MX2011001486A - El uso de mediadores inflamatorios en el tratamiento del deterioro cognotivo. - Google Patents

Abstract

La invención en cuestión involucra materiales y métodos para tratar a una persona o animal que tiene deterioro cognitivo; en una modalidad, el método comprende administrar una cantidad efectiva de uno o más mediadores inflamatorios, por ejemplo el ligando de tirosina quinasa tipo 3 relacionado con el síndrome de fibromialgia (Flt3), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), interleucina-1 (IL-I), interleucina-3 (lL-3), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento endotelial vascular tipo A (VEGF-A), factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1 alfa), factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (1GF-1), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre (SCF), darbepoyetina (ARANESP) y metaloproteinasas, a un animal o que necesita el tratamiento.

Description

EL USO DE MEDIADORES INFLAMATORIOS EN EL TRATAMIENTO DEL DETERIORO COGNITIVO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud clama el beneficio de la solicitud provisional de los EE.UU. serie No. 61/086,351 , presentada el 5 de agosto del 2008, que se incorpora por la presente mediante referencia en la presente en su totalidad, incluyendo cualesquiera figuras, cuadros, secuencias de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos y dibujos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La pérdida de memoria ha sido ampliamente reconocida como un acompañamiento común del envejecimiento. La incapacidad para recordar el nombre de un conocido reciente o el contenido de una lista corta de mandado son experiencias familiares para todos y esta experiencia parece ser más común a medida que se envejece.

Durante las últimas décadas, la comunidad médica ha cambiado su punto de vista sobre la pérdida de memoria en los ancianos. Estos problemas se veían en el pasado como acompañantes inevitables del envejecimiento, nombrados a menudo como "senilidad" o "lapsus mental." Más recientemente, los médicos han cambiado su punto de vista sobre la pérdida de memoria, de manera que el deterioro de la memoria de un cierto grado se considera ahora patológico y por lo tanto indica una enfermedad que afecta al cerebro. El umbral que la mayoría de los médicos usan para juzgar esto es que la pérdida de la memoria ha avanzado hasta tal punto que la función independiente normal no es posible; por ejemplo, si uno ya no puede administrar exitosamente sus propias finanzas o proveerse sus necesidades básicas. Este grado de deterioro cognitivo se ha llegado a conocer como demencia.

Sin embargo, muchas personas mayores se quejan de problemas de la memoria, pero aún logran llevar a cabo de forma independiente todas sus tareas habituales. Por lo general, su capacidad de buen desempeño se basa en compensar estas dificultades, tales como una mayor dependencia de un calendario o en notas de recordatorio, listas, etc. En algunos casos, estas dificultades de la memoria son una señal de que el i ¡ agravamiento de la pérdida de memoria no está muy lejos. ! ¡ El síndrome de los problemas subjetivos de la memoria ha llegado a conocerse como "Deterioro cognitivo leve" (MCI), aunque se han utilizado otros términos, como "el deterioro cognitivo sin demencia" (CIND). El paciente con deterioro cognitivo leve se queja de dificultades con la memoria. Por lo general, las quejas incluyen problemas para recordar los nombres de las personas que conocieron recientemente, dificultad para recordar el flujo ele una conversación y una mayor tendencia a perder las cosas, o problemas similares. En muchos casos, la persona será muy consciente de estas dificultades y las compensará con una mayor dependencia de notas y calendarios. Aún más importante, el diagnóstico de MCI se basa en el ¡ hecho de que el individuo es capaz de realizar todas sus actividades habituales con I éxito, sin más ayuda de otros que lo necesario previamente. ¡ Varios estudios han analizado el desempeño cognitiyo ide pacientes con MCI. Estos han demostrado que, en general, estos pacientes i : tienen un desempeño relativamente deficiente en pruebas formales i de; la memoria, incluso si se comparan con otros individuos de su misma edad.

También muestran dificultades leves en otras áreas del pensamiento; tales ; I como nombrar objetos o personas (recordar los nombres de las cosas) y i i tareas complejas de planificación. Estos problemas son similares, pero menos i I severos, que los hallazgos neuropsicológicos asociados con la enfermedad de Alzheimer. Un interrogatorio cuidadoso también ha revelado que, en algunos i casos, son evidentes las dificultades leves con actividades diarias, tales! como pasatiempos. j Varios estudios han demostrado que las quejas por la memoria en las personas mayores están asociadas con un riesgo más alto de lo norrhal de desarrollar demencia en el futuro. Por lo general, el tipo de demencia que los pacientes con MCI tienen más riesgo de desarrollar es la enfermedad de Alzheimer, aunque otros tipos de demencia, tales como la demencia vascular o demencia frontotemporal también pueden ocurrir. Sin embargo, también és i ; claró que algunos pacientes con estas quejas nunca llegan a desa'rroljar demencia.

Ciertas características se asocian con una mayor probabilidad de progresión. Estas incluyen la confirmación de las dificultades de la memoria por parte de un cercano con conocimiento (por ejemplo, un cónyuge, hijo o amigo cercano), malos resultados en pruebas de memoria objetiva y cualquier cambio en la capacidad de realizar tareas diarias, tales como pasatiempos o las finanzas, manejo de emergencias o en la higiene personal.

Un factor que tuvo que ser controlado en muchos de estos estudios fue la depresión, ya que muchos pacientes con depresión también se quejan de su memoria. Varios estudios han sugerido que ciertas mediciones de atrofia (contracción) o disminución del metabolismo en imágenes del cerebro (escaneos PET o MRI) aumentan las posibilidades de desarrollar demencia en el futuro.

A pesar de que estos factores anteriores aumentan las posibilidades de desarrollar demencia, actualmente no es posible predecir con certeza qué pacientes con MCI desarrollarán demencia o no. Por lo tanto, muchas de estas mediciones, en particular las mediciones a partir de imágenes del cerebro, aún se consideran útiles sólo para la investigación.

Un trastorno neurológico que es más conocido por su pérdida progresiva de la capacidad intelectual es la enfermedad de Alzheimer (AD). A nivel mundial, cerca de 20 millones de personas padecen la enfermedad de Alzheimer. La AD se caracteriza clínicamente por la pérdida inicial de la memoria, seguido por la desorientación, deterioro del juicio y el razonamiento, que comúnmente se conoce como deterioro cognitivo, demencia y, finalmente, demencia total. Los pacientes con AD finalmente caen en un estado muy debilitante e inmóvil entre los cuatro y doce años después de la aparición de la enfermedad.

La evidencia patológica clave de la AD es la presencia de placas amiloides extracelulares y nudos intracelulares de la proteína tau en el cerebro, que están asociadas con la degeneración neuronal (Ritchie y Lovestone (2002)). Se cree que las placas amiloides extracelulares son el resultado de un aumento en el péptido beta amiloide insoluble 1-42 producido por el metabolismo de la proteína precursora beta-amiloide (APP). Después de la secreción ß, ? estos péptidos beta amiloide 1-42 forman fibrillas amiloides más fácilmente que los péptidos beta amiloide 1-40, que se producen en su mayoría en personas sanas. Parece que el péptido beta amiloide está en la parte superior de la cascada neurotóxica: experimentos muestran que las fibrillas beta amiloide, cuando se inyectan en el cerebro de ratones transgénicos P301 L tau, mejoran la formación de ovillos neurofibrilares (Gótz et al. (2001 )). De hecho, una variedad de péptidos beta amiloides han sido identificados como péptidos beta amiloide 1-42, 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, que se npuede encontrar en las placas y se ven a menudo en el líquido cefalorraquídeo.

Los péptidos beta amiloides se generan (o procesan) desde la APP anclada a la membrana, después de la escisión por la beta secretasa y gamma secretasa en la posición 671 y 7 1 ó 713, respectivamente. Además, la elevada actividad de la beta secretasa resulta en un cambio de la escisión de la posición 1 a la posición 1 1. La escisión de la proteína precursora beta amiloide por la actividad de la alfa secretasa generará ?ß 1-17 y la actividad de gamma secretasa en 40 ó 42 genera el péptido p3 no patológico. Se identificó la beta secretasa como la aspartil proteasa BACE anclada a la membrana, mientras que la gamma secretasa es un complejo proteínico que comprende la presenilina 1 (PS1) o presenilina 2 (PS2), nicastrina, faringe anterior-defectuosa 1 (APH1 ) y aumentador de presenilina 2 (PEN-2). De estas proteínas, se cree ampliamente que las présenilinas constituyen la actividad catalítica de la gamma secretasa, mientras que los i otros componentes juegan un papel en la maduración y la localización del complejo. La identidad de la alfa secretasa es ilustre, aunque algunos resultados apuntan a las proteasas ADAM 10 y TACE, que podrían tener funciones redundantes. ' Una pequeña fracción de los casos de AD (sobre todo la AD de aparición temprana) es causada por mutaciones autosómicas dominantes en los genes que codifican la presenilina 1 y 2 (PS1 , PS2) y la prpteína precursora beta amiloide (APP) y se ha demostrado que las mutaciones en APP, PS1 y PS2 alteran el metabolismo de la proteína precursora beta amiloide que conduce a tales niveles aumentados de beta amiloide 1-42 producida en el cerebro. Aunque no se han identificado mutaciones en PS1 , PS2 y en la proteína precursora beta amiloide en pacientes con AD dé inicio tardío, las características patológicas son muy similares a las de pacientes con AD de aparición temprana. Estos mayores niveles del péptidó beta amiloide podrían originarse progresivamente con la edad a partir del procesamiento alterado de la proteína precursora beta amiloide (por ejemplo, niveles altos de colesterol potencian la producción del péptido beta amiloide) o a partir de un menor catabolismo del péptido beta amiloide. Por lo tanto, generalmente se acepta que la AD en pacientes con AD de inicio tardío también es causada por aumentos muy anormales en el nivel del péptido amiloide en el cerebro. El nivel de estos péptidos beta amiloides y más particularmente el péptido beta amiloide 1-42 es mayor en los pacientes de Alzheimer en comparación con los niveles de estos péptidos en personas sanas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los materiales y métodos para tratar a una persona o animal que tiene deterioro cognitivo en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de un mediador inflamatorio que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. En una modalidad, el mediador inflamatorio prevé un aumento en las respuestas cognitivas en el cerebro y/o ejerce un efecto protector neuronal. Los mediadores inflamatorios comprendidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan al, ligando de tirosina cinasa relacionada con fms tipo 3 (Flt3), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-3 (IL-3), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1 alfa), factor de crecimiento : ! i 1 similar a insulina 1 (IGF- 1), factor de necrosis tumoral (TNF), factor ¡ estimulante de colonia de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias i I de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de i ; macrófagos (M-CSF), factor de células madre (SCF), darbepoyetiha (ARANESP) y metaloproteinasas. En una modalidad el mediador inflamatorio es él GM-CSF, o un fragmento funcional o variante de la misma. Efi una I modalidad específica, el deterioro cognitivo es causado por o es resultado ele la enfermedad de Alzheimer. Además, también se contempla que los ¡ | compuestos capaces de inducir la producción de GM-CSF en un mamífero, que posteriormente ejerzan un aumento de las respuestas cognitivas i en i el . ¦ , ! I cerebro, pueden utilizarse según la presente invención. En una modalidad,! el i mediador inflamatorio se administra o suministra a una célula o tejido no neural del humano o animal. I La presente invención se refiere también a métodos ; para ; i i disminuir o inhibir la progresión del deterioro cognitivo en una persona- o ! i anirnal que tiene problemas de memoria asociados con funciones cognitivas o dem :encias relacionadas, que comprende administrar una cantidad efica i z d 1 e Í i un rnediador inflamatorio como se describe en este documento. ! | BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1 y 2 muestran fotos de un dispositivo típipo de i laberinto de brazos radiales y agua para los ensayos de comportamiento en enfermedades cognitivas en ratones. La figura 1 muestra el diagrarna del laberinto como se viera desde arriba el dispositivo. La figura 2 muestra el dispositivo en si que se utiliza para el ensayo de comportamiento de animales.

Las figuras 3 y 4 muestran los ensayos de interferencia de GMCSF - Bloque 1 (figura 3) y bloque 2 (figura 4). ! Las figuras 5A y 5B muestran niveles decrecientes de los niveles de beta amiloide insoluble en el hipocampo de los ratones. La figura 5C muestra un incremento en los niveles de los niveles de beta amiloide soluble en el hipocampo de ratones con mayores concentraciones en plasma de GM¬ CSF.

Figuras 6A y 6B: La figura 6A muestra la inyécción I intrahipocampal de GM-CSF (hemisferio izquierdo) y aCSF (hemisferio derecho). Tejido coronal representativo sometido a criosección a 14 pm y teñido con MabTech a-?ß/Alexa 546. La imagen es un montaje de cerca de 145 fotografías tomadas a 10X. Las manchas blancas indican inmunoetiquetado de placa amiloide (véase las Figuras 13A-13D 1; para secciones montadas representativas de los 4 ratones). La figura 6B muestra reducciones globales de placa observadas en los cuatro parámetros de placa medidos, calculados a partir de 5 secciones cuantificadas por ratón (n = 4 ratones). Las barras de error son ± SEM. La importancia estadística se obtuvo mediante la prueba t de Student apareada con los valores de P (Área: P <1.11 E-07; perímetro: P <1.4 E-06¡ diámetro de Feret: P <2.36E-09¡ densidad integrada: P < 1.1 1 E-07).

Las figuras 7A-7F muestran el análisis de comportamiento después de inyecciones subcutáneas diarias de GM-CSF. Las figuras 7A-7D muestran errores estándares en el laberinto de brazos radiales y agua. Muestra el deterioro sustancial en los ratones Tg de control (n = 8) en pruebas de la memoria funcional T4 y T5 en comparación con ratones de control NT (n = 8) en bloques individuales de ensayos (figuras 7A y 7B) y para los 4 días de ensayos (figuras 7C y 7D). Los ratones Tg tratados con GM-CSF (n = 7) se desempeñaron tan bien o mejor que los ratones de control NT en pruebas de la memoria funcional T4 y T5 durante los bloques individuales y los globales.

Los ratones NT tratados con GMCSF (n = 9) se desempeñaron de manera similar o ligeramente mejor que los controles NT (Nota: un desempeño significativamente mejor del grupo NT+GMCSF contra el grupo NT para T4 del bloque 1 , figura 7A), aunque este efecto no fue significativo de manera global. La importancia estadística determinada por ANOVA de una vía (** p <0.05 o mayor importancia comparado con los demás grupos; † P <0.05 o mayor importancia en comparación con Tg+GM-CSF y NT+GMCSF). La figura 7E muestra la interferencia cognitiva en funciones a nivel global (4 días) que muestra que los ratones de control Tg registran un deterioro en comparación con los ratones NT en las cuatro mediciones cognitivas evaluadas. Los ratones Tg tratados con GM-CSF mostraron una mejor memoria en 3 pruebas (A1 -A3) y memoria diferida (A5), en comparación con los controles Tg y se comportaron de manera similar a los ratones NT en las cuatro mediciones cognitivas. El tratamiento con GM-CSF a ratones NT no se tradujo jen un i desempeño significativamente mejor en comparación con los controles NT, aunque las tendencias de un efecto beneficioso por GM-CSF en los ratones NT fueron evidentes en general. La importancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía (* Tg es significativamente diferente de NT+GM- CSF, ** Tg es significativamente diferente de los demás grupos). La figura 7F muestra la función de interferencia cognitiva. Ensayo de interferencia proactiva (2 primeros días). Los ratones Tg tratados con GM-CSF se i desempeñaron significativamente mejor que los controles Tg y de' igual manera a los ratones NT y los ratones NT tratados con GM-CSF. La importancia estadística es determinada por ANOVA de una vía (**P < 0.05 o : i . ' importancia mayor comparado con los demás otros grupos). ' Las figuras 8A-8E muestran la deposición amiloide en ratones inyectados por vía subcutánea con GM-CSF. Las figuras 8A-8D son fotomicrografías de secciones de corona de 5 pm insertas en párafina inmünoetiquetadas con anticuerpo anti-?ß (clon 4G8). Las fotos son representativas de la carga de amiloide más cercana a la media de los grupos Tg tratados con GM-CSF o con solución salina. Barra de escala = 50 pm. La figura 8E muestra el porcentaje de la carga de amiloide del promedio de 5 secciones por ratón tratado con GM-CSF (n = 5) comparado con los tratados i con solución salina (n = 6). La importancia estadística se determinó mediante el ensayo t de Student homocedástica bilateral: la corteza entorrinal (* p <0.026) y el hipocampo (P = 0.12).

Las figuras 9A-9E muestran la ¡nmunotinción con sinaptofisina en ratones inyectados consubcutáneamente con GM-CSF. Las figuras 9A-9D son fotomicrografías de secciones de corona de 5 pm insertas en parafina inmunoetiquetadas con anticuerpo de antisinaptofisina. Las fotos son representativas del inmunoetiquetado con sinaptofisina más cercana a la media de los grupos tratados con GM-CSF o con solución salina. Barra de escala = 50 pm. La figura 9E muestra el porcentaje de inmunoreactividád a la sinaptofisina del promedio de 5 secciones por ratón tratado con GM-CSF (n = 5) comparado con los tratados con solución salina (n = 6). Aunque numéricamente pequeñas, las diferencias entre los dos grupos fueron estadísticamente significativas por el ensayo t de Student homocedástica bilateral: CA1 (P < 0.00 3), CA3(P < 0.0023).

La figura 10 muestra una variación significativa de la carga de placa amiloíde entre los ratones. Los ratones PS/APP de edad similar (numerados en secuencia de acuerdo a la fecha de nacimiento) después de infusiones bilaterales intracerebroventriculares de M-CSF. Los ratones número 148, 160, 171 y 21 1 recibieron M-CSF y los ratones 164, 170, 176, y 177 recibieron aCSF. Las infusiones duraron 2 semanas. Crioseccionados a 14 pm y se tíñeron con 6E10/Alexa 488 y HoechsL Las manchas verdes brillantes indican las placas amiloides. Las imágenes tomadas en 5X.

Las figuras 11A-11C muestra la inyección intrahipocámpica de M-CSF (hemisferio izquierdo) y aCSF (hemisferio derecho). En la Figura 1 A, la imagen es un montaje de - 145 fotos a 10X y es representativa de los efectos observados en el hipocampo anterior a posterior en los 4 ratones inyectados con M-CSF. Los hemisferios inyectados con M-CSF no muestran ninguna diferencia de la deposición amiloide entre los hemisferios. Figura 11B: Esta foto muestra el aumento del hemisferio izquierdo inyectado con M-CSF, como se ve Idespués de la perfusión con solución salina. Nóte la pequeña protuberancia en el sitio de la inyección. La figura 11C es una imagen que muestra el quiste o crecimiento similar a tumor formado i en ' el trayecto de la aguja en el sitio de la inyección con M-CSF. Crioseccionado a 14 pm y teñido con 6E10/Alexa 488 y Hoechst. La tinción verde brillante no es específica y no indica la placa amiloide. Las imágenes se tomaron a 20X.

Las figuras 12A y 12B muestra la inyección en el intrahipocampo de G-CSF (hemisferio izquierdo) y aCSF (hemisferio derecho). Las placas amiloides se indican como manchas blancas. Aunque el cerebro se seccionó en un ángulo pequeño, la observación visual de las placas amiloides muestra una reducción general en todo el hemisferio izquierdo inyectado con G-CSF. Crioseccionado a 14 µ?? y teñido con 6E107IR800. Escaneado en el generador de imágenes Odyssey de LI-COR y ampliada para visualización. Secciones numeradas del 1 al 6 y corresponden con anterior a posterior. ' Las figuras 13A-13D muestran la inyección intrahipocampal de GM-CSF (hemisferio izquierdo) y aCSF (hemisferio derecho). Secciones representativas de cada ratón próximas al lugar de la inyección. Las secciones de tejidos se tiñieron con MabTech a-?ß/Alexa 488. Las manchas blancas indican inmunoetiquetado de placa amiloide. Las imágenes son montajes de cerca de 145 fotografías tomadas a 10X. Las figuras 13Á-13C somde secciones congeladas de 14 pm y la figura 13D es de una sección inserta en parafina de 5 pm.

Las figuras 14A-14F muestran la cuantificación de¡ una deposición amiloide reducida en los hemisferios izquierdos inyectados con GM-!CSF comparados con hemisferios derechos contralaterales inyectados con aCSF. Se cuantificaron 5 secciones por ratón. Cada sección mointada contiene más de 140 imágenes a 10X y de éstas se seleccionaron 15 a 25 imágenes por hemisferio para cuantificar. Todas la^ imágenes por sección fueron tomadas en la misma exposición en un microscopio de fluorescencia : 1 1 Zeiss Imager.ZI con una cámara Zeiss Axiocam Mrm (Oberkochen, Alemania) con , software Axiovision 4.7. Cada figura muestra los valores totales o promedio de las 5 secciones/ratón con importancia individual y generajl. Las ; i i barras de error son ± SEM: (Figuras 14A-14B) áreas de placa (Figuras' 14C- 14D) valores de perímetro (Figura 14E) diámetros promedio feret (Figura 14F) densidades promedio integradas.

I ! DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para tratar a una persona o animal que tiene deterioro cognitivo en donde el método comprende administrar a la persona o animal una cantidad efectiva de uno o varios mediadores inflamatorios que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, o un polinucleótido que codifica el mediador inflamatorio (si el mediador inflamatorio es un polipéptido), o una composición que comprende el mediador inflamatorio o polinucleótido. El deterioro cognitivo puede ser un deterioro cognitivo progresivo. En una modalidad específica, el deterioro cognitivo es causado por o es resultado de la enfermedad de Alzheimer. En una modalidad, el deterioro cognitivo es causado por o resulta de un accidente cerebrovascular, síndrome de Down, demencia pugilística, lesión cerebral traumática, demencia asociada al SIDA, enfermedad con I cuerpos de Lewy o enfermedad de Pick. En una modalidad, el mediador I inflamatorio prevé un aumento en las respuestas cognitivas en el cerebro y/o ejerce un efecto protector neuronal. En una modalidad, el mediador I inflamatorio, o polinucleótido que codifica el mediador inflamatorio, es de origen o de una secuencia de humano.

Los mediadores inflamatorios comprendidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan al, ligando de tirosina cinasa relacionada con fms tipo 3 (Flt3), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-3 | i I (IL-3), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1 alfa), factor de crecimiento 1 similar a insulina 1 (IGF- 1 ), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonia de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de macrófagos ( -CSF), factor de células madre (SCF), darbepoyetina (ARANESP) y metaloproteinasaso un fragmento funcional o variante de los mismos que muestren sustancialmente la misma actividad biológica que el mediador inflamatorio de longitud completa o no variante. Por lo general, para tratar el deterioro cognitivo en un humano, el mediador inflamatorio tendrá la secuencia de la proteína humana o polinucleótido que la codifica. Las secuencias de humano de los mediadores inflamatorios descritos en este documento son conocidas en la materia (véase, por ejemplo, No. de acceso GenBank NM_013520.3, NM_000799.2, NM_000759.2, M11220.1 , NM_181054.2, NG_011713.1 , NG_008851. 1 , NM_000588.3, NG_011640.1 , NM_000757.4, NG_012099.1 , NM_004530.4, NG_01 1468.1 , NG_007462.1 y NG_008732.1 ). En una modalidad el mediador inflamatorio es GM-CSF, o un fragmento funcional o variante del mismo que demuestre actividad biológica de GM-CSF. En una modalidad específica, el GM-CSF de GM-CSF de humanos. En una modalidad, el GM-CSF y la darbepoyetina y/o EPO se administran en un método de la invención para el tratamiento del deterioro cognitivo. En otra modalidad se administran G-CSF y darbepoyetina y/o EPO. Además, también se contempla que los compuestos capaces de inducir la producción en un mamífero de un mediador inflamatorio de la invención, como GM-CSF, que posteriormente ejerzan un aumento de las respuestas cognitivas en el cerebro, pueden utilizarse según la presente invención. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, EPO y HIF-1a (Fisher (2003)). En una modalidad, el mediador inflamatorio se administra o suministra a un tejido no neural del humano o animal.

En una modalidad, un mediador inflamatorio de la invención, o un polinucleótido que codifica el mediador inflamatorio, o una composición que contiene el mediador inflamatorio o polinucleótido, se suministra con una dosis efectiva por vía subcutánea o por infusión, intracranealmente, por vía oral, parenteral, por vía intranasal, por inhalación, por vía intratecal, intramuscular, sublingual, o por cualquier otro método conocido y aceptable de suministro de fármaco a una persona o animal que necesite dicha terapia.

La invención en cuestión se refiere también a métodos para disminuir o inhibir la progresión del deterioro cognitivo en una persona o animal que tiene problemas de memoria asociados con funciones cognitivas o demencias relacionadas. En una modalidad, un método de la invención comprende administrar una cantidad eficaz de un mediador inflamatorio de la invención, o un polinucleótido que codifica el mediador inflamatorio, o una composición que contiene el mediador inflamatorio o polinucleótido, a la persona o animal.

La aplicación in vivo de los mediadores inflamatorios de la invención, polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios y/o composiciones que los contienen, se puede realizar por cualquier método y técnica adecuada actual o prospectiva que conozcan los expertos 'en la técnica. Los compuestos en cuestión pueden formularse en una forma fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable y administrarse por cualquier vía adecuada conocida en la técnica, incluyendo, por ejemplo, rutas de administración oral, nasal, rectal y parenteral. Tal como se utiliza aquí, el término parenteral incluye administración subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e intraesternal, como por inyección.

La administración de los mediadores inflamatorios en cuestión de la invención puede ser una sola administración, o en intervalos continuos o distintos ¡como puede determinarlo fácilmente un experto en la técnica. ; Los mediadores inflamatorios de la presente invención, poliriucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios, y composiciones que los comprenden, también se puede administrar utilizando la tecnología de liposomas, cápsulas de liberación lenta, bombas implantables y contenedores biodiegradables. Estos métodos de suministro pueden, convenientemente, proporcionar una dosificación uniforme durante un período prolongado. Los mediadores inflamatorios de la invención también pueden administrarse en sus formas derivadas de sal o formas cristalinas.

Los mediadores inflamatorios de la invención en cuestión y poliriucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios pueden formularse de acuerdo a los métodos conocidos para preparar composiciones fisiológicamente aceptables o farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones se describen en detalle en una serie de fuentes que son bien conocidas y fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science por E.W. Martin describe formulaciones que pueden utilizarse en relación con la invención. En general, las composiciones de la invención en cuestión se formularán de manera que una cantidad efectiva del compuesto se combina con un portador adecuado con el fin de facilitar la administración eficaz de la composición. ; Las composiciones utilizadas en los métodos actuales también pueden estar en una i variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólida, semi-sólida y líquida tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones líquidas o suspensión, supositorios, soluciones inyectables e infusionables y i atomizadores. La forma preferida depende del modo de administración ' : i i pretendido y la aplicación terapéutica. Las composiciones también incluyen preferiblemente portadores y diluyentes convencionales fisiológicainehte aceptables que son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de portadores o diluyentes para su uso con los compuestos en cuestión incluyen etanol, dimetilsulfóxido, glicerol, alúmina, almidón, solución " salina y los portadores y diluyentes equivalentes. Para contemplar la administración de tales dosificaciones para el tratamiento terapéutico deseado, las composiciones de la invención pueden comprender entre 0.1% y 99%, y n especial 1 y 15% en peso del total de uno o más de los mediadores inflamatorios en cuestión con base en el peso de la composición total, incluido el portador o diluyente.

Los mediadores inflamatorios de la invención, polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios y composiciones qué (os comprenden se pueden suministrar una célula ya sea por contacto directo con ésta o por medios portadores. Medios portadores para suministrar mediadores inflamatorios y composiciones a las células son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, encapsular la composición en una porción de liposomas. Otro medio para el suministro de mediadores inflamatorios y de las composiciones de la invención a una céluja comprende unir los mediadores inflamatorios a una proteína o ácido nucleico que esté enfocada para el suministro a la célula objetivo. La patente de EE.UU. No. 6,960,648 y las solicitudes de patente publicadas de los Estados Unidos No. 20030032594 y 20020120100 divulgan las secuencias de aminoácidos que se pueden acoplar a otra composición y que permiten a la composición moverse a través de membranas biológicas. La solicitud de patente publicada de los EE.UU. No. 20020035243 también describe composiciones para el transporte ele porciones biológicas por las membranas celulares para el suministro intracelular. Los mediadores inflamatorios también pueden incorporarse en polímeros, que incluyen ejemplos de poli (DL láctido-co-glicólido) polímero para suministro intracraneal; poli [bis (p-carboxifenoxi) propano: ácido sebácico] en una relación molar 20:80 (tal como se utiliza en GLIADEL®), condroitina, quitina y quitosano. ; Aunque los mediadores inflamatorios de la invención y polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios se pueden administrar solos, estos mediadores inflamatorios también pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica. La presente invención proporciona además composiciones que comprenden uno o más mediadores inflamatorios en asociación con al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede adaptarse para las distintas rutas de administración, tales como enteral, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, subcutánea, etc. La administración puede ser continua o en intervalos distintos, como puede determinarlo un experto en la técnica. ' Otras formulaciones de mediadores inflamatorios y polinucleótidos que los codifican adecuadas para administración incluyen, por ejemplo, soluciones para inyección estériles acuosas que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del destinatario; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y frascos sellados y pueden ser almacenadas en una condición liofilizada que requiere únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvo estéril, gránulos, tabletas, etc. Debe entenderse que, además de los ingredientes antes mencionados en particular, las composiciones de la invención en cuestión pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica respecto al tipo de formulación que se trate.

Mediadores inflamatorios de la invención, polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios y composiciones de los mismos pueden administrarse de forma local en uno o más sitios anatómicos, opcionalmente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte. Los mediadores inflamatorios de la invención y las composiciones de los mismos pueden administrarse por vía sistémica, como por , vía intravenosa o por vía oral, opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como un diluyente inerte, o un portador comestible asimilable para suministro oral. Pueden almacenarse en cápsulas de gelatina dura o blanda, pueden comprimirse en tabletas o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, los mediadores inflamatorios pueden combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, atomizadores de aerosol y similares.

Las tabletas, pastillas, pildoras, cápsulas y similares también puede contener lo siguiente: aglutinantes tales como tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes como el fosfato dicálcico, un agente de desintegración como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante como el estearato de magnesio y un agente edulcorante como la sacarosa, fructosa, lactosa o aspartame, o un agente saborizante como la menta, aceite de menta fresca o aroma de cerezas.

Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, como aceite vegetal o un polietilenglicol. Varios otros materiales pueden estar presentes como revestimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas se pueden revestir con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante y metil y propilparabenos como conservadores, un colorante y saborizante, como sabor cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

Los mediadores inflamatorios y polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios y composiciones de la invención, incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables o análogos de las mismas, se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o por infusión o inyección. Las soluciones del agente activo o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezclarse con un agente tensoactivo no tóxico. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas de dosificación farmacéutica adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que contienen el ingrediente activo que se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables estériles o infusionables, opcionalmente encapsuladas en liposomas. La forma de dosificación final debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilol no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o mediante el uso de tensoactivos. Opcionalmente, la prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antímicóticos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, reguladores de pH o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse al incluir en agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el mediador inflamatorio de la invención en la cantidad requerida en el solvente apropiado con diversos otros ingredientes enumerados arriba, como se requiera, seguido de esterilización con filtrado. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y de liofiíización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional que se desee en las soluciones filtradas previamente esterilizadas.

Para la administración tópica, mediadores inflamatorios de la codificación de la invención y los polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios pueden aplicarse como líquido o sólido. Sin embargo, en general, será deseable administrarlos por vía tópica en la piel ; como composiciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un liquido. Los mediadores inflamatorios se pueden aplicar en una formulación como un ungüento, crema, loción, solución, tintura o similares. También se pueden utilizar sistemas de suministro de fármaco para el suministro de las sustancias farmacológicas a los sitios dérmicos, como el descrito en la patente de EE.UU. No. 5,167,649, Portadores sólidos útiles sólidos incluyen sólidos finamente divididos, como el talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina, etc. Portadores líquidos útiles incluyen el agua, alcoholes o glicoles o mezclas de agua-alcohol/glicol, en los que los compuestos pueden ser disueltos o dispersos a niveles eficaces, de forma opcional con la ayuda de tensoactivos no tóxicos. Se pueden agregar adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar las propiedades para un uso determinado. Las composiciones líquidas resultantes se pueden aplicar a partir de almohadillas absorbentes, que se utilizan para impregnar vendajes y apositos, o rociarse sobre la zona afectada mediante atomizadores tipo bomba o de aerosol, por ejemplo.

Espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados también se pueden emplear con portadores líquidos para formar las pastas para untar, geles, ungüentos, jabones y similares, para su aplicación directamente en la piel del usuario. Ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden utilizarse para suministrar un mediador inflamatorio a la piel se describen en la patente de EE.UU. No. 4,608,392, patente de EE.UU. No. 4,992,478, patente de EE.UU. No. 4,559,157 y la patente de EE.UU. No. 4,820,508.

Dosificaciones útiles de los mediadores inflamatorios, polihucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios y composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden determinar al comparar su actividad in vitro y la actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosificaciones efectivas en ratones y otros animales a los seres humanos se conocen en la técnica, por ejemplo, ver la patente de EE.UU. No. 4,938,949.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden un mediador inflamatorio de la invención, o un i polinucleótido que codifica el mediador inflamatorio, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral, tópica o parenteral, que comprenden una cantidad de un compuesto, constituyen una modalidad preferida de la invención. La dosis administrada a un paciente, especialmente un humano, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para lograr una respuesta terapéutica en el paciente durante un período razonable, sin toxicidad letal y preferiblemente sin causar más de un nivel aceptable de efectos secundarios o morbilidad. Un experto en la técnica reconocerá que la dosificación dependerá de una variedad de factores que incluyen la condición (salud) del sujeto, el peso corporal del sujeto, tipo de tratamiento simultáneo, en su caso, la frecuencia del tratamiento, la relación terapéutica, además de la gravedad y el etapa de la condición patológica.

Para contemplar la administración de tales dosificaciones para el tratamiento terapéutico deseado, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender entre 0.1% y 45% y en especial 1 y 5% en peso del total de uno o más de los compuestos con base en el peso de la composición total, incluido el portador o diluyentes. De manera ilustrativa, los niveles de dosificación de los ingredientes activos administrados pueden ser: por vía intravenosa, de 0.01 a alrededor de 20 mg/kg, intraperitoneal, de 0.01 a alrededor de 100 mg/kg; por vía subcutánea, de 0.01 a alrededor de 100 mg/kg; por vía intramuscular, de 0.01 a alrededor de 100 mg/kg; por vía oral de 0.01 a alrededor de 200 mg/kg y preferiblemente de 1 a 100 mg/kg; instilación intranasal, de 0.01 a alrededor de 20 mg/kg; y aerosoles, de 0.01 a alrededor de 20 mg/kg de peso (corporal) del animal.

La invención en cuestión se refiere también a construcciones de expresión de polinucleótidos que comprenden un polinucleótido de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un mediador inflamatorio de la presente invención. En una modalidad, el polinucleótido codifica GM-CSF de humano, o un fragmento o variante de la misma que presenta sustancialmente la misma actividad que el GM-CSF de longitud completa o sin variante.

Tal como se utiliza aquí, el término "construcción de expresión" se refiere a una combinación de secuencias de ácido nucleico que proporcionan la transcripción de una secuencia de ácido nucleico unido vinculada de forma operativa. Tal como se utiliza aquí, el término "vinculado operativamente" se refiere a una yuxtaposición de los componentes descritos en donde los componentes están en una relación que les permite funcionar en su forma propuesta. En general, los componentes vinculados operativamente están en relación contigua.

Construcciones de expresión de la invención también incluirán generalmente elementos reguladores que son funcionales en la célula hospedera en la que se pretende construir la construcción de expresión. Así, una persona experta en la técnica puede seleccionar elementos regulatorios para uso en, por ejemplo, células hospederas bacterianas, células hospederas de levadura, células hospederas vegetales, células hospederas de insecto, células hospederas de mamífero y células hospederas de humano. Elementos de regulación incluyen promotores, secuencias terminadoras de transcripción, secuencias terminadoras de traducción, potenciadores y elementos de poliadenilación.

Una construcción de expresión de la invención puede comprender una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de polinucleótido que codifica un mediador inflamatorio de la invención. Los promotores se pueden incorporar a un polinucleótido usando técnicas estándares conocidas en la técnica. Varias copias de los promotores o múltiples promotores pueden utilizarse en una construcción de expresión de la invención. En una modalidad preferida, un promotor puede colocarse alrededor de la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción que desde el sitio de inicio de la transcripción en su entorno genético natural. Se permite alguna variación en esta distancia sin una disminución sustancial de la actividad del promotor. Un sitio de inicio de transcripción se suele incluir en la construcción de expresión.

Para la expresión en células animales, la construcción de expresión de la invención puede comprender promotores adecuados que pueden impulsar la transcripción de la secuencia de polinucleótidos. Si las células son células de mamífero, entonces los promotores como, por ejemplo, el promotor de actina, promotor de metalotioneína, el promotor NF-kappaB, el promotor EGR, el promotor de SRE, el promotor IL-2, el promotor NFAT, el promotor de osteocalcina, el promotor temprano de SV40 y el promotor tardío de SV40, el promotor de Lck, el promotor BMP5, el promotor TRP-1 , el promotor repetidor terminal largo del virus de tumor mamario murino, el promotor de STAT o un promotor de inmunoglobulina pueden utilizarse en la construcción de expresión. El promotor de polihedrina del baculovirus se puede utilizar con una construcción de expresión de la invención para su expresión en células de insecto. Promotores adecuados para su uso con una construcción de expresión de la invención en células de levadura incluyen, sin restricción, el promotor de 3-fosfoglicerato cinasa, el promotor gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, el promotor de metalotioneína, el promotor de alcohol deshidrogenasa-2 y el promotor de la hexocinasa.

Para la expresión en sistemas procarióticos, una construcción de expresión de la invención puede comprender promotores como, por ejemplo, el promotor de fosfatasa alcalina, el promotor de triptófano (trp), el promotor lambda PL, el promotor de ß-lactamasa, el promotor de lactosa, el promotor phoA, el promotor T3, el promotor T7 o el promotor tac (de Boer et al., 1983).

Si la construcción de expresión se incluirá en una célula vegetal, se pueden utilizar promotores virales de la planta, tales como, por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S (incluido el promotor mejorado de CaMV 35S (véase, por ejemplo la patente de EE.UU. No. 5,106,739)) o el promotor 19S. Los promotores vegetales como promotor de E. prolifera, el promotor Ap3, los promotores de choque térmico, el promotor T-ADN 1' ó 2' de A. tumafaciens, el promotor de poligalacturonasa, el promotor de chalcona sintasa (CHS-A) de la petunia, el promotor PR-1a del tabaco, el promotor de ubiquitina, el promotor de la actina, el promotor del gen alcA, el promotor pin2 (Xu et al., 1993), el promotor Wipl del maíz, el promotor del gen trpA del maíz (Patente de EE.UU. No. 5,625,136), el promotor del gen CDPK del maíz y el promotor RUBISCO SSU (Patente de EE.UU. No. 5,034,322) también pueden ser utilizados. Promotores específicos de semillas, como el promotor de un gen de ß-faseolina (de frijol rojo) o un gen de glicina (de soya) y otros también se pueden utilizar. Los promotores constituyentes (como el promotor CaMV, de ubiquitina, actina, o NEP), promotores específicos del tejido (como el promotor E8 del tomate), promotores de desarrollo regulado y los promotores ¡nducibles (como los promotores que pueden ser inducidos por calor, 'por la luz, por las hormonas o por sustancias químicas) se contemplan para su uso I con los polinucleótidos de la invención.

Construcciones de expresión de la invención pueden contener opcionalmente una secuencia terminadora de transcripción, secuencia terminadora de traducción, secuencia de péptido de señal y/o elementos potenciadores. Las regiones terminadoras de transcripción normalmente se pueden obtener de la región no traducida 3 'de¡ una secuencia de gen eucariótica o viral. Las secuencias terminadoras de transcripción se pueden colocar en dirección 3' de una secuencia de codificación para proporcionar una terminación eficiente. Los péptidos de señal son un grupo de secuencias amino terminales cortas que codifican la información responsable de la reubicación de un péptido vinculado operativamente a una amplia gama de destinos celulares posteriores a la traducción, que van desde un compartimiento específico de organelos a los sitios de acción de la proteina y el medio extracelular. Dirigir un polipéptido a un destino celular y/o extracelular pretendido mediante el uso de la secuencia de péptido de señal vinculada operativamente se contempla para uso con los mediadores inflamatorios de la invención. Los mejoradores químicos son elementos de actuación cis que aumentan la transcripción de genes y también se pueden incluir en la construcción de expresión. Los elementos mejoradores químicos se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan al, elemento mejorador de CaMV 35S, el elemento mejorador del promotor temprano de citomegalovirus (CMV) y el elemento mejorador de SV40. Las secuencias de ADN que dirigen la poliadenilación del ARNm codificado por el gen estructural también pueden incluirse en la construcción de expresión.

Los sitios únicos de la enzima de restricción puede incluirse en los extremos 5 'y 3' de la construcción de expresión para permitir la inserción en Un vector de polinucleótido. Tal como se utiliza aquí, el término "vector"' se refiere a cualquier elemento genético, incluyendo, por ejemplo, plásnnidos, cósmidos, cromosomas, fagos, virus y similares, que sea capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de polinucleótidos entre células. Los vectores contienen una secuencia de nucleótidos que permite al vector replicarse en una célula hospedera seleccionada. Un número de vectores están disponibles para la expresión y/o clonación, e incluyen, pero no se limitan a vectores pBR322, la serie pUC, la serie M13 y pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA).

Los polinucleótidos, vectores y construcciones de expresión de la invención en cuestión se pueden introducir en una celda por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen transfección, microinyección, eleetroporación, lipofección, fusión celular, precipitación con fosfato de calcio y por métodos de biobalística. En una modalidad, un polinucleótido o construcción de expresión de la invención puede introducirse in vivo a través de un vector viral, como el virus adeno-asociado (AAV), el virus de herpes simple (VHS), virus del papiloma, adenovirus y el virus de Epstein-Barr (VEB). Las formas atenuadas o defectuosas de vectores virales que pueden utilizarse con la presente invención se conocen en la técnica. Normalmente, el virus defectuoso no es capaz de infección después de que el virus se introduce en una célula. Los polinucleótidos, vectores y construcciones de expresión de la invención también pueden introducirse in vivo a través de lipofección (transfección de ADN a través de liposomas preparados a partir de lípidos catiónicos sintéticos) (Felgner et al., 1987). Se pueden usar lípidos catiónicos sintéticos (Lipofectin, Invitrogen Corp., La Jolla, CA) para preparar liposomas para encapsular un polinucleótido, vector, o construcción de expresión de la invención. Un polinucleótido, vector, o construcción de expresión de la invención también pueden introducirse in vivo como ADN desnudo usando métodos conocidos en la técnica, como la transfección, microinyección, eleetroporación, precipitación con fosfato de calcio y por métodos de biobalística.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención en cuestión también se pueden definir en términos una identidad más particular y/o escalas de similitud con los que se ejemplifican aquí. La identidad de la secuencia generalmente será superior a 60%, preferiblemente superior a 75%, preferiblemente superior a 80%, más preferiblemente superior a 90% y puede ser mayor a 95%. La identidad y/o similitud de una secuencia puede ser 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66 67„ 68 , 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% en comparación con una secuencia ejemplificada en este documento. A menos que se especifique lo contrario, tal como se utiliza en este documento el porcentaje de identidad de secuencia y/o similitud de dos secuencias se puede determinar mediante el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), modificado como en Karlin y Altschul (1993). Este algoritmo se ha incorporado a los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990). Las búsquedas dé BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias con el porcentaje de identidad de secuencia deseado. Para obtener alineaciones abiertas para efectos comparativos, se puede utilizar el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997). Cuando se utiliza los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (NBLAST y XBLAST). Ver la página web de NCBI/NIH.

La invención en cuestión también contempla las moléculas de polihucleótidos (que codifican un mediador inflamatorio de la invención) que tienen secuencias que son lo suficientemente homologas con las secuencias de polinucleótido que codifican un mediador inflamatorio de la invención a fin de permitir la hibridación con aquella secuencia bajo condiciones rigurosas y métodos estándares (Maniatis, T. et al., 1982). Como se usa aquí, condiciones "rigurosas" para la hibridación se refiere a las condiciones en las que hibridación se suele realizar durante la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en SSPE 6x, solución de Denhardt 5x, SDS 0.1%, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula (Beltz, G.A. et al, 1983): Tm=81.5 C+16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(% formamida)- 600/longitud del duplo en pares de bases.

Los lavados suelen llevarse a cabo de la siguiente manera (1) dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1x SSPE, 0.1 % SDS (lavado de rigor bajo). (2) Una vez a Tm-20 C durante 15 minutos en 0.2x SSPE, 0.1% SDS (lavado de rigor moderado).

Tal como se utiliza en este documento, los términos "ácido nucleico" y "secuencia de polinucleótido" se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido ya sea de cadena simple o doble y, salvo se limite en otro sentido, abarcaría los análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de forma similar manera que los nucleótidos que se presentan en la naturaleza. Las secuencias de polinucleótido incluyen tanto la secuencia de cadena de ADN que se transcribe a ARN y la secuencia de ARN que se traduce en proteínas. Las secuencias de polinucleótido incluyen secuencias de longitud completa, así como secuencias más cortas derivadas de las secuencias de longitud completa. Se entiende que una secuencia de polinucleótido particular incluye los codones degenerados de la secuencia nativa o secuencias que pueden introducirse proveer la preferencia del codón en una célula hospederas específica. Las secuencias de polinucleótido que entran en el ámbito de la invención en cuestión incluyen además las secuencias que híbridan específicamente con las secuencias que codifican un mediador inflamatorio de la invención. El polinucleótido incluye tanto las cadenas de sentido como antisentido, ya sea como cadenas individuales o en el duplo.

La invención en cuestión se refiere también a kits que comprenden un mediador inflamatorio y/o polinucleótidos que codifican los mediadores inflamatorios, o una composición que comprende un mediador inflamatorio, o un compuesto o agente que induce la producción de los mediadores inflamatorios de la invención en uno o más contenedores. Los kits de la invención pueden incluir opcionalmente portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Un kit de la invención pueden comprender uno o más del, ligando de tirosina cinasa relacionada con fms tipo 3 (Flt3), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la interleucina-1 (IL- ), la interleucina-3 (IL-3), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1 alfa), factor de crecimiento 1 similar a insulina 1 (IGF- 1 ), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonia de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) y metaloproteinasas. En una modalidad, un kit de la invención incluye uno o más de otros componentes, complementos o adyuvantes como se describe en este documento. En una modalidad, un kit de la invención incluye instrucciones o materiales de empaque que describen cómo administrar un mediador inflamatorio o la composición del kit. Los contenedores del kit pueden ser de cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio, plástico, metal, etc. y de cualquier tamaño adecuado, forma o configuración. En una modalidad, un mediador inflamatorio de la invención se proporciona en el kit como un sólido, como una tableta, una pildora, o en polvo. En otra modalidad, un mediador inflamatorio de la invención se proporciona en el kit como un líquido o solución. En una modalidad, el kit comprende una ampolla o jeringa que contiene un compuesto y/o agente de la invención en forma líquida o en solución.

La presente invención se refiere también a métodos para identificar un compuesto que estimula las actividades de GM-CSF y sus actividades biológicas en la reducción del deterioro cognitivo.

La invención en cuestión se refiere también a métodos para identificar un compuesto que inhibe competitivamente las actividades de GM-CSF y sus actividades biológicas en la reducción del deterioro cognitivo.

Especies de mamíferos que se benefician de los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, los primates, como monos, chimpancés, orangutanes, seres humanos, monos; animales domésticos (por ejemplo, mascotas) como perros, gatos, conejillos de indias, hámsters, cerdos vietnamitas, conejos y hurones; animales domésticos de granja como vacas, búfalos, bisontes, caballos, burros, cerdos, ovejas y cabras; animales exóticos que suelen encontrarse en los zoológicos, como osos, leones, tigres, panteras, elefantes, hipopótamos, rinocerontes, jirafas, antílopes, perezosos, gacelas, cebras, ñus, perros de la pradera, koalas, canguros, zarigüeyas, mapaches, osos panda, hienas, focas, leones marinos, elefantes marinos, nutrias, marsopas, delfines y ballenas. Otras especies que pueden beneficiarse de los métodos descritos incluyen peces, anfibios, aves y reptiles. Tal como se utiliza en este documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente y tienen por objeto incluir tales especies humana y no humanas. Del mismo modo, los métodos in vitro de la presente invención pueden llevarse a cabo en las células de tales especies humana y no humanas.

Los siguientes términos se destinan a los significados presentados a continuación y con ello son útiles para comprender la descripción de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

El término "células neuronales" significa cualquier célula de origen neurológico (por ejemplo, el cerebro, la médula espinal), incluyendo las I células sensoriales, de transmisión y motrices del sistema nervioso central o el sistema nervioso periférico, como una neurona, células gliales, astrocitos, etc.

El término "péptido beta amiloide" significa péptidos beta amiloides procesados a partir de la proteína precursora beta amiloide (APP). Los péptidos más comunes incluyen péptidos beta amiloide 1-40, 1-42, 11-40 y 11-42. Otras especies menos frecuentes péptidos beta amiloides son descritos como y-42, en el cual y está en la escala de 2-17 y 1-x, en donde x varía desde 24 hasta 39 y 41.

El término "portador" significa un material no tóxico que se utiliza en la formulación de composiciones farmacéuticas para proporcionar un medio, forma a granel y/o utilizable a una composición farmacéutica. El portador puede comprender uno o más de dichos materiales, tales como un excipiente, estabilizador o una solución de pH regulado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen ingredientes reguladores de pH acuosos o sólidos, incluyendo fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antipxidantes como el ácido ascórbico; polipéptido de peso molecular bajo (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, como albúmina de suero, la gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona, aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o tisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos como la glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA, alcoholes de azúcar como el manitol o sorbitol, contraiones formadores de sales como el sodio y/o tensoactivos no iónicos como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS, El término "contacto" o "en contacto" significa acercar al menos dos porciones juntas, ya sea en un sistema in vitro o en un sistema in vivo.

El término "condición" o "enfermedad" significa la presentación manifiesta de los síntomas (es decir, enfermedades) o la manifestación de indicadores clínicos anormales (por ejemplo, indicadores bioquímicos) o un riesgo genético o ambiental o de propensión a desarrollar tales síntomas o indicadores clínicos anormales.

El término "endógena" significará un material que un animal produce de forma natural. Endógena en referencia a, por ejemplo y sin restricción, el término "cinasa" significará aquel que produce naturalmente un animal, como un mamífero (por ejemplo y sin restricción limitación, un ser humano) o un virus. En contraste, el término no endógeno en este contexto significará aquel que no produce naturalmente un animal, como un mamífero (por ejemplo y sin restricción limitación, un ser humano) o un virus. Ambos términos se pueden utilizar para describir sistemas tanto "in vivo" como e "¡n vitro". Por ejemplo y sin restricción, en un criterio de selección, la cinasa endógena o no endógena puede ser en referencia a un sistema de detección in vitro. Como otro ejemplo y sin restricción, cuando el genoma de un mamífero se ha manipulado para incluir una cinasa activada constitutivamente no endógena, la selección de un compuesto candidato a través de un sistema in vivo es viable.

El término "inhibir" o "inhibición" o "suprimir" o "supresión" o "supresivo", en relación con el término "respuesta" significa que una respuesta se reduce o se impide en presencia de un compuesto en lugar de la ausencia del compuesto.

El término "ligando", una molécula endógena, de origen natural específica para un receptor endógeno de origen natural.

El término "profármacos farmacéuticamente aceptables" como se usa aquí, significa los profármacos de los compuestos útiles en la presente invención, que son, en el marco de un criterio médico sustentado, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin una toxicidad , indebida, irritación, una respuesta alérgica acorde a una relación razonable entre beneficio/riesgo y eficaz para el uso previsto de los compuestos de la invención. El término "profármaco" significa un compuesto que se transforma in viyo para dar un compuesto eficaz, útil en la presente invención, o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. La transformación puede ocurrir por diversos mecanismos, tales como a través de la hidrólisis en la sangre. Los compuestos que portan grupos escindibles metabólicamente tienen la ventaja de que pueden presentar una mejor biodisponibilidad como resultado de una mejor solubilidad y/o velocidad de absorción que le confiere el compuesto de origen en virtud de la presencia del grupo escindióle metabólicamente, por lo tanto, estos compuestos actúan como profármacos. Una discusión detallada se proporciona en Bundgaard (1985), Widder et al. (1985), Krogsgaard-Larsen y Bandaged (1991), Bundgard (1992), Nielsénw y Bundgaard (1988), Nakeya et al. (1984), Higuchi y Stella (1987), que se incorporan a la presente por referencia. Un ejemplo de los profármacos es un profármaco de éster. "Profármaco de éster" significa un compuesto que se puede convertir ¡n vivo por medios metabólicos (por ejemplo hidrólisis) a un compuesto inhibidor de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un profármaco de éster de un compuesto que contiene un grupo carboxi puede convertirse por hidrólisis in vivo al grupo carboxi correspondiente.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales acidas de adición no tóxicas, inorgánicas y orgánicas y a las sales básicas de adición de compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos útiles en la presente invención.

El término "excipientes farmacéuticos" se refiere a adyuvantes o compuestos no tóxicos que se pueden agregar a la presente invención, que es capaz de mejorar los efectos biológicamente activos del péptido : o su absorbancia en el cuerpo.

El término "polipéptido" se refiere a una proteína conformada por cualquiera de los aminoácidos naturales o sintéticos y sus equivalentes. En la presente invención, un polipéptido puede significar, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína GM-CSF o un equivalente biológicamente activo de la misma. En ciertos casos, cualquiera de los aminoácidos de origen natural puede sustituirse con un aminoácido funcional sin modificar la actividad biológica del péptido. Por ejemplo, los péptidos son oligómeros cortos específicos a una secuencia y longitud compuestos por aminoácidos. Estas biomoléculas familiares son ubicuas en las células vivas y asumen múltiples roles, como ligando del receptor celular, antibiótico endógeno e incluso componentes de tensoactivo pulmonar. Cada papel asumido por un péptido bioactivo normalmente corresponderá a una estructura tridimensional única. De esta manera, la naturaleza ha refinado delicadamente las secuencias y actividades de los péptidos bioactivos a través de la evolución y, por supuesto, ha habido un gran interés en la explotación de estas moléculas como compuestos farmacéuticos líderes. A menudo las terapias farmacéuticas de segunda generación se han centrado en la creación de imitadores de péptidos no naturales. Estos "péptidomiméticos" pueden basarse en cualquier oligómero que imite la estructura primaria del péptido mediante el uso de isoésteres con enlace a amida y/o modificación de la estructura del péptido nativo, incluyendo la extensión de la cadena o la incorporación del heteroátomo. Los oligómeros péptidomiméticos son a menudo resistentes a la proteasa y puede tener una reducida inmunogenicidad y biodisponibilidad mejorada con respecto a los análogos del péptido. Además del mimetismo estructural primario, un subconjunto selecto de los oligómeros peptidomimético específicos a la secuencia, los llamados 'foldámeros', muestra elementos estructurales secundarios bien definidos, tales como las hélices, giros y estructuras pequeñas, como hojas. Cuando la bioactividad de un péptido o su equivalente biológico está supeditado a una estructura precisa en 3-D, la capacidad de un oligómero biomimético para doblarse puede ser indispensable. Ejemplos de péptidomiméticos simples incluyen azapéptidos, oligocarbamatos y oligoureas y ejemplos de foldámeros comunes incluyen ß-péptidos, ?-péptidos, oligo(fenilenetileno), sulfonopéptidos vinílogos y glicinas poli-N-sustituidas (peptoides). Por lo tanto, los peptidomiméticos de un mediador inflamatorio de la presente invención, como el polipéptido de GM-CSF se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto útil en esta invención con una o más moléculas de solvente. Esta asociación física puede incluir enlaces de hidrógeno. En algunos casos el solvato será capaz de aislamiento, por ejemplo, cuando una o más moléculas de solvente se incorporan a la retícula de cristal del sólido cristalino. "Solvato" abarca solvatos tanto en fase de solución y aislables. Solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de un compuesto o agente que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto buscada por un médico ? otro clínico. En particular, en lo que respecta al tratamiento de un trastorno neuronal, el término "cantidad efectiva" pretende significar las dosis efectivas de medicamento que pueden reducir el deterioro cognitivo en un sujeto. El peso típico de un ratón promedio es de aproximadamente .025 kg, con una tasa metabólica de aproximadamente 7.2 veces la de un ser humano. El peso típico de una persona promedio es de aproximadamente 70 kg. Con el peso estándar y ajustes a la tasa metabólica, está dentro del alcance de un experto en la materia poder obtener las dosis eficaces para las terapias de i ¡ medicamento de la invención tal como se describe en este documento. Por ejemplo, cantidades eficaces dentro del alcance de la invención son las dosis equivalentes para ratón que se encuentran en alrededor de 5 mcg/día durante un período, según sea necesario para lograr los efectos cognitivos que se encuentran en unos 2 mg/día para los seres humanos. Por otra parte, las dosis efectivas para los seres humanos también pueden estar dentro de la escala de aproximadamente 50 mcg/día a cerca de 2 mg/día, o bien 50 mcg/día o 100 mcg/día o 250 mcg/día, o 500 mcg/día, o 750 mcg/día o 1 mg/día o 1.25 mg/día o 1.5 mg/día o 2 mg/día o 2.25 mg/día o 2.5 mg/día o ajustarse según sea necesario para el peso, el metabolismo y las necesidades metabólicas de la persona para al menos alcanzar los efectos cognitivos efectivos de dicho individuo.

El término "tratamiento" significa una intervención realizada con la intención de revertir o prevenir el desarrollo o alterar la patología de, y con ello aliviar un trastorno, enfermedad o condición, incluyendo uno o más síntomas de dicho trastorno, enfermedad o condición. La prevención se refiere a las medidas profilácticas o preventivas. El término relacionado "tratamiento", como se usa aquí, se refiere al acto de tratar un trastorno, síntoma, enfermedad o condición, como el término "tratamiento" se define más arriba.

El ligando Flt3 es un ligando para el receptor de la tirosina cinasa FLT3 y pertenece a un pequeño grupo de factores de crecimiento que regulan la proliferación de células hematopoyéticas tempranas. Se han identificado isoformas múltiples del ligando Flt3. La forma predominante es la forma de transmembrana, que es biológicamente activa en la superficie celular. Cuando se escinde proteolíticamente la isoforma de transmembrana genera una forma soluble, que también es biológicamente activa. El ligando Flt3 se une a células que expresan el receptor de la tirosina cinasa Flt3. El ligando Flt3 por si solo no puede estimular la proliferación, pero se sinergiza bien con otros factores estimulantes de colonia (CSF) e interleucinas para inducir el crecimiento y la diferenciación.

La interleucina 6 (IL-6) es una proteína multifuncional de 24 kDa originalmente descubierta en el medio de células fibroblastoides estimuladas con ARN. Se regula al alza de la IL-1 , TNF, PDGF, IFN-beta, TNF-alfa, NGF, IL-17 y se regula a la baja por los glucocorticoides IL-4, TGF-beta. IL-6 parece estar directamente involucrado en las respuestas que se producen después de la infección y la lesión celular y puede llegar a ser tan importante como IL-1 y TNF-alfa en regular la respuesta de fase aguda. IL-6 también se ha implicado en la regulación de la masa adiposa. Se reporta que IL-6 se produce por fibroblastos, linfocitos T activados, monocitos activados o macrófagos y células endoteliales. Actúa sobre una variedad de células incluyendo fibroblastos, células mieloides progenitoras, linfocitos T, linfocitos B y hepatocitos. Además, la IL-6 parece interactuar con IL-2 en la proliferación de los linfocitos T. IL-6 potencia el efecto proliferativo de la IL-3 en progenitores hematopoyéticos multipotenciales.

El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), originalmente descrito como un factor derivado de linfocitos T que inhibieron la migración aleatoria de macrófagos, es una citoquina enigmática durante casi tresi décadas. En los últimos años, el descubrimiento de MIF como un producto de la hipófisis anterior y la clonación y expresión de la proteína MIF bioáctiva recombinante han llevado a la definición de su función biológica crítica in vivo. MIF tiene la propiedad única de ser liberado por los macrófagos y los linfocitos T que han sido estimulados por los glucocorticoides. Una vez liberado, el MIF supera los efectos inhibidores de los glucocorticoides sobre la producción de TNF alfa, IL-1 beta, IL-6 e IL-8 por parte de monocitos estimulados por LPS in vitro y suprime los efectos protectores de los esferoides contra la endotoxemia letal in vivo. MIF también antagon.iza la inhibición glucocorticoide de proliferación de linfocitos T in vitro al restaurar la producción de IL-2 e IFN-gamma. Esta observación ha resultado en la identificación de un papel fundamental del MIF en el sistema inmunológico y llena un importante vacío en nuestra comprensión del control de las respuestas inflamatorias e inmunes. Los glucocorticoides han , sido considerados durante mucho tiempo como un componente integral de t la respuesta al estrés a la infección o a la invasión de tejidos y sirven para modular las respuestas inflamatoria e inmune. MIF es el primer mediador identificado para contrarrestar a regular los efectos inhibidores de los glucbcorticoides y por lo tanto juega un papel fundamental en el control hospedero de la inflamación y la inmunidad.

El factor de necrosis tumoral (TNF) es un miembro de una superfamilia de proteínas, cada una con 157 aminoácidos, que inducen la necrosis (muerte) de las células tumorales y poseen una amplia gama de acciones proinflamatorias. El factor de necrosis tumoral es una citosina multifuncional con efectos sobre el metabolismo lipídico, la coagulación, resistencia a la insulina y la función de las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos.

La interleucina-1 (IL-1) es una de las citosinas descritas por primera vez. Su descubrimiento inicial fue como un factor que podía inducir la fiebre, los linfocitos de control, aumentar el número de células de la médula ósea y causar la degeneración de las articulaciones de los huesos. En ese momento, la IL-1 se conocía bajo varios otros nombres incluyendo pirógeno endógeno, factor activador de linfocitos, hemopoyetina-1 y factor de células mononucleares, entre otros. Fue alrededor de 1984-1985, cuando los científicos confirmaron que la IL-1 se compone en realidad de dos proteínas distintas, que ahora se llama IL-1a e IL-1 ß.

La interleucina-3 (IL-3), una proteína de 152 aminoácidos, por lo general glicosilada, se encontró originalmente como un factor derivado de linfocitos T que indujo la síntesis de 20alfa-hidroxiesteroide deshidrogenase en las células hematopoyéticas. Es secretada por linfocitos T activados y se une al receptor de IL-3 que se heterodimeriza con una subunidad del receptor beta c común, que es compartida por el GM-CSF e IL-5. IL-3 funciona de manera similar a GM-CSF y el gen IL-3 humano se encuentra en el cromosoma 5, nueve kilobases de distancia del gen GM-CSF. IL-3 ha demostrado apoyar la proliferación de muchos tipos de células hematopoyéticas y participa en una variedad de actividades celulares, tales como el crecimiento celular, diferenciación y apoptosis.

La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoproteína de 30.4 kDa, producida principalmente por los fibroblastos peritubulares de la corteza renal y trabaja para proteger a los eritrocitos de la apoptosis, así como promover la proliferación y la maduración de las células progenitoras eritroides a través de acciones sinérgicas con otros factores de crecimiento (IGF -1 , IL-3 y Glyl-CSF). La oxigenación de la sangre se cree que regula la expresión de la EPO, a través de factores de transcripción sintetizados constitutivamente, llamados factores inducibles por hipoxia. La EPO también se ha informado que tiene propiedades neuroprotectoras y angiogénicas.

El factor de crecimiento endotelial vascular tipo A (VEGF-A) es una proteína multifuncional que pertenece a la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y participa en la vasculogénesis y la angiogénesis. Se produce en las células hipóxicas y es liberado por la expresión HIF-1a para unirse a los receptores de la superficie celular VEGFR-1 (Flt-1) o VEGFR-2 (KDR/Flk-1 ), induciendo diversas funciones en consecuencia. Ha demostrado estimular la mitogénesis de células endoteliales y la migración, vasodilatación y ser quimiotáctica para las células hematopoyéticas de linaje monocítico.

El factor de transcripción inducible por hipoxia tipo alfa (HÍF-1a) es un factor de transcripción que responde a los cambios en el oxígeno celular disponible. En condiciones normóxicas, se degrada rápidamente por el proteasoma con la hidroxilación de prolilo por HIF-prolil-hidroxilasa, que posteriormente induce su ubiquitinación. Las condiciones de hipoxia impiden hidroxilación del prolilo y HIF-1a se estabiliza y actúa para regular al alza varios genes que promueven la supervivencia hipóxica, como la EPO y VEGF. HIF-?a por tanto, aumenta la vasculogénesis y la angiogénesis mediante la regulación al alza de estos genes.

El factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-1 ) es una hormona proteínica de polipéptido de 70 aminoácidos similar en su estructura molecular a la insulina y la produce principalmente el hígado. IGF-1 se une al receptor de IGF-1 (IGF-R) y el receptor de la insulina (IR) y es un potente activador del crecimiento celular y de la ruta de señalización de AKT anti-apoptótica. Aunque se produce durante toda la vida, su expresión es más baja en la infancia y la vejez y se ha reportado que el IGF-R e IR se reducen en la enfermedad de Alzheimer (EA) y se relacionan con la neurodegeneración. IGF-1 también se ha implicado en la patogénesis de la diabetes tipo 2, un factor de riesgo positivo para la DA, a través de complicaciones vasculares derivadas de su señalización deficiente con la insulina y la EPO.

El factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF o GCSF) es una hormona del factor estimulante de colonias. Es una glicoproteína, factor de crecimiento o citosina producida por una serie de tejidos diferentes para estimular a la médula ósea a que produzca granulocitos y células madre. G-CSF a continuación estimula la médula ósea para su liberación en la sangre. También estimula la supervivencia, proliferación, diferenciación y función de los precursores de los neutrófilos y de neutrófilos maduros. G-CSF también se conoce como el factor estimulante de colonia tipo 3 (MCA-3).

EL factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) es una proteína secretada por los macrófagos, linfocitos T, mastocitos, células endoteliales y fibroblastos. GM-CSF es una citosina que funciona como un factor de crecimiento de leucocitos de la sangre. GM-CSF estimula las células madre para producir granulocitos (basófilos, neutrófilos y eosinófilos), monocitos y células dendríticas. Los monocitos salen de la circulación y migran hacia el tejido, con lo cual se maduran en macrófagos.

Por tanto, es parte de la cascada inmunitaria/inflamatoria, con la cual la activación de un pequeño número de macrófagos puede conducir rápidamente a un aumento en sus números, un proceso crucial para combatir las infecciones. La forma activa de la proteína se encuentra extracelularmente como un homodímero.

El factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF o CSF- 1 ) es una citosina secretada que influye en las células monocíticas hematopoyéticas para prolíferar y diferenciarse en macrófagos u otros tipos de células relacionadas, tales como osteoclastos, así como la activación de los macrófagos maduros, osteoclastos y microglía. Se ha informado recientemente que M-CSF tiene una expresión reducida en pacientes con AD y su administración periférica en un modelo animal murino de amiloidosis con i deposición amiloide mejorada con AD y la función cognitiva.

Las metaloproteinasas (o metaloproteasas) constituyen una familia de enzimas del grupo de las proteinasas, clasificadas por la naturaleza del grupo funcional más prominente en su sitio activo. Existen dos subgrupos de metaloproteinasas: exopeptidasas llamadas metaloexopeptidasas y endopeptidasas llamadas metaloendopeptidasas. Las metaloendopeptidasas bien conocidas incluyen proteínas ADAM y metaloproteinasas de matriz.

La darbepoyetina es un nuevo factor estimulador de eritropoyetina (NESP) que tiene una vida media plasmática mayor que la EPO y sólo varía con la EPO humana endógena en 5 posiciones de aminoácidos. La darbepoyetina también se espera que actúe de forma sinérgica con GM-CSF en la maduración y proliferación de las unidades eritroides formadoras de colonias y formadoras de ramillete a la etapa de normoblastos de¦ la eritrppoyesis (Fisher (2003)). La eritropoyesis es importante en la enfermedad de Alzheimer debido a la oxigenación de las células neuronales y con la remóción proteínas beta amiloide unidas al complemento circulantes a travos de la expresión del receptor de complemento tipo 1 (CR1) en la superficie del eritrocito (Rogers et al. (2006); Cadman y Puttfarcken (1997);. Helmy et al. (2006)).

El factor de células madre (SCF) es una citosina que se ha inforrnado estimula el crecimiento y el desarrollo de células madre hematopoyéticas pluripotenciales y unipotenciales primitivas ya sea soló o en combinación con otras citosinas como GM-CSF, G-CSF y la EPO (Fisher (2003)). SCF también actúa para estimular la función de los granulocitos maduros (Czygier et al. (2007)).

Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisionales y las publicaciones a las que se hace referencia o citadas en este documento se incorporan por referencia en su totalidad, incluyendo todas las figuras y cuadros, en la medida en que no sean incompatibles con las enseñanzas explícitas de esta especificación.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los procedimientos para la puesta en práctica de la invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como una limitación. Todos los porcentajes son en peso, y todas las proporciones de mezcla de solventes son por volumen a menos que se indique lo contrario.

EJEMPLO 1 Ensayo de laberinto acuático de brazos radiales - la memoria funcional (a corto plazo) se evalúa en la función del laberinto acuático de brazos radiales (RAWM), utilizando el mismo grupo que participó en el ensayo de laberinto acuático de Morris y de reconocimiento de plataforma. Esta función también utiliza la misma plataforma transparente y señales visuales como en el ensayo del laberinto de Morris.

Para la función del laberinto acuático de brazos radiales para la memoria funcional espacial, un inserto de aluminio se colocó en una alberca circular de 100 cm para crear 6 carriles de nado distribuidos radialmente que emanan de un área de nado circular central. Una distribución de impulsos señales en 2-D y 3-D rodearon la alberca. El número de errores antes de ubicar cuál de los 6 carriles de nado contenía una plataforma de escape sumergida (diámetro de 9 cm) se determinó por 5 pruebas/día al transcurso de 8 días de ensayo con tratamiento previo y 4 días de ensayos posteriores al tratamiento. Hubo un retraso de 30 minutos entre la 4a prueba (T4; prueba de adquisición final) y la 5a prueba (T5; prueba de retención de memoria). La ubicación de la plataforma se cambió diariamente a un brazo diferente, con diferentes brazos de inicio para cada una de las 5 pruebas seleccionada de manera semialeatoria de los 5 carril de nado restantes. Durante cada prueba (60 s máximo), el ratón se regresó a aquel brazo de inicio de la prueba al nadar en un carril incorrecto y se registró el número de segundos requeridos para localizar la plataforma sumergida. Si el ratón no encontró la plataforma dentro de una prueba de 60 s, se guió a la plataforma por una permanencia de 30 s. Los números de errores y la latencia de escape durante las pruebas 4 y 5 se consideraron como indicios de la memoria funcional y son temporalmente similares al ensayo de registro/memoria estándar de puntos específicos clínicamente utilizados en la evaluación de los pacientes con AD.

Tras la finalización post-trata miento de los ensayos con RAWM (4 días), todos los ratones fueron evaluados en una nueva función de interferencia cognitiva durante 6 días. Esta : función implica , dos configuraciones de laberinto acuático de brazos radiales en dos cuartos diferentes y 3 conjuntos diferentes de señales visuales. La función requirió que los animales recordaran una serie de señales visuales, por lo que tras la interferencia con un conjunto diferente de señales, el conjunto inicial de señales pueden ser memorizados para resolver con éxito la función del laberinto acuático de brazos radiales. Se examinaron cinco medidas de comportamiento. Las medidas de comportamiento fueron: A1-A3 (puntuación de memoria de tres pruebas compuestas de las primeras 3 pruebas realizadas en RAWM "A"), "B" (medida de interferencia proactiva alcanzada durante una prueba individual en RAWM-B), A4 (medida de interferencia retroactiva alcanzada durante una sola prueba en RAWM "A") y A5 (medida de memoria diferida alcanzada a partir de una sola prueba en RAWM "A" después de una demora de 20 min entre A4 y A5). Al igual que con la función RAWM estándar, esta función de interferencia involucró la localización de la plataforma que se cambiaba diariamente a un brazo diferente para las dos configuraciones del RAWM utilizadas y brazos de inicio diferentes de cada día del ensayo para ambas configuraciones de RAWM. Para las pruebas Al y B, el animal inicialmente tuvo un minuto para encontrar la plataforma por su cuenta antes de ser guiado a la plataforma. Después la prueba real se llevó a cabo en cada caso.

El GM-CSF recombinante de ratón se utilizó en cada experimento utilizando ratones PS/APP. Se reconstituyeron 5 g por inyección en solución salina y se inyectaron subcutáneamente en ratones tratados durante el estudio como se indica a continuación.

Cohorte V. 29 ratones, F8 White Generation, DOB 04/20- 05/07/2007 8 ratones APP, 21 ratones no transgénicos RAWM de ensayo previo: Ratón de 1 año de edad 8 días de RAWM: 25/04-02/05/2008 Retraso de 15 días entre las inyecciones de ensayo previo y de inicio Inicio del tratamiento 17/05/2008 10 días de inyecciones (5pg/día s.c.) antes del ensayo posterior de RAWM con inyecciones diarias durante todo el periodo de ensayo.

Inicio del RAWM de ensayo posterior 27/05/2008 - 30/05/2008; sin epsayo 31/05/2008 - 01/06/2008 pero continuaron las inyecciones diarias; inicio de RAWM de interferencia 02/06/2008 - 07/06/2008.

Ratones adicionales agregados al estudio = Cohorte 2 8 ratones: Anaranjado vivo F8, DOB 27/05/2007, 3 APP/PS1 , 4 APP Azul claro F7, DOB 27/06/2007, 1 APP RAWM de ensayo previo: 8 días de RAWM: 12/05-19/05/2008 Inició 7 días después del cohorte 1 Retraso de 15 días entre las inyecciones de ensayo previo y de inicio Inicio del tratamiento 03/06/2008 10 días de inyecciones (5pg/día s.c.) antes del ensayo posterior de RAWM con inyecciones diarias durante todo el periodo de ensayo.

Inicio del RAWM de ensayo posterior 12/06/2008 - 15/06/2008; sin ensayo 16/06/2008 - 17/06/2008 pero continuaron las inyecciones diarias; inicio de RAWM de interferencia 18/06/2008 - 23/06/2008.

Resultados Las figuras 3, 4 y 7A-7F muestran los resultados del ensayo GM-CSF. Las figuras 7A-7D: Errores de RAWM estándar (4 días de ensayo, dos bloques de 2 días). Para ambos bloques 1 y 2 de ensayo, el grupo transgénico APP no tratado muestra un claro deterioro comparado con todos o la mayoría de otros grupos al trabajar en las pruebas de memoria T4 y T5. Él desempeño sobre todos los días de tratamiento posterior de los ensayos mostró que el grupo transgénico APP no tratado se deterioró sustancialmente comparado con todos los otros 3 grupos, los cuales tuvieron un desempeño similar entre si.

Figura 7E: Ensayo de interferencia G -CSF - Total El grupo transgénico APP no tratado se deterioró mucho en las pruebas de memoria inmediata (A1-A3) comparado con todos los otros 3 grupos. El grupo transgénico APP no tratado mostró un desempeño significativamente deteriorado tanto para las pruebas de interferencia proactivas (Prueba B) y retroactivas (Prueba A4) comparado con los controles de crías no transgénicas no tratadas. El grupo tratado con GM-CSF transgénico APP tuvo un desempeño no tan diferente a los grupos control de crías no transgénicas no tratado en estas pruebas. E grupo transgénico APP no tratado se deterioró mucho en las pruebas de memoria diferida (A5) comparado con todos los otros 3 grupos, que no difirieron entre sí en desempeño.

Las figuras 3 y 4: Ensayo de interferencia GM-CSF - Bloque 1 y Bloque 2.

Durante ambos bloques, el grupo transgénico APP no tratado mostró memoria inmediata deteriorada (A1-A3) y memoria diferida deteriorada (A5) comparado con todos los otros 3 grupos, que no mostraron diferencias entre sí en desempeño. Durante el Bloque 1 , el grupo transgénico no tratado APP mostró un deterioro selectivo en el desempeño de interferencia proactiva (Prueba B). Todos los otros grupo tuvieron mucho mejor desempeño durante esta prueba y los desempeños fueron idénticos entre sí. Durante ambos bloques, el grupo transgénico APP no tratado se deterioró en la interferencia retroactiva (A4) comparado con el grupo de crías no transgénicas tratado con GM CSF Es evidente a partir de ambos ensayos de RAWM estándar y ensayos de interferencia de RAWM que el grupo transgénico APP no tratado está sistemáticamente deteriorado en la memoria funcional, interferencia proactiva, interferencia retroactiva y memoria diferida comparado con los otros 3 grupos. En contraste, el desempeño del grupo transgénico APP tratado con GM-CSF nunca es estadísticamente diferente a aquél del las , crías transgénicas que fueron tratados o no tratados con GM-CSF. Se indica claramente que el grupo transgénico APP no tratado tuvo un desempeño más deficiente a través de las múltiples medidas cognitivas en comparación con los otros 3 grupos.

Además, en un juego separado de experimentos donde los grupos de ratones se trataron con cafeína y los niveles de plasma de GM-CSF determinaron si hubo correlación entre los niveles de GM-CSF y los niveles de beta-amiloide en el hipocampo, se descubrió que había fuertes correlaciones inversas entre GM-CSF en plasma y los niveles de A-beta insolubles en él hipocampo, por ejemplo, ver figuras 5A y 5B. En contraste, hubo una importante correlación positivo entre los niveles de GM-CSF en plasma y los niveles de A-beta solubles en el hipocampo (ver figura 5C). Este estudio de observación separado que utiliza animales en un juego diferente de experimentos sugirió que GM-CSF de alguna manera remueve el A-beta depositado insoluble del cerebro, resultando en A-beta soluble aumentado en el cerebro. Probablemente, el A-beta soluble elevado es el mecanismo de transporte para la compensación de las placas beta en el plasma. Esto puede sugerir un mecanismo de beneficios cognitivos de GM-CSF. Otro mecanismo que puede explicar los beneficios cognitivos de GM-CSF o sus equivalentes biológicos son posibles y están dentro del alcance de la invención como se describen en la presente, incluirían neovascularización en el cerebro con flujo sanguíneo cerebral aumentado, reducciones en placas y sus inflamaciones asociadas, neurogénesis derivada de la médula ósea o neuroprotección contra la isquemia inducida por placas microvasculares y estrés oxidativo resultante. También se puede considerar que cualquier combinación de estos mecanismos mencionados en la presente se consideren como atribuibles a los efectos de GM-CSF y sus equivalentes biológicos sobre los beneficios cognitivos y estaría dentro del alcance de la invención reclamada como aquí se describe.

, Materiales v métodos para el ejemplo 2 Ratones transgénicos que incluyen la administración intracerebral de CSF. Se generaron ratones PS/APP al cruzar ratones PDGF-hAPP (V717F) heterocigóticos con PDGF-hPS1 (M146L) en ambos antecedentes Swiss Webster y C57BL/6. La detección transgénica se realizó utilizando PCR comparativo en tiempo real (Bio-Rad iCycler- Hercules,; CA). El fenotipo patógeno en este modelo es una acumulación resistente de placas amiloides que inicia de los 6-8 meses de edad. Todos los procedimientos que incluyen la experimentación en animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos establecidos por el Comité de cuidados y uso de animales de la Universidad de Florida del Sur.

Infusiones intracraneales de M-CSF Los animales (PS/APP, todos de 8.8-9.6 meses, 25-35 g, ambos géneros) se anestesiaron con isoflurano al 1-2%, se afeitaron y lavaron con solución de Betadina al 10% en el lugar de incisión y se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA). Se hizo una pequeña incisión (4cm), exponiendo el cráneo y se utilizaron tijeras de doble cuchilla para formar una bolsa subcutánea a lo largo del lomo del animal en el que sé insertaron minibombas osmóticas (Alzet model 1004, Durect Corp., Cup'ertino, CA. Se perforaron dos orificios en el cráneo (de Bregma -0.1 mm antero-posterior, +/- 0.9 mm medio-lateral y se insertaron los catéteres calibre 30 a una profundidad de 3.0 mm correspondiente a los ventrículos laterales.) Conduciendo desde la bomba Alzet se encuentra un sistema de catéteres comercial (Solicitud internacional No. PCT/US08/73974)) con las puntas de suministro creadas para lós contornos del cráneo más que la cánula de pedestal comercialniente disponible. Este sistema completamente contenido de manera subcutánea permite la infusión intracerebral bilateral de las sustancias de ensayo. Esta capacidad supera el problema de la varianza en el depósito amiloide entre los animales (ver figura 10) al tener en cuenta la infusión en cada hemisferio, donde una sustancia de ensayo puede suministrarse ipsolateralmente. y el vehículo contralateralmente haciendo eficazmente cada animal su propio control. Además, el cuero cabelludo cura y reduce la inflamación crónica e irritación de los ratones de la herida abierta, vista con el uso de una cánula montada en pedestal. Una vez que las cánulas se insertan, se fijan al cráneo utilizando adhesivo Locktite 454 (Plastics One, Roanoke, VA) y se sujetan con nitrilo de 1cm de diámetro. Después de que el adhesivo cura, el cuero cabelludo se sutura con 6-7 suturas de seda y se le da al animal una dosis inmediata de ketoprofeno (10 mg/kg) y nuevamente cada 6 horas según sea necesario para otras 48 horas.

Se inyectó bilateralmente M-CSF directamente en los ventrículos laterales (5 pg/día) durante 14 días utilizando Alzet modelo 1004 con un caudal promedio de 0.12 pL/hora. Las bombas y los catéteres se cebaron durante 48 horas en un baño maria a 37oC antes de la implantación. Después de un periodo de 14 días, se les dio a los animales un sobredosis ( ~100 mg/kg, i.p.) de pentobarbital de sodio después de la perfusión transcardiaca con solución salina fría al 0.9%.

Inyección estereotáxico de CSF Todos los 3 CSF se inyectaron estereotáxicamente (5 pg/inyección) en el hipocampo (ipsolateral) con el vehículo (fluido cerebroespinal artificial (aCSF)) inyectado contralateralmente en cuatro ratones PS/APP (todos de 10-12 meses de edad, 25-35 g ambos géneros). Se perforaron dos orificios en el cráneo (de Bregma -2.5 mm antero-posterior, +/- 2.5 mm medio-lateral y se insertó una aguja calibre 30 a una profundidad de 2.5 mm). Se sacrificaron los ratones y 7 días después, se inyectó solución salina fría al 0.9%. GMCSF recombinante de ratón (rrhGM-CSF), G-CSF recombinante de murina (rmG-CSF) y M-CSF recombinante de ratón (rmM-CSF) (R&D Systems) se mencionarán como GM-CSF, G-CSF y M-CSF en toda esta publicación.

Inmunohistoquímica y análisis de imágenes de ratones inyectados ¡ntrahipocámpicamente Los tejidos cerebrales perfundidos de los ratones ¡ntrahipocámpicamente se fijaron en formalina regulada neutral al 10% de 24-36 horas y después se colocaron a través de un gradiente de sacarosa (10-30%) por otras 72 horas. Los cerebros después se congelaron al peltier (Physitemp, Clifton, NJ) del corte histológico (Leica, Heerbruug, Suiza) y se seccionaron coronalmente en 14 µ?t?. Alternativamente, los cerebros seleccionados se empotraron con parafina después de la fijación con formalina regulada neutral al 10%, seccionados en 5 µ?t? y adheridos a los portaobjetos. Se llevó a cabo la desparafinación y la eliminación del antígeno (hervido en 10mM de regulador de citrato de sodio por 20 min) antes de la tinción inmunohistoquímica. Para reducir significativamente el costo de los agentes activos y anticuerpos con portaobjetos empotrados con parafina, se desarrolló un dispositivo de tinción inmunohistoquímica magnética Las técnicas inmunohistoquímica estándar utilizaron anticuerpos anti-?ß es decir, 6E10 (1 :1000) y MabTech's (1 :5000) para el depósito amiloide inmunoetiquetado seguido por fluoróforos secundarios Alexa 488 y/o 564 (1 :1000, 1 :4000 - Invitrogen) y tinción nuclear Hoechst (Sigma). Se visualizaron los tejidos en un microscopio de fluorescencia Zeiss Imager.ZI con una cámara Zeiss Axiocam Mrm (Oberkochen, Alemania) con software AxioVision 4.7. Se tomaron fotomicrografías a 10X y se montaron cón Axiovision Panarama Module para seleccionar áreas iguales de los lugares correspondientes de cada hemisferio cerebral. Hubo 5 secciones coronales/ratón con 15-25 10X fotografías/hemisferio analizados (variados de acuerdo con la ubicación antero-posterior). La cuantificación amiloide se realizó con un programa de software ImageJ (desarrollado en y disponible de National Institutes of Health). Brevemente, cada fotografía analizada por sección coronal se limitó igualmente a la misma desviación estándar desde la media del histograma y se utilizó el mismo umbral del área para disminuir los artefactos originales y se analizaron para los parámetros de área, perímetro, diámetro feret y densidad integrada. El diámetro feret es la distancia más larga a través de una placa dada y la densidad integrada es el producto del área y el valor de grises promedio de los pixeles de la placa. ' Estudio del comportamiento de ratones transgénicos incluyendo el tratamiento con GM-CSF En este estudio, los ratones provinieron de la colonia de ratones transgénicos del Centro de Investigación de Florida sobre la Enfermedad de Alzheimer, donde los ratones heterocigóticos que portan el gen muíante APPK670N, 671 L (APPsw) por rutina se cruzan con ratones PS1 heterocigóticos (línea Tg 6.2) para obtener crías que consisten en genotipos APPsw/PS1 , APPsw, PS1 , y no-transgénicos (NT) en una base de C57/B6/SW/SJL mezclada. Se seleccionaron once ratones APPsw, 4 APPsw/PS1 y 17 NT, todos de 12 meses de edad para el uso en este estudio y se evaluaron en la RAWM de la memoria funcional durante 8 días (ver siguiente protocolo). Muchos experimentos han mostrado que varios genotipos de AD tienen un desempeño igual una vez que alcanzan el deterioro cognitivo. De este modo, los 15 ratones se dividieron en dos grupo, equilibrados en desempeño RAWM con 2 ratones APPsw incluidos en cada grupo. Los 17 ratones NT también se dividieron en dos grupos, equilibrados en desempeño RAWM. Dos semanas después de terminar el ensayo de pretratamiento, un grupo de ratones Tg (n = 7) y un grupo de ratones NT (n = 9) iniciaron un protocolo de tratamiento de 10 días con GM-CSF (5 g/día dados subcutáneamente), mientras que los animales en los grupos Tg y NT control (n = 8 por grupo) recibieron diariamente tratamiento con vehículo (solución salina) subcutáneamente por el mismo periodo de 10 días. En el día 1 1 de inyecciones, todos los ratones iniciaron la evaluación por cuatro días en la función RAWM, se les dio 2 días de descanso y después de 4 días adicionales de pruebas en la función de interferencia cognitiva novedosa (ver a continuación el protocolo). Las inyecciones diarias de GMCSF y solución salina continuaron durante todo el periodo de prueba de comportamiento. Después de terminar la prueba de comportamiento en 3 semanas en el tratamiento, se sacrificaron todos los ratones, se fijaron los cerebros como se describió anteriormente y se empotraron con parafina. El examen visual cuidadoso de todos los tejidos con la necropsia no mostró anormalidades morfológicas y los ratones toleraron bien las inyecciones subcutáneas diariamente.

Inmunohistoquímica y análisis de imágenes de ratones tratados con GM-CSF subcutáneo Los tejidos cerebrales perfundidos de los ratones de la prueba de comportamiento inyectados subcutáneamente se fijaron en formalina regulada neutral al 10% de 24-36 horas y después se empotraron con parafina. En el nivel del hipocampo (bregma -2.92 mm a -3.64 mm), cinco secciones de'5-µG? (150 µ?t? aparte) se hicieron a partir de cada cerebro de ratón utilizando una microtoma de deslizamiento y montado por portaobjetos. La tinción inmunohistoquímica se realizó siguiendo el protocolo del fabricante utilizando un kit Vectastain ABC Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) acoplado con la reacción de diaminobencidina, excepto que el paso de anticuerpos secundarios biotinilados se omitió para la tinción inmunohistoquímica ?ß. Los siguientes anticuerpos primarios se utilizaron para la tinción inmunohistoquímica: un anticuerpo monoclonal ?ß humano biotiniliado (clon 4G8; 1:200, Covance Research Products, Emeryville, CA) un anticuerpo policlonal sinaptofisina de conejo (no diluido, DAKO, Carpintería, CA). Para la tinción inmunohistoquímica ?ß, las secciones cerebrales se trataron con ácido fórmico al 70% antes del paso de prebloqueo. La solución salina regulada con fosfato (0.1 mM, pH 7.4) o el suero normal de conejo (control isotipo) se utilizó en vez del anticuerpo primario o del reactivo ABC como un control negativo. El análisis cuantitativo de imágenes se llevó a cabo con base en los métodos anteriores (Sanchez-Ramos et al. (2009). Se adquirieron las imágenes utilizando un microscopio Olympus BX60 con un sistema de cámara digital unido (DP-70, Olympus, Tokio, Japón) y la imagen digital se enviaron a Windows PC para el análisis cuantitativo utilizando un software SimplePCI (Compix Inc., Imaging Systems, Cranberry Township, PA). Las imágenes de cinco secciones de 5-µ?? (150 µ?? aparte) a través de ambas regiones anatómicas de interés (hipocampo y corteza entorrinal) se capturaron de cada animal y se obtuvo una densidad óptica de umbral que discriminó la tinción del original. Cada región de interés se editó manualmente para eliminar los artefactos. Para el análisis cargado ?ß, se reportan los datos como el porcentaje del área inmunoetiquetada capturada (pixeles positivos) relacionados con el área completa capturada (pixeles totales). Para evaluar la inmunorreactividad de la sinaptofisina, después de que el modo de imágenes se convirtió a la escala de grises, la intensidad promedio de las señales positivas de cada imagen se cuantificó en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo como un número relativo de cero (blanco) a 255 (negro). Cada análisis se realizó por un examinador simple ciego para tomar muestras a las identidades (T.M.).

Funciones de comportamiento Cada análisis se realizó por un examinador simple ciego (N.G.) para tomar muestras a las identidades y los análisis estadísticos se llevaron a cabo por un examinador simple ciego (M.R.) para las identidades del grupo de tratamiento. El código no se rompió sino hasta que se acabaron los análisis.

Laberinto acuático de brazos radiales Para la función de RAWM de memoria funcional espacial (Arendash et al. (2001); Ethell et al. (2006); Arendash et al. (2007)), se colocó un inserto de aluminio en una alberca circular de 100 cm para crear 6 brazos de nado distribuidos radialmente que emanan de un área circular central de nado. Una distribución de señales visuales en 2-D y 3-D rodearon la alberca. El número de errores antes de ubicar cuál de los 6 brazos de nado contiene una plataforma de escape sumergida (diámetro de 9 cm) se determinó por 5 pruebas/día. Hubo un retraso de 30 minutos entre la 4a prueba (T4; prueba de adquisición final) y la 5a prueba (T5; prueba de retención de memoria). La ubicación de la plataforma se cambió diariamente a un brazo diferente, con diferentes brazos de inicio para cada una de las 5 pruebas seleccionada de manera semialeatoria de los 5 carril de nado restantes. Durante cada prueba (60 s máximo), el ratón se regresó a aquel brazo de inicio de la prueba al nadar en un brazo incorrecto y el tiempo de latencia requerido para colocar la plataforma sumergida se registró. Si el ratón no encontró la plataforma dentro de la prueba de 60 s, se guió a la plataforma por una permanencia de 30 s. Los números de errores y la latencia de escape durante las pruebas 4 y 5 se consideraron como indicios de la memoria funcional y son temporalmente similares al ensayo de registro/memoria estándar de puntos específicos clínicamente utilizados en la evaluación de los pacientes AD.

Funciones de interferencia cognitiva Esta función se diseñó para imitar, medir por medir, una función de interferencia cognitiva recientemente utilizada para discriminar entre los pacientes MCI y AD que envejecieron de manera normal ((2004).Loewenstein et al. (2004)). La función incluye dos instalaciones de RAWM en dos diferentes salas, con dos juegos de señales diferentes de aquellos utilizados en el ensayo de RAWM estándar. La función requiere animales que recuerden un juego de señales (en RAWM-A) para que i después de la interferencia con un juego diferente de señales (en RAWMB), el juego inicial de señales se recuerde para resolver de manera exitosa la función de RAWM. Se revisaron cinco medidas de comportamiento: A1-A3 (puntuación de memoria de tres pruebas compuestas de las primeras 3 pruebas realizadas en RAWM-A), B (medida de interferencia proactiva alcanzada de una sola prueba en RAWM-B), A4 (medida de interferencia retroactiva alcanzada durante una sola prueba en RAWM-A) y A5 (medida de memoria diferida alcanzada de una sola prueba en RAWM-A después de un retraso de 20 min entre A4 y A5). De igual manera que la función RAWM estándar, esta función de interferencia incluye la ubicación de plataforma cambiada diariamente a un brazo diferente para ambas instalaciones RAWM. Para las pruebas A1 y B, el animal inicialmente tuvo un minuto para encontrar la plataforma por su cuenta antes de ser guiado a la plataforma. Después la prueba real se llevó a cabo en cada caso. De igual manera que con la función RAWM estándar, se les dio a los animales 60 s para encontrar la plataforma de escape por prueba, con el número de errores y latencia de escape registrados por prueba.

Análisis estadístico El análisis estadístico de los parámetros de placas amiloides de la administración de GM-CSF ipsolateral contra los hemisferios de inyección con aCSF contralaterales se llevó a cabo utilizando una prueba t de Student pareada con un valor P de < 0.05 considerado importante. Para el análisis estadístico de los datos RAWM, los 8 días del ensayo de tratamiento previo (cuatro bloques de 2 días) o los 4 días del ensayo de tratamiento posterior (dos bloques de 2 días) se evaluaron para bloques individuales, así como sobre todos los bloques, utilizando ANOVA de un sentido. En lo sucesivo, las diferencias par por par post hoc entre los grupos se resolvieron con la prueba de Fisher LSD (diferencia menos importante). Para el análisis estadístico de los datos de interferencia cognitiva, ambos bloques de 2 días se analizaron por separado, como fue para los cuatro días colectivamente. ANOVA de un sentido se empleó para cada una de las cuatro medidas de comportamiento analizadas, seguido por la prueba de Fisher LSD post hoc para determinar las diferencias de grupo importantes en P < 0.05. El análisis estadístico de depósito de placas amiloides y tinción de sinaptofisina a partir de la administración de GM-CSF subcutánea se llevó a cabo utilizando la prueba t de Student de homócedasticidad de dos colas con un valor P de < 0.05 considerado importante.

EJEMPLO 2 La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo progresivo relacionado con la edad que se presenta como el descenso aumentado en la función cognitiva y motriz. La demencia del Alzheimer está asociada con la disfunción cerebrovascular ((Humpel and Marksteiner (2005)), acumulación extracelular de péptidos ß-amiloide (?ß) en el parénquima cerebral y vasculatura de las paredes (Rhodin et al. (2000); Scheuner et al. (1996)) (predominantemente ?ß1-42 and ?ß1-40) y acumulación intraneuronal de ovillos neurofibrilares que consisten en proteínas Tau hiperfosforiladas. (Rapoport et al. (2002)). La neuroinflamación asociada puede contribuir a la patogénesis AD (Griffin et al. (1989); Akiyama et al. (2000); Wyss-Coray (2006)), mientras las proteínas inflamatorias, apolipoproteína E (apoE) y a1-Ántiquimiotripsina (ACT) catalizan la polimerización de los péptidos ?ß en filamentos amiloides in vivo e in vitro (Wisniewski t al. (1994); Ma et al. ( 996), Potter et al. (2001); Nilsson et al. (2004); Padmanabhan et al. (2006)). Sin embargo, las NSAID no han podido invertir o prevenir la patología de AD y se sugiere que los microgliales distróficos preceden la demencia neurodegenerativa (Streit et al. (2009)). También se ha mostrado que las placas amiloides se forman rápidamente y después se decoran mediante los microgliales (Koenigsknecht-Talboo et al. (2008); Meyer-Luehmann et al. (2008)), ambos residentes y derivados de la médula espinal, lo cual sugiere una capacidad e intención de eliminar los amiloides (Malm et al. (2005); Simard and Rivest (2004); Simard et al. (2006)).

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune en la que el tejido sinovial inflamado y las formas de queratitis vascular altamente vascularizado dañan de manera irreparable el cartílago y hueso. En esta queratitis vascular inflamatoria, las poblaciones de leucocitos se expanden en gran medida y se producen muchos factores proinflamatorios que trabajan juntos en los mecanismos de alimentación anticipada, aumentando adicionalmente la leucocitosis, la liberación de citosina/quimiócina, osteoclastogénesis, angiogénesis y producción de autoanticuerpos (factores reumatoides y anticuerpos de proteína anticitrulina) (Szekanecz and Koch (2007); van der Voort et al. (2005); Schellekens et al. (2000)). Adicionalmente, el sistema inmunológico adaptativo presenta un fenotipo Th17 dentro de CD4 + linfocitos, con producción final de interleucina (IL-17) que después és responsable de la inducción de la mayoría de los efectos proinflamatorios (Parsonage et al. (2008); Cox et al. (2008)). Otras mejoras de las poblaciones de leucocitos provienen de la expresión local de los factores estimulantes de la colonia: M-CSF (macrófago), G-CSF (granulocito) y GM-CSF (granulocito-macrófago) (Seitz et al. (1994); Leizer et al. (1990); Nakamura et al. (2000)).

Aunque los leucocitos aumentados en RA podrían entrar potencialmente en el cerebro e inhibir el desarrollo de la patología de AD y/o disfunción neuronal, los infiltrados linfocíticos en el cerebro de los pacientes AD no se han reportado. La falta de infiltración sugiere que la activación del sistema inmunológico innato puede ser responsable de prevenir la patología de ÁD en pacientes RA. Por ejemplo, las proteínas complementarias aumentan en el cerebro AD y la inhibición de la convertasa C3 aumenta significativamente la patología amiloide en ratones AD (Wyss-Coray et al. (2002)). Los microgliales derivados de la médula espinal desempeñan un papel crítico en la restricción del depósito de amiloides, pero esta asociación disminuye con la edad, mientras que la patología de AD aumenta (Simard et al. (2006)). El Khoury y colegas han demostrado qúe los microgliales son realmente protectores contra la patogénesis AD en, múltiples maneras, es decir, a través del retraso de la amiloidosis por medio de la incorporación del receptor de quimiocina (CCR2) por la regulación a la alza de su ligando, proteína quimotáctica de monocito tipo 1 (MCP-1/CCL2), por la expresión inducida de los receptores secuestradores de enlace de ?ß (CD36, receptor A secuestrador y receptor para los productos finales de glicación avanzada) y mediante la expresión inducida de las enzimas degradadoras ?ß [neprilisina, insulisina y metaloproteinasa de matriz (MMP9)]. No obstante, la expresión de estos receptores y enzimas también disminuye con ía edad (Hickman et ál. (2008); El Khoury et al. (2007)).

Para investigar la interacción del sistema inmunológico innato y AD, estudiamos los efectos en la patología de AD de tres factores estimulantes de la colonia estructuralmente no relacionados (M-CSF, G-CSF y GM-CSF), los cuales están aumentados en RA (Seitz et al. (1994); Leizer et al. (1990); Nakamura et al. (2000)). Estos CSF mejoran la supervivencia de sus leucocitos respectivos y activa su proliferación y diferenciación de los precursores monocíticos. M-CSF y G-CSF inducen subjuegos específicos del sistema inmunológico innato, mientras que GMCSF induce la escala completa de células innatas. Al utilizar la infusión intracerebroventricular bilateral de M-CSF durante dos semanas en ratones PS/APP, primero revisamos el efecto de MCSF en el depósito de placas. El análisis inmunohistoquímico mostró considerables varianzas del depósito de amiloides entre los ratones de edad similar (figura 10) comprometiendo significativamente nuestra capacidad de determinar el efecto de MCSF en un cohorte limitado de ratón. Mientras se mejora nuestro sistema de suministro de fármacos al desarrollar catéteres de infusión cerebral bilateral novedosos, encontramos que los péptidos recombinantes parenquimalmente infundidos se quedaron localizados para infundir el hemisferio. Estos hallazgos nos llevan a administrar CSF como un bolo intrahipocámpico unilateral con una inyección contralateral de vehículo corrió control, de este modo se obvia la necesidad de grandes números de ratones transgénicos y controles de crías que coinciden con la edad para obtener importancia estadística. Cada CSF se inyectó estereotáxicameiite en el hipocampo de 4 ratones, con un vehículo de fluido cerebroespinal artificial (aCSF) inyectado contralateralmente. Los ratones fueron sacrificados 7 días después de la inyección.

De manera sorprendente, las inyecciones M-CSF resultaron en una ; tumefacción visible de los hemisferios completos tratados, fragilidad notable al seccionarlos y en un ratón, una hiperplasia aparente en el sitio de inyección (figura 1 1C). La sobreexpresión de MCSF y/o su receptor en las glándulas mamarias resultó de manera similar en la formación de tumor e hiperplasia (Kirma et al. (2004)). Las cargas de placas de amiloides no cambiaron significativamente en los hemisferios inyectados con MCSF como se compara con los lados control (no se muestran datos). No obstante, Boissonneault et al. (2009) publicó que la inyección intraperitoneal crónica (i.p.) de MCSF previene e invierte el depósito de amiloides y el deterioro cognitivo. Al utilizar la médula ósea que expresa GFP, los autores también hallaron que M-CSF indujo una acumulación importante en los microglialés i derivados de la médula ósea (Boissonneault et al. (2009)). Las diferencias entre estos datos y nuestros punto a los diferentes efectos de longitud y dosis de estudio, con Boissonneault et al. que suministra la i.p. crónica de 1.3 pg de MCSF por inyección, comparado con nuestro bolo intrahipocámpico de 5 pg.

A diferencia de M-CSF, las inyecciones G-CSF no indujeron la tumefacción y mostraron algunas reducciones razonables del depósito de amiloides (figuras 12A y 12B), que se confirmaron mediante las observaciones I \ independientes realizadas por los coinvestigadores (Sanchez-Ramos et al. (2009)). Sin embargo, las inyecciones GM-CSF resultaron en reducciones de amiloides pronunciadas, comparadas con los hemisferios control (figuras 13A- 13D) y por lo tanto, todos nuestros experimentos posteriores enfocados en el estudio de los efectos de GM-CSF en ratones AD. La cuantificación de placas de amiloides mostraron reducciones importantes dentro de cada uno de los ratones y reducciones importantes generales para todos los parámetros de placas medidos (figura 6B y figuras 14A-14D). El diámetro feret y los parámetros de densidad integrada se redujeron en todos los hemisferios inyectados con GM-CSF de todos los 4 ratones, indicando que los tamaños generales de las placas y los núcleos densos se redujeron simultáneamente.

La reducción por ciento en el depósito de placas entre las secciones individuales del mismo ratón y entre los ratones diferentes varió dentro de una escala de 8 a 62% (no se muestran los datos) y con esto resalta adicionalmente la varianza del depósito de amiloides en cada cerebro y entre los múltiples ratones.

Con base en estos datos de patología, investigamos el efecto de la inyección de GM-CSF subcutánea en la patología de AD y la función cognitiva. Antes del tratamiento con GMCSF, los ratones APPsw+PS 1 (Tg) primero fueron confirmados por el ensayo de RAWM para estar deteriorados cognitivamente para la memoria funcional. Tanto los ratones control no transgénicos (NT) como los ratones Tg se subdividieron en dos grupos equilibrados cognitivamente, para el tratamiento con GM-CSF o con solución salina. La inyección posterior de ensayo de RAWM volvió a confirmar que los ratones control Tg estaba sustancialmente deteriorados comparados con los ratones control NT. Este deterioro fue evidente en bloques individuales de ensayo, pero también en los 4 días de ensayo (figuras 7A-7D). En definido contraste, los ratones Tg tratados con GM-CSF tuvieron un desempeño igualmente bueno o mejor que el de los ratones control NT durante los bloques individuales y generales. Los ratones NT tratados con GMCSF tuvieron un desempeño tan bueno o ligeramente mejor que el de los controles NT (figuras 7A-7D).

Antes de la evaluación en la Función dé interferencia cognitiva, los ratones descansaron dos días. Esta función imita el ensayo de interferencia humana, la cual distingue a los pacientes que padecen deterioro cognitivo leve (MCI) de los controles viejos con un alto grado de precisión. (2004)). En todas las cuatro medidas de interferencia valoradas durante 4 días de ensayo (figura 7E), los ratones control Tg estaban claramente deteriorados comparados con los ratones NT y al los ratones NT tratados con GM-CSF mostraron memoria significativamente mejor de 3 pruebas y memoria diferida comparada con los controles Tg. De hecho, para todas las cuatro medidas cognitivas, los ratones AD transgénicos tratados con GM-CSF tuvieron un desempeño similar al de los ratones NT. Un efecto particularmente fuerte del tratados con GM-CSF en ratones Tg fue evidente para la medida de interferencia proactiva durante la primera mitad del ensayo (figura 7F), en donde los ratones Tg tratados con GM-CSF tuvieron un desempeño sustancialmente mejor que el de los controles Tg y idéntico al de ambos grupos de ratones NT. La susceptibilidad a la interferencia proactiva se mostró como un marcador sensible para la diferenciación de pacientes que padecen MCI y AD de los normales viejos que las medidas tradicionales de la memoria diferida y el índice de olvido (Loewenstein et al. (2004)). Parentéticamente, incluso los ratones NT tratados con GM-CSF mostraron una tendencia a la cognición mejorada en estudios de comportamiento, aunque no estadísticamente significativa. Los análisis posteriores de los cerebros de los ratones Tg de este estudio mostraron que el tratamiento con GM-CSF indujo grandes reducciones en cargas de amiloides dentro de la corteza entorrinal (¿55%) e hipocampo (¿57%) comparados con los ratones Tg control (figura 8E).

La función cognitiva mejorada y la amiloidosis cortical reducida de los ratones Tg tratados con GM-CSF fueron paralelos mediante la inmunorreactividad de la sinaptofisina aumentada tanto en CA1 como en CA3 (figuras 9A-9E), indicando la densidad sináptica aumentada en estas áreas hipocámpicas. El trabajo previo mostró que las células madre neurales adultas en la circunvolución dentada del hipocampo (DG) expresa los receptores GM-CSF y GM-CSF aumenta la diferenciación neuronal de estas células en una manera que depende de la dosis (Kruger et al. (2007)). De este modo, un mecanismo para el mejoramiento cognitivo inducido por GM-CSF es la eliminación mejorada de ?ß depositado en el hipocampo, con el crecimiento neuronal/diferenciación sináptica subsecuentes de la inervación de las fibras musgosas a CA3, resultando en inervación/sinaptogénesis aumentada de los colaterales Schaffer en CA1. La eliminación de los ?ß depositados de la corteza entorrinal también puede aumentar la viabilidad de la trayectoria perforante a los campos de proyección hipocámpicos en DG y CA1. De esta manéra, el mejoramiento inducido por GM-CSF del circuito hipocámpico/de corteza entorrinal, el cual es crítico para la memoria funcional (corto plazo), puede subyacer en la inversión de GM-CSF del deterioro de la memoria funcional en los ratones Tg de Alzheimer.

EJEMPLO 3 Se inyectaron estereotáxicamente cuatro ratones PS/APP de 10-12 meses de edad con 5pg de rmGM-CSF en el hipocampo en un hemisferio del cerebro con vehículo (aCSF: fluido cerebroespinal artificial) contralateralmente. Se sacrificaron los ratones y se perfundieron con solución salina 7 días después, fijada con formalina al 10% y cada uno se crioseccionaron en 14µ?? o se empotraron con parafina y se seccionaron en 5µp?. Las técnicas inmunohistoquímicas estándar utilizaron 6E10 y anticuerpos anti-?ß de MabTech para etiquetar el depósito de amiloides. La microscopía y el procesamiento de imágenes se realizaron en un imagerZI Zeiss utilizando un software Axiovision. Se utilizó ImageJ para cuantificar el depósito de amiloides.

Dieciséis ratones PS/APP de 10-12 meses de edad y dieciséis controles no transgénicos de la misma edad se analizaron previamente de manera cognitiva mediante el RAWM, un paradigma de memoria funcional. Se eligieron casi aleatoriamente ocho ratones de cada grupo para las inyecciones subcutáneas (5pg/día) de rmGM-CSF. La otra mitad recibió inyecciones diarias del vehículo (solución salina). Huno un período de reposo de 15 días después del ensayo previo antes de que iniciaran las inyecciones diarias. Se inyectaron los ratones durante 10 días antes de 4 días del ensayo posterior de RAWM. Hubo un periodo de reposo de 2 días antes de 6 días del ensayo de la función de interferencia cognitiva. Se aplicaron las ¡ inyecciones en todo el ensayo y más de 1 hora antes se realizaron los ensayos de comportamiento. El ensayo de comportamiento y el análisis lo llevó a cabo personal separado que fueron observadores ciegos para las identidades de grupo.

Resultados La inyección intrahipocámpica del bolo redujo el depósito de placas de amiloides rmGM-CSF en todos los hemisferios cerebrales respectivos por tanto como 60%. En las inyecciones subcutáneas de rmGM-CSF, los ratones PS/APP mostraron estar deteriorados cognitivamente comparados con los controles, invirtieron significativamente su deterioro cognitivo en la función RAWM estándar. En la función de interferencia cognitiva, los ratones PS/APP que recibieron rmGM-CSF mostraron resultados similares a aquellos de los ratones no transgénicos en todas las 4 medidas cognitivas. Sin embargo, las reducciones en el depósito de placas de amiloides no se observaron en el estudio subcutáneo. 1 GM-CSF invierte significativamente la patología similar a la enfermedad de Alzheimer y mejora la cognición.

Debe entenderse que los ejemplos y las modalidades aquí descritas son únicamente para propósitos ilustrativos y que se sugerirán varias modificaciones o cambios en vista de los mismos a los expertos en la técnica y se incluirán en la esencia y ámbito de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Además, cualquier elemento o limitación de cualquier invención o modalidad del mismo aquí descrito puede combinarse con cualquier y/o todos los elementos o limitaciones (individualmente o en combinación) y cualquier otra invención o modalidad del mismo aquí descrita y todas las combinaciones están dentro del alcance de la invención sin limitación a la misma.

REFERENCIAS Patente de E, U .A. No. US 4,559, 157 Patente de E U .A. No. US 4,608,392 Patente de E u .A. No. US 4,820,508 Patente de E u A. No. US 4,938,949 Patente de E. u .A. No. US 4,992,478 Patente de E. u .A. No. US 5,034,322 '.' Patente de E, u .A. No. US 5,106,739 Patente de E. u .A. No. US 5, 167,649 Patente de E. u .A. No. US 5,625,136 Patente de E u .A. No. US 6,960,648 Patente de E u .A. Publicada No. 20020035243 Patente de E. u .A. Publicada No. 20020120100 Patente de E, u .A. Publicada No. 20030032594 Solicitud Internacional No. PCT/US08 73974 Akiyama, H. et al. (2000) Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 21 , 383-421.

AltschuI, S. F. et al. (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215:403-410.

AltschuI, S. F. et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Datábase Search Programs" Nucí. Acids Res. 25:3389-3402.

Arendash, GW et al. (2001 ) "Progressive, age-related behavioral impairments in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes" Brain Res 891 :42-53 Arendash, GW et ai. (2007) "A diet high in omega-3 fatty acids does not improve or protect cognitive performance in Alzheimer's transgenic mice" Neuroscience 149:286-302 Beltz, G.A., Jacobs, K. A., Eickbush, T. H., Cherbas, P. T., Kafatos, F. C. (1983) "Isolation of multigene families and determinaron of homologies by filter hybridization methods" Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285.

Boissonneault, V. et al. 2009) Powerful beneficial effects of macrophage colony-stimulating factor on beta-amyloid deposition and cognitive impairment in Alzheimer's disease. Brain 132, 1078-1092.

Bundgaard, H., Ed. (1985) Design of Prodrugs, Elsevier Bundgard, H. (1992) Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 1-38 Cox, C.A. et al. (2008) Both Th1 and Th17 are immunopathogenic but differ in other key biological activities. J Immunol 180, 7414-7422. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) "The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters" Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 80(1):21-25.

El Khoury, J. et al. (2007) Ccr2 deficjency impairs microglial accumulation and accelerates progression of Alzheimer-like disease. Nat Med 13, 432-438.

Ethell, DW et al. (2006) "Abeta-specific T-cells reverse cognitive decline and synaptic loss in Alzheimer's mice" Neurobiol Dis 23:351-361 Felgner, P.L., T.R. Gadek, M. Holm, R. Román, H.W. Chan, M. Wenz, J.P. Northrop, G.M. Ringold, M. Danielsen (1987) "Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure" Proc Nati Acad Sci U.S.A. 84(21)7413-7417.

Fisher, J.W. (2003) "Erythropoietin: physiology and pharmacology update" Exp Biol Med (Maywood), 228(1): 1-14.

Gótz, J, F. Chen, J. van Dorpe, R.M. Nitsch (2001) "Formation of neurofibrillary tangles in P301 I tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils" Science, 293(5534):1491-5.

Griffin, W.S. et al. (1989) Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease. Proc Nati Acad Sci USA 86, 7611-7615.

Hickman, S.E., Allison, E.K. and El KhOury, J. (2008) Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci 28, 8354-8360.

Higuchi, T. and Stella, V. (1987) "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", 14 A.C.S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design, E.B. Roche, Ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press Humpel, C. and Marksteiner, J. (2005) Cerebrovascular damage as a cause for Alzheimer's disease. Curr Neurovasc Res 2, 341-347.

Karlin S., Altschul, S. F. (1990) "Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268.

Karlin S., Altschul, S. F. (1993) "Applications and Statistics for Múltiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences" Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 90:5873-5877.

Kirma, N. et al. (2004) Overexpression of the colony-stimulating factor (CSF-1) and/or its receptor c-fms in mammary glands of transgenic mice resúlts in hyperplasia and tumor formation. Cáncer Res 64, 4162-4170.

Koenigsknecht-Talboo, J. et al. (2008) Rapid microglial response around amyioid pathology after systemic anti-Abeta antibody administration in PDAPP mice. J Neurosci 28, 14156-14164.

Krogsgaard-Larsen and Bandaged, H., Eds. (1991) A Textbook I· of Drug Design and Development, Chapter 5 "Design and Applications ; of Prodrugs" 1 13-191 Kruger, C, Laage, R., Pitzer, C, Schabitz, W.R. and Schneider, A. (2007) The hematopoietic factor GM-CSF (granulocyte-macrophage colony- stimulating factor) promotes neuronal differentiation of adult neural stem cells in vitro. BMC Neurosci 8, 88.

Leizer, T., Cebón, J., Layton, J.E. and Hamilton, J.A. (1990) Cytokine regulation of colony-stimulating factor production in cultured human synovial fibroblasts: I. Induction of GM-CSF and G-CSF production by ¡nterleuk¡n-1 and tumor necrosis factor. Blood 76, 1989-1996.

Loewenstein, D.A. et al. (2004) Semantic interference déficits and the detection of mild Alzheimer's disease and mild cognitive impairment without dementia. J Int Neuropsychol Soc 10, 91-100.

Ma, J., Brewer, H.B., Jr. and Potter, H. (1996) Alzheimer A beta neurotoxicity: promotion by antichymotrypsin, ApoE4; inhibition by A beta-related peptides. Neurobiol Aging 17, 773-780.

Malm, T.M. et al. (2005) Bone-marrow-d rived cells contribute to the recruitment of microglial cells in response to beta-amyloid deposition in APP/PS1 double transgenic Alzheimer mice. Neurobiol Dis 18, 134-142.

Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Martin, B.K. et al. (2008) Cognitive function over time in the Alzheimer's Disease Anti-inflammatory Prevention Trial (ADAPT): results of a randomized, controlled trial of naproxen and celecoxib. Arch Neurol 65; 896-905.

McGeer, P.L., Rogers, J. and McGeer, E.G. (2006) Inflammation, anti-inflammatory agents and Alzheimer disease: the last 12 years. J Alzheimers Dis 9, 271-276.

Meyer-Luehmann, M. et al. (2008) Rapíd appearance and local toxicity of amyloid-beta plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.

Nature 451 , 720-724.

Nakamura, H. et al. (2000) High serum and synovial fluid granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) concentrations in patients with rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol 18, 713-718.

Nakeya, N. et al. (1984) Chem. Pharm. Bull., 32:692 Nielsenw, N.M. and Bundgaard, H. (1988) "Glycotamide esters as biolabile prodrugs of carboxylic acid agents: Synthesis, stability, biocónversion, and physicochemical properties" J. Pharm. Sci., 77(4):285L298.

Nilsson, L.N. et al. (2004) Cognitive impairment in PDAPP mice depends on ApoE and ACT-catalyzed amyloid formation. Neurobiol Aging 25, 1 153-1167.

Padmanabhan, J., Levy, M., Dickson, D.W. and Potter, H. (2006) Alphal-antichymotrypsin, an inflammatory protein overexpressed in Alzheimer's disease brain, induces tau phosphorylation in neurons. Brain 129, 3020-3034.

Parsonage, G. et al. (2008) Prolonged, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent, neutrophil survival following rheumatoid synovial fibroblast activation by IL-17 and TNFalpha. Arthritis Res Ther 10, R47.

Potter, H., Wefes, I.M. and Nilsson, L.N. (2001) The inflammation-induced pathological chaperones ACT and apo-E are necessary catalysts of Alzheimer amyloid formation. Neurobiol Aging 22, 923-930.

Rapoport, M., Dawson, H.N., Binder, L.I., Vitek, M.P. ánd Ferreira, A. (2002) Tau is essential to beta -amyloid-induced neurotoxicity. Proc Nati Acad Sci USA 99, 6364-6369.

Rhodin, J., Thomas, T., Bryant, M. and Sutton, E.T. (2000) Animal model of Alzheimer-like vascular pathology and inflammatory reaction. Ann N Y Acad Sc¡ 903, 345-352.

Ritchie, K. and S. Lovestone (2002) "The dementias" Lancet, 360(9347): 1759-66.

Sanchez-Ramos, J. et al. (2009) Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) Decreases Brain Amyloid Burdenand Reverses Cognitive Impairment in Alzheimer's Mice. Neuroscience.

Schellekens, G.A. et al. (2000) The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43, 155-163.

Scheuner, D. et al. (1996) Secreted amyloid beta-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer's disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease. Nat Med 2, 864-870.

Seitz, M., Loetscher, P., Fey, M.F. and Tobler, A. (1994) Constitutive mRNA and protein production of macrophage colony-stimulating factor but not of other cytokines by synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Br J Rheumatol 33, 613-619.

I Simard, A.R. and Rivest, S. (2004) Bone marrow stem cells nave the ability to popúlate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. FASEB J 18, 998-1000.

Simard, A.R., Soulet, D., Gowing, G., Julien, J.P. and Rivest, S. (2006) Bone marrow-derived microglia play a critical1 role in restricting senile plaque formation in Alzheimer's disease. Neuron 49, 489-502.

Streit, W.J., Braak, H., Xue, Q.S. and Bechmann, I. (2009) Dystrophic (senescent) rather than activated microglial cells are associated with tau pathology and likely precede neurodegeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol.

Szekanecz, Z. and Koch, A.E. (2007) Macrophages and their products in rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 19, 289-295. van der Voort, R. et al. (2005) Elevated CXCL16 expression by synovial macrophages recruits memory T cells into rheumatoid joints. Arthritis Rheum 52, 1381-1391.

Widder, K. et al, Eds. (1985) Methods in Enzymology, Academic Press, 42:309-396 ! Wisniewski, T., Castaño, E.M., Golabek, A., Vogel, T. and Frangione, B. (1994) Acceleration of Alzheimer's fibril formation by apolipoprotein E in vitro. Am J Pathol 145, 1030-1035.

Wyss-Coray, T. (2006) Inflammation in Alzheimer disease: driving forcé, bystander or beneficial response? Nat Med 12, 005-10 5.

Wyss-Coray, T. et al. (2002) Prominent neurodegeneration and ¡ncreased plaque formation in complement-inhibited Alzheimer's mice. Proc Nati Acad Sci USA 99, 10837-10842.

Xu, D., McEIroy, D., Thornburg, R. W., Wu, R. et al. (1993) "Systemic induction of a potato pin2 promoter by wounding, methyl jasmonate, and abscisic acid in transgenic rice plants" Plant Molecular Biology 22:573-588.

Fisher, J.W. (2003) "Erythropoietin: physiology and phafmacology update" Exp Biol Med (Maywood), 228:1-14).

Rogers, J. et al. (2006) "Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes" Neurobiol Aging, 27:1733-1739.

Cadman, E.D. and Puttfarcken, P.S. (1997) "Beta-amyloid peptides initiate the complement cascade without producing a comparable effect on the terminal pathway in vitro" Exp Neurol 146:388-394.

Helmy, K.Y. et al. (2006) "CRIg: a macrophage complement receptor required for phagocytosis of circulating pathogens" Cell 124:915^927.

Czygier, M., Lawicki, S., Stankiewicz, I. & Szmitkowski, M. (2007) [Stem cell factor (SCF) in the plasma and phagocytic functions of granulocytes in breast cáncer patiénts]. Przegl Lek 64:1014-1017.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de uno o más mediadores inflamatorios o un fragmento o variante funcional de los mismos que muestra sustancialmente la misma actividad biológica como el mediador inflamatorio de longitud completa o no variante o un polinucleótido que codifica dicho mediador inflamatorio, o un compuesto o agente que induce la producción de dicho mediador inflamatorio, donde dicho mediador inflamatorio es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica, en la elaboración de un medicamento para tratar el deterioro cognitivo en una persona o animal. i

2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho mediador inflamatorio comprende uno o más de un ligando de tirosina cinasa relacionada con fms tipo 3 (Flt3), interleucina 6 (IL-6), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la interleucina-1 (IL-1 ), la interleucina-3 (IL-3), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1 alfa), factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF- 1), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre (SCF), darbepoyetina (ARANESP) y metaloproteinasas o un fragmento funcional o variante de los mismos que muestren sustancialmente la misma actividad biológica que el mediador inflamatorio de longitud completa o no variante.

3. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho mediador inflamatorio comprende GM-CSF o un fragmento o variante funcional de la misma que presenta sustancialmente la misma actividad que el GM-CSF de longitud completa o no variante.

4. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho mediador inflamatorio comprende un equivalente biológico de GM-CSF.

5. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el mediador inflamatorio es capaz de reducir los niveles beta amiloides en el plasma o cerebro de la persona o animal.

6. - El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicho GM-CSF es capaz de reducir los ovillos neurofibrilares en el plasma o cerebro de la persona o animal.

7.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el deterioro cognitivo es causado por o resulta en la enfermedad de Alzheimer. ,

8.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el mediador inflamatorio está adaptado para ser intracranealmente administrable.

9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el mediador inflamatorio está adaptado para ser administrable por infusión intracraneal.

10.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el mediador inflamatorio está adaptado para ser administrable a una célula o tejido no neural.

11. - El uso como se reclama en la reivindicación 1, en donde la persona o animal se evalúa adicionalmente para el deterioro cognitivo antes del tratamiento.

12. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición comprende un portador, diluyente o soluto farmacéuticamente aceptables.

13. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido se provee en un principio de expresión.

14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el principio de expresión se provee para la expresión de dicho polinucleótido en células neurales.

15. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en doride dichas células neurales son células humanas.

16. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto o agente que induce la producción de dicho mediador inflamatorio es EPO o HIF-1a.

17. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho deterioro cognitivo es causado por o resulta de un accidente cerebrovascular, síndrome de Down, demencia pugilistica, lesión cerebral traumática, demencia asociada al SIDA, enfermedad on cuerpos de Lewy o enfermedad de Pick.

18. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde i) GM-CSF y/o GM-CSF y ii) darbepoyetina y/o EPO están adaptados para ser adrninistrables a la persona o animal.

19. - Un kit que comprende en uno o más contenedores uno o más mediadores inflamatorios, un polinucleótido o una composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.