JP2005506287A - 造血障害を治療するためのlp82の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、人間の医療分野に適用される組換えDNA技術に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物造血障害(貧血を含むが、これに限定されるわけではない)の新規な治療方法または予防方法に関し、これらの方法は、LP82(最近、インターロイキン様ポリペプチドとして同定された)の投与を含む。さらに、LP82活性を中和するまたはアンタゴナイズする抗体および他の薬剤の投与を含む、哺乳動物造血障害(白血病を含むが、これに限定されるわけではない)の新規な治療方法または予防方法が、本明細書中に開示される。
【背景技術】
【0002】
造血は一生における必須のプロセスであり、これにより、非常に特化した血液細胞(二酸化炭素および酸素輸送を担う細胞(赤血球)、血液凝固を担う細胞(血小板)、体液性免疫を担う細胞(Bリンパ球)、細胞性免疫を担う細胞(Tリンパ球)ならびに外来生物およびそれらの生成物に反応する細胞(顆粒球、単球およびマクロファージ)を含む)が造血幹細胞から生産される。これらの細胞は全て、骨髄性およびリンパ性と称される機能的に異なる2つのグループに分けることができる。正常な成人の一生の間には、骨髄系細胞は骨髄内に限られて生産される(Lichtman, M.A., Exp.Hematol. 9:391, 1981)が、他方、リンパ系統の細胞は骨髄、脾臓、胸腺およびリンパ節で種々の程度で生産される。成熟した機能的に目的の細胞およびその中間前駆体は、限られた寿命および限られた増殖能力を有しており、それゆえ自己保持的ではない。従って、これらの細胞はより原始的な増殖前駆細胞のプールから連続的に複製される。最終的には、骨髄系統およびリンパ系統の両方の細胞全てが全能性幹細胞に由来する。正常なヒト成人では、2000億の赤血球(Erslev, A.J., Hematology, McGraw-Hill, New York, 1983)および600億の中性好性白血球(Dancey, J.T.ら、J. Clin. Invest. 58:705, 1976)が、毎日産生される。
【0003】
造血は、必然的に厳密に制御されている。造血の種々の局面の制御を担う分子は、通常、2つのグループ、細胞外増殖因子および細胞内増殖因子(例えば、増殖因子レセプター、シグナル伝達分子および転写因子)に分けることができる。造血サイトカインは、血液細胞の分解および再構築の間の不均衡、または特定の血液細胞の不適切な数での産生から生じる種々の疾患を治療するためにうまく使用されてきた。例えば、組換えエリスロポエチン(EPO)は、慢性腎不全患者、ジドブジン処置HIV感染患者、化学療法中の癌患者、および自己輸血を受けている患者における貧血の治療のために投与される糖タンパク質である。組換えトロンボポエチン(TPO)は、血小板減少症の治療に関して臨床評価を現在受けている。EPOおよびTPOの有用性にもかかわらず、個人の造血状態を改変する別の方法を提供する必要性が存在する。従って、本発明の目的は、患者における望ましくない造血状態を予防および/または校正し得る新規な治療方法を提供することである。
【発明の要旨】
【0004】
インターロイキンファミリーの新規なメンバーは、国際特許出願WO99/27103およびWO00/12708(それぞれの内容を参照して本明細書中に組み込む)に記載されており、あるいは、それぞれヒトZcyto10およびPRO1801と命名されている。このタンパク質(以下LP82と称する)は、既知のサイトカインに典型的な4個のαへリックス構造を示し、IL-10およびIL-19と顕著なホモロジーを共有する。
【0005】
本発明は、赤血球生成(赤血球細胞の産生)、白血球生成(白血球細胞の産生)および/または血小板生成(thrombocytopoiesis)(血小板の産生)を含む、造血を調節する方法に関し、この方法は、本明細書中に記載のLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82の機能的フラグメント、LP82変異体またはLP82抗体のうちの少なくとも1つを、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に、治療上有効な量で投与することを含む。
【0006】
本発明は、1種以上のタイプの造血前駆細胞(好ましくは、CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM、BFU-Eおよび/または巨核球細胞、最も好ましくは、CFU-GEMM細胞)の数を増加させる方法に関し、この方法は、LP82ポリペプチドまたはその変異体、LP82ポリヌクレオチド、LP82アゴニストまたはLP82機能的フラグメントのうちの少なくとも1つを治療上有効な量で、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に投与することを含む。
【0007】
本発明の方法は全て、LP82の投与に加えて、造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体のうちの少なくとも1つを治療上有効な量で投与することをさらに含み得ることが意図される。好ましい造血サイトカインは、Epo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよび/またはSCFであり、最も好ましくは、Epo、IL-3、SCF、G-CSFおよび/またはGM-CSFである。造血サイトカインは、LP82の投与の前、同時、および/または後に投与され得ることが意図される。本発明の方法は、化学療法または放射線療法の投与と同時、その後または前に行われ得ることがさらに意図される。
【0008】
本発明はさらに、少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞の増加を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において、少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞を増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のLP82ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与すること、場合によりLP82投与に加えて少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で投与することをも含む。
【0009】
なおさらに、本発明は、赤血球の増加を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において、増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のLP82ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与すること、場合によりLP82ポリペプチドに加えて少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で投与することをも含む。LP82の投与の前、LP82の投与と同時、および/またはLP82の投与の後に、少なくとも1つの造血サイトカインが投与され得ることが意図される。
【0010】
また、本発明は、ヘマトクリットの増加を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において、増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のLP82ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与することを含む。
【0011】
本発明はさらに、細胞サイクルのS期にある哺乳動物、ヒトまたは患者において、1つ以上のタイプの造血前駆細胞(好ましくは、GFU−GEMM細胞)の割合を増加させる方法に関し、この方法はそのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に本明細書中に記載のLP82ポリペプチド、LP82ポリヌクレオチド、LP82アゴニスト、LP82の機能的フラグメントまたはLP82変異体のうちの少なくとも1種を治療上有効な量で投与することを含む。この方法はLP82投与に加えて、造血サイトカインを少なくとも1種、治療上有効な量で投与することをさらに含むことが意図される。LP82の投与の前、LP82の投与と同時および/またはLP82の投与の後に、少なくとも1種の造血サイトカインが投与され得ることが意図される。
【0012】
本発明はさらに、1種以上のタイプのリンパ系細胞の数を増加させる方法に関し、この方法はLP82ポリペプチドを治療上有効な量で投与することを含む。
【0013】
本発明はさらに、1種以上のタイプの造血前駆細胞(好ましくはGFU−GEMM細胞)の数を減少させる方法に関し、この方法は本明細書中に記載のLP82アンタゴニスト、LP82アンチセンスポリヌクレオチドフラグメントまたはLP82抗体のうちの少なくとも1種を治療上有効な量で、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に投与することを含む。このような方法は、少なくとも1種の追加の造血サイトカインアンタゴニスト、アンチセンスポリヌクレオチドフラグメント、または造血サイトカイン抗体を治療上有効な量で投与することをさらに含むことを意図する。
【0014】
さらに、本発明の方法は、例えば、癌に関する治療を受けている哺乳動物(好ましくはヒト)に投与される化学療法または放射線療法の前、同時、および/または後に投与され得ることが意図される。
【0015】
本発明は、造血前駆細胞刺激量、あるいはCFU−GEMM細胞刺激量、あるいはリンパ系細胞刺激量あるいは治療上有効な量の、本明細書中に記載のLP82ポリペプチド、LP82ポリヌクレオチド、LP82アゴニスト、LP82の機能的フラグメントおよび/またはLP82変異体のうちの少なくとも1種、ならびに製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、あるいはそれらからなる、または本質的に構成されている医薬組成物に関する。このような組成物は、追加の造血サイトカイン(好ましくは、Epo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよび/またはSCF、より好ましくは、Epo、IL-3、SCF、G-CSFおよび/またはGM-CSF、最も好ましくは、Epo、IL-3および/またはSCF)を少なくとも1種、治療上有効な量でさらに含有し得ることが意図される。
【0016】
本発明はさらに、造血前駆細胞刺激量、あるいはCFU−GEMM細胞刺激量、あるいは治療上有効な量の、本明細書中に記載のLP82アンタゴニスト、LP82アンチセンスポリヌクレオチドフラグメントおよび/またはLP82抗体のうちの少なくとも1種、ならびに製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、あるいはそれらからなる、または本質的に構成されている医薬組成物に関する。このような組成物はさらに、追加の造血サイトカインアンタゴニスト、造血サイトカインアンチセンスポリヌクレオチドフラグメントまたは造血サイトカイン抗体を少なくとも1種、治療上有効な量で含有し得ることが意図される。
【0017】
以下に記載の特定の態様は、それらを変更してもなおかつ特許請求の範囲内に含まれ得るので、本発明は以下の特定の実施態様に限定されない。本明細書中で用いる技術用語は、特定の実施態様を記載するためのものであり、限定を意図するものではない。それよりも、本発明の範囲は特許請求の範囲により確立される。
【0018】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、特に明確に記載しない限り、単数系は複数形の表示を含む。
【0019】
定義
用語「アミノ酸」は、本明細書中において最も広い意味で用いられており、天然のアミノ酸、および非天然のアミノ酸(アミノ酸変異体および誘導体を含む)を含む。後者は、アミノ酸部分を含有する分子を含む。当業者であれば、本明細書中のアミノ酸の言及である、この最も広い定義に関して、天然のタンパク質性(proteogenic)L−アミノ酸、D−アミノ酸、化学的に修飾したアミノ酸(例えば、アミノ酸変異体および誘導体)、天然の非タンパク質性アミノ酸(例えば、ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等)、および当該分野において公知のアミノ酸に特徴的である特性を有する化学的に合成した化合物を含むと認識する。
【0020】
本発明のLP82ポリペプチドおよび/またはそのフラグメント、および/またはその変異体への非天然のアミノ酸(これは合成性のネイティブではないアミノ酸、置換アミノ酸または1つ以上のDアミノ酸(「D−LP82ポリペプチド」)を含む)の組み込みは、多数の異なる方法において有利である。D−アミノ酸含有ポリペプチドは、L−アミノ酸含有対応物と比較してインビトロまたはインビボで増加した安定性を示す。従って、D−アミノ酸を組み込むLP82ポリペプチドの構築は、インビボでのより高い安定性が所望されるまたは必要である場合に、特に有用であり得る。より具体的には、D−ペプチドは内生的ペプチダーゼおよびプロテアーゼに耐性であり、それにより分子のインビボにおける改善されたバイオアベイラビリティおよび長期化させた寿命が望ましい場合に、このような特性を提供する。ペプチドが短期間のみ活性であることが望ましい場合、分子内にL−アミノ酸を使用することにより、内生的ペプチダーゼ、プロテアーゼ等が分子を消化できるようにし、それにより細胞の分子への暴露を制限する。さらに、D−ペプチドは、ヘルパーT細胞への主要組織適合複合体クラスII限定的提示に関して効率的に処理されないので、それゆえ、生物全体における体液性免疫反応がおそらく弱くなる。
【0021】
D−アミノ酸の使用に加えて、当業者であれば、LP82ポリペプチドおよび/または任意のLP82ポリペプチド変異体のアミノ酸配列における修飾により配列番号2に示される本来のポリペプチド配列またはその任意のフラグメントと、等しいかまたはそれよりも優れた機能特性を示す機能的LP82ポリペプチドを生じ得る。従って、このような修飾により生じる配列は、本明細書中に開示されるLP82ポリペプチドおよびLP82ポリペプチド変異体と実質的に同じ(または、望ましくありうる場合には、改善された、もしくは減少した)活性を有するならば、本発明の方法は本明細書中に記載のLP82ポリペプチドおよび/またはLP82変異体における変更を意図し、これには、天然の変異または人為的操作のいずれかによる1つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換、短縮、融合、サブユニット配列のシャッフリングなどを含み得る。
【0022】
用語「LP82アンタゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、本明細書中に記載のLP82ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に、遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、用語「LP82アゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、LP82ポリヌクレオチドまたはLP82ポリペプチドの発現、安定性および/または生物学的活性を誘導または増加させる任意の分子を含む。LP82アゴニストおよびLP82アンタゴニストとしては、例えば、本明細書中に記載の低分子、LP82ポリペプチド、LP82ポリヌクレオチド、LP82フラグメント、ならびにLP82ポリペプチドに対する抗体を挙げることができる。本発明のLP82アンタゴニストとしては、アンチセンスおよびリボザイム分子、ならびにLP82遺伝子の発現を阻害するために用い得る遺伝子または調節配列置換構築物のようなヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。適切なLP82アゴニストとしては、LP82ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、LP82変異体および有機低分子が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。LP82アゴニストまたはLP82アンタゴニストの同定方法は、LP82ポリペプチドをLP82アゴニスト候補分子またはLP82アンタゴニスト候補分子と接触させる工程、および通常、LP82ポリペプチドと関連している1つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定する工程を含む。
【0023】
「抗体」(Ab)および「イムノグロブリン」(Ig)は、同一の構造特性を有する糖タンパク質である。Abが特定の抗原に対して結合特異性を示す一方で、Igは、Abおよび抗原特異性を欠失している他の抗体様分子の両方を含む。用語「抗体」は、もっとも広い意味で用いられており、具体的には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2種のインタクトな抗体から形成される多特異的(multispecific)抗体(例えば、2特異性抗体)、および所望の生物活性を示す抗体フラグメントが含まれるがこれらに限定されない。
【0024】
LP82遺伝子またはLP82をコードするDNAもしくはcDNA配列、またはそのようなDNAもしくはcDNA配列の相補的配列に関しての用語「フラグメント」または「そ(れら)のフラグメント」は、LP82核酸のセグメントを意味し、これは配列番号1に示されるネイティブな核酸分子またはその相補配列中で隣接する15以上のヌクレオチド、好ましくは30以上のヌクレオチド、さらにより好ましくは50以上のヌクレオチドを含有する。
【0025】
LP82ポリペプチド配列に関しての用語「フラグメント」または「そ(れら)のフラグメント」は、LP82タンパク質またはポリペプチドのセグメントを意味し、配列番号2に示されるネイティブなポリペプチドに隣接している15以上のアミノ酸、好ましくは30以上のアミノ酸、さらにより好ましくは50以上のアミノ酸を含有する。
【0026】
LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82変異体および/またはLP82抗体に関する用語「機能的」は、特定の分子がインビボまたはインビトロで本明細書中に開示されるLP82ポリペプチドに起因する生物学的活性と実質的に類似するまたは同一である生物学的活性(例えば、少なくとも1つのタイプの造血前駆細胞(好ましくはCFU−GEMM細胞)の増殖および/または分化を誘発する能力)を示す意味であることを意図する。
【0027】
本明細書中で用いる「機能的フラグメント」は、本明細書中に記載のLP82ポリペプチドまたはその変異体あるいはLP82ポリヌクレオチドまたはその相補体の単離セグメントを意味し、これは機能的に明確な領域(例えば、酵素上の活性部位、LP82アゴニストまたはアンタゴニストに対する結合部位、LP82レセプター、LP82ポリペプチド、またはLP82抗体、あるいはLP82アンチセンス分子)を含有する。機能的フラグメントは、当業者に公知の方法(組換DNA法、酵素/蛋白質分解的消化を含むが、これらに限定しない)により、または選択的スプライシング方法の天然の生成物として製造することができる。
【0028】
用語「ヘマトクリット」は、血液中の血漿および血球の相対量を測定する際に使用される装置により測定される、赤血球細胞の体積の白血球細胞に対する比の値を意味する。通常のヘマトクリット範囲は、年齢、ならびに青年期の後は個体の性別に依存する。ヘマトクリットの達成目標はある個体と別の個体とでは異なり、その結果として所定の患者に対する実際の目的ヘマトクリットを決定する際に医師の判断が適切であり得ることが理解される。
【0029】
用語「LP82」は、核酸、遺伝子、cDNA(配列番号1に示す)、そのフラグメントおよび配列番号1に相補的な配列、ならびにそれらによりコードされるポリペプチド配列(配列番号2に示す)を意味する。また、用語「LP82」は、さらなる限定を伴わずに、ネイティブなLP82ポリペプチド(配列番号2)およびLP82ポリペプチドの成熟形態(これは配列番号2に示される配列のアミノ酸25〜176であると推定される)の両方を意味する。特記しない限り、用語「LP82ポリペプチド」は、配列番号2に示されるLP82ポリペプチドの全長および機能的フラグメント、ならびにそれらの分泌型、成熟型、縮合型、変異型、選択的スプライシング型および対立遺伝型形態を含む。
【0030】
用語「LP82組成物」は、本明細書中に記載のLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82アンチセンスポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82フラグメント、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82縮合型タンパク質および/またはLP82抗体のうちの少なくとも1つを含有する組成物を意味することを意図する。
【0031】
「LP82ポリペプチド抗体」または「LP82抗体」は、本明細書中に記載の抗体を意味し、これは本明細書中に記載のLP82ポリペプチドのエピトープの少なくとも1つを認識し、これに結合する。
【0032】
「LP82アンチセンスポリヌクレオチド」は、配列番号1に示される配列の相補体の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含有し、これはLP82アンタゴニストとして機能する。
【0033】
本明細書中で用いる用語「LP82変異体」は、それぞれ配列番号1または2に示されるLP82ポリヌクレオチドまたはLP82ポリペプチド、ならびにその任意のフラグメントを意味し、これらはさらに、本明細書中に記載の修飾体の種々のタイプのうちの少なくとも1つを含有する。さらに、ポリペプチドで用いる場合、LP82変異体は、配列番号2に示される縮重型アミノ酸配列を有するLP82ポリペプチドと少なくとも約95%アミノ酸配列の同一性を有する、本明細書中に記載の「機能的な」LP82ポリペプチドを意味することを意図する。このようなLP82ポリペプチド変異体としては、例えば、配列番号2のN末端、C末端または配列内で、1つ以上のアミノ酸残基が付加、置換または欠失しているLP82ポリペプチドが挙げられる。通常、LP82ポリペプチド変異体は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と、シグナルペプチドを有して、または有さずに、少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。変異体には、LP82の対立遺伝子変異体、すなわち、哺乳動物(好ましくはヒト)の集団内に存在する種々の対立遺伝子によりコードされるものが含まれることが意図される。
【0034】
本明細書中で使用する用語「半減期」は、この分子の集団を構成する分子の約半分がインビトロで分解(cleave)されるために必要とされる時間を意味する。より具体的には、「血漿半減期」は、この分子の集団を構成する分子の約半分が循環から取り除かれる、またはインビボで不活性にされるために必要とされる時間を意味する。
【0035】
本明細書中で用いる用語「造血サイトカイン」は、造血前駆細胞に作用する、あるいは造血の調節に関連する(好ましくは、造血前駆細胞の増殖および/または分化を誘導するように機能する)任意のサイトカインまたは因子を意味する一般的用語である。好ましい造血サイトカインとしては、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFが挙げられる。
【0036】
本明細書中で用いられる用語「造血前駆細胞」は、造血細胞系統に属する(commit)が、なお完全には成熟造血細胞に分化していない任意の細胞を意味する。好ましい造血前駆細胞タイプとしては、CFU−GEMM、CFU−Mk、CFU−GM、BFU−E、巨核球が挙げられる(図1を参照のこと)。
【0037】
本明細書中で用いる用語「成熟造血細胞」は、最終的に分化した造血細胞、例えば、rbc、顆粒球、単球、血小板を意味する。
【0038】
核酸またはタンパク質に関して本明細書中において用いる場合、用語「単離」は、天然の供給源においては同定され、そして通常は共に存在する(associate)夾雑物の少なくとも1つから分離されている核酸配列またはタンパク質を意味する。単離されている核酸またはタンパク質は、天然で見出されるものとは異なる形態または配置(setting)で存在する。対照的に、単離されていない核酸またはタンパク質は、それらが天然に存在する状態で見出される。
【0039】
本明細書中で用いる場合、用語「精製(した)」または「精製する」は、目的の成分(例えば、タンパク質または核酸)から夾雑物を取り除くプロセスの結果を意味する。これにより、精製した成分の割合はサンプル中で増加する。
【0040】
本明細書中で用いる用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、哺乳動物細胞中での発現により産生される形態のタンパク質を意味する。通常、一旦、粗面小胞体での成長タンパク質鎖の搬出(export)が開始されると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、「成熟」形態のタンパク質を産生するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルペプチド(SP)配列を有すると仮定される。しばしば、分泌タンパク質の切断は均一ではなく、1種類以上の成熟タンパク質を生じるかも知れない。分泌タンパク質の切断部位は、完全なタンパク質の1次アミノ酸配列により決定され、通常、完全に正確には推測することはできない。タンパク質がSP配列を有するかどうか、ならびに配列に対する切断点を推測する方法を利用することができる。切断点は、アミノ酸15とアミノ酸30の間、最も好ましくは、配列番号2に示される配列のアミノ酸24の後のLP82のN−末端ドメイン内に存在し得る。当業者であれば理解するように、しばしば、切断点は生物間で変化し、完全に確実には推測することはできない。場合により、分泌タンパク質の切断点は、タンパク質の精製製造法内で見出される1種以上の成熟タンパク質のアミノ末端配列決定により経験則により決定される。
【0041】
本明細書中で用いる用語「処置」または「治療」は、造血疾患、病状、または傷害と戦うまたは予防するための患者の管理または看護を意味し、これには、症状または合併症の発症を予防するため、症状または合併症を緩和するため、または疾患,病状または障害を排除するためのLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82フラグメント、LP82アンチセンスポリヌクレオチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82抗体および/またはLP82組成物の投与が含まれる。
【0042】
本明細書中で用いられる「治療上有効な量」は、活性薬剤(例えば、LP82ポリペプチド、造血サイトカインポリペプチド、LP82抗体、造血サイトカイン抗体)が哺乳動物に治療効果を与えるために必須である最小量である。例えば、哺乳動物に対する「治療上有効な量」は、障害に関連する病的症状、疾患、進行または生理学的状態における改善、または障害に圧倒されることへの抵抗性を改善、あるいはそれらを引き起こさせるような量である。
【0043】
本発明は、LP82活性が造血プロセスに密接に関連していることを実証する。本出願人は、LP82ポリペプチドが、単独または少なくとも1種の他の造血サイトカインとの組合せの両方で、顕著にCFU−GEMM細胞の数を増加させ、そして赤血球、血小板、顆粒球および単球の数を増加させることを示した。また、LP82ポリペプチドは細胞サイクルのS期に存在するCFU−GEMM細胞の割合を増加させる、すなわち、LP82はCFU−GEMM細胞サイクル(cycling)状態を増加させる。エリスロポエチン(Epo)および幹細胞因子(SCF)と組み合わせての、ならびにまた、Epo、SCFおよびIL−3と組み合わせての、LP82ポリペプチドのヒトCD34+細胞への添加により、LP82ポリペプチドを添加しないコントロール細胞と比較して、CFU−GEMM造血前駆細胞の数を顕著に増加させた。CFU−GEMMは、最終的には、赤血球、血小板、顆粒球および単球へと分化する(図1)。また、これらのコロニーは、増加した数の巨核球細胞を含み、このことはLP82が赤血球および巨核球経路に共通の造血前駆細胞に影響を与えていることを実証する。本出願人は、LP82が、赤血球、顆粒球/単球および巨核球経路に共通の造血前駆細胞に影響を与えて造血前駆細胞ならびに成熟造血細胞を増加させていることを実証する。さらに、本発明により、LP82アンタゴニストおよび抗体の、1つ以上のタイプの造血前駆細胞および1つ以上のタイプの成熟造血細胞の数を減少させる能力を意図する。
【0044】
造血
造血は、新しい血液細胞の形成の複雑な発生プロセスを意味する。造血系においては、唯一の長期自己複製細胞が造血幹細胞(HSC)であり、これに全ての異なるタイプの血液細胞が由来する。HSCは、T細胞、B細胞、顆粒球、単球/マクロファージ、赤血球細胞などで見出されるマーカーに対して系列(lineage)陰性(Lin−)である(概説に関しては、例えば、Weissmanら、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:387−403,2001を参照のこと)。ヒトHSCは、CD34+、Thy−1+、Lin−、c−kitloおよびCD38−である。HSCは、骨髄系またはリンパ系細胞へと分化することができ、各々、自己に特異的な細胞表面抗原を有する(図1)。造血幹細胞から生じた前駆細胞は、分化決定(committed)細胞と称する。HSCが分化する骨髄系統における前駆細胞としては、CFU−GEMM、BFU−E、CFU−E、CFU−GM、CFU−G、CFU−M、CFU−Mkおよび巨核球が挙げられる。これらの細胞に関する当該分野の用語には、いくらかの変動がある。最終的には、骨髄性細胞は、最終的に分化した血小板、顆粒球(好中球、好酸球、好塩基球)、単球および赤血球を生じる。
【0045】
CFU−GEMMは、血液形成細胞の系統における多能性前駆細胞タイプの名称であり、これは全ての骨髄系細胞タイプに分化し得る。CFU−GEMM細胞の特異的な形態によりコロニー形成アッセイで同定することができる。また、細胞は、それらが発現する細胞表面マーカー(CD33、CD34およびHLA−DRを含む)により特徴付けることができる。LP82がその主な活性を及ぼすのはCFU−GEMM細胞であり、これにより、本明細書中の実施例においてインビトロおよびインビボの両方で示されているように、CFU−GEMMの数の顕著な増加を導く。CFU−GEMMを刺激することが知られている造血サイトカインとしては、SCF、GM−CSF、IL−6、IL−3、IL−11およびEpoが挙げられる。
【0046】
BFU−E(赤芽球コロニー形成細胞(burst forming unit erythroid))は、最も初期の公知の赤血球前駆細胞であり、最終的に赤血球へと分化する(すなわち、赤血球系統に分化することが決定している)。BFU−Eは、コロニー形成アッセイにおいて小さいコロニーの「バースト」からなる赤血球細胞の大きいコロニーを生じる。赤血球幹細胞系統では、BFU−Eは、より成熟したCFU−Eの先に生じる。細胞の成熟には、細胞上のEpo受容体の数の増加が伴う。BFU−Eは多数の造血サイトカイン(IL3、EDF、IL4、IL6、IL9、IL1、SCFおよびEpoを含む)に応答する。
【0047】
CFU−GMは、顆粒球および/または単球への分化が決定されている多能性前駆細胞タイプを定義する。CFU−GMは、細胞表面マーカー(CD13、CD33、CD34およびHLA−DR)の発現によりコロニー形成アッセイで形態学的に同定することができる。CFU−GMは、GM−CSF、SCF、IL−1、IL−4およびIL−6、とりわけ、造血サイトカインにより刺激される。また、CFU−GMはIL−9、IL−11、IL−12、ウテロフェリン(Uteroferrin)およびbFGFにも応答する。
【0048】
本明細書中で用いる、LP82に言及する場合の用語「CFU−GEMM刺激量」は、LP82が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者に存在するCFU−GEMM細胞の数の少なくとも20%、好ましくは30%、40%、50%、60%、70%、80%またはそれ以上、CFU−GEMM細胞の基底数を増加させるLP82の量を意味する。本明細書中で用いる、LP82に言及する場合の用語「造血前駆刺激量」は、LP82が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者に存在する任意の造血前駆細胞タイプの数を少なくとも20%、好ましくは30%、40%、50%、60%、70%、80%またはそれ以上、そのタイプの造血前駆細胞のベースライン数を増加させるLP82の量を意味する。本明細書中で用いる、LP82に言及する場合の用語「リンパ系(性)細胞刺激量」は、LP82が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者に存在する任意のタイプのリンパ系細胞またはリンパ系前駆細胞タイプの数を少なくとも20%、好ましくは30%、40%、50%、60%、70%、80%またはそれ以上、そのタイプのリンパ系細胞またはリンパ系前駆細胞のベースライン数を増加させるLP82の量を意味する。
【0049】
多数の血液細胞障害が、血液細胞の減少数と関連している。これらは、一般的に、貧血(減少赤血球細胞カウント)、白血球減少症(減少WBCカウント)、好中球減少症(減少好中球カウント)、血小板減少症(減少血小板カウント)および無形成性貧血(減少RBC、WBCおよび血小板)に分類することができる。貧血は、身体が充分な赤血球細胞を産生できない場合に生じ、血液の酸素運搬能力の減少を生じる。通常、癌を有する患者で生じ、また、化学療法および/または放射線療法での癌の処置の一般的な副作用である。化学療法で処置された患者の60%以上が貧血を発症している。本発明により実証されるように、LP82はCFU−GEMM細胞の数を増加させ、次いで最終的には赤血球の数を増加させ、貧血の治療に有用でありうる。
【0050】
血小板減少症は、循環血中における異常に低いレベルの血小板の存在であり、化学療法の一般的な副作用であり、出血の危険性を生じる。また、癌患者は他の薬物療法により、または元々の癌の結果として血小板減少症を体験するかもしれない。内生的サイトカイン((とりわけ)Epo、TPOおよびSCFなど)は、通常、例えば、貧血または血小板減少症に関する治療を受けている癌患者により必要とされる場合に、化学療法または放射線療法の後にアップレギュレートされる。従って、LP82ポリペプチド(またはその変異体)は、造血前駆細胞(特にCFU−GEMM細胞およびCFU−GEMM細胞に由来する細胞)の数および/またはサイクル状態の増加により、このタイプの治療の後に血小板および/または赤血球の回復の増加のための単独治療として働く可能性を有する。
【0051】
好中球減少症は、循環血中における異常に低いレベルの好中球の存在により特徴付けられる。好中球は白血球細胞の1つのタイプであり、感染と戦う身体の主な防御機構のうちの1つである。癌患者が好中球減少症を経験する最も一般的な理由は、化学療法の副作用である。
【0052】
骨髄抑制(骨髄の血液細胞産生能力の減少)を処置するために現在診療所での使用が認可されているサイトカインとしては、G−CSF、EPO、IL−11およびGM−CSFが挙げられるが、しかし、EPOおよびG−CSFのみが、貧血および好中球減少症を治療するために広範に使用される。従って、本発明は、造血障害の処置を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)または患者におけるこのような障害の治療方法または予防方法を提供し、この方法は、LP82ポリペプチドまたはその変異体を含有する医薬組成物(場合によりさらに、1種以上のタイプの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する)の治療上有効な量での投与を含む。
【0053】
造血障害の治療
本発明は、造血障害の処置を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)または患者におけるこのような障害の治療または予防方法を提供し、この方法はLP82アンタゴニスト、LP82アゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82抗体および/またはLP82ポリペプチドのうちの少なくとも1種を治療上有効な量で、場合により造血サイトカインまたは造血サイトカインアンタゴニストもしくは抗体の少なくとも1種の治療上有効な量の存在下での投与を含む。このような方法は、種々の病状および/または状況において必要とされる場合、造血、赤血球生成、白血球生成、血小板生成、好中球、単球、顆粒球および/または血小板を、このような細胞の前駆体の増殖および/または分化を刺激することにより増加させるまたは刺激するために特に有用である。このような病状および状況としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定するわけではない。
(a)不適切な血小板の産生(例えば、無形成性貧血、不応性貧血、白血病、前白血病(preleukemia)/骨髄異型症候群、巨赤芽球性貧血、化学療法または放射線療法)、および既存の血小板欠乏症または推定の血小板欠乏症(例えば、臓器/骨髄移植を含む(これらに限定されない)計画的な外科手術による)、
(b)血小板破壊の増加(例えば、特発性血小板減少性紫斑病、他の免疫性血小板減少症、HIV関連血小板減少症、敗血症/播種性血管内血液凝固および脈管炎、
(c)異常な血小板機能(例えば、グランツマン(Glanzmann)血小板無力症、急性/慢性白血病、骨髄増殖症候群、尿毒症、血小板ストレージプール疾患(platelet storage pool disease)、フォンウイルブランド病および術後心血管機能不全、ならびに
(d)他の血液凝固障害(例えば、無フィブリノーゲン血症または任意の原因の創傷)。
【0054】
血小板欠乏症に関する一般的な用語は血小板減少症であり、従って、本発明の方法および組成物は、通常、血小板減少症の治療に利用可能である。血小板減少症は、種々の理由(化学療法、放射線療法、外科手術、不慮の血液損失および他の特定の疾患状態を含む)のために存在し得る。血小板減少症に関連する、本発明に従って処置され得る代表的な特定の疾患状態は、以下のものである。無形成性貧血、特発性血小板減少症および血小板減少症を生じる特定の転移性腫瘍。また、後天性免疫不全症候群(AIDS)に関する特定の処置もまた、血小板減少症を生じる(例えば、AZT)。特定の創傷治癒障害もまた、血小板数の増加により利益を得るかもしれない。
【0055】
予測される血小板欠乏症(例えば、将来の外科手術に起因するもの)に関しては、LP82ポリペプチド、LP82アゴニストまたはそれらの変異体を、血小板が必要となる前に数日間〜数時間、投与することができる。急性状態(例えば、不慮および大量の血液損失)に関しては、LP82ポリペプチド、アゴニストおよび/またはそれらの変異体を、血液または精製血小板と共に投与することができる。
【0056】
さらに、本発明はLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82抗体およびLP82組成物を提供し、これらは造血、赤血球生成、白血球生成または血小板生成関連機能のうちの少なくとも1つに依存して細胞内シグナル伝達経路を調節する。
【0057】
LP82ポリペプチドは、T細胞活性化および/または増殖を増強または刺激し、それによりウィルスにより引き起こされる感染(HIV、免疫弱体化障害を含むが、これらに限定されない)および種々の自己免疫疾患(リウマチ様関節炎、狼瘡、移植片対宿主、宿主対移植片、インスリン依存型糖尿病、自己免疫脳脊髄炎(encephlomyelitis)および多発性硬化症を含むが、これらに限定されない)の処置に治療用途を有する。
【0058】
本発明の好ましい実施態様は、造血障害(貧血および貧血と一般的に関連している障害を含むが、これらに限定されない)の治療または予防方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物に配列番号2〜3またはその変異体で示される配列を有するLP82ポリペプチドを治療上有効な量で投与すること、場合によりまた、哺乳動物に治療上有効な量の造血サイトカインを投与することを含む。
【0059】
本発明の好ましい実施態様は、赤血球増加症、白血病を含む(しかし、これらに限定されない)造血障害の治療または予防方法を提供し、この方法はこのような治療を必要とする哺乳動物にLP82アンタゴニストを治療上有効な量で投与すること、およびまた、場合により哺乳動物に造血サイトカインアンタゴニストまたは造血サイトカイン抗体を治療上有効な量で投与することを含む。
【0060】
本発明はさらに、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82抗体および/またはLP82組成物のうちの少なくとも1つを、それらに対する1種以上の薬学的に許容されている希釈剤、キャリアまたは賦形剤と共に含有する医薬組成物を提供する。また、造血サイトカインをさらに含有するような組成物も意図される。
【0061】
本発明はまた、造血障害(貧血および/または一般的に貧血と関連している障害を含むが、これらに限定されない)を治療または予防する方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物にLP82組成物を治療上有効な量で投与することを含み、この組成物は、少なくとも1つの活性(例えば、赤血球、CFU−GMおよび/または巨核球前駆細胞の分化および/または増殖を含むが、これらに限定されない)を有する。従って、LP82ポリペプチドはこれらの効果に応じて対応する活性についてスクリーニングされ得る。
【0062】
本発明はさらに、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82核酸、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体の、貧血およびそのような状態と関連する障害の治療または予防のための医薬の製造での使用を提供する。
【0063】
本発明により意図される新規な方法としては、それぞれ、配列番号1および2に示されるLP82ポリヌクレオチドおよびLP82ポリペプチドならびにそれらの機能的フラグメント、さらに1つ以上の置換、欠失、挿入、逆転、付加またはグリシル化部位またはパターンの変更をさらに含む、対応する修飾していないLP82ポリヌクレオチドまたはLP82ポリペプチドと実質的に類似の生物学的活性および/または薬学的に所望の特性をなお有するLP82ポリヌクレオチド変異体および/またはLP82ポリペプチド変異体の、そのような処置を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)を処置してその造血細胞構成を変更するための使用方法が挙げられる。
【0064】
LP82ポリペプチド変異体
本発明において有効なLP82ポリペプチドは、配列番号2に示される配列と約95%以上、好ましくは96%以上、さらにより好ましくは、97%、98%または99%以上の配列同一性の変異体を含むことを意図する。本発明の実施態様において、単独のアミノ酸変化は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するLP82ポリペプチド内で行なわれる。あるいは、2、3、4、5、6、7または8個の変更が、配列番号2に示されるLP82ポリペプチド配列のアミノ酸約1〜約176またはアミノ酸約25〜約176の間で行なわれる。アミノ酸の変更は、挿入、置換および/または欠失でありうる。変更は連続的、独立的またはその両方の組合せであり得る。変更はNおよび/またはC末端にあるか、および/または内部に位置しているかもしれない。最も好ましくは、本発明の方法および組成物において用いられるLP82ポリペプチドは、配列番号2または3に示される配列から0または1個のアミノ酸変化を有する。
【0065】
当業者であれば理解するように、タンパク質の配列または構造に対する多数の置換および/または他の変化が、それらの生物学的活性または特性に実質的に影響を与えることなくポリペプチドに対して行われ得る。例えば、保存的アミノ酸置換の作製、またはあるアミノ酸の同じクラス(例えば、負に荷電した残基、正に荷電した残基、極性的に荷電していない残基および非極性残基または当該分野において許容される任意の他の分類)のアミノ酸由来の別のものでの変更が、機能に顕著な影響を与えることなく頻繁に行なわれる。本明細書中の表1に従って行なわれる配列番号2に示されるLP82ポリペプチド配列の修飾は、特定のアミノ酸の当該分野で認識されている代替(例えば、M.Dayhoff,In Atlas of Protein Sequence and Structure,Vol.5,Supp.3,345−352頁,1978を参照のこと)に基づき修飾していないLP82ポリペプチドと同一または実質的に類似の生物学的活性を保持するLP82変異体を生じると期待され、また本発明の方法に有用であると意図される。
【0066】
配列番号1に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体(サイレント変異を含むもの、および変異がアミノ酸配列変化を生じるものを含む)は、配列番号2の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の方法および組成物の範囲内に入ると意図される。配列番号2の対立遺伝子変異体は、当該分野において公知の標準的な手順に従って、異なる個体または組織由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングすることができる。代表的な対立遺伝子変異体は、国際特許出願WO99/27103に記載されており、本明細書中の配列番号3にも示されている。
【0067】
【表1】
【0068】
LP82変異体ポリペプチドにおけるアミノ酸変化を作製する際に考慮され得る1つの因子は、アミノ酸のハイドロパシーインデックスである。タンパク質上の相互作用的生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、KyteおよびDoolittleにより議論されている(J.Mol.Biol.,157:105−132,1982)。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与していると受け止められている。次いで、これはタンパク質と、分子(例えば、酵素、基質、レセプター、リガンド、DNA、抗体、抗原など)との相互作用に影響を与える。疎水性および荷電特性に基づき、各アミノ酸は以下のようなハイドロパシーインデックスを割り当てられている。イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸/グルタミン/アスパラギン酸/アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)およびアルギニン(−4.5)。
【0069】
当該分野において公知のように、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、類似の生物学的活性を有する結果物のペプチド(すなわち、なお生物学的機能を保持している)等を生じる。このような変更を作製する際に、±2以内のハイドロパシーインデックスを有するアミン酸で互いに置きかえることが好ましい。より好ましい置換は、±1以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。最も好ましい置換は、±0.5以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。
【0070】
また、類似のアミノ酸は親水性に基づいて置換され得る。米国特許第4,554,101号は、隣接するアミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最も高い局地的な平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを開示する。以下の親水性値がアミノ酸に割り当てられている。アルギニン/リジン(+3.0)、アスパラギン酸/グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン/グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン/ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン/イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)およびトリプトファン(−3.4)。従って、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1つのアミノ酸を類似の親水性スコアを有する別のアミノ酸で置換することができ、類似の生物学的活性を有する生成ペプチド等をやはり生じる(すなわち、やはり正確な生物学的機能を保持する)。このような変更を作製する場合、±2以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が互いに置換されることが好ましく、±1以内のものがより好ましく、±0.5以内のものが最も好ましい。
【0071】
上記に概説したように、LP82ポリペプチド中のアミノ酸置換はアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性(例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等)に基づき得る。本発明のペプチドなどの内部でサイレントな変更を生じる保存的アミノ酸変化を作製するために、種々の上記の特徴を考慮に入れた代表的な置換は、天然のアミノ酸が属するそのクラスの別のメンバーから選択され得る。アミノ酸は以下の4つのグループに分けることができる。(1)酸性アミノ酸、(2)塩基性アミノ酸、(3)中性極性アミノ酸、および(4)中性非極性アミノ酸。これらの種々のグループ内の代表的なアミノ酸としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。(1)酸性(負に荷電した)アミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸、(2)塩基性(正に荷電した)アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジン、(3)中性極性アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン、ならびに(4)中性非極性アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。
【0072】
本明細書中に記載のLP82ポリペプチド変異体と類似または同一であるインビボまたはインビトロでの生物学的活性(例えば、CFU−GEMM細胞の数を増加させる能力、赤血球および/または巨核球前駆細胞の分化および/または増殖を誘発または増加させる能力)を有するLP82ポリペプチド変異体もまた、本発明の方法に有用であり、それ自体、本発明に含まれる。LP82変異体ポリペプチドは、機能的に関連付けられると同時に、定義により、配列番号2に示す配列と1以上の位置から約10個までの位置で異なるアミノ酸配列を含む。本発明の方法に有用であるLP82変異体ポリペプチドは、配列番号2の配列を有するLP82ポリペプチド中の1つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、逆転および/または置換により作製することができる。このようなLP82変異体は、通常、例えば、表1に従う単独または複数の保存的アミノ酸置換が行なわれる固相技術または組換え技術により作製することができる。
【0073】
通常、複数の置換の場合、LP82ポリペプチド変異体の95%〜99%の残基が、配列番号2に示す対応する配列と同一であることが好ましく、LP82ポリペプチド変異体の96%〜99%の残基が、配列番号2に示す対応する隣接配列と同一であることがより好ましく、LP82変異体の97%〜99%の残基が、配列番号2に示す対応する隣接配列と同一であることが最も好ましい。好ましいLP82変異体の例としては、配列番号3に示されるLP82ポリペプチド変異体が挙げられる。配列同一性割合は、従来的な方法により決定される(例えば、Altschulら、Bull.Math.Bio.48:603−616(1986)およびHenikoff and Henikoff,PNAS USA 89:10915−10919(1992)を参照のこと)。
【0074】
本発明の方法に有用である、別のクラスのLP82変異体としては、アミノ酸置換を1つ以上さらに含有する本明細書中に定義するLP82ポリペプチドが挙げられ、これは対応する置換されていないLP82ポリペプチドと比較して改変されたグリコシル化パターンを生じている。
【0075】
用語「N−グリコシル化ポリペプチド」とは、アスパラギンの側鎖アミド中の窒素原子がグリコシル基に共有結合しているNXS/Tモチーフを1つ以上有するポリペプチドを意味する。「X」は、プロリン以外の天然に存在する任意のアミノ酸残基を意味する。「天然に存在するアミノ酸」とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシンおよびトリプトファンである。N−グリコシル化タンパク質は、場合によりO−グリコシル化されている。
【0076】
用語「O−グリコシル化ポリペプチド」は、側鎖中の酸素原子がグリコシル基に共有結合しているセリンおよび/またはトレオニンを1つ以上有するポリペプチドを意味する。O−グリコシル化タンパク質は、場合によりN−グリコシル化されている。グリコシル化ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を適切な哺乳動物宿主細胞中で発現させることにより組換え的に製造して、ポリペプチド表面上の利用可能なNXT/Sモチーフに見出される側鎖アミド、および/または表面の利用可能なセリンおよびトレオニンの側鎖アルコールのグリコシル化を生じることができる。哺乳動物細胞中で遺伝子を組換え的に発現させる具体的な方法は、本明細書中以下に記載する。グリコシル化タンパク質を製造するための他の手順は、EP640,619号に開示されており、この全技術を本明細書中に参照して組み込む。グリコシル化されていないポリペプチドは、適切な原核生物宿主細胞中で、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることにより組換え的に製造することができる。また、本発明のLP82ポリペプチドおよびLP82変異体は、グリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくともよい。グリコシル化ポリペプチドは、単糖またはオリゴ糖で1ヵ所以上修飾されている。単糖は、キラルなポリヒドロキシアルカノールまたはポリヒドロキシアルカノンであり、代表的には、ヘミアセタール形態で存在する。「オリゴ糖類」は、通常、アセタール結合により連結されている約2〜約18個の単糖類のポリマーである。通常、グリコシル化タンパク質中で見出されるグリコシル基の1つのタイプは、N−アセチルノイラミン酸である。グリコシル化ポリペプチドは、N−グリコシル化型および/またはO−グリコシル化型であり得、好ましくはN−グリコシル化型である。
【0077】
本発明の方法に有用であり得るLP82変異体の別のクラスは、N−末端および/もしくはC−末端に付加したオリゴペプチドまたはアミノ酸を少なくとも1つさらに含む、本明細書中に規定のLP82ポリペプチドが挙げられる。「オリゴペプチド」は、ペプチド結合によりN−末端およびC−末端に連結された2〜約25個のアミノ酸の鎖である。適切なオリゴペプチドおよびアミノ酸は、本明細書中に記載のLP82ポリペプチドの生物学的活性を顕著には減少させないものであり、LP82ポリペプチドの所望の薬学的および薬理学的特性を実質的には減少させない。このような修飾の好ましい例としては、他のポリペプチド(例えば、プレトリプシノーゲンリーダー配列)中に見出されるリーダー配列をさらに含む本明細書中に規定のLP82ポリペプチドが挙げられる。
【0078】
また、本発明の方法に有用なLP82変異体としては、1つ以上のポリエチレングリコール基(本明細書中以下、「PEG」基)をさらに含む、本明細書中に規定のLP82ポリペプチドが挙げられる。PEG基はLP82ポリペプチドのN−末端またはアミノ酸側鎖中のアミン基またはチオール基に結合され得る。通常、適切なPEG基は、約5,000〜40,000原子質量単位の間の分子量を有する。PEG化ポリペプチドの製造手段は、MumtazおよびBachhawat,Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 28:346,1991、およびFrancisら、International Journal of Hematology 68:1,1998に開示されている。
【0079】
また、本明細書中に規定のLP82ポリペプチドは、修飾型(例えば、融合タンパク質または「タグ化」タンパク質)で発現させ、用いることができる。LP82融合タンパク質は、天然では見出されないハイブリッドタンパク質分子を表し、これは2つ以上の異なるタンパク質、フラグメントまたはそれらの変異体が1つのポリペプチド鎖上で共有結合で連結されている、翻訳的融合物または酵素的融合物を含む。場合により、2つ以上のタンパク質がリンカー配列により分離されて融合タンパク質の各々の独立した活性を可能とするかもしれない。ヒト血清アルブミン、トロンボポエチンのC−末端ドメイン、hCGのC−末端伸長ペプチドおよび/またはFcフラグメントは、本発明で用いるためのLP82ポリペプチド、LP82フラグメントおよび/またはLP82変異体と融合することができるタンパク質の例である。本明細書中で用いる場合、抗体の「Fcフラグメント」は、この単語に免疫学の分野において通常与えられる意味を有する。具体的には、この用語は、補体に結合する抗体フラグメントを意味し、抗体から2つの抗原結合領域(Fabフラグメント)を取り除くことにより得られる。従って、Fcフラグメントは、両方の重鎖(これらは非共有結合相互作用およびジスルフィド結合により会合している)由来のほぼ等しいサイズのフラグメントから形成される。Fcフラグメントはヒンジ領域を含み、抗体のCH2およびCH3ドメインからC末端へと伸張する。融合タンパク質の製造手順は、EP394827、Traneckerら、Nature 331:84,1988、およびFaresら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4304,1992に開示されている。
【0080】
多くの融合タンパク質は、最終的なポリペプチドの製造の前に取り除くことができる領域内の外来性分泌シグナルによって分泌され得る。このような方法は当該分野において周知である。タンパク質発現および続いての精製に関する好ましい方法において、LP82遺伝子は5’末端で修飾され、発現により得られるLP82タンパク質のアミノ末端にいくつかのヒスチジン残基を組み込むことができる。この「ヒスチジンタグ」により、「固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー」(IMAC)(これは基本的には米国特許第4,569,794号に記載されており、この参考文献は本明細書中に参照して組み込む)と称される1工程タンパク質精製法を可能とする。IMAC法は、上記のような修飾型組換えタンパク質を発現する細胞の粗抽出物から開始する、組換えLP82タンパク質の実質的に純粋な迅速な単離を可能とする。
【0081】
また、本発明の方法に有用なLP82ポリペプチド変異体およびそれをコードする核酸は、配列番号2または配列番号1のいずれかに対する同一性類似性割合にに関して定義することができる。配列同一性は当該分野において周知の標準的なアルゴリズムを用いて2つの分子間の比較を意味する。この目的のために任意の適切な配列比較アルゴリズムを用いることができるが、例示のために、本実施態様では、参照配列として配列番号2を用いる周知のSmith−Watermanアルゴリズムに関して記載して比較配列に対する同一性割合を規定する。配列同一性をポリペプチドに関して用いる場合、比較にポリペプチド全体、または代わりにその規定されたサブ領域のいずれかを用いることができる。
【0082】
マッチ、ミスマッチおよび挿入または欠失に関してのパラメーター値の選択は任意である。Smith−Watermanアルゴリズムで用いるための値の好ましいセットは、「最大類似セグメント」アプローチに記載する。これはマッチした残基に値1を用い、ミスマッチした残基に−1/3を用いる(Waterman,Bulletin of Mathematical Biology,46,473−500,1984を参照のこと)。挿入および欠失(indels)であるxは、以下のように評価する。
Xk=1+k/3(式中、kは所定の挿入または欠失中の残基数である)
例えば、250個の残基の参照タンパク質配列に関して20個の置換および3個の挿入を有する比較配列は、以下の同一性を有する。
[(1×250)−(1/3×20)−(1+3/3)]/250=96%同一性。
【0083】
LP82変異体は当該分野において公知の従来的な組換えまたは固相合成技術により簡単に製造することができるので、本発明の方法は、このような変異体が対応するLP82ポリヌクレオチドまたはLP82ポリペプチドと実質的に類似の活性を保持する間は、それぞれ、配列番号1または2に示されるヌクレオチドまたはアミノ酸の隣接配列と少なくとも70%および80%の同一性を有する程度までは本発明の方法におけるLP82ポリヌクレオチドおよびLP82ポリペプチド変異体の使用を意図する。
【0084】
LP82ポリペプチド合成
LP82ポリペプチドおよびLP82変異体の機能的フラグメントは、当業者に周知の任意の数の適切な技術(配列番号2の任意の部分の化学合成、LP82ポリペプチドまたはLP82変異体のタンパク質分解的消化、最も好ましくは組換えDNA変異誘発技術を含む)により作製することができる。例えば、好ましい方法では、欠失変異のネステッドセットを、LP82ポリペプチドをコードする核酸配列に導入して、タンパク質分子のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかから種々の量のタンパク質コード領域を欠失する。また、この方法を用いてカルボキシおよびアミノ末端の両方が取り除かれている、インタクトなタンパク質の内部フラグメントを作製することができる。
【0085】
本明細書中に開示のタンパク質の機能的フラグメントは、上記のように製造することができる(好ましくは、小さいバージョンのインタクトな遺伝子を操作するためのクローニング技術を用いて、5’末端、3’末端、両方の末端、または内部から配列を欠失する)。フラグメントを、任意の適切なアッセイを用いて、生物学的活性(例えば、赤血球、巨核球またはCFU−GMもしくはCFU−GEMM前駆細胞のような造血前駆細胞の分化および/または増殖をインビボまたはインビトロで誘発または増加させる能力)を試験することができる。
【0086】
当業者であれば、LP82遺伝子を多数の組換えDNA技術(例えば、国際出願WO99/27103に記載。この文献を本明細書中に組み込む。)により入手することができることを理解する。
【0087】
当業者であれば、本発明に用いるタンパク質は、当該分野で周知の化学方法(固相ペプチド合成または組換え方法をふくむ)のような多数の異なる方法により合成することができることを理解する。両方の方法は、米国特許第4,617,149号に記載されており、参照により本明細書中に組み込む。また、本発明に有用なタンパク質は、クローニングしたLP82遺伝子を用いる組換えDNA法により製造することができる。組換え法は、高収率が望ましいならば好ましい。クローニングした遺伝子の発現は、当該分野に周知の種々の適切な宿主細胞中で行なうことができる。このために、LP82遺伝子を、当該分野に周知の任意の適切な方法により宿主細胞(例えば、原核生物、哺乳動物、酵母、SF9)中に導入する。組換え法により産生したタンパク質は、当該分野において周知の方法により形質転換細胞の細胞抽出物から精製することができる。
【0088】
本発明の方法で用いるLP82ポリペプチドは、直接発現、または場合により酵素的または化学的切断により除去し得る別のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物として目的のLP82ポリペプチドを含む融合タンパク質としてのいずれかにより、合成することができる。融合タンパク質としての発現が長期にわたり、所望のペプチドの収率を増加させ、タンパク質の精製の簡便な方法を提供することが、しばしば、組換え系における特定のペプチドの産生において観察される。これは特に、原核生物宿主での哺乳動物タンパク質を産生する場合に、関連している。特定の部位でポリペプチドを切断する、またはペプチド鎖のアミノまたはカルボキシ末端からペプチドを消化する種々のペプチダーゼが公知である。さらに、特定の化学物質(例えば、臭化シアン)は特定の部位でポリペプチド鎖を切断する。当業者であれば、部位特異的内部切断部位を組み込むためのアミノ酸配列(および組換え手段を用いる場合には合成または半合成コード配列)に必須の修飾を認識する(例えば、P.Carter,「Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins」Chapter 13、Protein Purification:From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes,American Chemical Society,Washington,D.C.(1990)を参照のこと)。
【0089】
LP82抗体
また、本発明の方法はLP82抗体を利用することができる。代表的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、2特異的およびヘテロ結合型抗体が挙げられる。
【0090】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造方法は当該分野において周知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor,NY,1989)およびHurrell,J.G.R.編、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL,1982)を参照のこと)。また、モノクローナル抗体は組換えDNA法により作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号に記載。この文献を参照して本明細書中に組み込む。)。
【0091】
当業者に明らかであるように、ポリクローナル抗体は、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリのような多数の動物から製造することができる。LP82ポリペプチドの免疫原性は、アジュバントの使用により増加させることができる。目的のポリペプチドに特異的な抗体を検出するための代表的なアッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988に詳細に記載されている。
【0092】
LP82抗体は一価の抗体であり得る。一価の抗体の製造方法は、当該分野において周知である。例えば、ある方法は、イムノグロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現に関する。一般に、重鎖を、重鎖架橋を阻害するようなFc領域の任意の点で短縮する。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を阻害するように別のアミノ酸残基で置換するか、欠失する。また、インビトロ方法も一価の抗体を製造するために適している。抗体のフラグメント、特にFabフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該分野において公知の従来的な技術を用いて達成され得る。
【0093】
本発明の方法で用いられるLP82抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、キメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖またはそのフラグメント(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原結合結果物)であり、これらは非ヒトイムノグロブリンに由来する最小配列を含有する。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定部位(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基により置きかえられているヒトイムノグロブリン(レシピエント抗体)が挙げられる。いくつかの例において、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク残基を対応する非ヒト残基と置きかえる。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または組み込んだCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含有し得る。通常、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てはヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである可変ドメインの少なくとも1つ、代表的には2つの実質的に全てを含む。また、必要に応じてヒト化抗体は、イムノグロブリン定常域(Fc)(代表的にはヒトイムノグロブリン)の少なくとも一部を含有する[Jonesら、Nature 321:522−5,1986;Riechmannら、Nature 332:323−7,1988;およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−6,1992]。
【0094】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野において周知である。本質的に、ヒト化はJonesら、Nature 321:522−5,1986;Riechmannら、Nature 332:323−7,1988;Verhoeyenら、Science 239(4847):1534−6,1988に記載の方法に従って、げっ歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置きかえることにより行なうことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、非ヒト種由来の対応する配列により、実質的により少ないインタクトなヒト可変ドメインが置換されている。また、ヒトLP82抗体は、ファージディスプレイライブラリー(HoogenboomおよびWinter,J.Mol.Biol.227:381−8,1992;Marksら、J.Mol.Biol.222:581−97,1991)を含む当該分野において公知の種々の技術を用いて産生されうる。Coleら、およびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77頁(1985)およびBoernerら、J.Immunol.147:86〜95,1991)。同様に、ヒトLP82抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子座をトランスフェニック動物(例えば、マウス)に導入することにより作製することができ、この場合、内生的イムノグロブリン遺伝子は部分的または完全に不活性化されている。抗原投与の際には、ヒトLP82ポリペプチド抗体の産生が観察され、これは全ての点(遺伝子転位、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む)でヒトにおいて見出されるものと非常に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号に記載されている。
【0095】
二特異的抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル(好ましくはヒトまたはヒト化)抗体である。本発明の場合、結合特異性のうちの1つはLP82ポリペプチドに対するものであり、他方が任意の他の抗原(好ましくは細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニット)に対するものである。二特異性抗体の製造方法は、当該分野において公知である。2つ以上の結合手を有する抗体が意図される。例えば、三特異的抗体を製造することができる(Tuttら、J.Immunol.147:60〜9、1991)。
【0096】
ヘテロ結合型抗体の使用もまた、本発明の一部として意図される。ヘテロ結合型抗体は2つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化させるように[米国特許第4,676,980号]、およびHIV感染の治療[WO91/00360、WO92/20373]のために計画されている。抗体は、合成タンパク質化学における公知の方法(架橋剤に関するものを含む)を用いてインビトロで製造することができることが意図される。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合の形成により構築することができる。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−4−メルカプトブチルイミデートが挙げられ、これらは例えば、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【0097】
本発明の方法に関するLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82変異体、LP82抗体および/またはLP82組成物の有用性は、本明細書中に記載の、あるいは当該分野において公知の方法またはアッセイの適用により、過度の実験を行なうことなく当業者により決定することができる。LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82変異体、LP82抗体および/またはLP82組成物を、本明細書中に記載のように、あるいは当該分野において公知のように、生物学的活性または機能性について試験することができる(例えば、Xunxiang DuおよびDavid A.Williams,Blood,89(11),(1997)、ならびにDonald MetcalfおよびNicos A.Nicola,The Hemopoietic Colony−Stimulating Factors(1995)を参照のこと)。同様に、本発明の方法におけるLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82変異体、LP82抗体、および/またはLP82組成物の有用性は、本明細書中に記載の造血のインビトロモデルまたはインビボモデル(実施例を参照のこと)、または当該分野において公知のアッセイを用いて評価または定量することができる。
【0098】
さらに、本発明は、哺乳動物LP82遺伝子の発現および/または哺乳動物LP82遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物を同定する方法に関する。このような化合物には、貧血のような哺乳動物造血障害の症状を減少させる、または除去する医薬組成物として用いることができる治療用化合物が含まれる。LP82遺伝子および/または遺伝子産物と相互作用する(例えば、LP82遺伝子の活性を調節する、および/またはLP82遺伝子産物に結合する)化合物を同定するために用いることができる細胞アッセイおよび非細胞アッセイを記載する。このような本発明の細胞ベースのアッセイは、LP82遺伝子産物を発現する細胞、セルライン、または遺伝子操作した細胞もしくはセルラインを利用する。
【0099】
最初に、細胞ベースの系は、造血障害の症状を改善するように作用し得る化合物を同定するために用いられる。このような細胞系としては、例えば、LP82遺伝子を発現する組換えまたは非組換え細胞(例えば、セルライン)を挙げることができる。このような細胞系を用いる際には、造血障害の症状を改善する能力を示すと思われる化合物を、LP82を発現する細胞におけるそのような症状の改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、その細胞に暴露する。暴露した後、例えば、LP82mRNA転写物に関して(例えば、ノザン分析により)、または細胞により発現されるLP82遺伝子産物に関して細胞溶解物をアッセイすることにより細胞をアッセイして、LP82遺伝子の発現における変化を測定することができる。LP82遺伝子の発現を調節する化合物は、治療薬剤として良好な候補物質である。
【0100】
さらに、動物ベースのシステムまたは哺乳動物造血障害に関するモデル(例えば、ヒトまたは改変形のLP82遺伝子を含むトランスジェニックマウス)は、障害の症状を改善する能力を同定するために使用することができる。このような動物モデルは、薬物の同定、調剤、医薬および診療のための試験物質として使用することができる。例えば、症状を改善する能力を示すと思われる化合物を、造血障害の症状のこのような改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、動物モデルに暴露してもよい。特定の処置に対する動物の反応を、障害に起因する症状の減少を評価することによりモニターすることができる。造血障害様症状に好ましい影響を与える処置は、このような障害でのヒトの治療的診療に対する候補物質とみなすことができる。試験薬剤の用量は、用量応答曲線を誘導することにより決定することができる。
【0101】
1つの実施態様において、本発明の方法は、細胞に化合物を接触させること、LP82遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定すること、およびそのレベルを化合物無しでの細胞により産生されたLP82遺伝子の発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較することを含む。化合物の存在下で得られたレベルが非存在下で得られたレベルと異なるならば、哺乳動物LP82遺伝子の発現および/または哺乳動物LP82遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物が同定されている。
【0102】
別の実施態様において、本発明の方法は、宿主(例えば、LP82トランスジーンまたはLP82変異体トランスジーンを発現する野生型またはトランスジェニック動物)に化合物を投与すること、およびLP82遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定することを含む。測定したレベルを、化合物にさらされていない宿主におけるLP82遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較する。宿主が化合物に曝された場合に得られるレベルが、宿主が化合物に曝されていない場合に得られるレベルと異なる場合、哺乳動物LP82遺伝子の発現、LP82遺伝子産物の合成または活性のいずれかを調節する化合物は本発明の方法に用いることができる。
【0103】
本発明の方法は、例えば、哺乳動物LP82遺伝子の発現および/または哺乳動物LP82遺伝子産物の合成および/または活性を調節する化合物を投与して、造血障害の症状が改善されることを含み得る。あるいは、哺乳動物造血障害がLP82遺伝子変異から生じる場合、このような方法は、損なわれていないLP82遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に補うことにより、損なわれていないLP82遺伝子産物が発現され、障害の症状が改善されることを含み得る。
【0104】
本発明の別の実施態様としては、哺乳動物造血障害の治療方法が挙げられ、これは損なわれていないLP82遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を、そのような処置を必要とする哺乳動物に投与することにより損なわれていないLP82遺伝子産物および/またはそれによりコードされるポリペプチドを細胞が発現し、障害の症状が改善されることを含む。
【0105】
LP82のポリヌクレオチド阻害
あるいは、赤血球増加症(通常よりも多い数の赤血球に関連する)のような特定の造血障害の症状は、LP82遺伝子発現および/またはLP82遺伝子産物活性のレベルを阻害することにより改善することができる。LP82遺伝子産物の合成または発現のレベルの阻害または減少方法としては、例えば、阻害的アンチセンス、リボザイムおよび3重らせんアプローチのような方法を挙げることができる。別の実施態様においては、造血障害の症状は、LP82遺伝子発現のレベルを減少させるために周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイムおよび/または3重らせん方法に関してLP82遺伝子配列を用いることにより、LP82遺伝子発現および/またはLP82遺伝子産物活性のレベルを減少させることにより、改善することができる。LP82遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力(哺乳動物造血障害の症状を改善する能力を含む)を示し得る化合物の中でも、アンチセンス、リボザイムおよび3重らせん分子がある。このような分子は、損なわれていない、または望ましい場合には変異標的遺伝子および/または異状型のLP82活性のいずれかを減少させるまたは阻害するように設計され得る。このような分子の産生および使用に関する技術は、当業者に周知である。
【0106】
アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的化されるmRNAにハイブリダイズし、タンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子mRNAに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子mRNA転写物に結合し、翻訳を妨害する。完全な相補性は、好ましいけれども必要ではない。本明細書中で称する、RNAの一部に対する配列「相補性」とは、RNAとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成し得るために充分な相補性を有する配列を意味する。従って、二重らせんアンチセンス核酸の場合、二本鎖DNAの一重らせんを試験するか、または三本鎖の形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズ能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。通常、ハイブリダイズ核酸が長ければ長いほど、RNAとの塩基ミスマッチをより多く含むかもしれず、なお安定な二本鎖(三本鎖の場合もあり得る)を形成する。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用により、ミスマッチの慣用され得る程度を確かめることができる。
【0107】
1つの実施態様において、LP82遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで用いて、内生的なLP82mRNAの翻訳を阻害することができる。アンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは、6〜約50ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。標的配列の選択にかかわらず、遺伝子発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するためのインビトロ研究を最初に行なうことが好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果を区別するためのコントロールを利用することが好ましい。これらの研究は標的RNAまたはタンパク質のレベルを内部コントロールRNAまたはタンパク質のレベルと比較することもまた、好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、コントロールオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することも予測される。コントロールオリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのものであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションを阻害するために必要な分を超えない程度でアンチセンス配列と異なることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾バージョン、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために塩基部分、糖部分またはフォスフェート骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、宿主細胞レセプターをインビボで標的化するため)、または細胞膜(例えば、Letsingerら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,6553−6556;Lemaitreら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:648;PCT公開番号W088/09810、1988年12月15日公開)もしくは血液脳関門(例えば、PCT公開番号W089/10134、1988年4月25日公開)を通る輸送を容易化するための薬剤、ハイブリダイゼーショントリガード(hybridization−triggered)切断薬剤(例えば、Krolら、1988,BioTechniques 6:958を参照のこと)またはインターカレート剤(intercalating agents)(例えば、Zon,1988,Pharm.Res.5:539を参照のこと)のような他の付属基を含みうる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガード架橋剤、輸送薬剤、ハイブリダイゼーショントリガード切断薬剤など)に結合させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の群から選択される(しかし、これらに限定されるわけではない)修飾塩基部分を少なくとも1つ含有し得る。5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルケオシン(galactosylqueosine)、イノシン、NG−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルケノシン(mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、ケオシン(queosine)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸−メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシルおよび2,6−ジアミノプリン。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む(しかしこれらに限定されるわけではない)群から選択される修飾糖部分を少なくとも1つ含有し得る。
【0108】
さらに別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート(phosphoramidate)、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはそれらのアナログからなる群から選択される修飾ホスフェート骨格の少なくとも1つを含む。
【0109】
さらに別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはa−アノマーオリゴヌクレオチドである。a−アノマーオリゴヌクレオチドは、鎖が互いに平衡に走る、相補的RNAとの特有の二本鎖ハイブリッドを形成する(Gautierら、1987,Nucl.Acids Res.15:6625)。オリゴヌクレオチドは2’−O−メチルリボヌクレオチド(Inoueら、1987,Nucl.Acids Res.15,6131)、またはキメラRNA−DNAアナログ(Inoueら、1987,FEBS Lett.215:327)である。本発明のオリゴヌクレオチドは、自動DNA合成機(例えば、Biosearch,Applied Biosystemsにより市販のものなど)の使用のような当該分野において公知の標準的方法により合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinら(1988,Nucl.Acids Res.16:3209)の方法により合成することができる。メチル−ホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御型多孔性ガラスポリマー支持体の使用により製造することができる(Sarinら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448)。標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができるが、転写非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【0110】
アンチセンス分子は、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へと送達される。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞へと送達するために多数の方法が開発されており(例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射してもよい)、または所望の細胞を表的化するように設計された修飾アンチセンス分子(例えば、標的細胞表面上で発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体へと連結されているアンチセンス)を全身的に投与することができる。しかし、内生的mRNAの翻訳を抑制するために充分な細胞内アンチセンス濃度を達成することが困難であることが頻繁にある。従って、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いpolIIIまたはpolIIプロモーターの制御下に配置されている組換えDNA構築物を利用する。患者内の標的T細胞をトランスフェクトさせるためのこのような構築物の使用は、内生的標的遺伝子転写物と相補的な塩基対合を形成する一本鎖RNAの充分な量の転写物を生じ、それにより標的遺伝子mRNAの翻訳を妨害する。例えば、ベクターを、例えば、細胞により取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を指令するように導入することができる。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを生じ得る間、エピソーム性のままであるかもしれないし、または染色体に組み込まれるかもしれない。このようなベクターは当該分野において標準的な組換えDNA技術法により構築され得、哺乳動物細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウィルスまたは当該分野において公知の他のものであり得る。
【0111】
アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物(好ましくはヒト細胞)において作用することが当該分野において公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは誘導性であってもよいし、または構成性であってもよい。このようなプロモータとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981,Nature 290:304)、ラウス肉腫ウィルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980,Cell 22:787)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1961,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982,Nature 296:39)など。任意のタイプのプラスミド、コスミド、YACまたはウィルスベクターを用いて、組織部位に直接導入され得る組換えDNA構築物を製造することができる。あるいは、所望の組織を選択的に感染させるウィルスベクターを、別の経路により達成され得る投与(例えば、全身的)の場合に用いてもよい。また、標的遺伝子mRNA転写物を酵素的に切断するように設計されているリボザイム分子を用いて標的遺伝子mRNAの翻訳を阻害し、それにより標的遺伝子産物の発現を阻害することができる(例えば、PCT国際公開WO90/11364、1990年10月4日公開、Sarverら、1990,Science 247:1222を参照のこと)。
【0112】
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒し得る酵素RNA分子である(概説に関しては、Rossi,1994,Current Biology 4:469を参照のこと)。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続いての内ヌクレオチド結合分解性切断事象に関する。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子mRNAに相補的な配列を1つ以上含まなければならず、そしてmRNA切断の原因となる周知の触媒配列を含まなければならない(この配列に関しては、例えば、米国特許第5,093,246号を参照のこと。この文献を参照して本明細書中にそのまま組み込む)。部位特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムを用いて標的遺伝子mRNAを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する2S隣接領域により指示される位置でmRNAを切断する。標的mRNAが以下の2塩基の配列を有することがただ一つの要件である。5’−UG−3’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当該分野において周知である。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子mRNAの5’末端の近くに位置するように、すなわち、効率を上昇させ、機能的ではないmRNA転写物の細胞内蓄積を最小化するために操作される。
【0113】
また、本発明のリボザイムは、RNAエンドリボヌクレアーゼ(本明細書中以下「Cech型リボザイム」と呼ぶ)を含む(例えば、Tetrahymena thermophila中に天然で存在するもの(IVSまたはL−19 IVS RNAとして公知)およびThomas Cechおよび共同研究者ら(Zaugら、1984,Science 224:574;ZaugおよびCech,1986,Science,231:470;Zaugら、1986,Nature,324:429;国際特許出願公開WO88/04300、University Patents Inc.)により広範囲に記載されているもの)。Cech型リボザイムは、標的RNA配列にハイブリダイズした後に標的RNAの切断が生じる8塩基対活性部位を有する。
【0114】
本発明の方法は、標的遺伝子内に存在する8塩基対活性部位配列を標的化するCech型リボザイムの使用を含む。アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチド(例えば、安定性の改善、標的化などのため)から構成され、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へと送達される。好ましい送達方法は、強い構成性polIIIまたはpolIIプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」DNA構築物を用いることに関し、その結果としてトランスフェクトされた細胞は内生的標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を妨害するために充分な量のリボザイムを産生する。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるので、効率のために必要とされる細胞内濃度は低い。
【0115】
また、標的型相同組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより内生的標的遺伝子の発現を減少させることができる(例えば、Smithiesら、1985,Nature 317:230;ThomasおよびCapecchi,1987,Cell 51:503を参照のこと)。例えば、内生的標的遺伝子(標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか)に相同なDNAに隣接する変異型非機能的標的遺伝子(または相補的な非関連DNA配列)を、選択マーカーおよび/またはネガティブな選択マーカー有りまたは無しで使用して、標的遺伝子をインビボで発現する細胞をトランスフェクトさせることができる。標的型相同組換えを介してのDNA構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、ES(胚性幹)細胞への修飾を用いて不活性な標的遺伝子を有する動物子孫を作製し得る農業分野に特に適している。しかしながら、このアプローチはヒトでの使用に適合させることができるが、ただし、組換えDNA構築物は適切なウィルスベクターを用いてインビボで必要とされる部位に直接投与されるか、または標的化されている。
【0116】
あるいは、内生的標的遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域(すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、体内での標的T細胞における標的遺伝子の転写を阻害する3重らせん構造を形成することにより減少させることができる(一般的には、Helene,1991,Anticancer Drug Des.,6:569;Heleneら、1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:27;ならびにMaher,1992,Bioassays 14:807を参照のこと)。
【0117】
転写の阻害のための3重らせん形成に用いられる核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Hoogsteen型塩基対ルールにより3重らせん形成を促進するように設計されなければならない(通常、二本鎖のうちの1つの鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの大きなストレッチを必要とする)。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであり、これは得られた3重らせんの3本会合鎖にわたってTATおよびCGC*トリプレットを生じる。ピリミジンが豊富な分子は、その鎖に平行な配向で、二本鎖のうちの1本鎖のプリンが豊富な領域に対して塩基相補性を提供する。さらに、プリンが豊富である核酸分子(例えば、G残基のストレッチを含む)が選択され得る。これらの分子はGC対が豊富であるDNA二本鎖と3重らせんを形成し、プリン残基のうちの大多数が標的二本鎖のうちの1本鎖に位置し、3重鎖の3本の鎖にわたりGGCトリプレットを生じる。あるいは、3重らせん形成に関して標的され得る可能性のある配列を、いわゆる「スイッチバック(switchback)」核酸分子を作製することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、交代性(alternating)5’−3’、3’−5’様式で合成し、結果として2本鎖の第1鎖を塩基対合し、次いで他方と塩基対合して、二本鎖の一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの大きなストレッチに関する必要性を排除する。
【0118】
本明細書中に記載のアンチセンス、リボザイムおよび/または3重らせん分子を用いて変異遺伝子発現を阻害する場合、この技術は、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるよりも低いかもしれない可能性を生じ得る、通常の標的遺伝子対立遺伝子により産生されるmRNAの転写(3重らせん)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を大変効率的に減少または阻害し得ることが可能である。このような場合に、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性を確実に維持するために、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし、発現する核酸分子を、遺伝子治療法(これはアンチセンス、リボザイムまたは3重らせん治療に用いられるかもしれない配列を含まない)を介して細胞内に導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、必要なレベルの標的遺伝子活性を維持するために正常な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましくあり得る。
【0119】
本発明の方法に有用なアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムおよび3重らせん分子は、上記のように、DNAおよびRNA分子の合成に関する当該分野において公知の方法により製造することができる。これらには、当該分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる(例えば、固相ホスホラミダイト化学合成など)。あるいは、RNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写により作製することができる。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む広範な種々のベクターに組み込まれうる。あるいは、用いるプロモーターに応じて、構成的または誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を、セルライン中に安定に導入することができる。
【0120】
医薬組成物
治療用途のために、治療上有効な量のLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体ならびに治療上有効な量の造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を、それらを必要とする哺乳動物に、約0.1〜10,000μg/kg/日の用量で投与する。本発明に関する方法の実施の際には、場合により、さらに造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を含むLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、LP82抗体および/またはそれらのLP82組成物を、1日に複数回、1日に1回、週に1回の投薬、または他の任意の定期的な間隔で投与することができる。投薬あたりの量および投薬の頻度は医師により決定され、疾患の性質および重篤度、ならびに患者の年齢および全体的な健康のような因子に依存する。
【0121】
また、本発明は、活性薬剤としてLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体、ならびに/またはそれらの製薬上許容される非毒性の塩、ならびに製薬上許容される固体または液体のキャリアを含有する医薬LP82組成物を提供する。例えば、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体のうちの少なくとも1つは、従来的な製薬キャリアおよび賦形剤とともに投与され得、錠剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェハ、非経口製剤などの形態で用いられ得る。LP82組成物は、約0.1重量%〜90重量%、ならびにより一般的には、約10重量%〜30重量%の活性なLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体を含有する。LP82組成物は、一般的なキャリアおよび賦形剤(例えば、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸)を含有し得る。
【0122】
一般的な提案として、非経口的に患者に投与される、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体、あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体の用量あたりの薬学的な全有効量は、約1μg/kg/日〜10mg/kg/日、具体的には2mg/kg/日〜8mg/kg/日、より具体的には2mg/kg/日〜4mg/kg/日、さらになお具体的には2.2mg/kg/日〜3.3mg/kg/日、ならびに最終的には2.5mg/kg/日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の判断のもとにある。より好ましくは、この用量は少なくとも0.01mg/kg/日である。連続投与される場合、代表的には、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体および/または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の投薬速度で、1日1〜4回の注射、または、例えばミニポンプを用いる連続皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用することができる。変化を観察するために必要とされる治療の長さ、ならびに反応が生じるための治療の後の間隔は、おそらく所望の効果に応じて変化する。
【0123】
LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体、ならびに/あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を含む医薬組成物は、経口的、経直腸的、頭蓋内、非経口的、くも膜下槽内(intracisternally)、膣内、腹膜内、局所的(散剤、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして)、経皮的、髄膜下、経頬粘膜または経口もしくは経鼻スプレーとして、投与され得る。「製薬上許容されるキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液体の増量剤(filler)、希釈剤、アジュバント、カプセル化材料、または任意のタイプの処方補助物質(auxiliary)を意味する。本明細書中で用いる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内への、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体を含む注射、注入およびインプラントを含む投与態様を含むが、これらに限定するわけではない。
【0124】
化合物は経口または非経口投与のために処方することができる。皮下投与のために好ましい経口製剤は、緩衝剤(リン酸、クエン酸、酢酸、ホウ酸、TRIS)、塩(NaCl、KCl)、二価金属(Zn、Ca)および等張化剤(グリセロール、マンニトール)、界面活性剤(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ジクサートナトリウム(ddicusate sodium)、ラウリル流酸ナトリウム)、抗酸化剤(アスコルビン酸)、および抗菌剤(フェノール、m−クレゾール、アルコール、ベンジルアルコール、ブチルパラベン(butylparben)、メチルパラベン(methylparaben)、エチルパラベン、クロロクレゾール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベンを含有してもよい。
【0125】
静脈内(IV)用途のため、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体および/または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は一般的に用いられる静脈内流体中で投与され、注入により投与される。生理的生理食塩水、リンゲル溶液、または5%デキストロース溶液のような流体が用いられ得る。
【0126】
筋肉内製剤に関しては、滅菌処方物(好ましくは、適切な可溶性塩形態)のLP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体ならびに/または造血サイトカインもしくは造血サイトカイン抗体(例えば、塩酸塩)を薬学的な希釈剤(例えば、発熱物質不含水(滅菌)、生理的生理食塩水または5%グルコース溶液)に溶解し、投与することができる。適切な不溶性形態の化合物を、水性ベースまたは製薬上許容されるオイルベース(例えば、オレインエチルのような長鎖脂肪酸エステル)中の懸濁液として製造し、投与することができる。
【0127】
また、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/もしくはLP82抗体ならびに/または造血サイトカインもしくは造血サイトカイン抗体を、徐放性システムにより適切に投与する。徐放性組成物の適切な例としては、成形物品の形態での半透過性ポリマー性マトリックス(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)が挙げられる。徐放性マトリックスは、ポリラクチド(米国特許第3,773.919号、EP58,481)、L−グルタミン酸とγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidman,U.ら、Biopolymers 22:547−556(1983))、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(R.Langerら、J.Biomed.Mater.Res.15:167(1981)およびR.Langer,Chem.Tech.12:98(1982))、エチレンビニルアセテート(R.Langerら、同上)またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP133,988)が挙げられる。また、他の徐放性組成物としては、リポソーム閉じ込め式修飾型(liposomally entrapped modified)LP82ポリペプチドおよび/またはそのフラグメントおよび/またはその変異体が挙げられる。このようなリポソームは、本質的に公知の方法により製造される(DE3,218,121;EP52,322;EP36,676;EP88,046;EDP143,949;EP142,641;日本特許出願第83−118008号;米国特許出願第4,485,045号および同第4,544,545号;およびEP102,324)。通常、リポソームは小さく(約200〜800オングストローム)単層タイプのものであり、これは脂質含量が約30mol%コレステロールを超え、この選択した割合は最適な治療のために調節される。
【0128】
非経口投与のため、1つの実施態様では、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体および/または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、通常、所望の程度の純度で、単位投薬注射形態(液剤、懸濁剤または乳剤)中で製薬上許容されるキャリア(すなわち、用いる投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性のものであり、製剤中の他の成分と適合性であるもの)と混合することにより製剤化することができる。好ましくは、製剤は、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含有しない。
【0129】
通常、製剤は、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体、ならびに/あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を、液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアもしくはその両方と、均一および密接に接触させることにより製造する。次いで、必要であれば、製品を所望の製剤に成形する。好ましくは、キャリアは非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性ビヒクル(例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチル、ならびにリポソームもまた、本明細書中において有用である。
【0130】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増加させる物質のような添加剤を少量、適切に含有する。このような物質は、用いる用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これにはリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、ポリアルギニンまたはトリペプチドのような低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物、EDTAのようなキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン、および/またはポリソルベート、ポロキサマーまたはPEGのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【0131】
LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82機能的フラグメント、LP82変異体、および/またはLP82抗体ならびに/あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、代表的に、このようなビヒクル中に約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは1〜10mg/mlの濃度で、約3〜8のpHで処方される。上記の賦形剤、アジュバント、キャリアまたは安定化剤の特定の使用により、特定の活性成分の塩の形成が生じることが理解される。
【0132】
治療上の投与のために用いられる組成物は滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌ろ過メンブレン(例えば、0.2ミクロンメンブレン)を通してのろ過により簡単に達成される。通常、治療用組成物を滅菌アクセスポートを有する容器(例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアル)内に配置し、続いて皮下注射針で穿刺可能なストッパーを有するようにシールする。
【0133】
製薬上有用なLP82組成物および造血サイトカイン組成物は、通常、水溶液または再構築のための凍結乾燥製剤として単位用量または複数回用量の容器(例えば、シール型アンプルまたはバイアル)中に保存される。凍結製剤の例として、10mlのバイアルに滅菌ろ過したLP82組成物のうちの1つの1%(w/v)水溶液5mlを充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注射用静菌水を用いて凍結乾燥ポリペプチドを再構築することにより、注入溶液を作製する。
【0134】
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分の1つ以上を充填した容器を1つ以上含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により規定されている形態の注意書きがこのような容器に添えられるかもしれない。この注意書きは、ヒト投与に対する製造、使用または販売の政府機関による認可を反映する。
【0135】
併用療法
さらに、造血疾患状態の治療において、単独または他のサイトカイン、可溶性Mplレセプター、造血因子、インターロイキン、増殖因子または抗体との組合せ、好ましくは本明細書中に記載の造血サイトカインと組み合わせての本発明の治療方法もまた、使用され得る。本発明の治療方法は、いくつかの形態の血小板減少症、貧血、白血病、骨髄移植(trans)の治療に有用であり、IL−3またはGM−CSFのような造血の一般的な刺激物質との組み合わせに有用であると判明している。他の巨核球刺激因子(すなわち、meg−CSF、幹細胞因子(SCF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM(OSM)または他の巨核球刺激活性を有する分子)もまた、LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82変異体および/またはLP82抗体のうちの少なくとも1つと組み合わせて用いることができる。このような同時投与のためのさらなる例示的なサイトカインまたは造血因子としては、以下のものが挙げられる。IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−22、IL−24、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロン−α(IFN−α)、コンセンサス(consensus)インターフェロン、IFN−β、IFN−γ、トロンボポエチン(TPO)、アンジオポエチン(例えば、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y)、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管上皮成長因子(VEGF)、アンジオゲニン、骨形成タンパク質−1〜15、骨形成タンパク質レセプター1a、骨形成タンパク質レセプター1b、脳由来神経栄養(neutrophic)因子、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子レセプター、上皮細胞成長因子、内皮由来好中球誘引物質、繊維芽細胞成長因子4〜10、酸性繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor acidic)、塩基性繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor basic)、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプター、へパリン結合上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、幹細胞成長因子レセプター、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子レセプター、インスリン様成長因子11、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプターa、神経成長因子、神経成長因子レセプター、ニュートロフィン−3、ニュートロフィン−4、胎盤成長因子、胎盤成長因子2、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子(血小板由来成長因子A鎖、血小板由来成長因子AA、血小板由来成長因子AB、血小板由来成長因子B鎖、血小板由来成長因子BBおよび血小板由来成長因子レセプターを含むがこれらに限定しない)、前B細胞成長刺激因子、幹細胞因子レセプター、腫瘍壊死因子(TNFO、TNFI、TNF2を含む)、形質転換増殖因子u、形質転換増殖因子P、形質転換増殖因子P1、形質転換増殖因子P1.2、形質転換増殖因子P2、形質転換増殖因子P3、形質転換増殖因子P5、潜伏(latent)形質転換増殖因子P1、形質転換増殖因子P結合タンパク質1、形質転換増殖因子P結合タンパク質2、形質転換増殖因子P結合タンパク質3、腫瘍壊死因子レセプター1型、腫瘍壊死因子レセプター2型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプター、血管内皮成長因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的または免疫学的に活性なフラグメント。さらに、同時または連続的のいずれか(前または後のいずれか)で、可溶性哺乳動物Mplレセプター(これは、一旦成熟形態に至った巨核球を血小板へと破片にする効果を有する)を有効量投与することはさらに有用であり得る。従って、可溶性Mplレセプター(リガンドを不活性化させて成熟巨核球に血小板を産生させるため)の投与と組み合わせての、上記の追加の因子のうちの少なくとも1つと組み合わせてのLP82組成物の投与により、血小板産生を刺激する特に有効な手段が期待される。上記の用量は、治療用組成物におけるこのような追加の成分を補うように調節される。1つ以上のさらなる治療用薬剤と組み合わせての投与には、同時(併用)および任意の順番での連続投与が挙げられる。治療する患者の進行は、本明細書中に記載のアッセイ、あるいは当該分野において公知のアッセイによりモニターすることができる。
【0136】
以下の実施例は本発明をより充分に記載する。当業者であれば、記載の特定の試薬、装置および手順が単に例示であり、いかなる様式においても本発明を制限することは意図しないことを認識する。
【実施例】
【0137】
実施例1:LP82トランスジェニックげっ歯類開発
A.トランスジェニック構築
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを合成し、全長コード領域および周囲配列を含むプラスミドからLP82コード領域を増幅するために用いた。
【化1】
5’プライマー(配列番号4)はAscI制限酵素部位(下線)およびKozak配列を組み込み、一方、3’プライマー(配列番号5)はクローニングを容易にするためにNotI制限酵素部位を組み込んだ。増幅した約0.7kbのフラグメントをプラスミドpK409(pFastBac発現ベクターの誘導体、Gibco BRL)のマルチクローニング部位(AscI〜NotI)に連結した。続いて、LP82Flag[pEW1943]を用いて構築したベクターをAscI〜XhoIで消化し、MluI〜XhoI部位でpLIV7(John Taylor,Gladstone Institutesより供与)にクローニングしてプラスミドpLIV7/LP82Flag−pEW3033を作製した。
【0138】
当業者であれば、LP82のヌクレオチド配列、配列番号1に示す周囲配列および当該分野において標準的な技術を用いてヒトDNAまたは他の哺乳動物DNAにおけるLP82遺伝子を増幅するための多数の別のPCRプライマーを簡単に設計することができる。
【0139】
B.トランスジェニック動物開発
確立されている技術(Hogan,B.ら、(1986)Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,NY、FoxおよびSolterによる改変(Mol.Cell.Biol.8:5470,1988)を用いてトランスジェニックマウスを作製した。簡単に説明すると、ヒトアポリポプロテインE(hApoE)遺伝子プロモーター−5’hApoE非翻訳領域−LP82/FLAG肝臓制御配列(HCR)融合遺伝子を取り巻く6.4kbのDNAフラグメントをSalIおよびSpeIを用いての消化によりプラスミドpLIV7−LP82から切りだし、ゲル電気泳動およびガラスビーズ抽出により精製した。hApoE遺伝子プロモーター−5’hApoE非翻訳領域−LP82−HCR融合遺伝子を含む精製DNAフラグメントを、FVB/N系統の受精したばかりの1細胞期胚(接合体)の雄性前核にマイクロインジェクションした。胚をインビトロで一晩培養して2細胞期まで発生させる。次いで、2細胞期の胚を擬性妊娠させたICR系統マウスの卵管に移植し、出産まで発達させた。新生児マウスにおけるトランスジーンの存在について試験するために、足指の小さい破片を各動物から取り、プロテイナーゼKを用いて消化して核酸を放出させた。続いて、足指抽出物のサンプルを、hApo非翻訳領域に特異的なプライマーを用いるPCR分析にかけてトランスジーン含有マウスを同定した。5匹の創始(founder)トランスジェニックマウスを同定した。これらの各創始体を交配させてF1およびF2世代を作製した。トランスジェニック仔マウスのうちの多数は出生後、最初の数日以内に死ぬ(これらは体のサイズが小さく、厚い表皮にしわが寄っていた)。同腹子の非トランスジェニックマウスはトランスジェニックマウスよりも明らかに大きく、トランスジェニックマウスの生存をより良く確実にするために同腹子から取り除いた。トランスジェニックマウスは脾臓に野生型マウスの約2倍の数のCFU−GEMMを有する(実施例2を参照のこと)。
【0140】
実施例2:LP82トランスジェニックマウス造血前駆細胞
マウス骨髄細胞および脾細胞を、LP82トランスジェニックマウスおよび年齢が適合する野生型マウスから単離した。次いで、各マウスの骨髄由来の単核細胞を1×105細胞、または脾臓由来の単核細胞を1×106細胞を、当該分野において公知の標準的なプロトコルを用いて、0.1mMへミン存在下でメチルセルロース(Stem Cell Technologies)中で培養した。以下の組換え成長因子の組合せ(200ng/ml)を用いてコロニー増殖を刺激した。:培地A:Epo(1U/ml,R&D System)およびSCF(50ng/ml,R&D System)およびPWM−SCM(5%培地で順化5%,Stem Cell Technologies)または培地B:Epo 1U/ml。37℃で7日間細胞を培養した後、倒立顕微鏡のもとで各ディッシュから異なるタイプのコロニーをカウントした。グループの平均値およびSDを計算した。以下の表2のデータは各グループの20匹のマウスからの平均値±標準偏差をあらわす。骨髄の値は大腿骨1本あたりのものであり、脾臓の値は脾臓1個あたりのものである。
【0141】
【表2】
【0142】
LP82トランスジェニックマウスは、試験した両方のタイプの条件で骨髄および脾臓の両方で約2倍の数のCFU−GEMMを有した。また、LP82の存在により、いくつかの条件においてBFU−EおよびCFU−GM細胞の数の増加を導いた。
【0143】
実施例3:LP82トランスジェニックマウスにおけるHCT回復の上昇
10〜12週齢のLP82トランスジェニックマウスおよび年齢が適合する野生型マウスを、全身照射合計400radの骨髄抑制治療に曝し、続いてKaushanskyら(J.Clin.Invest 96:1883,1996)に記載されているようにカルボプラチン0.8mgの腹膜内注射を1回行なった。比較グループに関しては、組換えヒトEpoを12日間、毎日20IUで皮下注射した。血液カウントを、Hemavet1500血液学分析器(CDC Technologies)を用いて後眼窩(retro−orbital)経路により得たサンプル50μlでおこなった。図2に示すように、LP82トランスジェニックマウスは野生型マウスと比較してヘマトクリット(HCT)の回復が顕著に上昇し、これはLP82の発現が骨髄抑制治療の後のRBCおよびHCTの回復を上昇させることを示す。
【0144】
実施例4:LP82はCFU−GEMMのサイクル状態を増加させる
骨髄細胞および脾細胞を、10匹のLP82トランスジェニックマウスおよび10匹の野生型マウスから単離した。へミン存在下のメチルセルロース培養培地中に細胞をプレーティングする前に、各マウス由来の個々のサンプルを比活性の高いトリチウム化チミジンを用いて20〜30分間パルスした。コントロールサンプルの細胞はトリチル化チミジンでパルスしない。この分析により、前駆細胞をマウスから取り出した時点での細胞のサイクル状態の推定を可能にした(すなわち、細胞サイクルのS期における前駆細胞の割合)。S期の細胞サイクルの細胞のみ、トリチル化チミジンで標識される。トリチル化チミジンは組み込んだ細胞を致死的に照射するので、分裂することができなくなる。コントロールサンプル中に存在するコロニーの数からトリチル化サンプル中に生存している数を差し引いた差異は、標識前のS期の細胞の数に等しい。コロニー増殖を、Epo(2U/ml)、SCF(50ng/ml)、PWM−SCM(5%)およびへミンで刺激した。以下の表3に示すように、LP82トランスジェニックマウスは、CFU−GEMMのサイクル状態を統計上有意に増加させた。
【0145】
【表3】
【0146】
実施例5:LP82のマウスへの投与はCFU−GEMMの数を増加させる
【0147】
8〜10週齢の雌性BDF1マウス(Harlan,Indianapolis)のグループを研究に用いた。後眼窩経路により実験の7日前にマウスを採血してベースライン血液細胞カウントを得た。以下を用いて、グループを11日間1日2回注射(s.c.)した。
【0148】
1001−3:希釈剤(PBS+0.5%相同マウス血清)
2001−3:希釈剤中のLP82(注射1回あたり5μg)
3001−3:希釈剤中のEpo(注射1回あたり10単位)
4001−3:希釈剤中のLP82+Epo(上記と当量)
5001−3:希釈剤中のSCF(1.5μg/注射)+Epo(10単位/注射)
6001−3:希釈剤中のLP82+Epo+SCF(上記と当量)。
【0149】
次いで、マウス由来の骨髄細胞を回収し、30%ウシ胎仔血清およびへミンの存在下でメチルセルロースベースの培地中で培養した。コロニー増殖はEpo(2U/ml,R&D System)、SCF(50ng/ml、R&D System)およびIL−3(R&D System)で刺激した。BFU−E、CFU−GMおよびCFU−GEMM細胞のコロニーを倒立顕微鏡下でスコアした。大腿骨1本中の各種類の前駆体の総数を各マウスについて計算した。
【0150】
以下の表4に示すように、単独での、または他のサイトカインと組合せたLP82は、マウスCFU−GEMMの数をインビボで顕著に増加させた(大腿骨1本あたり)。LP82+Epo+SCFで処置したマウス(Epo+SCFと比較)のCFU−GM細胞およびLP82+Epoで処置したマウス(Epoと比較)のBFU−E細胞の顕著な増加もまた、観察された。データは、LP82が造血前駆細胞に作用し、例えば、化学療法の次の貧血、血小板減少症および好中球減少症を治療するために用いることができることを支持する。
【0151】
また、注射後8および12日目に研究中のマウスを採血した。マウス血液に最適化した設定のHemavet 1500血液分析機械で血液サンプルを分析した。結果を、以下の式を用いて計算した規定値からの増加割合として以下の表5に示す。
((実験グループの平均変化−希釈剤グループの平均変化)/実験グループの予備処理平均)×100。
【0152】
データは、規定値からの増加割合が12日目に試験した全てのパラメーターについてのLP82+SCF+Epoに関するものよりも高いことを実証した。8日目に、Epo+SCFと比較して、LP82+Epo+SCFについて血小板、白血球および好中球に関してより高い増加を観察した。これは、SCF投与の効果は一過性であり、7〜8日目にピークを有するという当該分野における知見と一致する(Ulichら、Blood,78:645−50,1991)。
【0153】
【表4】
【0154】
【表5】
【0155】
実施例6:造血モジュレーターに関してのインビトロ試験
A.ヒト巨核球アッセイ
LP82ポリペプチドを、CD34+前駆細胞に由来するヒト巨核球の発生を刺激する能力についてアッセイすることができる。CD34+選択細胞を記載されるように骨髄から入手し(Hokom,M.ら、Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15,1994)、2mMグルタミン、2−メルカプトエタノール(10−4M)、1%ウシ血清アルブミン、低密度リポプロテイン(40μg/ml,Sigma)、ウシ膵臓インスリン(10μg/ml)、ヒトトランスフェリン(200μg/ml)、ヒト組変えトロンボポエチン(50ng/ml,R&D System)、ヒト組変え幹細胞因子(50ng/ml,R&D Systems)および+/−単離LP82(200ng/ml)を加えたイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM;GIBCO, Grand Island,NY)中でインキュベートした。CD34+細胞をStemCell Technologies(Vancouver,Canada)から購入した2ウェルチャンバスライドで3300細胞/mlの最終濃度でプレーティングする。細胞を、5%CO2大気の加湿ボックス中で37℃で12日間、インキュベートする。次いで、1:3のメタノール:アセトン溶液を用いて細胞を直接培養ウェルに固定し、モノクローナル抗体である抗−GPIIb/IIIa(StemCell Technologies)でインキュベートする。免疫反応系を、ビオチン結合型ヤギ抗マウスIgG、続いてアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体を用いて発色させ、桃色により同定し、100倍の倍率で倒立位相差顕微鏡を用いてカウントする。LP82非存在下、47個の巨核球コロニーが観察され、LP82(200ng/ml)存在下、65個の巨核球コロニーが観察された。
【0156】
B.骨髄液体培養物に対するアッセイ
CD34+ヒト骨髄細胞(Poietics,Inc.)をポリプロピレンV底96ウェルプレートに、10,000細胞/ウェルで、3ウェル/グループでプレーティングする。幹細胞因子(SCF)を10ng/mlで用い、インターロイキン−3(IL−3)を0.1ng/mlで用い、エリスロポエチン(EPO)を1U/mlで用い、LP82を400ng/mlで用いる。以下のサイトカイン条件をIMDM/30%FBS+抗生物質中で試験する。
1.SCF/IL−3/(±LP82)
2.IL−3/EPO/(±LP82)
3.SCF/IL−3/EPO/(±LP82)
4.SCF/IL−3/MCSF*
5.SCF/IL−3/EPO/TGFβ*
*MCSFはマクロファージ刺激因子であり、TGFβは形質転換増殖因子βである。
【0157】
サンプル1(SCF+IL−3)は追加の因子(例えば、LP82)が存在しない最小限の増殖が期待されるネガティブコントロールである。サンプル2(IL−3+EPO)は追加の成長因子が存在しない最小限の増殖が期待されるネガティブコントロールである。サンプル3(SCF+IL−3+EPO)は追加の因子が存在しない条件下で強い赤血球増殖および/または分化を生じることが期待され、また、SCF+IL−3またはIL−3+EPOを第3の因子の非存在下(+または−LP82)で用いた場合に観察される量を超える量の赤血球増殖および/または分化を生じる。サンプル4(SCF+IL−3+MCSF)を用いて、MCSF非存在下でSCF+IL−3を用いる場合(+または−LP82)と比較して、顕著な単球増殖および/または分化を実証する。サンプル5(SCF+IL−3+EPO+TGFβ)を用いて、TGFβ非存在下でSCF+IL−3+EPOを用いる場合(+または−LP82)と比較した場合の、赤血球増殖および/または分化の調節を実証する。
【0158】
培養は、蒸発を防止するために通気性シールメンブレンを用いて、5%CO2、95%湿度で37℃で10日間、インキュベートする。栄養補充(feeding)は、培地400μlを新しい培地に交換することにより4および7日目に行なう。10日目に細胞をV底プレートに移し、CD14(FITC)およびCD36(PE)細胞表面抗原で染色する。細胞を遠心分離し、50μg/mlヒトIgG(Sigma)と共に4℃で15分間インキュベートする。単球はCD14+であり、赤血球株の細胞はCD36+であり、CD14およびCD36の両方に対してネガティブである細胞は「未確定」と呼び、これは続いて単球または赤血球へと分化し得る。診断抗体(単球に対してはαCD14−FITC(Miltenyi Biotec)であり、赤血球細胞に対してはαCD36−PE(BD Pharmingen)である)をさらに15分間加える。洗浄(リン酸緩衝化生理食塩水、0.1%ウシ血清アルブミン)の後、細胞を最終容量1ml(0.1ml FlowCount Fluorospheres(Coulter)含有)でチューブ(12×75mm)に移す。次いで、細胞を、一定(constant)FlowCount Fluorosphere数(例えば、5000)に基づいてフローサイトメーターで得る。データの分析は、各ウェル中に存在する各系列の細胞数を決定することにより行う(これは、サンプル中の既知数の蛍光体に基づいて計算する)。全細胞、単球細胞、赤血球細胞および未確定系列(CD14−およびCD36−マイナス)の数を決定する。データを、JMP4ソフトウェアを用いて統計分析に供する。未知(unknown)は、ダネット検定(p=0.01)を用いてネガティブコントロールと比較する。データを以下の表6に示す。
【0159】
【表6】
【0160】
データは、幹細胞因子、インターロイキン3およびエリスロポエチンの存在下でLP82が全細胞、赤血球および未確定(赤血球または単球ではない)の細胞の数をネガティブコントロールよりも多く誘導することを示す。
【0161】
C.LP82はCFU−GEMMの数を増加させる
CD34+細胞を、標準的な手順を用いてメチルセルロース培養物またはAgar培養培地(Stem Cell Technologies)に播種した。コロニー増殖は、LP82(200ng/ml)有りまたは無しで、以下の組換え増殖因子の組合せを用いて刺激した。(1)Epo(2U/ml)+SCF(50ng/ml)および(2)Epo+SCF+IL−3(10ng/ml)。市販のサイトカインは全てR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入した。37℃で2週間培養した後、異なるタイプのコロニーを、倒立顕微鏡下で各ディッシュからカウントした。結果を以下の表7に示す。LP82は、最終的には赤血球、顆粒球、単球および血小板へと分化するCFU−GEMMの数を顕著に増加させ、CFU−GMの数をわずかに増加させた。
【表7】
実施例7:造血モジュレーターに関する、正常マウスでの追加のインビボ試験
A.骨髄移植の後の血液細胞の回復に関するアッセイ
RPMI培地(10%ウシ胎仔血清含有)を用いて正常8〜10週齢Balb Cマウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapoils,INから購入)の後足を穏やかに洗浄することにより骨髄(BM)を回収した。いくつかの実験に関して、ドナーマウスを、BMの回収前に3日間、5−フルオロウラシル(5−FU)(150mg/体重1kg)で腹膜内注入して注射用に予備処理する。約10.8Gy(126cGy/分で137Cs、投薬間隔最短3時間での分割投薬)での全身照射の後、1×106骨髄細胞を、致死量で照射したマウスに静脈内注射(IV)する。LP82(250μg/体重1kg)をPBSで希釈し、毎日0.2ml容量を皮下注射する(これは照射およびドナー骨髄細胞の注入と同日から開始する)。コントロールマウスには同体積のPBSを投与した。LP82ポリペプチドの投与は0〜17日目に行なう。移植後の期間の間、マウスを4日ごとに秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、CDC HemavetTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright−Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。ヘマトクリットは、Model MB Micro−Capillary Centrifugeを用いてキャピラリーチューブを5分間スピンさせることにより行なう。従って、LP82ポリペプチドを用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
【0162】
B.化学/放射線療法併用後の血液細胞の回復に関するアッセイ
8〜10週齢のBDF1マウス(Harlan Sprague Dawley)に、カルボプラチン(60mg/体重1kg)を腹膜内投与(IP)した1時間後に致死量未満の照射(20〜22mgのマウスに対して0.5Gy全身照射)を行なう。LP82ポリペプチド(EPOまたはG−CSF有りまたは無し)を、毎日0.2mlの体積で皮下注射する(これは照射と同日に開始する)。ネガティブコントロールマウスには処置マウスと同体積のPBSを投与する。LP82ポリペプチド投与は17日間続ける。マウスを、照射後、種々の日に分析する。マウスを照射後の期間の間、2〜4日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、CDC HemavetTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright−Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。ヘマトクリット測定は、Model MB Micro−Capillary Centrifugeでキャピラリーチューブを5分間スピンさせることにより行なう。LP82ポリペプチドは、化学および/または放射線療法後の抹消血液細胞カウントの回復の加速に有用であり得る。
【0163】
C.貧血の処置に関するアッセイ
貧血および造血障害の種々の動物モデルは当該分野において公知であり、通常、貧血病態の指標であると受け入れられている。例えば、前低酸素性赤血球増加症(exhypoxic polycythemic)マウスバイオアッセイを用いて、外来的に投与した試験サンプル(例えば、推定LP82アゴニスト、LP82アンタゴニスト、LP82ポリヌクレオチド、LP82ポリペプチド、LP82フラグメント、LP82変異体および/またはLP82抗体)に反応してのマウスにおける赤血球生成の上昇の指標として5’Fe(鉄)の新規に合成された赤血球細胞への取込を定量することができる。WO/0024893(本明細書中に参照して組み込む)に記載のアッセイは、CotesおよびBangham(Nature 191:1065(1961))の方法の変法である。
試験薬剤は任意の種々の投与経路(例えば、i.v.、s.c.、i.p.またはミニポンプまたはカニューレによる)により投与することができ、適切な試験動物としては、実施例1の記載と同様に正常マウスならびにLP82トランスジェニックマウスが挙げられる。これらの処置に対する非特異的効果についてのコントロールは、類似の組成の活性薬剤を用いて、または用いずに、ビヒクルを使用して、同じタイプの動物で同じパラメーターをモニターすることにより行なわれる。
【0164】
実施例8:抗原性刺激の際にLP82を発現する脾細胞の増殖およびサイトカイン分泌
平底96ウェルプレートを5μg/mlα−CD3/ウェルを含む100μl培地(RPMI,10%FBS)でコーティングする。プレートを1.5時間、37℃でコーティングし、吸引し、PBSで2回洗浄する。次いで、培地体積100μl中の4×105脾細胞を各ウェルに加え、プレートを37℃で48時間、インキュベートする。プレートを1200rpmで5分間遠心分離した後、各ウェルからの上清100μlを取り出し、96ウェルU底プレートに移し、そのうちの10μlを標準的な手順に従ってサイトカイン分泌イムノアッセイに用いる。細胞の残りを1μCiの3H−チミジン/ウェルでパルス標識し、計測前にさらに24時間インキュベートする。抗−CD3による脾細胞の活性化に加えて、他の刺激を同じ様式で試験することができる。試験する好ましい刺激としては、IL−2(2.5ng/ml)の希釈物、ConA(8μg/ml)の希釈物、PMAの1μMイオノマイシン(ionomycin)での希釈物、およびLPS(100μg/ml)が挙げられる。
【0165】
実施例9:LP82トランスフェニックマウスの致死量未満の用量での放射線への暴露
両方の性別の野生型およびトランスジェニックマウスを600cGyで照射する。マウスを、照射後3、7、10、14、21、28日目に分析する。マウスを照射後の期間に2日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、CDC MascotTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright−Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。抹消血ヘマトクリットは、Model MB Micro−Capillary Centrifugeを用いてキャピラリーチューブを5分間スピンさせることにより行なう。致死量未満の用量での放射線に対する照射後に、LP82を用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
【0166】
CFU−GEMM細胞の絶対数および/またはサイクル状態の増加により、単独または他のサイトカインと組み合わせてLP82を用いて、貧血、血小板減少症、好中球減少症(neuropenia)および他の造血および免疫障害を治療することができる。
【0167】
実施例10.ラージスケールでのLP82ポリペプチドの精製
LP82(FLIS−タグ化−LP82を発現する細胞から分泌)を含有する細胞培養培地Amicon S3Y10 UFメンブレンを用いて、Amicon ProFlux M12接線(tangential)ろ過システムで濃縮する。濃縮培地を固定金属アフィニティークロマトグラフィーカラム(Pharmacia)に流速2ml/分で通す。カラムを、吸光度が基底地に戻るまで緩衝液A(PBS(1mMリン酸カリウム、3mMリン酸ナトリウム)、0.15M NaCl、pH7.4、50mMイミダゾール含有)で洗浄する。結合型ポリペプチドを、100%緩衝液A〜55%緩衝液Aの勾配で溶離させ、70分展開させる。次いで、勾配を20分間かけて、100%緩衝液B(0.5Mイミダゾールを含有する緩衝液A)まで段階的に上げる(stepped)。LP82を含有する画分をプールし、Ultrafree濃縮ろ過ユニット(Millipore、10kDa分子量カットオフ)を用いて14mlまで濃縮する。この材料を、PBS(0.5M NaCl、pH7.4)で平衡化したSuperdex75(Pharmacia,26/60)サイズ画分カラムに流速3ml/分で通す。LP82を含む画分をSDS−PAGEにより分析する。LP82のN−末端配列を、標準的技術を用いて精製ポリペプチドで確認した。
【0168】
実施例11:混合リンパ球反応系でのLP82脾細胞の増殖
混合リンパ球反応アッセイにおいて、マイトマイシンCで処理した後にDBA/2マウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)由来の脾細胞を刺激細胞として用いることができる。応答細胞は、LP82遺伝子またはネイティブなマウスで移植したC57Bl/6マウス(Harlan Sprague Dawley)から単離した脾細胞である。応答T細胞の懸濁液を同種刺激リンパ球と共に培養する。活性化刺激は、同種刺激細胞で発現させた外来性組織適合性抗原(通常、MHCクラスIまたはクラスII分子)である。
【0169】
簡単に説明すると、DBA/2由来の脾細胞をRPMI+10%FBSおよびPen/Strep中で96−ウェルプレートに1×106細胞/ウェルで加える。年齢適合C57Bl/6ネイティブマウスまたはレトロウィルス発現型LP82マウスのいずれか由来の脾細胞を、0.5、1、2、4または8×105細胞/ウェルのいずれかで応答細胞としてウェルに加える。コントロールウェルは、DBA刺激脾細胞単独、またはC57Bl/6応答脾細胞単独を含有した。インビトロで72時間後、ウェルをトリチル化チミジン1μCiでパルス標識する。18時間後、細胞を回収し、カウントする。
【図面の簡単な説明】
【0170】
【図1】図1は、造血幹細胞から最終的に分化したRBC、顆粒球、単球および血小板へと分化する細胞系統の模式図を示す。
【図2】図2は、マウス化学療法/放射線モデルにおけるヘマトクリットの回復を示す。値は平均値+/−SEMを表す。
Claims (54)
- 1つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の1つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を増加させる方法であって、治療上有効な量のLP82ポリペプチドを投与することを含む方法。
- 造血前駆細胞のタイプが、CFU−GEMM、BFU−E、CFU−E、CFU−GM、CFU−Mk、CFU−G、CFU−Mおよび巨核球からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上のタイプの造血前駆細胞がCFU−GEMMを含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞の数を増加させる方法であって、治療上有効な量のLP82ポリペプチドを投与することを含む方法。
- 成熟造血細胞のタイプが赤血球、顆粒球、単球および血小板からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 赤血球細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の赤血球細胞の数を増加させる方法であって、治療上有効な量のLP82ポリペプチドを投与することを含む方法。
- ヘマトクリットを増加させることを必要とする哺乳動物のヘマトクリットを増加させる方法であって、治療上有効な量のLP82ポリペプチドを投与することを含む方法。
- 1つ以上のタイプのリンパ性細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の1つ以上のタイプのリンパ性細胞の数を増加させる方法であって、治療上有効な量のLP82ポリペプチドを投与することを含む方法。
- LP82ポリペプチドに加えて少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で投与することをさらに含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- LP82ポリペプチドの前、同時、または後に造血サイトカインを投与する、請求項9に記載の方法。
- LP82ポリペプチドに加えての少なくとも1つの造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- LP82ポリペプチドの前、同時または後に化学療法薬剤を治療上有効な量で哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 1つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を減少させることを必要とする哺乳動物の1つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を減少させる方法であって、治療上有効な量のLP82抗体を投与することを含む方法。
- 造血前駆細胞のタイプがCFU−GEMM、BFU−E、CFU−E、CFU−GM、CFU−Mk、CFU−G、CFU−Mおよび巨核球からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 1つ以上のタイプの造血前駆細胞がCFU−GEMMを含む、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞の数を減少させることを必要とする哺乳動物の少なくとも2つのタイプの成熟造血細胞の数を減少させる方法であって、治療上有効な量のLP82抗体を投与することを含む方法。
- 成熟造血細胞のタイプが赤血球、顆粒球、単球および血小板からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- ヘマトクリットを低下させることを必要とする哺乳動物のヘマトクリットを低下させる方法であって、治療上有効な量のLP82抗体を投与することを含む方法。
- LP82抗体に加えて少なくとも1つの造血サイトカイン抗体を治療上有効な量で投与することをさらに含む、請求項13〜18のいずれか1つに記載の方法。
- LP82抗体の前、同時、または後に造血サイトカイン抗体を投与する、請求項19に記載の方法。
- 少なくとも1つの造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 哺乳動物における造血障害を治療または予防する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物にLP82ポリペプチドを治療上有効な量で含む医薬組成物を投与することを含む方法。
- 少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- LP82ポリペプチドの投与の前、同時または後に造血サイトカインを投与する、請求項23に記載の方法。
- 造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- LP82ポリペプチドを含有する組成物がさらに造血サイトカインを含有する、請求項23に記載の方法。
- 哺乳動物における貧血、血小板減少症および/または好中球減少症を治療または予防する方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物にLP82ポリペプチドを治療上有効な量で含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
- 少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- LP82ポリペプチドの投与の前、同時または後に造血サイトカインを投与する、請求項27に記載の方法。
- 造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- LP82ポリペプチドを含む組成物が造血サイトカインをさらに含有する、請求項27に記載の方法。
- 貧血、血小板減少症および/または好中球減少症が化学療法または放射線治療から生じる、請求項27または28に記載の方法。
- 哺乳動物における免疫弱体化障害を治療または予防する方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物に、LP82ポリペプチドを治療上有効な量で含有する医薬組成物および少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
- 造血サイトカインがLP82ポリペプチドの投与の前、同時または後に投与される、請求項33に記載の方法。
- LP82ポリペプチドを含む組成物が造血サイトカインをさらに含有する、請求項33に記載の方法。
- 造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 哺乳動物における自己免疫疾患を治療または予防する方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物に、LP82ポリペプチドを治療上有効な量で含有する医薬組成物および少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
- 造血サイトカインがLP82ポリペプチドの投与の前、同時または後に投与される、請求項37に記載の方法。
- LP82ポリペプチドを含む組成物が造血サイトカインをさらに含有する、請求項37に記載の方法。
- 造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 哺乳動物における造血障害を治療または予防する方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物に、LP82抗体を治療上有効な量で含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
- 少なくとも1つの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
- LP82ポリペプチドの投与の前、同時または後に造血サイトカインを投与する、請求項42に記載の方法。
- 造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- LP82ポリペプチドを含む組成物が造血サイトカインをさらに含有する、請求項42に記載の方法。
- LP82ポリペプチドが、以下:
a)配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチド、
b)配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチド、
c)1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチドであって、配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を有するポリペプチド、ならびに
d)1、2、3、4、5、6または7個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチドであって、配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項1、4、6、7、22、27、33または37のいずれか1つに記載の方法。 - 造血前駆細胞刺激量のLP82ポリペプチドおよび製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
- CFU−GEMM刺激量のLP82ポリペプチドおよび製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
- リンパ性細胞刺激量のLP82ポリペプチドおよび製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
- LP82ポリペプチドに加えて、少なくとも1つの造血サイトカインをさらに含有する、請求項47、48または49のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- LP82ポリペプチドに加えての少なくとも1つの造血サイトカインが、Epo、TPO、IL−1、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−9、IL−11、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項50に記載の医薬組成物。
- 造血前駆細胞減少量のLP82抗体、および製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
- CFU−GEMM減少量のLP82抗体および製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
- LP82ポリペプチドが、以下:
a.配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチド、
b.配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチド、
c.1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチドであって、配列番号2の約1〜約176の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を有するポリペプチド、ならびに
d.1、2、3、4、5、6または7個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチドであって、配列番号2の約25〜約176の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項47〜53のいずれか1つに記載の組成物。
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