CN103173446A

CN103173446A - 一种靶向干扰socs1基因的重组腺相关病毒载体的构建方法与应用

Info

Publication number: CN103173446A
Application number: CN 201110442731
Authority: CN
Inventors: 吕成伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种特异性抑制SOCS1基因表达的shRNA(short hairpin RNA，shRNA)重组腺相关病毒载体的构建方法及其应用。本发明的shRNA重组腺相关病毒载体输送入单核细胞-巨噬细胞-树突状细胞系中，下调SOCS1基因的表达，增强CTL的抗肿瘤活性。因此，本发明将在生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，可被用于制备抗肿瘤药物，有很好的临床应用价值。

Description

一种靶向干扰SOCS1基因的重组腺相关病毒载体的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别是涉及shRNA重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备抗肿瘤药物和疫苗中的应用。

背景技术

细胞因子信号抑制因子(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)是信号传导通路JAK/STAT(Januskinase/signal transduction and activators of transcription)的一个负性调控分子家族。SOCS家族包括八个成员(CIS，SOCS1-7)，其中SOCS1与多种细胞因子的信号转导有关。SOCS1是多种细胞因子的负性调控因子，TLR信号活化的DC产生大量的细胞因子，包括IL-12、TNF-α、IL-6、IFN-α/β、IFN-γ等，其中大部分被SOCS1调节。研究表明，SOCS1参与DC的发生、成熟和活化，对DC的免疫负反馈调节起重要作用，SOCS1可通过负反馈降低DC对细胞因子和LPS刺激的反应，能限制DC的抗原提呈能力，下调其表达可以有效增强DC的抗肿瘤免疫反应。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)对靶基因转录后的mRNA的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默现象。RNA干扰技术可以高效、特异地下调目标基因的表达，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。RNAi因具有特异、快速、高效等优点，现已广泛应用于抗肿瘤、抗病毒和基因治疗等研究。

在RNAi技术的应用方式中，采用化学合成siRNA，存在小分子RNA在体外易被RNase降解、转染效率低、持续时间短等缺点；质粒介导RNAi也存在局限性，瞬时转染在不同的宿主细胞质粒的转染效率差别很大，尤其对于原代细胞、干细胞等体系难以满足实验要求，而腺病毒、逆转录病毒本身具有生物毒性，具有很大的潜在相关危险，限制了其临床应用。

腺相关病毒(AAV)是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其他病毒(如腺病毒)的基因产物辅助才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。美国国立卫生研究院(NIH)和食品及药品管理局(FDA)宣布，AAV是基因治疗最安全的病毒载体。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗临床试验。

腺相关病毒载体介导的RNA干扰能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组中，能够长期稳定并特异性抑制靶基因的表达，并且与腺病毒和逆转录病毒相比，还具有低免疫原性的特点，因而成为基因治疗载体的首选。

发明内容

本发明的目的主要是提供一种靶向干扰SOCS1基因的重组腺相关病毒载体。

本发明所提供的重组腺相关病毒载体，是携带人U6启动子和RNAi核苷酸序列，其针对SOCS1的RNAi序列为：

5′-CAGCTTAACTGTATCTGGA-3′

用于转录该shRNA的DNA序列为：

正义链：5′-TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGC TCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3′；

反义链：5′-CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTGG-3′；

本发明的第二个目的是提供上述shRNA重组腺相关病毒载体的构建方法。

本发明所提供的构建方法，是使用常规的基因重组方法，先将腺相关病毒载体中的结构基因剔除，再将人U6 snRNA启动子与shRNA核苷酸序列与AAV质粒连接，构建成靶向SOCS1基因的RNAi表达质粒，然后将shRNA重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到相应的重组腺相关病毒(rAAV/shRNA)。

本发明的最后一个目的是提供上述shRNA重组腺相关病毒载体及其相关产品在制备抗肿瘤药物及疫苗中的用途。

附图说明

图1为人U6启动子PCR扩增鉴定图。

图2重组腺相关病毒载体的结构示意图。

图3为重组腺相关病毒载体rAAV的双酶切鉴定图。

图4为重组腺相关病毒rAAV的制备流程图。

图5为重组腺相关病毒的病毒滴度检测结果。

图6为重组腺相关病毒载体感染效率流式检测图。

图7为RT-PCR检测靶基因干扰效率。

图8为western blot检测靶基因干扰效率。

具体实施方式

实施例1目的基因片段的获取

所用引物、DNA序列由上海生工生物公司合成，DNA测序由华大基因公司完成。

hU6启动子引物序列：U6F：5′-ATATGCATCCAAGGTCGGG CAGGAAGAGGGCCTAT-3′和U6R：5′-ATCTCGAGATCGATGC GGCCGCCA TATGGA-3′。

根据NCBI Genebank中登录的人SOCS1基因序列(NM_003745)及shRNA设计原则，利用Ambion公司的RNAi Design软件，设计合成针对SOCS1基因有效的RNAi序列：

5′-CAGCTTAACTGTATCTGGA-3′

用于转录该shRNA的DNA序列为：

反义链：5′-CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTG G-3′；

实施例2pAAV2-SOCS1-shRNA载体构建及鉴定

A.采用PCR扩增技术扩增hU6启动子

利用引物U6F：5′-ATATGCATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG CCTAT-3′

和U6R：5′-ATCTCGAGATCGATGCGGCCGCCA TATGGA-3′，

通过PCR反应从PAVU6+27质粒中扩增出含hU6启动子的序列片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，胶回收纯化产物。

B.将扩增出的片段经SalI和XbaI双酶切后，和SOCS1-shRNA干扰序列连接，行琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收纯化产物，获得完整的hU6启动子及干扰序列，并行测序鉴定。

C.以XhoI和NsiI双酶切pAAV2和hU6启动子及干扰序列，分别回收大片段，以T4DNA连接酶将hU6启动子及干扰序列插入pAAV2质粒，得到重组腺相关病毒载体(pAAV2-SOCS1-shRNA)。

D.将连接后的导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(按分子克隆实验指南方法制备)，涂板到含100ug/mlAmp的LB琼脂培养基上进行抗性筛选，挑选阳性单克隆菌落，提取质粒并纯化，行后续双酶切鉴定(图3)，经鉴定正确的质粒再扩增培养，大量抽提质粒。

实施例2重组腺相关病毒(rAAV)的制备及滴度测定

A.按照Lipofectin说明书进行操作：将1.0ug rAAV载体质粒、phelper质粒、4.0ul Lipofectin和50ulDMEM混匀，共转染AAV-HEK293细胞培养过夜。次日换液，加入完全培养基。培养至72hr后，收集培养液和细胞于50ml无菌离心管中，剧烈振荡1分钟，4℃，10000rmp离心15min。取上清，过滤除菌，即可获得相应的重组腺相关病毒(rAAV/shRNA)。

B.病毒滴度的测定：以地高辛(DIG)标记的探针进行斑点杂交法检测rAAV的病毒滴度。以已知病毒滴度的质粒作为对照，制备的rAAV/shRNA病毒滴度(拷贝数)为1×10¹²eg/ml(图5)。

实施例3重组腺相关病毒转染效率的检测

无菌抽取健康志愿者外周血50mL，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，培养于6孔板，贴壁5h后，轻轻洗去悬浮的淋巴细胞，剩余贴壁的细胞即为DC前体细胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(800U/mL)的AIM-V培养基，隔天半量换液，从培养第2天起加入IL-4(1000U/mL)。在DC培养第3天用重组腺相关病毒(rAAV/shRNA)感染，实验分为干扰组、阴性对照组(NC)和空白对照组(Mock)。感染复数MOI为100，8小时后除去含病毒的培养基，以新鲜的AIM-V培养基取代之，并于第4天起给予TNF-a(20ng/mL)刺激DC成熟，第6天收集悬浮细胞，即为成熟的DC细胞，流式细胞仪检测GFP表达量，每个样本测10000个细胞，GFP阳性细胞的阳性率即为感染效率。可见重组腺相关病毒的感染效率高达90％以上(图6)。

实施例4重组腺相关病毒体外抑制效率检测

A.qRT-PCR检测干扰后SOCS1mRNA的表达情况

按照Trizol试剂盒操作说明分别提取干扰组、阴性对照组和空白对照组细胞总RNA，经逆转录获得cDNA。以GAPDH基因为内参，采用实时荧光定量PCR法检测SOCS1mRNA的表达情况。SOCS1基因上游引物序列为5′-AGAGCTTCGACTGCCTCTTC-3′，下游引物序列为5′-GATGCGCTGGCGGCACAGCT-3′；GAPDH基因为内参照，上游引物序列为5′-GCATCCTGGGCTACACTGAG-3′，下游引物序列为5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。实验操作按试剂盒说明书进行。PCR反应采用美国罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪完成。采用相对定量法计算SOCS1mRNA的变化。实时荧光定量PCR结果显示，与空白细胞组及阴性对照组比较，干扰组mRNA表达量下调达82.5％，较对照组显著下调，差异有统计学差异(P＜0.05)。(见图7)

B.Western blot检测干扰后SOCS1蛋白的表达情况

转染96h后收集各组细胞进行总蛋白提取，BCA法测定总蛋白浓度，样品蛋白SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜上，封闭液中孵育，加入鼠抗人SOCS1单克隆一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜。TBST洗涤后加入山羊抗鼠二抗(1∶1000)室温下摇床孵育2h，TBST洗涤后用化学发光试剂孵育1min，用X线片曝光显影。以β-actin为内参照验证蛋白的含量。Western blot检测结果显示：与空白细胞组及阴性对照组相比，干扰组SOCS1蛋白的表达显著降低(P＜0.05)(见图8)。

临床应用

实验证明，本发明的shRNA重组腺相关病毒载体能有效下调人DC中SOCS1基因的表达，这为后续研究、制备SOCS1受抑的DC抗肿瘤效应和制备新型DC疫苗奠定了基础，有很好的临床应用前景。

Claims

1.一种针对SOCS1的RNAi序列：5′-CAGCTTAACTGTATCTGGA-3′

2.一种用于转录权利要求1所述的shRNA的DNA序列，其DNA序列的正义链：

5′-TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGC TCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3′；

反义链：

5′-CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTG G-3′

3.权利要求1、2所述的RNAi序列及shRNA的DNA序列在制备抗肿瘤药物及疫苗中的用途。

4.一种重组腺相关病毒基因治疗载体及构建方法，其特征在于：所述的重组腺相关病毒载体携带有权利要求2所述的DNA序列和适宜的启动子和终止子。

5.权利要求4所述的shRNA重组腺相关病毒载体及相关产品的制备方法，包括如下步骤：

(a)设计合成具有靶向抑制SOCS1基因的shRNA的DNA序列；

(b)将人U6snRNA启动子与RNAi核苷酸序列连接，分别经双酶切后与AAV载体质粒相连接，构建成靶向SOCS1基因的RNAi表达质粒；

(c)将上述shRNA重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到相应的重组腺相关病毒(rAAV/shRNA)。

6.权利要求4、5所述的shRNA重组腺相关病毒载体及其相关产品在制备抗肿瘤药物及疫苗中的用途。