ES2715412T3 - Péptido derivado de SOCS1 para su uso en complicaciones crónicas de la diabetes - Google Patents

Péptido derivado de SOCS1 para su uso en complicaciones crónicas de la diabetes Download PDF

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Abstract

Péptido derivado de SOCS1 para su uso en complicaciones crónicas de la diabetes, especialmente complicaciones oculares, renales, nerviosas y vasculares, así como composiciones que lo contienen y polinucleótidos aislados que lo codifican.La presente invención también se refiere al péptido derivado de SOCS1 para su uso tópico en el tratamiento y/o prevención de enfermedades neurodegenerativas de la retina, en particular en las primeras etapas de la retinopatía diabética y otras enfermedades de la retina en lasque la neurodegeneración juega un papel esencial.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido derivado de SOCS1 para su uso en complicaciones crónicas de la diabetes
Objeto de la invención
La presente invención se refiere a un péptido derivado de SOCS1 para su uso en la prevención y el tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes, particularmente complicaciones oculares, renales, nerviosas y vasculares. Dentro del capítulo de las complicaciones oculares de la diabetes se incluyen la retinopatía diabética y el edema macular. Dado el carácter neuroprotector del péptido derivado de SOCS1, la presente invención también se considera potencialmente eficaz para otras enfermedades de la retina, aparte de la retinopatía diabética, en las que la neurodegeneración desempeña un papel fundamental como son las enfermedades neurodegenerativas de la retina de carácter adquirido o hereditario.
Antecedentes de la invención
La diabetes mellitus es una enfermedad sistémica de gran prevalencia, que causa frecuentemente lesiones en varios órganos, particularmente retina, riñón, nervios y el sistema vascular. Sus complicaciones suelen dividirse en: a) complicaciones agudas, como hipoglucemia, cetoacidosis y coma hiperosmolar; b) complicaciones crónicas o tardías, divididas a su vez en microangiopáticas (nefropatía, retinopatía, y neuropatía), macroangiopáticas (enfermedad cardiovascular) y pie diabético (macro y microangioangiopatía).
El enorme impacto socio-sanitario de la diabetes se debe a estas complicaciones crónicas, principalmente oculares (retinopatía), renales (nefropatía) y vasculares (aterosclerosis). Los enfoques actuales para tratar la diabetes, como el control estricto de la glucosa y la hipertensión, detienen exitosamente la evolución de la enfermedad pero no evitan en muchos casos la aparición de complicaciones crónicas, particularmente la retinopatía, los eventos cardiovasculares o la progresión de los pacientes a insuficiencia renal e incluso entrada en programas de diálisis y trasplante.
El pie diabético es una de las complicaciones más frecuentes de la diabetes que produce una importante morbilidad y un alto riesgo de amputación y cuyo tratamiento requiere enfoque multidisciplinario.
La retinopatía diabética es la complicación más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. En la etiopatogenia de la retinopatía diabética interviene la hiperglucemia per se y las vías metabólicas directamente relacionadas con ella, provocando daño en el lecho capilar situado en la retina interna (lesión microangiopática). Clásicamente, la retinopatía diabética se ha considerado como una enfermedad microangiopática de la retina. Sin embargo, la evidencia actual indica que la neurodegeneración es un fenómeno precoz en la patogenia de la retinopatía diabética que participa en el desarrollo de las alteraciones microvasculares. En la actualidad no existen tratamientos específicos para las fases iniciales de la retinopatía diabética. Además, los tratamientos específicos indicados en fases avanzadas de la enfermedad (fotocoagulación con láser, inyecciones intravítreas de agentes como los anticuerpos anti-VEGF -“Factor de crecimiento endotelial vascular”- o corticoides o la vitrectomía) tienen una efectividad limitada y una elevada tasa de efectos secundarios. Para prevenir la retinopatía diabética o tratarla en fases iniciales (neurodegeneración) serían necesarios enfoques terapéuticos no invasivos. En este sentido la administración tópica ocular (colirio) sería la vía más adecuada debido a su carácter no invasivo ya que evitaría los efectos secundarios sistémicos.
Además de la retinopatía diabética existen otras enfermedades que cursan con neurodegeneración de la retina como la degeneración macular asociada a la edad (AMD), el glaucoma y la retinitis pigmentosa. Las enfermedades neurodegenerativas de la retina se refieren a las condiciones de la retina caracterizadas por la pérdida neuronal progresiva.
Un análisis en profundidad de estas enfermedades, sus sitios críticos, así como de las posibles formas de protección y caminos que conducen a la recuperación, se pueden extraer de Schmidt et al., “Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery’’, Current Neuropharmacology -2008, Vol. No. 6, pp.: 164-178.
En el caso de la retinopatía diabética, la neurodegeneración (pérdida de neuronas efectivas) se produce en las primeras etapas de la enfermedad y produce anormalidades funcionales, tales como la pérdida de la discriminación cromática y la sensibilidad al contraste. Estas alteraciones pueden detectarse mediante estudios electrofisiológicos en pacientes diabéticos, incluso con menos de dos años de duración de la diabetes, es decir, antes de que las lesiones microvasculares puedan detectarse bajo examen oftalmológico. Además, el retraso en tiempo implícito de electrorretinograma multifocal (mfERG-IT) predice el desarrollo de anomalías microvasculares tempranas. Por otra parte, la degeneración neurorretinal inicia y/o activa varias rutas metabólicas y de señalización que participarán tanto en el proceso microangiopático como en la disrupción de la barrera hemato-retiniana (BRB).
La BRB es una estructura del ojo de gran importancia en muchas de las enfermedades de la retina y en especial es un elemento crucial en la patogénesis de la retinopatía diabética. La BRB está constituida por la BRB interna y la BRB externa. La BRB interna está formada por las uniones estrechas de las células endoteliales. La BRB externa está constituida por el epitelio pigmentario de la retina (RPE), cuyas células también están conectadas por uniones estrechas. El edema macular diabético es debido a la disrupción de la BRB. Otra enfermedad de la retina que es frecuente debida a un deterioro de la BRB que da como resultado un edema retiniano es la AMD. Además, la alteración de la BRB se produce también en muchas situaciones oculares, tales como uveítis, trauma, cirugía intraocular, retinopatías vasculares, distrofias hereditarias, etc. (Cunha-Vaz et al., “The Blood-Retinal Barrierin Retinal Disease”, European Ophthalmic Review -2009, Vol. No. 3, pp.:105-108).
En los últimos años se está dedicando gran esfuerzo para conocer los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, así como estudiar su potencial terapéutico.
La vía de señalización JAK/STAT (Janus quinasas/transductores de la señal y activadores de la transcripción, por sus siglas en inglés) es un importante mecanismo intracelular por el que la hiperglucemia y otros factores contribuyen al desarrollo de la diabetes y sus complicaciones. JAK/STAT controla numerosos procesos celulares, como proliferación, migración y diferenciación, así como la expresión de mediadores inflamatorios. Se ha descrito un aumento en la expresión y activación de miembros de la vía JAK/STAT en placas de ateroma, en biopsias renales de pacientes diabéticos y en modelos animales de retinopatía y nefropatía diabética.
La familia de proteínas SOCS (Supresores de la señalización de citocinas, por sus siglas en inglés) es el principal mecanismo endógeno de regulación negativa de la vía JAK/STAT y alteraciones en los niveles de expresión se han relacionado con diferentes enfermedades inmunes e inflamatorias. Los estudios experimentales en animales con modificaciones genéticas para miembros de la familia SOCS han demostrado un efecto protector en las células p pancreáticas, con reducción de la incidencia de diabetes (Flodstrom-Tullberg et al., Diabetes 2003;52:2696-700) y del daño renal asociado (Ortiz-Muñoz et al., J Am SocNephrol 2010;21:763-72), así como un efecto anti-aterosclerótico (Ortiz-Muñoz et al., ArteriosclerThromb Vasc Biol 2009;29:525-531;Wesoly et al., Acta Biochim Pol 2010; 57(3):251-260; Liang et al., Int J Mol Med. 2013 May;31(5):1066-74). Esto sugiere un potencial terapéutico de estas proteínas endógenas en las complicaciones de la diabetes.
El uso de péptidos miméticos de proteínas SOCS se ha descrito previamente en la encefalomielitis alérgica experimental, un modelo de esclerosis múltiple (Mujtaba et al., J Immunol 2005;175:5077-5086; Jager et al., J Neuroimmunol2011;232:108-118) y también en modelos de daño en nervios periféricos (Girolami et al., ExpNeurol 2010;223:173-182) e infección vírica por poxvirus (Ahmed et al., J Virol 2009;83:1402-1415). Asimismo se han descrito polipéptidos SOCS como inhibidores de la señalización inducida por citocinas, en particular en inflamación e infecciones víricas o bacterianas (US2009/0209458). La publicación de patente WO2010/151495 describe péptidos antagonistas de SOCS-1 o SOCS-3, útiles como antivíricos. En el documento US 8.420.096 se describe un péptido soluble conteniendo la secuencia de SOCS1/SOCS3 y una secuencia de translocación de membrana y su potencial uso para tratamiento de enfermedades inmunes. En el documento de patente US2009253618 se han descrito asimismo péptidos de este tipo, para su uso en la diferenciación de neuronas. En el documento de patente US2009030179 se emplean como agentes antimicrobianos varios péptidos sintéticos de la región SOCS-box de estos péptidos.
A pesar de la investigación existente en este campo y el hecho de que se haya postulado la relación entre la vía de señalización JAK/STAT, las proteínas SOCS y la diabetes, hasta la fecha no se ha descrito la administración eficaz de ningún péptido per se para la prevención o el tratamiento de complicaciones oculares, renales o vasculares de la diabetes. No se ha relacionado en ningún caso los péptidos miméticos SOCS con trastornos oculares.
Breve descripción de la invención
Se ha descubierto que un polipéptido correspondiente a una región de la proteína SOCS1 es eficaz para el tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes in vivo en modelos animales de diabetes.
Adicionalmente, se ha encontrado que dicho polipéptido es eficiente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que contiene
a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;
para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido del primer aspecto y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea homóloga en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2; para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de un polipéptido aislado que contiene
a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;
para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea homóloga en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2; para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
Se desvela el uso de un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea homóloga en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2; para la preparación de un medicamento para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
Se desvela un método de tratamiento, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido del primer aspecto a un paciente con complicaciones crónicas de la diabetes y/o que padece una enfermedad neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde dicha enfermedades neurodegenerativa de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
Estos compuestos actúan como agentes neuroprotectores tópicos de la retina. Cabe destacar que la administración tópica de péptidos para su uso de acuerdo con la invención, no solamente alcanzan la retina, sino que también logran concentraciones eficaces para prevenir la evolución de la retinopatía diabética.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Evolución de la glucemia y el peso en el modelo de retinopatía diabética. Niveles de glucosa en sangre (A) y peso corporal (B) a lo largo del estudio. El tratamiento con péptido inhibidor no afectó a estos parámetros. Figura 2: Efecto de la administración tópica (gotas oculares) del péptido derivado de SOCS1 en la activación glial: Cuantificación de la activación glial basada en la medida de la tinción de GFAP (Proteína ácida fibrilar glial, por sus siglas en inglés) en la retina entre muestras representativas de un ratón diabético tratado con el vehículo [D-Sham], un ratón diabético tratado con gotas oculares que contienen el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1] y un ratón no diabético [control (db/+)].
Figura 3: Efecto de la administración tópica (gotas oculares) del péptido derivado de SOCS1 sobre la apoptosis. Porcentaje de células positivas mediante la técnica de TUNEL (Marcado del extremo libre por dUTP con transferasa terminal, por sus siglas en inglés) en la neurorretina de un ratón representativo de cada grupo, ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham], ratones no diabéticos [control (db/+)] y ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1]. Los resultados se expresan como la media ± SD. *: p<0,01 en comparación con los otros grupos.
Figura 4: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 mejora las anomalías del ERG. (A) Amplitud de la onda a (panel superior) y tiempo implícito de la onda a (panel inferior) en los grupos experimentales. (B) Amplitud de la onda b (panel superior) y tiempo implícito de la onda b (panel inferior) en los grupos experimentales.
Figura 5: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 impide la disrupción de la b Rb inducida por la diabetes. Cuantificación de la extravasación de albúmina en unidades arbitrarias de fluorescencia (U.A.) evaluada en un ratón diabético representativo tratado con vehículo [D-Sham], un ratón diabético tratado con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1] y un ratón no diabético [control (db/+)]. Los resultados se expresan como media ± DE *<0,01 en comparación con otros grupos.
Figura 6: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 mejora el metabolismo del glutamato en ratones diabéticos. (A) Cuantificación de la inmunofluorescencia de GLAST en unidades arbitrarias (U.A.). Los resultados se expresan como media ± DE. (B) Concentración de glutamato de la retina medida por UPLC en los grupos experimentales. Los resultados se expresan como media ± DE. *p<0,001 en comparación con los otros grupos. ** p <0,01 en comparación con el grupo control.
Figura 7: El péptido derivado de SOCS1 reduce la expresión de genes inflamatorios en la retinopatía diabética. Cuantificación de la expresión del ARNm IL-1p usando RT-PCR en ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham], ratones no diabéticos [control (db/+)] y ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1]. Los resultados se expresan como media ± DE. * p<0,05 en comparación con los otros grupos. RQ: cuantificación relativa.
Figura 8: El péptido derivado de SOCS1 inhibe la activación de STAT en los riñones diabéticos. Se realizó la inmunodetección de STAT1 y STAT3 fosforilados en secciones de riñón de ratones diabéticos. Se muestra la cuantificación de la tinción positiva en compartimentos glomerulares y tubulointersticiales. Los resultados son la media ± SD. * p<0,02 frente a grupo control.
Figura 9: Efecto renoprotector del péptido derivado de SOCS1 en ratones diabéticos. (A) Evaluaciones semicuantitativas de las lesiones glomerulares (Híper, hipercelularidad, MM, matriz mesangial; Dil, dilatación capilar), fibrosis y degeneración tubular (Tub) y fibrosis e inflamación intersticial (Int). (B) Análisis morfométrico del área glomerular. (C) Cuantificación del área mesangial PAS+. Los resultados son la media ± SD. * p <0,05 frente a grupo control.
Figura 10: El péptido derivado de SOCS1 previene la fibrosis renal en la nefropatía diabética. (A) Análisis cuantitativo del contenido de colágeno en los compartimentos glomerular y tubulointersticial en muestras renales de ratones diabéticos (control y SOCS1). (B) Análisis RT-PCR de la expresión del ARNm de las proteínas de la matriz extracelular (fibronectina y colágeno tipo I), el factor pro-fibrótico (TGF-p) y el marcador de lesión tubular (Kim-1) en la corteza renal. Los datos son la media ± SEM. * p<0,05 frente a grupo control.
Figura 11: Efecto antiinflamatorio del péptido derivado de SOCS1 en los riñones diabéticos. (A) Detección inmunoperoxidasa de la infiltración de macrófagos (F4/80) y linfocitos T (CD3) en muestras de riñón de ratones diabéticos. Se muestra la cuantificación de células positivas en glomérulos y túbulo intersticial. (B) Análisis RT-PCR de la expresión del ARNm de quimiocinas (CCL2 y CCL5) y la citocina TNFa en la corteza renal. Los datos son la media ± SEM. * p<0,05 frente a grupo control.
Figura 12: Efecto anti-aterosclerótico del péptido miS1 en la diabetes experimental. (A) Evolución del tamaño de la placa ateromatosa a lo largo del tiempo en cortes transversales de aorta de ratones diabéticos. (B) Cuantificación del contenido inflamatorio (tinción de macrófagos Moma2) y de marcadores de estabilidad de la placa (tinción de fibras de colágeno con rojo sirio y de células vasculares con a-actina) en las lesiones ateroscleróticas de ratones diabéticos. *, p<0,05 frente a grupo control.
Figura 13: Efectos in vitro del péptido derivado de SOCS1 y su control mutante inactivo. (A) Activación de STAT1 y STAT3 en macrófagos estimulados con citocinas en presencia de diferentes concentraciones del péptido derivado de SOCS1 o del péptido mutante. (B) Producción de la proteína quimiotáctica CCL2 en macrófagos y VSMC. (C) Ensayo de migración de macrófagos. *, p<0,05 frente a condiciones basales; #, p<0,05 frente a estimulación con citocinas.
Descripción detallada de la invención
Como se indica anteriormente, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado que contiene
a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;
para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad, glaucoma y retinitis pigmentaria.
Uno o más de los aminoácidos de cualquiera de las secuencias mencionadas en la presente invención, en particular las SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, pueden modificarse, por ejemplo pueden estar fosforilados. De acuerdo con una realización particular, solo un aminoácido de la secuencia está modificado, preferentemente fosforilado. De acuerdo con una realización preferida, el aminoácido fosforilado es la tirosina (Y).
En el alcance de la presente invención, la frase “% de identidad” o “idéntica en al menos un %”, con respecto a secuencias de aminoácidos, significa el porcentaje de identidad determinado por medio del siguiente método: la alineación de dos secuencias de aminoácidos se realiza por medio del servicio proporcionado en https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, aplicando los ajustes por defecto de este servicio. De esta manera, por ejemplo, la SEQ ID NO 1 sería una variante a la secuencia de SEQ ID NO como se define en el presente documento.
En el alcance de la presente invención, la frase “complicaciones crónicas de la diabetes” debe entenderse que engloba, pero no necesariamente se limita a, complicaciones o trastornos oculares, renales, nerviosos y vasculares, entendiéndose en el presente documento el término “vasculares” englobando complicaciones tanto cardiovasculares como cerebrovasculares. Específicamente, incluiría complicaciones seleccionadas de retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, incluyendo microangiopatías y macroangiopatías, tales como aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica. Por lo tanto, el péptido de la invención es para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes, seleccionadas del grupo que consiste en complicaciones o trastornos oculares, renales, nerviosos y cardiovasculares en pacientes diabéticos.
Por lo tanto, en una realización particular, las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica. De acuerdo con una realización preferida, la complicación crónica de la diabetes es un trastorno ocular, en particular retinopatía diabética.
El péptido para su uso de acuerdo con la invención también es útil en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina. En el alcance de la presente invención, la frase “enfermedades neurodegenerativas de la retina” debe entenderse que engloba aquellas patologías oculares que se caracterizan por la presencia de inflamación de la glía (activación glial o gliosis reactiva) debido a la muerte neuronal progresiva por apoptosis de las neuronas de la retina, específicamente de los fotorreceptores, que como consecuencia pueden ocasionar ceguera. Los ejemplos de dichas enfermedades incluyen pero no se limitan a retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, dichas enfermedades se seleccionan de un grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. De acuerdo con una realización preferida, la enfermedad neurodegenerativa de la retina es retinopatía diabética.
En el sentido de la invención, el término "neuroprotección" debe entenderse que engloba, pero no necesariamente se limita a, cualquier tipo de tratamiento o método profiláctico que puede utilizarse con el fin de que las neuronas que constituyen la neurorretina permanezcan preservadas en un estado fisiológico correspondiente al de un sujeto animal sano (incluyendo humanos). La "neurorretina" es la parte neurosensorial de la retina y es la responsable del ciclo visual.
En particular, el péptido "para su uso tópico en el tratamiento y/o la prevención" de acuerdo con la invención debe entenderse que engloba, pero no necesariamente se limita al uso tópico ocular en el tratamiento y/o la prevención, específicamente, de una enfermedad neurodegenerativa de la retina seleccionada del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
De acuerdo con una realización particular, la variante a la secuencia SEQ ID NO 2 es idéntica en al menos un 90 %, incluso más preferentemente en aproximadamente un 94 %, una cifra que se correspondería por ejemplo con el reemplazo de un aminoácido por otro en la secuencia SEQ ID NO 2, o la adición de un aminoácido a la secuencia SEQ ID NO 2. De acuerdo con una realización particular, la variante sería la SEQ ID NO 1 (DTHFRTFRSHSDYRRI). Otras especies de mamíferos, tales como Ratus norvergicus, Gorilla gorilla gorilla, Oryctolagus cuniculus, Pan troglodytes, Pongo abelii, Cavia porcellus o Sus scrofa, tienen la SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, ya que esta secuencia está muy conservada entre las especies de mamíferos.
De acuerdo con una realización preferida, tal secuencia SEQ ID NO 2 o las variantes de la misma que son idénticas en un porcentaje como se define anteriormente, está unida a una región de permeabilidad celular. Dicha región de permeabilidad celular puede seleccionarse de entre diferentes secuencias de permeabilidad descritas, generalmente pequeños péptidos de naturaleza catiónica o hidrófoba, tales como TAT (SEQ ID NO 4: YGRKKRRQRRR), Antp (SEQ ID NO 5: RQIKIWFQNRRMKW), PTD-5 (SEQ ID NO 6: RRQRRTSKLMKR), SEQ ID NO 7: 8K (K=Lys) y SEQ ID NO 8: 6R (R=Arg). Más preferentemente, la región de permeabilidad celular es lisina-palmitato. Aún más preferentemente, la región de permeabilidad celular está unida por el extremo amino terminal de la SEQ ID NO 2 o las variantes idénticas de la misma.
Cualquier polipéptido que comprenda la secuencia mencionada o las variantes idénticas de la misma como se define anteriormente se incluye en el alcance de la invención. Sin embargo, de acuerdo con una realización preferida el polipéptido consiste esencialmente en
a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia.
En particular, la variante consistirá en la secuencia SEQ ID NO 1.
En el alcance de la presente invención, la frase “consiste esencialmente en” se refiere a la inclusión de un máximo de 8 aminoácidos adicionales (en otras palabras, un máximo de un 50 % más) a las secuencias definidas o las variantes homólogas de las mismas, de acuerdo con realizaciones preferidas, un máximo de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos adicionales, que pueden estar unidos independientemente al extremo amina de la secuencia, al extremo ácido o en cualquier lugar de la secuencia, pasando a formar parte de la secuencia.
En cualquiera de los casos anteriores, la secuencia puede o no estar unida a una región de permeabilidad celular como se define anteriormente.
De acuerdo con una realización particular, el polipéptido consiste en la secuencia SEQ ID NO 2; puede o no estar unido a una región de permeabilidad celular como se define anteriormente.
En el caso de que el polipéptido sea para su uso en complicaciones oculares en pacientes diabéticos, o para su uso en enfermedades degenerativas de la retina tales como retinopatía diabética, el polipéptido que contiene la secuencia de SEQ ID NO 2 o las variantes idénticas de la misma como se define anteriormente de acuerdo con una realización particular consiste esencialmente en o es:
a) la proteína SOCS1 humana (UniProt: O15524);
b) la proteína SOCS1 murina (UniProt: O35716); o
c) una variante a las secuencias de a) o b) que sea idéntica en al menos el 85 % a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 murina o a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 humana.
Al igual que cualquiera de las realizaciones particulares anteriores, al menos uno de los aminoácidos de la proteína SOCS1 humana o murina, o una variante idéntica de las mismas, puede encontrarse modificado, preferentemente fosforilado. De acuerdo con una realización preferida, el aminoácido fosforilado o uno de los aminoácidos fosforilados será una tirosina (Y). Asimismo, la proteína SOCS1 de acuerdo con las definiciones anteriores puede unirse a una región de permeabilidad celular, preferentemente a un grupo palmitato-lisina. De acuerdo con una realización preferida, la región de permeabilidad celular está unida al extremo N-terminal del polipéptido, siendo más preferentemente la región de permeabilidad celular un grupo palmitato-lisina.
La variante idéntica en al menos el 85 % incluye las proteínas SOCS1 de otros mamíferos, tales como Ratus norvergicus, Gorilla, Oryctolagus cuniculus, Pan troglodytes, Pongo abelii, Cavia porcellus o Sus Scrofa.
De acuerdo con realizaciones particulares, la variante de las secuencias de SOCS1 humana o murina son idénticas en al menos un 90 %, incluso más preferentemente en aproximadamente un 94 %, a dichas secuencias.
Todas las realizaciones preferidas indicadas para este primer aspecto de la invención son aplicables también al resto de aspectos de la invención, proporcionados en detalle a continuación.
Se desvela el uso de un polipéptido aislado que comprende
a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;
para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, este se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores, y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables, para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, de acuerdo con las definiciones dadas anteriormente.
En una realización preferida de la invención, la composición es adecuada para su uso o pretende usarse en la prevención o el tratamiento de trastornos oculares en pacientes diabéticos y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, preferentemente retinopatía diabética. También podría usarse para otras enfermedades de la retina que cursen con neurodegeneración, glaucoma y retinitis pigmentaria.
De esta manera, de acuerdo con una realización particular el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración oftálmica.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención comprenden al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables. La frase “vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a sustancias o entidades moleculares junto a los cuales se administra el péptido de la invención. Tales vehículos o excipientes serán adecuados para la vía de administración elegida, y serán obvios para un experto en la materia dependiendo de la vía de administración. Los vehículos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo aquellos derivados de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, excipientes, disgregantes, agentes humectantes, o diluyentes. Los vehículos y excipientes adecuados se describen por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin, el cual se incorpora en el presente documento por referencia.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a través de cualquier vía conocida, incluyendo vía oral, vía gastroentérica, vía parenteral, vía rectal, vía respiratoria y vía tópica, en particular por vía oftálmica. Igualmente, las composiciones pueden contener otros principios activos o adyuvantes adecuados que serán obvias para el experto en la materia. Igualmente, las composiciones podrían contener solamente un único polipéptido de acuerdo con la invención o dos o más polipéptidos de acuerdo con la invención.
En el caso de la vía oftálmica, el vehículo o excipiente debe ser adecuado para esta vía de administración. Las composiciones en este caso se prepararán adecuadamente, bien como una solución o una suspensión acuosa, en un vehículo o solución base oftálmicos farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, en este caso el polipéptido de acuerdo con la invención, puede contener otros adyuvantes, tales como agentes antimicrobianos, conservantes, agentes quelantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes reguladores del pH, incluyendo soluciones tampón, agentes espesantes, etc.
Si el sujeto recibe compuestos que ayudan a la neuroprotección de la retina (tales como el péptido de la invención) en las fases tempranas de la retinopatía diabética cuando las anomalías funcionales pueden detectarse (es decir, la discriminación cromática, la sensibilidad al contraste y las anomalías electrorretinográficas), los tratamientos agresivos de la enfermedad pueden evitarse. Así que, si la retina está protegida de las consecuencias de la hiperglucemia crónica, las complicaciones mayores se pueden minimizar o incluso no aparecer nunca, lo que supone una mejora real de la calidad de vida de los pacientes diabéticos. Por otra parte, el péptido previene la desorganización de la BRB. La administración tópica ocular de los péptidos representa una ventaja real, evitando tratamientos más agresivos.
El tratamiento en las fases tempranas de la retinopatía diabética tiene la ventaja real de que se evitan complicaciones adicionales, a saber, microaneurismas, microhemorragias, exudados duros, edema macular y neovascularización.
En las composiciones para su uso de acuerdo con la invención el péptido estará contenido en un intervalo de concentración de 1-12 mg/ml. En el caso particular de administración por vía ocular, el péptido estará contenido en una concentración de al menos 5 mg/ml, en realizaciones particulares estará contenido en una concentración de al menos 8 mg/ml, al menos 9 mg/ml, al menos 10 mg/ml, de acuerdo con una realización preferida en una concentración de 10 mg/ml ± 5 %, es decir, 10 mg/ml ± 0,5 mg/ml. En el caso particular de administración por vía intraperitoneal, el péptido estará contenido en una concentración de entre 1 y 5 mg/ml, de acuerdo con una realización particular estará contenido en una concentración de entre 1 y 3 mg/ml, de acuerdo con realizaciones preferidas, en una concentración de 2 mg/ml ± 10 % o ± 5 %, es decir, ± 0,2 mg/ml o ± 0,1 mg/ml.
La composición para su uso de acuerdo con la invención es adecuada para la administración de una dosis diaria de entre l0 y 200 |jg del péptido por ojo. De acuerdo con una realización particular, el péptido se administrará en una dosis diaria de entre 30 y 70 jg por ojo, de acuerdo con una realización preferida, en una dosis diaria de entre 40 y 60 jg por cada ojo, preferentemente entre 45 y 55 jg por ojo. En el caso de administración por vía intraperitoneal o vía oral, la composición será adecuada para la administración de una dosis diaria de entre 1 y 16 mg del péptido por kg de peso del paciente o sujeto al que se realiza la administración, de acuerdo con realizaciones particulares entre 2 y 10 mg del péptido por kg de peso del paciente o sujeto, preferentemente entre 2,5 y 3,5 del péptido por kg de peso del paciente o sujeto.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que es homóloga en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2; para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, de acuerdo con las definiciones anteriormente proporcionadas.
De acuerdo con una realización particular, el polinucleótido aislado codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 unida a un grupo lisina; o
b) una variante a la secuencia de a) que es idéntica en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2, unida a un grupo lisina;
para su uso en la prevención o el tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, de acuerdo con las definiciones anteriormente proporcionadas.
El polinucleótido anteriormente definido es adecuado para su uso tópico o pretende usarse tópicamente en la prevención o el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas.
Preferentemente el polinucleótido definido anteriormente es adecuado para el uso del mismo o pretende usarse en la prevención o tratamiento de trastornos oculares en pacientes diabéticos y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, más preferentemente para su uso en la prevención o tratamiento de la retinopatía diabética.
A continuación se incluye una serie de ejemplos no limitantes, ilustrativos de la presente invención.
Ejemplos
Materiales y métodos
Péptidos:
Se sintetizó un péptido de 16 aminoácidos (SEQ ID NO 1: DTHFRTFRSHSDYRRI, AspThrHisPheArgThrPheArg Ser His Ser AspTyrArgArgIle), que se corresponde con la secuencia “región inhibitoria de quinasa” de la proteína SOCS1 murina, unido a una región de permeabilidad celular (lisina-palmitato) en el extremo N-terminal de la secuencia peptídica (resto D, ácido aspártico), en el cual la tirosina (Y) está fosforilada. A lo largo de los ejemplos se denominará miS1 o D-SOCSMIS1 al péptido derivado formado por SEQ ID NO 1 y el grupo palmitato-lisina. En algunos casos el último se conjugó con un marcador fluorescente para posibilitar su posterior seguimiento en tejidos y células. Asimismo se sintetizó también un péptido mutado no funcional (Mut) reemplazando F (Phe) por A (Ala): SEQ ID NO 3, DTHARTARSHSDYRRI, AspThrHisAlaArgThrAla Arg Ser His Ser AspTyrArgArgIle; unido igualmente a la región de permeabilidad celular lisina-palmitato, para el uso del mismo como control de los experimentos. Los péptidos se disolvieron (<1 % DMSO en solución salina) y se esterilizaron por filtración.
Animales:
Se emplearon dos modelos experimentales, concretamente un modelo experimental de diabetes tipo 2 (ratones db/db) y otro de diabetes tipo 1 (inyección de estreptozotocina en ratones apoE). Los ratones se mantuvieron en jaulas de tamaño convencional en condiciones controladas de temperatura (20 °C) y humedad (60 %), con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y con acceso a comida (dieta convencional) y agua a discreción. Estos estudios se han realizado según la legislación española vigente en términos de uso, protección y cuidado de los animales de experimentación (Real Decreto 53/2013), siguiendo recomendaciones de la CEE (86/609/CEE) y ARVO (Associationfor Research in Vision and Ophthalmology) y han sido aprobados previamente por los Comités Éticos de las dos instituciones participantes (NS-FundaciónJiménez Díaz/Universidad Autónoma de Madrid e Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'Hebron).
Tratamiento de la neurodegeneración de la retina causada por la diabetes mediante tratamiento tópico ocular con un péptido derivado de SOCS1
Ratones diabéticos (db/db) de 8 semanas recibieron el péptido miS1 en forma de colirio (gotas de 5 pl en cada ojo; 10 mg/ml; dos veces al día durante 15 días; n=7 ratones). Como controles se emplearon ratones diabéticos tratados con el péptido no funcional Mut (n=7), tratados con vehículo y ratones no diabéticos (db/+). El colirio se administró directamente en la superficie superior de la córnea de cada ojo utilizando una micropipeta. Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorimétrico) a lo largo del periodo de estudio. En el día 15, la gota con el péptido miS1 o vehículo se administró aproximadamente dos horas antes de la autopsia. Se realizó eutanasia a los animales por dislocación cervical y los ojos enucleados se congelaron inmediatamente y se cortaron secciones dorsoventrales de 8 mm para analizar la morfología de la retina y otros análisis inmunohistoquímicos.
La activación glial se evaluó mediante inmunofluorescencia de GFAP (Proteína ácida fibrilar glial) siguiendo la metodología descrita en otros estudios (Bogdanov et al. PLoS One. 2014;9:e97302). Las secciones fijadas se bloquearon (1 % BSA y 10 % suero de cabra en PBS, 2h a TA) y se incubaron con anticuerpos anti-GFAP (dilución 1:500, 16h a 4 °C) seguido de un anticuerpo secundario (cabra anti-conejo, conjugado con Alexa 488, dilución 1:200). Las muestras se contrastaron con Hoesch y se montaron para análisis en microscopio confocal. Las imágenes de muestras de diabéticos y controles se tomaron con idénticos parámetros y se analizó la distribución topográfica del marcaje GFAP en una escala de 0 a 5 (Anderson et al. Clin Ophthalmol 2008;2(4):801-16). Una puntuación de 1 indica ausencia de activación glial (inmunofluorescencia positiva para GFAP restringida a la capa de células ganglionares) mientras que una puntuación de 5 representa la máxima activación glial (inmunofluorescencia para GFAP se extiende desde la capa de células ganglionares hasta el margen externo de la capa nuclear externa). La apoptosis se determinó mediante inmunohistoquímica TUNEL (Marcado del extremo libre por dUTP con transferasa terminal; kit de fluorescencia) utilizando el método descrito anteriormente (Bogdanov et al. PLoS One. 2014;9:e97302) y posterior cuantificación en un microscopio de fluorescencia. Las secciones de retina se permeabilizaron mediante incubación a temperatura ambiente durante 5 min con una solución de Proteinasa K de 20 pg/ml, recién preparada. Las células apoptóticas se identificaron utilizando fluorescencia verde [Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo (Invitrogen) (1:200 dilución preparada en PBS)]. Para la evaluación por microscopía de fluorescencia, se empleó una longitud de onda de excitación en el intervalo de 450 - 565 nm (por ejemplo, 488 nm) y para la detección se empleó el intervalo de 515 -565 nm (verde). Los resultados se presentan como el porcentaje de células positivas TUNEL con respecto a las células de tinción Hoestchst obtenidas por Image J software.
Para investigar los mecanismos por los que el péptido miS1 produce neuroprotección se evaluó el metabolismo del glutamato. La concentración de glutamato se determinó mediante cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UPLC) (Acquity-UPLC, Waters, MassTrak aminoacid system). El GLAST (transportador Glutamato/Aspartato) se evaluó mediante inmunofluorescencia.
Las secciones de parafina se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en una serie gradual de etanol. Las secciones se fijaron en metanol ácido (-20 °C) durante 1 minuto y se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS) 0,01 M a pH 7,4. Después de eso, se recuperaron los antígenos. Las secciones se sumergieron en una solución de recuperación de antígenos (citrato sódico 10 mM, pH 6,0) y se calentó en una olla a presión a 150 °C durante 4 minutos. Las secciones se incubaron en solución de bloqueo (BSA al 0,5 %, y 10 % de suero de cabra en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario conejo anti-GLAST (1:200, Abcam) durante la noche a 4 °C. Después de un lavado en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario Alexa 488 cabra anti-conejo (1:200, Molecular Probes) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con Hoechst (1:500, Sigma-Aldrich) y se colocaron en Medio de Montaje Fluorescente (Prolong, Invitrogen) con un cubreobjetos. La inmunofluorescencia GLAST se cuantificó mediante microscopía confocal láser (Microscopio confocal Olympus FluoView ™ FV1000, Hamburgo, Alemania) utilizando el software ImageJ.
Se evaluó la expresión de IL-1p, TNF-a e IL-6. El ARN total se extrajo con Mini Kit RNeasy con digestión de DNasa (QIAGEN, Distribuidores IZASA, Barcelona, España) según las instrucciones del fabricante. El ARN (1 pg) se utilizó para la transcripción inversa con cebadores de hexanucleótidos aleatorios y reactivos de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Madrid, España) en un volumen de reacción de 20 pl. La PCR en tiempo real se realizó en un ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems; Madrid, España) con SYBR Green Supermix; Applied Biosystems, Madrid, España). Cada muestra se ensayó por triplicado y se incluyó un control negativo en cada experimento. S18 humano se utilizó como control de la expresión del gen endógeno. Se utilizó el método AACt para obtener la cuantificación relativa (RQ).
Se realizaron registros de electroretinogramas (ERG) en ratones anestesiados y adaptados a la oscuridad (12 h durante la noche). Se midieron registros de electroretinogramas focales (Ferg) utilizando un sistema Micron III Focal ERG (Phoenix Research Labs, Pleasanton, CA). Los registros fueron tomados con un electrodo integrado en la lente corneal del ratón montado en el ERG focal, un electrodo de referencia colocado en la cabeza entre los ojos, y un electrodo de tierra colocado en la cola. Además, para asegurar que todas las retinas centrales se habían estimulado, los estímulos de luz se proyectaron en los discos ópticos y se utilizó el punto de luz más grande disponible (1,5 mm de diámetro). Las respuestas ERG de ambos ojos se registraron en respuesta a 20 ms con estímulos de luz blanca. Las intensidades de los estímulos de luz blanca estaban en 800, 3200 y 12800 c d ^ m -2 y para cada intensidad, se realizó un promedio de 6-10 destellos de luz consecutivas. Las señales ERG se amplificaron, la banda filtrada fue entre 0,5 y 1000 Hz, y se analizó con LabScribe-2 software (BioSeb, Vitrolles, Francia) con el fin de calcular la amplitud y el tiempo implícito de la onda a y la onda b, como se recomienda por la Sociedad Internacional de Electrofisiología Clínica de la Visión (ISCEV) (Marmor et al Doc Ophtalmol 108: 107 a 144). Los registros de ERG se realizaron al inicio y en el día antes de eutanasia.
Tratamiento de la disrupción de la BRB causada por la diabetes mediante tratamiento tópico ocular con un péptido derivado de SOCS1
Ratones diabéticos (db/db) de 8 semanas recibieron el péptido miS1 en forma de colirio (gotas de 5 pl en cada ojo; 10 mg/ml; dos veces al día durante 15 días; n=7 ratones). Como controles se emplearon ratones diabéticos tratados con vehículo (n=7) y no diabéticos (db/+) (n=7). Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorimétrico) a lo largo del periodo de estudio. En el día 15 se realizó la eutanasia a los animales por dislocación cervical. La disrupción de la BRB se evaluó mediante la determinación de la permeabilidad a la albúmina.
Las secciones de parafina se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en una serie gradual de etanol. Las secciones se fijaron en metanol ácido (-20 °C) durante 1 minuto y se lavó con solución PBS 0,01 M a pH 7,4. Las secciones se incubaron en una solución de bloqueo (2,5 % de leche seca no grasa) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo primario, ovejas anti-albúmina de suero humano (1:500, Abcam) durante la noche a 4 °C. Después de un lavado en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario Alexa 594 burro anti-oveja (1:200, Molecular Probes) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con Hoechst (1:500, Sigma-Aldrich) y se colocaron en Medio de Montaje Fluorescente (Prolong, Invitrogen) con cubreobjetos. La inmunofluorescencia de la albúmina se analizó mediante microscopía confocal láser (Olympus FluoView ™ FV1000 confocal Microscopio, Hamburgo, Alemania).
Tratamiento de la nefropatía y aterosclerosis causada por la diabetes mediante tratamiento intraperitoneal con un péptido derivado de SOCS1
Ratones macho deficientes en apolipoproteína E (apoE) de 8 semanas de edad se hicieron diabéticos por inyección de estreptozotocina (125 mg/kg peso en 10mM citrato pH 4,5, dos días consecutivos). Después de 2 semanas, los animales con glucemia superior a 350 mg/dl se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n=9 animales por grupo): animales tratados (péptido miS1: 65 pg/día, 200 pl, intraperitoneal, cada 2 días durante 8 semanas) y controles (vehículo). Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorimétrico) a lo largo del periodo de estudio.
Al final del estudio, los animales anestesiados se perfundieron con solución salina y se sacrificaron, procesando los tejidos inmediatamente. En corteza renal (cortes en parafina, 5pm) se estudió la morfología glomerular y tubulointersticial mediante tinciones de PAS y tricrómico de Masson y las lesiones se evaluaron de forma semicuantitativa y a doble ciego en escala 0-3. La fibrosis renal se determinó mediante tinción de rojo picrosirio y las células infiltrantes inflamatorias (macrófagos F4/80+ y linfocitos T CD3+) por inmunohistoquímica. En la aorta, la zona de raíz/arco (criosecciones seriadas de 8 pm desde las válvulas hasta una extensión de 1000 pm) se tiñó con Oil-red-O/hematoxilina y se cuantificó el área de la lesión aterosclerótica (programa Metamorph). La estabilidad de la placa se valoró por tinción de fibras de colágeno con rojo picrosirio e inmunofluorescencia de a-actina. El componente inflamatorio se determinó mediante inmunohistoquímica para monocito/macrófagos (Moma2). Utilizamos el programa Image Pro-Plus para cuantificar las tinciones positivas. Los parámetros bioquímicos en suero (hemoglobina glicada, colesterol y creatinina) y orina (albúmina y creatinina) se determinaron mediante kits comerciales convencionales.
Estudios in vitro
Se emplearon macrófagos RAW264.7 y células de músculo liso vascular (VSMC) cultivadas en medio con 10 % suero bovino fetal. Las células se sincronizaron (24h sin suero), se preincubaron durante 90 min con diferentes concentraciones de péptidos (miS1 o su control, 50-150 pg/ml) y se estimularon con citocinas (IFNy 103 U/ml; IL-6 102 U/ml). La activación de STAT se analizó mediante transferencia Western para las isoformas STAT1/STAT3 fosforiladas. La expresión de quimiocinas dependientes de la vía JAK/STAT (CCL2) se determinó mediante ELISA. La viabilidad celular se analizó por ensayo colorimétrico MTT y la migración de macrófagos por ensayo de quimiotaxis.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media±error estándar del total de animales por grupo y de al menos 3 cultivos celulares independientes. Para el análisis estadístico se usó el programa GraphPadPrism (ensayo ANOVA, Tukey y t de Student; significación con P<0,05).
Ejemplo 1: efecto del péptido de la invención sobre la neurodegeneración de la retina
En el modelo de diabetes tipo 2 (ratones db/db) se administró de forma local el péptido miS1 en forma de colirio (50 |jg en 5 jl/ojo, dos veces al día) durante 15 días. La evolución del peso corporal y los niveles de glucosa se muestran en la Figura 1.
La activación glial se midió con el marcador GFAP (Figura 2). Como era de esperar, en ratones no diabéticos [control (db/+)] la expresión de GFAP se limita principalmente a la capa de células ganglionares de la retina (GCL) (Figura 2). Los ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham] presentaron significativamente mayor expresión de GFAP que los ratones no diabéticos equiparados por edad. Por lo tanto, el 100 % de los ratones diabéticos presentaron una puntuación GFAP > 3. La administración del péptido derivado de SOCS1 durante dos semanas resultó en una disminución significativa de gliosis reactiva, y la puntuación de GFAP de los ratones tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] fue < 3 en todos los casos (Figura 2). El porcentaje de células apoptóticas en capas de la retina (ONL, INL, y GCL) en ratones diabéticos [D-Sham] fue significativamente mayor en comparación al observado en retinas de los controles no diabéticos [control (db/+)] de la misma edad (Figura 3). Los ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] presentaron una tasa significativamente menor de la apoptosis que los ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham]. No se observaron diferencias en el porcentaje de células apoptóticas entre los ratones diabéticos tratados con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] y los ratones no diabéticos.
El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 aminora la reducción de la amplitud de la onda a y la onda b inducida por la diabetes, así como el aumento del tiempo implícito de la onda a y la onda b (Figura 4).
GLAST es el principal transportador de glutamato expresado por las células de Müller, ya que es el responsable al menos el 50 % de la captación de glutamato en la retina de mamíferos (Figura 6A panel superior). El contenido de GLAST se reguló a la baja en las retinas de ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham]. En los ratones diabéticos tratados con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1], la regulación a la baja GLAST fue evitada (Figura 6A panel inferior). En consecuencia, se redujeron los niveles de glutamato intrarretinianos pero sin alcanzar significación estadística (Figura 6B). Por lo tanto, entre los mecanismos por los que el péptido miS1 es neuroprotector de la retina, cabe destacar que evita el incremento del glutamato y la reducción del trasportador del glutamato GLAST.
Además, el péptido miS1 previno el aumento de IL-1p inducido por la diabetes (Figura 7). Cabe destacar que esta citocina juega un papel crucial en la patogénesis de la retinopatía diabética.
En conclusión, la administración en gotas oculares del péptido miS1 en ratones diabéticos previno la neurodegeneración de la retina, determinada por una reducción significativa (aproximadamente un 80 %) de la tinción de proteína glial GFAP y de la apoptosis en comparación con los grupos que recibieron péptido Mut o vehículo. El efecto neuroprotector del péptido derivado de SOCS1 también se evidenció mediante el examen funcional de la retina (ERG).
Estos resultados demuestran que el péptido de la invención es útil en el tratamiento de otras enfermedades que cursen con neurodegeneración de la retina como el glaucoma y la retinitis pigmentaria puesto que estas enfermedades, al igual que la neurodegeneración de la retina inducida por la diabetes, se caracterizan por la presencia de inflamación de la glía y muerte neuronal progresiva por apoptosis.
Ejemplo 2. Efecto del péptido de la invención sobre la permeabilidad de la barrera hematoretiniana
En el modelo de diabetes tipo 2 (ratones db/db) se administró de forma local el péptido miS1 en forma de colirio (50 jg en 5 jl/ojo, dos veces al día) durante 15 días. La evolución del peso corporal y los niveles de glucosa se muestran en la Figura 1.
La permeabilidad vascular se evaluó midiendo la extravasación de albúmina. Se observó una extravasación de albúmina superior en ratones db/db tratados con vehículo [D-Sham] comparado con animales control [control (db/+)]. El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1, miS1, previno la extravasación de albúmina en ratones db/db [D-SOCSM1S1] (Figura 5).
Estos resultados demuestran que el péptido de la invención es útil en el tratamiento del edema macular diabético puesto que dicha patología se produce por la disrupción de la barrera hematoretiniana, caracterizándose por la extravasación de fluido al espacio extravascular (agua y solutos; entre los solutos el más abundante es la albúmina) y el péptido derivado de SOCS1 según la invención impide dicha disrupción.
Ejemplo 3: efecto del péptido de la invención sobre la nefropatía y la formación de placas de ateroma en ratones diabéticos
En el modelo de diabetes tipo 1 (estreptozotocina en ratones apoE) se realizó el tratamiento sistémico con péptido miS1 (65 jg/día, cada 2 días) durante 8 semanas. En la Tabla 1 se muestran los parámetros clínicos y metabólicos al final del estudio. Todos los ratones diabéticos presentaron niveles equivalentes de hiperglucemia (glucosa y hemoglobina glicada (HbA1c) y colesterol, lo que indica que el efecto protector del péptido no es debido a una posible acción sobre el control de la glucemia de estos animales. El tratamiento con miS1 también mejoró significativamente la función renal de los ratones diabéticos, observándose un 28 % de descenso en los niveles de albuminuria. Además, la pérdida de peso originada por la diabetes crónica fue menos acusada en el grupo tratado con péptido miS1.
El análisis histológico en cortes renales de los ratones diabéticos demostró una disminución en la activación renal de STAT1 y STAT3 (Figura 8) junto con una mejora de las lesiones glomerulares (hipercelularidad, expansión mesangial e hipertrofia glomerular) y tubulointersticiales (atrofia, degeneración e infiltrado) en el grupo tratado con péptido miS1 en comparación con los diabéticos que recibieron vehículo (Figura 9). El péptido miS1 redujo significativamente la fibrosis tubulointersticial (Figura 10) y el infiltrado inflamatorio de linfocitos y macrófagos (Figura 11). En otra serie de experimentos estudiamos las propiedades anti-ateroscleróticas del tratamiento con péptido miS1 en los ratones diabéticos. La tinción de las placas de ateroma con Oil-red-O/hematoxilina y su posterior cuantificación mostraron una significativa reducción en el tamaño y extensión de las lesiones en los ratones diabéticos tratados con péptido miS1 (50 % reducción en comparación con el grupo control que recibió vehículo; Figura 12A). El análisis de la composición de la placa demostró una disminución en el número de macrófagos en las lesiones de los animales tratados, así como un mayor contenido de colágeno y células vasculares (Figura 12B), indicando por tanto que el tratamiento redujo la inflamación y mejoró la estabilidad de las placas de ateroma de los animales diabéticos.
Tabla 1: Datos metabólicos renales en ratones con diabetes ti o 1
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Ejemplo 4: estudios in vitro
En los estudios in vitro se emplearon macrófagos murinos y cultivos primarios de células de músculo liso vascular de ratón (Figura 13). En ambos casos la activación de la vía JAK/STAt se indujo por estimulación con las citocinas proinflamatorias IFNy e IL-6. La preincubación de macrófagos con concentraciones crecientes (50-150 ug/ml) del péptido inhibidor miS1 redujo de forma dosis-dependiente la activación de STAT1 y STA3 (determinada por los niveles de fosforilación de ambas proteínas en un ensayo de transferencia Western). Por el contrario, una dosis similar de péptido Mut (150 ug/ml) no causó ningún efecto, confirmándose así la especificidad del péptido inhibidor miS1. De forma similar, el péptido miS1 previno la activación de STAT1 y STAT3 en VSMC, como puede verse en las imágenes de inmunofluorescencia. Para determinar las consecuencias funcionales de la inhibición por el péptido miS1 se analizó la secreción de la proteína quimiotáctica de monocitos CCL2, cuya expresión depende de la vía JAK/STAT. La preincubación con el péptido inhibidor miS1, pero no con el péptido Mut, logró reducir significativamente (30-40 %) la producción de CCL2 inducida por citocinas, tanto en VSMC como en macrófagos. Por último, mediante ensayos de quimiotaxis se comprobó el efecto anti-migratorio del péptido inhibidor miS1 en macrófagos. No se observaron variaciones en la viabilidad celular de VSMC y macrófagos en ninguna de las condiciones experimentales estudiadas, lo que indica la no-toxicidad del péptido a las concentraciones empleadas.
Ejemplo 5: justificación de que los datos aportados son extrapolables a humanos
Los modelos animales y celulares usados en los ejemplos de la presente invención son aceptados en el sector médico y farmacéutico como modelos que permiten extrapolar los datos obtenidos mediante su uso a enfermedades humanas. Por un lado, el ratón deficiente en el gen de apolipoproteína E se caracteriza por tener un transporte reverso de colesterol deficiente que determina una hipercolesterolemia sistémica con alta acumulación de lípidos y colesterol en tejidos adiposos y periféricos. Este modelo de ratón desarrolla espontáneamente (de forma acelerada si se alimenta con dieta grasa) lesiones ateromatosas con algunas características similares a las lesiones humanas. Por ello, es uno de los modelos más ampliamente utilizado en investigación cardiovascular. En segundo lugar, la inducción de diabetes

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que comprende
a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o
b) una variante de la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;
para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, preferentemente retinopatía diabética.
2. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia SEQ ID NO 2 o la variante de la misma idéntica en al menos el 85 % está unida a una región de permeabilidad celular.
3. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la región de permeabilidad celular es lisinapalmitato.
4. El polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que la región de permeabilidad celular está unida al extremo N-terminal de la secuencia peptídica (resto D, ácido aspártico).
5. El polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que consiste esencialmente en
a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o
b) una variante de la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia.
6. El polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que consiste esencialmente en
a) la proteína SOCS1 murina (UniProt: O35716);
b) la proteína SOCS1 humana (UniProt: O15524); o
c) una variante de la secuencia de a) o b) que sea homóloga en al menos el 85 % a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 murina o a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 humana.
7. El polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que consiste en la secuencia SEQ ID NO 2 unida a una región de permeabilidad celular.
8. Un polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos un aminoácido de la secuencia del mismo está fosforilado, preferentemente un aminoácido tirosina (Y) fosforilado.
9. El polipéptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el aminoácido tirosina (Y) está fosforilado.
10. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables, para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes o en la prevención o tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, adecuada para su uso por vía oral, vía gastroentérica, vía parenteral, vía rectal, vía respiratoria o vía tópica, en particular por vía oftálmica.
12. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, para su uso en la prevención o tratamiento de la retinopatía diabética.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, donde el vehículo es un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable.
14. Un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia;
para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
15. Un polinucleótido aislado que codifica
a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 unida a un grupo lisina; o
b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la secuencia SEQ ID NO 2, unida a un grupo lisina, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia; para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.
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