RO110263B1 - Secventa sintetica de nucleotide, cu actiune insecticida, la porumb planta stabil, transformata si procedeu de producere a secventei - Google Patents

Description

Prezenta invenție se releră la o secvență sintetică de nucleotide, cu acțiune insecticidă la porumb, plantă stabil transformată și un procedeu de producere a secvenței.

Exprimarea genelor proteinelor insecticide (PI), provenite din Bacillus thuringiensis (Bt), la plante, s-a dovedit extrem de dificilă. S-au făcut încercări de a exprima la plante combinații de gene de tipul promotor himeric/Bt PI. De regulă, s-au obținut doar nivele reduse de proteine la plantele transgenice. A se vedea, ca exemplu, Vaeck etal., Nature 328.33-37, 1987, Barton et.al., Plani Physiol. 85:1103- 1109, 1987; Fischoff et.al., Bio/Techonology 5:807-813, 1987.

O presupusă explicație pentru cauza nivelului redus de exprimare este aceea că situsurile întâmplăt oare ale procesului de transcripție produc forme aberante ale transcriptorului ARNm BtPI. Acești transcriptori, produși aberant, sunt nefuncționali la o plantă, în ceea ce privește producerea unei proteine insecticide. Situsuri posibile includ situsuri de poliadenilare, situsuri de legare tip intron, semnale terminale de transcripție și semnale de transport Majoritatea genelor nu conțin situsuri ce vor afecta, prin ștergere, exprimarea genei în organismul- gazdă normal al acesteia. Totuși, apariția întâmplătoare a unor astfel de situsuri în cursul prelucrării, într-o regiune de codificare, poate complica exprimarea acelei gene la gazdele transgenice. De exemplu, regiunea de codificare pentru gena proteinei cristaline insecticide Bt provenite din Bacillus thuringiensis varietatea kurstaki (GENBANK BTHKURHD), număr de intrare M152H, B. thuringiensis var. kurstaki), HD-1; Geiser et.aL, Gene 48:109-118 (1986), așa cum a derivat direct din Bacillus thuringiensis, poate conține situsuri ce împiedica prelucrarea corespunzătoare a acestei gene la plante.

La încercarea de exprimare a proteinei din Bacillus thuringiensis la un organism, cum este, de exemplu, o plantă, apar și alte dificultăți. S-a descoperit că utilizarea codonului unei gene native BtPI este diferită semnificativ de aceea a unei gene din porumb. Ca urmare, ARNm rezultat din această genă poate să nu fie utilizat eficient. Utilizarea codonului poate influența exprimarea genelor la nivelul translației sau transcripției ori a prelucrării ARNm. în scopul îmbunătățirii unei gene insecticide, pentru a fi exprimată la plante, s-au făcut încercări de a modifica gena pentru a se asemăna, atât cât este posibil, cu genele naturale din planta gazdă ce urmează a fi transformată.

Adang et al., EP 0359472 (1990), se referă la o genă sintetizată din Bacillus thuringiensis tenebrionis (Btt) care este omoloagă în proporție de 85% genei native Btt și care este prevăzută să aibă conținut de A+T aproximativ egal cu cel care există la plante, în general. Adang et al. arată secvența de codoni a unei gene sintetice Btt, care a fost realizată să se asemene cât mai mult cu distribuția normală a codonilor unor gene dicotiledonate. Adang. et al. afirmă că se poate îmbunătăți codificarea genei sintetice pentru PI, în scopul creșterii exprimării la plantele monocotiledonate, prin metode similare, pezentând frecvența utilizării codonilor unor proteine de monocotiledonate cu exprimare înaltă. Adang et al. afirmă că gena sintetică Btt este prevăzută a avea un conținut de A+T de 55% (și implicit un conținut de G+C de 45%). Adang et al. dezvăluie faptul că gena sintetică este realizată prin modificarea codonilor pentru fiecare aminoacid din gena nativă Βζ pentru a exprima distribuția globală a codonilor, realizată de genele dicotiledonate pentru fiecare aminoacid, în interiorul regiunii de codare a genei. Adang et al. mai afirmă că doar câțiva codoni ai genei native Btt vor fi înlocuiți, pentru fiecare aminoacid, de către codonul preferențial al plantei, astfel încât distribuția globală a codonilor folosită la plantele dicotiledonate să se păstreze.

Fischhoff et al., EP 0385962 (1990) se referă la gene de plante ce codifică toxina proteică cristalină din Bacillus thuringiensis. Fischhoff et al. dezvăluie, în procente, utilizările codonilor pentru fiecare aminoacid. Fischhoff et al. sugerează modificarea unei gene native Bt, prin îndepărtarea semnalelor putative de poliadenilare și a secvențelor ATTTA. Fischhoff et al. mai sugerează analizarea secvenței de genă nativă Bt pentru regiuni mai mari de patru nucleotide consecutive de adenină sau tiniină, în scopul identificării semnalelor putative de poliadenilare la plante. Fischhoff et al. afirmă că secvența de nucleotide trebuie modificată dacă se identifică mai mult de un semnal putativ de poliadenilare, în intervalul de zece nucleotide al secvenței reciproce. Fischhoff et al. afirmă că s-au făcut eforturi de a selecta codoni pentru reglarea conținutului de G+C, la valoarea preferată de aproximativ 50%.

Perlak et al., PNAS USA, 88:33243328 (1991), se referă la secvențe de codare modificate din gena CrylA(b) de la Bacillus thuringiensis, similare celor prezentate în Fischhoff et al. Așa cum este arătat, gena CrylA(b), parțial modificată de Perlak et al. este omoloagă în proporție de aproximativ 96% genei native CiylA(b) (1681 din 1743 de nucleotide), cu un conținut de G+C de 41%, un număr de secvențe de semnale de poliadenilare la plante (SSPP) redus de la 18 la 7 și un număr de secvențe Α'ΓΓΓΑ redus de la 13 la 7. Se arată că gena CryIA(b), complet modificată din Perlak et al., este în întregime sintetică. Această genă este aproximativ 79% omoloagă genei CiylA(b) native (1455 din 1845 de nucleotide), cu un conținut de G+C de 49%, un număr de secvențe de semnal de poliadenilare la plante (SSPP) redus la 1 și cu toate secvențele Α'ΓΓΓΑ îndepărtate.

Barton et al., EP 0431829 (1991), se referă la exprimarea toxinelor insecticide la plante. Barton et al. descrie constituirea unei gene sintetice AalT de toxină de insectă, ce codifică o toxină de scorpion, folosind codonul preferențial, pentru fiecare aminoacid.

Secvența sintetică de nucleotide, conform invenției, codifică o proteină insecticidă de Bacillus thuringiensis capabilă să se exprime în cantități eficiente la porumb și prezintă o succesiune explicitată în secvența 3, secvența 4 sau în fig.7, iar în continuare, un prim promotor capabil să direcționeze exprimarea legat operațional la această secvență.

Această secvență este folosită pentru transformarea stabilă a unei plante la care proteina insecticidă este exprimată de cel puțin 100 ori mai mult decât exprimarea proteinei, folosind o secvență de codare nativă și este capabilă să controleze dezvoltarea insectelor Lepidoptere sau Coleoptere.

Procedeul de producere a secvenței sintetice, conform invenției, constă în: delimitarea secvenței de aminoacizi a proteinei insecticide de Bacillus thuringiensis și alterarea secvenței de codare a proteinei prin substituirea codonilor care sunt preferați la porumb cu codonii nativi corespondenți.

Invenția de față constă în descrierea de metode pentru creșterea exprimării genelor heterologe în celulele vegetale. In general, o genă sau regiune de codare de interes este constituită astfel, încât să furnizeze o secvență de codoni preferențiali, specific vegetală. în acest mod, utilizarea codonilor pentru o anumită proteină este modificată pentru a-i crește exprimarea la o anumită plantă. Astfel de secvențe de codare optimizate, pot fi legate operațional de promotori capabili de exprimare direcționată a secvenței de codare la o celulă vegetală.

In mod specific, unul din obiectele invenției de față este realizarea de gene sintetice pentru proteine insecticide cărora li s-a îmbunătățit exprimarea la plante.

Un alt obiect al invenției de față este realizarea de gene sintetice pentru proteine insecticide Bt, pentru creșterea la maximum a exprimării proteinelor Bt la s

o plantă, de preferat la porumb. Una din caracteristicile invenției de față este aceea că gena sintetică pentru PLBt este realizată folosind codoni preferențiali din porumb, cu excepția modificărilor necesare realizării de situsuri de legare pentru realizarea genei sintetice în totalitate.

în conformitate cu obiectele prezentate anterior, am sintetizat gene pentru proteine cristaline insecticide Bt la care utilizarea codonului a fost modificată în scopul creșterii exprimării la plante, în particular la porumb. Ca toate acestea, mai degrabă decât modificarea utilizării codonului pentru a semăna cu o genă din porumb în ceea ce privește distribuția globală a codonilor, noi am îmbunătățit utilizarea codonului prin folosirea de codoni preferențiali din porumb la sinteza genei sintetice. îmbunătățirea utilizării codonului preferențial din porumb determină exprimarea unor nivele ridicate de proteină insecticidă Bt Aceasta poate fi rezultatul creșterii la maximum a proteinei insecticide Bt, translatate dintro populație determinată de ARN mesager. Sinteza unei gene de PIBt, folosind codoni preferențiali din porumb, tinde, de asemenea, să elimine situsurile de prelucrare ce pot apare întâmplător în secvența de codare nativă.

Secvențele ADN îmbunătățite din porumb, preferențial sintetice, ale invenției de față derivă din proteina codificată de gena CrylA(b) la Bacillus thuringiensis var. kurstaki, HD- 1; Geiser et al., Gene, 48:109-118 (1986) sau de gena CrylB (gena AKA Ciy 4) descrisă de Brizzard și Whiteley, (Vuc.4cidj.Res., 16:2723 (1988). Secvența ADN a genei native kurstaki HD-1 CryIA(b) este figurată ca secvența 1. Aceste proteine acționează împotriva unor variate insecte lepidoptere, inclusiv Ostrinia nubilalis, dăunătorul european al cerealelor.

Deși invenția de față a fost exemplificată prin sinteza de gene îmbunătățite din porumb pentru proteina

Bt, este cunoscut că metoda poate fi utilizată pentru îmbunătățirea exprimării oricărei proteine la plante.

Gene îmbunătățite curente pot fi cuplate cu o varietate de promotori, inclusiv promotori constitutivi, inductibili, stabilizați în timp, cu extindere stabilizată, cu afinitate pentru țesuturi și cu specificitate pentru țesuturi, în scopul realizării de molecule de ADN recombinat adică gene himerice. Gena îmbunătățită din porumb (secvența de codare) deține nivele substanțial crescute de exprimare la o plantă transformată, atunci când este comparată cu o genă îmbunătățită, dar nu din porumb. în conformitate cu aceasta, pot fi produse plante rezistente la distrugătorii coleoplere sau lepidoptere, cum ar fi dăunătorul european al cerealelor sau dăunătorul trestiei de zahăr.

Un alt obiect al invenției de față este realizarea de promotori cu afinitate și specificitate pentru țesuturi, care dirijează exprimarea unei gene structurale, asociată operațional într-o anumită parte sau părți ale unei plante, excluzând masiv celelalte părți.

Un alt obiect al invenției de față este realizarea de promotori cu afinitate pentru măduvă. Prin afinitate pentru măduvă se înțelege faptul că promotorul este capabil să direcționeze exprimarea, într-o măsură mai mare, a unei gene structurale asociată operațional, la nivelul măduvei, față de rădăcini, teaca externă, rădăcini secundare și lipsită aproape total de exprimare la nivelul seminței.

încă un obiect al invenției de față este realizarea de promotori cu specificitate pentru polen. Prin specificitate pentru polen se înțelege faptul că promotorul este capabil să direcționeze exprimarea unei gene structurale, asociate operațional exclusiv la nivelul polenului unei plante, cu exprimare neglijabilă în oricare altă porțiune a plantei. Prin neglijabil se înțelege funcțional nesemnificativ.

încă un obiectai invenției de față este realizarea de molecule de ADN recombinat, conținând un promotor cu afinitate pentru țesuturi, asociați operațional sau legați la o genă structurală de interes, în mod particular la o genă structurală ce codifică o proteină insecticidă, ca și exprimarea unei molecule recombinante la o plantă.

Un alt obiect al invenției este realizarea de plante transgenice care dețin cel puțin o genă structurală de interes, operațională într-un mod de exprimare cu afinitate pentru țesuturi sau cu specificitate pentru țesuturi.

Intr-o alcătuire specifică invenției, promotorul cu afinitate pentru țesuturi sau specificitate pentru țesuturi este legal operațional la o genă structurală ce codifică o proteină insecticidă, iar o plantă este transformată stabil cu cel puțin o astfel de moleculă recombinantă. Planta rezultată va fi rezistentă la insectele specifice care se hrănesc cu acele părți ale plantei în care gena (genele) sunt exprimate. Genele structurale preferențial codifică proteine insecticide Bt Cele mai preferate sunt genele îmbunătățite din porumb pentru PIBt

Se dau în continuare exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1...38, care reprezintă:

- fig.l, comparația între gena nativă Bt CrylA(b) /BTHKURHD/ în lungime completă, o genă sintetică îmbunătățită din porumb Bt CryIA(b) /flayabtfin/, în lungime completă și o genă sintetică îmbunătățită, din porumb, fragmentată Bt CiyIA(b) /bssyn/. Această figură arată că secvența de genă sintetică îmbunătățită, din porumb, CryIA(b) în lungime completă, se potrivește cu secvența de genă nativă CrylA(b) la aproximativ 2354 din 3468 de nucleotide (omoloagă aproximativ 68%);

- fig.2, comparația între gena nativa Bt CiyIA(b) /BTHKURHD/, fragmentată. Această figură arată că secvența de genă sintetică îmbunătățită, din porumb CiyIA(b), fragmentată, se potrivește cu secvența de genă nativă CrylA(b) la aproximativ 1278 din 1947 nucleotide (omoloagă aproximativ 66%);

- fig.3, comparația între secvența de genă pură îmbunătățită, din porumb Bt /SyalT.mze/, o genă sintetică îmbunătățită, din porumb Bt /bssyn/, fragmentată, și o gena sintetică îm-bunătățită, din porumb, în lungime completă, modificată astfel, încât să cuprindă situsuri restrictive pentru facilitatea construirii genei /synful.mod/. Această figură arată că secvența de genă sintetică îm-bunătățită din porumb CrylA(b), fragmentată, se potrivește cu secvența de genă pură îmbunătățită CrylA(h) la 1913 din 1947 de nucleotide (omoloagă aproximativ 98%);

- fig.4, comparația între o genă nativă Bt CiylA(b) /BTHKURHD/, fragmentată, o genă sintetică CrylA(b), fragmentată, descrisă în Perlaket al.,7Wz45 USA. 88:3324-3328 (1991) /PMONBT/ și o genă sintetică îmbunătățită, din porumb Bt/bssyn/. Această figură arată că secvența de genă PMONBT se potrivește cu secvența de genă nativă CrylA(b) la aproximativ 1453 din 1845 de nucleotide (omoloagă aproximativ 79%), în timp ce gena sintetică îmbunătățită, din porumb Bt CrylA(b), fragmentată, se potrivește cu gena nativă CrylA(b) la aproximativ 1209 din 1845 de nucleotide (omoloagă aproximativ 66%);

- fig.5, comparația între o genă sintetică CrylA(b) fragmentată descrisă în Perlak et al., PNAS USA, 88:3324-3328 (1991) /PMONBT/ și o genă sintetică îmbunătățită, din porumb Bt CiyIA(b) /bssyn/, fragmentată. Această figură arată că secvența de genă PMONBT se potrivește cu secvența de genă sintetică îmbunătățită din porumb Bt CryIA(b) la aproximativ 1410 din 1845 de nucleotide (omoloagă aproximativ 77%);

- fig.6, gena îmbunătățită din porumb CrylB, în lungime completă.

- fig.7, secvența ADN, în lungime completă, hibridă, parțial îmbunătățită, din porumb, a unei gene CiyIA(b) ce este conținută în pCIB4434. Regiunea sintetică este cuprinsă între nucleotidele 1 și 1938 (aminoacizii 1-646), iar regiunea nativă este cuprinsă între nucleoti110263 dele 1939 și 3468 (aminoacizii 6471155). Punctul de fuziune între secvențele de cedare sintetică și nativă este marcat printr-o tăietură (/) în secvență;

- fig.8, hartă a pCIB4434;

- fig.9, secvența ADN, în lungime completă, hibridă, îmbunătățită, din porumb, ce codifică o proteină termostabilă CrylA(b), conținut în pCIB5511;

- fig. 10, hartă a pCIB5511;

- fig. 11, secvență ADN în lungime completă, hibridă, îmbunătățită, din porumb, ce codifică o proteină termostabilă CrylA(b), conținută în pCIB5512;

- fig. 12, hartă a pCIB5512;

- fig. 13, secvența ADN, în lungime completă, îmbunătățită, din porumb, ce codifică o proteină termostabilă CrylA(b), conținută în pCIB5513;

- fig. 14, hartă a pCIB5513;

- fig. 15, secvență ADN, în lungime completă, îmbunătățită, din porumb, ce codifică o genă termostabilă CryLA(b), conținută în pCIB5514;

- fig. 16, hartă a pCIB5514;

- fig. 17, hartă a pCIB4418;

- fig. 18, hartă a pCIB4420;

- fig. 19, hartă a pCIB4429;

- fig.20, hartă a pCIB4431;

- fig.21, hartă a pCIB4428;

- fig.22, hartă a pCIB4430;

- fig.23A, tabelul conținând date privind nivelurile de proteină CryLA(b), la porumbul transgenic;

- fig.23B, tabelul ce însumează rezultatele testelor biologice, pentru Ostrinia și Diatraea, pe frunza descendenților de porumb, ce conține o genă îmbunătățită din porumb CiylA(b);

- fig.23C, tabelul ce conține date privind nivelurile de proteină CryIA(b), la porumbul transgenic;

- fig.23D, tabelul care însumează rezultatele testelor biologice, pentru Ostrinia și Diatraea, pe frunza descendenților de porumb, ce conține o genă sintetică din porumb Bt, legată operațional de un promotor pentru măduvă;

- fig.23E, tabelul ce conține date despre exprimarea genei CiyLA(b) la porumbul transgenic, utilizând promotorul cu atinitate pentru măduvă;

- fig.24, secvență ADN, cu genom complet, a unei subunități genice de triptofan-sintetază din porumb. Sunt figurați introni, exoni. inițiatori de transcripție și translație, inițierea și oprirea ADNc. S = inițierea și sfârșitul ADNc; + 1 = inițierea transcripției; 73 = declanșator de extensie; +1 = inițierea translației; + + + = codon de oprire; bp 1495-99 = caseta CCAAT; bp 15931598 = caseta TATAA; bp 3720-3725 — situs de poli A adiție; nr. de sub secvențele subliniate reprezintă declanșatori PCR;

- fig.25A, 25B, 25C și 25D, teste Northern biol, care arată exprimări diferite ale subunității genice, din porumb TrpA, la țesuturile porumbului, la 2 h, 4 h, 18 h și 48 h, la -80°C, cu ecrane amplificatoare DuPont Cronex. P — măduvă; C = știulete; BR = rădăcini secundare; ES = panicul; LP = măduvă inferioară; MP = măduvă mijlocie; UP = măduvă superioară; S = sămânță; L = frunză; R = rădăcină; P (stânga sus) — măduva în totalitate;

-fig.26, testul Horthem bloț ale cărui două intervale din stânga arată exprimarea genei din porumb TrpA, în frunza (L) și măduva (P), liniilor Funk 211D și 5N984. Cele cinci intervale din dreapta indică absența exprimării ARN total în sămânța Funk 211D. S( 1,2,3,4 și 5) = sămânța la 1,2,3,4 și 5 săptămâni după polenizare. L= frunza; P = măduva; S = nr.sămânța la nr. de săptămâni după polenizare;

- fig.27, testul Seuthem blot, al liniei Funk 211D de ADN genomic, probat cu ADNc 8-2 TrpA din porumb (pCIB5600), în care B desemnează BamHI, E desemnează EcoRI, EV desemnează EcoRV, H desemnează HINDIII iar S desemnează SacLlx, 5x și lOx desemnează copii echivalente de gene reconstruite;

- fig.28A, testul de declanșare a extensiei care arată inițierea transcripției subunității genice TrpA din porumb și treptele consecutive. Intervalul +1 și +2 sunt mostre lx + 0,5x ale reacției de declanșare a extensiei;

- fig,28B, testul de protecție RNazică de la 72 bp la +387 bp, la temperaturi de maleabilizare de 42°C, 48°C și 54°C, la o expunere de 16 h, împotriva formării peliculei, la - 80°C, cu ecrane amplificatoare DuPont Cronex;

- fîg.29, hartă a clonei ADNc originale Tip II cu specificitate pentru polen. Este ilustrată subclonarea celor trei fragmente EcoRI în vectori pBluescript, pentru a realiza pCIB3168, pCIB3169 și ΙΤ6;

- fig.30, secvența ADN a genei ADNc pentru proteinkinaza calciu - dependentă cu specificitate pentru polen, din porumb, așa cum se găsește în fragmentele 1,0 kb și 0,5 kb ale clonei ADNc Tip II originale. Este ilustrat situsul EcoRI care împarte fragmentele 1,0 kb și 0,5 kb. Acest ADNc nu este în lungime totală, deoarece situsul de inițiere ARNm trasează 490 bp în amonte de capătul clonei ADNc;

- fig.31, ilustrează exprimarea, cu specificitate pentru țesuturi, a ARNm CDPK din polen. ARN din țesuturile 21 ID din porumb indicate a fost denaturat, supus electroforezei pe gel de agaroză, transferat pe nitroceluloză și testat cu fragmentul 0,5 kb de ADNc CDPK din polen. ARNm este detectabil doar în polen, unde se observă un semnal puternic;

- fig.32, comparație de secvențe de aminoacizi, dintre secvența proteică CDPK derivată din polen și secvența proteică de proteinkinază 2 de la șobolani, descrisă în Tobimatsu și al., J. BioLChem., 263:16082-16086 (1988). Pentru evaluarea secvențelor s-a folosit programul Align al programului software star ADN. Omologia cu proteinkinazele apare la 5’, la două treimi din genă, adică la fragmentul 1,0 kb;

- fig.33, comparație de secvențe de aminoacizi, dintre secvența proteică, derivată CDPK din polen și secvența proteică a calmodulinei umane descrisă în Fischeret al., J.BioLChem., 263:1705517062 (T9S8). Omologia cu calmodulina apare la 3‘. la o treime din genă, adică la fragmentul 0,5 kb;

- fig.34, comparația de secvențe de aminoacizi, dintre secvența proteică derivată CDPK din polen și CDPK din soia. Omologia survine de-a lungul întregii gene;

- fig.35, secvența genei CDPK cu specificitate pentru polen din porumb. Este figurată 1,4 kb din secvența ce precede situsul de inițiere ARNm. Pozițiile celor șapte exoni și șase introni sunt descrise sub secvența ADN corespunzătoare. Este indicat situsul de poliadenilare în clona ADNc;

- fig.36, hartă a pCIB4433;

- fig.37, secvență ADN îmbunătățită din porumb, hibridă, în lungime totală, ce codifică o proteină termostabilă CrylA(b);

- fig.38, hartă a pCIB5515.

Secvența 1 este secvența ADN a unei gene Bt CrylA(b) native în lungime completă.

Secvența 2 este secvența ADN a unei gene pure Bt CrylA(b) sintetice, îmbunătățite din porumb în lungime completă.

Secvența 3 este secvența ADN a unei gene Bt CryLA(b) sintetice, îmbunătățite din porumb, într-un fragment de aproximativ 2 kb.

Secvența 4 este secvența ADN a unei gene Bt CiyIA(b) sintetice, îmbunătățite din porumb, în lungime completă.

Secvența 5 este secvența ADN a unei gene Bt sintetice conform cu Perlak et al., într-un fragment de aproximativ 2 kb.

Următoarele definiții sunt prezentate în scopul aducerii de clarificări în legătură cu termenii, așa cum sunt ei folosiți în descriere și revendicări, pentru descrierea invenției de față.

Codon preferențial din porumb. Codonul preferențial se referă la preferința arătată de o anumită celulă-gazdă specifică în folosirea codonilor de nucleotide pentru specificarea unui aminoacid determinai. Codonul preferențial pentru aminoacid într-o gazdă anumită este singurul codon care cel mai frecvent <odiiiv.ă acel aminoacid în acea gazdă. Codonul preferențial din porumb, pentru un aminoacid anumit, poate deriva din secvențe de gene cunoscute din porumb. De exemplu, utilizarea codonului din porumb, pentru 28 gene din plantele de porumb, este clasificată în Murray et ai., Nucleic Acids Research. 17:477-498 (1989). De exemplu, codonul preferențial din poitiiid) penhu alanină esle GCC întrucât, conform secvențelor alăturate <i 26 uc gene din porumb în Murray et al., t>upra, acel codon codifică alanina în 36% din situații, comparativ cu GCG (24%), GCA (13%) și GCT (27%).

Secvență pură îmbunătățită din porumb. O genă îmbunătățită sau secvență ADN se referă la o genă Ia care secvența de nucleotide a unei gene native a fost modificată în scopul utilizării de codoni preferențiali pentru porumb. De exemplu, o genă Bt CrylA(b) sintetică, îmbunătățită din porumb, a fost modificată astfel, încât codonii folosiți sunt codoni preferențiali din porumb, așa cum au fost descriși anterior. O genă pură îmbunătățită din porumb este aceea la care secvența de nucleotide cuprinde 100% secvențe de codoni preferențiali din porumb pentru un polipeptid anumit De exemplu, gena Bt CrylĂ(b) îmbunătățită din porumb este aceea la care secvența de nucleotide cuprinde 100% secvențe de codoni preferențiali și care codifică un polipeptid cu aceeași secvență de aminoacizi ca și aceea produsă de către gena BtCiyIA(b) nativă. Secvența pură de nucleotide a genei îmbunătățite poate fi variată pentru a permite manipularea genei, de exemplu modificarea unei nucleotide pentru a crea sau elimina situsuri restrictive. Secvența pură de nucleotide poate fi, de asemenea, variată pentru a elimina situsuri de prelucrare potențial nocive, cum ar fi situsuri potențiale de poliadenilare sau situsuri de recunoaștere a intronilor.

Se cunoaște faptul că se poate folosi și expresia secvențe parțiali îmbunătățite din porumb. Prin parțial îmbunătățite din porumb se înțelege faptul că regiunea de codare a genei este himerică (hibridă), fiind compusă din secvențe derivate dintr-o genă insecticidă nativă și din secvențe ce au fost îmbunătățite pentru a se exprima la porumb. O genă parțial îmbunătățită exprimă proteina insecticidă la un nivel suficient pentru a controla acțiunea dăunătoare a insectelor, iar această exprimare este la un nivel mai mare decât cel atins prin folosirea doar a secvențelor native. Secvențele parțial îmbunătățite din porumb sunt reprezentate de cele care dețin cel puțin 5% secvențe îmbunătățite.

Gene Bt în lungime completă. Se referă la secvențele ADN ce cuprind secvența completă de nucleotide necesară pentru codificarea polipeptidului produs dc o genă Bt nativă. De exemplu, gena Bt CryIA(b) nativă are lungimea de 3,5 kb și codifică un polipeptid cu lungime de aproximativ 1150 aminoacizi. O genă CrylA(b) Bt sintetică în lungime completă va avea o lungime de cel puțin 3,5 kb.

Gene Bt fragmentate. Se referă la secvențele de ADN ce cuprind mai puțin decât secvența completă de aminoacizi necesară pentru a codifica polipeptidul produs de o genă Bt nativă, dar care codifică porțiunea de toxină activă a polipeptidului. De exemplu, o genă Bt sintetică fragmentată de aproximativ 1,9 kb codifică porțiunea de toxină activă a polipeptidului, astfel încât produsul proteic are activitate insecticidă.

Promotor cu afinitate pentru țesuturi. Termenul promotor cu afinitate pentru țesuturi este folosit pentru a desemna faptul că o anumită secvență ADN reglatoare va promova un nivel mai crescut de transcripție al unei gene structurale asociate sau secvență ADN de codare sau un nivel mai crescut de exprimare a produsului genei asociate, așa cum arată orice test convențional pentru ARN sau proteine, sau pentru a desemna faptul că o anumită secvență ADN va avea un efect diferit: anume faptul că transcripția secvențelor ADN asociate sau exprimarea unui produs genic este mai mare într-un țesut decât în toate celelalte țesuturi ale plantei.

Promotor cu specificitate pentru țesuturi. Este folosit pentru a desemna faptul ca o anumită secvență ADN reglatoare va promova transcripția unei secvențe ADN Je codare asociate, în întregime în unui sau mai multe țesuturi ale plantei, sau într-un tip de țesut, de exemplu țesut verde (tânăr), în timp ce în toate celelalte țesuturi sau tipuri de țesuturi ale plantei nu seva produce transcripția acelei secvențe ADN de codare asociate.

Invenția de față realizează secvența ADN îmbunătățite pentru exprimare la plante, în special la porumb. într-o alcătuire preferată a invenției de față, secvențele ADN codifică producerea unei toxine insecticide, de preferat un polipeptid ce prezintă secvența de aminoacizi a unei toxine proteice cristaline insecticide produsă în mod normal de Bacillus thuringiensis. Gena sintetică poate codifica o proteină insecticidă fragmentată sau în lungime completă. Sunt preferate mai ales secvențele ADN sintetice care codifică un polipeptid eficace împotriva insectelor din ordinul Lepideptera și Coleoptera și secvențele ADN sintetice care codifică un polipeptid ce are o secvență de aminoacizi similară ca o secvență a toxinelor proteice kurstaki HD-1.

Invenția de față realizează secvența ADN sintetice eficace în producerea unei exprimări înalte a proteinelor insecticide active la plante, de preferat la protoplasti de porumb, celule vegetale și plante. Secvențele ADN sintetice din invenția de față au fost modificate pentru a semăna cu o genă din porumb în ceea ce privește utilizarea codonului și conținutul de G+C. Ca rezultat al acestor modificări secvențele ADN sintetice din lo invenția de față nu conțin situsurile de prelucrare potențiale care sunt prezente în gena nativă. Secvențele sintetice de ADN rezultate (secvențe de codare BtPI sintetice) și vectorii de transformare ai plantei ce conțin această secvență ADN sintetică (gena BtPI sintetice) determină creșterea surprinzătoare a exprimării genei BtPI sintetice, în comparație cu gena BtPI activă, în ceea ce privește producerea proteinei insecticide la plante, în particular porumb. Nivelul ridicat de exprimare la celulele și plantele de porumb se concretizează prin apariția rezistenței acestora la insecte lepidoptere, în mod special la dăunătorul porumbului european și la Diatrea saccharalis, dăunătorul trestiei de zahăr.

Secvențele ADN sintetice din invenția de față sunt proiectate să codifice proteine insecticide din Bacillus thuringiensis, dar sunt îmbunătățite pentru a se exprima la porumb, în ceea ce privește conținutul de G+C și utilizarea codonului. De exemplu, tabelul de utilizare a codonului din porumb, descris în Murray et al., supra., este folosit pentru revers-translația secvenței de aminoacizi a toxinei produse de gena Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 CiyLAțb), folosint doar codoni preferențiali din porumb. Secvența ADN reverstranslatată este considerată drept secvența pură îmbunătățită din porumb și este figurată ca secvența 4. Această secvență este apoi modificată pentru eliminarea situsurilor endonucleazice restrictive nedorite și pentru realizarea situsurilor endonucleazice restrictive dorite. Aceste modificări sunt realizate în scopul facilitării donării genei fără a altera apreciabil utilizarea codonului sau secvența îmbunătățită din porumb. In timpul donării, în scopul facilitării donării genei, se realizează alte modificări într-o regiune ce este în mod particular susceptibilă la erori induse în timpul donării de către reacția lanțului polimerazic (PCR). Secvența finală a genei BtPI sintetice îmbunătățite de porumb este figurată în secvența 2. O comparație a genei BtPI sintetice îm bunătățite, de porumb cu gena Bl CiylA(b) kurstaki nativă este arătata în fig.l.

Intr-o alcătuire preferată a invenției de față, proteina produsă de secvența ADN sintetică este eficientă împotriva insectelor din ordinul Lepidoptera sau Coleoptera. într-o alcătuire și mai avantajoasă, polipeptidul codificat de secvența ADN sintetică constă în esență din secvența de aminoacizi, în lungime completă sau fragmentată, a unei proteine insecticide produse în mod normal de Bacillus thuringiensis var. kurstaki IID-l. într-oalcătuire particulară secvența ADN sintetică codifică un polipeptid ce constă în esență dintr-o secvență de aminoacizi fragmentată din proteina Bt CrylA(b).

Proteinele insecticide din invenție sunt exprimate la o plantă într-o cantitate suficientă pentru a controla acțiunea dăunătoare a insectelor, adică nivele de control ale insectelor. Se recunoaște faptul că nivelul exprimării proteinelor insecticide la o plantă, necesar pentru a stăpâni insectele poate varia în funcție de specia plantei, tipul insectei, factori de mediu. în general, populația de insecte va fi menținută sub pragul economic care este variabil de la o plantă la alta. De exemplu, pentru a controla dăunătorul european al cerealelor la porumb, pragul economic este de 5 grupuri de ouă/plantă, ceea ce reprezintă aproximativ 10 larve/plantă.

Procedeele invenției sunt folositoare pentru a controla o largă varietate de insecte, ce include dar nu este limitată Ia viermi de rădăcină, viermi scurți, viermi armați, în particular viermi de toamnă și de sfeclă, viermi subțiri, afide, dăunători de cereale, în mod particular, dăunători europeni ai cerealelor, dăunători ai trestiei de zahăr, mai puțin dăunătorul tulpinii de cereale, dăunătorul sud-vestic al cerealelor etc.

într-o alcătuire preferată a invenției de față secvența sintetică ADN de codare îmbunătățită pentru exprimarea la plante cuprinde un procent de G+C mai mare decâtacela al genei CrylA(b) native. Este de preferat ca procentul de G+C să fie cel puțin 50%, și mai bine cel puțin

60%. In mod special, este de preferat un procent dc aproximativ 64% G+C.

într-o altă alcătuire preferată a invenției de față, secvența sintetică ADN de codare îmbunătățită pentru exprimarea la porumb cuprinde o secvență de nucleotide ce are o omologie de cel puțin '*()'< cu secvența pură dc nucleotide îmbunătățită pentru porumb din proteina CrylA(b) nativă dhxBacillus thuringiensis. și mai bine o omologie de cel puțin 95%, cel mai bine fiind cel puțin 98%.

Alte alcătuiri preferate ale invenției dc fața includ secvențe aDN sintetice care au în esență secvența ADN a secvenței ID nr.4, ca și mutante sau variante ale acesteia; vectorii de transformare cuprind în esență secvența ADN a secvenței ID nr.4; și secvențe ADN izolate derivate din plasmidele pCIB4406. pC.IB4407, pCIB4413, pCIB4414, pCIB4416, pCIB4417, pCIB4418, pCIB4420. pCIB4421, pCIB4423, pCIB4434, pCIB4429, pCIB4431, pClB4433. Cele mai preferate sunt secvențele ADN izolate derivate din plasmidele pCIB4418 si pCIB4420, pCIB4434, pCIB4420, pCIB4431 si pCIB4433.

în scopul realizării uneia din secvențele ADN îmbunătățite, de porumb, din invenția de față, se realizează oligonucleotide ADN sintetice cu lungime medie de aproximativ 80 de nucleotide. Aceste nucleotide sunt proiectate să fie hibridate pentru a produce fragmente cc cuprind diverse sectoare ale genei fragmentate a toxinei. Oligonucleotidele unui anumit sector sunt hibridate și amplificate folosind PCR. Sectoarele sunt apoi donate, iar sectoarele donate sunt trecute în revistă pentru a le găsi pe acelea ce conțin secvențele dorite. într-un caz, al patrulea sector, oligonucleotidele hibridate sunt donate direct, fără amplificare prin PCR. Odată identificate toate clonele celor patru sectoare, conținând ferestre de citire deschise, este asamblată o genă intactă ce codifică proteina insecticidă activă. Gena asamblată poate fi apoi testată pentru acțiunea insecticidă împotriva oricărei insecte de interes, incluzând dăunătorul european al cerealelor (ECB) și dăunătorul trestiei de zahăr. (Exemplele 5 A, respectiv 5B). Atunci când este obținută o genă complet funcțională, este din nou trecută în revistă pentru a-i confirma structura primară. Gena complet funcțională produce o mortalitale la 100% atunci când este testată împotriva ECB. Gena complet funcțională este deci modificată pentru a se exprima la porumb.

Gena îmbunătățită de porumb este testată într-un test de exprimare pasageră, de exemplu testul de exprimare pasageră la porumb.

Secvența nativă de codare Bt CiylA(b) pentru toxina insecticidă activă nu este exprimată la un nivel detectabil într-un sistem de exprimare pasageră la porumb. Astfel poate fi determinat nivelul de exprimare al genei sintetizate. Prin procedeul de față exprimarea unei proteine într-o plantă transformată poate fi crescută cel puțin de aproximativ 100 până la aproximativ 50000 de ori, mai exact cel puțin de aproximativ 1000 la cel puțin 20000 de ori.

Creșterea exprimării unei gene insecticide la un nivel eficient nu necesită manipularea genei native pe toată secvența. O exprimare eficientă se poate obține și prin manipularea doar a unei porțiuni a secvenței, necesară pentru a obține exprimare crescută. Poate fi realizată o genă CrylA(b) îmbunătățită, din porumb, în lungime completă, ce conține o proteină din secvența nativă CiylA(b). De exemplu, fig.7 ilustrează o genăCiyIA(b) îmbunătățită din porumb, de lungime completă, care este un hibrid nativ-sintetic. Aceasta înseamnă că aproximativ 2 kb din genă (nucleotidele 11938) este îmbunătățită din porumb, adică este sintetică. Partea rămasă, nucleotidele C - terminale 647-1155 sunt identice cu secvența nativă corespondentă a genei CrylA(b). Gonstrucția genei ilustrate este descrisă în exemplul 6, mai departe.

Se recunoaște faptul că prin folosirea procedeelor descrise aici pot fi construiți și testați, pentru exprimare, variați hibrizi sintetici/nativi. Aspectul important al construcției hibrizilor este faptul că proteina este produsă în cantități suficiente, pentru a stăpâni distrugerea produsă de insecte. în acest caz, pot fi identificate regiunile critice ale genei și sintetizate, folosind codoni preferențiali. Secvențele sintetice pot fi legate de secvențe native, așa cum se demonstrează în exemplele care urmează. în general, porțiunile N-terminale sau situsurile de prelucrare pot fi sintetizate și substituite în secvența nativă de codare pentru exprimare crescută la plante.

într-o altă alcătuire a invenției de față, genele îmbunătățite din porumb ce codifică proteina CrylA(b) pot fi manipulate pentru a face proteina codificată mai stabilă la căldură (termostabilă) în comparație cu proteina nativă CrylA(b). S-a demonstrat că gena CrylA(b) găsită în Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 conține o lipsă prin deleție de 26 aminoacizi, atunci când este comparată cu proteinele CrylA(a) și CrylA(c), la nivelul jumătății - COOH a proteinei. Această deleție conduce la o proteină CryIA(b) termosensibilă. A se vedea Geiser, EP 0410581, cu titlul Toxinele din Bacillus thuringiensis termostabile. Repararea acestei deleții cu regiunea corespunzătoare din proteina CrylA(a) sau CrylA(c) îmbunătățește termostabilitatea proteinei refăcute. Construcția genei sintetice CrylA(b) modificate, în lungime completă, este astfel proiectată, încât să insere secvențele de codare pentru aminoacizii care lipsesc la locurile potrivite din secvență, fără a altera fereastra de citire și fără a modifica restul secvenței de proteină. Versiunea sintetică în lungime completă a genei este asamblată prin sinteza unei serii de casete ADN dublu-catenar, fiecare având di110263 mensiunede aproximativ 300 bp, folosind tehnici standard de sinteză ADN și reacții enzimalice. Gena refăcută se presupune că va modifica o proteină CrylA(b) stabilă la căldură sau termostabilă, în-lrucât păstrează o activitate biologică mai mare decât corespondența sa nativă, atunci când este expusă la temperaturi mari. Secvențele specifice din porumb î mbu-nătățit, genele termostabile CrylA(b) care codifică proteine termostabile sunt explicate în fig.9, 11, 13 și 15 și suni, de asemenea, descrise în exemplul 7 de mai jos.

Invenția de lață cuprinde secvențe de codare îmbunătățite din porumb, care codifică alte polipeptide, inclusiv cele ale altor polipeptide insecticide din Bacillus thuringiensis sau proteine insecticide din alte surse. De exemplu, genele CrylB pot fi îmbunătățite din porumb, și apoi introduse stabil în plante, de preferat porumb. Secvența unei gene CrylB îmbunătățită din porumb, construită conform invenției de față, exte explicată în fig.6, îmbunătățirea unei gene BtPI pentru exprimare la porumb, pe baza utilizării codonului preferențial din porumb, conform invenției de față, conduce Ia creșterea semnificativă a exprimării genei insecticide. Se prefigurează faptul că alte gene pot fi sintetizate, folosind preferențialitatea codonilor din plante, pentru a le îmbunătăți exprimarea la porumb sau alte plante. Folosirea preferențialității porumbului pentru codoni este un procedeu posibil pentru îmbunătățirea și maximizarea exprimării genelor străine la porumb. Astfel de gene includ genele folosite ca markeri selectabili sau înregistrabili în transformarea porumbului, genele care conferă rezistență la ierbicide, genele care conferă rezistență la boli și alte gene care conferă rezistență la insecte.

Gena sintetică CiyIA(b) este, de asemenea, inserată în vectori de Agrobacterium, care sunt utili pentru transformarea unei mari varietăți de specii de plante dicotiledonate (exemplul 44).

Plantele stabil transformate cu vectori sintetici CrylA(b) de Agrobacterium au activitate insecticidă.

Gena nativă Bl CrylA(b) este foarte bogată în A+T conținutul de G+C al genei native Bt CrylA(b) în lungime completă este de aproximativ 39%. Conținutul de G+C al genei native Bt CrylA(b) fragmentate în lungime de aproximativ 2 kb este de aproximativ 27%. In general, regiunile de codare din porumb tind să fie bogate predominant în G+C. Modificările aduse genei Bl CiylA(b) conduc la o regiune dc codare PI sinteticei care are un conținut mai mare de 50% de G+C, și are omologie de aproximativ 05% la nivel de ADN, cu gena nativă CrylA(b). Proteina codificată de această genă sintetică CrylA(b) este 100% omoloagă cu proteina nativă și ca urmare păstrează funcția completă în ceea ce privește activitatea insecticidă. Gena sintetică CryIA(b) PI fragmentată are lungimea de aproximativ 2 kb, iar gena codifică regiunea toxic activă a proteinei insecticide native Bt kurstaki CiylAțb). Lungimea proteinei codificate de către gena sintetică CrylA(b), fragmentată, este de 648 aminoacizi.

Genele sintetice, din invenția de față, sunt utile pentru creșterea exprimării la plante transgenice, de preferat la porumb transformat Plantele transgenice din invenția de față pot fi folosite pentru exprimarea proteinei insecticide CrylA(b) la un nivel înalk rezultând rezistență la distrugerea produsă de insecte, de preferat insecte lepidoptere și coleoptere și mai ales dăunătorul european al cerealelor (ECB) și dăunătorul trestiei de zahăr.

în invenția de față, secvența ADN de codare a genei sintetice, îmbunătățite din porumb, poate fi sub controlul elementelor reglatoare, cum ar fi promotori care direcționează exprimarea secvenței de codare. Astfel de elemente reglatoare, de exemplu, includ promotori funcționali de monocotiledonate sau porumb și alte monocotiledonate pentru a realiza expri110263 marea genei în părți diferite ale plantei de porumb. Elementul reglator poate li constitutiv. Aceasta înseamnă că poate promova exprimarea continuă §i stabilă a genei. Astfel de promotori includ, dar nu sunt limitați la promotorul CaMV 35S, promotorul CaMV 19S, promotorul din A. tumefaciens, cum ar fi promotori de octopin - sintetază, manopin - sintetază, nopalin - sintetază sau alte opin sintetaze; promotori de ubicvinină, actină, histonă și tubulină. Elementul regulator poate fi un promotorcu afinitate pentru țesuturi, ceea ce înseamnă că poate promova o exprimare mai înaltă în unele țesuturi ale unei plante decât în celelalte. De preferat, promotorul cu afinitate pentru țesuturi poate direcționa exprimarea genei sintetice la frunze, trunchi, rădăcini și/sau polen, dar nu la sămânță. Elementul regulator poate fi, de asemenea, influențat prin stres termic, stres- hidric, lirănirea insectelor sau inducție chimică, sau poate avea extindere stabilizată. Se cunosc din literatură numeroși promotori a căror exprimare variază într-o manieră specifică țesutului. Un astfel de exemplu este fosfoenolpiruvat-carboxilaza (PEPC) din porumb, care are specificitate pentru țesutul verde (tânăr). A se vedea, ca exemplu Hudspeth, R.L. and Gruia, J.W.Plant Molecular Biology 12:579-589, (1989). Alți promotori cu specificitate pentru țesut tânăr includ proteine de legare a clorofilei a/b și promotori RubisCO cu subunități mici.

Invenția de față cuprinde și promotori cu afinitate pentru măduvă izolați și purificați. Promotorii cu afinitate pentru măduvă preferați sunt izolați din graminacee monocotiledonate, cum ar fi trestia de zahăr, orez, grâu, sorg, orz, secară și porumb; mai preferați sunt cei izolați din plantele de porumb.

într-o alcătuire preferată, promotorul cu afinitate pentru măduvă, este izolat dintr-o genă vegetală TrpA; într-o alcătuire mai avantajoasă este izolat dintr-o genă din porumb TrpA. Aceasta înseamnă că promotorul, în stare nativă, este operațional asociat cu o subunitate genică triptofan alfa - sintetază (notată aici TrpA). Proteina codificată are o masă moleculară de aproximativ 38 KD. împreună cu o altă subunitate alfa și două subunități beta, TrpA formează o enzimă multimerică, triptofansintetaza. Fiecare subunitate poate opera separat, dar funcționează mai eficient împreună. TrpA catalizează conversia indol-glicerol-fosfatului în indol. Nici gena din porumb TrpA, nici proteina codificată nu au mai fost izolate din nici o plantă. Subunitatea genică este de triptofan-sintetază din Arabiclopsis thaliana a fost donată conform descrierii lui Wright et al., The Plani Cell, 4:711-719 (1992). în cazul genei din porumb TrpA nu există omologie cu subunitatea beta ce codifică gena.

Invenția de față realizează, de asemenea, promotori cu specificitate pentru polen purificați, ce se pot obține dintr-o genă vegetală pentru fosfatkinaza calciudependentă (CDPN). Aceasta înseamnă că, în stare nativă, promotorul este legat operațional la o genă vegetală pentru CDPK într-o alcătuire preferată, promotorul este izolat dintr-o genă din porumb pentru CDPK Prin specificitate pentru polen se înțelege faptul că exprimarea unei gene structurale, asociată operațional de interes, este exclusivă (adică în întregime) la nivelul polenului unei plante și este neglijabilă în toate celelalte părți ale plantei. Prin CDPK se înțelege o proteinkinază vegetală care are mare afinitate pentru calciu, dar nu calmodulină, și care necesita calciu, dar nu calmodulină, pentru activitatea sa catalitică.

Pentru a obține promotori cu afinitate pentru țesuturi sau cu specificitate pentru țesuturi se pot obține gene ce codifică ARN mesager (ARNm) cu specificitate pentru țesuturi, prin triajul diferențial al unui fișier ADNc. De exemplu, un ADNc cu afinitate pentru măduvă se poate obține supunând un fișier ADNc din măduvă unui triaj diferențial, folosind probe de

ADNc obținute din ARNm din măduvă și sămânță. A se vedea, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrock et al eds. Cold Spring Harbor Press: New

York (1989).

Ca alternativă promotorii cu specificitate pentru țesuturi pot fi realizați prin obținerea de proteine cu specific de țesut, trecerea în revistă a N-terminațiilor, sintetizarea probelor de oligonucleotide și folosirea probelor pentru triajul unui fișier ADNc. Asemenea procedee sunt exemplificate mai departe pentru izolarea unui promotor specific pentru polen.

Domeniul invenției de față, în ceea ce privește promotorii cu afinitate pentru măduvă și cu specificitate pentru polen, cuprinde fragmente active funcțional dintr-un promotor în lungime completă, fragmente ce sunt totuși capabile să direcționeze transcripția genelor structurale asociate din punct de vedere al afinității pentru măduvă și al specificității pentru polen. Fragmentele funcțional active dintr-o secvență de ADN promotor pot deriva dintr-o asemenea secvență de ADN promotor prin câteva metode cunoscute în literatura de specialitate, cum ar fi desfacerea secvenței de ADN promotor cu ajutorul enzimelor restrictive sau sinteza, conform secvenței de ADN promotor sau pot fi obținute prin utilizarea tehnologiei PCR. A se vedea, de exemplu Mullis et al., Math.Enzymol, 155:335-350 (1987); Erlich (ed), PCR Technology, Stockton Press (New York 1989).

în domeniul invenției de față sunt incluși și promotorii cu afinitate pentru măduvă și cu specificitate pentru polen echivalenți promotorilor în lungime completă. Aceasta înseamnă că diverse nucleotide sau grupuri de nucleotide pot fi modificate, alăturate, sau descrise într-un mod care nu abolește activitatea de promotor, conform metodelor cunoscute.

în fig.24 este ilustrat un promotor cu afinitate pentru măduvă obținut dintr-o genă TrpA din porumb. Specialiștii din domeniu, având cunoștința acestei sec26 vențe, vor recunoaște că promotorii cu afinitate pentru măduvă, incluși în domeniul invenției de față, pot fi obținuți din alte plante, testând fișierele de măduvă din aceste plante cu probe derivate din gena structurală TrpA, din porumb. Sunt preferate probe realizate din secvențe ce sunt înalt conservate printre subunitățile genice TrpA de la variate specii, așa cum este discutat, în general, în exemplul 17. Alți promotori cu specificitate pentru polen, care în starea lor nativă sunt legați de gene CDPK de la alte plante decât porumbul, pot fi izolați într-un mod similar folosind probe derivate din regiunile conserva te ale genei CDPK de porumb, pentru testarea fișierelor de polen.

Intr-o altă alcătuire a invenției de față, promotorul cu afinitate pentru măduvă sau cu specificitate pentru polen este legat operațional de o secvență ADN, adică de o genă structurală ce codifică o proteină de interes, pentru a forma o moleculă de ADN recombinat sau genă himerică. Fraza legat operațional de are un înțeles cunoscut în literatura de specialitate; poate fi folosită la schimb cu asociați operațional cu legată la sau fuzionată cu.

Gena structurală poate fi omoloagă sau heteroloagă în ceea ce privește originea promotorului și/sau o plantățintă în interiorul căreia este transformată. Indiferent de originea relativă, secvența ADN asociată va fi exprimată în planta transformată, conform cu proprietățile de exprimare ale promotorului, de care este legată. Astfel, alegerea secvenței ADN asociate trebuie să decurgă din dorința de a avea secvența exprimată în acest mod. Exemplele de secvențe ADN heteroloage includ acele secvențe care codifică proteine insecticide, de exemplu proteine sau polipeptide toxice ori inhibitoare, pentru insecte sau alte artropode parazite la plante, sau patogeni ai plantelor, cum sunt fungi, bacterii și nematode. Aceste secvențe ADN heteroloage codifică proteine, cum ar li magainine, Zasloff, PNAS USA. 84:5449-5453 (1987); secropine, Hultmark et al., EurJ.Biochem. 127:207-217 (1982); attacine, Hultmark et al., EMBO J. 2:571-576 (1983); melittina, gramicidina S, Kalsu et al. Biochem. Biophys Acta, 939:57-63 (1988); proteine ale canalelor de sodiu și fragmente sintetice, Oiki et al., PNAS USA, 85:2395-2397 (1988); toxina alfa din Slaphylylococus aureus, Tobkes et al., Biochem., 24:1915-1920 (1985) apolipoproteine și fragmente din acestea, Knott et al., Science, 230:37 (1985); Nakagawa et al., J.Am. Chem.Soc., 107:7087 (1985); alameticină și o varietate de proteine amfipatice sintetice, Kaiser et al., Am.Rev.Biophys. Chem., 16:561-581 (1987); lecitine, Lis et al., Arn.Rev.Biochem., 55:35-68 (1986); proteaze și inhibitori de amilază; și proteine insecticide din Bacillus thuringiensis, în mod special deltaendotoxina din B. thuringiensis și din alte bacterii sau fungi.

într-o alcătuire preferată a invenției, un promotor cu afinitate pentru măduvă obținut dintr-o subunitate genică TrpA din porumb, legată operațional de o secvență ADN heteroloagă ce codifică o proteină insecticidă (B.t) din Bacillus thuringiensis. Aceste proteine și genele structurale corespunzătoare sunt bine cunoscute în domeniu. A se vedea Hofte și Whiteley, Microbiol. Reviews, 53:242255 (1989).

Deși este recunoscut că poate fi utilizat orice promotor capabil să direcționeze exprimarea, ar fi preferabil să se folosească promotori heterologi, mai degrabă decât promotorul nativ al proteinei de interes. în acest fel se pot construi secvențe de nucleotide himerice, lucru ce se stabilește în funcție de planta ce va fi transformată ca și de acțiunea dăunătoare, a insectei. De exemplu pentru a stăpâni acțiunea dăunătoare a insectelor la porumb, un promotor din monocotiledonat sau porumb poate fi legat operațional la o proteină Bt Promotorul din porumb poate fi ales dintre promotorii cu afinitate pentru țesuturi și cu speci licitate pentru țesuturi, cum ar fi promotorii cu afinitate pentru măduvă și cu speciticitate pentru polen, așa cum a fost descris în prezenta lucrare.

în anumite situații, ar fi de preferai să se trnasforme celula vegetală cu mai mult de o construcție genică himerică. Astfel, de exemplu, o singură plantă poate fi transformată cu un promotor cu afinitate pentru măduvă legat operațional de o proteină Bt ca și cu un promotor cu specificitate pentru polen legat operațional dco proteină Bt Plantele transformate vor exprima proteinele Bt în măduva și polenul plantei și într-o măsură mai mică în rădăcini, tulpina exterioară și rădăcini secundare.

Din diverse alte motive. în special controlul potențialei rezistențe a insectelor, dezvoltată la proteinele insecticide exprimate în plantă, este avantajos să se exprime mai mult de o proteină insecticidă (PI) la aceeași plantă. Se pot exprima două gene, diferite (cum ar fi două dc/fiz-endotoxine diferite derivate din Bacillus thuringiensis, care se leagă la receptori diferiți în intestinul mijlociu al insectei - țintă) în aceleași țesuturi, sau se pot exprima selectiv cele două toxine în țesuturi diferite ale aceleiași plante folosind promotori cu specificitate pentru țesuturi. Exprimarea a două gene Bt (sau a oricăror două gene insecticide) la aceeași plantă, folosind trei promotori cu specificitate pentru țesuturi diferiți, prezintă o problemă pentru producerea unei plante ce exprimă fenotipul dorit. Trei promotori diferiți determinând două gene diferite, produc șase gene insecticide diferite, care necesită introducerea în interiorul plantei în același timp. Este necesar, de asemenea, pentru transformare, un marker selectabil ca ajutor în identificarea plantelor transformate. Aceasta presupune introducerea a șapte gene diferite în interiorul plantei, în același timp. Cel mai de dorit este ca toate genele, în mod special genele insecticide, să se integreze în genomul plantei în același locus, pentru a se comporta ca o singură genă și nu ca o genă multiplă, lucru care ar fi greu de urmărit în cursul multiplicării hibrizilor comerciali. Numărul total de gene poate li redus prin folosirea exprimării diferențiale cu specificitate pentru țesuturi, a diferitelor proteine insecticide.

De exemplu, prin fuzionarea CrylA(b) cu promotorii pentru polen și PEP carboxilază, se va obține exprimarea acestei gene în țesuturile tinere și polen, f uzionând un promotor cu afinitate pentru măduvă cu dc/ta-endotoxina CrylB din Bucillus ihuringicnsis, se va produce exprimarea acestei proteine insecticide mai abundent în măduva plantei transformate, dar nu în țesuturile seminței. Transformarea unei plante cu trei gene, PEP carboxilaza/CryIA(b), polen/ CrylA(b) și măduvă/CrylB realizează o plantă ce exprimă două endotoxine insecticide Bt diferite, în diferite țesuturi ale aceleiași plante. CrylA(b) va fi exprimată în țesuturile exterioare ale unei plante (în particular porumb), adică în acele țesuturi din care dăunătorul european al cerealelor se hrănește prima dată după invazie. Dacă ECB se dovedește rezistent la CrylA(b) și perforează tulpina plantei, după care s-a hrănit cu țesutul frunzei și/sau polen, va întâlni ulterior de/ta-en do toxina CrylB și va fi expus celui de-al doilea compus insecticid. In acest fel, se pot exprima diferențiat două componente insecticide diferite la aceeași plantă și se poate reduce numărul total de gene necesar de a fi introdus ca o singură unitate genetică, realizând în același timp protecția împotriva dezvoltării rezistenței la un singur compus insecticid.

în același fel, o plantă poate fi transformată cu construcții ce codifică mai mult de un tip de proteină insecticidă, pentru a stăpâni insecte diferite. în acest fel, se pot realiza numeroase variații de către un specialist în domeniu.

Moleculele de ADN recombinat din invenție pot fi preparate prin manipularea diverselor elemente, pentru a le plasa în orientarea adecvată. Astfel, se pot folosi adaptori sau linkeri pentru a alătura fragmentele ADN. Pot fi realizate și alte manipulări pentru a determina situsuri de restricție convenabile, pentru a îndepărta situsuri de restricție sau ADN de prisos. Aceste manipulări pot fi realizate prin procedee consacrate în domeniu. A se vedea, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboraîoiy Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ediția a doua, 1989. De exemplu, procedee, cum ar fi restricția, citirea inversă sau completarea peste rând înapoi, pentru a realiza capete teșite, legări de linkeri, pot realiza capete complementare ale fragmentelor sau pentru alăturare și legare Ase vedea, Sambrook et al. supra.

Alte secvențe ADN funcționale pot fi incluse în molecule de ADN recombinat, în funcție de calea prin care molecula va fi incorporată în genomul plantei-țintă. De exemplu, în cazul transformării mediate prin Agrobacterium, dacă se folosește plasmide Ti sau Ri pentru a transforma celulele vegetale, marginile stângă și dreaptă ale T-ADN ale plasmidei Ti - și Ri - vor fi anexate ca regiuni marginale la caseta pentru exprimare. Transformarea plantelor mediată prin Agrobacterium tumefaciens a fost descrisă în Horsch et al., Science, 25:1229 (1986); Marton, Cell Culture Somatic Cell Genetics ofPlant, 1:514-529 (1984); Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset - Drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam. 1985, ChapterV.Fra\ey. ct n\., Crit.Rev.Plant Sci.. 4:1- 46: și An et al., EMBO J„ 4:277-284 (1985).

Moleculele ADN recombinat ale invenției pot include și o genă - marker pentru ușurarea selecției în celulele vegetale recombinate. Exemple de markeri includ rezistența la un biocid, cum ar fi antibiotice: kanamicină, higromicină, cloramfenicol, paromomicină, metotrexat și biomicină, sau ierbicide imidazolone, sulfoniluree, glifosfat, fosfinotricină sau bialafos. Genele - marker sunt bine cunoscule în domeniu.

Intr-o altă alcătuire a invenției de față, se realizează plante stabil transformate, cu ajutorul unei molecule ADN recombinat sau o genă himerică, așa cum s-a descris anterior. Plantele transgenice rezultante conțin gena transformată. stabil incorporată în genomul său și vor exprima gena structurală asociată operațional la promotor în maniera corespunzătoare.

Plantele transgenice cuprinse în această invenție includ atât mono- cât și dicotiledonate. Exemplele reprezentative includ porumb, tutun, roșii, bumbac, semințe de rapiță, soia, grâu, orez, alfalfa, cartof și floarea soarelui (și altele).

Plante preferate sunt porumbul, îndeosebi plante naturale de porumb.

Toate plantele transformate cuprinse în invenția de față pot fi produse prin câteva procedee cunoscute în domeniu. Transformarea mediată prin A.tumcfaciens a fost descrisă anterior. Alte procedee includ transferul direct al genei în protoplaști, Paszowski et al., EMBO J. 12:2717, (1984); Lorez et al., MoLGen. Sc Genet., 1199.178 (1985); Fromm et al., Nature, 319.719 (1986); bombardament cu microproiectile, Klein et al., BiotTechnology, 6:559-563 (1988); injectare în protoplaști, celule în culturi și țesuturi, Reich et al., BiolTechnology, 4:1001-1004 (1986); sau injectoare în țesuturi meristematice sau răsaduri și plante, așa cum este descris de De La Pena et al., Nature, 325:274-276 (1987); Graves et al., Plant.Mol.Biol., 7:43-50 (1986); Hooykaas- Van Slogteren et al., Nature, 34:763-764 (1984); Grimsley et al., BiojTechonology, 6:185 (1988); și Grimsley et al, Nature, 325:177 (1988); și electroporație WO 92/09696.

Tipul exprimării unei gene structurale asociată operațional cu un promotor cu afinitate pentru țesuturi sau cu specificitate pentru țesuturi din invenția de față, într-o plantă transformată ce conține aceeași genă, este periculos în cazul în care gena structurală codifică o proteină insecticidă. De exemplu, tipul exprimării cu afinitate pentru măduvă descris aici, va permite plantei transgenice să tolereze și să reziste la patogeni și ierbivore care atacă primar măduva, dar și rădăcini secundare, tulpina exterioară și frunzele plantei, întrucât proteina va fi exprimată într-o măsură mai mică, dar totuși într-o cantitate care stăpânește acțiunea insectei, în aceste părți ale plantei, dar, cu roate acestea. în cazul ambelor tipuri de promotori, sămânța plantei va rămâne neafectată.

Exemplele următoare descriu pe larg materialele și procedeele folosite în realizarea invenției.

Exemplul 1. Procedee generale. Manipulările ADN au fost făcute folosind metode standard în domeniu. Aceste metode pot fi modificate și/sau substituite frecvent, fără schimbarea substanțială a rezultatului. Cu excepția situațiilor când se menționează alte referințe, majoritatea acestor metode sunt descrise în Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manula, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, ediția a doua, 1989.

Sinteza oligomerilorADN. Oligomerii ADN, care sunt formați din aproximativ 20-90, de preferat între aproximativ 60 și 80 de nucleotide în lungime, sunt sintetizați prin folosirea unui sintetizator ADN de tip Biosisteme Aplicate Model 380 B și a unor metode standard. Oligomerii sunt realizați folosind ciclul SSCAF 3 adus la zi, având 0,2/zmol, pori largi și coloană ABI cu scală mică. Metoda finală este scoaterea tritilului, iar oligomerul este separat din coloană folosind ciclul automatic de separare al ciclului 380B. Oligomerii sunt apoi deblocați printr-un exces de hidroxid de amoniu (NH4OH) la 55°, timp de 8...12 h. Oligomerii sunt apoi uscați într-un evaporator cu azot gazos. După încheierea operațiilor, oligomerii sunt resuspendați în 0,25...0,5 ml apă, deionizată.

Purificarea oligomerilor sintetici. O parte alicotă din fiecare oligomer este amestecată cu un volum egal de mixtură formată din colorant albastru/formamidă. soluția finală conținând 0.05% albastru bromfenol, 0,05% cianolxilen FF și 25% formamidă. Acest amestec este încălzit la 95°C, timp de 10 min, pentru denaturarea oligomerilor. Ulterior cantități din acesta sunt aplicate pe gel de poliacrilamidă - uree 12% ce conține 7M uree (Sambrook et al.). După electroforeză la

300...400 v, timp de 3...4 h. folosind un element cu strat de gel vertical (Hoefer Scientific Instruments. San Francisco. CA), se folosește ecranarea UV pentru a localiza corect fragmentul dimensionat în gel, ulterior el fiind excizat cu o lamă. Fragmentul de gel purificat este mărunțit și incubat în 0,4 M LiCl, 1 mM tampon EDTA (pH=8), la 37°C până a doua zi.

Se poate folosi oricare din următoarele două metode, pentru a separa oligomerii din gelul de poliacrilamidă: elemente de filtrare cu polietilenă cu pori de 25 μΜ Gene /x sau elemente de filtrare 0,45 μΜ ultrafree-Ml Millipore. Oligomerii purificați sunt precipitați în etanol, recuperați prin centrifugare într-o microcentrifugă, timp de 20 min, la 4°C și, în final, resuspendați în Te (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=8,0). Concentrațiile sunt ajustate la 50 mg/μΙ prin fotometrie de absorbție la 260 nm.

Determinarea dimensiunilor oligomerilor cu kinaze. Pentru controlul dimensiunii unor oligomeri pe un gel secvențial se desfășoară reacții de etichetate de kinaze, folosind oligomeri sintetici purificați din fiecare dimensiune reprezentativă: 40 meri, 60 meri, 70 meri, 80 meri și 90 meri. In fiecare 20 ml de reacție cu kinază, se folosește un pmol de oligomer purificat într-un tampon de 7,0 mM Tris, pH =7.5,10 ml KC1,1 meMhC12, 0,5 mM DTT, 50 μ_δ/πι1 BSA, 3000 pd (3 pmoli) de 32 p-gamma ATP, și 8 unități de T4 - polinucleotidkinază. Reacția cu kinază este incubată timp de 1 h, la 37°C, urmată de extracția cu fenol/cloroform și trei precipitări în etanol cu glicogen cu vehicul (Tracy, Prep Bio34 chem.. 11.251-268 (1981).

Sunt pregătite două încercări pe gel (una ce conține 1000 cpm, alta 2000 cpm) din fiecare reacție, cu 25% formamidă, 0,05% albastru-bromfenol și 0,05) cianol-xilen PF. Oligomerii cu kinaze sunt fierți, timp de 5 min, înainte de încărcarea pe gel secvențial cu 6% poliacrilamidă 7M uree (BRL Gel Mix TM 6, BRL, Gaitherzburg, MD). O reacție secvențială a plasmidului p(JC 18 este dirijată pe același get, pentru a realiza markeri de dimensiune.

După electroforeză gelul este uscat și expus la un film de diagnostic cu raze X (Kodak X-OMAT AR). Autoradiografia obținută arată că toți oligomerii purificați testați au dimensiunea corectă. Oligomerii care nu au fost dimensionați direct pe gelul secvențial sunt aplicați pe un gel cu 6% poliacrilamidă 7 M uree (BRL Gel Mix TM6) folosind oligomeri dimensionați ca markeri de dimensiune. Toți oligomerii sunt întâi denaturați cu 25% formamidă la 100°C, timp de 5 min, înainte de încărcarea pe gel. Colorarea gelului de poliacrilamidă cu bromură de etidium permite vizualizarea oligomerilor pentru determinarea dimensiunii.

Hibridizarea oligomerilor pentru donare directă. Oligomerii ce vor fi hibridizați sunt puși laolaltă (între 1 μg și 20 μg ADN total) și supuși kinazelor la 37°C, timp de 1 h, în tampon ligand IX Promega, ce conține 30 mM Tris-HCl, pH=7,8, 10 mM MgC12,10 mM DTT, 1 mM dATP. în reacție se folosesc 1...20 unități de T4 - polinucleotidkinază, în funcție de cantitatea prezentă de ADN total. Reacțiile cu kinaze sunt oprite prin plasarea reacției într-o baie de apă, care fierbe timp de 5 min. Oligomerii ce formează terminațiile 5’ ale moleculelor hibridizate nu reacționează cu kinazele, dar sunt adăugați oligomerilor ce au reacționat cu kinazele, împreună cu tamponul adițional de hibridizare, după încălzire. Oligomerii puși laolaltă se află într-un volum de

50...100 μΐ, cu tamponul de hibridizare adăugat, pentru ajustarea caracteristicilor finale ale sării la 100 mM NaCl. 120 mM Tris,pH=7.5 și 10 mM MgClz. Oligomerii fără reacție cu kinaze și cei care au reacționat cu kinazele, sunt puși laolaltă și încălziți într-o baie de apă care fierbe timp de 5 min și lăsată apoi să se răcească, treptat, la temperatura camerei, timp de aproximativ 4 h. Oligomerii hibridizați sunt apoi extrași cu fenol/cloroform, precipitați în etanol și resuspendați în 17 /zl de TE (10 mM Tris, lmMEDTA,/tH=8,0). Folosind acești 17 /zl se realizează o reacție de ligare cu un volum final de 20 u\ (caracteristici finale — 30 mM Tris- HCl,pH=7,8, 10 mM MgClz, 10 mM D ΓΓ, 1 mM ATP și 3 unități de T4 - ADN ligază/Promega, Madison WI). Ligarea este incubată timp de 2 h, la temperatura camerei. Fragmentele hibridizate/legate sunt de regulă purificate pe geluri Nusieve 2% înainte și/sau după tăierea cu enzime de restricție, anterior clonării în vectori. O reacție de ligare de 20 /zl în volum este realizată folosind 100...500 ng din fiecare fragment, cu cantități aproximativ echimolare de ADN, în 30 mM Tris-HCl, pH=7,8, 10 mM MgC12,10 mM DTT, 1 mM ATP și 3 unități de T4 - ADN ligază (Promega, Madison WI). Ligațiile sut incubate la temperatura camerei, timp de 2h. După ligare, ADN este transformat în celule E.coli competente, înghețate, folosind metode standard (Sambrook et al.), iar transformanții sunt selectați pe agar-LB (Sambrook et al.) ce conține 100 /zg/m ampidlină (a se vedea mai departe).

Reacții PCR pentru evidențierea clonelor în E.coli. Coloniile de E.coli care conțin inserția ADN corectă sunt identificate folosind PCRI (a se vedea generalitățile, Sandhu et al., Biotechniques, 7:689-690, 1989). Folosind un dispozitiv de prindere, coloniile sunt curățate dintr-o placă de a doua zi și puse într-un amestec de reacție de 20...45 /zl PCR, conținând aproximativ 50 pmoli din fiecare primer hibridizat (a se vedea exemplul de folosire a primerilor MK 23128 și MK 25 A 28 pentru a selecta orientarea fragmentului

Sac II în pHYB2II6). 200 /zm - 400 mM din fiecare dATP și IX tampon de reacție (Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT). După fierberea amestecului E.coZz/PCR într-o baie de apă, care fierbe timp de 5 min, se adaugă 5 /zl de Taqpolimerază (0,5 unități) (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn) în IX tampon de reacție. Para metrii reacției PCR sunt stabilizați cu o etapă de denaturare la 94°C, timp de 30 s, maleabilizare la 55°C, timp de 45 s și extensie la 72°C, timp de 45 s, pentru 30...36 cicluri. Produșii de reacție PCR sunt aplicați pe geluri de agaroză sau agaroză Nusieve (FMC), pentru a depista fragmentul cu dimensiune corectă amplificat

Ligări. Fragmentele digerate de enzimele de restricție sunt purificate la 1 % LGT (agaroză cu temperatură joasă de gelifiere, FMC) 2% Nusieve (FMC) sau 0,75% agaroză, folosind tehnici standard în domeniu. Benzile ADN sunt vizualizate cu bromură de etidium și recuperate din geluri prin excizie cu lama. Fragmentele izolate din LGT sunt ligate direct în LGT. Se folosesc 10 /zl din fiecare fragment ADN, recuperat, pentru realizarea reacțiilor de ligare, producând volume finale de reacții de ligare de aproximativ 23 /zl. După excizie cu lama, benzile de gel obținute, ce conțin fragmentele ADN dorite, sunt topite și puse în contact cu IX tampon de ligare și 3 unități de T4 - ADN ligază (Promega), așa cum s-a descris anterior. Fragmentele izolate atât din agaroza obișnuită cât și din agaroza Nusieve sunt purificate de agaroză, folosind elemente de filtrare ultrafree - MC 0,45/zM (Millipore), iar fragmentele sunt ligate, după cum s-a descris anterior. Reacțiile sunt incubate la temperatura camerei, timp de 2 h, înainte de transformarea în celule de E.coli competente, înghețate, folosind metode standard (Sambrook et al.).

Transformări. Celulele E.coli competente, înghețate, din linia DH5 alfa sau

HB101, sunt realizate și transformate folosind metode standard (Sambrook et al.). Celulele E.coli SURE competente sunt obținute din Stratagene (La Jolla CA). Pentru ligările ce se desfășoară în agaroză LGT, după încheierea reacției de ligare, se adaugă 50 mM CaC12 la un volum final de aproximativ 150 μΐ, iar soluția este încălzită la aproximativ 63°C, timp de 10 min.pentru topirea completă a agarozei. Soluția este apoi amestecată și răcită pe gheață, timp de 10 min. înainte dc adăugarea a aproximativ 20 m\ de celule competente care au fost topite din gheată. Acest amestec este lăsat Ia incubare, timp dc 30 min, pe gheață. Amestecul este apoi agitat la cald, la 42°C. timp dc 60 s înainte dc a ti răcit pe gheață, timp de 2 min. Apoi, se adaugă 800 //I de mediu SOC (20% triptenă, 0.5% extract de drojdie, 10 mM NaCl,

2,5 mM KCI. ajustai la pH=8 cu 5N NaOJ I, 20 mM MgCh; MgSO4 în amestec și 20 mM glucoză; Sambrook et al.), iar celulele sunt incubate la 27°C, cu agitare timp de aproape 1 h înainte dc însămânțarea pe plăci cu medii selective. De regulă, se folosește L-agar (Sambrook et al.) ce conține 100 //g/ml ampicilină.

Când ligările se desfășoară într-o soluție fără agaroză, de regulă 200 μ\ de celule E.coli competente înghețate (linia DH5 alfa BRL, Gaithersburg, MD sau celule SURE, Stratagene, La Jolla, CA) sunt topite din gheață și se adaugă 5 //1 amestec de ligare. Reacția incubată pe gheață, timp de aproximativ 45...60 min, iar apoi celulele sunt agitate la cald, la 42°C, timp de 90 s. După lăsarea la temperatura camerei, timp de aproximativ 10 min, se adaugă 800 μ\ de mediu SOC, iar celulele sunt din nou incubate 1 h, la 37°C, cu agitare și însămânțare, așa cum au fost descrise anterior.

Atunci când se face trierea inserturilor în gena betagalactozidazei, în unii vectori standard folosiți, 200 μΐ din amestecul de transformare obținut este însămânțat pe plăci LB-agar ce conțin 0,008% X-wolframit, 80 //M TPTG și 100 //g/ml ampicilină (Sambrook et al.). Plăcile sunt incubate la 37°C până a doua zi. pentru a permite selectarea și creșterea transformanților.

Minitrierea ADN-ului. Transformanții din plăcile cu medii selective sunt crescuți și structura lor plasmidică este examinată și confirmată, folosind metode standard pentru minitrierea plasmidelor. (Sambrook et al.). De regulă metoda fierberii este folosită pentru a produce cantități mici de plasmidă ADN pentru teste (Sambrook el al. I. Alternativ. în unele cazuri se folosește o metodă cu acetat de amoniu. Această metodă este o modificarea celei comunicate de Shingvi l.ee et al., Biotechniques, 9:676-679 (1990).

1) Inocularea unei singure colonii bacteriene din plăcile de selecție din ziua precedentă în 5 ml (se poate coborî până la 1 ml) de mediu TB (Sambrook et al.) și creșterea în prezența antibioticului adecvat

2) Incubarea pe un rulou la 37°C până a doua zi.

3) Colectarea a 5 ml de celule bacteriene într-un tub de plastic Oakdridge și centrifugarea timp de 5 min, la 5000 rot/min, într- un rotor Scrvall SS-34, la 4°C.

4) Recuperarea supematantului.

5) Resuspendarea precipitatului în 1 ml tampon tipic (50 mM glucoză, 25 mM Tris-HCl /pH=8,0/, 10 mM EDTA și 5 //g/mg lizotime), agitarea timp de 5 s și incubarea la temperatura camerei, timp de 5 min.

6) Adăugarea a 2 ml de soluție alcalină, proaspăt preparată (0,2 N NaOH, 1% dodecil-sulfat de sodiu), acoperirea cu un capac strâns, amestecarea prin răsturnare de 5 ori și plasarea tubului într-o baie de apă cu gheață, timp de 5 min.

7) Adăugarea a 1,5 ml acetat de amoniu 7,5 M glacial (pH=7,6) la soluție, amestecarea prin răsturnarea ușoară a tubului de 5 ori și plasarea pe o baie de apă cu gheață, timp de 5 min.

8) Centrifugarea amestecului la 9000 rot/min, timp de 10 min, la temperatura camerei.

6) Transferarea supernatantului limpede într-un tub Corex de 15 ml și adăugarea a 0,6 volume de izopropanol (aproximativ 2,5 ml). Lăsarea la temperatura camerei, timp de 10 min.

10) Centrifugarea amestecului la 9000 rot/min, timp de 10 min la temperatura camerei și separarea supernatantului.

11) Resuspendarea precipitatului în 300 zd de tampon TE.

Adăugarea a 6 ml de materie primă RNază A Si'l's (făcută sub forma a 200 //I de soluție, prin adăugarea a 180μ 1 de RNază A/3254 Unități/mg proteină, 5,6 mg proteină/ml/ și a 20 /d de RNază Ί'ι/481 unități pg proteină. 1,2 mg proteină/ml). Aceste materii prime pot li obținute din CJSB (US Biochemical). Transferarea într-un tub de microcentrifugă și incubarea la 37°C, timp de 15 min.

12) Adăugarea de 75 //Iapă distilată și 100 μϊ de acetat de amoniu 7,5 M și incubarea într-o baie de apă cu gheață timp de 10 min.

13) Centrifugarea amestecului la 14000 rot/min, timp de 10 min, într-o microcentrifugă Beckman, la 4°C.

14) Precipitarea prin adăugarea a 2,5 volume de EtOH 100% (aproximativ 1 ml) și incubarea într-o baie de apă cu gheață, timp de 10 min.

15) Centrifugarea la 14000 rot/min, timp de 10 min, într-o microcentrifugă.

16) Spălarea precipitatului cu etanol 70% (folosind 0,5-1 ml). Uscarea precipitatului și resuspendarea în 100 //1 de IX tampon 4 cu enzime de restricție New England Biolabs /20 mM Tris-HCl (pH=7,9), 10 mM acetat de magneziu, 50 mM acetat de potasiu, 1 mM DTT/ Măsurarea concentrației și verificarea purității prin spectrofotometrie de absorbție la 260 și 280 nm.

Pentru a determina mai rapid dacă o anumită colonie bacteriană adăpostește o plasmidă recombinată, se realizează o metodă de minitriere PCR, folosind o modificare a metodei descrise deSandhu, G.S. et al.. 1989. Biotechniques.

7:689-660. Pe scurt, se prepară următorul amestec:

100 «1 amestec de primeri ca mai sus, μΜ din fiecare primer;

100 //1 amestec de NPP (2,5 mM fiecare):

100 μϊ 10 X tampon AmpliTaq (perkin-Elmer Cetus, 1 x tampon = 1.0 mM Tris-HCl pH=8.3, 50 mM KCI. 1.5 mM MgC12 și 0,01% gelatină):

700 μϊ apă deionizată;

μϊ din amestecul de mai sus sunt puse într-un tub de polipropilenă PCR de 0,5 ml. O colonie acteriană transformată este preluată cu o ansă și resuspendatăîn amestec. T ubul este pus într-o baie de apă, care fierbe timp de 10 min, și apoi răcită la temperatura camerei, înainte de adăugarea a 5pl din amestecul descris în continuare:

265 μϊ apă deionizată:

μϊ 10X tampon AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus, IX tampon = 10 mM Tris-HCl, pH=8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgC12 și 0,01% gelatină);

7,5 μϊ polimerază Taq.

Deasupra mostrelor se întinde 50 μϊ ulei mineral și PCR, se desfășoară, timp de 30 de cicluri, folosind următorii parametrii:

- denaturare: 94°C, timp de 1 min;

- maleabilizare: 55°C, timp de 1 min;

- extindere: 72°C, timp de 45 s.

După amplificarea PCR, se adaugă la întreaga reacție 1 μϊ de colorant de încărcare (30% glicerol, 0,25% albastrubromfenol, 0,25% cianolxilen) apoi 20μ1 din amestec sunt încărcați pe un gel 2% Nusieve, 1% agaroză, pentru a vedea dacă există un produs PCR cu dimensiunea scontată.

Metoda este utilizată ca o triere inițială. Ulterior se desfășoară minipreparative pentru a confirma structura plasmidei și a inserției sale, înainte de secvențializare.

Exemplul 2. Amplificarea și asamblarea fiecărei pătrimi. Fragmentele de donare ale genei Bt CiylA(b) sintetice:

Gena sintetică a fost proiectată să fie donată în patru piese, fiecare, în linii mari, reprezentând o pătrime din genă. Oligomerii pentru fiecare pătrime au fost puși laolaltă pentru a fi, fie asamblați prin PCR, fie hibridizați, apoi supuși amplificării PCR, așa cum s-a descris în altă parte. Pătrimile sintetice au fost montate laolaltă prin superpozarea situsurilor de restricție AalII, Ncol și Apal între prima și a doua, a doua și a treia și respectiv, a treia și a patra pătrime.

fiecare pătrime a genei (reprezentând aproximativ 500 bp) a fost asamblată prin hibridizarea oligomerilor adecvați și amplificarea fragmentului dorit, folosind primeri PCR specifici pentru capetele acelei pătrimi. S-au folosit două seturi diferite de reacții PCR, utilizând două seturi de primeri ușor diferiți. Produșii PCR ai celor două reacții au fost proiectați să fie identici, cu excepția faptului că în prima reacție a existat o secvența AATT adițională la capătul 5’ al regiunii de codare, iar în cea de-a doua reacție a existat o secvență AGC-T la capătul 3’ al pătrimii date. Atunci când produșii celor două reacții, pentru o pătrime anume, au fost amestecați (după îndepărtarea polimerazei, a primerilor și a produșilor incompleți), denaturați și apoi re-maleabilizați, o anumită proporție (teoretic 50%) din produsul maleabilizat va avea capete proeminente neomoloage. Aceste capete au fost proiectate să corespundă capetelor aderente formate în timpul digestiei restrictive cu EcoRI la capătul 5’ și cu HindIII la capătul 3’ al moleculei. Moleculele rezultate au fost fosforilate, ligate într-un vector Bluescript digerat și supus fosfatazei EcoRI/HindIII și transformate în linii E.coli competente înghețate DH5 alfa. După selectare, coloniile E.coli conținând fragmentul dorit, sunt identificate prin modalitatea digestiei restrictive a ADN. Inserturile reprezentând porțiuni din gena sintetică sunt apoi purificate și secvențializate, folosind metode standard. în toate cazurile sunt generate și secvențializate clone din reacții PCR multiple. Pătrimile sunt ulterior alăturate, folosind situsuri de restricție unică la nivelul joncțiunilor, obținând astfel gena completă.

Pătrimile donate sunt identificate prin metode de minitriere. iar fragmentul de genă este secvențializat. S-a descoperit că în interiorul secvenței sunt introduse frecvent erori, cel mai probabil în cursul etapelor de amplificare PCR. Pentru corectarea erorilor în clonele ce conțin doar câteva din aceste erori, sunt folosiți oligomeri hibridizați. Fragmentele hibridizate sunt digerate la nivelul situsurilor de recunoaștere pentru enzime restrictive, în interiorul fragmentului, și donate pentru a întocmi regiunea mutantă în gena sintetică. Fragmentele hibridizate sunt cuprinse între 90 bp în lungime (de exemplu regiunea care înlocuiește fragmentul între situsurile Sac II din a doua pătrime) și aproximativ 350 bp la fragmentul din cea de-a patra pătrime, care înlocuiește cele două mutații induse de PCR în această pătrime.

Datorită frecvenței mari a erorilor în PCR, s-a proiectat și realizat o plasmidă care permite selectarea unui fragment de genă donat ce conține o fereastră de citire deschisă. Această plasmidă este astfel proiectată încât dacă se introduce o fereastră de citire deschisă în interiorul situsurilor de donare, bacteria transformată va crește în prezența kanamicieni. Construirea acestui vector este descrisă detaliat mai departe. Acest sistem de selecție accelerează progresul, permițând să se identifice cu rapiditate clonele cu ferestre de citire deschise, fără a trebui să se secvențializeze un număr mare de clone independente. Pătrimile sintetice sunt asamblate în variate plasmide, incluzând BSSK (Stratagene; La Jolla, CA), PUC18 (Sambrook et al.) și vectorul de exprimare Km. Alte plasmide corespunzătoare, incluzând plasmide de bază de pUC, sunt cunoscute în domeniu și pot fi, de asemenea, utilizate. Sec110263 vențializarea compielă a fragmentelor donate, testele Western blot ale produșilor genelor donate și biotestele pentru insecte folosind dăunătorul european al cerealelor ca teste pentru insecte, verifică dacă s-au obținut gene CrylA(b) sintetice funcționale în totalitate.

Construirea vectorului de exprimare Km pentru selectarea ferestrelor de citire deschise:

Vectorul de exprimare Km este proiectat să selecteze fragmentele genei sintetice care conțin ferestre de citire deschise. Sunt proiectați oligomeri PCR care permit fuzionarea genei NPT II din Tn5 începând la nudeotidul 13 (Reinss et al.. EMBOJ. 3:3317-3322, 1984) cu plJC 18 și introduc situsuri de restricție folositoare între segmentele ADN. Regiunea cu poli-linkeri conține situsuri de restricție pentru a permite donarea diverselor fragmente BtPI sintetice încadrate de gene Km. Oligomerul 88 bp 5, conținând regiunea cu polimeri, este purificat pe un gel de poliacrilamidă 6%, așa cum s-a descris anterior pentru purificarea oligomerului PAGE. O reacție PCR este cuplată cu un fragment șablon 1 Kb BglII/Smal care conține gena NPT II derivată din Tn5. Amestecul de reacție PCR conține 100 ng de șablon și 100 pmoli de oligomeri KE 72 A 28 și KE 74 A 28 (a se vedea secvențele de mai jos), 200 nM dnTP și 2,5 unități de Taq polimeraza, toate într-un volum de 50 μ\ cu un volum egal de ulei mineral deasupra. Secvențele primerilor sunt: KE74A28

5’-GCAGATCTGG ATCCATGCAC GCCGTGAAGG GCCCTTCTAG AAGGCCTATC GATAAAGAGC TCCCCGGGGA TGGATTGCAC GCAGGTTC-3’

KE72A28

5’-GCGTTAACAT GTCGACTCAG

AAGAACTCGT CAAGAAGGCG-3’

Parametrii PCR utilizați sunt: 94°C, timp de 45 s, 55°C, timp de 45 s și 72°C, timp de 55 s, cu extensie în etapa a treia timp de 3 s și 20 cicluri. Toate reacțiile

PCR au loc într-un termociclu PerkinElmer Cetus. Produsul PCR amplificat are 800 bp și conține regiunea de poli-linkare, cu un situs de inițiere a transcripției urmat de situsuri de restricție unică, fuzionate împreună cu gena Km din baza nr.13, încheiat prin stoperul translației pUC: KM 74 este caseta de exprimare Km ce a fost asamblată din fragmentul Km/800 bp acZ permite exprimarea genei Km la E.coli. Derivații pUC: KM 74 trebuie întâi însămânțați pe plăci cu agar-LB, conținând 100 Rg/ml ampicilină, pentru a selecta transformanții ce pot fi ulterior trimiși pe mediu agar-LB, ce conține 25 țzg/ml kanamicină/IPTG. Fragmentele de genă BtPI sintetică sunt asamblate din fiecare pătrime în caseta Km, pentru a verifica donarea ferestrei de citire deschisă care conține porțiunile de fragmente. Primul fragment de genă BtPI sintetică activă pe ECB, pBt:Km nr.6, este o genă BtPI ce prezintă rezistență Km. Acestui fragment i se descoperă ulterior mutații, în cea de-a treia și a patra pătrime, care sunt reparate mai târziu.

Exemplul 2A Sinteza și donarea primei pătrimi a genei sintetice, /baze perechi 1-550/. Următoarele metode sunt parcurse în scopul donării primei pătrimi a secvenței ADN sintetice care codifică o genă Bt CrylA(b) sintetică. Aceleași metode sunt parcurse în esență pentru sinteza și donarea celorlalte pătrimi, cu excepția cazului menționat pentru primeri și situsuri de restricție.

Șablonul pentru pătrimea 1: amestec de părți egale din oligomeri purificați U1-U7 și L1-L7.

Primeri PCR: Citire directă:

Pl(a): 5’-GTCGACAAGG ATCAA CAATGG-3’

Pl(b): 5’-AATTGTCGAC AAGGATCCAA CAATGG-3’

Citire inversă (reversă):

P2(a): 5’-ACACGCTGAC GTCGGG

CAGC ACG-3’

P2(b): 5’-AGCTACACGC TGAC

GTCGCG CAG-3

Pereche de primeri Aj: Pi(b) + P2(a)

Pereche de primeri Â2: Pl(a) + P2(b)

Reacția PCR conținând oligomeri ce cuprind prima pătrime a genei BtPI, îmbunătățită din porumb, este condusă după cum urmează:

200 ngamestec oligomeri (toți oligomerii din pătrime amestecați în părți egale de greuTaîe):

μ\ amestec primeri (amestec 1:1 din fiecare la 20 //M; primeni sunt cei descriși anterior);

/zl de 10X tampon PCR.

Tamponul PCR folosit poale fi:

(a) Concentrația IX = 10 mM KCI, 10 mM (NIL02S04, 20 mM Tris-IICl, />11=8,0, 2 mM MgSO/| și 0,1% Triton X - 100;

(b) Concentrația IX = 10 mM TrisHC1. pll=8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,01% wt/vol. gelatină.

Componenții sunt amestecați, încălziți într-o baie de apă care fierbe timp de 5 min și incubați la 65°C-, timp de 10 min.

Ulterior sunt adăugați următorii agenți de reacție:

8/zl de amestec dNTPs (concentrația finală în reacție — 0,2 mM fiecare);

unități polimerază;

Volumul final al reacției este 50 /zl.

Oligomerii sunt apoi incubați, timp de 3 min, la 72°C și apoi se desfășoară un ciclu PCR. Reacția PCR se desfășoară într-un termociclu Perhin Elener cu un ciclu - protocol, după cum urmează:

ciclul de denaturare: 94°C, timp de 1 min;

ciclul de maleabilizare: 60°C, timp de 1 min;

ciclul de extensie: 72°C, timp de 45 s (+ 3 s/ciclu);

număr de cicluri: 15.

După încheierea reacției, 10 /zl din reacția PCR sunt încărcați pe un gel analitic 2%. Nusieve-GTC (FMC), 1% agaroză, pentru monitorizarea reacției. Cei 40 /zl rămași sunt folosiți pentru donarea fragmentelor, după descrierea •Io următoare:

Produși! PCR

Capetele produsului PCR cu bandă dublă, corespunzătoare variatelor perechi de primeri sunt ilustrate (doar banda superioară):

Ai AATTGTCGAC----GCGTGT (554 bp) prima pătrime

A2 G 1GGAC----G( GTG'I AGCT (554 bp) prima pătrime

Hibridizarea

40//1 din fiecare reacție P( R din cele descrise anlerior sunt purificați folosind o coloană dc cromaspin 400 (Clonctech. Palo Alto. CA), conform cu indicațiile producătorilor. 5/zgde ADN transportor au fost adăugați la reacții înainte de încărcarea pe coloană. (Aceasta se face pentru majoritatea donărilor), lotuși, în unele reacții, reactanții PCR sunt extrași cu fenol: cloroform,folosind metode standard (Sambrook et al.), pentru a îndepărta Taq polimeraza, iar ADN generat prin PCR este recuperat din faza lichidă printr-o metodă de precipitare standard cu etanol). Transportorul ADN nu participă la eluție împreună cu fragmentele generale în PCR. Corespondenții de reacție Al și A2 pentru fiecare pătrime, sunt amestecați, încălziți într-o baie de apă, care fierbe timp de 10 min și apoi incubați la 65°C, până a doua zi. Reactanții sunt apoi îndepărtați din baia de 65°C și precipitați cu etanol, cu 1 /zl (20/zg) de glicogen fără nuclează (Tracy, Prep. Biochem., 11:251-268 (1981) ca transportor. Precipitatul este resuspendat în 40 /zl apă deionizată.

Reacția de fosforilare se desfășoară după cum urmează:

μ\ KDN;

2,5 /zl mM ATP;

0,5/zl 10XBSA/DTK1X-5 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA);

1,0 /zl 10X tampon de polinucleotidkinază (IX = 70 mM Tris-HCl,/?H =7,6,

0,1 mM KCI, 10 mM MgC12);

2,0 /zl polinucleotidkinază (New England, Biolabs. 20 unități).

Incubația durează 2 h, la 37°C.

Reacția este apoi extrasă in aceiași timp cu un amestec J: 1 fenokdoroform, apoi odală cu cloroform și faza lichidă precipitată cu etanol, folosind metode standard. Precipitatul este resuspendat în 10 μ\ TE Digestii de restricție.

μ\ de vector Bluescript (BSSK+, Stratagene, Ea Jolla, CA);

μ\ tampon de restricție (IX = 20 mM Tris-HCl, pi1=8.0. 10 mM MgCh, 100 mM NaCl);

μ\ EcoRi (New England Biolabs) 100 unități;

5p| Hind III (N ew England Biolabs) 100 unități:

Volumul final de reacție este 100 pl; Incubația durează 3 h, la 37°C.

Când ia sfârșit, reacția este extrasă cu un volum egal de fenol saturat cu TE (TO mM Tris-HCl, pH= 8,0 și 10 mM EDTA). După centrifugare, faza lichidă a fost extrasă cu un volum egal de amestec 1:1 format din (saturat cu TE) fenokcloroform (cloroformui este amestecat în proporție de 24:1 cloroform:izoamil alcool), iar, în final, faza lichidă din această extracție este la rândul ei extrasă cu un volum egal cu cloroform. Faza lichidă finală este precipitată cu etanol (prin adăugarea a 10 pl de 3M acetat de sodiu și 250 pl etanol absolut, lăsate la 4°C, timp de 10 min și centrifugate într-o microcentrifugă la viteza maximă, timp de 10 min). Precipitatul este clătit în 70% etanol și uscat la temperatura camerei, timp de 5...10 min și resuspendat în 100 pl de 10 mM Tris-HCl (pH = 8,3).

Reacția cu fosfatază.

Vectorul ADN este de regulă tratat cu fosfatază pentru a reduce numărul coloniilor obținute fără un insert De regulă, se folosește fosfataza alcalină din intestin de vițel (Sambrook et al.), dar în această etapă se pot folosi și alte fosfataze.

Reacția obișnuită cu fosfataza este prezentată în cele ce urmează.

90pl de ADN digerat, descris anterior;

pl de 10X tampon de fosfatază alcalină de intestin de vițel (lX=50 mM lris-HCLpI 1=8.3, 10 mM MgC'h. 1 m.M

Z11CI2, 10 mM spermidină);

pl (1 undate) de fosfatază alcalină de intestin de vițel (C1P, Bochringer Mannheim, Indiauapolis, IN);

Incubația durează 1 h, la 37°C.

Apoi ADN este purificat pe gel (pe un gel de agaroză 1% cu temperatură joasă de gelifiere EGT). iar precipitatul resuspendat în 50 pl TE. După electroforeză. banda corespunzătoare este excizată din gel cu o lamă, topită la 65°C, timp de 5 min și diluată 1:1 cu TE. Această soluție este extrasă de două ori cu fenol, o dată cu amestecul fenol, cloroform de mai sus și o dată cu cloroform. Faza lichidă finală este precipitată cu etanol și resuspendată în tampon TE.

Ligarea.

Pentru ligarea fragmentelor genei sintetice în vectori, sunt folosite de regulă următoarele etapă:

pl de ADN cu insert fosforilat;

pl de vector Bluescript digerat cu EcoRI/Hind III de către fosfatază, încălzit la 65°C, timp de 5 min, apoi răcit;

pl BSA (1 mg/ml);

pl ligază (3 unități, Promoga, Mari ison, Wisc.).

Reacțiile cu ligază sunt de regulă incubate la 16°C până a doua zi sau la temperatura camerei, timp de 2 h. Transformarea.

Transformarea fragmentelor de ADN liga te în E.coli este realizată folosind metode standard (Sambrook et al.), așa cum s-a descris anterior.

Identificarea recombinau ți lor.

Sunt selectate coloniile albe sau albastru-deschis rezultate din incubarea până a doua zi a mediilor de transformare. Plasmidele din transformanți sunt caracterizate folosind metodele de minitriere (Sambrook et al.) sau pe cele descrise anterior. De regulă, este folosită una din următoarele trei metode:

(1) metoda de mini preparare cu fierberea ADN;

(2) miniuierea PCR:

(3) miniprepararca cu acetat de amoniu.

Digeslia de restricție a plasmidelor recombinante presupune a conține prima pătrime și se desfășoară după cum urmează:

ța) digestia cu BamHI/AalII: 10 μ\ ADN + 10 μΙ IX tampon cu enzimă de restricție 4 New England Biolabs:

0.5 //I BamHI (10 unități):

0.5/zl AalII (5 unități);

Incubarea durează 2 h, la 37°C.

('Ionele identificate ca având caiac terele de restricție dorite sunt apoi dige ratecu PvuII și cu BglI în reacții separate. Doar elenele cu caractere de restricție dorite, cu toate cele trei digestii enzimatice sunt conduse mai departe pentru secvențializare.

Secvențializarea fragmentelor de genă donate.

Secvențializarea se desfășoară folosind o modificare a metodei de încheiere a lanțului cu dideoxi a lui Banger (Sambrook et al.), folosind ADN dublu catenar cu kitSequenaze 2 (United States Biochemical Corp, Cleveland, OH). în total, sunt secvențializate clonele primelor șase pătrimi. Din clonele secvențializate, doar două clone, notate pQAl și pQA5, conțin fiecare o singură deleție. Aceste delegații au fiecare o pereche de baze, localizate la poziția 452 în pQAl și la poziția 297 în pAQ5.

Plasmida pQAl este folosită împreună cu pPl-8 (așa cum va fi descris mai departe, pentru a obține o primă pătrime cu secvența așteptată.

Exemplul 2B. Sinteza și donarea celei de-a doua pătrime /Baze - perechi 531 - 1050/ Șablon oligomerii U8-U14 și I .8-L/14 Primeri PCR:

Citire directă: P3(a): 5’-GCTGCGCGAC GTCA GCGTGT TCGG-3’

P3(b): 5’-AATTGCTGCG CGACGTCAGC GTG-3’ reversă:

Pt(a): 5 -GGCGTTGCCC ATGT

GCCG T ACAGG-3’

P4( b): 5 ’ - A G C TG G C G T TG C C

CATGGT GCCG-3’

Perechea primer Bi: P.3(b) 4- P4(a) Perechea primer B2: P3(a) + P4(b) Produșii PCR

Bi AAITGCTGCG-----AACGCC (524bp) a doua pătrime

B2 GC TG( )G------AACGCCAGCT (524bp) a doua pătrime

Hibridizarea, amplificarea PCR, fracționarea după mărime în coloană centrifugă și donarea acestui fragment de genă în Benescript digerai cu IxoRI/HindlIJ se desfășoară după cum a fost descris anterior pentru prima pătrime (exemplul 2A). Produsul PCR pentru această pătrime are aproximativ 529 bp în dimensiune, reprezentând cea de-a doua pătrime a genei (nucleotidele 531 - 1050). Transformarea se face în celule E.coli competente, înghețate, folosind metodele standard descrise anterior (Sambrook et al.).

Minitrierea clonelor pQB.

Minipreparatul, ADN este realizat așa cum a fost descris anterior și digerat cu (a) Aatll/Ncol, (b) PvnII și (c) BglI, pentru a confirma structura insertată în vector, înainte de secvențializare.

Secvențializarea se realizează așa cum s-a descris anterior, folosind metoda cu dideoxi a lui Sânger (Sambrook et al.).

Sunt secvențializate în total 13 clone pentru această pătrime. A doua pătrime conține în cea mai mare parte una sau mai multe deleții între pozițiile 884-887. în majoritatea cazurilor este deletată G la poziția 884.

Plasmida pQB5 are o singură deleție la poziția 884. Această regiune se întinde între două situsuri Sacii (pozițiile 859 și 949). Corecția acestei deleții este descrisă în exemplul 3.

Clonele din prima jumătate (1 -1050 bp).

Un fragment pentru donarea primei jumătăți (pătrimile 1 și 2) a genei de porumb Bt sintetice, ca fragment de ADN unic, se obține prin digestia de restricție a produsului unei reacții PCR ce cuprinde prima păi rime și cea de-a doua pătrime. Se folosește endonuclcaza de restricție Aat II pentru a tăia ADN (după extracția cu fenol și precipitarea cu etanol) într-o reacție de 20μΐ, 15 μ\din fiecare pătrime digerată de Aat II sunt amestecați și ligați (într-un volum de 50 μΐ, obținut prin adăugarea a 5 μ! de 10X tampon de ligare (IX = 30 mM Tris-IlCI. μΐΐ =7.8. 10mM MgCb, lOmMDTE 1 mM ATP). 14μΙ apă deionizată și 1 μΙ^τ^ΑΰΝ ΊΧ 3 unități, Promega, Madison, WI) la temperatura camerei, timp de 2 h. Rezultatul este apreciat la aproximativ 1 kb prin electroforeză pe gel de agaroză folosind condiții standard (Sambrook et al.). 10 μ.Ι din produsul de ligare este amplificat prin PCR. în condițiile descrise anterior, cu excepția faptului că se desfășoară doar 5 cicluri.

Perechea primer: HA = Pi(a) + P4(b) Perechea primer: HB — Pi(b) + P4(a)

Produsul acestor reacții este donat în Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA), așa cum a fost descris pentru pătrimile individuale, doar că metoda este aplicată o singură dată, adică ADN cu toate inserturile este obținut într-o anumită regiune dintr-o singură reacție PCR.

Sunt minitriate 36 de colonii de digestie Săli și Pvnll. Toate, cu excepția a 4 dintre ele, conțin un insert cu dimensiuni de aproximativ 1 kb, din care cel puțin 20 conțin aspectul corect de digestie Pvnll. 8 din aceste clona sunt alese pentru teste de secvență. Una din clone, PI-8, are secvența dorită între situsul EcoNI (396 bp) și situsul DralII (640 bp). Această clonă este folosită pentru obținerea unui plasmid cu secvența dorită, până la situsul DralII (640 bp) în pătrimea a doua, cu pQAl (prima pătrime cu o deleție în poziția 452 bp descrisă anterior).

Exemplul 2C. donarea și sinteza celei de-a treia pătrimi /baze perechi 1021 - 1500/

Șablon: oligomerii U15-U20 și L15L21

Primerii PCR

Citire înainte:

P₅(a): 5’-1TCCCCCTGT ACGGCACCAT GGGCAACGCC GC-3’

Ps(b): 5’-AATTGTACGG CACCATGGGC AAC-3’ reversă:

IX(a): 5’ GAAGCCGGGG CCCT TCACCA CGCTGG-3’

Ρλ( b): 5 - A G C'l G A A G (' (' GGGG CCCTFC ACC 3’

Primeri pereche Cp Pș(b) + Pf>(a) Primeri pereche (Ț: P.s(a) + P<>(b) Produs PCR:

Ci AATTGTACGG------GGCTl'C (475bp) a treia pătrime

C? TTCCCCTGTACGG----GGCTTCAGCT(484bp) a treia pătrime

Reacțiile PCR, recuperarea fragmentului ADN corect dimensionat, prin coloană centrifugă și ligarea în vectori se desfășoară, așa cum s-a descris anterior (exemplul 2A), folosind un vector Bluescript tăiat cu EcoRI și HindIII. Produsul PCR cu aproximativ 479 baze perechi reprezintă a treia pătrime a genei sintetice (NT 1021 - 1500).

Transformarea în celule E.coli competente, înghețate, linia DH5 alfa, selectarea și identificarea transformanților, caracterizarea transformanților prin metode de minitriere și secvențializarea fragmentului de genă sintetic în vector sunt toate la fel ca cele descrise anterior. Minitrierea clonelor pQC:

A treia pătrime este minitriată folosind metode standard (Sambrook et al.). Minipreparatul ADN este tăiat cu (a) NCOI/Apal și (b) cu Pvnll. Clonele ce conțin caracterele corecte de digestie de restricție sunt secvențializate prin metode standard. Sunt identificate trei puncte fierbinți de deleție majore în cea de-a treia pătrime (a) la poziția 1083, (b) între pozițiile 1290 -1397 și (c) între pozițiile 1356 -1362. In toate clonele, cu excepția uneia, pQC8, există și o inserție consecventă a unei C la poziția 1369. Adăugate acestor mutații, clonele celei de-a treia pătrimi conțin un număr mare de alte deleții aparent întâmplătoare. Factorul comun al celor trei puncte fierbinți mutaționale din cea de-a treia pătrime și al celui din pătrimea a doua este faptul că aceste regiuni sunt toate mărginite pe fiecare parte de secvențe cu aproximativ 80% C+G. Alte regiuni, ce conțin 5-9 C-Gs într-o linie, nu sunt afectate. Oligomerii din U]5, U16, U18, IJ19.1-15,1-16,1-18 și I-19sunt reproiectați pentru reducerea conținutului dc C+G din aceste regiuni. Sunt secvențializate 5 clone, fiecare dintre o reacție PCR cc folosește oligomeri modificați.

Plasmida pQCN 103 are secvența corectă pentru cea de-a treia pătrime, cu excepția unei schimbări la poziția 1326. Această schimbare care substituie o G cu o C, determină substituirea unui aminoacid (leucina) pentru cel original (fenilalanina).

Exemplu! 21). Sinteza și donarea celei de-a patra pătrimi /baze perechi 1480 - 1960/

A patra pătrime a genei se obține dintr-o clonă, proiectată inițial să conțină pătrimile a treia și a patra ale genei. A doua jumătate a genei sintetice se obține în urma unei reacții PCR, prin care fuzionează a treia și a patra pătrime. Aceste reacții sunt realizate cu primeri PCR P.ș(a) și P6(a) descriși anterior pentru a treia pătrime și primeri P7(a) și P8(a) (ce vor fi descriși mai departe). Primerul revers este modificat prin includerea unui situs Saci și unui codon final. Pentru fiecare pătrime au loc reacții separate în 30 cicluri folosind condițiile descrise mai sus. Cele două pătrimi sunt reunite prin superpozarea PCR și apoi digerate cu enzime de restricție Ncol și Saci. Fragmentul de 953 bp rezultat este donat direcțional în pCIB 3054, care a fost tăiat cu NcoI/SacI și tratat cu fosfatază alcalină.

pCIB 3054 este construit prin inserarea intronului nr.9 al PEP carboxilazei (PEPCIVS nr.9) în unicul situs Hpal al pCIB 246 (descris pe larg în exemplul 4). pCIB 246 este tăiat cu Hpal și supus fosfatazei C1P. prin metode standard descrise în exemplul 2A. PEPC ivs nr.9 este obținut prin PCR, folosind pPEP-10 ca șablon. pPEP-10 este o subclonă genomică ce conține întreaga genă de porumb pentru PEP carboxilază, care codifică enzime de fotosinteză C4, cu și ADN de margine. 2.2 kb din 5' și 1,8 kb din 3’. ADN de 10 kb este ligat la nivelul situsului HindlII al plJC 18. (Hadspeth et a\.,Pkmt Molecular Biolog». 12:576-589, 1989). Primerul PCR citit înainte, folosit pentru a obține PEPC ivs nr.9 este GTACAAAA ACCAGC-AACTC, iar primerul revers este (Ί < > C ACΆΑAGTGG AG FAGI. Produsul PCR este un fragment de 108 bp conținând doar secvențele pentru intronul nr.9 al PEP carboxilazei. Reacția PCR este extremă cu fenol și cloroform, precipitată cu etanol, fosforilată cu polinucleotidkinază și tratată cu T4 - polimerază pentru a completa fondul de baze 3’ non-șablon în produșii PCR (Clark J.M, Nucleic Acid Research, 16:9677-9686 (1988), folosind metode standard. Fragmentele supuse kinazei sunt donate în capăt turtit în situsul Hpal al pCIB 246, folosind metodele standard descrise mai devreme.

Amplificarea și asamblarea celei de-a patra pătrime

Șablon: U21-U26 și 122-128

Primeri PCR Citire înainte: P7(a): 5’-RFFRFAAFFF CCCC FFCRRF ACCFF-3’ reversă:

P₈(a): 5’-ATCATCGATG AGCTCCTACA GCTGATCGAT GTGGTA-3’ Primeri pereche 4: P7(a) + Ps(a) Primeri pereche 3: Ps(a) + P6(a) Primeri pereche pentru superpozarea PCR: P7(a) + Ps(a)

Produsul PCR a patra pătrime: GGTGAA.....ATCAGGAGCTCATCGATGAT (484bp) a treia pătrime: TTCCCCCTGTA.....

TTCACCGG (484bp) a doua jumătate:

GGTGAA-----CATGATGAT (953bp)

Pentru clone sigure sunt identificate prin minitrierea plasinidului și sunt uite riorsecvențializate prin metode standard.

Plasmida Bt.P2nr.l conține cu aproximație secvența corectă a celei de-a patra pătrime, cu excepția a două mutații. Acestea sunt la poziția 1523 (substituind o A cu o G, rezultă o schimbare a unui aminoacid care substituie His cu Arg) și la poziția 1643 (substituind o '1 cu o C, rezultă o substituire a unui aminoacid Ser cu Thr).

Plasmida B1.P2 nr. 1 este folosită la construirea pClB 4414, descrisă mai departe. (Greșelile sunt în final corectate prin hibridizarea tuturor oligomerilor celei de-a patra pătrime, digerarea cu Apal/BstEII și înlocuirea acelei regiuni în pC!B4414. De aceea, numai secvențele de la poziția 1842 -1960 rămân din Bt,P2 nr. 1 în construcția finală).

Exemplul 3 Asamblarea și repararea genei sintetice finale. Gena sintetică din porumb îmbunătățită, Bt CrylA(b) este proiectată să fie donată în pătrimi. Folosind tehnica PCR, apar totuși mutații, care de cele mai multe ori sunt deleții ce determină mutații prin decalare de ferestre. De aceea, plasmidele care conțin pătrimile individuale, sunt secvențializate, iar porțiunile corecte sunt ligate laolaltă prin metoda standard.

După obținerea primei și a celei de-a doua clone cu secvența aproape de cea dorită, sunt construite plasmidele pEBLQ nr.4 și pEBEQ nr.5, pentru a obține secvența dorită a genei Bt sintetice până la situsul DralII la baza pereche din poziția 634 (această mutație distruge situsul DralII). Structurile pEBlQ sunt realizate prin ligarea unui fragment EcoNI/BamHI de 3,9 kb din pBl-8 cu un fragment de 400 din pQAl. pEBlQ nr.5 are secvența dorită până la situsul DralII, dar pEBlQ nr.4 are o mutație la nivelul bazei perechi din poziția 378.

Plasmidele pLHIM4 și plHIMssunt construite pentru a repara situsul DralII în pEBlQ nr.4 și pEBlQ nr.5. Plasmidele plHIM nr.4 și nr.5 sunt realizate prin ligarea unui fragment Ecol/Aatll de 3,5 kb din pl/BlQ nr.4, respectiv nr.5, cu un fragment Ncol Aal II de 500 bp din pQB5. Plasmida plHIM5 conține o mufație înlre situsurile Sacii la poziția 884, în a doua pătrime a genei sintetice. Plasmidul plHIMi conține o mutație adițională, așa cum s-a descris la structura sa precursoare, pEBlQ nr.4.

Situsul Sacii în regiunea vectorului Bluescript a plHIM i este deletat prin tăierea plHIMi cu Not I și Bac I convertirea acestor situsuri în capete turtite folosind ADN polimerază Ti în condiții standard, înainte de ligarea acestui fragment pentru a forma pllllM4 S. Deleția situsului Sacii din regiunea vectorială permite îndepărtarea fragmentului Sacii de 90 bp cu mutație la poziția 884 în a doua pătrime a pl#î2u S, înainte de înlocuirea cu un fragment Sacii de 90 bp. Oligomerii U/L 12 și 13 sunt supuși kinazei și hibridizați (descris anterior), înainte de tăierea cu Sacii și izolarea unui fragment de 90 bp pe un gel Nusieve 2%. Fragmentul Sacii este ligat într-un vector plHIM4 S de aproximativ 3,8 kb tăiat cu Sacii, care a fost supus fosfatazei CIP. Structura reparată cu Sacii se numește pHyB2 nr.6. Orientarea fragmentului Sacii în pHYB2 nr.6 este detectată prin tăiere PCR, așa cum s-a descris anterior, folosind următorii primeri:

MK23A28 = 5’-GGGGCTGGGGAT GCTGCCCT-3’

Μ K25 A28 = 5 ’ -G AGCTG ACCCTG A CCGTGCT-3’

MK26 A28 = 5’-CACCTGATGGACA TCCTGAA-3’

Conducând reacțiile PCR cu 50 pmoli de primeri MK23A28 și MK25A28 se produce un fragment de aproximativ 180 bp, arătând că fragmentul inseraL legat de situsurile Sacii în pHYB2 nr.6 este în orientare directă, folosind primeri MK25A28 și MK26A28 în testele de triere PCR ca și control negativ, se produce un fragment de aproximativ 180 bp doar în structurile ce conțin fragmentul legai de Sacii în orientarea greșită.

Secvența pHYB2 nr.6 se determină prin metode standard.

pIIYB2 nr.6 are o mutație la poziția 378. care necesită repararea, pentru a obține o primă pătrime cu secvența dorită.

Plasmida plHG nr.6 conține secvența dorită pentru întreaga primă jumătate a genei sintetice Bt pil IG nr.6 este realizai dintr-un fragment AatlI/’Ncal de 3,4 kb din plIIIMS nr.2 ligat la un fragmenl AatlI/NcoI de 500 bp din pHYB2 nr.6.

Pentru a idenlifica clonele sau clonele parțiale ale genei sintetice, care conțin ferestre de citire deschise, se folosește vectorul de selectare komaniicină (descris anterior). A patra pătrime a genei sini elice Bt este prima introdusă în caseta kanamicină pKM74-4 conține fragmentul Apal/cea I de aproximativ 500 bp din plasmida BtP2 (care a fost anterior transformat într-o linie de baraj E.coli Po-100 spre a fi capabil de a fi tăiat de Clăi, ligat depUC:KM74-4 tăiat cu Apal). Plasmida pKM74-4 prezintă rezistență la kanamicină, dar ulterior se descoperă că are două mutații la pozițiile 1523 și 1643 (mutațiile sunt descrise anterior, în secțiunea privind donarea celei de-a patra pătrimi, acestea sunt substituiți, nu deleții ori inserții).

Prima jumătate corectă a genei sintetice Bt din plasmida plHG nr.6 este inserată în plasmida pKM74-4. Plasmida rezultată, desemnată pKm 124, este formată din fragmentul Apal/BamHI de aproximativ 3,9 kb derivat din pKM74-4, ligat la fragmentul Apal/BamHI de 1 kb din plHG nr.6. pKm 124 prezintă rezistență la kanamicină. Această plasmidă conține prima, a doua și a patra pătrime a genei sintetice, formând o singură fereastră de citire deschisă.

A treia pătrime a genei sintetice este donată ulterior în pKM124. Prima clonă funcțională, în plasmida pBt:Km nr.6, este o copie funcțională a genei sintetice

CrylA(b), fragmentată în caseta Km, care prezintă rezistență la kanamicină, dar care conține mutații prin deleție între a treia și a patra pătrime. Plasmida pBl; Km nr.6 este realizată din fragmentul vectorial Apal/Ncol pEM124 de aproximativ 5 kb ligat la fragmentul Apal/Ncol de aproximativ 500 bp din pQCN 103/pQCN103 conține o mutație prin neadaptare la poziția 1326. care este reparată mai târziu. Se pare că activitatea nudeazică prin contaminare a deletat situsul Apal intre a treia și a patra pătrime în pBT: Km nr.6. Gena Bt codificată de gena sintetică în plasmida pBt: Km nr.bdeține aproximativ 50...60% din activitalea proteinelor native împotriva BCB Fragmentul Smal/BamlII de 2 kb din pBt: km nr.6 este inserat într-o casetă de exprimare 358: pentru a forma o plasmidă desemnat 35S: Bt6.

Două clone sintetice Bt funcționale, având fiecare mutații, se obțin inițial, plasmidele pBT:KM nr.6 și pCIB 4414, pCIB4414. care este activă 100% în biotestele pe insecte împotriva dăunătorului european al cerealelor, comparativ cu gena nativă conține mutații de substituție în a treia și a patra pătrime la pozițiile 1323, 1523 și 1634.

pCIB4414 este construită din două plasmide, MG3G4 nr.18 și 1HG, care s-a descris anterior. MG3.G4 nr.18 este obținut prin donarea fragmentului Apal/Kpal din plasmida BtP2 nr.l în pQCN103 (folosind aceleași situsuri de restricție). Aceasta produce o plasmidă ce conține a treia și a patra pătrime a genei. Prima jumătate a genei sintetice din plasmida 1HG este tăiat cu BamHI și Ncol și mutată în MG3.GH nr.18 (ce conține a treia și a patra pătrime a genei. Plasmida rezultată, jk^IB4414, conține o versiune funcțională a genei sintetice. Deși este funcțională, gena sintetică din această plasmidă conține trei erori: poziția 1326 (G substituită cu C), poziția 1523 (substituția A cu G) și la poziția 1643 (substituția T cu C).

A patra pătrime din pCIB4414 este înlocuită cu un fragment Apal/BatE II de 354 bp obținut prin hibridizarea, ligarea și clivarea de restricție a oligomerilor pătrimii a patra (cum s-a descris anterior) și izolarea fragmentului dintr-un gel de agaroză Nusieve 2% pCIB4408 este o clonă de genă sintetică Bt obținută prin înlocuirea fragmentului de pătrime a patra în pCIB 4414 cu fragmentul hibridizai de pătrimea a patra. Pentru a insera promotorul Qi MV 35S la începutul genei sintetice, pCIB4406 este realizat dintr-un fragment EcoNI/Kpal de 4 kb din plasmida p35SB16 și un fragment EcoNI/Kpal de 1,8 kb din pCIB4408.

p(ΠΒ4406 este 100% activ (în comparație cu proteina din gena nativă) împotriva ECB dar conține mutația prin substituții în cea de-a treia pătrime a genei sintetice, la poziția 1323, determinând substituția unui aminoacid (leucină cu fenilalanină). Plasmida pBS123 nr. 13 este folosită pentru repararea acestei mutații.

Fragmentul pentru cea de a treia pătrime din plasmida pBS123 nr.13 este realizat dintr-un oligomer hibridizat de aproximativ 479 bp. Oligomerii pentru a treia pătrime, U15 - U20 și L15 - L21 sunt supuși kinazei, hibridizați și ligați, după cum s-a descris anterior. Reacțiile PCR se desfășoară așa cum a fost descris anterior, cu primeri P5 (a) și P6 (b)în 15 cicluri. Produsul PCR este tratat cu proteinkinază K într-o concentrație finală de aproximativ 50 ^g/ml într-un volum aproximativ de 90 μ\, timp de 30 min, la 37°C, apoi timp de 10 min, la 65°C.(Crowe et al., Nucleic Acid Research, 19:184, 1991). Ulterior, produsul este extras cu fenol/cloroform și precipitat cu etanol, folosind metode standard, înainte de tăierea cu enzime de restricție Apal și Ncol.

Fragmentul PCR Apal/Ncol de aproximativ 450 bp la un fragment vectorial Apal/Ncol de 3,8 kb din plHG nr.6, pentru a forma pBS 123 nr.13. Plasmida pBS123 nr.13 conține secvența dorită pentru cea de-a treia pătrime a genei de porumb îmbunătățite CiylA(b) de la poziția 1319, la nivelul situsului NspI până la situsul Apal la poziția 1493. Acest fragment Nspl/Apalde 170bp din pBS123 nr. 13 este utilizat la gena sintetică

CrylA(b) complet activă în plasmida pCIB 4418.

Testele Western biol. 'Iestele Western blot pentru diverși transformanți se realizează cu extracte pure obținute din E.coli crescută pe medii selective. Cu o ansă, culturile sunt zgâriate de pe mediile proaspete ce conțin transformanții de interes ce au fost lăsate peste noapte să crească la 37°C. Controlul pozitiv pentru exprimarea genei Bt în E.coli a fost o structură desemnată pCIB 3069, care conține gena nativă Bt-K fuzionată cu promotorul CaMV 35S exprimabil la plante, pCIB3069 conține și promotorul 35S legat operațional la gena pentru rezistență la higromicină, promotorul 35S având intronul Adh nr.l legat operațional la gena GUS și promotorul 35S legat operațional la o genă ce codifică producerea PI native Bt CryLA(b). Este inclus în teste și un control negativ al E.coli care nu conține o genă Bt. Culturile sunt resuspendate în 100 μΐ tampon de încărcare, ce conține 62 mM Tris-HCl, pH=6,8, 1% SDS, 0,0025% albastru bromfenol, 10% glicerol și 7,5% mercaptoetanol. După încălzirea amestecului la 95°C, timp de 10 min, preparatele sunt supuse ultrasunetelor timp de 1...3 s. Fragmentele sunt centrifugate într-o microcentrifugă la temperatura camerei, timp de aproximativ 5 min, iar 10...15 μ\ din fiecare mostră este încărcată pe un gel de acrilamidă cu 10% gel mobil pe 6% gel stratificat (Laemmli, Nature, 224:680-685, 1970). După electroforeză până a doua zi la 10 mAmps, proteinele sunt transferate din gel pe o membrană immobilon (Millipore). Transferul se face utilizând un element de absorbție electroforetică (American BioNuclear, Emeryville, CA) în tampon de transfer (20 mM Tris, 150 mM glicină, 20% etanol), timp de 1,5 h, la 450 mAmps. Mediiletampon pentru Western blot cuprind:

Oi

Tampon de blocare:

?.% Tween - 20;

mM Tris.BCl pH = 10.2;

150 mM NaCl.

Tampon de spălare:

0.05% Tween - 20;

mM Tris-HCl pH = 10,2:

150 mM NaCl.

Tampon de deezvoltare:

100 mM Tris-HCl pH=C6;

100 mM NaCl:

mM MgClz.

După încheierea transferului, membrana este incubată timp de aproximativ 10 min în tamponul de blocare. Se fac trei spălări, de câte a 15 min. cu tampon de spălare, înainte de prima tratare cu anticorpi. Primul anticorp este un anticorp cu imunoafinitate purificai de iepure sau capră, preparat folosind proteina CrylA(b) ca antigen (Ciba-Geigy, RTP, N.C.: Rockland inc., Gilbertsville, PA: și Berkelly Antibody CO., Richmond, CA). Anticorpul specific CryLA(b) este tratat imediat înainte de utilizare cu lizat de E.coli din Bio-Rad, într-un volum de 1 ml, cu 5 /zg anticorp, 50 /zg lizat de E.coli în soluția tampon de spălare. Acest amestec este incubat timp de 1 h, la temperatura camerei, înainte de a fi diluat 1 la 30, pentru o diluție finală de 1:6000, cu tampon de spălare. Incubarea membranei cu primul anticorp se face la temperatura camerei, timp de 1,5 h.

Se fac trei spălări de câte 10 min, între prima și a doua tratare cu anticorpi. Al doilea anticorp este anticorp de iepure anti- capră sau anticorp de capră-anti-iepure, conjugat cu fosfatază alcalină. (Sigma StLouis, Mc). Incubarea cu fosfataza alcalină conjugată se desfășoară la temperatura camerei, timp de 1 h, folosind o diluție 1 la 6000 în tampon de spălare. Se fac șase spălări de câte 10 min, între tratarea cu al doilea anticorp și reacția Western blot, Western blot are loc în 100 ml tampon de dezvoltare, cu 440 /zl de nitrobluetetrazolium în 70% dimetilformamidă (75 mg/ml) și 330 /zl de

5-brom-4-clor-indolil fosfat în 100% di«2 metil-lormamidă (50 mg/ml). După dezvoltare timp de 15...30 min, membrana este spălată în apă și uscată la aer.

Exemplul 4. Construcția vectorilor de transformare

Construcția pCTB710 și a derivatelor

Plasmidele cu casetă pentru promotorul CaMV 35S. pCIB709 și pCIB710. sunt construite după cum se arată în Rothsteni et al.. Gene, 50:153-161 (1987). pCIB710 conține promoloruJ CaMV și secvențele de terminare a transcripției pent ru Iranscriptorul ARN 35S/Covey et Nucl.Acids.Res., 9:6735-6747 (1981)/. Un fragment de restricție BglII de 1149 bp al ADN CaMV /bp 6494 - 7643 în Hohn et al., Current topice in Microhiology and Immunology, 96:194-220 și Appendices A-G (1982)/ este izolat din ADN CaMV prin electroforeză preparativă pe gel de agaroză, așa cum s-a descris anterior. Fragmentul este amestecat cu plasmidul ADNpUC 19 clivat cu BamHI, tratat cu ligaza ADN T4 și transformat în E.coli (de notat că situsul de restricție BamHI din plasmida rezultată este distrus prin ligarea capetelor coezive ale Bgl II la capetele coezive ale BamHI).

Plasmida rezultată, desemnată pUC19/35 S este apoi folosita în mutageneza in vitro direcționată de oligo-nucleotide, pentru a insera secvența de recunoaștere GGATCC a BamHI, imediat după nucleotidele 7483 al CaMV , în referința Hohn. Plasmida rezultată pCIB710, conține regiunea promotorului CaMV 35 S și regiunea de terminare a transcripției separate printr-un situs de restricție BamHI. Secvențele ADN inserate în acest situs BamHI vor fi exprimate în plante, prin această secvență de reglare a transcripției CaMV. (De notat, de asemenea, că pCIB710 nu conține nici un codon ATG de inițiere a translației între începutul translației și situsul BamHI).

pCIB710 este modificat pentru a realiza pCIB709 prin inserarea unui fragment BamHI ce conține secvența de codare pentru higromicin fosfotransfera110263 za din pLG90 /Rothstein et al.. Gene.

53:153-161 (1987)/, în situsul BamHI.

pC!B709 este modificat pentru a realiza pCIB996 prin îndepărtarea ATG din amonte de codonul de inițiere al genei pentru higromicin- fosfotransferază, prin tehnici standard de mutageneză prin care se insera un situs de restricție BglIII în această localizare. Plasmida rezultată. pCIB 996, este modificată apoi prin îndepărtarea, din codonul de inițiere, a situsurilor BamHI și BglIII din regiunea dc dirijare netranslată 5’, localizată 5’, a codonului de inițiere. Rezultatul este o modilicăre a secvenței de bază ADN din TATAAGGATC CCGGGGGCA AGATCTGAGA Ί ATG Hyg în - TATAAGGATC TGAGATATG Hyg. Plasmida rezultată este desemnată pC!B3073.

Alternativ, pCIB710 este modificată pentru a realiza pCIB 900 prin inserarea fragmentului BamHI - Beli al pCIB 10/35 SBt, care conține secvența de codare Bt a aminoacidului 645, descris în Partea C4 de mai jos, în situsul BamHI a pCIB 710, pentru a forma pCIB710/35 S Bt. Pentru a introduce un marker pentru rezistență la antibiotice, pC!B709 este tăiat cu Sall, este ligat un adaptor Kpal/SaII, iar produsul de ligare rezultat este tăiat cu KpnI. Fragmentul Kpa I al pCIB 709, conținând gena pentru rezistență la higromicină/35 S, este inserat în situsul Kpal al pCIB710/35 S Bt, pentru a realiza pCIB 900.

Gene utile, ca genă marker selectabilă, includ gena pentru rezistență la higromicină descrisă în Rothstein et al., Gene, 53:153-161 (1987). Gena pentru higromicină descrisă în această referință este mutată într-o plasmidă pUC, cum ar fi pCIB710 și pCIB709, iar ATG suplimentar'' din amonte de secvența de codare pentru higromicin - fosfotransferază este îndepărtat pentru a realiza pCIB996. Această genă modificată pCIB 996 este iar modificată prin îndepărtarea situsurilor BglII, BamHI și Smal din regiunea 5’ a genei, folosind tehnici standard de biologie moleculară, pentru a realiza p( 'IB 3073.

pCl B 9.32 este o plasmidă pe bază de pUC 19. ce conține gena - himerică Pep-C: promotor /Bt/Pep-C: terminalor. Este compus din fragmente derivate din pPEP-

10. o subclonă HindIIl a unei clone genomice, Hl-lambda -14, PNAS USA, 83:2884-2888 (1986), a unei gene de porumb ce codifică enzima PEP carboxilază activă în fotosinteză, și din pGIB 930. care este un fragment BamHI ce conține aminoacidul 645 fragmentat din genă CrylA(b) pentru endotoxină în situsul BamHI (a) pUC18.

f ragmentul EcoRI-X-hoI de 2,6 kb din pPEP-10. conținând situsul de adiție poli A din gena PEP carboxilază, este izolat și digerat cu PatI și Hinc II. Digestiade restricție este ligată cu pUC 18 digerat cu Patl/HincII, transformată în E.coli. iar transformanții triați pentru depistarea acelora care conțin o inserție Patl+Hincll de 412 bp, inserția fiind verificată prin secvențializare. Plasmida rezultată este desemnată pCIB931.

Gena nucleară care codifică izoenzima fosfoenolpiruvatcarboxilază (PEPC) este descrisă în Iludspeth et a\.,Plant Molecular Biology, 12:579-589 (1989). pCIB932este construit prin ligarea celor trei fragmente. Primul fragment, conținând terminatorul transcripției PEP-C, este produs prin digerarea completă a pCIB931 cu HindIIl, parțială cu Sphl, iar fragmentul de 3098 bp este izolat Al doilea fragment, conținând secvențea de codare Bt a endotoxinei, este produs prin digestia pCIB930 cu Ncol și Sphl și izolarea fragmentului de 1950 bp. Al treilea fragment, conținând promotorul PEP-C, este produs prin digestia completă a pPEP-10 cu HindIIl și parțială cu Hcol și izolarea fragmentului de 2,3 kb. Amestecul de ligare este transformat în transformanți E.coli, cu inserția corectă identificată și verificatp prin secvențializare.

pCIB932 este tăiat cuPvnII pentru a genera un fragment de 4,9 kb ce conține structura din porumb Pep-C: promo110263 tor/Bt/Pep-C: terminator și purificat pe gel de agaroză 1% LGT în IX TAE. Vectorul Îinearizat pCIB3079 și insertul de4,9kbdin pClB932sun1 ligate folosind ligaza ADN 4T. în I.GT, pentru a forma pCIB4401, pCIB4401 este un vector de transformare din porumb conținând ge ncle himerice: 35 S: promo1or/PAT/35 S: terminator, Pep-G: promolor/Bt/PcpC: terminator și 35 S: promotor/Aoh I nr. 1 intron/GUS/35S: terminator.

ConstrucțiipCIB24b (35S-GUS-35S). O casetă a promolorului CaMV 35 S. pCIB 246, este construită după cum urmează:

Situsul de restricție Dde I la poziția nucleolidului 7482 a genomului CaMV /Franck el al.. Cele, 21:285-294 (1980)/ este modificat prin inserarea unui oligonucleotid de 48 bp ce conține câteva situsuri pentru enzime de restricție, incluzând un situs Ncol (CCATGG) un situs Săli (GTCGAC) și un situs SstI (GAGCTC). Acest promotor alterat CaMV 35 S este inserat într-un vector pUC19 care a fost modificat prin distrugerea situsurilor SstI și Săli ale vectorului. în acest fel, promotorul CaMV 35 S al pCIB1500 conține situsuri unice Satl și Săli pentru donare.

pCIB1500 este digerat cu Sstl/Ncol și ligat cu gena GUS obținută din pBi221 (Clontech Laboratories, inc., Palo Alto, CA). Situsul Ncol este fuzionat la gena GUS, în așa fel încât ATG al situsului Ncol funcționează ca și codon de pornire, pentru translația genei GUS. Semnalele de poliadenilare și terminare ale CaMV 35 S sunt folosite pentru capătul 3’ al genei - himerice.

Construcția pCIB3069 (35 5’-AdhlGUS-35 S). pCIB246 este modificat prin adăugarea intronului Adhl nr.l al genei alcooldehidrogenazei din porumb (Dennisetal., Nucleic Acids Research, 12:39834000, 1984) Săli a pCIB246, pentru a forma plasmidul pCIB3007. In tronul Adhl este excizat din gena Adhl din porumb cu fragment Ball/PstI și subclonat în pUC18, care a fost tăiat cu Smal/PatI, <><>

pentru a forma o plasmidă desemnata Adh 1026. Adhl026 este tăiat cu Pvall/Sacll, fragmentelor li se produc capete turtite cu ADN polimeraza T4. sunt adăugați linkeri Săli folosind metode standard iar un fragment de aproximativ 560 bp este recuperat din gel 3% Nusieve și ligat în pUC18 tratat cu fosfatază și tăiat cu Sall. lntronul Adh nr.l linkat cu Săli, din plasmidă rezultată, este tăiat cu Sall. purificat în gel și ligat în pCIB 246 tratat cu foslatază și tăiat Sall, pentru a forma plasmida pCIB3007.

pCIB3007 este tăiat cu PstI, iar capetele sunt turtite cu ADN polimeraza 4'4 (New England Biolabs), în conformitate cu precizările furnizorilor. Moleculele cu capete turtite rezultate sunt tăiate cu Sphl, iar fragmentul de aproximativ

5,8 kb, având un capăt turtit și un capăt Sphl, este purificat pe un gel de agaroză cu temperatură joasă de gelifiere (LG Γ), folosind metode standard. pCIB900 este tăiat cu Smal/Sphl, iar fragmentul ce conține gena 35 S/Bt este purificat pe un gel de agaroză LGT. Cele două fragmente purificate în gel sunt legate în agaroză LGT, folosind ADN ligaza T4 în conformitate cu condițiile standard. Fragmentele ligate rezultate sunt transformate în E.coli prin metode standard, iar plasmidul rezultat este desemnat pCIB3062. Există două versiuni ale pCIB3062. pCIB3062 nr.l are un situs Smal regenerat în care capetele turtite ale situsului Smal și polimeraza 4'4 sunt ligate. Aceasta rezultă cel mai probabil prin ștanțarea de către polimeraza T4 a câtorva baze perechi din situsul PstI în cursul reacției de turtire. pCIB3062 nr.3 nu are acest situs Smal.

pCIB3062 nr.3 este tăiat cu Kpal și capetele îi sunt turtite cu ADN polimeraza T4, iar apoi tăiat cu PvuII pentru a produce un fragment de 6,4 kb cu capete turtite, ce conține genele 35 S/GUb și 35S/BL Acest fragment cu capete turtite este ligat într-un CIB3073 tăiat cu Smal, pentru a produce pCIB3063 sau pCIB3069. pCIB3069 conține același fragmenl folosit pentru a realiza pCIB3063, dar genele himerice din pCIB3069 sunt toate în aceeași orientare relativă, spre deosebire de cele din pCÎB3063. Aceste plasmide conțin: a) un promotor 35 S legat operațional la gena pentru rezistență la higromicină; b) un promotor 35 S cu intron Adh nr. 1. legat operațional la gena GUS; c) un promotor 35 S legat operațional ia o genă ce codifică producerea proteinei insecticide CryiA(b) sintetice din Bacillus thuringiensis, așa cum s-a descris anterior.

Teslele GUS. Teslele GUS se realizează, în general, după descrierea din Jelîerson, Plani Mol. Bio. Reporter, 5:387405 ț 1987). Așa cum s-a arătat anterior, plasmida pCIB246 conține un promotor CaMV 35 S, fuzionat cu gena GUS. Ramura principală 5’ netranslatată a acestei gene himerice conține o copie a intronului Adh nr.l de porumb. Aici este folosit ca un control al transformării. Deși se adaugă aceeași cantitate de pCIB246, la fiecare transformare activitatea calculată variază la structurile Bt testate. Valorile comunicate mai jos reprezintă media a 3 probe. pCIB4407 a fost testat de două ori, pCIB3069 28 nM MU//ig/min pCIB4407 0,7 nm MU/ /zg/rnin, 2,3 nM MU/z/g/min.

Exemplul 5A Testul activității insecticide a genei CrylA(b) sintetice împotriva dăunătorului european al cerealelor

Gena CrylA(b) sintetică din pCIB4414 din E.coli este testată pentru activitatea insecticidă împotriva dăunătorului european al cerealelor, în conformitate cu protocolul următor;

Hrana artificială pentru insecte, topită, este turnată într-o cutie Petri, cu capac Gellman de 60 mm. După solidificare, celulele de E.coli, suspendate în 0,1% Triton X-100 sunt împrăștiate p^ suprafață^ la o concentrație de 3 x 10 celule/cnT. Cutiile sunt uscate la aer. Primele zece elemente de dăunător european al cerealelor, Ostrinia nubilalis, având vârsta sub 12 h, sunt plasate pe (>8 suprafața hranei, iestul este incubat la 30°C, la întuneric complet, timp de 2...5 zile. La sfârșitul testului, se înregistrează mortalitatea în procente. Oclonă pozitivă a fost definită ca fiind aceea care determină o mortalitate de 50% sau mai mare, atunci când celulele E.coli dau o mortalitate de referință de 0...10%.

Pentru comparație, gena CrylA(b) nativă din pCIB3069 este testată la aceeași concentrație. (^Ionele sunt testate pe3x 10 celule/cm hrană; 20 insecte per clonâ.

Suni observate următoarele rezultate:

(lona MortaUtale-procenie

Goni rol0 pClB3069100 pCIB4414100

Aceste rezultate arată că proteina insecticidă, cristalină, produsă de gena sintetică CrylA(b), este activă împotriva dăunătorului european al cerealelor, în comparație cu activitatea Pi produsă de CrylA(b) nativă.

Alte plasmide ce conțin o genă CryLA(b) sintetică au fost testate într-o manieră similară.

Exemplul 5AB. Testul activității insecticide a proteinei CrylA(b) împotriva dăunătorului trestiei de zahăr.

CrylA(b) a fost exprimată în E.coli și testată pentru activitatea insecticidă împotriva dăunătorului trestiei de zahăr (Diatrea secoharalis), în conformitate cu același protocol utilizat pentru dăunătorul european al cerealelor, descris imediat anterior. Rezultatele sunt însumate în tabelul următor:

Testul trestiei de zahăr cu proteina

Concentrația proteinei, (ne/e)	Mortalitatea procente, CrylA(b)
10	0
25	0
50	7
100	13
250	40
500	53
1000	80
IC 50	380
95% CI	249 - 646

Rezultatele arată că proteina insecticidă produsă de o genă de porumb îmbunătățită Bl este activă împotriva dăunătorului trestiei de zahăr. Concentrațiile superioare de proteină CrylA(b),

250...1000 mg/g pot fi atinse în plantele transgenice de porumb, produse conform invenției dc față.

Exemplul 6. Izolarea protoplaștilor din porumb și transformarea cu gena sin teii că Bt

Exprimarea genei sintetice Bt este testată în protoplaști de porumb, transformați pasager.

Metoda izolării protoplaștilor

1. Conținut ul a 10 cult uri în suspensie de porumb 2717 Linia 6, în vârstă de 2 zile este pipeta! în tuburi sterile de 50 ml și lăsate să se liniștească, lot mediul de cultură este apoi îndepărtat și aruncat.

2. Celulele (dintr-un volum de 3...5 ml) sunt resuspendate în 30 ml soluție de enzimă protoplastică. Rețeta este următoarea:

- 3% celuloză RS;

- 1% macerozim R10 în tampon KMC;

Tampon KMG (rețetă pentru 1 litru):

KC1 8,65g;

MgCl2 - 6H2O 16,47g;

CaC12 - 2H2O 12,50g;

MES 5,0 g;

- pH=5,6 sterilizat prin filtrare.

3. Se amestecă bine celulele și soluția în cutii Petri 100 x 25 mm, aproximativ 15 ml per cutie. Se agită, într-un agitator rotativ, timp de 4 h, pentru digestie.

4. Se pipetează 10 ml KC1 prin fiecare sită de 100 μ, folosită. Se filtrează conținutul cutiilor prin sită. Se spală sita cu un volum egal de KMC.

5. Se pipetează protoplaștii filtrați, cu grijă, în tuburi de 50 ml și se rolează într-o centrifugă Backman Tj-6, timp de 10 min, la 1000 rot/min (500 x g).

6. Se îndepărtează supematantul și se resuspendă precipitatul cu grijă în 10 ml KMC. Se combină conținutul a 3 tuburi într-unul singur și se completează vo lumul până la 50 ml cu KMC.

7. Se centrifughează și se spală din nou, repetând etapa anterioară.

8. Se resuspendă toți protoplaștii spălați în 50 ml KMC. Se numără întrOo cameră dc numărat. Se centrifughează protoplaștii și se resuspendă în concentrație de 8 x lO’/ml în lampon de resuspendare (Lampon RS).

Lampon RS (rețetă pentru 500 ml): -Manitol 27,33 g;

-Cad? (0.1M) 75 ml:

- MGS 0,5 g;

-/>11 = 5,8 sterilizat prin filtrare.

Metoda transformării protoplaștilor

1. Se pun 50 ț/g plasmide ADN în soluție (structuri BtPI atât sintetică, pCIB4407, cât și nalivă. pCIB3069), în tuburi de 15 ml, din polistircn. pentru culturi. Se pun și 25 /zg plasmide ADN cu conținut de GUS (care conține BtPI, pCIB246), în toate tuburile. Se folosesc 3 probe pentru fiecare structură ce va fi testată și o probă fără ADN pentru control.

Structuri Bt Structuri GUS pCIB3069 pCIB246 pCIB4407 pCIB246

2. Se amestecă protoplaștii ușor, dar bine și se pun 0,5 ml lichid per tub.

3. Se adaugă 0,5 ml PEG-40 în fiecare tub PEG-40:

- 0,4 Manitol;

- 0,1 M Ca(NO3)2-4H2O;

- pH=8,0 sterilizat prin filtrare.

4. Se amestecă ușor pentru a combina protoplaștii cu PEG. Se așteaptă 30 min.

5. Ulterior se adaugă 1 ml, 2 ml și 5 ml soluție W5, la intervale de 5 min.

Soluția W5:

- 154 mM NaCl;

- 125 mM CaC12-H2O;

- 5 mM KC1;

- 5 mM glucoza;

- pH=7,0, sterilizat prin filtrare.

6. Se rotește, timp de 10 min, într-o centrifugă Beckman TJ-6, la aproximativ 1000 rot/min (500 g), se îndepărtează supernatant ul.

Se resuspendă, ușor, precipitatul în

1,5 ml mediu FW și se însămânțează cu grijă, pe plăci Petri de 35 x 10 mW.

Mediul FW (rețetă pentru 1 litru):

- Săruri MS 4,3 g;

- Vit. B5 200X5 ml:

- Sucroză30 g;

- Prolină 1.5 g;

- Mamtol54 g;

- 2,4 D3 mg:

-/>H=5.7. sterilizai prin filtrare.

<8. Se incubează până a doua zi. la întuneric, la temperatura camerei.

9. Se fac iestele GUS, testele pentru insecte, și ELISA cu extractele de protoplaști, după cum va fi descris mai departe.

Exemplul 7. Construcția unei gene de porumb îmbunătățite sintetice CrvlA(b) în lungime completă

Secvența 4 reprezintă secvența sintetică din porumb, îmbunătățită, ce codifică proteină insecticidă CrylA(b) în lungime completă din B. thuringiensis. Versiunea fragmentată, descrisă anterior, reprezintă aproximativ primele 2 kb ale acestei gene. Restul din gena în lungime completă este donat, folosind metodele descrise anterior. Pe scurt, această metodă realizează sinteza oligomerilor ADN cu lungime de 40—90 NT, de regulă folosind o dimensiune medie de 80 meri. Oligomerii sunt purificați prin metode standard de HPLC sau recuperați dintr-un gel de poliacrilamidă. Oligomerii purificați sunt tratați cu kinază și hibridizați pentru a forma fragmente de aproximativ 500 bp. Oligomerii hibridizați pot fi amplificați prin PCR în condiții standard. Fragmentele de 500 bp, provenite direct din hibridizare, din amplificarea PCR sunt recuperate din gelurile de agaroză după fiecare hibridizare sau amplificare PCR, sunt apoi clonate într-o plasmidă și transformate în E.coli prin metode standard.

Plasmidele recombinate ce conțin inserțiile dorite sunt identificate, după cum s-a descris anterior, folosind metode de minilriere PCR și/sau standard. Inserțiile care sunt corecte, pe baza profilului lor PCR și/sau al enziinei de restricție, suni apoi secvențializate pentru a identifica acele clone ce conțin fereastra de citire deschisă dorită. Fragmentele sunt apoi liga te împreună cu secvența sintetică de aproximativ 2 kb. descrisă în exemplul 2, pentru a forma gena de porumb îmbunătățită sintetică CrylA(b) în lungime completă, utilă pentru exprimarea unor nivele ridicate de proteină ('iylA(b) - la porumb.

Conținutul în G+C al genelor Bt native și sintetice:

- nativă în lungime completă 38,8%;

nativă fragmentată 37,2%;

- sintetică în lungime completă 64,8%;

-sintetică fragmentată 64,6%.

Procentul etnologiei versiunii finale fragmentate genei Bt față de o genă pură de porumb cu utilizare de codoni: 98,25%.

Exemplul 8. Construcția unei gene CrylA(b) de porumb îmbunătățită parțial hibridă, în lungime completă, capabilă de exprimare în plantă pCIB4434 conține o gură CiyIA(b) în lungime completă, formată din gena CryLAțb) de porumb, îmbunătățită sintetică, de aproximativ 2 kb și din restul de genă (porțiunea ce codifică COOH terminal) al genei native. în acest fel, regiunea de codare este o himeră între gena sintetică și gena nativă, dar proteina care rezultă este identică cu proteina nativă CrylA(b). Regiunea sintetică este cuprinsă între nucleotidele 1 și 1938 (aminoacizii 1-646), iar secvența de codare este cuprinsă între nucleotidele 1939 și 3468 (aminoacizii 647-1155). Secvența de codare este prezentată în fig.7. O hartă a pCIB 4434 este arătată în fig.8.

Următoarele oligomere au fost proiectate să formeze: pCIB4434: KE 134a28 = 5’- CGTGACCGAC TACCACATCG ATCAAGTATC CAATTTAGTTGAGT-3’

KE 135A28 = 5’-ACTCAACTAA ATTGGATACT TGATCGATGT

CiG 1 ’AGTCGG TCACG- 3’

KE 136A28 = 5’-GCAGATCTGA

G El’C T T A G G T ACC C A A TA G C

GTAACGT-3’

KE 137A28 = 5’GCTGA EFATG CATCAGCCTAT-3’

KE 138A28 = 5 -GACGATCTGA GCTCTTA'ITC CTCCATAAGA AGΓΑΑ ITC-3'

MKO5 Λ28 - S’-CAAAGG 1 ACC CAAΊ AGCG'I A ACG-3’

MK 35 A 28 - 5'AACG AGGTG1 ACA1CGACCG-3’ [<1134434 se realizează prinți o ligare in patru puncte cu un fragment de 5,7 kb din pC!B3418, un fragment de 364 bp de fuziune sintetic: nativ Bst /Il/Kpnl, generat prin PCR, un fragment nativ CrylA(b) dc 108 bp Kpnl/Nsil din pCIB1315 și un fragment de 224 bp generat prin PCR Nsil/Bglll. Condițiile standard pentru ligare și transformare sunt cele descrise anterior.

Un fragment de fuziune de genă sintetică, nativă este realizat în două etape, folosind PCR. Primele 253 bp ale fragmentului de fuziune PCR sunt realizate utilizând 100 pmoli de oligomeri KE 134 A28 și MKOH A 28 și aproximativ 200 mg șablon CrylA(b) nativ, în 100 μΐ volum cu câte 200 mm din dNTP, IX tampon (Perkin Elmer Cetus), 20% glicerol și 5 unități Taq polimerază (Perkin Elmer Cetus). Reacția PCR se desfășoară la următorii parametri: 1 min la 94°C, 1 min la 55°C, 45 s la 72°C, cu extensie la fiecare 3’ cu 25 cicluri. O fracțiune (1%) din această primă reacție PCR este folosită ca șablon împreună cu 200 mg de ADN sintetic CrylA(b), pentru a forma fragmentul de fuziune sintetic nativ complet (351 bp). Oligomerii folosiți drept primeri PCR în cea de-a doua reacție PCR sunt 50 pmoli de MK 28, 50 pmoli de MK 04 A și 25 pmoli de KE 135 A 28. Amestecul de reacție PCR și parametrii sunt aceiași cu cei enumerați anteior. Fragmentul de fuziune sintetic, nativ de 351 bp rezultat este tratat cu proteinkinază K la o con74 centrație totală de 50//g/ml, apoi extras cu fenol/cloroform, urmată de precipitarea cu etanol înainte de tăierea cu

BslEII/Kpnl în condiții standard.

Fragmentul PCR N și I/BglII de 224 bp folosit pentru realizarea pCIB4434 este realizat la rândul lui cu 100 pmoli de oligomeri KE 137 A 28 și KE 138 Λ 28 și 200 mg de genă nativă CrylA(b) ca șablon, în 100 //I volum cu același amestec de reacție PCR și parametri enumerați anterior. Fragmentul PCR nativ CrylÂ(b) de 230 bp esle tratat cu proteinkinază K, extrasă cu fenol/cloroform și precipitată cu etanol după cum s-a descris anterior. înainte de tăierea cu Nsil/Bglll.

pCIB4434 a fost transformat în protoplaști de porumb, așa cum s-a descris anterior. Protoplaștii Liniei 6 2717 au fost folosiți împreună cu pC!B4434 și pCIB4419 ca martor pentru comparare.

Rezultatele sunt prezentate mai jos: ng Bt/mg proteină 4419(35S) 14,400 + 2.100

4434(lungime corn 2.200+ 900

Referință = 13 ng Bt/mg proteină pentru protoplaști netransformați.

Rezultatele arată că pCJB4434 se exprimă la un nivel de aproximativ 5% față de pCIB4419.

Testele Western blot arată că cel puțin o treime din proteine CrylA(b) produsă de pCIB4434 în acest sistem are dimensiuni de aproximativ 130 KD. De aceea o cantitate semnificativă de proteină CiylA(b) în lungime completă este produsă în celulele de porumb prin exprimarea pCIB4434.

Exemplul 7. Construirea unor gene CryL4(b) în lungime completă, ce codifică o proteină CryIA(b) termostabilă

Structurile pCIB5511-5515, ce conțin fiecare o genă CrylA(b) în lungime completă sunt descrise mai jos. în aceste secvențe, deleția a 26 aminoacizi între aminoacizii 793 și 794, KCGEPNRCA PHLEWNOLDCSCRDGE, prezentă în CiylA(a) și CiyLA(b), dar nu în Ciy IA(b), a fost reparată. Gena din pCIB5513 este sintetică: celelalte patru gene sunt hibride și de aceea sunt parțial oplimizate.

('onslru irea p( IB5511

Plasmida este o derivată a pCIB4434. O hartă a pCIB5511 este arătată în fig. 10. Un segment de 435 bp de ADN, între bp 2165 și 2590 a fost construit prin hibridizarea oligomerilor sintetici proiectați să formeze banda superioară și inferioară, așa cum a fost descris anterior. pentru construirea genei CrylA(b) fragmentate. Acest segment de ADN sintetic este sintetizat prin tehnici standard, cunoscute în domeniu, și includ deleția a 26 aminoacizi, care survine în mod natural în proteina CrylA(b) din Bacillusthuringiensis kurstaki HD-1. întregul segment ADN inserat folosește preferențialitatea codonilor de porumb îmbunătățiți, pentru a codifica aminoacizii. Cei 26 aminoacizi folosiți, pentru a repara deleția produsă natural, sunt cuprinși în acest fragment. Ei sunt inserați începând de la poziția 2387, între situsul Kpnl la nt 2170 și situsul Xbal la nt 2508 (2586 din pCIB5511) ale pCIB4434. pCIB55U este construit prin ligare în trei puncte, folosind un fragment de 3,2 kb deținut prin digestie de restricție a pCIB4434 cu Sphl și Kpnl, un fragment de 3,8 kb obținut prin digestia pCIB4434 cu Sphl și Xbal și un fragment de 416 bp obținut prin digestia ADN sintetic descris anterior, cu Kpnl și Xbal. Reacțiile enzimatice se derulează în condiții standard. După ligare, amestecul ADN este transformat în celule competente E.coli prin metode standard. Transformanții sunt selectați pe L-agar ce conține 100 μβ/ιηΐ ampicilină. Plasmidele din transformanți sunt caracterizate prin metode standard de minitriere. Secvența genei CrylA(b) reparate, care codifică proteina CryLA(b) termostabilă (stabilă la căldură) este prezentată în fig.9.

Construirea pCIB5512

Această structură plasmidică este un derivat al pCIB4434.0 hartă a pCIB5512 este arătată în fig. 12 ADN căruia trebuie să i se repare deleția a 25 aminoacizi este realizat prin tehnica standard de sinteză ADN și reacție enziinatică. Trei casete de ADN dublu catenar, pGF cas 1, pGF cas 2 și pGG cas 3. fiecare în dimensiune de aproximativ 300 bp. sunt pregătite. Aceste casete sunt proiectate să conțină codonii îmbunătățiți de porumb, menținând în același timp identitatea de 100% aminoacizilor cu proteine insecticide. Aceste casete sunt folosite pentru a înlocui regiunea cuprinsă între situsurile de restricție BstEIl la poziția 1824 și Xbal la poziția 2508 și includ inserția a 78 bp adiționale, care codifică cei 26 aminoacizi lipsa (descris anterior pentru pClB5511 din pCIB4434). Fiecare din aceste casete este donată într-un situs EcoRV al vectorului în Bluescript (Stratagene) prin tehnici standard. Cele trei casete sunt proiectate să conțină situsuri de rest ricție a suprapunerii. Caseta 1 are situsuri de restricție BstEIl la capătul 5’ și EcoRN la capătul 3'; caseta 2 are EcoRV la capătul 5’ și Clăi la capătul 3’, iar caseta 3 are Clăi la capătul 5’ și Xba I la capătul 3’. Ele sunt donate individual în Bluescript iar fragmentul de 762 bp complet este asamblat ulterior prin ligare, folosind tehnici standard. pCIB5512 este asamblat folosind acest fragment de 762 bp și ligându-1 cu un fragment de 6,65 kb obținut prin digestia completă a pCIB 4434 cu BetEII și digestia parțială cu Xbal. Alternativ, se poate folosi și ligarea în patru puncte, folosind același vector și cele trei casete digerate cu enzimele specifice. Reacțiile enzimatice se derulează în condiții standard. După ligare, amestecul ADN este transformat în celule competente E.coli, folosind metoda standard. Transformanții sunt selectați pe L-agar, ce conține 100 /ig/ml ampicilină. Plasmidele din transformanți sunt caracterizate prin metode standard de minitriere. Plasmida rezultată este pCIB5512. Secvența genei CryIA(b) reparate este ilustrată în fig. 11. Această CryIA(b) reparată diferă de cea conținută în pCIB5511, prin faptul că o regiune mai largă a regiunii de codare

CrylA(b) este îmbunătățită pentru exprimare la porumb folosind codoni preferențiali de porumb.

Construirea pC!B5513

Această plasmidă conține o genă CrylA(b) reparată, derivată din pCIB5512. O hartă a pCIB5513 este ilustrată în fig. 14. Regiunea 3' de la situsui Xbal la poziția 2586până ia capătul genei (situsui BglII la poziția 3572) este în totalitate înlocuită cu codoni îmbunătățiți de porumb. Această regiune este sintetizată prin tehnici standard dc sinteză ADN și reacția enzimatică. bine cunoscută în domeniu, sub forma a patru casete de ADN dublu catenar (casetele nr.4, 5, 6 și 7). Casetele adiacente au situsuri de restricție a suprapunerii pentru a facilita asamblarea între casete. Acestea sunt Xbal și Xhal la capetele 5’ și 3' ale casetei 4: Xhal și Saci la capetele 5’. respectiv 3' ale casetei 5; Saci și BstXI la capetele 5'. respectiv 3’ ale casetei 6 și Post XI și BglII ;a capetele 5’, respectiv 3’ ale casetei 7. Așa cum s-a descris pentru pdB5512, casetele sunt donate în situsui EcoRV de la capătul turtit al vectorului în Bluescript (Stratagene), iar gena CiyIA(6) în lungime completă reparată, este donată prin asamblare secvențială în Bluescript a casetelor anterioare, urmată de ligarea regiunii sintetice complete de 967 bp cu un fragment de 6448 bp reținut prin digestia completă a pCIB5512 cu BglII și digestia parțială cu Xbal. Alternativ, plasmida ce conține genele în lungime completă poate fi obținută printr-o ligare în 5 puncte a fiecăruia din cele 4 casete (după clivarea cu enzimele adecvate) și a vectorului similar cu cel anterior. Secvența genei CiyIA(b) reparată, în lungime completă este prezentată în fig. 13. Proteina codificată de diversele himere de regiuni de codare sintetice/ native și sintetice, codifică aceeași proteină. Această proteină este versiunea stabilă la căldură a CtyIA(b) produsă prin repararea deleției a 26 aminoacizi apărută natural, găsită în gena CrylA(b) din

BaciUus thuringiensis kurstaki HD-1, atunci când regiunea omoloagă este comparată cu f/z/to-endotoxinele CrvIA(a) sau

CrylA(c) din BaciUus thuringiensis.

Construirea pCIB5514 /Xceastă plasmidă este un derivat al pCIB4434. O hartă a pCIB5514 este ilustrată în fig. 16. Este realizat folosind caseta nr.3 de ADN sintetic (a se vedea mai sus), care conține o secvență de porumb îmbunătățită a regiunii cuprinse' între situsui Glal (poziția 2396). găsit în regiunea termostabilă de 26 aminoacizi, și situsui Xbal la poziția 2508 din pClB4434 (2586 din pClB5511). Regiunea cuprinsă între nt 2113 al pCIB 4434 și joncțiunea regiunii termostabile este amplificată PCR folosind ca șablon pCIB4434, cu următorii primeri: citirea înainte:

’ -GC A CCG A T ATC ACC A TCCAAG GAGGCBATGACGTATTCAAAG-3’ reversă:

5’-AGCGCATCGATTCGGCTCCC CGCACTTGCCGATTGGACTTGG GCTGAAG-3’

Produsul PCR este apoi digerat cu enzime de restricție Kpa I și Clăi și ligat într-o reacție în patru părți cu un fragment de 189 bp obținut prin digestia casetei 3 cu Clăi și Xbal, un fragment de 3,2 kb din pCIB4434 digerat cu Sphl și Kpal și un fragment de 3,8 kb din pCIB4434 obținut prin digestia cu Spăl și Xba. Reacțiile enzimatice se derulează în condiții standard, produsul ligării este transformat în celule competente E.coli, selectate cu ampicilină și triate prin metodele standard descrise anterior. Secvența genei CtylA(b) reparate, cuprinsă în pCIB5514, este ilustrată în fig. 15.

Construirea pCIB5515 pCIB4434 a fost modificat prin adăugarea elementului termostabil Geiser de 78 bp (Geiser TSE), descris mai sus între situsui Kpnl (2170 bp) și situsui KbaX (2508 bp) în regiunea Btk nativă. Situsui exact de inserție începe la nucleotida nr.2379. Regiunea ce conține

Geiser TSE a losl amplificată prin două seturi de reacții PCR, respectiv fragmentul Kpn I-Geiser TSE și fragmentul

Geiser TSE-Xbal.

Primer PCR nr. 1: (situs Kpnl) ’-ATTACG ΊT AC GCTÂT Ί G G G T ACCTTTGATG-3’

Primer PCR nr. 1: (partea inferioară Geiser TSlî) >' !('('( CG ICCC TGCAGCTGCA G TCΊ A G G TCC G G G 1 TC (' A O Ί A(' AG GTGCGG AGCGOATGGA I 1 C (τ G C 1 ( C C C ( î C A C 1' 1 G C (' GAlTGGAt '13 GGGGOTGA-3 Primer PCR nr3: (vârf Geiser 1 SE) 5'CAAG TGCGGG GAGCCGAATC G ATGCGCTCC GCACCTGGAG TGGAACCCGG ACCTAGACTG C A G Cl’GCAG G G ACG G ( j G A A A AATG3 GCCCA TCATTCCC-3’

Primer PCR nr.4: (situs Xbal) 5’-TGGTITCTCT TCGAGAA ΑΤΓ CrPAGATlTCC-3’

După amplificare, fragmentele PCR au fost digerate cu (Kpnl + Clăi) și (Clăi + Kbal). Aceste două fragmente au fost ligate la pCIB4434 digerat cu Kpnl și Xbal. Structura pCIB5515 rezultată este pCIB4434 cu un Geiser 1SE și un situs Clăi suplimentar plancat de Kpal și XbaL O hartă a pCIB5515 este ilustrată în fig.38. Gena CryIA(b) conținută în el, care codifică o proteină CrylA(b) termostabilă, este ilustrată în fig.37.

Exemplele 9...20, prezentate mai jos, sunt orientate spre izolarea și caracterizarea unui promotor, cu afinitate pentru măduvă.

Exemplul 9. Izolarea ARN și testele Northern Blot întregul ARN a fost izolat de la pla nte crescute în condiții de seră. ARN total a fost izolat conform descrierii din Kramer <A‘a\.,Plant Physiol., 90:1214-1220 (1990), din următoarele țesuturi de porumb linia 5N 984 Funck: frunze verzi în vârstă de 8, 11, 15, 25, 35, 40 și 60 zile; măduvă în vârstă de 8, 11, 15, 25, 35, 39, 46, 60 și 70 zile; rădăcini secundare în vârstă de 60 și 70 zile, din porumb linia 5N

P’unk: teacă și peduncul 5N984 în vârstă de 60 și 70 zile. ARN a fost izolat și din rădăcini 211D în vârstă de 14 zile și din semințe dezvoltate, recoltate la intervale săptămânale între săptămânile unu-cinci post polenizare. ARN poly A+ a fost izolat folosind oligomer CIT, așa cum a fost descris de Sambrook et. al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, (a doua ed.’}. 1989. iar testele Northern Blot s au derulat tot conform Sambrook et al., folosind atât ARN total (30 /zg) cât si ARN poli A+ (2-10 /zg). După electroforeză, ARN a fost testat Northern Blot pe membrane Nitroplus 2000 (Micron Separations inc) ARN a fost legat dc filtru folosind Stratalinker (Stratagene) la 0,2 mlouli. I estele au fost probate cu fragmentul cADN 8-2 de măduvă FîcoRI(TPpA) de 1200 bp izolat prin folosirea de agaroză cu temperatură joasă de topire 0,8% în sistem tampon TEE. Iestele au fost hibridizate și spălate, iar filtrele au fost expuse la film, așa cum este descris în izolarea clonelor cADN.

Exemplul Vb. Izolarea clonelor cADN Sinteza primei catene cADN s-a derulat folosind sistemul I de revers transcriptază BRL AMV, în condițiie precizate de furnizor (Life Technologies, inc.. Gaithersburg, MD). în mod particular, 25 «1 reacție, ce conține 50 mM Tris-HCl, pH=8,3, 20 mM KC1, 1 mM DTT, 6 mM MgC12, câte 1 mM din fiecare dNTP, 0,1 mM oligomer (dT) 12-18, 2 /zg ARN poly (A+) de măduvă, 100 /zg/ml BSA, 5 /zg/ml actinomicină D, 8 unități inhibitor de RNaza plancentară, 1/zl (10 mM Cl/ml) 32 p d CTP 3000 mC mM ca trasor și 30 unități revers-transcriptază AMV, au fost incubați la 42°C, timp de 30 min. S-a adăugat KC1 adițional până la o concentrație de 50 mM și s-a continuat incubarea încă 30 min, la 42°C. S-a adăugat, din nou, KC1 pentru a atinge o concentrație finală de 100 mM. S-a adăugat tampon de reacție pentru revers transcriptaza AMV, pentru a menține concentrațiile inițiale ale celorlalte com110263 ponente și, in plus, 10 unități adiționale, incubarea continuând încă 30 min, ia 42°C. Sinteza celei de-a doua catene s-a încheiat prin folosirea sistemului de sinteză Riboclone cADN cu linkeri EcoRI (Promega, Madison, WI). cADN dublu catenar a fost dimensionat pe un gel de agarozâ 1%, folosind tampon 7w-boral· EDTA așa cum se arata în Sambrook et al., și etalat la o mărime medie de aproximativ 1.2 kb. cADN a fost fracționat după mărime, folosind membrană NA45 DBAI· pentru a reține acele molecule de aproximativ 1000 bp sau mai mari, utilizând codițiile precizate de furnizor (Schleicher și Schuell). cADN fracționat după mărime a fost ligat într-un vector 1 ambdaZapII (Stratagene. La Jolla, CA) și aranjat în particule lambda folosind Gigapack II Plus (Stratagene. La Jolla, CA). Fișierul neamplificat are un titru de 315000 pfu, în timp ce fișierul amplificat are un titru de 3,5 milioane/ml folosind celule PLK-P.

Fagii recombinați au fost însămânțați la o densitate de 5000 pfu pe plăci de

I.-agarde 150 x 15 mm. Un total de 50000 fagi a fost triat, folosind prelevări duble din fiecare placă și probe din prima catenă cADN, generata din ARNm derivat din măduvă și din sămânță. Prelevările s-au făcut ca în descrierea din Sambrook et al., folosind filtre de nitroceluloză. ADN a fost fixat la filtre prin legare încrucișată UV folosind un Stratelinker (Stratagene, La Jolla, CA), la 0,2 mJouli. Prehibridizarea și hibridizarea filtrului s-au derulat într-o soluție formată din soluția 10 x Denhardts, 150 /zg/ml ADN din spermă de semen, 1% SDS, 50 mM fosfat de sodiupH=7, 5 mM EDTA, 6 X SSC, 0,05% pirofosfat de sodiu. Prehibridizarea s-a făcut la 62°C, timp de 4 h, iar hibridizarea s-a făcut la 62°C, timp de 18 h (până a doua zi) cu 1 milion cpm/ml, într-un volum de 40 ml. Filtrele au fost spălate în 500 ml de 2 X SSC, 0,5% SDS, la temperatura camerei, timp de 15 min, apoi Ia 63°C în 0,1 X SSC, 0,5% SDS, timp de 30 min, pentru fiecare spălare. Probele ADN marcate radioactiv s-au realizat folosind sistem de marcare primar întâmplător BRL, iar semnalele neî ncorporate culese cu NiCK Columns (Pharmacia). Filtrele au fost expuse până a doua zi cu Raze X la film Kodak X Ornat AR cu ecrane de amplificare (Du Pont) Cronex Lightning Plus, la -80°C. Plăcile care prezintă hibridizare cu proba derivată din măduvă și nu cu proba derivată din sămânță au fost purificate de mediu pentru caracterizarea ulterioară.

Exemplul 11. Izolarea clonelor genomiee

ADN genomiedin linia naturală din porumb 21 ID Funk a fost izolat ca în descrierea lui Shure et al., Cell, 35:225-233 (1988). ADN a fost parțial digerat cu Sau 3A și apoi fracționat după mărime pe gradienți de sucroză 10...40%, și centrifugă într-un rotor Beckman SW 40 la 22000 rot/min, timp de 20 h, la 20°C. Fracțiunile cuprinse între 9 și 23 kb au fost alăturate și precipitate cu etanol. A fost folosit Lambda Dash II (Stratagene), tăiat cu BamHI, așa cum a fost descris de furnizor. Fișierul a fost triat neamplificat și a fost triat un total de 300000 pfu, folosind condițiile descrise mai sus. Fișierul a fost probat folosind clona ADNc 8-2 cu specificitate pentru măduvă (TrpA), pCIB5600. care a fost identificată în trierea diferențială a fișierului ADNc. Clonele izolate au fost purificate de mediu și s-a realizat o preparare fagică pe scară largă folosind

l.ambda sorb (Promega), așa cum descrie furnizorul. Clonele genomice izolate au fost digerate cu EcoRI, iar fragmentul EcoRI de 4,8 kb a fost subclonat în vectorul Bluescript (Stratagene).

Exemplul 12. Secvențializarea ADN și analiza computerizată

Secvențializarea nucleotidelor s-a realizat folosind metoda terminației lanțului cu dideoxi, descrisă în Sânger et al.,

PNAS, 74:5463-5467 (1977). Primerii secvențializați au fost sintetizați într-un sintetizator ADN Applied Biosystems modei 380B, în condiții standard. Reacțiile de secvențializare s-au derulat folosind sistemul Sequenose (IJS Biochemical Corp). S-au lacul teste în gel pe 40 cm gel de poliacrilamidă 6% cu 7 M uree în tampon Tris-Borat-EDTA (BRE Gel-Mix 6). Iestele secvențelor și compararea cu secvențele din Gen Bank s-au realizat folosind programul software de analiza a secvențelor al Genetic Computer Group al Univ. din Wisconsin. (UWGCG).

Exemplul 13. Mapping-ulsitusului de inițiere a transcripției

Extensia primerilor s-a derulat conform metodei lui Melraux et al.. PNAS. 86:896-900 (1988). Pe scurt, 30 pg de ARN totală din măduvă de porumb au fost maleabilizati împreună cu primerul în 50 mM Iris, pH=7,5, 40 mM KC1, 3 mM MgC12 (tampon RT), prin încălzirea la 80°C, timp de 10 min și răcire lentă la 42°C. Amestecul ARN/primer este lăsat pentru hibridizare până a doua zi.

S-au adăugat tampon RT suplimentar, DTT până la 6 mM, BSA până la 0,1 mg/ml, ARNsin la 4 U/ml și dNTP-uri câte 1 mM. Apoi s-au adăugat 8 unități de revers-transcriptază și reacția a fost lăsată pe loc la 37°C, timp de 1 h. Primerul folosit a fost 5’-CCGTTCGTTC CTCCTTCGTC GAGG-3’ și începe la

4-90 bp față de inițiatorul transcripției. Asevedeafig.29A. O punte de secvențializare, folosind același primer ca și în reacția de extensie a primerului, a fost generată folosind clona genomică de 4,8 kb, pentru a permite determinarea situsului de inițiere a transcripției. Reacția de secvențializare s-a derulat conform descrierii din exemplul 12.

Protecția RNazei a fost folosită pentru a stabili dacă secvența de 385 bp, de la

4-2 bp la 4-373 bp (începutul ADNc), este continuă sau conține unul sau mai mulți introni. Un fragment SphI-NcoI de 385 bp desfășurat între 4-2 bp și 387 bp față de inițiatorul transcripției, a se vedea fig.29B, a fost clonat în pGEM 5 Zf (4-) (Promega) și transcris folosind sislemul Riboprobc Gemini (Promega) din promotorul SP 6, pentru a genera ARN antisens radioactive, așa cum a fost descris de către furnizor. Protecția RNazei s-a derulat conform descrierii din Sambrook et al., pBR322 (tăiat cu Hpall și marcat la capăt cu 32p - dCTP) și fragmentul Klenow au fost folosite ca markeri de greutate moleculară. Gelurile au fost de 6% acrilamidă Π M uree (BRL-Gel- Mix 6) și au fost lucrate la putere constantă de 60 W.

Exemplul 14. Testele genomice Southern Blot

ADN genomică fost izolat din porumb lima 211 D prin metoda din Shure et al., supra. Pentru fiecare digestie cu enzinie de restricție s-au folosit 8 itg de ADN genomic. în tamponul sugerat de furnizor au fost utilizate următoarele enzime: BamHI, EcoRi, EcoRV, Hindlll și Saci. Clona ADNc de măduvă număr 8-12 a fost folosită pentru estimarea numărului de copii genice. ADN digerat a fost lucrat pe un gel de 0,7% agaroză folosind sistemul - tampon Tris-Borat-EDTA. Gelul a fost pretratat cu 250 mM HC1, timp de 15 min, pentru a facilita transferul ADN cu masă moleculară mare. ADN a fost transferat pe membrană Nitroplus 2000 și probat ulterior cu ADNc 8-12 de măduvă. Testul a fost spălat ca în exemplul 10.

Exemplul 15. Materiale și procedee PCR

Reacțiile PCR s-au desfășurat folosind kitul ca reactiv de amplificare ADN Gene-Amp și polimeraza ADN recombinat Taq Ampli Taq (Perkin Elmer Cetus). Condițiile reacției au fost următoarele: câte 0,1...0,5 μΜ din fiecare din cei doi primeri folosiți per reacție, 25 mg de fragment EcoRi în Bluescript, de

4,8 kb din măduvă, plus amestecul de reacție PCR descris de furnizor, într-un volum total de 50 μ 1 într-un tub de reacție Gene Amp de 0,5 ml (Perkin Elmer Cetus). Se folosește Thermal Cycler ADN (Perkin Elmer Cetus) cu setul de programe Step-Cycle pentru denaturare

Conservarea secvențelor TrpA la gena de porumb TrpA ș i alte organisme la 94°C, timp de 60 2, maleabilizare la 55°C, timp de 60 s și extensie la 72°C, timp de 45 s, urmate de o extensie de 13 s per ciclu și un total de 30 cicluri. S-au folosit următoarele seturi de primeri: 1.83 x 84, - 429 bpp la - 2 bp; II, 49 x 73, - 69 bp la + 91 bp; III, 38 x 41, + 136 bp la + 258 bp; și IV. 40 x 75, + 239 bp la + 372 bp. Acestea sunt prezentate în fig.24.

Exemplul 16. Izolarea unei gene cu afinitate pentru măduvă

Un fișier ADNc derivat din ARNm de măduvă este donat în Lambda Zap și testat, folosind prima catenă ADNc derivată din ARNm de măduvă sau sămânță. Clonele care au hibridizat doar cu probele de măduvă au fost purificate de mediu și triate din nou. Clonele care au trecut dea doua triere au fost folosite ca probe în Northerm blot, conținând ARN din diferite țesuturi de porumb.

Exemplul 17. Structura genei și analiza computerizată

Insertul de 1,2 kb al clonei ADNc 8-2 a fost secvențializată prin metoda dideoxi din Sânger et al, supra. De asemenea, a fost secvențializat echivalentul genomic conținut într-un fragment de 4,8 kb EcoRI în Bluescript, desemnat pCIB5601. Aceste informații arată că o copie genomică a regiunii de codare are

1,7 kb și conține 5 introni. Transcriptorul ARNm deține 6 introni. Acesta este prezentat în fig.24. Exonii au mărime cuprinsă între 43 bp și 313 bp, iar intronii au mărime variabilă, cuprinsă între 76 bp la 130 bp. întreaga secvență a genei și secvența de aminoacizi corespondentă dedusă din această genă sunt ilustrate în fig.24.

Această genă codifică o proteină de 346 aminoacizi cu o masă moleculară de aproximativ 38 KD. Așa cum este prezentat în tabelul 1, proteina sus-menționată conține 62% similaritate și 41% identitate cu subunitatea proteică din Pseudomonas aeruginosa și are o mare omologie cu proteinele TrpA din alte organisme.

5	t Organisme comparate	^Similar %>ldentita
tate aminoacizi	te aminoacizi
10	Haloferaxvolancii M e t h a n o c o cc u s	56.4	36,1
voltae Pseudomonas	58,1	35,1
	aeruginosa	62,5	41,8
	Neurospora crassa	61,4	39,3
15	Saccharamvces	56,7	36,1
cerevisiae

Grupări prin similaritate, I=L=M=V, D=E, F=Y, K=R, N=Q, S=T. Similaritățile și identitățile s-au determi20 nat folosind programul GAP al U WGCG.

Crawford et al., Ann. Rev. Microbiol., 43:567-600 (1989), comunică regiuni de aminoacizi conservate în genele bacteriene TrpA. Acestea sunt aminoacizii 25 49-58, 181-184, 213-216, restul genei prezentând o variabilitate mai mare decât există în secvența TrpB. Egalizarea proteinelor TrpA cunoscute cu proteina TrpA de porumb (nefigurată), arată că omolo30 gia între gena de porumb și alte proteine TrpA este considerabilă. Astfel, ea este comparabilă cu gradul de omologie observat atunci când alte proteine TrpA sunt comparate cu fiecare din proteinele 35 descrise în Crawford et al., supra.

Pentru a determina localizarea situsului de inițiere a transcripției, indiferent dacă în această regiune se găsesc sau nu introni, s-au folosit teste Northem blot 40 cu patru fragmente generate prin PCR (reacția de lanț polimerazic), de aproximativ 122 bp la 427 bp, din regiunea 429 bp la + 372 bp. Rezultatele testelor Northem blot arată că probele PCR Π, 45 III și IV au hibridizat cu ARN total de măduvă, iar proba PCR I nu a hibridizat. Aceasta arată că inițierea transcripției este în regiunea - 69 bp la + 90 bp. Pentru localizarea mai precisă a situsului 50 de inițiere a transcripției, s-a folosit

extensia primerilor. Fig.29A arată că, atunci când pentru extensia primerilor se folosește un primer (nr.73) localizat la +90 bp față de inițierea transcripției, situsul de inițiere a transcripției, este localizat la + 1, 1726 bp pe secvența genomică.

Primul ATG al situsului de inițiere a transcripției este la + 114 bp. Acesta este ATG care se presupune că servește drept situs pentru inițierea translației. Acest ATG începe o citire deschisă ce se desfășoară în fereastra de citire deschisă găsită în clona ADNc. Primi 60 de aminoacizi ai ferestrei de citire deschisă sus- menționată se aseamănă puternic cu un peptid tranzistor de clorplast A se vedea Berlyn et al., PNAS, 86:46044608 (1989) și Newmann-Karlin et al., EMBO.l, 5:9-13 (1986). Acest rezultat sugerează că această proteină este ținta unui plastic și este probabil prelucrată pentru a realiza proteina activă. Testele de exprimare tranzitorie într-un sistem protoplastic mezofil de porumb, folosind o genă de porumb optimizată Bt, dirijată de promotorul TrpA, au arătat că se obțin cele mai mari nivele de exprimare atunci când ATG de la + 114 bp este folosit drept punct de fuziune. Folosirea unuia din următoarele două ATG din secvență reduce substanțial nivelul exprimării genei indicate. ATG de la + 390 bp determină o oarecare activitate, dar la un nivel mult mai scăzut decât ATG de la + 114 bp, iar ATG de la + 201 bp nu determină deloc activitate.

Deși un număr de casete TAT-like sunt localizate în amonte, de partea ce precede situsul de inițiere a transcripției la + 1 bp, TATAAT de la - 132 bp aproape ca și consensul TATAAA din plantă. A se vedea Yoshi, NucAcids Res., 15:6643-6653 (1987). Caseta prezumptivă CCAAT - like s-a găsit la - 231 bp. Secvența de nucleotide ce înconjoară începutul ATG (GCGACATGGC) are omologie cu alți inițiatori de translație din porumb, așa cum s-a descris în Messing at al., Genetic Engineering of

Plants: An Agricultura! Prospective. Plenum Press. pp.211-227 (1988), dar diferă de aceea considerată ca secvență - consens la plante (ANN ATGGC). A se vedea, Joshi anterior. Semnalul de adiție poli (A) prezumtiv este localizat la bp 3719 (AATAAA) pe secvența genomică, la 52 bp de capătul ADNc. Secvența se potrivește cu secvențele cunoscute pentru porumb, așa cum este descris în Dean ela\., Nuc. Âcids Res.. 14:2229-2240 (1986) și este localizat la 346 bp în aval de capătul translației proteinei. A se vedea Dean et al., Nuc. Acids Res., 14:2229-2240 (1986). Secvența 3’ netranslatată a ADNc se sfârșește la bp 3775 pe secvența genomică.

Fig.28 prezintă un test Southern blot a ADN genomic de porumb 211 D, cu numărul aproximativ de copii genice, așa cum au fost reconstruite prin folosirea ADNc al genei 8-2 din măduvă. Din digestiile de restricție și reconstrucție par să rezulte 1-2 copii ale genei pentru fiecare genom haploid. Nu pare să existe alte gene cu nivele mai reduse de omologie cu această genă. Totuși, aceasta reprezintă o familie unică sau redusă de gene la porumb.

Exemplul 18. Protecția cu RNază

Structura capătului 5’ al ARNm a fost determinată folosind protecția cu RNază. Protecția cu RNază s-a derulat folosind o probă ce reprezintă 385 nt, de la + 2 bp la + 387 bp. Această regiune din clona genomică a fost plasată în vectorul de transcripție a ARN pGEM 5 Zf (+) și a fost generată o probă ARN marcata cu 32 P, folosind polimeraza SP6. Proba și bazele suplimentare din situsul multiplu de clonare produc un transcriptor de 461 nt Proba a fost hibridizată cu ARN total din măduvă și ulterior digerată cu un amestec de RNază A și Ti, iar fragmentele protejate analizate pe geluri de poliacrilamidă denaturate. Testul pe geluri evidențiază un fragment de aproximativ 355 nt și un alt fragment de aproximativ 160 nt A se vedea fig.29B.

Faptul că extensia primerilor folosind un primer (nr.73) la + 80 bp generează un produs de 90 NT în lungime dovedește că terminația 5’ a transcriptorului este localizată la poziția + 1 bp. Extensia primerilor dintr-un primer în această regiune generează un produs, deci se așteaptă ca și acesta să fie detectat prin testul protecției cu RNază. Acest primer este localizat în regiunea 5’ a probei cu protecție cu RNază. Clona ADNc conține secvențe prezente în capătul 3’ al probei protejate cu RNază și ca urmare se așteaptă să fie protejate în acest test întrucât doar o singură bandă este prezentă pe gel, care ar putea justifica ambele secvențe, suntem convinși că fragmentul protejat este întradevăr cea mai largă bandă, iar singura bandă cea mai mică este un artefact Dacă ar exista un intron în această regiune, fragmente din fiecare capăt ar fi prezente în probă și în consecință, ar fi detectabile în gel. Din cele două benzi observate, una pare să reprezinte întreaga regiune 5’, de aceea nu credem că există un intron localizat în această regiune.

Exemplul 19. Complementarea mutantului TrpA de E.coli cu ADNc 8-2 de măduvă

E.coli linia CGSC linia 5531 din E.coli de la Genetic Stock Center, Universitatea Yale (linia O.H. Smith lab desemnată nr.M5004), având markeri cromozomiali gen A3, TrpA 9825, 1-, IN (rroD-rruB), thi-1, după cum este descris în Mayer et al., Mol.Gen.Gentet, 137:131-142 (1975), a fost transformată atât cu AANC 8-2 (TrpA) de măduvă, cât și cu plasmida Bluescript (Stratagene), așa cum a fost descris în Sambrook et al., supra. Transformanții conținând ADNc 8-2 TrpA au fost capabili să crească în lipsa triptofanului, în timp ce transformanții cu plasmid Bluescript (Stratagene) sau martorul netransformat nu au fost capabili sa crească fără triptofan. Celulele transformate cu gena de porumb TrpA au crescut foarte încet, cu colonii vizibile, după o creștere de 7 zile la temperatura camerei. Toate specimenele au fost cultivate pe mediu minimal Mg îmbogățit cu 200 /zg/ml glutamină, 0,01/tg/ml tiamină, cu/fără 20 jUg/ml triptofan. Toți transformanții au fost testați pentru a detecta prezența plasmidei adecvate prin testul cu enzimă de restricție. Coloniile ce au crescut în absența triptofanului conțineau, toate, clonele 8-2cu ADNc pentru gena putativă de porumb TrpA, așa cum este confirmat de hibridizare prin test Southern (nu suni prezentate date). Aceste rezultate susțin concluzia că aceasta este subunitatea proteică A a triptofan-sintetazei din porumb.

Exemplul 20. Exprimarea genei

A fost examinat modelul exprimării genei cu afinitate pentru măduvă în toată planta. Diferite genotipuri de porumb au fost, de asemenea, examinate din punctul de vedere al modelului exprimării acestor gene. Au fost folosite următoarele țesuturi ca sursă de ARN, pentru aceste studii: măduvă superioară, mijlocie și inferioară, rădăcini secundare, peduncul, știulete, la genotipul SN 984; măduvă superioară, mijlocie și inferioară, frunze în vârstă de 10 zile, rădăcini în vârstă de 14 zile și măduvă din întreaga plantă, la genotipul 21 ID, și sămânță din genotipul 21 ID, care a fost recoltat la intervale săptămânale între săptămâna întâia și a cincea post-polenizare. Măduva inferioară derivă din, respectiv constituie cele două internodale de deasupra rădăcinilor secundare; măduva mijlocie derivă din următoarele trei regiuni intemodale; măduva superioară reprezintă ultimele două regiuni internodale, înainte de inflorescență, la plante în vârstă de 60 și 70 zile. I .a plantele în vârstă de 39 zile au fost prezente doar două regiuni internodale, iar la plantele de 46 zile, doar trei regiuni internodale. Testele Northern blot arată că transcriptorii hibridizați cu o probă derivată din ADNc de măduvă se acumulează rapid de măduva tânără și frunza tânără. Pe măsură ce vârsta plantei se mărește și tulpina înaintează, există o scădere marcată a cantității de transcriptor detectat A se vedea fig.25A-D. în nici un moment mesajul acestei gene nu este detectat în ARN derivat din sămânță, fie el ARN total sau ARN poli A+. Ase vedea fig.26. Transcriptorul este detectat, de asemenea în rădăcină, peduncul, în teacă, dar nu la nivele mari ca cele detectate în țesuturile măduvei și frunzei tinere. A se vedea fig.25B, 25C. Un oarecare mesaj estedetectat în rădăcinile secundare, dar numai la un nivel foarte redus. A se vedea fig.25D. Prin testele Northern blot au fost analizate 6 linii nediferențiate din calus de porumb și nu s-a detectai nici o exprimare a acestei gene (nu sunt prezentate date) în nici o probă de calus. Nivelul exprimării acestei gene este extrem de ridicat întrucât poate fi detectat un semnal foarte puternic dintr-o probă de genă 8-2 TrpA, în măduvă și frunză, la numai două ore de la expunerea testului Northem blot la film (fig.25A). Cantitatea de ARNm produsă este comparabilă cu aceea derivată din gena de porumb pentru fosfoenolpiruvetcarboxilază descrisă în HudspethetaL, Plani Mol. Biology, 12:579589 (1989), altă genă de porumb înalt exprimată.

Modelul exprimării acestei gene nu este constant în timp. Exprimarea este foarte mare în măduva inferioară și mijlocie, la plante mai tinere de 60 zile și scade rapid aproape de vârful plantei. Pe măsură ce planta se apropie de maturitate, de exemplu peste vârsta de 70 zile, exprimarea se prăbușește până la niveluri aproape de nedetectat, cu excepția măduvei inferioare și a peduncululiu. Acumularea transcriptorul ui în frunza tânără este aproape la fel de mare ca cea găsită în măduva inferioară, dar exprimarea scade rapid și este de nedetectat în frunze peste 40 zile. Exprimarea în frunză s-a dovedit a fi variabilă, în funcție de anotimpul în care crește.

Exemplele 21-39, prezentate mai departe, sunt orientate spre izolarea, caracterizarea și testarea exprimării unui promotor cu specificitate pentru polen, în conformitate cu invenția de față.

Identificare proteinelor cu specificitate pentru polen.

Exemplul 21. Creșterea plantei de porumb

Plantele de porumb (Zea Mays familia Funk 211D) au crescut din sămânță într-un amestec vermiculită/nisip, într-o seră cu regim 16 ore lumină/8 ore întuneric.

Exemplul 22. Izolarea proteinei totale din polen

Polenul matur a fost izolat din plantele de porumb la momentul scuturării maxime a polenului. A fost cernut pentru îndepărtarea deșeurilor, înghețat în azot lichid, iar un volum de 3...4 ml de polen înghețat a fost măcinat într-un mojar cu pistil cu un volum egal de bile de sticlă de 75...Î50 wm. S-au adăugat 40 ml tampon de măcinare (2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1 / SUS, 100 mM Hepes pH=8) și amestecul a fost măcinat din nou. Bilele de sticlă și grăunțele de polen intacte au fost precipitate prin centrifugare la viteză joasă iar amestecul a fost limpezit prin centrifugare la 10000 g, timp de 15 min. Proteina a fost precipitată din supematant prin adăugarea de acetonă până la 90%.

Exemplul 23. Izolarea proteinei exină din polen

Proteina exină a fost izolată din polenul scuturat din porumbul 211D, așa cum este descris în Matousek și Tupy, J., Plant Physiology, 119:169-178 (1985).

Exemplul 24. Izolarea proteinei din frunze

Frunzele tinere (crescute aproximativ 60%) au fost tăiate din planta de porumb, iar nervura mijlocie a fost îndepărtată. Proteina totală a fost izolată la fel ca la polen cu excepția faptului că materialul nu a fost înghețat, iar măcinarea s-a făcut într-un amestecător Waring fără bile de sticlă.

Exemplul 25. Izolarea proteinei din boabe

Spicele cu boabe complet dezvoltate, dar încă moi au fost strânse de la plantă și boabele au fost tăiate cu un bisturiu.

Proteina totală a fost izolată ca la frunze.

Exemplul 26. Electroforeza pe gel a proteinelor din pontmbS

Proteinele din polen, frunze și boabe au fost separate pe geluri de poliacrilamidă SDS așa cum este descris în Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press: New York (1989). Următoarele probe colorate cu albastru Coomasiecu benzi de proteine din polen, frunze și boabe au fost comparate și proteine abundente de aproximativ 10 KD. 13 KD, 20 KD, 45 KD. 55 KD și 57 KD au fost depistate ca fiind specifice polenului.

Identificarea clonelor ADNc cu specificitate pentru polen.

Exemplul 27. Determinarea secvenței parțiale a proteinelor cu specificitate pentru polen

Benzile de proteine având specificitate pentru polen au fost purificate prin electroabsorbție din gelul de poliacrilamidă, prin membrană PVDF (Matsudaria, P.J. Biol. Chem., 261:10035-10038 (1987) sau prin fază reversă HPLC. Secvența N- terminală a proteinelor purificate a fost determinată prin gradare automată Edman cu un element de secvențializare în fază gazoasă Applied Biosystems 470A Aminoacizii feniltiohidantoinei (PTH) au fost identificați folosind un analizator de PTH Applied Biosystems 120A. Pentru a obține secvența internă, proteinele au fost digerate cu endoproteinaza Lys-C (Bochringer Mannheim) în 0,1 ml M Tris-HCl, pH =8,5, timp de 24 h, la temperatura camerei folosind o proporție enzimă:substrat de 1:10. Peptidele rezultate au fost izolate prin HPLC, folosind o coloană Aquapore C-8 eluată cu un gradient linear acetonitril/izopropanol (raport 1;1) în 0,1% TFA Secvența proteinei izolate cu Lys-C a fost determinată ca mai sus. Următoarele secvențe au fost determinate pentru proteina cu specificitate pentru polen de kD:

N-terminal: ΤΊ PLTFQVGKGSKP

GHLILTPNVATI

Lvs C 61: KPGHI .ILTPN VATISD WIK I,vp C 54: SGGTRIADDIPADFK Lys C 49: EHGGDDFSFTLK Lys C 43: EGPTCrTWTLDTK

Exemplul 28. Sinteza probelor de nucleotide pentru ADN cu specificitate pentru polen

Au fost selectate regiuni ale secvenței peptidice din proteina de 13 kD ce prezintă o redundanță de codoni redusă și au fost sintetizate probe de oligonucleotide corespunzătoare pentru gena ce codifică aceste regiuni, folosind un sintetizator Applied Biosystems 380 A. Au fost sintetizate unnăloarele oligonucleotide. Oligonucleotid nr.51

5’- AA AICAICACAG AIG HC -3’

G G G	G C
	T
	c
Oligonucleotid nr.58
5’- CC TTT AZC CAC T1G MÂ -3’
C G	C G

T C în care coloanele de nucleotide reprezintă bazele care au fost încorporate întâmplător, în proporții egale, la poziția indicată din oligomer. Oligomerul nr.51 codifică secvența de aminoacizi EHGGDDF găsită în peptidul Lys C 49, iar oligomerul nr.58 codifică secvența de aminoacizi FQVGKG în peptidul N-terminal. Folosirea acestor oligonucleotide mixte, pentru a tria un fișier ADNc pentru gena cu specificitate pentru polen, va fi descrisă mai departe.

Exemplul 29. Construirea unui fișier ADNc din polen de porumb5

ARN total de porumb, din polenul scuturat din porumbul 211D, a fost izolat, așa cum este descris în Glisen et al., Biochemistry, 13:2633-2637 (1974). ARNm poli A+ a fost purificat din ARN total, așa cum este descris în Sambrook ctaL Folosind acest ARNm, a fost realizat

ADNc folosind un kt de sinteză a ADNc derivat din Promega și urmând protocoalele furnizate împreună cu kitul. La ADNc au fost adăugați EcoRI și a fost ligat în brațele vectorului de donare lambda Zap, derivat don Stratagene, folosind protocolul furnizat de producător. Produsul de ligare a fost conservat într-un extract de conservare lambda. de asemenea derivat din Stratagene și folosit pentru infectarea celulelor E.coli BB4.

Exemplul 30. Izolarea Nonelor ADNc cu specificitate pentru polen

Fișierul ADNc, din polenul de porumb, a fost testat folosind probe de oligonucleotide sintetice specifice pentru gena proteinei de 13 kD, așa cum este descris în Sambrook et al. Pe scurt, au fost însămânțate aproximativ 100000 de plăci de fagi din fișierul ADNc al polenului de porumb, și au fost introduse în filtre de nitroceluloză. Probele au fost hibridizate la filtre cu strictețe redusă (50°C, în IM NaCl, 10% dextran sulfat, 0,5% SDS), spălate 30 min, la temperatura camerei și apoi 30 min, la 45°C, în 6 X SSC 0,1% SDS și expuse la film cu raze X, pentru a identifica clonele sigure. Clonele putative au fost purificate prin patru runde de hibridizare în mediu. Au fost izolate trei clase de clone ADNc: tipul I, ce conține fragmente EcoRI de 0,2 kb și 1,8 kb; tipul II, ce conține fragmente EcoRI de 0,6 kb, 0,5 kb și 1,0 kb; tipul III, ce conține un fragment EcoRI de 2,3 kb.

Exemplul 31. Caracterizarea clonelor ADNc cu specificitate pentru polen

Fragmentele EcoRI ale clonei ADNc, tip II, au fost subclonate în vectorul plasmidic pBluescript SK+, derivat din Stratagene A se vedea fig.30. Fragmentul de 0,6 kb din pBluescript a fost desemnat Π-6, fragmentul de 0,6 kb din pBluescript a fost desemnat II-5 (ulterior redesemnat pCIB3169), iar fragmentul de 1,0 kb din pBluescript a fost desemnat II-1.0 (ulterior redesemnat pCIB3168). Așa cum va fi descris mai departe, fragmentele de '«>

0.5 kb și 1,0 kb codifică gena pentru CDPK. cu specificitate pentru polen de porumb. ARN din antere, polen, frunză, rădăcină și clorofilă a fost denaturat cu glioxal, supus electroforezei pe un gel de agaroză 1%, transferat pe nitroceluloză, și probat separat cu cele trei fragmente EcoRI care au fost marcate cu prin extensie de primeri întâmplătoare, așa cum este descris în Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Lold Spring Harbor Laboratory Press: New York (1989). Iestele au fost expuse la film cu raze X și a fost identificată o bandă de ARNm, de aproximativ 1,5 kb, cu proba ce conține fragmentul de 0,6 kb, în timp ce fragmentele de 0,5 și 1,0 kb au hibridizat într-un ARNm, de aproximativ 2,0 kb. în toate cazurile hibridizarea a fost observată doar pe culoarul ARN de polen, cu excepția unui semnal slab al fragmentului de 0.6 kb din ARNm, din aniera. Concluzia acestor date este că, clona originală ADNc a fost o fuziune a moleculelor ADNc derivate din două mARN diferite. Fragmentul de 0,6 kb a fost un ADNc parțial al unui ARNm cu specificitate pentru polen de

1,5 kb, iar acest ARNm codifică peptidele Lys C 49 și N-terminal. Fragmentele de 1,0 și 0,5 kb cuprind un ADNc parțial al unui ARNm cu specificitate pentru polen de 2,0 kb, fără legătură cu probele de peptide și oligonucleotide folosite pentru teste. Această concluzie a fost verificată atunci când fragmentele au fost secvențializate, folosind procedeul de terminare a lanțului cu dideoxi, așa cum este descris în Sambrook et al. Secvența ADNc este ilustrată în fig.31.

Exemplul 32. Determinarea specificității exprimării ARNm

Pentru a determina dacă ARN de 2,0 kb, reprezentat prin clonele ADNc pCIB3169 și pCIB3168, au fost prezente doar în polen, ARN total a fost izolat din rădăcinile, frunzele, polenul, anterele și clorofila porumbului 211D. ARN-urile au fost denaturate cu glioxal, supuse electroforezei pe un gel de agaroză 1%, transferate pe nitroceluloză și ^estate cu un insert EcoRl marcat cu din plasmida pCIB3168sau pdB3169, toate folosind tehnici standard, așa cum sunt descrise în Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press: New York (1989). Expunerea acestui test la film-fotografie, demonstrează că gena reprezentată de aceste doua clone este doar activă transcripțional la polen (fig.32).

Identificare unui promotor cu specificitate pentru polen

Exemplul 33. Construcția unui fișier de ADN genomic din porumb

ADN genomic din lăstari tineri de porumb linia 211D a fost izolat, așa cum se descrie în Shure et al., Cell, 35:225233 (1983). ADN a fost dus la Stratagene, unde a fost construit un fișier de ADN genomic, prin donarea ADN parțial digerat cu Sau 3AI într-un vector de donare Lambda Dash de la Stratagene.

Exemplul 34. Hibridizarea prin absorb fie a ADN genomic pentru determinarea numărului de copii genice

ADN genomic din linia de porumb 211D a fost digerat cu un număr de enzime de restricție, fragmentele digerate au fost supuse electroforezei pe un gel de agaroză, transferate pe nitroceluloză si testate cu insertul EcoRl marcat cu ³ r din plasmida pCIB3168 (fragmentul de 1,0 kb), pCIB31.69 (fragmentul de 0,5 kb) sau dona II-6, folosind tehnicile standard descrise în Sambrook et al. Mai mult de 10 benzi au fost detectate, prin proba cu II- 6, pe majoritatea fragmentelor de digestie, indicând că acest ADNc este derivat dintr-o familie mai largă, multigenica. S-a testat cu fragmentul de 1,0 kb detectat de la 3 la 6 benzi și s-a testat cu fragmentul de 0,5 kb detectat doar de la 1 la 3 benzi, care erau un subset al celor detectate de fragmentul de 1,0 kb. Datorită celei mai mici dimensiuni a familiei genice detectată de fragmentele de 1,0 și 0,5 kb, s-a decis inarcarea de a izola clona genomică ce le este cores98 punzătoare.

Exemplul 35. Izolarea unei clone genomice cu specificitate pentru polen

Fișierul genomic Stratagene al porumbului 211D a foști riat prin sondarea prelevărirlor pe plăci cu inserții marcate cu “P. din plasmida pCIB3168 (fragmentul de 1.0 kb) și pCIB3169 (fragmentul de 0.5 kb) - folosind metode standard descrise în manualul Stratagene care însoțește fișierul. Pe baza acestei strategii, a fost izolată clona l^ambda MG1H și a fost hibridizată la ambele probe. Fragmentul BamHI de 9,0 kb al MGIII, care este, de asemenea, hibridizat la ambele probe, a fost subclonat în situsul BamHI al pBluescript SK+ pentru a crea plasmidul pCIB379.1800 bp din pCIB379, în regiunea ce corespunde secvenței ADNc, au fost secvențializate, conform descrierii anterioare. Compararea secvențelor ADNc și genomice prezintă identitate doar 91%. Inserțiile pCIB379 reprezintă o genă în legătură cu specificitatea pentru polen.

Un al doilea fișier genomic de porumb 211D a fost construit în vectorul lambda GEM-11, derivat din Promega, folosind metodele descrise în manualul Promega. Prin trierea acestui fișier neamplificat, conform explicației anterioare, s-a determinat clona GEM 11-1, care a hibridizat cu ambele probe, de 0,5 și 1,0 kb. Fragmentul HindIII de 20 kb din GEM 11-1, care, de asemenea, hibridizează cu ambele probe, a fost subclonat în situsul HindIII și pBluescript SK+, pentru a realiza pCIB3166. Secvența ADN de 4,1 kb din pCIB3166 a fost determinată (fig.36) și după numărarea a 6 introni în clona genomică, a fost identică 100% cu secvența ADNc a pCIB3168 si pCIB3169. Compararea secvenței pCIB3166 cu baza de date Genbank/EMBL a dezvăluit ca porțiunea 5’, până la al treilea exon, a fost identică 34,6% cu proteinkinaza II calmodulin dependentă de șobolan, la nivel de aminoacizi (fig.33) în timp ce de la al patrulea la al șaselea exon a fost iden110263 titate 39,4% cu calmodulina de șobolan. Λ se vedea lig.34. Nu au fost descrise alte kinaze cu specificitate pentru polen și în același timp domeniile kinazei de combinare a proteinelor și calmodulinei au fost necunoscute. Ulterior, Harperetal., Science, 252:951-954 (1991). au descris secvența ADNc a unei proteine similare de soia, deși această genă nu are exprimare cu specificitate pentru polen. Compararea proteinkinazei calciu-dependentă (CDPK) de soia și a CDPK din polenul de porumb arată identitate 38% la nivel de aminoacizi. A se vedea fig.35.

Exemplul 36. Identificarea situsului inițiatorului transcripției al promotorului pe baza extensiei primerului

Oligonucleotidul PE51, având următoarea secvență a fost sintetizat ca primer: 5’-TGGCCCATGGCTGCGGGGGG GAACGAGTGCGGC-3’

Testul extensiei primerului s-a derulat pe ARNm poli A+ de polen, după cum este descris în Metraux et al., PNAS USA, 86:896- 890 (1989). Situsul inițierii transcripției a fost stabilit între bazele 1415 și 1425 pe secvența parțială a pCIB3166. arătată în fig.36.

Testarea funcționării promotorilor la plantele transgenice

Exemplul 37. Construirea vectorilor promotorilor, pentru hibridizarea plantelor

Pentru a demonstra că promotorul CDPKdin polen poate dirija exprimarea unei gene linkate la plantele transgenice, a fost construită o fuziune genică a promotorului CDPK din polen cu gena beaglucoronidazei din E.coli, după cum urmează: fragmentul BamHI de 10 kb din lambda GEMM-1, conținând primul exon și o parte din primul intron al genei CDPK din polen plus 9 kb din amontele genei, a fost subclonat în situsul BamHI al pBluescript SK+, pentru a crea plasmida pCIB 3167. Fragmentul BamHI - HindIIl de 2,3 kb din pCIB 3167 a fost donat în situsurile BamHI și HindIIl ale pBluescript SK+, pentru

100 a crea plasmida pSK 105, pSK105 a fost digerat cu Aval și HindIIl și fragmentul HindIIl Aval de 1,75 kb a fost izolat pe un gel de agaroză. O reacție PCR s-a 5 derulat în condiții standard, conform descrierii din Sambrook et al., folosind SK 105 intact drept șablon ca și următorii primeri:

nr.42: 5’-AGCGGTCGACCTGCAGG10 C ATGCG ATCTGC ACCTCCCGCCG

-3’ n r. 43: 5 - AT G G G ()AAG G AOCT’C GGG -3’

Produșii de reacție PCR au fost 15 digerați cu Aval și Sall, iar fragmentul rezultat izolat pe un gel de agaroză pBluescript SK a fost digerat cu HindIIl și Sall. Fragmentul HindIII-Aval de 1,75 kb, fragmentul Aval-Sall derivat din 20 PCR și vectorul pBluescript cu capete HindIIl și Sall au fosat ligate într-o reacție de ligare în trei puncte, pentru a crea plasmida pSKl 10.

O fuziune a fragmentului de promotor 25 din pSKllO la gena betaglucoronidazei (GUS) a fost creată prin digerarea pSKl 10 cu HindIIl și Sall, izolând fragmentul de 1,9 kb pe un gel de agaroză și ligându-1 în situsurile HindIIl și Sall ale pCIB 30 3054, pentru a forma plasmida pKL2, o plasmidă derivată din pUC 19 ce conține gena GUS urmată de intron vegetal din gena PEPC de porumb și un semnal Poli A din virus mozaic de conopidă. 35 Această fuziune de promotori a fost inactivă la plante, probabil datorită prezenței de codoni ATG în afara ferestrei în secvența principală ce precede gena ATG din GUS.

O fuziune funcțională a promotorilor a fost realizată prin digestia pKL2 cu Xbal și Sall pentru a îndepărta joncțiunea de fuziune anterioară. O nouă joncțiune de fuziune a fost produsă într-o reacție 45 PCR, folosind pSK105 drept șablon, ca și următorii primeri:

nr.SK50: 5’-CCCTTCAAĂATCTAGAAACCT-3’ nr.SK49: 5’-TAATGTCGACGAAC 50 GGCGAGAGATGGA-3’ *

102

101

Produsul PCR a fost digerat cu Xbal și Săli și purificat pe un gel de agaroză. Fragmentul purificat a fost ligat în situsurile Xbal și Săli ale pKL 2 pentru a crea plasmidul pCIB3171. Acest plasmid conține o fuziune funcțională a promotorului CDPK de polen și GUS, care direcționeazăexprimarea genei GUS exclusiv în polen.

Pentru a crea un vector ce conține fuziunea promotor CDPK de polen GUS potrivită pentru transformarea plantelor mediată de Agrobacterium tumefaciens, gena de fuziune a fost izolată din pC!B3171 prin digestie cu IlindIII și Săli. Fragmentul rezultat a fost ligat în situsurile IlindIII și Săli ale pBIlOl (derivat din Clontech), pentru a crea plasmidul pCIB3175.

Exemplul 38. Producerea plantelor transgenice pdB3175 a fost transformat în Agrobacterium lumefaciens, care conține plasmida - helper pCIB542, iar cultura rezultată a fost folosită pentru a transforma discurile frunzelor din culturile din vârf de lăstar de tutun, așa cum este descris în Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985), cu excepția faptului că au fost omise culturile de control iar selecția s-a făcut pe 100 jUg/1 Kanamicină. Plantele transgenice au fost regenerate și verificate prin PCR pentru a depista prezența transgenei.

Exemplul 39. Testul exprimării genei GUS

Polenul din transformanții primari și progenii lor a fost analizat histochimic pentru exprimarea genei GUS, așa cum este descris de Guerrero et al., Mol. Gen. Genet., 224:161-168 (1990). Procentul granulelor de polen care exprimă gena GUS, așa cum se demonstrează prin colorare albastră în tampon I-gluc, este

Numărul plantei	% polen albastru
PP1 - 51	28%
PP1 - 54	54%
PP1- 55	absent

PP1- 61	foarte puțin
PP1- 63	51%
PP1 - 67	15%
PP1- 80	10%
PP1 -	12%

Transformanții primari în care a fost integrată o singură fuziune promotor CDPK de polen - genă GUS vor produce maximum 50% |K>len pozitiv pentru GUS, datorită segregării singurei gene.

Teste flowmetrice GUS au fosl realizate pentru țesut de polen stern, rădăcină, frunză și pistil din plantele selectate, pentru a demonstra specificitatea exprimării promotorului CDPKde polen. Testele s-au efectuai ca în descrierea din Jefferson. Plani Mol. Biol.. 14:995-1006 (1990), iar valorile activității GUS exprimate în mmoli MU/ng proteină/minut.

Nr. plantei	Țesut	Activi tate GUS	Activita-, te GUS la plante netrans formate	'Kctivitatt GUS netă
PP1-51	stern	0,01	0,02	0
	frunză	0	0	0
	rădăcină	0,15	0,10	0,05
	pistil	0,02	0,01	0,01
	polen	0,24	0.02	0,22
PP1-54	stern	0,01	0,02	0
	frunză	0	0	0
	rădăcină	0,13	0,1	0,03
	pistil	0,01	0,01	0
	polen	0,60	0,02	0,58
PP1-63	stem	0,01	0,02	0
	frunză	0	0	0
	rădăcină	0,07	0,1	0
	pistil	0,01	0,01	0
	polen	0,57	0,02	0,55

Exemplele 40...50 sunt orientate, în primul rând, spre prepararea structurilor himerice, adică molecule de ADN recombina/ ce conțin promotori constitutivi, cu afinitate pentru țesuturi sau cu specificitate pentru țesuturi, legați operațional la o genă Bt din prezenta invenție,

103 spre inserarea acelorași structuri în vectori, spre producerea de plante transgenice ce conțin vectori și spre tratarea nivelelor de exprimare a proteinelor Bt din plantele transgenicc.

Exemplul 40. Construirea vectorilor de transformare ai Bt de porumb îmbunătățite

Pentru a demonstra eficiența genei sintetice Bt CrylA(b) la porumb, promotorii PepC și cu specificitate pentru măduvă sunt fuzionați la gena sintetică CrylA(b) prin PCR. Oligomerii desemnați pentru fuziunea PCR au fost: (PEPC)

K E 9 9 A 2 8 = 5 ’ - T 0 C G G TT A C C G CCGATCACATG -3'

KE97A28= 5’-GCGGTA-CCGC GTCGACGCGG ATCCCGCGGC GGGAAGCTAAG-3’ (MĂDUVĂ)

KE 100A28= 5’-GTCGTCG ACC GCAACA-3’

KE 98A28=5’-GCGGTAC-CGC GTTAACGCGG ATCCTGTCCG ACACCGGAC-3’

KE 104A28=5’-GATGTCGTTCG ACCGCAACAC-3’

KE 103A28= 5-GCGGTACCGC GGATCCTGTC CGACACCGGACGGCT-3’

Primerii PCR sunt proiectați să înlocuiască si tușurile Ncol din regiunea principală 5’ netranslatată a fiecăruia din aceste gene cu specificitate de țesut (conținând situsuri ATG de inițiere a translației), cu situsurile BamHI, pentru a facilita donarea genei sintetice CrylA(b) în acest situs BamHI. Construirea ulterioară a vectorilor ce conțin promotori cu specificitate de țesut fuzionați cu gena sintetică CrylA(b) și, de asemenea, conținând și gena marker 35 S: PAT: 35S, implică un număr de structuri intermediare.

1. pCIB4406 (35S:CryIA(b) sintetic.pepC ivs nr.9:35S) pCIB4406 con fine gena CrylA(b) sintetică Bam

HT/Clal de 2 kb; fuzionată cu promotorul CaMV 35S (Rothstein et al.,

1(M

Gene, 53:153-161. 1987). Gena mai conține intronul nr.6. derivat din gena PEP carboxilazei din porumb (IVS nr.9), la regiunea 3’ netranslatată a genei, care folosește capătul 3’ al CaMV. PNAS USA, 83:2884-2888 (1986), Hudspeth et al.. Plani Molecular Biology, 12:579-589 (1989). pCIB4406 este ligat și transformat în linia SURE de celule E.coli (Stratagene, La Jolla, CA), așa cum s-a descris anterior. O mutație este depistată în gena CrylA(b) a pCIB4406, la aminoacidul nr.436 care determină înlocuirea Phe dorit cu Leu. pCIB4406 este complet activ împotriva dăunătorului european al cerealelor atunci când este încercat în testele biologice pe insecte, și produce o proteină CrylA(b) de dimensiune scontată, determinată prin test Western biol.

2. pCIB4407 (35S: CryIA(b) sintetic: pepC ivs nr.9:35 S + 35 S: PAT: 35 S) pCIB4407 este realizat dintr-un fragment HindIII/EcoRI de aproximativ 4 kb, ce conține gena 35 S: PAT: 35S și din gena HindIII/EcoRI 35 S: CryIA(b) sintetic: 35 S de 3,1 kb din pCIB4406. pCIB4407 este ligat și transformat în linii SURE, DH 5 alfa și HB101, de E.coli, folosind metode standard (Sambrook et al.). Gena sintetică CrylA(b) are aceleași proprietăți ca și precursorul său pCIB4406.

3. pCIB4416 (35S: CrylA(b) sintetic: pepC IVS nr.9:35S + 35 S: PAT: 35S + 35 S: intron Adh: GUS: 35S) pCIB4407 este tăiat cu EcoRI și tratat cu fosfatază alcalină intestinală de vițel (CIP) în condiții standard (Sambrook et al.), pentru a produce un fragment de aproximativ 7,2 kb care este ligat cu un fragment EcoRI 35S: Adh/GUS: 35S de 3,4 kb, pentru a produce pCIB4416. Ligările și transformările în celulele SURE sunt cele descrise anterior.

Gena sintetică CrylA(b) din pCIB4416 are aceleași proprietăți ca și gena din pCIB4406.

4. pCIB4418 (35S:CryIA(b) sintetic:

105 pepC IVS nr.9:35S) pCIB4406 este digerat cu Apal și BamHI și tratat cu CIP. pCIB4406 este digerat cu BamHI și Nspl. pBsl23 nr. 13 este digerat cu Nspl și Apal. Se realizează o ligare în trei puncte, constând dintr-un fragment Apal/BamHI de 4,3 kb, din pCIB4406, un fragment BamHI/NspI de 1,3 kb din pCIB 4406 și un fragment de Nspl/Apal de 170 bp din pBS123 nr. 13, pentru a forma pCIB4418. Linia de E.coli gazdă pentru pCIB4418 este HB101.

5. pCIB4419 (35S: CrvIA(b) sintetic: pepC IVS nr.9: 35S + 35S: PAT: 35S + 35S sintron Adh: GUS: 35S) pCIB4416 și pC!B4418 sunt digerate cu BstEIl și EcoNI, iar fragmentele de pCIB4416 sunt tratate cu CIP. Un fragment de 9,1 kb din pCIB4416 1 igat la un fragment de 1,4 kb din pCIB4418 formează pCIB4419, pCIB4419 transformat în celulele competente de E.coli HB 101 prezintă activitatea completă în testele biologice pe insecte împotriva dăunătorului european al porumbului.

6. pCIB4420 (Măduvă: CrylA(b) sintetic: PEPC IVS nr.9:35S + 35S: PAT: 35S)

Structurile intermediare în realizarea pCIB4420 sunt pBT in 1, pBT in 2, p4420A și pBTin 3. pBT in 1 (promotor de măduvă: a doua jumătate a genei sintetice Bt + 35 S: PAT: 35S) este realizat prin ligarea fragmentului de promotor de măduvă Kbal/Ncol de 2,1 kb din plasmida măduvă (3-1) cu un fragment Xbal/Ncol de 5,2 kb din pCIB4407 pBTin 2 este o structură intermediară ce conține promotorul de măduvă modificat cu un fragment PCR de 210 bp, realizat prin utilizarea primerilor KE100 A28 și KE 98A28, enumerați anterior. Amestecul de reacție PCR conține aproximativ 100 ng de fragment de promotor de măduvă BamHI/NcoI de 2,1 kb și 100 pmoli din fiecare oligomer, 200 mM din fiecare NTPd, IX tampon (Cetus) și 2,5 unități de polimerază termostabilă. întrucât Tm este relativ scăzut (între 40° - 60°C), reacțiile PCR se desfășoară la următorii

106 parametri:

ciclul denaturării: <>4^OC. timp de 1 min;

ciclul maleabilitații: 37°C, timp de 1 min;

ciclul extensiei: 72°C, timp de 45 s (4-3 s/ciclu);

număr de cicluri: 25.

Reacțiile PCR sunt tratate cu proteinaza K, așa cum s-a descris anterior, înainte de tăierea cu Sall/Kpnl, urmată de extracția cu fenol/cloroform și precipitarea cu etanol, așa cum este descris anterior. Fragmentul de 210 bp este purificat pe un gel Nusieve 2% și extras din gel folosind elemente filtrante Millipore. Fragmentul Sall/Kpnl de 210 bp este ligat la fragmentul Sall/Kpnl de 4,9 kb din măduvă (3-1), pentru a forma pBtin 2. p4420A (măduvă: Bt sintetic in tron Pep; 35S + 35 S: PAT: 35 S) este realizat printr-o ligare în trei puncte, constând dintr-un fragment Nsil/BamHl de 700 bp din pBtin 2, un fragment BamHI/BstEII de 1,8 kb din pCIB4418 și un fragment BstEII/Nsil de 5,9 kb din pBtin 1.

După ce p4420A este realizat, se descoperă trei mutații în pBtin 2. Un al doilea fragment PCR este realizat pentru a modifica situsul NCOI în secvența principală de măduvă, folosind primerii KE 104A28 și KE 103A28, cu valori ale Tm în jurul a 65°C. Amestecul de reacție PCR este identic cu cel enunțat mai sus, cu adăugare de glicerol până la 20% pentru a reduce mutațiile în zonele bogate în G-C. (Henry et al., Plant Molecular Biology Reporter 9(2): 139-144, 1991). Parametrii PCR sunt următorii:

rândul I 94°C: 3 min, 1 ciclu: rândul II 60°C: 1 min;

94°C: 1 min;

cicluri;

rândul III 72°C: 5 min, 1 ciclu.

Reacțiile PCR sunt tratate ca mai sus și tăiate cu endonucleazele de restricție Săli și KpnI. Fragmentul PCR (cu glicerol în reacție) Sall/Kpal de 210 bp este ligat la fragmentul Sall/Kpal de 4,9

107 kb din plasmida de măduvă (3-1) pentru a forma pBtin 3. Datele despre secvența pBtin 3 - G nr.l arată că acest fragment general prin PCR este corect.

pBtin 3 G nr.l este folosit pentru a realiza pCIB4420 (desemnat și pCIB 4420B G nr.6). pdB4420 este constituit printr-o ligare în trei puncte, folosind fragmentul Nsil/BamHI de 700 bp din pBtin 3-G nr.l, un fragment BamHi/BstEII de 1,8 kb din pCIB4418, și un fragment BstEII/NslI de 5,9 kb din pBtin I. pCIB4420 este folosit în experimente cu protoplast mezofil și prezintă o activitate completă a genei CrylA(b) sintetice împotriva dăunătorului european al cerealelor.

7. pCIB4413 (PEPC: Bt sintetic (mutație Phe): intron PEPC: 35s

Un fragment de fuziune este generat prin PCR folosind primerii KE 99A28 și KE97A28 cu un șablon HindIII/Sall de 2,3 kb din șablon., dNTR-uri, straturi și polimerază termostabilă ca cele descrise anterior. Parametrii reacției PCR sunt:

ciclul denaturării: 94°C, timp de 1 min;

ciclul maleabilizării: 55°C, timp de 1 min;

ciclul extensiei: 72°C, timp de 45 s (+3 s/ciclu);

număr de cicluri: 30.

In final, reacțiile PCR sunt tratate cu proteinază K, urmată de extracția cu fenol/cloroform și precipitare cu etanol, așa cum a fost descris, înainte de tăierea cu endonucleazele de restricție BamHI și BstEII.

pCIB4413 este realizat printr-o ligare în trei puncte, folosind fragmentul PCR/ BamHI/BatEIII de 210 bp, un fragment BamHI/HindIII de 4,7 Hb din pCIB4406 și un fragment HindIII/BatEII de 2,2 kb din pGUS4.5.

8. pC!B4421 (PEPC: CryIA(b) sintetic: intron PEPC: 35S) pCIB4421 este realizat pentru a înlocui gena CiyIA(b) sintetică ce conține mutația Phe în pCIB4413 cu gena Ciy

108

IA(b) sintetică ce conține mutația Phe în pCIB4413 cu gena CrylA(b) sintetică din pCIB 4419. pCIB4421 este realizat prin ligarea unui fragment BamHl/Sacl de 5,2 kb din pCIB 4413 de fragmentul BamHI/SacI de 1,9 kb din _PC1B4419.

9. pCIB4423 (PEPC: CrvIA (b) sintetic: intron PEPC: 35 S + 35S: PAT: 35S)

Fragmenlul de promotor PEPC BamHl/HindIII de 2,4 kb din pCIB4421 este ligat la fragmentul BamHI/HindIII de 6,2 kb în pCIB4420. pentru a forma pCIB 4423. Situsul Hindlll este deletat prin endonucleaze în cursul donării pCIB 4423, pClB4423 conține gena CrylA(b) sintetică sub controlul promotorului PEP, ca și gena PAT sub controlul promotorului 35S.

10. Gena CrvlA(b) în liniile Agrobacterium

Liniile Agrobacterium realizate cu gena CiylA(b) sintetică permit transferul acestei gene într-o serie de plante dicotiledonate. Vectorul Agrobacterium pCIB4414 - conține fragmentul HindIII/EcoRI358: CrylA(b) sintetic: PepC: IVS nr.9. 35S de 3,3 kb din pCIB4406 (mutația Phe ligat la fragmentul Hindlll) EcoRI de 14 kb din pBilOl (Clontech). Prin electroporația, pCIB4417 este transferat în linia A. tumefaciens IVA4404 (Diethard et al., Nucleic Acids Research, Voi. 17: nr.16: 6747: 1989).

200 ng din pCIB4417 și 40 μΐ de celule competente LBA 4404 dezghețate sunt electroporate într-o cuvă de electroporație de 0,2 cm pre-răcită. (Bio-Rad Laboratiories Ltd). Folosind un puișor genic TM și elementul de controlare a impulsurilor (Bio- Rad), un impuls electric este aplicat imediat, cu voltajul fixat la 2,5 kV și capacitanța la 25 μΤ. După impuls, celulele sunt imediat transferate pe 1 ml de mediu YEB și agitate la 27°C, timp de 3 h, înainte de însămânțare a 10 μΐ pe medii AB min: Km 50 în plăci. După incubarea la 28°C, timp de aproximativ 60 h, coloniile sunt selectate pentru pregătirea mini-trierii, pentru a face testul cu enzimă de restricție. Linia

109 finală Agrobacterium este desemnată pCIB4417: LBA4404.

Exemplul 41. Testul ELISA de protoplaști de porumb transformați

Prezența proteinei CrylA(b) - toxină este detectată prin folosirea testului de imunoabsorbție legată de enzime (EI.lSA). Testele ELISA sunt foarte sensibile și specifice pentru materialul antigenic. Testele ELISA sunt utile pentru determinarea exprimării produselor genice polipeptidice. Antiserul pentru aceste teste este produs ca o reacție la imunizarea iepurilor cu cristale Bt purificate prin gradient (Ang et al., Applied Environ. Microbiol.. 36:625-626.1678/ solubilizate cu sodiu - dodecilsulfat). Testul ELISA al extractelor de celule pasager transformate de porumb se derulează prin metode standard ( a se vedea ca exemplu Harlow, E-, și Lane. D.in.AnticorpH. Un manual de laborator, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press. 1988). Tehnicile ELISA sunt pe larg descrise în Clarck et al., Methods in Enzimology, 118:742-766 (1986) și Bradford.,/bW. Biochem.,72:248 (1976). în consecință, aceste metode sunt binecunoscute specialiștilor în domeniu.

Festele ELISA sunt efectuate pentru a detecta producerea proteinei CrylA(b) în protoplaștii de porumb. Proteina produsă este dată mai jos în ng de Bt per mg proteină totală (ng Bt/mg). Fiecare element a fost testat de două ori.

pCIB3069 Nu s-a detectat Bt (ambele teste) pCIB4407 21900 ng Bt/mg proteină totaîă

21000 ng Bt/mg proteină totală.

Celulele transformate de porumb produc niveluri ridicate, de ordinul a aproximativ 20000 ng de proteină Bt CiylAfb) per mg proteină totală solubilă, atunci când PIBt este transformată cu gena Bt de porumb îmbunătățită. Nivelul de detecție al acestor teste pe bază de ELISA este de aproximativ 1...5 ng proteină CiyIA(b) per mg proteină. De aceea, gena Btde porumb îmbunătățită produce o creștere a exprimării acestei proteine

110 în celulele de porumb de aproximativ

20000 ori.

Exemplul 42. Testarea extractului din protoplaști transformați pentru activitatea insecticidă împotriva dăunătorului european al porumbului

Analizele Western blot sunt, de asemenea, efectuate folosind extracte din celulele de porumb care au fost pasagere transformate cu ADN pentru a exprima gene de porumb îmbunătățite. Atunci când este examinată prin Western blot. această proleină este identică cu proteina produsă în E.coli. Dimpotrivă, așa cum se demonstrează în exemplul 6 dinainte, nu se produce proteină Bt CrylA(b) insecticidă detectabilă de către celulele de porumb transformate cu vectori asemănători, în scopul exprimării regiunii de codare nativă derivată din Bt.

Testarea calitativă a toxicității pentru insecte se poate derula folosind protoplaști recoltați. Sunt preparate suspensii pentru fiecare specimen testat în toate testele biologice. Un specimen este considerat pozitiv dacă produce o mortalitate semnificativ mai mare decât martorii. De exemplu, specimenele sunt testate pentru activitatea lor împotriva insectelor din ordinul Lepidoptera, prin folosirea dăunătorului european al cerealelor, Ostrinia nubilalis. 100 de μϊ dintr-o suspensie de protoplaști în 0,1% Triton X-100 este pipetată pe suprafața hranei artificiale BÎack pentru viermi scurți (Bioserv, inc., Frenchtown, NJ, F9240) în plăci Petri cu capac de 50 mm x 10 mm. După uscarea la aer, pe fiecare placă se pun 10 larve recent formate. Mortalitatea este înregistrată după aproximativ 4 zile. Când această proteină este hrană pentru dăunătorii europeni ai cerealeîor, va produce o mortalitate de 100%.

Exemplul 43. Exprimarea Bt sintetice la protoplaști din mezofil de porumb

Metoda generală de izolare a protoplaștilor din mezofil de porumb este adaptată după Sheen et al., The Plant Cell, 2:1027- 1038 (1990). Sistemul de transformare a protoplaștilor folosit în

111

112

Sheen et al., este modificat prin folosirea transformării PCR - mediate față de electroporație. Această metodă, ca și modificările operate în metoda de izolare, este descrisă mai jos.

Izolarea/transformarea protoplaștilor din mezofîl de porumb

1. Se sterilizează și se lasă la germiant boabe de porumb pentru material de frunză. Răsadurile sunt crescute la lumină, la 25'C.

2. Se sterilizează suprafața pieselor de frunză de la răsadurile în vârstă de

10.. . 12 zile, cu Clorox5%, timp de 5 min. urmată de câteva spălări cu apă distilată sterilă.

3. Se pipetează soluția enzimatică (a se vedea rețeta de mai jos): 25 ml/placă (100 x 25 mm plăci Petri).

4. Se înlătură orice urmă de apă de pe frunze și se pun 6...8 piese de 2 inci în fiecare placă cu enzimă. De regulă, se obțin 14 plăci cu materialul de frunză de la aproximativ 100 de răsaduri.

5. Se taie frunzele în benzi longitudinale cât mai înguste (2...3 mm).

6. Se agită ușor, la 25°C, timp de

6.. .7 h. Se acoperă plăcile pentru ca incubația să se producă la întuneric.

7. înainte de a filtra protoplaștii, se spală sitele de 100 pm cu 10 ml 0,6 M manitol. Se pipetează protoplaștii ușor pe site. Se spală plăcile cu 0,6 M manitol, pentru a aduna toți protoplaștii rămași în plăci.

8. Se pipetează cu grijă lichidul filtrat în tuburi sterile de 50 ml. Se adaugă volume egale de 0,6 M manitol, pentru diluare.

9. Se centrifughează, timp de 10 min, Ia 1000 rot/min 500 g în centrifugă (model Beckman TJ-6).

10. Se îndepărtează soluția enzimatică și se aruncă. Se resuspendă precipitatele cu grijă în 5 ml manitol. Se adună mai multe precipitate. Se completează până la un volum de 50 ml cu 0,6 M manitol și se centrifughează.

11. Se resuspendă în volumul cunoscut (50 ml) și se numără.

12. După numărare ș i precipitare, se resuspendă protoplaștii, la 2 milioane/ml în tampon de resuspendare (rețeta mai jos). Se iasă protoplaștii la incubat 5 în tamponul de resuspendare, timp de cel puțin 30 min înainte de transformare. Transformarea

1. Se pipetează plasmidele în tuburi (tuburi din poliestiren cu capac etanș 10 pentru culturi, de 17 x 100 mm. Fisherbrand). cel puțin trei specimene pentru fiecare tratament: se folosesc cantități echimolare de plasmide astfel. încât să se compare un număr egal de copii genice. 15 2. Se adaugă 0,5 ml protoplaști și

0.5 ml PEG 40% realizatcu 0.6 M manitol.

3. Se agită ușor, pentru amestecare și se incubează la 25°C, timp de 30 min.

4. Se adaugă mediu de cultură pentru 20 protoplaști, la 5 min interval: 1, 2, 5 ml.

5. Se centrifughează, timp de 10 min, la 1000 rot/min 500 g.

6. Se separă lichidul de precipitat și se resuspendă într-un mediu de cultură (mediu BMV).

7. Se incubează până a doua zi, la 25°C, la întuneric.

Rețete:

Soluția enzimatică

0,6 M manitol:

mM MES, pH=5,7;

mM CaC12;

mM NgC12;

0,1% BSA;

sterilizat prin filtrare.

La această soluție se adaugă următoarele: 1% celuloză RS și 0,1% macerozim R10.

Tampon de spălare: 0,6 M manitol, 40 sterilizare prin filtrare.

Tampon de resuspendare: 0,6 M manitol, 20 mM KC1 sterilizare prin filtrare.

Mediu de cultură: rețeta pentru mediu 45 BMV din: Okuno et al., Phytopathology 67:610-615 (1977).

0,6 M manitol;

4mM MES, pH =5,7;

0,2 mM KH2PO4;

1 mM KNO3;

113 mM MgSOi;

mM CaClz;

IX K3 micronutrienți;

sterilizare prin filtrare.

I estul ELISA al protoplaștilor transformați se face la o zi după transformare. Testele EI.ISA se efectuează conform descrierii anterioare. Următoarele trei experimente sunt realizate cu linia 211D din familia porumbului. Desigur, pol fi folosite și alte linii de porumb. Se folosesc 50 pg de plasmid pCIB4419 și cantități echimolare din alte plasmide. Proteina totală solubilă se determină prin leslul pentru proteine BioRea (Bradford. Anal. Biochem., 72:248 (1976).

Experimentul transformării

Structurile lestate:

1. pC!B4419 (structura conține Bt sintetic sub controlul promotorului Ca MV 358 și gene marker 35 S PAT și 358/GUS).

2. pCIB4420 (structura conține Bt sintetic sun controlul promotorului de măduvă și gena-marker PAT).

3. pCIB4421 (structura conține Bt sintetic sub controlul promotorului PEPC).

4. pCIB4423 (structura conține Bt sintetic sub controlul promotorului PEPC și gena marker PAT).

In următoarele experimente, răsadurile 211D, în vârstă de 10 sau 11 zile, sunt analizate pentru producerea proteinei Bt CrylA(b), prin testul pentru proteine BioRad.

Experimentul 1 (răsaduri de 11 zile): pCIB4419 -15000 -3000 ng Bt/mg proteină; pCIB4420 -280-65 ng Bt/mg proteină; pCIB4421 -9000-800 ng Bt/mg proteină.

Experimentul 2 (răsaduri de 10 zile): pCIB4419 -5000-270 ng Bt/mg proteină; pCIB4420 - 80-14 ng Bt/mg proteină; pCIB4421 -1600-220 ng Bt/mg proteină.

Experimentul 3 (răsaduri de 11 zile):

pCIB4419 - 21500-1800 ng Bt/mg proteină;

pCIB4420 - 260-50 ng Bt/mg proteină;

pCIB4421 -11900-4000 ng Bt/mg proteină;

pCIB4423 - 7200-3400 ng Bt/mg proteină.

114

Experimentele de mai sus confirmă fapt ul că atât promotorul CaMV 35 S cât și promotorul PEI’C exprimă proteina CrylA(b) Bt sinletică la nivele foarte înalte. Promotorul de măduvă, deși mai puțin eficient, este și el eficace pentru exprimarea proteinei CrylA(b) sintetice.

Exemplul 44. Exprimarea stabilă a Bl sintetice la salata verde

Gena Bt sintetică din vectorul Agrobacterium pCIB4417 este transformată în Lactuca native cv. Redprize (salată verde). Metoda dc transformare folosită este descrisă în Ecomoto et al., Plant Cel! Reports, 9:6-9 (1990).

Metoda de transformare

Semințele de salată verde au suprafața sterilizată în Clorox 5%. timp de 5 min, urmat de câteva spălări în apă distilată sterilă. Semințele cu suprafața sterilizată sunt însămânțate pe mediu MS cu puterea la jumătate (Murashuge and Shoog, Physiol. Plant, 15:473-497 (1962). Cotiledoanele răsadurilor în vârstă de 6 zile ale Redprize, crescute la iluminare de 3000ex., timpde 16 h, la 25°C, sunt folosite drept explant pentru infectarea c\iAgrobacterium. Baza și vârful fiecărui cotiledon sunt îndepărtate cu un bisturiu. Explantele sunt agitate, timp de 10 min, în soluție de culturi bacteriene, cunoscute timp de 48 h, în mediu minimal AB cu antibioticele adecvate, la 28°C. După absorbția excesului de soluție bacteriană pe hârtie de filtru sterilă, explantele sunt însămânțate pe mediu MS (0,1 mg/1 BA și 0,1 mg/1 NAA), timp de 2 zile. Explantele sunt apoi transferate pe mediu selectiv ce conține 500 mg/1 carbenicilină și 50 mg/1 kanamicină. Explantele sunt subcultivate săptămânal pe mediu proaspăt. Condițiile din camera de creștere sunt 16 h, lumină 2000 ex. la 25°C. După aproximativ 4 săptămâni, se efectuează un test ELISA pe un calus cu aspect sănătos din fiecare din cele patru plăci care au fost subcultivate. Metoda ELISA este aceeași cu cea descrisă anterior pentru protoplaști; proteina solubilă este determinată din nou prin

115 lestul BioRad descris mai sus.

Rezultate:

pC!B3021 0;

pCIB4417 (placa 1) 0;

pCIB4417 (placa 2) 505 ng Bt/mg proteină;

pCIB4417 (placa 3) 45 ng Bt/mg proteină;

pCIB4417 (placa 4) 1,200 ng Bt/mg proteină.

Acest exemplu demonstrează că dicotiledonatele pot și ele să crească exprimarea genei insecticide îmbunătățite.

Exemplul 45. Construirea pCIB4429 pCIB4429 conține un promotor preferențial cu specificitate pentru polen de porumb, fuzionat cu gena CrvIA(b) de porumb îmbunătățită. Promotorul de porumb cu specificitate pentru polen folosit în această structură a fost obținut din plasmida pKL.2, descrisă în exemplul 57.

pKL2 este o plasmidă ce conține un promotor preferențial de porumb cu specificitate pentru polen, fuzionat cu gena beta - glucuronidazei de E.coli. A fost realizat din plasmidele pSKllO și p(TB3054, pSKllO conține promotorul de porumb cu specifici polenului. pCIB3054, un derivat al pUC19, conține gena 6e«/glucuronidazei deE.coli, fuzionată cu promotorul (CaNV) 358 al virusului-mozaic de la conopidă. Construirea lui este descrisă în altă secțiune a acestei cereri. Acest promotor poate fi recuperat din această plasmidă prin tăierea cu Sall/HindIII pentru a obține un fragment ce conține gena GUS o genă pentru rezistență bacteriană la ampicilină și o sursă de replicare Col SI. Un al doilea fragment conține promotorul COM 35S.

pCIB3054 a fost tăiat cu enzimele de restricție Săli și HindIII, în condiții standard, timp de 2 h, la temperatura camerei. Reacția a fost extrasă cu fenol/cloroform în condiții standard și ADN recuperat prin precipitare cu etanol în condiții standard. ADN recuperat a fost resuspendat în tamponum adecvat

116 pentru reacția cu foslatază alcalină de intestin de vițel (CIP) și a reacționat cu

2,5 unități de CIP, la 37°C, până a doua zi. După reacția CIP, ADN a fost purificat pe un gel de agaroză, în condiții standard descrise, pSKllO a fost tăiat cu Sall/Hind III în condiții standard, timp de 2 h, la temperatura camerei, iar ADN a fost ulterior purificat pe un gel de agaroză în condiții standard. Fragmentele de ADN recuperate au fosl liga te în condiții standard, timp de 2 h, la temperatura camerei și apoi transformate în celule competente E.coli linia HB 101, în condiții standard. Transformanții au fost selectați pel -agarcu lOO^gampicilină/ml. Transformanții au fost caracterizați pentru structura plasmidică dorită, folosind metode standard de mini-triere a plasmidelor. Structura corectă a fost desemnată pKL2.

Pentru a forma pCIB4429, s-a efectuat oligareîntrei puncte în condiții standard cunoscute în domeniu. Cele trei fragmente ligate au fost:

SK50:5’-CC TTC AAA ATC TAG AAA C-CT-3’

KE 127: 5’-GCG GAT CCG GCT GCG GCGGGGAACCA-3’

Primerii de mai sus au fost amestecați într-o reacție PCR ca plasmidă pSK105, o plasmidă ce conține promotorul specific polenului din porumb.

După încheierea reacției PCR, 10 ul din reacție au fost plasați pe un gel de agaroză. în condiții standard, pentru a avea siguranța că reacția a realizat dimensiunea scontată a produsului. Cei 90 μ\ rămași au fost tratați cu proteinază K la o concentrație finală de 50 /-ig/ml, timp de 30 min, la 37°C. Reacția a fost apoi încălzită la 65°C, timp de 10 min, apoi extrasă cu fenol/cloroform utilizând metode standard. ADN a fost recuperat din supernatant prin precipitare cu două volume de etanol, în condiții standard. După precipitare, ADN a fost recuperat prin centrifugare într-o microcentrifugă. Precipitatul a fost clătit o dată cu etanol 70% (așa cum este standardizat în

117 domeniu), uscal rapid pentru a îndepărta tot etanolul, iar apoi resuspendat în 17 ml tampon TE. 2/dde tampon de enzimă de restricție 10X au fost adăugați, la fel și 0,5 μ{ BamHI și 0,5 Xbal. ADN a fost digerat, timp de 1 li, 37°C. pentru a produce un fragment ADN tăiat cu Xbal/BamHI. După digerare cu enzime de restricție, acest fragment a lost purificat pe un gel de agaroză compus din 2% Nusieve (FMC) 1% gel de agaroză. Elemente filtrante Millipore au fost folosite pentru a elua ADN din agaroză, folosind precizările producătorului. După eluare, ADN a fost folosit în ligarea în trei puncte descrisă anterior.

După ligare, ADN a fost transformat în celule competente E.coli linia HB 101 prin tehnici standard. Transformanții au fost selectați pe plăci de L-agar conținând ampicilina 100//g/ml. Coloniile care s-au dezvoltat în condiții selective au fost caracterizate pentru inserțiile plasmidice, folosind tehnici standard în domeniu.

Exemplul 46. Construirea pCIB4431, un vector pentru exprimarea cu specificitate pentru țesuturi a genei CrylAțb) sintetice la plante pdB4431 este un vector proiectat să transformare porumbul. Conține două gene himerice de endotoxină Bt, exprimabile la porumb. Aceste gene sunt promotorul PEP carboxilază/CrylAțb) sintetic și promotor de polen/CryLAțb) sintetic. Gena PEP carboxilază/CrylAțb) din acest vector derivă din pCIB4421 mai sus. Promotorul de polen este, de asemenea, descris anterior. Fig.20 este o hartă a plasmid ului pCIB4431, pCIB4431 a fost construit prin ligarea a trei părți, folosind fragmentul KpnI/HindIII de aproximativ 3,5 kb (ce conține polen/CryIA(b) sintetic) din pCIB4429, HindIII/EcoRI de aproximativ 4,5 kb (PEPC/CiyIA(b) sintetic) și fragmentul KpnI/EcoRI de aproximativ 2,6 kb din vectorul Bluescript

Alți vectori, cum ar fi gena himerică promotor de polen/CryIA(b) sintetic, includ pCIB4428 și pCIB4430. A se

118 vedea fig.21 și 22. pClB4430 conține și gena PEP/Bt sintetic descrisă mai sus.

Exemplul 47. Producerea plantelor transgenice de porumb conținând gena sintetică CrylA(b) de porumb îmbunătățită

Exemplul de mai jos folosește Biolistice pentru a introduce particule învelite în ADN în interiorul celulelor de porumb, din care sunt generate plante transformate.

Experimentul KC-65

Producerea plantelor transgenice de porumb ce exprimă gena sintetică CrylA(b), folosind un promotor cu specificitate pentru țesuturi. Embrionii imaturi de porumb, în lungime de aproximativ

1,5...2,5 mm, nu au fost excizați dintr-un spic al genotipului 6H615 la 10...15 zile după polenizare. Planta mamă a crescut în seră. înainte de excizare. suprafața spicului a fost sterilizată cu Clorax 20%, timp de 20 min și clătită de trei ori cu apă sterilă.

Embrionii separați au fost însămânțați cu partea numită scutellum pe o suprafață de 2 cm, câte 36 embrioni pe o placă, pe mediu de inițiere a caisului, mediu 2 DG4 + 5 - cloramben (N6 săruri majore, B5 săruri minore, fier M8, 2% sucroză, cu 5 ‘mg/1 cloramben 20 mg/1 glucoză și 10 ml aditivi GH (tabelul 2), adăugați după autoclavare.

Aditivi G4

Tabelul 2

Ingredient	Mediu/litru
Hidrolizat de cazeină	0,5 mg
Prolină	1,38 mg
Acid nicotinic	0,2 mg
Piridoxină-HCl	0,2 mg
Tiamină HC1	0,5 mg
Colină HC1	0,1 mg
Riboflavină	0,05 mg
Biotină	0,1 mg
Acid folie	0,05 mg
Pantotenat de calciu	0,1 mg
Acid p-aminobenzoic	0,05 mg
S12	0,136 με

Țesutul a fost bombardat, folosind dizpozitivul Biolistics PDS - 1000 He.

L19

120

Țesutul a fost plasat pe locaș la <8 cm, sub locașul ecranului de oprire. Țesutul a fost țintit o dată cu soluție de micropurtător ADN/aur. 10μ\ uscat pe macropurtător. Ecranul de oprire folosit a fost 5 perforat manual la ABRU. folosind un ecran perforat de oțel inoxidabil 10 x 10.

S-au folosit discuri de ruptură, în valoare de 1550 psi. După bombardament embrionii au fosl cultvați la întuneric la 10 25°C.

Prepararea ADN pentru transport

Micropurlătorul a fost pregătit. în general, conform cu instrucțiunile furnizate cu dispozitivul Biolistics. în timp ce 15 se turbionează micropurlătorul de aur 50 /<1 1.0 μ, se adaugă 5 al pCLB4431 (1,23 μ&μΐ) /nr.898/ +2 /<1 pCIB3064 (0,895 /ig/ml) /nr.456/, urmate de 50 /îl

2,5 M CaClz) apoi 20//10.1 M spermidină 20 (bază libera, grad TC). Amestecul rezultat a fost turbionat 3 min și microcentrifugat timp de 10 s. Supematantul a fost îndepărtat iar micropurtătorii spălați de 2 ori cu 250 μΐ de EtOH 100% (grad 25 HPLC) printr-o scurtă turbionare, centrifugare și îndepărtarea supematantului. Micropurtătorii sunt resuspendați în 65 μΐ EtOH 100%.

Formarea călușului 30

Embrionii au fost transferați pe mediu de inițiere ca călușului cu 3 mg/1 PPT, la o zi după bombardament Embrionii au fost marcați pentru inițierea călușului la și 3 săptămâni după bombardament 35 Toate răspunsurile au fost transferate pe mediu de menținere a călușului, mediu 2DG4 + 0,5 2,4-D cu 3 mg/1 PPT. Mediul de menținere a călușului este Ne săruri majore, Bs săruri minore, fier MS, 2% 40 sucroză, cu 0,5 mg/12,4-D, 20 mg/2 glucoză și 10 ml aditivi G4, adăugați după autoclavare. Călușul embriogenic a fost subcultivat la fiecare 2 săptămâni pe mediu de menținere proaspăt conținând 45 mg/1 PPT. Toate călușurile au fost incubate la întuneric la 25°C.

Răspunsul la formarea călușului de tip I a fost 15%. Fiecare embrion care a produs calus a fost cultivat ca o probă 50 individuală ce dă naștere unei linii individuale.

Regenerarea

După 12 săptămâni de le selectare, țesutul a fost recuperat din mediul de menținere a călușului cu PPT și a fost plasat pe mediu de regenerare, (mediul de regenerare este 0,25MS3S5AB/ 0,25 mg/1 2,4-D, 5 mg/1 BAP. săruri MS, 3% sucroză). timp de 2 săptămâni, urmat de subcultivarea pe mediu MS38 pentru regenerarea plantelor. După 4...10 săptămâni, plantele au fost recuperate și puse în GA 7. Linia noastră KC 65 0-6, care a devenit proba nr.176 BT a produs un total de 38 plante.

Teste

Poate plantele așa cum au fost determinate în GA7, au fost testate prin testul cu roșu-clorofenol (CR) pentru rezistență la PPT. Aceste teste folosesc un indicator de culoare cu sensibilitate la/?H, pentru a arăta celulele care cresc în prezența PPT. Celulele care cresc produc o modificare de/>H în mediu și virează culoarea indicatorului în galben (din roșu). Plantele ce exprimă gena rezistenței la PPT se observă ușor în acest test (nr.176 = 8 pozitive/30 negative). Plantele pozitive la testul CR au fost testate prin PCR pentru prezența genei sintetice (Nr.176 = 5 pozitive/ 2 negative/ 1 moartă).

Plantele pozitive la PCR pentru gena Syn-Bt au fost dirijate spre fitotron. Odată fixate în fitotron au fost caracterizate, folosind testele biologice pentru insecte și analiza ELISA. Plantele au fost biotestate pentru insecte, folosind un test standard pentru dăunătorul european al cerealelor (descris în exemplul 5A), în care piese mici de frunze au fost tăiate, dintr-o plantă și plasate într-o cutie Petri mică, cu un număr de larve nou născute de ECB. Plantele sunt de regulă testate când au o înălțime de aproximativ 6 ioni. Plantele ce demonstrează o mortalitate de 100% ECB în acest test sunt caracterizate în continuare. Datele ELISA sunt prezentate mai jos. Plantele

122

121 pozitive sunt mutate în seră.

Planta cu numărul 176-11 a fost polenizată cu polen de tip sălbatic 6N615. Au fost produse un spic ramificat și un lăstar de spic. Toți embrionii din Spicul ramificat (H) și 56 boabe din Spicul 1 au fost păstrate. 294 de boabe au rămas pe spic și s-au scuturat natural.

Polenul de la nr. 176-11 a fost încrucișai cu diverse geno-tipuri de porumb, 5N984. 5NA89 și 3N961. Au fost păstrați embrioni din toate cele trei încrucișări (5NMX4 = 45; 5NA89 = 30: 3N961 = 8). Majoritatea boabelor au rămas în spicuri pe plantă, în seră, și s-au scuturat natural.

ADN a fost izolat din plante nr.176-11 prin tehnici standard și analizat prin test Southern bioL A fost depistat a conține secvențe care hibridizează cu probe obținute din gena C'rylA(b) sintetică și cu o probă obținută din gena PAT. Aceste rezultate demonstrează integrarea acestor gene în genomum porumbului.

Experimentul KC - 64

Producerea de plante transgenice de porumb ce exprimă gena sintetică CrylAțb) folosind un promotor constitutiv.

Embrioni imaturi de porumb, în lungime de aproximativ 1,5...2,5 mm, au fost excizați pe un spic cu genotipul 6N615, la 14...15 zile de la polenizare. Planta mamă a fost crescută în seră. înainte de excizare suprafața spicului a fost sterilizată cu Clorox 20%, timp de 20 min și clătită de 3 ori cu apă sterilă. Embrioni separați au fost însămânțați cu partea dinspre scutellum pe o suprafață de 2 cm , 36 embrioni pe o placă, pe mediu de inițiere a călușului, 2 DG4 + 5 mediu cloramben (N6 săruri majore, B5 săruri minore fier MS, 2% sucroză, cu 5 mg/l cloramben, 20 mg/l glucoză și 10 ml aditivi G4 (tabelul 3), adăugate după autoclavare.

Aditivi G4

Ingredient	Mediu /litru
Hidrolizat de cazeină	0,5 mg
Prolină	1,38 mg
Acid nicotinic	0,2 mg
Piridoxină-HCl	0,2 mg
Tiamină-HCl	0,5 mg
Colină-IICI	0,1 mg
Ribotlavină	0,05 mg
Biotină	0,1 mg
Acid lot ic	0,05 mg
Pantotenat de calciu	0.1 mg
Acid p-aminobenzoic	0.05 mg
B12	0,136/zg

Țesutul a fost bombardat folosind dispozitivul Biolistics PDS - 1000 He. Țesutul a fost plasat pe locaș, la 8 cm sub locașul ecranului de oprire. Țesutul a fost țintit o dată cu soluție ADN micropurtător de aur, 10 μ\ uscat pe macropurtător. Ecranul de oprire a fost perforat manual la ABRU, folosind un ecran cu rețea de oțel 10 x 10. Au fost folosite discuri de ruptură de 1550 psi. După bombardament, embrionii au fost cultivați în întuneric la 25°C.

Pregătirea ADN, pentru transport

Micropurtătorul a fost pregătit în esență, conform instrucțiunilor furnizate împreună cu dispozitivul Biolistic. în timp ce se turbionează 50 /zi 1,0 /zl micropurtător de aur, se adaugă 3,2 /zl pCIB4419 (0,85 /zg//zl) I nr.905/ +2 /zl pCIB3064 (0,895/zg//zl) /nr.456/ +1,6 /zl pCIB3007A (1,7 /zh//zl) (nr.152), urmată de 50 /zl 2,5 M CaC12, apoi 20 /zl 0,1 M spermidină (bază liberă, grad TC). Amestecul rezultat a fost turbionat 3 min și microcentrifugat timp de 10 s. Supematantul a fost îndepărtat și micropurtătorii spălați de 2 ori cu 250 /zl de EtOH 100% (grad HPLC) prin turbionare rapid, centrifugarea și îndepărtarea supernatantului. Micropurtătorii sunt resuspendați în 65 μ\ EtOH 100%.

Formarea călușului

Embrionii au fost transferați pe mediu de inițiere a călușului cu 3 mg/l PPT la

123 o zi după bombardament. Embrionii au fost estimați pentru inițierea călușului la și 3 săptămâni după bombardament Toate răspunsurile au fost transferate pe mediu de menținere a călușului mediu 2DG4 + 0.5 2,4-D cu 3 mg/1 PPT. Mediul de menținere a călușului este N6 săruri majore, B5 săruri minore, fier MS. 2% glucoza, cu 0,5 mg'l, 24-D, 20 mg/1 glucoza și 10 ml aditivi Ct4, adăugați după autoclavare. Călușul embriogenic a fost subcultivat la fiecare 2 săptămâni pe mediu de menținere proaspăt, ce conține mg/1 PPT. Toate călușurile au fost incubate în întuneric la 25°C.

Răspunsul la formarea călușului de tip I a fost 18%. Fiecare embrion care a produs calus a fost cultivat ca probă separată ce dă naștere la o linie individuală.

Regenerarea

După 12 săptămâni de selectare, țesutul a fost îndepărtat din mediul de menținere a călușului cu PPT și a fost plasat pe mediul de regenerare și incubat la 25°C, folpsind un regim de 16 h lumină (50 /zE.m’“ 5'¹) /8 h întuneric. Mediul de regenerare este 0,25 MS3S5BA (0,25 mg/12,4 D, 5 mg/1 BAP, săruri MS, sucroză 3%), timp de 2 săptămâni, urmată de subcultivare pe mediu MS3S pentru regenerarea plantelor. După 4...10 săptămâni, plantele au fost adunate și introduse în GA 7. Linia noastră KC 64 0-1, care a devenit proba nr.170 BT, a produs 55 plante. Linia noastră KC 64 0-7, care a devenit proba nr.171 Bt, a produs în total 33 plante.

Teste plante, așa cum au fost determinate în GA 7, au fost testate în testul cu roșu, clorofenul (CR) pentru rezistența la PPT, după Shillito et al., anterior. Acest test folosește un indicator de culoare cu sensibilitate pentrupH pentru a demonstra care celule cresc în prezența PPT. Celulele care cresc produc o modificare de pH în mediu și virează indicatorul în galben (din roșu). Plantele care exprimă gena rezistenței la PPT

124 sunt ușor de observat în acest test. Plantele pozitive la testul CR au fost testate prin PCR pentru prezența genei sintetice Bt (Proba 170 = 37 pozitive/ 18 negative; nr.171 = 25 pozitive/ 8 negative.

Plantele pozitive la PCR pentru gena sintetică Bt au fost dirijate spre fitotron. Odată fixate în fitotron, au fost caracterizate folosind testele biologice pentru insecte și analiza ELISA. Plantele au fost biotestate folosind un test standard pentru dăunătorul european al cerealelor (a se vedea mai jos) în care piese mici de frunză au fost tăiate, dintr-o plantă și plasate într-o cutie Petri mică împreună cu un număr de larve ECB nou născute. Plantele ce au demonstrat o mortalitate 100% a ECB în acest test, sunt mai departe caracterizate. Datele ELISA sunt prezentate mai jos. Plantele pozitive sunt mutate în seră.

Trierea Basta plante mature din proba nr.70 au fost selectate pentru evaluarea rezistenței Basta /Hoechst/. Pe o frunză medie per plantă, o suprafață de aproximativ 10... 14 cm în lungime x lățimea frunzei a fost vopsită cu o soluție apoasă. Basta 0, 0,4, 1,0 sau 2,6% (10 ml din 200 g/1 diluați în 100 ml apă deionizată), care conține 2 picături de Tween 20/100 ml. Au fost testate 2 plante per nivel. 8 plante din tipul sălbatic 6N615, de aproximativ aceeași vârstă, au fost tratate ca martori. Toate plantele au fost examinate la 4 și 7 zile. Toate plantele martor au murit în final. De-a lungul studiului nici una din plantele nr.170 nu a prezentat vreo deteriorare datorită ierbicidului.

Polenizarea

Toate spicele ramificate, primul spic și, dacă este disponibil, cel de-al doilea spic de pe plantele nr.170 și 171 au fost polenizate cu polen de tip sălbatic 6N615. Cel puțin 90% din plante erau feminine fertile.

Polenul de la plantele nr.171 a fost încrucișat cu genotipurile 6N615, 5N

984, 5NA89, 6F010, 5NA56, 2N217AF,

125

2ND01 și 3N961. Cel puțin 90% din plante s-au dovedit a fi bărbătești fertile.

Salvarea embrionilor

Embrionii din proba nr. 171 au fost salvați. La 14... 16 zile după polenizare, vârful spicului, cu 25...50 de boabe a fost tăiat de pe spic cu un fierăstrău. înainte de tăiere bobul a fost decortizat cu grijă pentru expunerea porțiunii superioare a spicului. C/apătul tăiat al spicului de pe plantă a fost vopsit cu fungicid Captan și apoi cojile au fost repuse la loc. Bobul rămas pe plantă a fost lăsat să se usuce natural.

Piesadespicexcizată a fost sterilizată la suprafață cu Clorox 20%, timp de 20 min și clătită cu apă sterilă. Embrionii separați au fost excizați și însămânțați cu partea dinspre scutelîum pe mediu B5 /Gamborg/ ce conține 2% sucroză. Se adaugă vitamine B5 în mediu, după autoclavare. Patru embrioni au fost însămânțați per conteiner GA 7, iar conteinerele au fost incubate în întuneric. Când s-a produs germinarea, conteinerele au fost mutate într-o cameră de cultivare la lumină și incubate la 25°C, folosind un regim 16 h lumină (50 μΕ. m “.s ț /8 h întuneric. Frecvența germinării este 94%.

Progeni din 15 plante din proba nr. 171 și 2 plante din proba nr.176 au fost salvați folosind tehnici standard de salvare a embrionilor și apoi evaluați. Toate plantele au fost evaluate prin teste pentru insecte. Plantele din proba nr.171 au fost testate și în testul histochimic Gun. Atât în testul pentru insecte cât și în testul GUS, proporția segregării transgenilor a fost 1:1, așa cum era de așteptat pentru o probă cu un singur locus de inserție.

Exemplul 48.^4n«/îzfl plantelor transgenice de porumb. Testul ELISA

Detectarea exprimării genei

CiylA(b) la porumbul transgenic este monitorizata prin teste biologice pentru insecte cu dăunătorul european al cerealelor și analiza ELISA, pentru o determinare cantitativă a nivelului de proteină

126

CrylA(b) obținută.

Determinarea cantitativă a PICrylA(b) în frunzele plantelor transgenice a fost efectuată folosind ELISA, așa cum e descris în Clark MF, Lister RM, Bar-Joseph M:ELISA Techniques. în: Weissbach A, Weissbach ll, Methods in Enzymology, 118:742-766, Academic Press. Florida (1986). Anticorpi policlonali purificați, cu imunoafinitate, de iepure și capră, specifici pentru PI B. thuringiensis subsp. kurstaki. au fost folosiți ixmtru a determina ng PI per mg proteină solubilă din extractele pure din mostrele de frunză. Sensibilitatea testului ELISA în dublu-sandwich este 1...5 ng PI per mag proteină solubilă, folosind 50 ng de proteină solubilă per sondă microtitrată ELISA.

Extractele de porumb au fost realizate prin măcinarea țesutului de frunză în pungi de plastic căptușite cu tifon, folosind un omogenizator cu rulment manual (AGDIA) Elkart IN. în prezența tamponului de extracție (50 mM Na2COs pH=9,5, 100 mM NaCl, 0,05% Triton, 0,05% Tween, 1 mM PMSF și 1 μΜ leupeptin). Determinarea proteinelor s-a efectuat folosind testul BlO-Rad pentru proteine (Richmond, CA).

Utilizând metoda de mai sus, transformanții primari de porumb descriși anterior au fost analizați pentru prezența proteinei CrylA(b) folosind ELISA. Aceste plante au variat în înălțime, de la 6 ioni, la aproximativ 3 picioare, la momentul analizării.

Planta	ng Bt/mg proteină solubilă 27V1991
176-8	o o
176-10	700 1585
176-11	760 2195
171-4A	59
171-6	50
171-8	60
171-9	280
171-13	77
171-14A	43
171-14B	60
171-15	55

127

Planta ng Bt/mg proteină solubilă

171-16A	13
171-16B	19
171-18	19
176-30	1160
171-32	980
171-31	166
171-30	370
71-14
Frunza nr. 10	26
Prima frunză	17
Planta 171-16
Frunza nr.')	40
Frunza nr. 1	120

lestul pentru dăunătorul european al cerealelor

1. Secțiuni de 1...4 cm sunt tăiate dintr-o frunză întinsă a unei plante de porumb.

Fiecare piesă de frunză este plasată pe un disc filtrant umed într-o placă Petri de 50 x 9 mm.

3. 5 larve nou născute de dăunător european al cerealelor sunt plasate pe fiecare piesă de frunză. (Realizând un total de 5...20 latve/plantă).

4. Plăcile Petri sunt incubate la 29,5°C-.

5. Degradările produse prin mâncatul frunzei și mortalitatea sunt estimate la 24, 48 și 72 h.

Exemplul 49. Exprimarea endotoxinei Bt la progenii plantelor de porumb transformate

Plantele de porumb transformate au fost complet fertile și au fost încrucișate cu câteva genotipuri de porumb. Progenii din aceste încrucișări au fost analizați pentru abilitatea lor de a omorî dăunătorul european al cerealelor (ECB) într-un test standard pentru ECB (descris imediat anterior), ca și pentru prezența proteinei CrylA(b) folosind ELISA, așa cum s-a descris anterior. Abilitatea de a omorî ECB și producția de proteină CryIA(b) au fost corelate. Aceste trăsături, segregate la progeni în proporție de 1:1 indică un singur situs de inserție pentru copia activă a genei sintetice. Această proporție de 1:1 a fost reală atât pentru

128 plantele promotor constitutiv/CrylAțb) sintetic, cât și pentru plantele promotor cu specifici Late pentru țesut uri/CryIA(b) sintetic (nu sunt figurate dale).

Fig.23A este un tabel ce conține un mic subsetdin numărul total de progeni analizați. Acest tabel este reprezentativ pentru un număr de încrucișări diferite.

Testele pe insecte au fost realizate cu Diatrea saccharalis i Ost rin ia nubilalis, folosind material de funză (ca în descrierea anterioară) din progenul transgenic ce conține gura CrylA(b) de porumb îmbunătățită. Rezultatele acestor teste sunt prezentate în tig.23B. Ele demonstrează că gena CrylA(b) de porumb îmbunătățită funcționează în porumbul transformat pentru determinarea rezistenței la dăunătorul trestiei de zahăr și la Ostrinia nubilalis.

Exemplul 50. Exprimarea genei CrvIA(b) la polenul de porumb

Progenii din plantele transformate de porumb care conțin gena himerică promotor de polen/CryIA(b) sintetică ce a derivat din pCIB4431, au crescut pe câmp până la maturitate. Polenul a fost adunat și analizat pentru prezența proteinei CryIA(b), folosind tehnicile standard ELISA, așa cum sunt descrise în altă acțiune. în polen au fost detectate niveluri înalte de proteină CryIA(b). progenii din plantele transformate cu promotor 35 S/CryIA(b) sintetic au fost crescute în seră. Polenul de la aceste plante a fost analizat prin ELISA și a fost detectată proteina CtylA(b).

Rezultatele sunt arătate mai departe în fig.23C.

Este recunoscut că pot de asemenea afecta exprimarea, factori, cum ar fi: selecția liniilor de plante, genotipurile plantelor, secvențele sintetice.

Exemplul 51. Exprimarea genei

CryL4(b) fuzionate cu un promotor cu afinitate pentru măduvă pCIB4433 (fig.3) este o plasmidă ce conține gena de porumb CrylA(b) îmbunătățită fuzionată cu promotorul cu afinitate pentru măduvă izolat din po110263

129 rumb. Aceasta plasmidă a fost construită folosind o ligare în trei puncte, constând din:

1. pCIB4418. tăiat cu Bs'l’EI și BamHI.· fragment de 1.8 kb;

2. pBtin 1. tăiat cu N și I șiBatEIl; fragment de 5,9 kb; pBtin este descris în altă secțiune în această cerere:

3. Fragmentul PCR VI - 151 a fost generai într-o reacție folosind condiții standard care au fost descrise în altă secțiune a acestei cereri.

Primerii PCR utilizați au fost:

KE 150A28: 5-ΑΊΤ CGC ATG CAT’ GTrrCA'TTATC-3’

KE 151A28: 5’-GCT GGT ACC AGG GAT’ CCG TCG CTT CTG T GC AAC C-3’

După reacția PCR. ADN a fost verificat pe un gel de agaroza pentru a avea siguranța că reacția s-a efectuat corect. ADN a fost recuperat din reacția PCR, folosind condițiile standard descrise în altă secțiune. PI a fost tăiat ulterior cu enzimele de restricție Nsil și BamHI în condiții standard. După tăiere fragmentul a fost dirijat pe un gel Nusieve 2%, iar banda dorită a fost recuperată, așa cum s-a descris în altă secțiune. ADN a fost folosit în ligarea descrisă anterior.

După ligare (în condiții standard, ADN a fost transformat în celule competente E.coli.

Transformarea s-a derulat folosind bombardamentul cu microproiectile, în mare la fel cu cel descris. Embrionii au fost transferați pe mediu cu 100 pg/ml PPT, la 24 h după bombardamentul cu microproiectile. Călușul rezultat a fost transferat pe mediu ce conține 40 /4g/ml PPT, după patru săptămâni. Plantele au fost regenerate fără selecție.

O mică mostră de plante (3-5) a fost testată prin PCR pentru fiecare probă.

S-au adăugat și alte coduri pentru a indica diferite poziții și distanțe ale embrionilor în legătură cu dispozitivul de bombardament cu microproiectile.

Plantele au fost trimise în sera având

130 următoarele coduri:

JS21A TOP Plante Bt PCR pozitive; JS21A MID Plante Bt PCR pozitive; JS21C Bot Plante Bt PCR pozitive; JS22DMID Plante Bt PCR pozitive; JS23D MID Plante Bt PCR negative (pentru control).

Mostrele de frunze din plantele regenerate au fost testate biologic pentru activitate insecticidă împotriva dăunătorului european al cerealelor, așa cum a fost descris în exemplul 48, cu rezultate prezentate în fig.23D.

Analiza EEISA a mostrelor de frunzăm pentru a cuantifica nivelul de proteină CrylA(b) exprimată în frunze, s-a derulat ca în descrierea din exemplul 48. cu rezultate prezentare în fig.24E.

Depozite

Următoarele plasmide au fost depozitate la Agricultural Research Culture Colection (colecția de culturi pentru cercetări în agricultură, NRRL 1818 N University St.Peoria. IL.61604) sub prevederile tratatului de la Budapesta: pCIB4429. pCIB4431, pCIB4433, pCIB5601, pCIB3166 și pCIB3171.

Claims (19)

1. Secvență sintetică de nucleotide, caracterizată prin aceea ca, codifică o proteină insecticidă de Bacillus thuringiensis capabilă să se exprime în cantități eficiente la porumb și prezintă o succesiune explicitata în secvența 3, secvența 4 sau în fig.7, iar în continuare un prim promotor capabil sa direcționeze exprimarea, legat operațional la această secvență.

2. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, codifică o proteină CrylA(b) care este stabilă din punct de vedere termic comparativ cu o proteină nativă CiyIA(b).

3. Secvență, conform revendicării 2, caracterizata prin aceea că, cuprinde o succesiune de nucleotide dintre cele explicitate în fig.9, 11, 13 și 15.

131

132

4. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că. codifică o proteină CrylB sau CrylA(c).

5. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, codifică o proteină CrylB, explicitată în fig.6.

6. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că. promotorul este capabil să direcționeze exprimarea unei secvențe asociate de Bacillus thuringiensis în celula de porumb.

7. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că. promotorul este selectat dintr-un grup constând din promotori inductibili, constitutivi, stabili în timp, cu afinitate sau specificitate pentru țesuturi.

8. Secvență, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că, promotorul este selectat dintr-un grup constând dintrun promotor CaMV35S, CaMV19S, PEP carboxidaza, cu afinitate pentru măduvă și cu specificitate pentru polen.

9. Secvență, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că, promotorul au afinitate pentru măduvă cuprinde o secvență ADN explicitată în fig.24.

10. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, promotorul cu specificitate pentru polen cuprinde o secvență ADN explicitată în fig.35.

11. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cuprinde în continuare un al doilea promotor capabil să direcționeze exprimarea unei secvențe de codare asociate în celula vegetală, legată operativ la cea de-a doua secvență de codare pentru o proteină insecticidă de Bacillus thuringiensis.

12. Secvență, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cel de-al doilea promotor este selectat dintr-un grup constând din promotori inductibili, constitutivi, stabili în timp, cu dezvoltare stabilă cu afinitate sau specificitate pentru țesuturi.

13. Secvență, conform revendicării

11. caracterizată prin aceea că, cel de-al doilea promotor este selectat dintr-un 5 grup constând dintr-un promotor CaMV35S, CaMV195, PEP carboxidaza, cu afinitate pentru măduvă și cu specificitate pentru polen.

14. Secvență, conform revendicării

10 11, caracterizată prin aceea că, cea de-a doua secvență de codare, codifică o proteină CrylA(b).

15. Secvență, conform revendicării

11. caracterizată prin aceea că, cea de-a

15 doua secvență de codare este o genă marker.

16. Plantă stabil transformată, caracterizata prin aceea că. transformarea s-a făcut cu o secvență de nucleotide descrisă

20 la revendicările 1...15, la care proteina insecticidă este exprimată în planta transformată de cel puțin 100 ori mai mult decât exprimarea proteinei, folosind o secvență de codare nativă și este capabilă 25 sa controleze dezvoltarea insectelor Lepidoptere și Coleoptere.

17. Plantă, conform revendicării 16, caracterizată prin aceea că, proteina insecticidă este capabilă să controleze

30 dezvoltarea insectelor selectate dintre: dăunătorul european al cerealelor, dăunătorul trestiei de zahăr, dăunători de tulpină, viermi scurți, viermi giganți, viermi de rădăcină, viermi subțiri, afide. 35

18. Plantă, conform revendicării 16, caracterizată prin aceea ca, aceasta este o plantă de porumb.

19. Procedeu de producere a secvenței de nucleotide sintetice conform reven40 dicării 1, caracterizat prin aceea că, se procedează la delimitarea secvenței de aminoacizi a proteinei insecticide Bacillus thuringiensis și alterarea secvenței de codare a proteinei prin substituirea co45 donilor care sunt preferați la porumb cu codonii nativi corespondenți.