH. El panel 3B es un gráfico que compara la actividad inhibidora del VIH de concentraciones variables de R-ATIII y S-ATIII sobre la infectividad de VIH X4 y VIH R5, respectivamente. La inhibición del virus se calculó usando los controles de tampón o los controles enzimáticos.

La Figura 4 es un gráfico que compara el efecto de diferentes formas de ATIII sobre la infectividad de VIH X4, SIV y SHIV. La Figura 4A es un gráfico que compara el efecto del tratamiento de calor (95ºC, 10 min y 60ºC, 30 min de tratamiento) sobre la inhibición de VIH X4 mediada por R-ATIII y S-ATIII, usando elastasa porcina sola como control experimental. También se evaluó la actividad inhibidora de una ATIII pre-latente (60ºC, 24 horas) y de S-ATIII pretratada con proteasa V8. La Figura 4B es un gráfico que compara la actividad inhibidora del VIH de R-ATIII y S-ATIII sobre la infectividad de SIV y SHIV (SIV_{KU-1}). La inhibición del virus se calculó usando los controles de tampón o los controles enzimáticos.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Como se usan en este documento cada uno de los siguientes términos tiene el significado que se asocia con él en esta sección.

El término "serpina", como se usa en este documento, pretende incluir < a un polipéptido de serpina nativo, así como a cualquier fragmento o fragmentos biológicamente activos o un análogo o análogos de los mismos. Los términos "fragmento" y "análogo" se usan indistintamente en este documento para describir serpinas útiles en los métodos de la presente invención.

La expresión "sustancialmente puro", como se usa en este documento, describe a un compuesto, por ejemplo, una proteína o polipéptido, que se ha separado de los componentes que lo acompañan habitualmente. Típicamente, el compuesto es sustancialmente puro cuando al menos el 10%, más preferiblemente al menos el 20%, más preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente al menos el 99% del material total (en volumen, en peso húmedo o seco o en porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo, en el caso de polipéptidos mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel o análisis de HPLC. Un compuesto, por ejemplo, una proteína está también sustancialmente purificado cuando está esencialmente libre de los componentes naturalmente asociados o cuando está separado de los contaminantes nativos que lo acompañan en su estado natural. Se incluye dentro del significado de la expresión "sustancialmente puro", como se usa en este documento, un compuesto, tal como una proteína o polipéptido, que es homogéneamente puro, por ejemplo, en el que al menos el 95% de la proteína total (en volumen, en peso húmedo o seco o en porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es la proteína o polipéptido de interés.

Las expresiones "unión específica" o "se une específicamente a", como se usan en este documento, se refieren a una proteína, tal como un anticuerpo, que reconoce y se une a una serpina, por ejemplo ATIII, o a un ligando de la misma, pero que no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a una composición química con la que puede combinarse el ingrediente activo y que, después de la combinación, puede usarse para administrar el ingrediente activo a un sujeto.

La expresión éster o sal "fisiológicamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a una forma de éster o de sal del ingrediente activo que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica, y que no es perjudicial para el sujeto al que se va a administrar la composición.

El término de líquido "oleoso", como se usa en este documento, es uno que comprende una molécula líquida que contiene carbono y que presenta un carácter menos polar que el agua.

La expresión "ingredientes adicionales", como se usa en este documento, incluye, pero sin limitación, a uno o más de los siguientes: excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos, agentes de suspensión; agentes dispersantes o humectantes; agentes emulsionantes, demulcentes; tampones, sales; agentes espesantes; cargas; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Genaro, ed., 1985, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa., que se incorpora en este documento como referencia.

Una "unidad" de actividad enzimática de ATIII, como se usa en este documento, es la actividad presente en 0,1 ml de plasma combinado humano normal analizado en presencia de 0,1 unidades de heparina (Damus y Rosenberg, METH. ENZYMOL., 45: 653 (1976); PORTEOLYTIC ENZYMES: A PRACTICAL APPROACH, eds. Beynon y Bond, pág. 247 (1989)). Una "unidad" de actividad enzimática de serpina, como se usa en este documento, se entiende que representa la medida convencional de la actividad de serpina, como se define en la técnica.

El termino "transformación", como se usa en este documento, se refiere a introducir ADN en una célula hospedadora adecuada, de tal modo que el ADN pueda replicarse, ya sea como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.

El término "transfección", como se usa en este documento, se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula hospedadora adecuada, independientemente de si se expresa o no realmente alguna secuencia codificante.

El término "infección", como se usa en este documento, se refiere a la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora adecuada mediante el uso de un virus o vector viral.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo específico o a un antígeno.

I. Inhibidores del VIH de la presente invención

La presente invención identifica la actividad antirretroviral de serpinas (Figura 1). La invención también incluye métodos para el tratamiento y la prevención de una infección por VIH, que comprende poner en contacto una composición de la invención con un paciente humano, o tratar una infección por VIH mediante la introducción en una célula susceptible a la infección por VIH una molécula de ADN que codifica una serpina. Además, la invención incluye anticuerpos y kits útiles en la detección, tratamiento y prevención de la infección por VIH.

Las serpinas constituyen una superfamilia de proteínas relacionadas estructuralmente que se encuentran en eucariotas, incluyendo seres humanos (Wright, BIOASSAYS, 18: 453-64 (1996); Skinner et al., J. MOL. BIOL., 283: 9-14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449-55 (1999); Interpro Nº IPR000215). Las serpinas son inhibidores de la serina proteasa extraordinariamente largos, por ejemplo, ATIII, inhibidor de la proteína C, proteína C activada, inhibidor del activador del plasminógeno y antitripsina alfa 1. En una base molar, las serpinas inhibidoras comprenden aproximadamente el 10 por ciento de las proteínas en suero humano.

Aunque los Ejemplos Experimentales que se presentan en este documento se refieren a antitrombina (en lo sucesivo, ATIII), se contempla que las presente invención incluya a otras serpinas, como se resume en la Figura 1, o a un fragmento o fragmentos peptídicos derivados de las mismas o a un análogo o análogos de las mismas. En una realización preferida, la serpina se une a heparina e inhibe tanto a la serina proteasa como al VIH. El término "serpina" incluye a serpinas de origen natural, así como a serpinas sintéticas o recombinantes. Además, el término "serpina" incluye variantes alélicas, variantes de especie y variantes por sustitución conservativa de aminoácidos. El término también incluye a serpinas de longitud completa, así como a fragmentos de serpina. Se entenderá, por lo tanto, que fragmentos de variantes de serpinas, en cantidades que proporcionen una actividad biológica equivalente a la de serpinas de longitud completa, pueden usarse en los métodos de la invención si se desea. Los fragmentos de serpina incorporan al menos los restos aminoacídicos de serpinas necesarios para una actividad biológica similar a la de la serpina intacta. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen las serpinas que se presentan en la Figura 1.

El término "serpina" también incluye variantes y análogos funcionales de serpinas que tienen una secuencia de aminoácidos homóloga a la de una serpina. La presente invención incluye, por lo tanto, formulaciones farmacéuticas que comprenden dichas variantes y análogos funcionales de serpina, que llevan modificaciones como sustituciones, deleciones, inserciones o ciclaciones, pero que, no obstante, tienen sustancialmente las actividades biológicas de las serpinas.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "secuencia homóloga de aminoácidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos que se diferencia en una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, o en una o más sustituciones no conservativas de aminoácidos, deleciones o adiciones localizadas en posiciones en las que no se destruyen las actividades biológicas del polipéptido. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen, típicamente, sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen por ejemplo (a) aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina; (b) aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; (c) aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y (d) aminoácidos que tienen cadenas laterales apolares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína. Preferiblemente, dicha secuencia tiene al menos el 75%, preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 85%, más preferiblemente el 90% y más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de la serpina de referencia.

La estructura de la serpina está tipificada por un plegamiento multidominio que contiene un haz de hélices y un sándwich, y una región reactiva C-terminal bien definida que actúa como "cebo" para una serina proteasa apropiada. Muchas serpinas tienen un alto peso molecular (de 400 a 500 aminoácidos) y son inhibidores extracelulares irreversibles de serina proteasas, implicando el mecanismo de inhibición cambios conformacionales drásticos (Skinner et al., J. MOL. BIOL. 283: 9-14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449-55 (1999)). Los cambios estructurales terciarios significativos pueden implicar la inserción del bucle peptídico del centro reactivo en un hueco de una hoja \beta principal, que forma una nueva hebra (Stein y Carrel, NATURE STRUCT. BIOL., 2: 96-113 (1995); Sharp et al., STRUCTURE, 7: 111-8 (1999)). Basándose en grandes similitudes de secuencia, se dice que varias proteínas, por ejemplo, angiotensinógeno, globulina de unión a tiroxina y globulina de unión a corticosteroides, sin actividad inhibidora conocida, pertenecen a esta familia (Stein y Carrell, NATURE STRUCT. BIOL., 2: 96-113 (1995)).

De entre las serpinas, la ATIII es una glicoproteína presente en el plasma sanguíneo con un papel bien definido en la coagulación sanguínea. Específicamente, ATIII es un potente inhibidor de las reacciones de la cascada de coagulación, con un peso molecular aparente de entre 54 kDa y 65 kDa (Rosenberg y Damus, J. BIOL. CHEM., 248: 6490-505 (1973); Nordenman et al., EUR. J. BIOCHEM., 78: 195-204 (1977); Kurachi et al., BIOCHEMISTRY, 15: 373-7 (1976)) del cual aproximadamente el diez por ciento lo aportan cuatro cadenas de carbohidratos basados en glucosamina (Kurachi et al., BIOCHEMISTRY, 15: 373-7 (1976); Petersen et al., IN THE PHYSIOLOGICAL INHIBITORS OF COAGULATION AND FIBRINOLYSIS, (Collen, Winman y Verstraete, eds.) Elsevier, Amsterdam, pág. 48 (1979)). Aunque el nombre de ATIII implica que funciona únicamente sobre la trombina, en realidad sirve para inhibir prácticamente todas las enzimas de la coagulación, al menos en cierto grado. Las enzimas principales que inhibe son el factor Xa, el factor IXa y la trombina (factor IIa). También tiene acciones inhibidoras sobre el factor XIIa, el factor XIa y el complejo del factor VIIa y el factor tisular, pero no sobre el factor VIIa ni la proteína C activada. La ATIII también inhibe la tripsina, la plasmina y la calicreína (Charlotte y Church, SEMINARS IN HEMATOLOGY, 28: 3-9 (1995). Su capacidad para limitar la coagulación a través de múltiples interacciones la convierte en una de las principales proteínas anticoagulantes naturales.

La ATIII sola actúa como un inhibidor relativamente ineficaz. Sin embargo, la ATIII puede activarse mediante un mecanismo de molde sencillo o mediante un cambio conformacional alostérico provocado por la unión a heparina (Skinner et al., J. MOL. BIOL., 283: 9-14 (1998); Huntington et al., J. MOL. BIOL., 293: 449-55 (1999); Belar et al., J. BIOL. CHEM., 275: 8733-41 (2000)). Cuando la ATIII se une a heparina, se acelera enormemente la velocidad con la que se produce la reacción que causa la inhibición; esto convierte al complejo ATIII-heparina en un componente esencial de la coagulación. Esta interacción también constituye la base del uso de heparina y de heparinas de bajo peso molecular como medicamentos para producir anticoagulación.

Existe un conjunto creciente de indicios de que la ATIII tiene una actividad biológica adicional aparte de su capacidad para inhibir la trombina. Por ejemplo, se ha demostrado la presencia de ATIII como una fracción antiinflamatoria en sepsis (Souter et al, CRIT. CARE MED., 29: 134-9 (2001)), como un factor antiangiogénesis en el crecimiento de tumores (O'Reilly et al., SCIENCE., 285: 1926-8 (1999)), y es quimiotáxica para neutrófilos a través del receptor sindecano-4 (Dunzendorfer et al., BLOOD, 97: 1079-85 (2001); Kaneider et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 287: 42-6 (2001). El mecanismo de acción aún no está completamente claro.

A. Purificación e identificación de mATIII

Las células T CD8^{+} activadas producen al menos dos factores capaces de inhibir la cepa X4 del VIH_{IIIB} (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306-16 (2001)). Estos factores se diferencian por su tamaño y por su capacidad para unirse a heparina. Uno de estos factores se une a heparina a concentración salina fisiológica, se eluye de una columna de purificación a NaCl 350 mM y queda retenida en un filtro de separación Centricon de 50 kDa. El otro factor no se une a heparina a concentración salina fisiológica y pasa a través de un filtro de separación Centricon de 50 kDa. La actividad inhibidora del VIH de estos factores es mayor con una masa de células T CD8^{+} de individuos seropositivos y de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del VIH, en comparación con una masa de células T CD 8^{+} de individuos VIH seronegativos (Geiben-Lynn et al., J. VIROL. 75: 8306-16 (2001)).

Se usó un ensayo de inhibición de VIH X4 (Geiben-Lynn et al., J. VIROL. 75: 8306-16 (2001); Shapiro et al., FASEB J., 15: 115-22 (2001)) para purificar la actividad inhibidora que se encuentra en la fracción unida a heparina del sobrenadante de células T CD8^{+} activadas (Geiben-Lynn et al., J. VIROL. 75: 8306-16 (2001)). La actividad inhibidora del VIH se purificó hasta una homogeneidad aparente, medida mediante tinción de plata de SDS-PAGE y HPLC C4 (Van Patten et al., J. BIOL. CHEM. 274: 10268-76 (1999)), usando cromatografía de exclusión por tamaños de heparina-sefarosa y Superdex-200 (Figura 2A). El factor inhibidor del VIH se identificó como una proteína de tipo ATIII de 43 kDa (mATIII; Figura 2B) mediante HPLC de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem por nano-electropulverización (\muLC/MS/MS) en un espectrómetro de masas cuadrupolar de trampa de iones Finnigan LCQ (Figura 2C).

B. Caracterización de las propiedades antirretrovirales de las formas de ATIII

La caracterización analítica de una CAF (compárese con la Figura 2) demostró que las células T CD8^{+} activadas modifican ATIII a mATIII, una forma con una capacidad potenciada para inhibir la infectividad del VIH. Por lo tanto, la actividad antirretroviral in vitro de las formas de ATIII se midió y se comparó (Figura 3 y 4). En condiciones fisiológicas, la ATIII existe en diferentes formas. En su configuración más abundante, la ATIII circula en una forma quiescente, la forma L, en la que su bucle reactivo COOH-terminal no está completamente expuesto y no se puede unir a proteínas diana. Cuando está unida a heparina, una conformación más sometida a tensión, se induce la forma S de la molécula: el bucle reactivo se expone y la afinidad de unión a trombina se aumenta en un factor de 100. Después, el complejo trombina-ATIII se disocia lentamente y el bucle reactivo de ATIII se escinde mediante la trombina liberada. La ATIII escindida está constituida por cadenas A y B unidas por puentes disulfuro y no se une a proteasas diana. Además, esta escisión induce un cambio conformacional a una conformación más relajada, la forma R, en la que el bucle reactivo se inserta irreversiblemente en una hoja beta A (Schreuder et al., NAT. STRUCT. BIOL., 1: 48-54 (1994)).

Se describió una forma R-ATIII como un factor antiangiogénico capaz de inhibir el crecimiento de tumores. Esta forma de ATIII está escindida entre Ser^{386} y Thr^{387}, y puede generarse mediante la digestión con elastasa porcina (O'Reilly et al., SCIENCE, 285: 1926-8 (1999)). Otras enzimas que pueden escindir la ATIII y producir formas R-ATIII son la trombina (Arg^{394}-Ser^{395}), la elastasa pancreática (Val^{388}-Iso^{389}) y la elastasa de neutrófilos humanos (Iso^{391}-Ala^{392}) (Evans et al., BIOCHEMISTRY, 31: 12629-42 (1992); Mourey et al., J. MOL. BIOL., 232: 223-41 (1993)). Una ATIII pre-latente, en la que todavía se conserva la actividad de ATIII y se mantiene la capacidad de unión a heparina, puede producirse mediante la incubación de S-ATIII a 60ºC durante 24 h en condiciones salinas fisiológicas (Larsson et al., J. BIOL. CHEM., 276: 11996-2002 (2001)).

Para determinar qué forma o formas de ATIII son capaces de inhibir la infectividad retroviral, se produjeron R-ATIII, ATIII pre-latente y L-ATIII a partir de una S-ATIII disponible en el mercado (S-ATIII purificada de suero bovino; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, Estados Unidos; 0,2-0,4 U/\mug)). Se obtuvo R-ATIII mediante la incubación de esta S-ATIII (200 \mug/ml) a 37ºC en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 150 mM y elastasa pancreática porcina 2,5 U/ml (Calbiochem-Novabiochem Corporation, San Diego, CA, Estados Unidos; Nº de pedido 324682). Se obtuvo una conversión esencialmente completa de S-ATIII a R-ATIII en estas condiciones de digestión (Figura 3A; O'Reilly et al., SCIENCE, 285: 1926-8 (1999)). En estudios seleccionados, la S-ATIII se digirió en PBS usando un V-8 Protease Kit inmovilizado (PIERCE) durante 1 hora a 4ºC, de acuerdo con el procedimiento del fabricante.

El HTLV-IIIB X4 (en lo sucesivo, VIH X4; Chang et al., NATURE, 363: 466-9 (1993)), una cepa T-trópica prototípica del VIH (Colección Americana de Tejidos Tipo, Monassass, VA, Estados Unidos; ATCC Nº CRL-8543), se usó para evaluar el efecto de ATIII sobre la infección por VIH T-trópico. La cantidad de virus en un volumen de suspensión determinado (por ejemplo, 0,1 ml) que infectará el 50% de un número (n) de pocillos de una microplaca de cultivo celular, o de tubos, se denomina dosis infecciosa en cultivo de tejidos 50 [DICT_{50}]. La DICT_{50} se usa como una alternativa a la determinación del título de virus mediante recuento de placas (que proporciona valores de PFU o unidades formadoras de placas). Karber, 1931.

Se infectaron de forma aguda células linfoblastoides T humanas (células H9) que expresan proteínas de antígeno leucocitario humano (HLA) B6, Bw62 y Cw3, con VIH X4 a una MOI de 1 x 10^{-2} DICT_{50} por mililitro. Las células H9 infectadas se resuspendieron a 5 x 10^{5} células/ml en medio de cultivo celular R20. Se pipetearon 2 ml de esta suspensión en cada pocillo de una placa de microtitulación de 24 pocillos.

Se infectaron de forma aguda células de tipo macrófago PM1 con VIH_{JR-CSF} R5 (en lo sucesivo, VIH R5; Koyanagi, et al., SCIENCE, 236: 819-22 (1987)) para investigar la capacidad de ATIII de afectar a la infección por VIH monocitotrópico. El aislado VIH R5, JR-CSF se obtuvo originariamente a partir del líquido cefalorraquídeo de un individuo infectado por VIH, en la autopsia. Esta cepa demuestra propiedades características de aislados primarios de VIH, por ejemplo, se replica eficazmente en células sanguíneas primarias pero no en líneas celulares. Es decir, JR-CSF presenta propiedades más características de aislados clínicos de VIH obtenidos directamente del paciente de VIH. Actualmente es una cepa patrón de referencia que representa a cepas de VIH con tropismo por macrófagos. Las células PM1 se infectaron de forma aguda con VIH_{IIB} a una MOI de 1 x 10^{-2} DICT_{50} por mililitro.

El virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV) pertenece a la familia Retroviridae (subfamilia Lentivirinae) y está estrechamente relacionado con los tipos 1 y 2 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2), los agentes etiológicos del SIDA. Originariamente descritos en 1985, el primer aislado de un macaco rhesus se denominó virus III T-linfotrópico de los simios (STLV-III). La cepa viral SIV mac239 (en lo sucesivo, SIV_{239}; P. Johnson, Harvard Medical School, Boston, MA, Estados Unidos), usada en estos estudios, es un virus infeccioso de doble tropismo que induce SIDA en monos macacos rhesus.

El SHIV_{KU-1} (Narayan y Joag, AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIADS, Bethesda, MD, Estados Unidos) es una segunda cepa de SIV con doble tropismo usada en estos estudios. SHIV_{KU-1} es una suspensión biológicamente pura de SHIV que es altamente patógena en macacos cola de cerdo. El virus se derivó mediante pases secuenciales de la construcción molecular del SIV(mac)239XHIV-1-HxB2 en médula ósea de monos macacos cola de cerdo (Joag et al., J. VIROLOGY, 70: 3189-3197 (1996)).

El tropismo celular del SIV en cultivo depende parcialmente de la cepa de virus que se propaga y de las condiciones del cultivo celular. En los presentes estudios, se infectaron de forma aguda células SEM-174 de línea celular T de macaco con SIV_{239} o con SHIV_{KU-1} a una MOI de 1 x 10^{-2} de TCDI_{50} por mililitro.

Como se muestra en la Figura 3B, la R-ATIII inhibió el virus X4 con la mitad de la inhibición máxima (DI_{50}) a aproximadamente 25 \mug/ml. La S-ATIII fue más potente que la R-ATIII y presentó, con una DI_{50} a 10 \mug/ml (\sim 3 U/ml), una actividad comparable a la de la forma de ATIII modificada por células T CD8^{+} (Fig. 3B). Ésta es similar a la DI_{50} (5,5 \mug/ml) que se midió para la mATIII, y con 130 nM similar a la observada para el factor derivado del estroma (SDF-1), el único ligando de origen natural que se ha encontrado que se une al correceptor CXCR4 (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75, 8306-16 (2001)).

Como se muestra en la Figura 4, la actividad antiviral mediada por S-ATIII y R-ATIII resistió al tratamiento de inactivación por calor, así como la ATIII pre-latente inhibió la infectividad del VIH X4 (Figura 4A). La actividad antirretroviral mediada por ATIII no se debió a citotoxicidad ya que el tratamiento con ATIII no afecta a la viabilidad celular ni al crecimiento celular, a juzgar por la exclusión de colorante azul tripán (no se muestran los datos). A una concentración de 50 \mug/ml (15 U/ml), la S-ATIII inhibió la infectividad de SIV y HSIV en el 92 y 91%, respectivamente (Figura 4B). La R-ATIII inhibió las cepas retrovirales de simios en un grado menor, con el 36 y el 57% de supresión de la proteína del núcleo del SIV (p27), respectivamente (Figura 4B).

Esta proteína purificada tenía un tamaño molecular similar, pero no era el mismo que el de un factor antiviral de células T CD8^{+} descrito anteriormente, CAF (Levy et al., IMMUNOL. TODAY, 17: 217-24 (1996)). Es decir, la proteína de tipo ATIII purificada de la presente invención es similar en tamaño a CAF y por su capacidad para inhibir virus X4, pero diferente respecto a su estabilidad al calor (Geiben-Lynn et al., J. VIROL; 75; 8306-16 (2001)). No obstante, el CAF no se ha definido a nivel molecular y sólo se ha analizado como sobrenadante no fraccionado. La actividad anti-
VIH del CAF puede reflejar múltiples factores implicados con diferentes puntos de inhibición en el ciclo vital del VIH.

La ATIII de células T CD8^{+} purificada es una forma molecularmente diferente de ATIII. La ATIII nativa no modificada tiene un peso molecular de 54-65 kDa, mientras que la forma de ATIII purificada de células T CD8^{+} tenía un tamaño de 43 kDa, a juzgar por el análisis de SDS-PAGE. La ATIII de células T CD8^{+} purificada es más pequeña que la S-ATIII y se eluye de una columna de heparina-sefarosa a una concentración salina menor (NaCl 350 mM frente a NaCl 1 M). La ATIII de células T CD8^{+} purificada también es más pequeña que la R-ATIII y no se disocia en las condiciones reductoras usadas en el SDS-PAGE. Por último, la ATIII purificada de células T CD8^{+} y la ATIII pre-latente presentaban una potencia anti-VIH similar in vitro, pero se diferenciaban por su peso molecular.

En las condiciones de pretratamiento enzimático, la proteasa V8 digiere preferiblemente el dominio de unión a heparina de ATIII. Por consiguiente, la falta de actividad anti-retroviral en una preparación de ATIII pretratada con proteasa V8 sugiere que el dominio de unión a heparina de ATIII es importante para la actividad antiviral (Figura 4A). Se ha demostrado que la ATIII se une a la familia de proteoglicanos de los sindecanos, que pueden mediar en estas actividades biológicas. A este respecto, VIH, SIV y SHIV requieren sindecanos para la adhesión, que facilitan la entrada de VIH/SIV en las células (Valenzuela-Fernandez et al., J. BIOL. CHEM., 276: 26550-8 (2001); Saphire et al., J. VIROL., 75; 9187-200 (2001)). La ATIII parece interactuar con el dominio de unión a sindecano del VIH y parece que la ATIII inhibe la entrada del VIH en las células, que puede ser sinérgica con otras rutas. De este modo, la ATIII y otros inhibidores de la serina proteasa ofrecen el potencial de una eficacia mejorada y una toxicidad disminuida en el tratamiento del VIH y otras enfermedades virales.

II. Uso de la presente invención para el tratamiento, prevención y detección de una infección retroviral

La invención incluye el uso de una composición que comprende ATIII sustancialmente purificada. La ATIIII es capaz de inhibir la infectividad del VIH, como se ha descrito anteriormente y, por lo tanto, es útil en métodos para la prevención de la infección por VIH en un paciente o para inhibir la infectividad de fluidos corporales que contienen VIH. La ATIII a usar en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que se haya purificado en un grado tal que pueda usarse como un agente farmacéutico. Por ejemplo, puede purificarse a partir de sangre completa, plasma sanguíneo, suero o suero obtenido por compresión de sangre coagulada. El material de partida para la preparación de ATIII puede ser, por ejemplo, la fracción IV-1 o IV, o el sobrenadante I o II + III obtenido por fraccionamiento de Cohn del plasma sanguíneo. La ATIII puede preparase también mediante, por ejemplo, E. coli, cultivo celular (por ejemplo, el documento EP-339919 de Isahiko et al.), ingeniería genética (por ejemplo, el documento EP-90505 de Botsuku y Roon), animales transgénicos (Larrik y Thomas, CURR. OPIN. BIOTECHNOL. 12: 41111-41118 (2001); Edmunds et al., BLOOD 12: 4561-4571 (1998)) y similares. Como alternativa, puede usarse una preparación de ATIII disponible en el mercado.

Las composiciones que comprenden ATIII sustancialmente purificada pueden incluir ATIII sola o junto con otras proteínas. La ATIII puede purificarse sustancialmente por cualquiera de los métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Puede purificarse proteína sustancialmente pura siguiendo procedimientos conocidos para purificación de proteínas, en los que se usa un ensayo inmunológico, cromatográfico, enzimático o de otro tipo para controlar la purificación en cada etapa del procedimiento. Los métodos de purificación de proteínas se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Deutscher et al., GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego (1990). La ATIII puede purificarse por un método descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 3.842.061 de Anderson et al. y en la Patente de Estados Unidos Nº 4.340.589 de Uemura et al.

En una realización, la ATIII de la invención es un componente de una composición farmacéutica, que también puede comprender tampones, sales, otras proteínas y otros ingredientes aceptables como composición farmacéutica. La invención también incluye una forma modificada de la ATIII que es capaz de contactar con el VIH y de inhibir la infectividad del VIH, como se describe en este documento. La ATIII modificada puede usarse como un componente de una composición para su uso en un método para la prevención de la infección por VIH en un paciente o en la inhibición de la infectividad del VIH en fluidos biológicos.

La ATIII de la invención puede ser una molécula que comprende la proteína sola o puede incluir otros componentes, tales como proteínas u otros carbohidratos, u otra molécula que puede estar covalentemente unida a la ATIII o que pueda estar asociada no covalentemente con la ATIII.

La ATIII de la invención puede generase mediante digestión enzimática o tratamiento químico de la proteína completa de ATIII. Los métodos de tratamiento químico pueden incluir, por ejemplo, la digestión usando hidrólisis con ácido débil, tratamiento con guanidina 0,9 M (Carrell et al., NATURE, 353: 576-8 (1991)) o la incubación de S-ATIII en citrato trisódico 0,25 mM a 60ºC durante 18 horas (Wardell et al., BIOCHEMISTRY, 36: 13133-42 (1997)). Los métodos de digestión enzimática pueden incluir, por ejemplo, la digestión usando una elastasa u otra proteasa. Los métodos de digestión enzimática pueden incluir también, por ejemplo, la digestión usando una exoglicosidasa específica (por ejemplo, neuraminidasa, manosidasa y fucosidasa) o una endoglicosidasa específica (por ejemplo, N-glicanasa y O-glicanasa).

En otra realización, la ATIII de la invención puede prepararse mediante el uso de un método de síntesis bioquímica. Los métodos bioquímicos para sintetizar proteínas son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

La capacidad de contactar con un virión de VIH puede evaluarse mediante el uso de ensayos descritos en este documento en la sección de Ejemplos. Por ejemplo, el virus puede incubarse con la molécula que comprende una ATIII de la invención, ponerse sobre un colchón de sacarosa y centrifugarse. El sedimento de virus obtenido se resuspende, se concentra con ácido tricloroacético (TCA) para concentrar las proteínas y se analizan alícuotas del sedimento y del sobrenadante mediante transferencia de Western, usando anticuerpos contra p24 (Nagashurmugam y Friedman, DNA CELL BIOL. 15: 353-61 (1996)) o mediante un método de ELISA.

En otra realización más, la molécula que comprende la ATIII de la invención es capaz de inhibir la infectividad del VIH en un paciente mediante el contacto con un virión de VIH. La molécula que comprende la ATIII de la invención se incluye como un componente en una composición farmacéutica que puede administrase a un paciente para inhibir la infectividad del VIH o para evitar la infección por VIH. La inhibición de la infectividad del VIH por la molécula que comprende la ATIII de la invención puede evaluarse como se describe en este documento. Dichos métodos pueden incluir el ensayo de p24, el ensayo de actividad de transcriptasa inversa o la DICT_{50}.

La invención también incluye un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a ATIII. El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, o puede ser un anticuerpo sintético, humanizado o de presentación de fagos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas obtenidas a partir de fuentes naturales o a partir de fuentes recombinantes, y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos de la presente invención pueden existir en una diversidad de formas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)_{2}, así como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1988, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N. Y.; Houston et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. 85: 5879-93(1988); Bird et al., SCIENCE, 242: 423-6 (1988)). La expresión "anticuerpo sintético", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que se genera mediante el uso de tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago, como se describe en este documento. Debe interpretarse que la expresión también que se refiere a un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo, en la que la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o de una secuencia de aminoácidos que determina el anticuerpo, en la que la secuencia de ADN o de aminoácidos se han obtenido mediante el uso de
tecnología de secuencia de ADN o de aminoácidos sintética, que está disponible y se conoce bien en la técnica.

La invención también incluye un kit para la detección de una proteína que inhibe la infectividad del VIH. Las proteínas incluyen a ATIII. El kit de la invención puede ser, por ejemplo, un kit de ELISA que incluye un anticuerpo, un reactivo de detección y una superficie de reacción. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de la invención que se une específicamente con ATIII. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de anticuerpo descrito en este documento y puede generase mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en este documento. La superficie de reacción puede ser una placa de microtitulación, tal como una placa de ELISA. El reactivo de detección puede ser cualquier reactivo de detección conocido por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, el reactivo de detección puede ser una enzima o un radionucleótido. En una realización, el kit de la invención es un kit de ELISA para la detección de la presencia de ATIII en un fluido corporal tal como suero de un paciente humano.

El kit puede incluir una placa de micropocillos, un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a cualquier ATIII, y una enzima secundaria capaz de unirse al anticuerpo de la invención y también a peroxidasa de rábano rusticano. El kit de ELISA de la invención puede usarse, por ejemplo, para realizar un ensayo de ELISA de un fluido corporal de un paciente, tal como una muestra de suero. El ensayo puede usarse para detectar y cuantificar los niveles de ATIII presentes en el suero del paciente. La cantidad de ATIII en el suero del paciente puede correlacionarse con la capacidad del suero del paciente de inhibir la infectividad del VIH.

En otra realización, el kit de la invención es un kit de transferencia de Western o de transferencia puntual para la detección de la presencia de ATIII en un fluido corporal, tal como suero de un paciente humano.

Los kits de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, para evaluar la susceptibilidad de un paciente a la infección por VIH. Los pacientes con una elevada susceptibilidad a la infección por VIH debido a bajos niveles de ATIII pueden tratarse con una de las composiciones farmacéuticas de la invención para potenciar la resistencia de estos individuos a la infección por VIH. La correlación entre los niveles de ATIII y la capacidad de un paciente de inhibir la infectividad del VIH se establece mediante el uso de los procedimientos descritos en los Ejemplos Experimentales que se presentan en este documento.

La invención también incluye un método para inhibir la infectividad del VIH en fluidos corporales o en secreciones orales infectivas. El método es útil en la prevención de la infección por VIH o en la inhibición de la infectividad del VIH. Este método puede usarse, por ejemplo, para inhibir la infectividad de fluidos biológicos, por ejemplo, en una instalación hospitalaria en la que el personal médico está expuesto a secreciones infecciosas de VIH.

En una realización, el método comprende poner en contacto un virión de VIH con las composiciones de ATIII humana descritas en este documento. En una realización, la composición de ATIII puede comprender ATIII sustancialmente purificada. La muestra de un paciente que contiene el virión de VIH puede obtenerse de cualquier muestra de fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero, semen, secreciones cervicales, saliva, orina, leche materna o líquidos amnióticos. En una realización, una composición que comprende ATIII sustancialmente purificada se pone en contacto con un virión de VIH de una muestra de un paciente durante un periodo de tiempo suficiente para que la ATIII inhiba la infectividad del VIH. La inhibición de la infectividad del VIH puede evaluarse como se describe en este documento en los Ejemplos.

En otra realización, el método para inhibir la infectividad del VIH comprende poner en contacto un virión de VIH, obtenido de una muestra de fluido corporal de un paciente, con una composición que tiene una superficie que contiene una ATIII humana sustancialmente purificada asociada con dicha superficie. Los ejemplos de dicha superficie incluyen plástico u otras superficies de polímeros, que son inertes a la reacción con fluidos corporales y que se consideran biocompatibles. En una realización del método de la invención, la composición que tiene ATIII humana sustancialmente purificada asociada con la superficie se pone en contacto con un fluido corporal de un paciente o con una secreción oral infectiva que contiene un virión de VIH. La composición se pone en contacto o se incuba con la muestra de fluido corporal que contiene el virión de VIH durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la infectividad del VIH. La inhibición de la infectividad del VIH puede evaluarse como se describe en este documento en la sección de Ejemplos. Por ejemplo, pueden usarse los parámetros que se usan para evaluar la replicación del VIH, tales como, por ejemplo, la presencia o ausencia de componentes específicos del VIH, tales como ácidos nucleicos o proteínas, o en el último caso, la actividad de componentes específicos del VIH, tal como la transcriptasa inversa, para evaluar la inhibición del VIH en una muestra.

La invención incluye la preparación y el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto útil para la prevención de la infección por VIH o la inhibición de la infectividad del VIH, como ingrediente activo. Dicha composición farmacéutica puede estar constituida por el ingrediente activo en solitario, en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender el ingrediente activo y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales, o alguna combinación de éstos. El ingrediente activo puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un éster o de una sal fisiológicamente aceptable, tal como junto con un catión o un anión fisiológicamente aceptable, como se conoce bien en la técnica. Además, la ATIII (o un análogo biológicamente activo de la misma) usada en la presente invención puede contener aditivos farmacológicamente aceptables (por ejemplo, vehículo, excipiente y diluyente), estabilizantes o componentes necesarios para la formulación de preparaciones, que se usan generalmente para productos farmacéuticos, siempre que no perjudiquen al objeto de la presente invención.

Los ejemplos de aditivos y estabilizantes incluyen sacáridos, tales como monosacáridos (por ejemplo, glucosa y fructosa), disacáridos (por ejemplo, sacarosa, lactosa y maltosa) y alcoholes de azúcares (por ejemplo, manitol y sorbitol); ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido málico y ácido tartárico, y sales de los mismos (por ejemplo, sal sódica, sal potásica y sal cálcica); aminoácidos tales como glicina, ácido aspártico y ácido glutámico, y sales de los mismos (por ejemplo, sal sódica); tensioactivos tales como polietilenglicol, copolímero de polioxietileno y polioxipropileno y éster de ácido graso de polioxietilensorbitán; heparina; y albúmina.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden preparase por cualquier método conocido o desarrollarse a partir de aquí mediante la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un vehículo o uno o más de otros ingredientes accesorios y, después, si es necesario o deseable, conformar o envasar el producto en una unidad de dosis unitaria o multidosis deseada.

Aunque las descripciones de composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se refieren principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética a seres humanos, el especialista entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para su administración a toda clase de animales. Se conoce bien la modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de dar composiciones adecuadas para la administración a diversos animales, y el farmacólogo veterinario especialista puede diseñar y realizar dicha modificación con una experimentación normal, si es que es necesaria. Los sujetos en los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, seres humanos y otros primates.

Las composiciones farmacéuticas que son útiles en los métodos de la invención pueden prepararse, envasarse o comercializarse en formulaciones adecuadas para la administración por vía oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica u otra vía de administración. El modo preferido es la administración por vía intravenosa.

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La ATIII y los ingredientes mencionados anteriormente se mezclan según sea apropiado para dar polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, jarabes, inyecciones y similares. Otras formulaciones contempladas incluyen la proyección de nanopartículas, las preparaciones lisosomales, la liberación de eritrocitos que contienen el ingrediente activo, y formulaciones basadas en inmunología.

Una composición farmacéutica de la invención puede preparase, envasarse o comercializarse a granel, como una dosis unitaria sencilla o como una pluralidad de dosis unitarias sencillas. Como se usa en este documento, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administrará a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación, tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, del vehículo farmacéuticamente aceptable y de cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán dependiendo de la identidad, tamaño y condición del sujeto que se trata, y dependerá además de la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) del ingrediente activo.

Además del ingrediente activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales.

Los agentes adicionales particularmente contemplados incluyen antieméticos y aceptores, tales como aceptores de cianida y cianato. Pueden prepararse formulaciones de liberación controlada o de liberación sostenida de una composición farmacéutica de la invención mediante el uso de tecnología convencional.

Una formulación de una composición farmacéutica de la invención adecuada para la administración por vía oral puede separase, envasarse o comercializarse en forma de una unidad de dosis sólida discreta incluyendo, pero sin limitación, un comprimido, una cápsula blanda o dura, una oblea, un trocisco o una pastilla, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo. Otras formulaciones adecuadas para la administración por vía oral incluyen, pero sin limitación una formulación en polvo o granular, una suspensión acuosa u oleosa, una solución acuosa u oleosa o una emulsión.

Un comprimido que comprende el ingrediente activo puede, por ejemplo, preparase por compresión o moldeo del ingrediente activo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Los comprimidos obtenidos por compresión pueden preparase por compresión en un dispositivo adecuado, el ingrediente activo en una forma fluida tal como una preparación en polvo o granular, opcionalmente mezclada con uno o más de un aglutinante, un lubricante, un excipiente, un agente tensioactivo y un agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden preparase por moldeo en un dispositivo adecuado, de una mezcla del ingrediente activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos líquido suficiente para humedecer la mezcla. Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de comprimidos incluyen, pero sin limitación, diluyentes inertes, agentes de granulación y disgregantes, agentes aglutinantes y agentes lubricantes. Los agentes de dispersión conocidos incluyen, pero sin limitación, almidón de patata y almidón glicolato sódico. Los agentes tensioactivos conocidos incluyen, pero sin limitación, lauril sulfato sódico. Los diluyentes conocidos incluyen, pero sin limitación, carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato cálcico, hidrogenofosfato cálcico y fosfato sódico. Los agentes de granulación y disgregantes conocidos incluyen, pero sin limitación, almidón de maíz y ácido algínico. Los agentes aglutinantes conocidos incluyen, pero sin limitación, gelatina, goma arábiga, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa. Los agentes lubricantes conocidos incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio, ácido esteárico, sílice y talco.

Los comprimidos pueden no estar revestidos o pueden revestirse usando métodos conocidos para conseguir una disgregación retrasada en el tracto gastrointestinal de un sujeto, proporcionando de este modo una liberación y absorción sostenidas del ingrediente activo. A modo de ejemplo, puede usarse un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para revestir comprimidos. A modo de otro ejemplo, los comprimidos pueden revestirse usando los métodos que se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.256.108 de Theeuwes; 4.160.452 de Theeuwes; y 4.265.874 de Bonsen et al., para preparar comprimidos de liberación osmóticamente controlada. Los comprimidos pueden comprender además un agente edulcorante, un agente aromatizante, un agente colorante, un conservante o alguna combinación de éstos con el fin de proporcionar una preparación farmacéuticamente elegante y apetitosa.

Pueden preparase cápsulas duras que comprenden el ingrediente activo mediante el uso de una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Dichas cápsulas duras comprenden el ingrediente activo y pueden comprender además ingredientes adicionales incluyendo, por ejemplo, un diluyente sólido inerte tal como carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín.

Pueden preparase cápsulas de gelatina blanda que comprenden el ingrediente activo mediante el uso de una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Dichas cápsulas blandas comprenden el ingrediente activo, que puede mezclarse con un medio acuoso u oleoso tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

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Pueden prepararse, envasarse y comercializarse formulaciones líquidas de una composición farmacéutica de la invención, que son adecuadas para la administración por vía oral, en forma líquida o en forma de un producto seco destinado a su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.

Pueden preparase suspensiones líquidas usando métodos convencionales para conseguir la suspensión del ingrediente activo en un vehículo acuoso u oleosos. Los vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina isotónica. Los vehículos oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, oliva, sésamo o coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como parafina líquida. Las suspensiones líquidas pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, agentes dispersantes o humectantes, agentes emulsionantes, demulcentes, conservantes, tampones, sales, aromatizantes, agentes colorantes y agentes edulcorantes. Las suspensiones oleosas pueden comprender además un agente espesante. Los agentes de suspensión conocidos incluyen, pero sin limitación, jarabe de sorbitol, grasas comestibles hidrogenadas, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto, goma arábiga y derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes dispersantes o humectantes conocidos incluyen, pero sin limitación, fosfatidas de origen natural tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, con un alcohol alifático de cadena larga, con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol o con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol anhidro (por ejemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenoxicetanol, monooleato de polioxietilensorbitol y monooleato de polioxietilensorbitán, respectivamente). Los agentes emulsionantes conocidos incluyen, pero sin limitación, lecitina y goma arábiga. Los conservantes conocidos incluyen, pero sin limitación, metil, etil o n-propil-parahidroxibenzonatos, ácido ascórbico y ácido sórbico. Los agentes edulcorantes conocidos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, sacarosa y sacarina. Los agentes espesantes conocidos para suspensiones oleosas incluyen, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura y alcohol acetílico.

Pueden preparase soluciones líquidas del ingrediente activo en disolventes acuosos u oleosos sustancialmente de la misma forma que las suspensiones líquidas, siendo la diferencia principal que el ingrediente activo está disuelto en lugar de suspendido en el disolvente. Las soluciones líquidas de la composición farmacéutica de la invención pueden comprender cada uno de los componentes descritos con respecto a las suspensiones líquidas, entendiéndose que los agentes de suspensión no facilitarán necesariamente la disolución del ingrediente activo en el disolvente. Los disolventes acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina isotónica. Los disolventes oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, oliva, sésamo o coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como parafina líquida.

Pueden preparase formulaciones en polvo y granulares de una preparación farmacéutica de la invención usando métodos conocidos. Dichas formulaciones pueden administrase directamente a un sujeto, usadas, por ejemplo, para preparar comprimidos, cargar cápsulas o preparar una solución o suspensión acuosa u oleosa mediante la adición de un vehículo acuoso u oleoso a la misma. Cada una de estas formulaciones puede comprender además uno o más agentes dispersantes o humectantes, un agente de suspensión y un conservante. Pueden también incluirse excipientes adicionales tales como cargas y agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes, en estas formulaciones.

Una composición farmacéutica de la invención puede también prepararse, envasarse o comercializarse en forma de una emulsión de aceite en agua o de una emulsión de agua en aceite. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o de cacahuete, un aceite mineral tal como parafina líquida o una combinación de éstos. Dichas composiciones pueden comprender además uno o más agentes emulsionantes, tales como gomas de origen natural como goma arábiga o goma de tragacanto, fosfatidas de origen natural tales como fosfatida de soja o de lecitina, ésteres o ésteres parciales derivados de combinaciones de ácidos grasos y hexitol anhidros tales como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, tal como monooleato de polioxietilensorbitán. Estas emulsiones pueden contener también ingredientes adicionales, incluyendo, por ejemplo, agentes edulcorantes o aromatizantes.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o comercializarse en una formulación adecuada para la administración por vía rectal. Dicha composición puede estar en forma de, por ejemplo, un supositorio, una preparación de enema de retención y una solución para irrigación rectal o del colon.

Pueden preparase formulaciones de supositorios mediante la combinación del ingrediente activo con un excipiente no irritante farmacéuticamente aceptable que sea sólido a temperatura ambiente normal (es decir, a aproximadamente 20ºC) y que sea líquido a la temperatura rectal del sujeto (es decir, a aproximadamente 37ºC en un humano sano). Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao, polietilenglicoles y diversos glicéridos. Las formulaciones de supositorios, pueden comprender además diversos ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, antioxidantes y conservantes.

Pueden prepararse preparaciones de enema de retención o soluciones para irrigación rectal o del colón mediante la combinación del ingrediente activo con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Como se conoce bien en la técnica, las preparaciones de enema pueden administrase usando, y pueden envasarse dentro de, un dispositivo de administración adaptado a la anatomía rectal del sujeto. Las preparaciones de enema pueden comprender además diversos ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitación, antioxidantes y conservantes.

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Una composición farmacéutica de la invención puede preparase, envasarse o comercializarse en una formulación adecuada para la administración por vía vaginal. Dicha composición puede estar en forma de, por ejemplo un supositorio, un material insertable por vía vaginal impregnado o revestido, tal como un tampón, una preparación de jeringa, o un gel o crema o solución para irrigación vaginal.

Se conocen en la técnica métodos para impregnar o revestir un material con una composición química, e incluyen, pero sin limitación, métodos de depósito o unión de una composición química sobre una superficie, métodos de incorporación de una composición química en la estructura de un material durante la síntesis del material (es decir, tal como con un material fisiológicamente degradable) y métodos de absorción de una solución o suspensión acuosa u oleosa en un material absorbente, con o sin secado posterior.

Pueden prepararse preparaciones de jeringa o soluciones para irrigación vaginal mediante la combinación del ingrediente activo con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Como se conoce en la técnica, las preparaciones de jeringa pueden administrarse usando, y pueden envasarse dentro de, un dispositivo de administración adaptado a la anatomía vaginal del sujeto.

Las preparaciones de jeringa pueden comprender además diversos ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitación, antioxidantes, antibióticos, agentes antifúngicos y conservantes.

Los métodos de administración adicionales para la administración de compuestos incluyen un dispositivo de administración de fármacos, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.928.195 de Malamud et al.

Como se usa en este documento, la "administración por vía parenteral" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la apertura física de una brecha en un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la brecha en el tejido. La administración por vía parenteral incluye, por lo tanto, pero sin limitación, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante aplicación de la composición a través de una herida penetrante en la piel no quirúrgica, y similares. En particular, la administración por vía parenteral se contempla que incluye, pero sin limitación, técnicas de infusión por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, de inyección intraesternal y de diálisis renal.

Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración por vía parenteral comprenden el ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Dichas formulaciones pueden preparase, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para la administración embolada o para la administración continua. Pueden prepararse, envasarse o comercializarse formulaciones inyectables en forma de dosificación unitaria, tal como en ampollas o en envases multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para administración por vía parenteral incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una realización de una formulación para la administración por vía parenteral, el ingrediente activo se proporciona de forma seca (es decir, en polo o granular) para su reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin agentes pirógenos) antes de la administración por vía parenteral de la composición reconstituida.

Las composiciones farmacéuticas pueden preparase, envasarse o comercializarse en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, junto con el ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en este documento. Dichas formulaciones inyectables estériles pueden preparase usando un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución de cloruro sódico isotónica y aceites fijos tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema de polímero biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero soluble en pequeñas cantidades o una sal soluble en pequeñas cantidades.

Las formulaciones adecuadas para la administración por vía tópica incluyen, pero sin limitación, preparaciones líquidas o semilíquidas, tales como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, tales como cremas, pomadas o pastas y soluciones o suspensiones. Las formulaciones administrables por vía tópica pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% (p/p) del ingrediente activo, aunque la concentración del ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el disolvente. Las formulaciones para la administración por vía tópica pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en este documento.

Una composición farmacéutica de la invención puede preparase, envasarse o comercializarse en una formulación adecuada para la administración por vía pulmonar a través de la cavidad bucal. Dicha formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7 nanómetros, y preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nanómetros. Dichas composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para la administración mediante el uso de un dispositivo que comprenden un depósito de polvo seco hacia el que puede dirigirse un chorro de un propulsor para dispersar el polvo, o mediante el uso de un disolvente que se autopropulse o un envase dispensador de polvo, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un envase cerrado herméticamente. Preferiblemente, dichos polvos comprenden partículas en las que al menos el 98% de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 0,5 nanómetros y al menos el 95% de las partículas en número tienen un diámetro menor de 7 nanómetros. Más preferiblemente, al menos el 95% de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nanómetro y al menos el 90% de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nanómetros. Las composiciones en polvo seco incluyen, preferiblemente, un diluyente sólido en polvo fino tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en una forma de dosis unitaria.

Los propulsores de bajo punto de ebullición incluyen, generalmente, propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de 18,33ºC (65ºF) a presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 al 99% (p/p) de la composición y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 al 20% (p/p) de la composición. El propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico o sólido aniónico, o un diluyente sólido (preferiblemente, que tiene un tamaño de partículas del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).

Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para la administración por vía pulmonar pueden proporcionar también el ingrediente activo en forma de gotitas de una solución o suspensión. Dichas formulaciones pueden preparase, envasarse o comercializarse como soluciones o suspensiones acuosas o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden el ingrediente activo y pueden administrase convenientemente mediante el uso de un dispositivo de nebulización o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitación, un agente aromatizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponante, un agente tensioactivo o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración tienen, preferiblemente, un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros.

Las formulaciones descritas en este documento como útiles para la administración por vía pulmonar son útiles también para la administración por vía intranasal de una composición farmacéutica de la invención.

Otra formulación adecuada para la administración por vía intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y tiene un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0,2 a 500 micrómetros. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un envase en el que se mantiene el polvo cerrado hasta los orificios nasales.

Las formulaciones adecuadas para la administración por vía nasal pueden comprender, por ejemplo, desde aproximadamente tan poco como el 0,1% (p/p) hasta tanto como el 100% (p/p) del ingrediente activo, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en este documento.

Una composición farmacéutica de la invención puede preparase, envasarse o comercializarse en una formulación adecuada para la administración por vía bucal. Dichas formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de comprimidos o pastillas preparadas usando métodos convencionales y pueden contener, por ejemplo, del 0,1 al 20% (p/p) del ingrediente activo, comprendiendo el equilibrio una composición disolvible o degradable en la boca y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en este documento. Como alternativa, las formulaciones adecuadas para la administración por vía bucal pueden comprender un polvo o una solución o suspensión en aerosol o atomizada, que comprende el ingrediente activo. Dichas formulaciones en polvo, en aerosol o atomizadas, cuando se dispersan, tienen preferiblemente un tamaño medio de partícula o de gotita en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en este documento.

Una composición farmacéutica de la invención puede preparase, envasarse o comercializarse en una formulación adecuada para la administración por vía oftálmica. Dichas formulaciones, pueden, por ejemplo, estar en forma de gotas oculares, incluyendo, por ejemplo un 0,1-1,0% (p/p) de una solución o suspensión del ingrediente activo en un vehículo líquido acuoso u oleoso. Dichas gotas pueden comprender además agentes tamponantes, sales, o uno o más de otros de los ingredientes adicionales descritos en este documento. Otras formulaciones administrables por vía oftálmica que son útiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina o en una preparación liposomal.

La mezcla de ATIII y de aditivos farmacológicamente aceptables se prepara preferiblemente como un producto liofilizado y se disuelve cuando se usa. Dicha preparación puede preparase en una solución, que contiene aproximadamente 1-100 unidades/ml de ATIII, mediante su disolución en agua destilada para inyección o en agua purificada estéril. Más preferiblemente, se ajusta para que tenga una concentración salina fisiológicamente isotónica y un valor de pH fisiológicamente deseable (pH 6-8).

Se ha demostrado que la ATIII se tolera bien cuando se administra a una dosis de \sim 100 U/kg/día (Warren et al., JAMA 286: 1869-78 (2001)) y se demostró que tiene una vida media de eliminación total de 18,6 horas (Ilias et al., INTENSIVE CARE MEDICINE 26: 7104-7115 (2000)). Aunque la dosis se determina adecuadamente dependiendo de los síntomas, del peso corporal, del sexo, de la especie animal y similares, es generalmente de 1-1.000 unidades/kg de peso corporal/día, preferiblemente de 10-500 unidades/kg de peso corporal/día de ATIII para un adulto humano, que se administran en una o varias dosis por día. En el caso de la administración por vía intravenosa, por ejemplo, la dosis es preferiblemente de 10-100 unidades/kg de peso corporal/día. El compuesto puede administrase tan frecuentemente como varias veces al día, o puede administrase menos frecuentemente, tal como una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes o incluso menos frecuentemente, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. La frecuencia de la dosis será fácilmente evidente para el especialista y dependerá de varios factores, tales como, pero sin limitación, el tipo y la gravedad de la enfermedad que se trata, el tipo y la edad del animal, etc.

La presente invención comprende además células hospedadoras obtenidas por ingeniería genética que contienen los polinucleótidos que codifican ATIII o análogos de ATIII y expresan el polipéptido ATIII en una cantidad suficiente para inhibir la infección de la célula por VIH. Además, la presente invención proporciona un método para tratar la infección por VIH en un sujeto, introducir en un sujeto una célula productora que expresa ATIII en una cantidad suficiente para inhibir la infección de una célula endógena del sujeto. Por ejemplo, dichas células hospedadoras pueden contener ácidos nucleicos que codifican ATIII y que se introducen en la célula hospedadora usando métodos conocidos de transformación, transfección o infección. La presente invención proporciona además células hospedadoras obtenidas por ingeniería genética para expresar los polinucleótidos de ATIII, en las que dichos polinucleótidos están operativamente asociados con una secuencia reguladora heteróloga para la célula hospedadora, que dirige al expresión de los polinucleótidos en la célula. Véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.632.981 de Bock y Lawn; y el documento EP-90505 de Botsuku y Roon.

Los conocimientos sobre las secuencias de ácidos nucleicos de ATIII permiten la modificación de las células para permitir, o aumentar, la expresión de polipéptido endógeno. Las células pueden modificarse (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) para proporcionar una expresión aumentada de polipéptidos mediante el reemplazo de la totalidad o parte del promotor de origen natural por la totalidad o parte de un promotor heterólogo, de tal modo que la célula exprese el polipéptido a niveles mayores. El promotor heterólogo se inserta de tal modo que esté operativamente unido a las secuencias codificantes. Véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT Nº WO94/12650 de Hartlein et al., la Publicación Internacional PCT Nº WO 92/20808 de Smithies y la Publicación Internacional PCT Nº WO 91/09955 de Chappel. También se contempla que, además del promotor de ADN heterólogo, puede insertarse un marcador de ADN amplificable (por ejemplo, ada, dhfr y el gen multifuncional CAD que codifica la carbamil fosfato sintasa, la aspartato transcarbamilasa y la dihidroorotasa) y/o un intrón de ADN junto con el promotor de ADN heterólogo. Si está unido a la secuencia codificante, la amplificación del marcador de ADN mediante métodos de selección convencionales da como resultado la co-amplificación de las secuencias codificantes de proteínas deseadas en las células.

La célula hospedadora, puede ser una célula hospedadora eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción recombinante en la célula hospedadora puede realizarse mediante transfección con fosfato cálcico, DEAE, transfección mediada por dextrano o electroporación (Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)). Las células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica ATIII pueden usarse de formas convencionales para producir el producto génico codificado por el análogo o fragmento aislado (en el caso de un marco de lectura abierto) o puede usarse para producir una proteína heteróloga bajo el control del EMF.

Cualquier sistema hospedador/vector puede usarse para expresar una o más formas proteicas de ATIII. Los hospedadores potenciales incluyen, pero sin limitación, hospedadores eucariotas tales como células HeLa, células Cv-1, células COS, células 293 y células Sf9, así como hospedadores procariotas tales como E. coli y B. subtilis. Las células más preferidas son las que no expresan normalmente el polipéptido o proteína en particular o las que expresan el polipéptido o proteína a un nivel natural bajo. Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacteria u otras células bajo el control de promotores adecuados. Pueden usarse también sistemas de traducción sin células para producir dichas proteínas, usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión adecuados para usar con hospedadores procariotas y eucariotas en Sambrook et al., en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SEGUNDA EDICIÓN, COLD SPRING HARBOR, NUEVA YORK (1989), cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.

Pueden emplearse también diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteína ATIII recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas Cos-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, CELL 23: 175-82 (1981). Otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible son, por ejemplo, la C127, la células COS de mono, las células de ovario de hámster chino (CHO), las células 293 de riñón humano, las células epidérmicas humanas A431, las células humanas Colo205, las células 3T3 y las células CV-1, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivos de tejidos primarios in vitro, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK o Jurkat. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias flanqueantes 5' no transcritas. Las secuencias de ADN obtenidas a partir del genoma viral SV40, por ejemplo, el origen SV40, el promotor temprano, el potenciador, los sitios de corte y empalme y de poliadenilación, pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos que se requieren. Los polipéptidos y proteínas recombinantes producidos en cultivos bacterianos se aíslan habitualmente mediante la extracción inicial de los sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de cromatografía por desplazamiento salino, intercambio iónico acuoso o exclusión por tamaños. Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Por último, puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular.

La presente invención también proporciona un método para tratar una infección por VIH en el que se introduce un ADN que codifica una serpina, por ejemplo, ATIII o un análogo de la misma, en una célula susceptible a una infección por VIH y se expresa en una cantidad suficiente para inhibir la infección de la célula por el VIH. Es decir, la invención proporciona una terapia génica para tratar patologías inducidas por retrovirus que implica a una serpina, por ejemplo, ATIII. La administración de un gel funcional que codifica una serpina a células apropiadas se realiza ex vivo, in situ o in vivo mediante el uso de vectores y, más particularmente, vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados o un retrovirus), o ex vivo mediante el uso de métodos físicos de transferencia de ADN (por ejemplo, liposomas o tratamientos químicos). Véase, por ejemplo, Anderson, NATURE 392 (6679 Suplemento): 25-30 (1998); véase también, Friedmann, SCIENCE, 244: 1275-81 (1989); Verma, SCI. AM. 263: 68-84 (1990); Miller, NATURE, 357: 455-60 (1992). La introducción de un gen codificante de serpina puede conseguirse también con sustratos extracromosómicos (expresión transitoria) o cromosomas artificiales (expresión estable). Las células pueden cultivarse también ex vivo en presencia de una serpina para inducir la proliferación o producir un efecto deseado sobre o una actividad en dichas células. Después, las células tratadas pueden introducirse in vivo con fines terapéuticos. Como alternativa, se contempla que la terapia antisentido o la terapia génica pueden aplicarse para regular negativamente la expresión de serpinas de la invención.

Otros métodos para inhibir la expresión de una proteína incluyen la introducción de moléculas antisentido de los ácidos nucleicos de la presente invención, sus complementarios o sus secuencias de ARN traducidas, mediante métodos conocidos en la técnica. Además, las serpinas pueden inhibirse mediante el uso de métodos de deleción dirigida o mediante la inserción de un elemento regulador negativo tal como un silenciador, que es específico de tejido.

La presente invención proporciona además células obtenidas por ingeniería genética in vivo para expresar polinucleótidos que codifican una serpina, por ejemplo ATIII, en la que dichos polinucleótidos están operativamente asociados con una secuencia reguladora heteróloga para la célula hospedadora, que dirige la expresión de los polinucleótidos en la célula. Estos métodos pueden usarse para aumentar o disminuir la expresión de los polinucleótidos de serpina.

En otra realización de la presente invención, pueden obtenerse por ingeniería genética células y tejidos para expresar un gen endógeno que comprende una serpina, por ejemplo ATIII, bajo el control de elementos reguladores inducibles, en cuyo caso las secuencias reguladoras del gen endógeno pueden reemplazarse mediante recombinación homóloga. Como se describe en este documento, puede usarse terapia génica dirigida para reemplazar una región reguladora existente en un gen por una secuencia reguladora aislada de un gen diferente o una nueva secuencia reguladora sintetizada mediante métodos de ingeniería genética. Dichas secuencias reguladoras pueden comprender promotores, potenciadores, regiones de adhesión al armazón, elementos reguladores negativos, sitios de inicio de la transcripción, sitios de unión a proteínas reguladoras o combinaciones de dichas secuencias. Como alternativa, las secuencias que afectan a la estructura o a la estabilidad del ARN o de la proteína producida pueden reemplazarse, eliminarse, añadirse o modificarse de otra forma mediante técnicas dirigidas. Estas secuencias incluyen señales de poliadenilación, elementos estabilizadores del ARNm, sitios de corte y empalme, secuencias líder para potenciar o modificar las propiedades de transporte o de secreción de la proteína u otras secuencias que alteran o mejoran la función o la estabilidad de las moléculas de proteína o de ARN.

En todas las realizaciones anteriores que implican un aumento de una serpina celular, por ejemplo, la expresión de ATIII, el acontecimiento dirigido puede ser una inserción sencilla de la secuencia reguladora, colocando el gen bajo el control de una nueva secuencia reguladora, por ejemplo, insertando un nuevo promotor o potenciador o ambos cadena arriba de un gen. Como alternativa, el acontecimiento dirigido puede ser una deleción sencilla de un elemento regulador, tal como la deleción de un elemento regulador negativo específico de tejido. Como alternativa, el acontecimiento dirigido puede reemplazar un elemento existente; por ejemplo, un potenciador específico de tejido puede reemplazarse por un potenciador que tenga una especificidad mayor o por diferentes tipos celulares que los elementos de origen natural. En este punto, las secuencias de origen natural se delecionan y se añaden nuevas secuencias. En todos los casos, la identificación del acontecimiento dirigido puede facilitarse mediante el uso de uno o más genes marcadores seleccionables que estén contiguos al ADN diana, permitiendo la selección de las células en las que se haya integrado el ADN exógeno en el genoma de la célula hospedadora. La identificación del acontecimiento dirigido puede facilitarse también mediante el uso de uno o más genes marcadores que presenten la propiedad de selección negativa, de tal modo que la selección por marcador negativo esté unida al ADN exógeno, pero configurada de tal modo que la selección por marcador negativo flanquee a la secuencia diana, y de tal modo que un acontecimiento de recombinación homóloga correctora con secuencias del genoma de la célula hospedadora no dé como resultado la integración estable del marcador seleccionable negativo. Los marcadores útiles para este fin incluyen el gen de la timidín quinasa (TK) del virus herpes simplex o el gen de la xantina-guanina fosforribosil-transferasa (GPT) bacteriana.

Las técnicas de terapia génica dirigida o de activación génica que pueden usarse de acuerdo con este aspecto de la invención se describen más particularmente en la Patente de Estados Unidos Nº 5.272.071 de Chappel; la Patente de Estados Unidos Nº 5.578.461 de Sherwin et al; la Solicitud Internacional Nº PCT/US92/09627 (WO93/09222) por Selden et al., y la Solicitud Internacional Nº PCT/US90/06436 (WO91/06667) por Skoultchi et al., cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

La presente invención se describe con más detalle a continuación mediante Ejemplos ilustrativos, a los que no se limita la presente invención.

Ejemplos

Estos Ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos solamente y no debe interpretarse de ningún modo que la invención se limita a estos Ejemplos, sino que debe interpretarse que incluye cualquiera y todas las variaciones que resulten evidentes como resultado de las enseñanzas que se proporcionan en este documento.

Ejemplo 1 Purificación por HPLC de un factor inhibidor del VIH a partir de células T CD8^{+} y su identificación como antitrombina III mediante el uso de espectrometría de masas en tándem por nano-electropulverización

Para purificar el factor inhibidor de VIH de tipo ATIII, se cultivaron CTL específicos de VIH o masas de células T CD8^{+} de enfermos de larga duración sin progresión in vitro y se estimularon con entrecruzamiento de CD3 (Geiben-Lynn et al., J. VIROL., 75: 8306-16 (2001)) en suero bovino fetal inactivado por calor al 10% o suero humano inactivado por calor al 10%. Después de 4 h a 37ºC, los medios se recogieron, se centrifugaron y se aplicaron a una columna de heparina-sefarosa. La columna se eluyó con un gradiente continuo de NaCl 1M en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Se combinaron las fracciones inhibidoras y se concentraron con un concentrador por centrifugación Centricon 50K. La muestra se aplicó a una columna de Superdex 200. Las fracciones que inhibían se aplicaron a una columna de Vydac RP-4 HPLC equilibrada con agua destilada y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (p/p) y se analizó su pureza (Figura 2A). La proteína unida se eluyó con un gradiente de acetonitrilo en TFA (Van Patten et al., J. BIOL. CHEM., 274: 10268-76 (1999)). Además, se evaluó la pureza de las muestras finales mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) con tinción de plata y se determinó la concentración de proteína con un ensayo de proteína de Bio-Rad. Las fracciones con > 95% de pureza por HPLC C4 y tinción de plata se usaron para los ensayos de inhibición para determinar la DI_{50} (Schreuder et al., NAT. STRUCT. BIOL., 1: 48-54 (1994))

Las fracciones de la columna de Superdex-200 que contenían actividad anti-VIH se combinaron y se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y mediante tinción de plata, que reveló una única especie molecular que migraba a 43 kDa (Figura 2B). Se realizó una digestión con tripsina en gel sobre el material que migraba en la banda de 43 kDa para producir fragmentos peptídicos que se eluyeron posteriormente del gel y se identificaron como ATIII bovina mediante HPLC de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem por nano-electropulverización (\muLC/MS/MS) en un espectrómetro de masas cuadrupolar de trampa de iones Finnigan LCQ (Figura 2C). La ATIII bovina (53%) se detectó con masas de 14 péptidos.

Por el contrario, los medios no tratados que contenían suero y los sobrenadantes de células T CD8^{+} no estimuladas cultivadas en medio que contenía suero, no inhibían sustancialmente la replicación del VIH_{IIB}, ni siquiera cuando se aplicaron a la columna de heparina-sefarosa. Además, usando medios no tratados que contenían suero, la forma de ATIII de 43 kDa no se detectó después de la cromatografía de heparina-sefarosa y la cromatografía de Superdex 200, ni por tinción de plata de SDS-PAGE ni por HPLC C4. Estos datos demuestran que las células T CD8^{+} activadas modifican la ATIII a una forma que es capaz de inhibir el VIH. La ATIII no procesada tiene normalmente un peso molecular de 54-65 kDa, mientras que la forma purificada se encontró a 43 kDa por SDS-PAGE. Esto condujo a la hipótesis de que puede ser necesario el factor de < 50kDa que no se une a heparina para activar la ATIII.

Ejemplo 2 Actividad antiviral de ATIII 1. Evaluación comparativa del efecto de formas purificadas de la ATIII bovina sobre la infectividad de VIH, SIV y SHIV in vitro

Para ensayar el efecto de ATIII sobre la infectividad de lentivirus (VIH X4, VIH R4, SIV_{239} o SHIV_{KU-1}), se cultivaron líneas celulares (H9, PM1, SEM-174) en presencia o ausencia de las diversas formas de ATIII durante nueve días (compárense las Figuras 3 y 4). Cada tres días (días 3, 6 y 9), se retiró 1 ml de sobrenadante celular de los pocillos de ensayo y se reemplazó por un volumen equivalente de medio de cultivo R20 que contenía ATIII bovina o ATIII humana. Los pocillos de control se muestrearon de manera similar, pero recibieron medio sin suplemento de ATIII.

Tanto los pocillos de ensayo como los de control se muestrearon de nuevo el noveno día de cultivo y se midió la concentración de la proteína del núcleo viral p24 (gag) para el VIH (Alliance® HIV-1 p24 ELISA kit; NEN® Life Science, Boston, MA, Estados Unidos) o del antígeno p27 (SIV core antigen ELISA kit, Coulter, Miami, FL) en las células infectadas con VIH y SIV o SHIV, respectivamente. La inhibición de la replicación viral en las muestras de ensayo se calculó como un porcentaje de la inmunorreactividad de p24 observada en los pocillos de control.

2. Evaluación in vivo de la actividad antirretroviral de ATIII

Actualmente no existe ningún modelo animal in vivo patrón aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) para la evaluación de agentes antirretrovirales tales como ATIII, y no es necesario un modelo in vivo para la aprobación de IND en Estados Unidos. No obstante, pueden cultivarse líneas celulares humanas en fibras huecas en los compartimentos subcutáneo e intraperitoneal de ratones (Hollingshead et al., LIFE SCI., 57: 131-41 (1995)). La evaluación in vivo de la actividad antirretroviral de ATIII puede evaluarse en el modelo de fibras huecas murino desarrollado por Hollingshead y colaboradores (ANTIVIRAL RES., 28: 256-79 (1995)).

Se preparan fibras de fluoruro de polivinilideno que llevan células H9 o PM1 (punto de corte 500.000 Mw; 1 mm I. D.; Spectrum Medical Corp., Houston, TX, Estados Unidos) mediante la carga de fibras huecas condicionadas con inóculo de células (células no infectadas, células infectadas de forma aguda con VIH o células crónicamente infectadas con VIH) (Hollingshead et al., LIFE SCI., 57: 131-41 (1995)). Estas fibras huecas inoculadas se implantan quirúrgicamente subcutáneamente o en la cavidad peritoneal de ratones SCID (SCID/NCr; NCI Animal Production Facility; NCI-FCRDC, Frederick, MD, Estados Unidos). A los ratones SCID que llevan fibras huecas se les administraron de forma aguda o crónica cantidades crecientes de una preparación de ATIII purificada. La preparación de ATIII (3-500 U/ratón/día) se administra a los ratones SCID que llevan fibras huecas mediante inyección por vía subcutánea, inyección por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía oral. A tiempos seleccionados, se toman muestras de sangre de los animales de control y de ensayo y se prepara el suero. La cantidad de partículas virales en el suero de ensayo y de control se mide mediante ELISA de p24. La acción antiviral mediada por ATIII produjo una disminución significativa de la carga viral, a juzgar por una disminución de al menos el 15% en suero de contenido de proteína p24 en animales tratados con ATIII respecto al contenido de p24 en suero de los animales de control no tratados.

Equivalentes

Aunque se han descrito con detalle realizaciones particulares en este documento, esto se ha realizado a modo de ejemplo con fines ilustrativos solamente, y no se pretende que sean limitantes con respecto al alcance de las reivindicaciones adjuntas, que siguen a continuación. En particular, se contempla por parte de los inventores que pueden realizarse diversas sustituciones, alternaciones y modificaciones de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, puede usarse ATIII, por ejemplo, como un fármaco antiviral contra otros virus (por ejemplo, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV o CMV).

<110> The General Hospital Corporation

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<120> Fármacos de serpina para el tratamiento de la infección por VIH y método de uso de los mismos

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<130> EA-PCT-12408

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<140> PCT/US02/02309

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<141> 25-01-2002

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<150> US 60/264.338

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<151> 26-01-2001

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<160> 1

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 433

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<212> PRT

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

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<400> 1

8

9

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Claims (7)

1. Uso de una ATIII seleccionada del grupo de

(a) antitrombina modificada de 43 kDa;

(b) R-antitrombina;

(c) S-antitrombina que puede obtenerse mediante la unión de heparina a L-antitrombina;

(d) antitrombina pre-latente; y

(e) una combinación de las mismas,

que opcionalmente puede pretratarse mediante el contacto con elastasa, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección viral por un virus seleccionado de entre VIH, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV y CMV.

2. Un método para disminuir la infectividad de un virus seleccionado de entre VIH, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV y CMV, si está presente, en una muestra biológica tal como sangre, plasma, suero, saliva, semen, secreciones cervicales, orina, leche materna y líquidos amnióticos, comprendiendo el método las etapas de:

(a) identificar una muestra biológica en la que sea deseable una disminución o eliminación de infectividad viral; y

(b) poner en contacto la muestra biológica con una ATIII, como se define en la reivindicación 1, en una cantidad suficiente para disminuir la infectividad del virus en la muestra biológica.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la cantidad de dicha ATIII es de al menos 2 unidades por mililitro de volumen de la muestra biológica.

4. Una composición que comprende una ATIII que se asocia con una superficie, seleccionándose dicha ATIII de entre:

(a) antitrombina modificada de 43 kDa;

(b) R-antitrombina;

(c) antitrombina pre-latente; y

(d) una combinación de las mismas.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicha superficie es una perla, microplaca, columna o matriz.

6. Un método para inhibir la infectividad de un virus seleccionado de entre VIH, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV y CMV, comprendiendo dicho métodos las etapas de:

(a) poner en contacto un virión viral con una composición de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5; y

(b) incubar dicho virión viral con la ATIII durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la infectividad del virus,

en el que se excluyen los métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia y los métodos diagnósticos practicados sobre el cuerpo humano o animal.

7. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una ATIII seleccionada de entre

(a) antitrombina modificada de 43 kDa;

(b) antitrombina pre-latente, que puede obtenerse mediante la incubación de S-antitrombina a 60ºC durante 24 horas en condiciones salinas fisiológicas; y

(c) una combinación de las mismas,

para inhibir, tratar o prevenir una infección viral por un virus seleccionado de entre VIH, HTLV-1, HTLV-2, HSV, EBV, HBV, HCV y CMV.