CN109688807B - 具有增加的除草剂耐受性的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物或植物部分，所述植物或植物部分包含编码突变TriA多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的表达向植物或植物部分赋予除草剂耐受性。

Description

具有增加的除草剂耐受性的植物
技术领域
本发明总体上涉及向植物赋予农用水平的除草剂耐受性的方法。特别地，本发明涉及对除草剂，更具体地对抑制纤维素生物合成并因此干扰细胞壁生物合成的除草剂，具有增加的耐受性的植物。
背景技术
微生物经常通过演化出利用生物异源物质作为其生长的营养源和能量源的机制，响应于这些物质向环境的输入。由于基于s-三嗪环的除草剂的结构不同于天然存在的化合物(Esser等人,1975)，微生物缓慢演化出能够降解它们的酶和途径。酰胺水解酶超家族包含令人瞩目的一组酶，这些酶催化水解广泛类型的在碳中心和磷中心携带酰胺或酯官能团的底物。在全部情况下，亲核性水分子通过与单核或双核金属中心络合而被激活。在单核金属中心，通过来自活性部位的质子转移激活底物并且通过金属连接和广义碱催化激活水。金属中心位于(βα)8结构域内部的β-桶核芯的C末端。一个明显例子是阿特拉津(atrazine)氯水解酶(AtzA)，一种催化除草剂阿特拉津水解脱氯，从而产生非除草产物2-羟阿特拉津(de Souza等人,1996；Seffernick等人,2002；Sadowsky和Wackett 2000)的Fe(II)依赖性同源六聚体(Seffernick等人,2002；Wackett等人,2002)。AtzA的已知最接近酶是蜜胺脱氨酶(来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)菌株NRRL B-12227的TriA；98％序列同一性)。尽管其序列相似性高，但AtzA和TriA在催化上不同；TriA是脱氯酶活性低于其生理脱氨酶活性几个数量级的脱氨酶，而AtzA是无可检出脱氨酶活性的脱氯酶。先前的工作已经显示，两种蛋白质之间不同的九个氨基酸中三个氨基酸(S331C；N328D；和F84I AtzA)主要负责催化特异性的差异。
本发明提供通过引入编码靶蛋白的细菌基因，增加植物中除草剂耐受性的新方法，所述靶蛋白生物降解除草剂，尤其命名为吖嗪类的纤维素生物合成抑制剂。细菌酶TriA以保留或增加酰胺水解酶活性并向接受体积更大底物的方向扩大酶口袋的形式工程化。本发明的发明人已经令人惊讶地发现，与非转化和/或非诱变的植物或植物细胞相比，在植物中过量表达野生型形式或突变形式的蜜胺脱氨酶TriA赋予针对特定类别除草剂的耐受性/抗性。更具体，本发明的发明人已经发现，TriA表达赋予吖嗪类耐受性/抗性。
本发明的技术问题可以视为通过鉴定靶多肽提供新性状，其中对所述靶多肽的操作令植物耐受除草剂。
三项主要策略可用于使植物耐受除草剂，即(1)用酶将除草剂脱毒，所述酶将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物，例如，用于溴苯腈耐受性或basta耐受性的酶(EP242236、EP337899)；(2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代谢物较不敏感的有功能酶，例如，用于草甘膦耐受性的酶(EP293356，Padgette S.R.等人,J.Biol.Chem.,266,33,1991)；或(3)过量表达敏感酶，从而在植物中产生根据敏感酶的动力学常数相对于除草剂而言足够量的靶酶，从而尽管植物中存在该酶的抑制剂，也仍有足够的有功能酶可用。
该技术问题由本发明的主题解决。
发明概述
因此，在一个方面，本发明提供植物或植物部分，所述植物或植物部分包含编码突变的TriA多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的表达向植物或植物部分赋予除草剂耐受性。
在一些方面，本发明提供种子，所述种子能够萌发成在其至少一些细胞中包含多核苷酸的植物，其中，所述多核苷酸与在植物细胞中可工作的启动子有效连接，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变的TriA多肽，突变的TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在一个方面，本发明提供能够再生出植物的植物细胞，所述植物在其至少一些细胞中包含多核苷酸，其中所述多核苷酸与在植物细胞中可工作的启动子有效连接，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变的TriA多肽，突变的TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性，其中所述植物细胞包含与启动子有效连接的所述多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供植物细胞，所述植物细胞包含与在细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变的TriA多肽，突变的TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在其他方面，本发明提供从植物或植物部分制备的植物产品，所述植物或植物部分在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变的TriA多肽，突变的TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在一些方面，本发明提供衍生自下述植物的子代或后代植物，所述植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，启动子能够表达由所述多核苷酸编码的突变的TriA多肽，其中所述子代或后代植物在其至少一些细胞中包含与所述启动子有效连接的所述重组多核苷酸，且该突变的TriA多肽的表达向该子代或后代植物赋予除草剂耐受性。
在其他方面，本发明提供一种在生长植物的位置控制杂草的方法，所述方法包括：(a)向该位置施用包含除草剂的除草剂组合物；和(b)在该位置播种种子，其中种子能够产生植物，所述植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达该多核苷酸编码的突变的TriA多肽，突变的TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在一些方面，本发明提供一种在生长植物的位置控制杂草的方法，所述方法包括：向该位置施用包含除草剂的除草组合物，其中所述位置是：(a)含有植物或能够产生所述植物的种子的位置；或(b)待在所述施用后包含植物或种子的位置，其中所述植物或种子在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在一个方面，步骤(a)在步骤(b)之前、之后或与之同时进行。
在其他方面，本发明提供一种产生具有除草剂耐受性的植物的方法，所述方法包括从植物细胞再生出植物，所述植物细胞用与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸转化，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
在一个方面，本发明提供一种产生具有除草剂耐受性的子代植物的方法，所述方法包括：将耐除草剂的第一植物与第二植物杂交以产生耐除草剂的子代植物，其中第一植物和子代植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
此外，本发明涉及一种通过使用核酸编码的本发明野生型或突变TriA鉴定除草剂的方法，所述核酸包含SEQ ID NO:1、或其变体、同源物、旁系同源物或直向同源物的核苷酸序列。
所述方法包括步骤：
a)产生包含编码本发明突变TriA的核酸的转基因细胞或植物，其中表达本发明的突变TriA；
b)向a)的转基因细胞或植物以及相同品种的对照细胞或植物施用除草剂；
c)在施用所述测试化合物后测定转基因细胞或植物和对照细胞或植物的生长或生存力，和
d)选择与转基因细胞或植物的生长相比引起对照细胞或植物生长减少的测试化合物。
另一个目的涉及一种鉴定核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列编码抵抗或耐受除草剂的突变TriA，所述方法包括：
a)产生编码突变TriA的核酸的文库，
b)筛选所得的突变TriA编码核酸群体，其中在细胞或植物中表达每一所述核酸并且用除草剂处理所述细胞或植物，
c)比较由所述突变TriA编码核酸群体提供的除草剂耐受性水平与由对照TriA编码核酸提供的除草剂耐受性水平，
d)选择至少一个突变TriA编码核酸，与对照TriA编码核酸提供的除草剂耐受性水平相比，所述核酸提供显著增加的除草剂耐受性水平。
在一个优选实施方案中，与对照TriA编码核酸提供的耐受性相比，步骤d)中选出的突变TriA编码核酸提供至少2倍的除草剂耐受性。
可以通过以下方式确定抗性或耐受性：产生包含步骤a)的文库核酸序列的转基因植物并且比较所述转基因植物与对照植物。
另一个目的涉及分离、重组和/或化学合成的编码突变TriA的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或其变体(如下文定义)的序列。
优选实施方案涉及分离的和/或重组产生的和/或合成的核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的编码突变TriA多肽的核酸分子：
(a)编码突变TriA多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:2或其变体、旁系同源物、直向同源物或同源物的序列；
(b)包含SEQ ID NO:1或其变体、旁系同源物、直向同源物或同源物的序列的核酸分子；
(c)核酸分子，所述核酸分子作为遗传密码简并性的结果可以源自SEQ ID NO:2或其变体、旁系同源物、直向同源物或同源物的TriA多肽序列，并且与相应的例如非转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的除草剂耐受性或抗性；
(d)核酸分子，所述核酸分子与包含SEQ ID NO:1的核酸分子或其变体、旁系同源物、直向同源物或同源物的核酸分子的多核苷酸序列具有30％或更大同一性，优选地40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大同一性，并且与相应的例如非转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的除草剂耐受性或抗性；
(e)核酸分子，所述核酸分子编码与SEQ ID NO:2的TriA多肽序列具有30％或更大同一性，优选地至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大氨基酸序列同一性的突变TriA多肽，并且与相应的例如非转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的除草剂耐受性或抗性；
(f)核酸分子，所述核酸分子与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核酸分子在严格杂交条件下杂交，并且与相应的例如非转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的除草剂耐受性或抗性；
其中所述突变TriA多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO:2的以下位置对应的一个或多个位置处不同于野生型TriA多肽的氨基酸序列：69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328。
另一个目的涉及表达盒，所述表达盒包含本发明的核酸分子和在植物细胞中可工作的启动子。
优选地，启动子是来自大豆(Glycine max)的根特异性或根增强性启动子。
另一个目的涉及分离、重组和/或化学合成的突变TriA多肽，所述多肽包含SEQ IDNO 2、或其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物(如下文定义)的序列。
优选地，突变TriA多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO:2的以下位置对应的一个或多个位置处不同于野生型TriA多肽的氨基酸序列：69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220.、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328。
在其他方面，本发明提供植物或植物部分，所述植物或植物部分在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性，其中所述植物或植物部分还显示第二或第三除草剂耐受性性状。
在另一个实施方案中，本发明涉及由本发明的野生型或突变TriA核酸转化并表达该核酸的植物细胞、或已经被突变的植物，其中所述突变导致获得表达、优选过表达本发明野生型或突变TriA核酸的植物，其中与野生型品种的植物细胞相比，所述核酸在植物细胞中的表达导致除草剂抗性或耐受性增加。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物，其中与野生型品种的植物相比，核酸在植物中的表达导致植物的除草剂抗性增加。
优选地，与野生型品种的植物相比，植物中本发明核酸的表达导致植物的除草剂抗性增加。
在另一个实施方案中，本发明涉及由包含本发明植物细胞的转基因植物产生的种子，其中与野生型品种的种子相比，所述种子就增加的除草剂抗性而言为纯种的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞与野生型品种的植物细胞相比具有增加的除草剂抗性，所述方法包括用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达该多核苷酸编码的突变TriA多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物的方法，所述方法包括(a)用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达该多核苷酸编码的突变TriA多肽，和(b)从植物细胞产生除草剂抗性增加的植物。
优选地，表达盒还包含在植物中有功能的转录启动调节区和翻译起始调节区。
附图说明
图1显示了用吖嗪类处理的大豆植物的出苗前耐受性评估。野生型事件(A)和表达SEQ ID NO：2的triA突变变体的转基因事件(B)的表型发展，所述triA突变变体在四个位置含有氨基酸取代，即L92A_Y93L_M155T_F157L。所示值反映6-环戊基-N4-(2,3,4,5,6-五氟苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的[g/ha]量。每株植物的上部显示被毒伤的枝条(stungshoot)，下部显示根损伤。
图2显示了用吖嗪类处理的玉米植物的出苗前耐受性评估。野生型事件(A)和表达SEQ ID NO：2的triA突变变体的转基因事件(B)的表型发展，所述triA突变变体在四个位置含有氨基酸取代，即L92A_Y93L_M155T_F157L。所示值反映6-环戊基-N4-(2,3,4,5,6-五氟苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的[g/ha]量。
发明详述
冠词“a”和“an”在本文中用来指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“an”要素意指一或多个要素。
如本文中所用，措辞“包含”或其变形形式如“包含了”或“包含着”将理解为意指包括所述的要素、整数或步骤，或成组的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤或成组的要素、整数或步骤。
术语“控制不想要的植物或杂草”将理解为意指杀死杂草和/或迟滞或抑制杂草的正常生长。杂草在最广泛的意义上理解，指在不想要它们的位置生长的所有植物。本发明的杂草包括例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。另外，本发明的杂草可以包括例如正在不希望其存在的位置生长的作物植物。例如，如果大豆植物田中不希望有玉米植物，则在主要包含大豆植物的大田中存在的自生玉米植物可以视为一种杂草。
术语“植物”以其最广意义使用，它涉及有机体物质并且意在涵盖属于植物界的真核生物，其例子包括但不限于维管植物、蔬菜、粮食作物、花卉、乔木、药草、灌木、草本植物、藤本植物、蕨类植物、藓类植物、真菌和藻类等，以及用于无性繁殖的克隆、分枝和植物部分(例如扦插物、pipings、芽、根状茎、地下茎、丛、冠、鳞茎、球茎、块茎、根状茎、在组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”还涵盖完整植株、植物的祖先和后代和植物部分、包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、花梗、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞以及植物的任何其他已知器官、组织和细胞、其中上述每一种均包含目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中前述每一者均包含目的基因/核酸。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括草料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的列表：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油籽油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloaspp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugeniauniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycinemax)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinari)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecalerimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)、苋菜、球蓟(artichoke)、芦笋、花茎甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、花椰菜、旱芹、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻、羽衣甘蓝(kale)、兵豆、油籽油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶和藻类等。根据本发明的一个优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子尤其包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油籽油菜、棉、番茄、马铃薯或烟草。进一步优选地，植物是单子叶植物，如甘蔗。进一步优选地，植物是禾谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
通常，术语“除草剂”在本文中用来意指杀死、控制或以其它方式不利地调节植物生长的活性成分。除草剂的优选量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这样的量或浓度，所述量或浓度足够杀死相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是所述量不杀死本发明的抗除草剂植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或不同样地严重抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。当用于本发明的除草剂在植物的任何生长阶段或在植物种植或出苗之前直接施用至植物或施用至植物位置时，它们显示除草活性。观察到的效果取决于待控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释物的施用参数和喷雾液滴大小、固态组分的粒度、使用时的环境条件、所用的具体化合物、使用的具体辅助剂和载体、土壤类型等，以及施用的化学品的量。如本领域已知，可以调节这些因素和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。通常，可以在PPI(种植前掺入)、PPSA(种植后表面施用)、出苗前或出苗后，应用除草剂处理。出苗后处理一般对相对不成熟的非期望植物进行，以实现对杂草的最大控制。
“耐除草剂的”或“抗除草剂的”植物意指耐受或抵抗下述水平的至少一种除草剂的植物，所述水平通常会杀死正常植物或野生型植物或抑制其生长。正常情况下抑制非耐受性植物生长的除草剂水平是已知的并且可以由本领域技术人员容易地确定。例子包括生产商推荐施用的量。最大比率是正常情况下抑制非耐受性植物生长的除草剂量的一个例子。对于本发明，术语“除草剂耐受的”和“除草剂抵抗的”互换地使用并且意图具有等同的意义和等同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”互换地使用并且意图具有等同的意义和等同的范围。类似地，术语“耐受的”和“抵抗的”互换地使用并且意图具有等同的意义和等同的范围。如本文所用，就其多个实施方案中有用的除草组合物而言，术语如除草剂等，指本领域公认的那些农艺学可接受的除草剂有效成分(A.I.)。类似地，术语如杀真菌剂、杀线虫剂、杀虫剂等指本领域公认的农艺学可接受的其他有效成分。
当谈及特定的突变酶或多肽使用时，术语如耐除草剂和除草剂耐受性指这类酶或多肽在下述量的除草剂A.I.存在下发挥其生理活性的能力，所述量正常情况下将失活野生型(非突变)形式的所述酶或多肽或抑制其活性。在另一方面，就TriA酶具体使用时，该术语特别指将抑制纤维素生物合成的除草剂(所谓的纤维素生物合成抑制剂(CBI))代谢并因而使其失活的能力。“耐除草剂的突变TriA蛋白”或“抗除草剂的突变TriA蛋白”意指，在已知干扰纤维素生物合成的至少一种除草剂存在时并且在该除草剂的已知抑制纤维素生物合成的浓度或水平，相对野生型TriA蛋白的代谢活性，这种突变TriA蛋白显示更高的代谢活性。另外，这种耐除草剂或抗除草剂的突变TriA蛋白的TriA活性可以在本文中称作“耐除草剂”或“抗除草剂”TriA活性。
如本文所用，当谈及核酸或多肽时，“重组”表示这类材料已经因人为应用重组技术，如通过多核苷酸限制性切割和连接、通过多核苷酸重叠延伸或通过基因组插入或转化而改变。如果基因序列可读框的核苷酸序列已经从其天然背景移出并克隆入任何类型的人工核酸载体，则该基因序列可读框是重组的。术语重组还可以指具有重组物质的生物，例如，包含重组核酸的植物可以视为重组植物。
术语“转基因植物”指包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定整合在基因组中，从而多核苷酸传递给后续世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的组成部分而整合入基因组中。“转基因”在本中用来指其基因型已经因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此改变的转基因生物或细胞，以及通过杂交或无性繁殖从初始转基因生物或细胞产生的那些。在一些实施方案中，“重组”生物是“转基因”生物。如本文所用的术语“转基因”不意在涵盖，通过常规植物育种方法(例如，杂交)、或通过天然存在的事件例如自受精、随机异花受精、非重组性病毒感染、非重组性细菌转化、非重组性转座或自发突变，对(染色体或染色体外)基因组的改变。
如本文所用，“诱变的”指，与相应野生型生物或DNA的遗传物质的序列相比，在其天然遗传物质的生物分子序列中具有改变的生物或其DNA，其中遗传物质的改变由人为措施引起和/或选择。可以用来产生诱变的生物或DNA的人为措施的例子包括但不限于，用化学诱变剂如EMS处理并后续用除草剂选择；或通过X射线处理植物细胞并后续用除草剂选择。可以用本领域已知的任何方法来诱导突变。诱导突变的方法可以在遗传物质的随机位置诱导突变或可以在遗传物质的特定位置诱导突变(即，可以是定向诱变技术)，如通过使用基因整形(genoplasty)技术。
如本文所用，“基因修饰的生物”(GMO)是这样的生物，所述生物的遗传特征含有人为方式造成的改变，所述的人为方式造成转染，导致目标生物被来自另一生物或“源”生物的遗传物质或被合成或修饰的天然遗传物质转化；或可以是这样的生物的后代生物，所述后代生物保留所插入的遗传物质。源生物可以是不同类型的生物(例如，GMO植物可以含有细菌的遗传物质)或来自相同类型的生物(例如，GMO植物可以含有来自另一植物的遗传物质)。就植物和其他生物而言，如本文所用，“重组”、“转基因”和“GMO”视为同义词并表示存在来自不同来源的遗传物质；相反，“诱变的”用来指，植物或其他生物或其DNA中不存在这类转基因物质，但是其中的天然遗传物质已经被突变从而与相应的野生型生物或DNA不同。
如本文所用，“野生型”或“相应的野生型植物”意指生物或其遗传物质在正常情况下存在的典型形式，该形式区别于例如诱变形式和/或重组形式。类似地，“对照细胞”或“相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺少本文公开的本发明抗除草剂特征和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。使用术语“野生型”因此不意图暗示植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA，和/或不拥有与本文中所披露的那些除草剂抗性特征相异的除草剂抗性特征。
如本文所用，“后代”指任何代次的植物。在一些实施方案中，后代是第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十代植物。
如本文所用，“子代”指第一代植物。
术语“种子”包含全部类型的种子，例如，实生种子(true seeds)、颖果、瘦果、果实、块茎、籽苗和相似形式。在芸苔属(Brassica)和白芥属(Sinapis)物种的情况下，除非另外说明，否则“种子”指实生种子。例如，种子可以是转基因植物的或通过传统育种方法获得的植物的种子。传统育种方法的例子可以包括杂交育种、自交、回交、胚拯救、近交系杂交、远缘杂交、近交、选择、无性繁殖和如本领域已知的其他传统技术。
尽管在多个实施方案中参考特定植物或植物变种及其杂种加以例举，但本发明描述的使用除草剂的方法可以随多种有商业价值的植物一起使用。描述为本文中有用的耐除草剂植物株系可以直接或间接地用于杂草控制方法中，即，作为供除草剂处理的作物、或作为除草剂耐受性状供体株系供开发，以产生含有这种性状(一或多个)的其他品种作物和/或杂交作物。含有祖先耐除草剂性状(一个或多个)的全部这类所得品种作物或作物，可以在本文中称作祖先耐除草剂株系的子代或后代。这类所得的植物可以称作保留祖先植物的“除草剂耐受性特征”，即意指它们拥有并表达负责该性状的祖先遗传分子组分。
在一个方面，本发明提供植物或植物部分，所述植物或植物部分包含编码突变TriA多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的表达向植物或植物部分赋予除草剂耐受性。
在一个优选实施方案中，已经通过下述方法事先产生该植物，所述方法包括通过引入并过量表达本发明的野生型或突变的TriA转基因，重组地制备植物，如下文更详细描述。
在另一个实施方案中，编码突变TriA多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、或其变体或衍生物的核酸序列。
在其他实施方案中，本发明的突变TriA多肽是功能性变体，其在变体的全长上与SEQ ID NO:2具有至少约80％、例如至少约80％、90％、95％、98％、99％或更大氨基酸序列同一性。
在另一个实施方案中，根据本发明使用的突变TriA多肽是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的功能性片段。
可以认识到，本发明的TriA多核苷酸分子和TriA多肽涵盖这样的多核苷酸分子和多肽，所述的多核苷酸分子和多肽包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列足够同一的核苷酸序列或氨基酸序列。术语“足够同一”在本文中用来指，第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列相比含有足够或最小数目的相同或等同(例如具有相似侧链的)氨基酸残基或核苷酸，从而所述的第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。
通常，“序列同一性”指两个最佳比对的DNA或氨基酸序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗口的整个范围内不变的程度。测试序列和参考序列的已比对区段的“同一性分数”是，两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即完整的参考序列或规定的参考序列的较小部分)中组分的总数目。"％同一性"是同一性分数乘以100。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以由以下工具实施：如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性检索方法，并且优选地由这些算法的计算机化执行，如作为GCG Wisconsin Package(Accelrys Inc.,Burlington,Mass.)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。
核苷酸和寡核苷酸
“分离的多核苷酸”，包括DNA、RNA或其组合、单链或双链、有义或反义或二者的组合、dsRNA或其他形式，意指所述多核苷酸至少部分地与其天然状态下结合或连接的多核苷酸序列分离。优选地，分离的多核苷酸是至少60％不含、优选地至少75％不含并且最优选地至少90％不含与其天然结合的其他组分。技术人员将清楚，分离的多核苷酸可以是例如存在于转基因生物中的外源多核苷酸，所述转基因生物不天然地包含该多核苷酸。另外，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用，并且指核苷酸(即，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、或二者组合)的任意长度的聚合非分支形式。
术语“突变的TriA核酸”指，所述TriA核酸具有从野生型TriA核酸突变而来的序列并且向表达该核酸的植物赋予增加的除草剂耐受性。另外，术语“突变的蜜胺脱氨酶(突变的TriA)”指，将SEQ ID NO:2或其变体、衍生物、同源物、直向同源物或旁系同源物的野生型一级序列中的氨基酸替换为其它氨基酸。表述“突变的氨基酸”在下文用来指被另一种氨基酸替换的氨基酸，因而指示蛋白质的一级序列中突变的位点。
在一个优选实施方案中，编码突变TriA的TriA核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或其变体或衍生物的序列。
另外，本领域技术人员将理解该TriA核苷酸序列涵盖SEQ ID NO:1的同源物、旁系同源物和直向同源物，如下文定义。
相对于一个序列(例如，多肽或核酸序列，例如，本发明的转录调节性核苷酸序列)而言，术语"变体"意图指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列，变体包括因为遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。可以使用熟知的分子生物学技术，例如聚合酶链反应(PCR)和杂交技术，鉴定天然存在的等位基因变体(如这些变体)。变体核苷酸序列也包括合成来源的核苷酸序列，如通过例如使用位点定向诱变法产生的那些核苷酸序列，并且对于可读框而言，其可以编码包含SEQ ID NO:2的序列的天然蛋白，以及编码相对于该天然蛋白具有氨基酸取代的多肽(例如，如本文中公开的本发明突变TriA)。通常，本发明的核苷酸序列变体将对SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少30％、40％、50％、60％至70％，例如优选地71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％、通常至少80％、例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％和99％核苷酸“序列同一性”。通过空位生成罚分＝5和空位延伸罚分＝0.3的GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)，确定多核苷酸的同一性％。除非另外声明，否则查询序列为至少45个核苷酸长度，并且GAP分析在至少45个核苷酸的区域范围内比对二个序列。优选地，查询序列为至少150个核苷酸长度，并且GAP分析在至少150个核苷酸的区域范围内比对二个序列。更优选地，查询序列为至少300个核苷酸长度，并且GAP分析在至少300个核苷酸的区域范围内比对二个序列。甚至更优选地，GAP分析在序列全长范围内比对二个序列。
多肽
“基本上纯化的多肽”或“纯化的”多肽意指，所述多肽已经与在其天然状态下与之结合的一种或多种脂质、核酸、其他多肽或其他杂质性分子分离。优选基本上纯化的多肽至少60％不含、更优选地至少75％不含和更优选地至少90％不含与其天然结合在一起的其他组分。如技术人员明了，纯化的多肽可以是重组产生的多肽。术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用并且指可以通过或可以不通过添加非氨基酸基团修饰的单条多肽链。将理解，这类多肽链可以与其他多肽或蛋白质或其他分子如辅因子结合。如本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”还包括如本文所述的本发明多肽的变体、突变体、修饰物、类似物和/或衍生物。
通过空位生成罚分＝5和空位延伸罚分＝0.3的GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)，确定多肽的同一性％。查询序列为至少25个氨基酸长度，并且GAP分析在至少25个氨基酸的区域范围内比对二个序列。更优选地，查询序列为至少50个氨基酸长度，并且GAP分析在至少50个氨基酸的区域范围内比对二个序列。更优选地，查询序列为至少100个氨基酸长度，并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域范围内比对二个序列。甚至更优选地，查询序列为至少250个氨基酸长度，并且GAP分析在至少250个氨基酸的区域范围内比对二个序列。甚至更优选地，GAP分析在二个序列的整个长度范围内比对二个序列。
就一个确定的多肽而言，可以理解高于上文提供那些数值的同一性％数值将涵盖优选的实施方案。因此，在适用的情况下，基于最小同一性％数值，优选本发明的TriA多肽包含与SEQ ID NO:2至少40％、更优选地至少45％、更优选地至少50％、更优选地至少55％、更优选地至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％和甚至更优选地至少99.9％同一的氨基酸序列。
"变体"多肽意指通过以下方式从SEQ ID NO:2的蛋白质衍生的多肽：在该天然蛋白的N末端和/或C末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或在该天然蛋白中一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。此类变体可以例如因遗传多态性或因人为操作而产生。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。
蛋白质的“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于其所源自的未修饰蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且具有相似的生物学活性和功能活性。因此，除非特别描述，TriA多肽的功能性变体和片段及编码它们的核酸分子也处于本发明的范围内，不考虑所述多肽的来源以及其是否天然存在。用于TriA多肽的功能性的多种测定法均可以使用。例如，可以分析TriA多肽的功能性变体或片段以确定其赋予除草剂脱毒作用的能力。例如，除草剂脱毒率可以定义为这样的催化性速率，其足以在包含编码TriA多肽的变体或片段的重组多核苷酸的植物或植物部分中提供可确定的除草剂耐受性增加，其中相对于类似处理的不表达该变体或片段的对照植物，该植物或植物部分以不多于细胞总蛋白的约0.5％、例如约0.05％至约0.5％、约0.1至约0.4％和约0.2至约0.3％，表达该变体或片段。
在一个优选实施方案中，突变TriA多肽是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蜜胺脱氨酶的功能性变体或片段，其中功能性变体或片段与SEQ ID NO:2具有至少约80％氨基酸序列同一性。
在其他实施方案中，功能性变体或片段还可以具有定义为下述催化性速率的除草剂脱毒率，所述催化性速率足以在包含编码该变体或片段的重组多核苷酸的植物或植物部分中提供可确定的除草剂耐受性增加，其中相对于类似处理的不表达该变体或片段的对照植物，该植物或植物部分以不多于细胞总蛋白的约0.5％表达该变体或片段。
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于其所源自的未修饰蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与未修饰蛋白具有相似的生物学活性和功能活性。
此外，本领域普通技术人员将进一步理解，可以通过突变向本发明的核苷酸序列引入变化，从而导致所编码的蛋白质的氨基酸序列变化，但不改变该蛋白质的生物学活性。因此，例如，可以通过以下方式产生编码突变TriA多肽的分离的多核苷酸分子，所述多肽具有不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入相应的核苷酸序列，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白质。可以通过标准技术如位点定向诱变法和PCR介导的诱变法引入突变。本发明也包括这类变体核苷酸序列。例如，优选地，可以在一个或多个预测的、优选地非必需的、氨基酸残基处产生保守性氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从蛋白质的野生型序列改变、同时不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性所需要的残基。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指向蛋白质中的预定位点引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，为约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure BDA0001990628130000191
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
取代指用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过也可以是簇集性的，这取决于置于多肽上的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸变动；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类取代将不对保守氨基酸残基或不对保守基序中存在的氨基酸残基进行。保守性取代表是本领域熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著))。
可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
“衍生物”还包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或者非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也涵盖这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然改变的(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与其所源自的氨基酸序列相比，衍生物也可以包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或其它配体)，例如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，以及相对于天然存在的蛋白质的氨基酸序列而言为非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(对于标签肽的综述，参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。
“直向同源物”和“旁系同源物”涵盖用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于祖先基因复制的基因；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，其也衍生自共同的祖先基因。
本发明涵盖的SEQ ID NO:2的变体、直向同源物和旁系同源物示于，但不限于，包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31的多肽。
本领域熟知，旁系同源物和直向同源物可以在给定位点共有携带合适氨基酸残基的独特结构域，如用于特定底物的结合袋或用于与其他蛋白质相互作用的结合基序。
术语“结构域”指，沿进化相关蛋白质的序列比对，在特定位置处保守的一组氨基酸。在同源物之间尽管在其他位置处的氨基酸可以不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifsand its function in automatic sequence interpretation.(ln)ISMB-94；Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology.Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编著，第53-61页,AAAIPress,Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具在ExPASy蛋白质组服务器上可获得(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis,NucleicAcids Res.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
用于比对序列来比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分数并且进行两个序列之间相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定同源物(参见图1)。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定总体相似性和同一性百分数(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
本发明的蛋白质可以按照多种方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变，制备氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列变更的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)PNAS,82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编著(1983),Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company,New York)和其中引用的参考文献。可以在Dayhoff等人(1978)Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到关于不影响目的蛋白的生物学活性的适宜氨基酸取代的指南，所述文献通过引用的方式并入本文。保守性取代，如将一个氨基酸交换为具有相似特性的另一个氨基酸，可以是优选的。
备选地，变体核苷酸序列可以通过沿着全部或部分的编码序列随机引入突变(如通过饱和诱变法)产生，并且可以筛选得到的突变体以鉴定编码保留活性的蛋白质的突变体。例如，诱变后，可以重组地表达所编码的蛋白质，并且可以使用标准测定法技术测定该蛋白质的活性。
本发明的发明人已经发现，通过取代SEQ ID NO:2的TriA酶的一个或多个关键氨基酸残基，例如，通过使用一个上述方法突变TriA编码核酸，可以明显地增加针对特定除草剂的耐受性或抗性。突变TriA的优选取代是增加植物的除草剂耐受性、但保留脱氨酶活性的生物学活性基本上不受影响的那些取代。
因此，本发明的另一个目的涉及突变TriA多肽，所述多肽包含其关键氨基酸残基由任何其他氨基酸取代的、SEQ ID NO:2或其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列。
本领域技术人员将理解，也可以取代紧邻下文所提到的氨基酸位置的氨基酸。因此，在另一个实施方案中，SEQ ID NO:2或其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的变体包含突变的TriA，其中距关键氨基酸±3、±2或±1个氨基酸位置的氨基酸由任何其他氨基酸取代。
基于本领域熟知的技术，可以形成高度特征性序列样式，借助所述序列样式可以检索具有所需活性的其他突变的TriA候选物。
本发明也涵盖通过使用合适的序列样式检索其他突变的TriA候选物。本领域技术人员明了，本发明序列样式不受该样式的两个相邻氨基酸残基之间的确切距离所限制。以上序列样式中每两个相邻者之间的距离可以例如彼此独立地变动多达±10、±5、±3、±2或±1个氨基酸位置，而基本上不影响所需的活性。
另外，通过采用位点定向诱变法，例如，饱和诱变剂法(参见，例如Schenk等人,Biospektrum 03/2006,第277-279页)，本发明的发明人已经鉴定并生成特定氨基酸取代和其组合，当相应的突变TriA编码核酸通过转化而引入植物和表达时，所述氨基酸取代和其组合向所述植物赋予对除草剂增加的除草剂抗性或耐受性。
因此，在一个特别优选的实施方案中，突变TriA的变体或衍生物指包含SEQ IDNO:2、其直向同源物、旁系同源物或同源物的TriA多肽，其中氨基酸序列在与SEQ ID NO:2的以下位置对应的一个或多个位置处不同于TriA多肽的野生型氨基酸序列：69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328。
这些氨基酸位置处差异的例子包括但不限于以下一种或多种：
与位置69相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置70相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置71相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置74相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置82相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置84相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置85相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置87相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置88相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置89相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置91相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置92相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置93相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置96相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置126相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置128相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置129相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置130相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置131相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置155相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置157相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置160相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置167相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置170相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置174相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置180相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置182相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置216相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置217相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置219相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置220相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置246相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置247相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置248相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置249相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置250相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置251相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置298相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置301相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置302相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置304相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置328相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代。
这些氨基酸位置处差异的例子包括但不限于以下一种或多种：
与位置69相对应的氨基酸不是缬氨酸；
与位置70相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置71相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置74相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置82相对应的氨基酸不是精氨酸；
与位置84相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置85相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置87相对应的氨基酸不是色氨酸；
与位置88相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置89相对应的氨基酸不是苯丙氨酸；
与位置91相对应的氨基酸不是缬氨酸；
与位置92相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置93相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置96相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置126相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置128相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置129相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置130相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置131相对应的氨基酸不是异亮氨酸；
与位置155相对应的氨基酸不是蛋氨酸；
与位置157相对应的氨基酸不是苯丙氨酸；
与位置160相对应的氨基酸不是蛋氨酸；
与位置167相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置170相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置174相对应的氨基酸不是赖氨酸；
与位置180相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置182相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置216相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置217相对应的氨基酸不是异亮氨酸；
与位置219相对应的氨基酸不是脯氨酸；
与位置220相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置246相对应的氨基酸不是谷氨酸；
与位置247相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置248相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置249相对应的氨基酸不是组氨酸；
与位置250相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置251相对应的氨基酸不是谷氨酸；
与位置298相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置301相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置302相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置304相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置328相对应的氨基酸不是天冬氨酸。
在优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的的氨基酸是Thr、Cys、Gly、Val或Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Thr、Val、Gly、Cys或Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Val，与位置71相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Val，与位置71相对应的氨基酸是Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Thr，与位置71相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Thr，与位置71相对应的氨基酸是Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置155相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置128相对应的氨基酸是Gly、Pro或Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置128相对应的氨基酸是Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置70相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置128相对应的氨基酸是Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Thr、Ala、Met或Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Ala，与位置70相对应的氨基酸是Leu，与位置71相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Ala，与位置70相对应的氨基酸是Ile，与位置71相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置88相对应的氨基酸是Val，与位置92相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置88相对应的氨基酸是Val，与位置92相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Val，与位置88相对应的氨基酸是Val，与位置92相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Val，与位置92相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置96相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Val，与位置92相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Ala，与位置157相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置128相对应的氨基酸是Ile，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置70相对应的氨基酸是Leu，与位置71相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Leu，与位置91相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Leu，与位置91相对应的氨基酸是Ala，与位置92相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Leu，与位置91相对应的氨基酸是Ala，与位置92相对应的氨基酸是Val，与位置88相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置157相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置69相对应的氨基酸是Ala、Leu或Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置74相对应的氨基酸是Val或Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置74相对应的氨基酸是Ala，与位置70相对应的氨基酸是Leu，与位置71相对应的氨基酸是Ile。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置82相对应的氨基酸是Leu、Met或Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置96相对应的氨基酸是Glu、Asp、Ala、Thr或Asn。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置126相对应的氨基酸是Ala、Met、Ser或Asp。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置128相对应的氨基酸是Ser、Ala或Asn。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置155相对应的氨基酸是Gly、Ala或Glu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置157相对应的氨基酸是Met或Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置167相对应的氨基酸是Ile，与位置88相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置167相对应的氨基酸是Ile，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置84相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置167相对应的氨基酸是Ile，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置84相对应的氨基酸是Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置216相对应的氨基酸是Ser或Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置217相对应的氨基酸是Ala、Ser或Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置219相对应的氨基酸是Gly，与位置249相对应的氨基酸是Asn。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置219相对应的氨基酸是Gly，与位置249相对应的氨基酸是Asn，与位置217相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置220相对应的氨基酸是Thr、Ser或Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置220相对应的氨基酸是Gly，与位置157相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置246相对应的氨基酸是Ser、Thr、Gln或Asp。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置247相对应的氨基酸是Ala、Asn、Val、Gly或Pro。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置248相对应的氨基酸是Ser、Asn或Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置249相对应的氨基酸是Val、Ile或Asn。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置250相对应的氨基酸是Glu或Asn。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置251相对应的氨基酸是Asp。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置251相对应的氨基酸是Asp，与位置248相对应的氨基酸是Glu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置298相对应的氨基酸是Cys、Asn、Thr或Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置301相对应的氨基酸是Ala、Thr或Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置302相对应的氨基酸是Glu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置304相对应的氨基酸是Lys。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置87相对应的氨基酸是Thr。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置128相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置128相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置128相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置88相对应的氨基酸是Ala，与位置128相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe，与位置128相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe，与位置128相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置157相对应的氨基酸是Val。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置328相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置89相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置89相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置89相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Ala，与位置160相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置89相对应的氨基酸是Ala、Val或Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置93相对应的氨基酸是Ala、Val、Leu或Phe。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置217相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置160相对应的氨基酸是Gly。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置250相对应的氨基酸是Ser。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置328相对应的氨基酸是Gly或Ala。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置129和/或位置130相对应的氨基酸被缺失。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置130和/或位置131相对应的氨基酸被缺失。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置170和/或位置182相对应的氨基酸被缺失。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置174和/或位置180相对应的氨基酸被缺失。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置89相对应的氨基酸是Ala，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置89相对应的氨基酸是Leu，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置85相对应的氨基酸是Leu，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu。
在另一个优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置85相对应的氨基酸是Leu，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Val。
在一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu，与位置155相对应的氨基酸是Val，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Phe，与位置96相对应的氨基酸是Thr，与位置128相对应的氨基酸是Gly。
在另一个特别优选的实施方案中，突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置71相对应的氨基酸是Asn，与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu，与位置96相对应的氨基酸是Thr，与位置128相对应的氨基酸是Gly。
其他优选的实施方案，即突变的组合，显示在下表1中。
Figure BDA0001990628130000381
Figure BDA0001990628130000391
鉴定由SEQ ID NO:1编码的同源物、直向同源物和旁系同源物之间共有的保守区域和基序将落入技术人员的知识范围内。在鉴定到可以代表合适结合基序的这类保守区域后，可以使用SEQ ID NO:2作为参考，选择氨基酸以由任何其他氨基酸、例如保守氨基酸、优选地由上文描述的氨基酸取代。
另一个目的涉及一种鉴定核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列编码抵抗或耐受除草剂的突变TriA，所述方法包括：
a)产生编码突变TriA的核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸并且用除草剂处理所述细胞或植物，筛选所产生的该突变TriA编码核酸群体，
c)比较由所述突变TriA编码核酸群体提供的除草剂耐受水平与对照TriA编码核酸提供的除草剂耐受水平，
d)选择至少一种突变TriA编码核酸，与对照TriA编码核酸提供的耐受性水平相比，所述核酸提供显著增加的除草剂耐受性水平。
也可以通过在细胞、组织或植物中测量脱毒率，确定除草剂耐受水平。
脱毒率是在相应组织中在一定的时间框内除草剂的降解率。可以例如通过偶联于高分辨(HR)质谱仪(MS)的液相色谱(LC)，分析性确定降解和产物形成。可以通过与可信标准品比较和/或通过结构阐明，确定产物。
在一个优选实施方案中，与对照TriA编码核酸提供的耐受性相比，步骤d)中选出的突变TriA编码核酸向细胞或植物提供至少2倍的除草剂抗性或耐受性。
在又一个优选实施方案中，与对照TriA编码核酸提供的抗性或耐受性相比，步骤d)中选出的突变TriA编码核酸向细胞或植物提供至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍的除草剂抗性或耐受性。
可以通过以下方式确定抗性或耐受性：产生包含步骤a)的文库核酸序列的转基因植物或宿主细胞，优选地植物细胞，并且比较所述转基因植物与对照植物或宿主细胞、优选地植物细胞。
技术人员熟知的许多方法可用于从多种不同的潜在来源生物(包括微生物、植物、真菌、藻类、混合培养物等)以及DNA环境来源(如土壤)获得合适的候选核酸用于鉴定编码突变TriA的核苷酸序列。这些方法包括尤其是，制备cDNA或基因组DNA文库、使用适当的简并寡核苷酸引物、使用基于已知序列的探针或互补测定法(例如，在酪氨酸上生长)、以及使用诱变法和改组法，以提供重组的或改组的突变TriA编码序列。
可以在酵母中、在细菌宿主菌株中、在藻类中或在高等植物如烟草或拟南芥(Arabidopsis)中表达包含候选和对照TriA编码序列的核酸，并且在不同浓度的所选择的除草剂存在下，根据转化菌株或植物的可视指示表型，筛选TriA编码序列的内在耐受性的相对水平。根据例如GR50(减少50％生长的浓度)或MIC(最低抑制浓度)值，可以便利地表述与这些指示表型(棕色的形成、生长抑制、除草效应等)相关的剂量反应和剂量反应的相对迁移，其中值的增加对应于表达的TriA的内在耐受性增加。例如，在基于细菌(如大肠杆菌)转化的相对快速的测定体系中，可以将每种突变TriA编码序列表达为DNA序列，例如，在可控启动子如lacZ启动子的表达控制下表达，并且例如通过使用合成性DNA，适当考虑诸如密码子选择等问题以便获得不同TriA序列的尽可能相当的表达水平。可以将表达包含替代性候选TriA序列的核酸的这些菌株在不同浓度的选定除草剂上在任选地补充酪氨酸的培养基中铺种，并且可以基于抑制棕色、褐黄病色素形成的程度和MIC，或通过借助LC-HRMS(液相色谱高分辨质谱法)测量除草剂降解，估计表达的TriA酶的内在耐受性的相对水平。
在另一个实施方案中，将候选核酸转化入植物材料以产生转基因植物，所述转基因植物再生成形态正常的能育植物，随后测量所述能育植物对选定除草剂的差异耐受性，如下文实施例部分中所述。本领域熟知许多合适方法可以用于转化，例如使用合适的选择标记如卡那霉素、双元载体(如来自农杆菌的双元载体)，以及用于植物再生(例如从烟草叶盘再生)。任选地，同样地用表达对照TriA的核酸转化对照植物群。可以以一系列不同浓度的除草剂，基于植物损伤、分生组织褪色症状等，以通常方式评价一系列原代植物转化事件或其子代针对上述除草剂的除草剂耐受性水平的平均数和分布。这些数据可以表示为例如从剂量/应答曲线推导的GR50值，所述剂量/应答曲线以“剂量”在x-轴上并且以“杀伤百分数”、“除草效应”、“出苗的绿色植株数”等在y-轴上绘制，其中GR50值增加对应于表达的TriA的内在耐受性水平增加。除草剂可以在出苗前或出苗后适当地施用。
本发明的另一个目的涉及分离、重组和/或化学合成的核酸，其编码如上文公开的突变TriA，其中所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其变体或衍生物。
这些氨基酸位置处差异的例子包括但不限于以下一种或多种：
与位置69相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置70相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置71相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置74相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置82相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置84相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置85相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置87相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置88相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置89相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置91相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置92相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置93相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置96相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置126相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置128相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置129相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置130相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置131相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置155相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置157相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置160相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置167相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置170相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置174相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置180相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置182相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置216相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置217相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置219相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置220相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置246相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置247相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置248相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置249相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置250相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置251相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置298相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置301相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置302相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置304相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代；
与位置328相对应的氨基酸被任何其他氨基酸取代。
在一个优选的实施方案中，编码的突变TriA是SEQ ID NO：2的变体，其包括以下一种或多种：
与位置69相对应的氨基酸不是缬氨酸；
与位置70相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置71相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置74相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置82相对应的氨基酸不是精氨酸；
与位置84相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置85相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置87相对应的氨基酸不是色氨酸；
与位置88相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置89相对应的氨基酸不是苯丙氨酸；
与位置91相对应的氨基酸不是缬氨酸；
与位置92相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置93相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置96相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置126相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置128相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置129相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置130相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置131相对应的氨基酸不是异亮氨酸；
与位置155相对应的氨基酸不是蛋氨酸；
与位置157相对应的氨基酸不是苯丙氨酸；
与位置160相对应的氨基酸不是蛋氨酸；
与位置167相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置170相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置174相对应的氨基酸不是赖氨酸；
与位置180相对应的氨基酸不是亮氨酸；
与位置182相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置216相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置217相对应的氨基酸不是异亮氨酸；
与位置219相对应的氨基酸不是脯氨酸；
与位置220相对应的氨基酸不是丙氨酸；
与位置246相对应的氨基酸不是谷氨酸；
与位置247相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置248相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置249相对应的氨基酸不是组氨酸；
与位置250相对应的氨基酸不是天冬氨酸；
与位置251相对应的氨基酸不是谷氨酸；
与位置298相对应的氨基酸不是谷氨酰胺；
与位置301相对应的氨基酸不是丝氨酸；
与位置302相对应的氨基酸不是天冬酰胺；
与位置304相对应的氨基酸不是酪氨酸；
与位置328相对应的氨基酸不是天冬氨酸。
在一个特别优选的实施方案中，由本发明的核酸编码的突变TriA包含SEQ ID NO：2的变体，其中与SEQ ID NO：2的位置92、93、155和157相对应位置处的氨基酸被任何其他氨基酸取代。
在一个特别优选的实施方案中，编码的突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Val，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在另一个特别优选的实施方案中，编码的突变TriA包含SEQ ID NO：2、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的序列，其中：
与位置92相对应的氨基酸是Ala，与位置93相对应的氨基酸是Leu，与位置155相对应的氨基酸是Thr，与位置157相对应的氨基酸是Leu。
在其他方面，本发明涵盖本发明耐除草剂植物的子代或后代以及衍生自本发明耐除草剂植物的种子和衍生自本发明耐除草剂植物的细胞。
在一些实施方案中，本发明提供衍生自下述植物的子代或后代植物，所述植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，启动子能够表达由所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，其中子代或后代植物在其至少一些细胞中包含与该启动子有效连接的该重组多核苷酸，该突变TriA多肽的表达向子代或后代植物赋予除草剂耐受性。
在一个实施方案中，本发明的种子优选地包含耐除草剂植物的除草剂耐受性特征。在其他实施方案中，种子能够萌发成在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸的植物，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向子代或后代植物赋予除草剂耐受性。
在一些实施方案中，本发明的植物细胞能够再生植物或植物部分。在其他实施方案中，植物细胞不能够再生出植物或植物部分。不能够再生出植物的细胞的例子包括但不限于胚乳、种皮(外种皮和果皮)和根冠。
在另一个实施方案中，本发明提供如下植物的植物细胞或能够再生出如下植物的植物细胞，所述植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性，其中所述植物细胞包含与启动子有效连接的该重组多核苷酸。
在其他实施方案中，本发明提供植物细胞，所述植物细胞包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向细胞赋予除草剂耐受性。
在另一个实施方案中，本发明涉及由编码本发明突变TriA多肽的核酸转化的植物细胞，其中与野生型品种的植物细胞相比，核酸在植物细胞中的表达导致增加的除草剂抗性或耐受性。优选地，编码突变TriA多肽的核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQ IDNO:1所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)编码如SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物；c)包含a)或b)任一者的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和d)与a)至c)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
在一些方面，本发明提供从本发明耐除草剂植物制备的植物产品。在一些实施方案中，植物产品的例子包括而不限于籽粒、油和粗粉(meal)。在一个实施方案中，植物产品是植物籽粒(例如，适合用作饲料或加工的籽粒)、植物油(例如，适合用作食物或生物柴油的油)、或植物粉(例如，适合用作饲料的粉)。
在一个实施方案中，提供从植物或植物部分制备的植物产品，其中所述植物或植物部分在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物或植物部分赋予针对该除草剂的耐受性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞与野生型品种的植物细胞相比具有增加的除草剂抗性，所述方法包括用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，启动子能够表达该多核苷酸编码的突变TriA多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物的方法，所述方法包括(a)用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，启动子能够表达该多核苷酸编码的突变TriA多肽，并且(b)从植物细胞产生除草剂抗性增加的植物。
在一些方面，本发明提供一种用于产生耐除草剂植物的方法。在一个实施方案中，该方法包括：从植物细胞再生出植物，所述植物细胞用与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸转化，所述启动子能够表达该多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指一个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，以及所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
为了获得所需的效应，即，耐受或抵抗本发明除草剂、除草剂衍生物的植物，应当理解，可以通过本领域技术人员已知的方法和手段“过量表达”至少一种核酸。
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指，在野生型表达水平之外的额外的任何表达形式。用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录过的，并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般在上游)，引入充当启动子或增强子元件的分离核酸，从而上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代在体内改变内源性启动子(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子在相对于本发明基因恰当的方向及距离引入植物细胞，从而控制该基因的表达。如果需要多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷化区可以衍生自天然基因、多种其他植物基因或T-DNA。待添加的3'末端序列可以衍生自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地衍生自另一种植物基因或较不优选地衍生自任何其他真核基因。内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加成熟信使在胞浆内积累的量。已经显示，在植物表达构建体和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA水平和蛋白质水平增加基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405；Callis等人(1987)Genes Dev 1:1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5'末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的应用是本领域已知的。对于一般信息，参见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot,Springer,N.Y.(1994)。
根据需要，可以优化核酸序列以便在转化植物中增加表达。例如，可以提供包含植物优选密码子以改善植物中表达的编码性序列。关于宿主优选密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。用于制备植物优选基因的方法也是本领域已知的。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人(1989)NucleicAcids Res.17:477-498，所述文献通过引用的方式并入本文。
因此，在用于目的植物中表达的表达盒中提供本发明的野生型/突变TriA核酸。该表达盒将包含与本发明的突变TriA核酸序列有效连接的调节序列。如本文所用，术语“调节元件”指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并介导对应于所述第二序列的DNA序列转录。通常，有效连接意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且处于相同的可读框中。该盒可以额外地含有待共转化至该生物中的至少一个额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。
这种表达盒可以备有多个限制性位点，以用于插入野生型/突变TriA核酸序列于调节区的转录调节下。该表达盒可以额外地含有选择标记基因。本发明的表达盒可以以5'-3'转录方向包含在植物中有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的野生型/突变TriA编码核酸序列、以及转录和翻译终止区(即，终止区)。对植物宿主和/或对本发明的野生型/突变TriA核酸序列而言，启动子可以是天然的或类似物，或是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。在启动子对于植物宿主是“外来的”或“异源的”情况下，意指该启动子在引入此启动子的天然植物中不存在。在启动子相对于本发明的野生型/突变TriA核酸序列是“外来”或“异源”的情况下，意指该启动子相对于有效连接的本发明野生型/突变TriA核酸序列不是天生或天然存在的启动子。如本文中所用，嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，其中所述转录起始区相对于所述编码序列是异源的。尽管可能优选使用异源启动子表达本发明的野生型/突变TriA核酸，但可以使用天然启动子序列。此类构建体将改变植物或植物细胞中野生型/突变TriA蛋白的表达水平。因此，改变植物或植物细胞的表型。
终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于有效连接的野生型/突变TriA目的序列是天然的，可以相对于植物宿主是天然的，或可以源自另一来源(即，相对于该启动子、目的野生型/突变TriA核酸序列、植物宿主或其任意组合，为外来或异源的)。从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可获得便利的终止区，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)MoI.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。根据需要，可以优化基因，用于在转化的植物中增加表达。即，可以使用植物优选的密码子合成所述基因用于改进的表达。参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11对宿主优选的密码子选择的讨论。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，所述文献通过引用的方式并入本文。
因此，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明的突变TriA核酸分子和在植物细胞中可工作的启动子。
在一个优选实施方案中，启动子是根特异性或根增强型启动子。
在一个特别优选的实施方案中，启动子是来自大豆(Glycine max)的根特异性或根增强型启动子(例如，p-Glyma04g34080，参见实施例8和9)。
甚至更优选地，启动子包含SEQ ID NO:32的核酸序列。
尽管本发明的多核苷酸可以作为选择标记基因用于植物转化，不过本发明的表达盒可以包括另一选择标记基因用于转化细胞的选择。选择标记基因(包括本发明的那些选择标记基因)用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括但不限于编码抗生素耐药性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予针对除草化合物(如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))抗性的基因。通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christophers on等人(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA 89:6314-6318；Yao等人(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff(1992)MoI Microbiol 6:2419-2422；Barkley等人(1980)The Operon,第177-220页；Hu等人(1987)Cell 48:555-566；Brown等人(1987)Cell 49:603-612；Figge等人(1988)Cell52:713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl Acad.AcL USA 86:5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl Acad.ScL USA 86:2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)海德堡大学博士论文；Reines等人(1993)Proc.Natl Acad.ScL USA 90:1917-1921；Labow等人(1990)MoICell Biol 10:3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA89:3952-3956；Bairn等人(1991)Proc.Natl Acad.ScL USA 88:5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol Struc.Biol 10:143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27:1094-1104；Bonin(1993)海德堡大学博士论文；Gossen等人(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA 89:5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人(1988)Nature334:721-724。此类公开内容通过引用的方式并入本文。上述选择标记基因的列表不意在限制。可以在本发明中使用任意的选择标记基因。
另外，已知增强细胞宿主中基因表达的其它序列修饰。这些修饰包括消除编码假多聚腺苷化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列、和可能有损于基因表达的其它此类充分表征的序列。可以调整序列的G-C含量至相对于给定细胞宿主为平均的水平，可以通过参考该宿主细胞中表达的已知基因计算该平均水平。另外，如果需要，可以轻易地修饰序列以避开预测的发夹二级mRNA结构。用于增强基因表达的核苷酸序列也可以用在植物表达载体中。这些核苷酸序列包括例如玉米Adh基因内含子Adh1-S内含子1、2和6(Callis等人,Genes and Development 1:1183-1200,1987)和来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列(W-序列)(Gallie等人,Nucleic AcidRes.15:8693-8711,1987和Skuzeski等人,Plant MoI.Biol.15:65-79,1990)。已经显示来自玉米皱缩-1基因座的第一内含子增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了基因表达构建体中特定内含子的用途，并且Gallie等人(PlantPhysiol.106:929-939,1994)还已经显示内含子可用于基于组织特异性基础调节基因表达。为进一步增强或优化基因表达，本发明的植物表达载体还可以包含含有基质结合区(MAR)的DNA序列。用此类修饰的表达系统转化的植物细胞随后可以表现出本发明核苷酸序列的过量表达或组成型表达。
本发明还提供包含表达盒的分离的重组表达载体，所述表达盒含有如上文所述的野生型/突变TriA核酸，其中与宿主细胞的野生型品种相比，该载体在宿主细胞中的表达导致增加的除草剂耐受性。如本文中所用，术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一个核酸的核酸分子。一个类型的载体是“质粒”，其指可以在其中连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加体型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合到该宿主细胞的基因组中，并因而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意在包括起到等同功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含处于下述形式的本发明核酸，其中所述形式适于该核酸在宿主细胞中表达，这意味着该重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选定的与待表达核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员会理解，表达载体的设计可取决于多种因素，如待转化细胞的选择、所需的多肽表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞，由此产生如本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如，突变TriA多肽、融合多肽等)。
表达载体可以在表达构建体中额外地含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)PNAS,86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene 165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)(Virology 154:9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling等人(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie等人(1989),引自Molecular Biology of RNA，Cech编著(Liss,NewYork)，第237-256页)；玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology81:382-385)。还参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968。
也可以使用已知增强翻译的其它方法，例如内含子等。在制备表达载体时，可以操作多种核酸片段，从而使得核酸序列处于合适的方向并且根据需要处于正确的可读框中。为此目的，可以使用衔接头或接头连接所述核酸片段或可以涉及提供便利限制性位点、移除多余核酸、移除限制性位点等的其它操作。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制作用、退火和再取代，例如转换和颠换。
多种启动子可以在本发明的实践中使用。可以基于想要的结果选择启动子。核酸可以与用于植物中表达的组成型、组织偏好的或其它启动子组合。
组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中披露的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2:163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
组织偏好的(或组织优选的)启动子可以用来在特定的植物组织中达到增强的目的表达。此类组织偏好的启动子包括但不限于叶偏好的启动子、根偏好的启动子、种子偏好的启动子和茎偏好的启动子。组织偏好的启动子的一些例子由以下描述：例如，Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2):157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.1 12(3):1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco ef al.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等人(1993)Voc Natl.Acad.ScL USA90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J 4(3):495-505。可以修饰启动子，如果需要，用于弱表达。
在一个优选实施方案中，启动子是根特异性或根增强型启动子。
在一个特别优选的实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:32的核酸序列。
在一些实施方案中，可以将目的核酸导引至叶绿体用于表达。以这种方式，不直接将目的核酸插入叶绿体时，表达载体将会额外包含叶绿体靶向序列，所述叶绿体靶向序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码指引目的基因产物至叶绿体的叶绿体转运肽。此类转运肽是本领域已知的。就叶绿体靶向序列而言，“有效连接”意指编码转运肽(即叶绿体靶向序列)的核酸序列与本发明的目的编码性序列连接，从而这两个序列是连续的并处于相同可读框中。参见例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233:478-481。例如，可以通过将叶绿体靶向序列有效连接到编码本发明TriA多肽的核苷酸序列的5’端，将本领域已知的叶绿体转运肽融合于本发明TriA多肽的氨基酸序列。
叶绿体靶向序列是本领域已知的并且包括叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996),Plant Mol.Biol.30:769-780；Schnell等人(1991),J.Biol.Chem.266(5):3335-3342)；EPSPS(Archer等人(1990),J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995),J.Biol.Chem.270(11):6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997),J.Biol.Chem.272(33):20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993),J.Biol.Chem.268(36):27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988),J.Biol.Chem.263:14996-14999)。还参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人(1993)BiochemBiophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233:478-481。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等人(1990),Proc.Natl.Acad.ScL USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993),EMBO J.12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择标记的DNA和通过同源重组靶向该DNA到质体基因组。另外，可以通过组织偏好地表达细胞核编码的且定向质体的RNA聚合酶，反式地激活质体携带的沉默转基因来实现质体转化。这种系统已经在McBride等人(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305中报道。
可以优化待靶向至叶绿体的目的核酸，用于在叶绿体中表达，其中考虑植物细胞核和这种细胞器之间密码子选择的差异。以这种方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。参见例如通过引用方式并入本文的美国专利号5,380,831。
用于转化植物的众多植物转化载体和方法是可获得的。参见例如An,G.等人(1986)Plant PysioL,81:301-305；Fry,J.,等人(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl.Genet.16:161-1 1A；Hinchee,等人(1990)Stadler.Genet.Symp.2032\2.203-2\2；Cousins,等人(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:481-494；Chee,P.P.和Slightom,J.L.(1992)Gene.l l 8:255-260；Christou,等人(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；Halluin,等人(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir,等人(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas等人(1993)Proc.Nat.Acad Sd.USA 90:1 1212-1 1216；Christou,P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant；29P.119-124；Davies,等人(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.和Mchughen,A.(1993)Plant ScL 91:139-148；Franklin,C.I.和Trieu,T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin,等人(1993)Plant ScL90:41-52；Guo Chin ScL Bull.38:2072-2078；Asano,等人(1994)Plant CellRep.13；Ayeres N.M.和Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo,等人(1994)Plant.J.5:583-592；Becker,等人(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska等人(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen等人(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman,等人(1994)Bio-Technology 12:919-923；Ritala,等人(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；以及Wan,Y.C.和Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。
在一些实施方案中，本发明的方法包括将多核苷酸构建体引入植物。术语“引入”意指以如此方式向植物呈递多核苷酸构建体，从而该构建体进入该植物的细胞的内部。本发明的方法不依赖用于将多核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要所述多核苷酸构建体可以进入该植物的至少一个细胞内部即可。用于将多核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。如本文中所提及的术语“引入”或“转化”还意指外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是何种方法。可以用本发明的基因构建体转化能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织并且可以从中再生完整植物。根据对于进行转化的具体物种而言可得的并且最适的克隆性增殖系统，所选的具体组织可以不同。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以瞬时或稳定地引入多核苷酸至宿主细胞中并且可以非整合地维持，例如作为质粒存在。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。
术语“稳定转化”意指，导入植物中的多核苷酸构建体整合至该植物的基因组中并且能够由其后代继承。术语“瞬时转化”意指，引入植物中的多核苷酸构建体不整合至该植物的基因组中。
为了转化植物和植物细胞，可以使用标准技术，将本发明的核苷酸序列插入本领域已知的适于在植物或植物细胞中表达该核苷酸序列的任何载体。载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的目标植物物种。在本发明的实施方案中，编码性核苷酸序列与植物启动子(例如，本领域已知用于植物细胞中高水平表达的启动子)有效连接，并且随后将该构建体引入对除草剂敏感的植物细胞，并再生转化的植物。在一些实施方案中，转化的植物耐受暴露于这样的除草剂水平，所述除草剂水平将杀死或明显伤害从未转化的细胞再生出的植物。这种方法可以适用于任何植物物种或作物。
用于构建植物表达载体并将外来核酸引入植物的方法学是本领域通常已知的。例如，可以使用瘤诱导(Ti)质粒载体，将外源DNA引入植物。用于送递外源DNA的其它方法包括使用PEG介导的原生质体转化法、电穿孔法、微量注射晶须法(whisker)和用于直接DNA摄取的生物射弹法或微抛射体轰击法。这类方法是本领域已知的。(Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人,(1991)Gene100:247-250；Scheid等人,(1991)MoL Gen.Genet.,228:104-112；Guerche等人,(1987)Plant Science 52:111-116；Neuhause等人,(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein等人,(1987)Nature 327:70-73；Howell等人,(1980)Science 208:1265；Horsch等人,(1985)Science 227:1229-1231；DeBlock等人,(1989)Plant Physiology 91:694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach编著)Academic Press,Inc.(1988)以及Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编著)Academic Press,Inc.(1989)。
将核苷酸序列引入植物细胞中的其他合适方法包括例如Crossway等人(1986)Biotechniques 4:320-334所述的微量注射法；例如Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.ScLUSA 83:5602-5606所述的电穿孔法；例如Townsend等人美国专利号5,563,055、Zhao等人美国专利号5,981,840所述的农杆菌介导转化法；例如Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722所述的直接基因转移法；和例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等人(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment”,引自Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编著(Springer-Verlag,柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology6:923-926)所述的射弹粒子加速法；和Led转化法(WO 00/28058)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等人(1987)ParticulateScience和Technology 5:27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8:736-740(稻)；Klein等人(1988)PNAS,85:4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Tomes等人(1995)"Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment,"引自Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods,Gamborg编著(Springer-Verlag,柏林)(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等人，美国专利号5,736,369(禾谷类植物)；Bytebier等人(1987)PNAS 84:5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)引自The Experimental Manipulation of OvuleTissues,编者Chapman等人(Longman,New York),第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等人(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔法)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12:250-255和Christou和Ford(1995)Annals ofBotany 75:407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(借助根癌农杆菌转化玉米)；所述每篇文献通过引用的方式并入本文。
包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。一个有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如可以将农杆菌作用于植物种子或可以用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明，特别有利的是将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基。随后继续培育该植物直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，如以下任一文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1、Aldemita和Hodges(Planta 199:612-617,1996)；Chan等人(Plant Mol Biol22(3):491-506,1993)、Hiei等人(Plant J 6(2):271-282,1994)，所述文献的公开内容通过引用的方式如同完全描述一样并入本文。在谷物转化的情况下，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol 14(6):745-50,1996)或Frame等人(Plant Physiol 129(1):13-22,2002)描述的方法，其公开内容通过引用的方式如同完全描述的那样并入本文。所述方法例如还在B.Jenes等人,Techniques for Gene,引自：Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,编者S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥属植物(拟南芥于本发明的范围中不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适培养基中培育。例如
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和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中描述了借助根癌农杆菌转化植物，或尤其可以从F.F.White,Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；引自Transgenic Plants,第1卷,Engineering andUtilization,S.D.Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,第15-38页中获知借助根癌农杆菌转化植物。
本领域技术人员已知的一种转化方法是将正开花的植物浸入农杆菌溶液，其中所述农杆菌含有TriA核酸，随后繁育转化的配子。可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株进行农杆菌介导的植物转化。可以通过标准转化及再生技术进行转化(Deblaere等人,1994,Nucl.Acids.Res.13:4777-4788；Gelvin,Stanton B.和Schilperoort,Robert A,PlantMolecular Biology Manual,第2版.-Dordrecht:Kluwer Academic Publ.,1995.-引自Sect.,Ringbuc Zentrale Signatur:BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick,Bernard R.和Thompson,John E.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,BocaRaton:CRC Press,1993 360S.,ISBN 0-8493-5164-2)。例如，可以通过子叶或下胚轴转化法进行油籽油菜转化(Moloney等人,1989,Plant Cell Report 8:238-242；De Block等人,1989,Plant Physiol.91:694-701)。用于农杆菌和植物选择的抗生素取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。通常使用卡那霉素作为植物选择标记进行油籽油菜选择。可以使用例如Mlynarova等人,1994,Plant Cell Report13:282-285描述的技术进行针对亚麻的农杆菌介导的基因转移。可以使用例如在欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中描述的技术进行大豆的转化。可以通过粒子轰击法、聚乙二醇介导的DNA摄取法或借助碳化硅纤维技术实现玉米的转化。(参见例如Freeling和Walbot“《玉米手册》”Springer Verlag:New York(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体例子见美国专利号5,990,387，并且小麦转化的具体例子见PCT申请号WO 93/07256。
在一些实施方案中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触，将本发明的多核苷酸引入植物。通常，此类方法包括将本发明的多核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子内部。可以认识到，本发明的多肽最初可以作为病毒聚蛋白的一部分合成，随后经体内或体外蛋白水解作用加工病毒聚蛋白以产生所需的重组多肽。另外，可以认识到，本发明的启动子也涵盖用于病毒RNA聚合酶转录的启动子。本领域已知将多核苷酸构建体(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并且在其中表达所编码蛋白质的方法。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，所述文献通过引用的方式并入本文。可以根据常规方法培育已经转化的细胞成植物。参见例如，McCormick等人(1986)Plant CellReports 5:81-84。随后可以培育这些植物，并且用相同的转化株系或不同的株系授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交种。可以培育两个或多个世代以确保所需要的表型特征的表达被稳定维持和遗传，随后可以收获种子以确保已经实现所需要表型特征的表达。
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于玉米或玉蜀黍(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可作为种子油来源的芸苔属物种，苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(双色蜀黍(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如，御谷(Pennisetumglaucum)、稷(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthus annu)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.Turgidum ssp.durum))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solarium tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、苷薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡属物种(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、可可树(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、芭蕉属物种(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、油橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、全缘叶澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松柏类植物。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，向日葵、芸苔属物种、棉、糖用甜菜、大豆、花生、苜蓿、红花、烟草、玉米、稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、粟等)。
除了转化随后需再生成完整植物的体细胞之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其是可以发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如，可以将拟南芥种子用农杆菌处理并且从正在发育的植物获得种子，其中一定比例被转化并且因此是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987)MolGen Genet 208:274-289；Feldmann K(1992),引自：C Koncz,N-H Chua和J Shell编著,Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。备选方法基于反复移除花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌温育，由此同样可以在之后的时间点获得转化的种子(Chang(1994)Plant J.5:551-558；Katavic(1994)Mol GenGenet,245:363-370)。然而，一个尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在真空浸润拟南芥属植物的情况下，将完整的植物在减压下用农杆菌悬液处理[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998)The Plant J.16,735-743]。在这两种情况下均可以收获一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了转基因经花粉流动的风险。一般可以通过已经在Klaus等人,2004[Nature Biotechnology22(2),225-229]中示意性展示的方法，实现叶绿体基因组的转化。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源性侧翼序列指导位点特异性整合至质体基因组中。已经对许多不同的植物物种描述了质体转化法，并且综述见Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J MolBiol.2001年月21日；312(3):425-38；或Maliga,P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology,Trends Biotechnol.21,20-28。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等人,2004,Nature Biotechnology22(2),225-229)。可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或
Figure BDA0001990628130000601
和Willmitzer的上述出版物中找到。
通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，通过喷洒进行合适的选择。另一种可能方式在于将种子(根据需要，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，可以对转化的植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在。
在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
可以通过多种手段繁殖产生的转化植物，如通过克隆性繁殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，全部细胞经转化而含有表达盒)；转化组织和未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，向未转化的接穗嫁接转化的砧木)。
优选地，与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物增加的除草剂抗性。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物，其中与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物的除草剂抗性增加。
本文所述的植物可以是转基因作物植物或非转基因植物。
除上文给出的一般定义之外，“转基因的”、“转基因”或“重组”，就例如核酸序列、包含该核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物而言，意指所有这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，其中所述修饰可以采取例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式，旨在允许表达本发明的突变TriA。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选被保留，至少部分地被保留。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp序列长度。天然存在的表达盒——例如编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列与核酸序列的天然启动子的天然组合，如上文所定义——当这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)修饰时，成为转基因表达盒。合适的方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
为本发明目的，因此，如上所述，转基因植物理解为意指，本发明核酸不处在所述植物的基因组中其天然基因座的位置，所述核酸可以同源或异源地表达。然而，如所提及，转基因还意指，尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指，本发明核酸在基因组的非天然基因座位置表达，即核酸的同源表达，或优选地异源表达。在本文中提及优选的转基因植物。另外，术语“转基因的”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在多种情况下，该重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合至染色体或整合至稳定的染色体外元件，从而它被传递到后续世代中。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指已经通过基因工程予以改变、重排或修饰的多核苷酸。例子包括任何克隆的多核苷酸，或与异源序列连接或接合的多核苷酸。术语“重组”不涉及，因天然事件(如自发突变)或因非自发诱变和随后的选择性育种而引起的多核苷酸改变。
“等位基因”或“等位变体”是给定基因的可选形式，其位于相同染色体位置处。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大部分生物的天然多态性株系中，SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。
术语“品种”指物种内的一组植物，这些植物通过共有如下的共同特征或性状集合来定义，所述共同的特征或性状集合被本领域技术人员认可为足以区分一个栽培种或品种与另一个栽培种或品种。在任一术语中均不存在这样的暗示：任何给定栽培种或品种的全部植物将在全基因水平或分子水平是遗传相同的，或任何给定的植物将在全部基因座是纯合的。如果一个栽培种或品种在自花授粉时全部后代均含有一个特定性状，则该栽培种或品种被认为对于该特定的性状而言是“纯种的(true breeding)”。术语“繁育系”或“株系”指栽培种内的一组植物，这些植物通过共有如下的共同特征或性状集合而定义，所述共同特征或性状集合被本领域技术人员接受为足以区分一个繁育系或株系与另一个繁育系或株系。在任一术语中均不存在下述暗示：任何给定繁育系或株系的全部植物将在全基因水平或分子水平是遗传相同的，或任何给定的植物将在全部基因座纯合。如果一个纯合繁育系或株系在自花授粉时全部后代均含有一个特定性状，则认为该繁育系或株系对该性状是“纯种的”。在本发明中，性状产生自植物或种子的TriA基因中的突变。
包含编码突变TriA多肽的多核苷酸的本发明抗除草剂植物也可以用于通过涉及有性繁殖的常规植物育种法增加植物的除草剂抗性的方法中。所述方法包括将第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物是本发明除草剂抗性植物，所述第二植物可以或可以不与第一植物抵抗相同的除草剂(一种或多种)，或可以与第一植物抵抗不同的除草剂(一种或多种)。第二植物可以是与所述第一植物杂交时能够产生有活力的子代植物(即种子)的任意植物。典型地，但不是必需的，第一植物和第二植物属于相同的物种。这些方法可以任选地涉及选择子代植物，所述子代植物包含第一植物的突变TriA多肽和第二植物的除草剂抗性特征。与第一或第二植物或这两种植物比较时，由本发明该方法产生的子代植物具有提高的除草剂抗性。当第一和第二植物抵抗不同的除草剂时，所述子代植物会具有所述第一和第二植物的联合除草剂耐受性特征。本发明的方法还可以包括使第一次杂交的子代植物与下述植物回交一代或多代，所述的植物与第一或第二植物是相同的品系或基因型。备选地，第一次杂交或任意后续杂交的子代可以与第三植物杂交，其中所述的第三植物与第一或第二植物为不同的品系或基因型。
本发明也提供用本发明的至少一种多核苷酸分子、表达盒或转化载体所转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。此类转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞针对在如下除草剂水平上的至少一种除草剂具有增强的耐受性或抗性，所述的除草剂水平可以杀死非转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞或抑制其生长。优选地，本发明的转化植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥和作物植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及由包含本发明植物细胞的转基因植物产生的种子，其中与野生型品种的种子相比，该种子就增加的除草剂抗性而言为纯种的。
在其他方面，可以使用本发明的耐除草剂植物作为除草剂耐受性状供体株系供开发，如通过传统植物育种，以产生含有该性状(一种或多种)的其他品种作物和/或杂种作物。含有祖先耐除草剂性状(一种或多种)的全部这类所得品种作物或杂种作物均可以在本文中称作祖先耐除草剂株系的子代或后代。
在其他实施方案中，本发明提供一种用于产生耐除草剂植物的方法。该方法包括：耐除草剂的第一植物与第二植物杂交以产生耐除草剂的子代植物，其中第一植物和子代植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，该重组多核苷酸在第一植物的细胞中有效表达多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
可使用传统植物育种法，其中将耐除草剂性状引入由此产生的子代植物中。在一个实施方案中，本发明提供一种产生耐除草剂的子代植物的方法，所述方法包括：将亲本植物与耐除草剂的植物杂交以将耐除草剂植物的耐除草剂特征引入子代植物的种质中，其中子代植物相对亲本植物具有增加的除草剂耐受性。在其他实施方案中，该方法还包括步骤：通过传统植物育种技术，渐渗耐除草剂特征，以获得具有耐除草剂特征的后代植物。
在其他方面，本发明的植物包括这样的植物，其中除耐受抑制纤维素生物合成的除草剂之外，所述植物还已经通过育种、诱变或基因工程经历进一步的基因修饰，例如已经由常规育种或基因工程方法而使其变得耐受其他特定类别的除草剂的施用，如AHAS抑制剂；植物生长素除草剂；褪色性除草剂(bleaching herbicides)如羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂；EPSPS抑制剂如草甘膦；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂如草铵膦；脂质生物合成抑制剂如乙酰CoA羧化酶(ACCase)抑制剂；或苯腈类{即溴苯腈(bromoxynil)或碘苯腈(ioxynil))除草剂。因此，可以通过多基因修饰，使得本发明的耐除草剂植物抵抗多个类别的除草剂，如同时对草甘膦和草铵膦的抗性或同时对草甘膦和来自另一个类别的除草剂如HPPD抑制剂、AHAS抑制剂或ACCase抑制剂的抗性。这些除草剂抗性技术例如在如下文献中描述：Pest Management Science(卷，年，页)：61,2005,246；61,2005,258；61,2005,277；61,2005,269；61,2005,286；64,2008,326；64,2008,332；Weed Science 57,2009,108；Australian Journal of Agricultural Research 58,2007,708；Science 316,2007,1185；和其中引用的参比文献。例如，在一些实施方案中，本发明的耐除草剂植物可以耐受ACCase抑制剂，如“dim类”{例如，噻草酮(cycloxydim)、稀禾定(sethoxydim)、烯草酮(clethodim)或醌肟草(tepraloxydim))、“fop类”{例如，炔草酸(clodinafop)、氯甲草(diclofop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、氟吡禾灵(haloxyfop)或喹禾灵(quizalofop))和“den类”(如唑啉草酯(pinoxaden))；耐受植物生长素除草剂，如麦草畏(dicamba)；耐受EPSPS抑制剂，如草甘膦；耐受其他纤维素生物合成抑制剂；和耐受GS抑制剂，如草铵膦。
除这些类别的抑制剂之外，本发明的耐除草剂植物也可以耐受具有其他作用模式的除草剂，例如，叶绿素/类胡萝卜素色素抑制剂、细胞膜破坏剂、光合作用抑制剂、细胞分裂抑制剂、根抑制剂、苗抑制剂和其组合。
这类耐受性状可以例如表达为突变型或野生型HPPD蛋白，表达为突变型或野生型PPO蛋白，表达为突变型AHASL蛋白、突变型ACCase蛋白、突变型EPSPS蛋白质，或突变型谷氨酰胺合成酶蛋白；或表达为突变型天然、近交或转基因芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD或DHT)、卤代芳腈酶(BXN)、2,2-二氯丙酸脱卤酶(DEH)、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、草甘膦脱羧酶(GDC)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT或bar)或具有除草剂降解活性的CYP450s蛋白。耐除草剂的本发明植物也可以与其他性状堆叠，所述其他性状包括但不限于农药性状如Bt Cry和对鞘翅类，鳞翅类，线虫或其他害虫具有杀虫活性的其他蛋白质；营养或营养药性状如改变的含油量或油谱性状、高蛋白质或高氨基酸浓度性状，和本领域已知的其他类型性状。
另外，在其他实施方案中，还涵盖这样的耐除草剂植物，其中通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或选择这类特征，使得所述植物能够合成一种或多种杀昆虫蛋白，尤其是来自细菌芽孢杆菌属(Bacillus)、特别地来自苏云金芽孢杆菌的那些已知蛋白，如[δ]-内毒素，例如CrylA(b)、CrylA(c)、CrylF，CryIF(a2)、CryllA(b)、CrylllA、CrylllB(bl)或Cry9c；营养期杀虫蛋白(VIP)，例如VIP1、VIP2、VIP3或VIP3A；线虫定植性细菌例如光杆状菌属某些物种(Photorhabdus spp.)或致病杆菌属某些物种(Xenorhabdus spp.)的杀虫蛋白；动物产生的毒素，如蝎毒素、蛛形动物毒素、胡峰毒素或其他的昆虫特异性神经毒素；真菌产生的毒素，如链霉菌毒素、植物凝集素，如豌豆凝集素或大麦凝集素；凝集素(agglutinin)；蛋白酶抑制剂如胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、patatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂或木瓜蛋白酶抑制剂；核糖体失活蛋白(RIP)，如蓖麻毒蛋白、玉蜀黍-RIP、相思豆毒蛋白、软瓜蛋白、肥皂草毒蛋白或异株泻根毒蛋白；类固醇代谢酶，如3-羟类固醇氧化酶、蜕皮甾醇UDP-葡糖基转移酶、胆固醇氧化酶、蜕皮激素抑制剂或HMG-CoA-还原酶；离子通道阻滞剂，如钠通道阻滞剂或钙通道阻滞剂；保幼激素酯酶；利尿激素受体(helicokinin受体)；芪合酶、联苄合酶、几丁质酶或葡聚糖酶。在本发明的上下文中，这些杀虫蛋白或毒素应当明确地还理解为前毒素、杂合蛋白、截短或修饰的蛋白质。杂合蛋白以蛋白质结构域的新组合为特征(见，例如WO 02/015701)。这些毒素或能够合成这些毒素的基因修饰植物的其他例子在例如EP-A 374 753、WO 93/007278、WO 95/34656、EP-A 427529、EP-A 451 878、WO 03/18810和WO 03/52073中公开。用于产生此类基因修饰植物的方法通常是本领域技术人员已知的并且在例如上文提到的出版物中描述。基因修饰植物中所含有的这些杀虫蛋白可以赋予产生这些蛋白质的植物针对来自节肢动物全部分类群的害虫，尤其针对甲虫(鞘翅目(Coeloptera))、双翅昆虫(双翅目(Diptera)和蛾(鳞翅目(Lepidoptera))以及针对线虫(Nematoda)的耐受性。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白质毒素(例如，杀虫蛋白)在耐除草剂植物中的表达有效控制例如包括以下纲和目成员的生物：鞘翅目(Coleoptera)如美洲大豆象(菜豆象(Acanthoscelides obtectus))；叶甲(杨毛臀萤叶甲(Agelastica alni))；叩甲(直条叩甲(Agriotes lineatus)、暗色叩甲(Agriotes obscurus)、二色叩甲(Agriotesbicolor))；谷盗(米扁虫(Ahasverus advena))；马铃薯鳃金龟(summer schafer，Amphimallon solstitialis)；家俱窃蠹(furniture beetle，Anobium punctatum)；花象属物种(Anthonomus spp.)(象鼻虫)；甜菜隐食甲(Pygmy mangold beetle，Atomarialinearis)；地毯甲虫类(圆皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、毛皮蠹属(Attagenus spp.))；豇豆象(四纹豆象(Callosobruchus maculates))；干果甲虫(黄斑露尾甲(Carpophilushemipterus))；卷心菜荚象甲(白菜房原象甲(Ceutorhynchus assimilis))；冬油菜茎象甲(Ceutorhynchus picitarsis)；线虫(烟草金针虫(Conoderus vespertinus)和Conoderusfalli)；香蕉象甲(Cosmopolites sordidus)；新西兰草地蛴螬(新西兰草金龟(Costelytrazealandica))；六月金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；向日葵茎象(Cylindrocopturus adspersus)；火腿皮蠹(Dermestes lardarius)；玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera))、Diabrotica virgifera virgifera和巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)；北美家天牛(Hylotropesbajulus)；紫苜蓿叶象(Hypera postica)；裸蛛甲(Gibbium psylloides)；烟草甲(Lasioderma serricorne)；科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata))；粉蠹属(Lyctus)甲虫{粉蠹属某些物种、露尾甲(油菜花露尾甲(Meligethes aeneus))；五月鳃金龟(Melolontha melolontha)；美洲蜘蛛甲(Meziumamericanum)；golden spider beetle，Niptus hololeucs；谷盗类(锯谷盗(Oryzaephilussurinamensis)和大眼锯谷盗(Oryzaephilus Mercator))；葡萄黑耳喙象(Otiorhynchussulcatus)；芥甲虫(辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae))、十字花科植物跳甲(蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)；卷心菜茎跳甲(油菜蚤跳甲(Psylliodes chrysocephala))；蛛甲属(Ptinus)某些物种(蜘甲)；谷蠹(Rhizopertha dominica)；豌豆象(条纹根瘤象甲(Sitona lineatus))；米象和谷象(米象(Sitophilus oryzae)和谷象(Sitophilus granaries))；红色瓜子象(黄褐小爪象(Smicronyx fulvus))；窃蠹(药材甲(Stegobium paniceum))；大黄粉虫(黄粉虫(Tenebriomolitor))、粉甲(赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和杂拟谷盗(Tribolium confusum))；仓库和橱柜甲虫{斑皮蠹属(Trogoderma)某些物种；向日葵叶甲(Zygogrammaexclamationis)；革翅目(Dermaptera)(蠼螋类)如欧洲球螋(普通蠼螋(Forficulaauricularia)和河岸蠼螋(Labidura riparia)；网翅目(Dictyoptera)如东方蜚蠊(Blattaorientalis)；温室马陆(Oxidus gracilis)；甜菜潜叶蝇(Pegomyia betae)；欧小蝇(fritfly)(黑麦秆蝇(Oscinella frit))；果蝇(实蝇属(Dacus)某些物种、果蝇属(Drosophila)某些物种)；等翅目(Isoptera)(白蚁类)包括来自草白蚁科(Hodotermitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotermitidae)、齿白蚁科(Serritermitidae)、白蚁科(Termitidae)、原白蚁科(Termopsidae)的物种；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris)；黑豆蚜(Aphis fabae)；棉蚜或甜瓜蚜(棉蚜(Aphis gossypii))；苹果绿蚜(苹果蚜(Aphis pomi))；橘刺粉虱(茶园黑刺粉虱(Aleurocanthus spiniferus))；甘薯粉虱(烟粉虱(Bemesia tabaci))；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)；梨黄木虱(Cacopsylla pyricola)；黑醋栗蚜(茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzus ribis))；葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae)；柑橘木虱(Diaphorina citri)；马铃薯微叶蝉(蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae))；bean leafhopper(Empoasca Solana)；假眼小绿叶蝉(vineleafhopper，Empoasca vitis)；绵蚜(苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum))；欧洲果蚧(水木球蜡蚧(Eulecanium corni))；桃粉蚜(桃大尾蚜(Hyalopterus arundinis))；灰飞虱(Laodelphax striatellus)；马铃薯蚜(马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae))；桃蚜(Myzus persicae)；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps)；褐飞虱(Nilaparvata lugens)；蛇麻蚜(蛇麻疣额蚜(Phorodon humuli))；黍缢蚜(禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi))；麦长管蚜(Sitobion avenae)；鳞翅目(Lepidoptera)如棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana，summer fruit tortrix moth)；果黄卷蛾(Archips podana)(果树梢卷蛾)；梨潜蛾(Bucculatrix pyrivorella，pear leafminer)；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella，cotton leaf perforator)；松尺蠖(Bupalus piniarius，pine looper)；苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella，codling moth)；二化螟(Chilo suppressalis，striped riceborer)；云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana，eastern spruce budworm)；条纹向日葵螟(Cochylis hospes)(带纹向日葵蛾)；西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)(西南玉米螟)；环针单纹卷蛾(Eupoecilia ambiguella，European grape berry moth)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)(棉铃虫)；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(棉铃虫)；烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)(烟夜蛾幼虫)、向日葵斑螟(Homeosoma electellum)(向日葵蛾)；后黄卷叶蛾(Homona magnanima，oriental tea tree tortrix moth)；苹细蛾(Lithocolletis blancardella，Spotted tentiform leafminer)；舞毒娥(Lymantriadispar)(gypsy moth)；黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria)(天幕毛虫)；甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae，cabbage armyworm)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata，Berthaarmyworm)；冬尺蛾(Operophtera brumata，winter moth)；欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis，European corn borer)、小眼夜蛾(Panolis flammea，松树beauty moth)、柑桔潜叶蛾(Phyllocnistis citrella，citrus leafminer)；大菜粉蝶(Pieris brassicae)(菜粉蝶)；薄荷灰夜蛾(Rachiplusia ni)(大豆尺蠖)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beetarmywonn)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis，cotton leafworm)；棉大卷叶螟(Sylepta derogata，cotton leaf roller)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(甘蓝尺蠖)；直翅目(Orthoptera)如家蟋(Acheta domesticus)、树蝗类(Anacridium spp.)、飞蝗(Locusta migratoria)、双带黑蝗(Melanoplus bivittatus)、异黑蝗(Melanoplusdifferentialis)、红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)、飞蝗(血黑蝗(Melanoplussanguinipes))、北方蝼蛄(六指蝼蛄(Neocurtilla hexadectyla))、红翅蝗(Nomadacrisseptemfasciata)、短翅蝼蛄(Scapteriscus abbreviatus)、南方蝼蛄(Scapteriscusborellii)、褐色蝼蛄(Scapteriscus vicinus)和沙漠蝗(Schistocerca gregaria)；综合亚纲(Symphyla)如白松虫(Scutigerella immaculata)；缨翅目(Thysanoptera)如烟蓟马类(烟蓟马(Frankliniella fusca))、花蓟马类(花蓟马(Frankliniella intonsa))、西花蓟马类(西花蓟马(Frankliniella occidentalism))、棉芽蓟马(梳缺花蓟马(Frankliniella schultzei))、温室条篱蓟马(Hercinothrips femoralis))、大豆蓟马类(Neohydatothrips variabilis)、椪柑蓟马(柑桔黄绿蓟马(Pezothrips kellyanus))、鳄梨蓟马(Scirtothrips perseae)、甜瓜蓟马(棕榈蓟马(Thrips palmi))和洋葱蓟马类(烟蓟马(Thrips tabaci))等，以及包含前述一种或多种生物的组合。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白质毒素(例如，杀昆虫蛋白)在耐除草剂植物中的表达有效控制跳甲虫，即叶甲科(Chrysomelidae)跳甲族的成员、优选地对抗条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)、如蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)和/或Phyllotretatriolata。在其他实施方案中、一种或多种蛋白质毒素(例如，杀昆虫蛋白)在耐除草剂植物中的表达有效控制卷心菜荚象甲、蓓带夜蛾(Bertha armyworm)、草盲蝽或小菜蛾(diamondback moth)。
另外，在一个实施方案中，还涵盖耐除草剂植物，其中通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或选择这类性状，使得所述植物能够合成一种或多种蛋白以增加这些植物对细菌病原体、病毒病原体或真菌病原体的抗性或耐受性。用于产生此类基因修饰植物的方法通常是本领域技术人员已知的。
另外，在另一个实施方案中，还涵盖耐除草剂植物，其中例如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或选择这类性状，使得所述植物能够合成一种或多种蛋白以增加这些植物的生产率(例如含油量)、其对干旱、盐度或其他生长限制性环境因素的耐受性、或对害虫、真菌、细菌或病毒病原体的耐受性。
另外，在其他实施方案中，还涵盖耐除草剂植物，其中例如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或选择这类性状，改变所述植物以含有数量经调整的一种或多种物质或新物质，以例如改善人类营养或动物营养，例如，产生促进健康的长链Ω-3脂肪酸或不饱和Ω-9脂肪酸的油料作物(例如Nexera(R)油菜,Dow Agro Sciences,加拿大)。
另外，在一些实施方案中，还涵盖耐除草剂植物，其中例如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或选择这类性状，改变所述植物以含有数量增加的维生素和/或矿物质，和/或改善的营养药化合物谱。
在一个实施方案中，相对于野生型植物，本发明的耐除草剂植物包含数量增加的化合物或改善的化合物谱，所述化合物选自：芥子油苷类(例如，萝卜硫苷(4-甲基亚磺酰基丁基-芥子油苷)、莱菔硫烷(sulforaphane)、3-吲哚基甲基-芥子油苷(葡萄糖芸苔素)、1-甲氧基-3-吲哚基甲基-芥子油苷(新葡萄糖芸苔素))；酚类(例如，类黄酮(例如，槲皮素、山柰酚)，羟基肉桂酰基衍生物(例如，1,2,2'-三芥子酰龙胆二糖、1,2-二阿魏酰龙胆二糖，1,2'-二芥子酰-2-阿魏酰龙胆二糖、3-O-咖啡酰-喹啉酸(新绿原酸))；及维生素和矿物质(例如，维生素C、维生素E、胡萝卜素、叶酸、烟酸、核黄素、硫胺素、钙、铁、镁、钾、硒和锌)。
在另一个实施方案中，相对于野生型植物，本发明的耐除草剂植物包含数量增加的化合物或改善的化合物谱，所述化合物选自：前致甲状腺肿素(progoitrin)；异硫氰酸酯；吲哚类(芥子油苷水解产物)；谷胱甘肽；类胡萝卜素类如β-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素类胡萝卜素类如叶黄素和玉米黄素；酚类，包括类黄酮类如黄酮醇类(例如槲皮素、芦丁)、黄烷类/单宁类(如原花青素，包括香豆素、原花色素、儿茶素和花青苷)；黄酮类；植物雌激素如香豆雌烷类(coumestan)、木脂素、白藜芦醇、异黄酮例如染料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素；雷琐辛酸内酯；有机硫化合物；植物甾醇；类萜如鼠尾草酚，迷迭香酸，甘草酸苷和皂素；叶绿素；叶绿酸(chlorphyllin)、糖类、花青苷和香草兰。
在其他实施方案中，相对于野生型植物，本发明的耐除草剂植物包含数量增加的化合物或改善的化合物谱，所述化合物选自：长春新碱、长春碱、紫杉烷类(例如，紫杉酚(紫杉醇)、巴丁卡III、10-脱乙酰巴丁卡III、10-脱乙酰紫杉酚、木糖基紫杉酚、7-表紫杉酚、7-表巴丁卡III、10-脱乙酰三尖杉宁碱、7-表三尖杉宁碱、泰索帝、三尖杉宁碱、木糖基三尖杉宁碱、欧紫杉吉吩、8-苯甲酰氧欧紫杉吉吩、9-乙酰氧紫杉素、9-羟紫杉素、taiwanxam、紫杉烷la、紫杉烷lb、紫杉烷Ic、紫杉烷Id、GMP紫杉醇、9-二氢13-乙酰基巴丁卡III、10-脱乙酰-7-表紫杉酚、四氢大麻酚-(THC)、大麻二醇(CBD)、染料木黄酮、大豆苷元、可待因、吗啡、奎宁、紫草素、ajmalacine、serpentine等。
在其他方面，提供了一种用于处理本发明植物的方法。
在一些实施方案中，该方法包括使植物与农艺学可接受的组合物接触。在一个实施方案中，农艺学可接受组合物包含植物生长素除草剂A.I。
在另一个方面，本发明提供一种用于制备后代种子的方法。该方法包括播种产生或能够产生本发明植物的种子。在一个实施方案中，该方法还包括从种子培育后代植物；并且从后代植物收获后代种子。在其他实施方案中，该方法还包括向后代植物施用含有除草剂的除草组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的转基因植物的可收获部分。优选地，可收获部分包含本发明的TriA核酸或TriA蛋白。可收获部分可以是包含TriA核酸或TriA蛋白的种子、根、叶和/或花或其部分。优选的大豆植物部分是包含TriA核酸或TriA蛋白的大豆。
在另一个实施方案中，本发明涉及从本发明转基因植物、其部分或其可收获部分衍生的产品。优选的植物产品是饲料、种子粗粉(seed meal)、油、或种子处理剂包覆的种子。优选地，粗粉和/或油包含TriA核酸或TriA蛋白。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于产生产品的方法，所述方法包括
a)培育本发明的或通过本发明方法可获得的植物，并且
b)从或借助本发明植物和/或这些植物的部分(例如种子)产生所述产品。
在又一个实施方案中，该方法包括步骤
a)培育本发明的植物，
b)从植物取下如上文定义的可收获部分，并且
c)从或借助本发明植物的可收获部分产生所述产品。
可以在培育这种植物的地点产生产品，可以从培育有植物的地点取出植物和/或其部分以产生产品。一般而言，将植物培育，从植物取下所需的可收获部分，如果可行的话，以重复循环进行，并且从植物的可收获部分产生产品。培育植物的步骤可以每次在实施本发明的方法时进行仅一次，同时允许产生产品的步骤重复多次，例如，通过反复取下本发明植物的可收获部分并且如果需要进一步加工这些部分以获得产品。还可以重复培育本发明植物的步骤并且贮藏植物或可收获部分直至随后对积累的植物或植物部分一次性进行产品的产生。另外，培育植物的步骤和产生产品步骤可以在时间上重叠地、甚至很大程度上同时地或依次地进行。通常，植物在产生产品之前培育一些时间。
在一个实施方案中，由本发明方法产生的产品是植物产品，如但不限于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品和/或药物。将食品视为用于营养和/或用于补充营养的组合物。将动物饲料并且尤其动物饲料补充物视为食品。
在另一个实施方案中，用于生产的本发明方法用于产生农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。
植物产品可以很大程度由一种或多种农产品组成。
除草剂
如上所述，本发明提供向植物赋予针对干扰或抑制细胞壁(纤维素)生物合成的化合物/除草剂的耐受性的核酸、多肽。
可以根据本发明使用的，即本发明植物耐受/抵抗的，除草剂的例子是技术人员称作吖嗪类的化合物。下表2的以下专利申请中详述了可以由本发明突变TriA多肽代谢的吖嗪类的例子。
表2
Figure BDA0001990628130000721
Figure BDA0001990628130000731
Figure BDA0001990628130000741
可以根据本发明使用的优选的除草剂的例子是具有式(I)的吖嗪类。
Figure BDA0001990628130000742
其中
A是由2至5个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-卤代链烯基、C2-C6-炔基、C1-C6-卤代炔基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
R1是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基、(C1-C6-烷基)磺酰基或苯磺酰基，
其中苯基是未取代的或由选自以下的1至5个取代基取代：卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基和C1-C6-烷氧基；
R2是H、卤素、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C2-C6-链烯基、C3-C6-炔基、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基、OH、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基；
R3是H、卤素、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
R4是H、卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或
R3和R4连同与它们连接的碳原子一起形成选自以下的部分：羰基、C2-C6-链烯基、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基和3元至6元杂环基，
其中C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基、或3元至6元杂环基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；和
R5是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基、(C1-C6-烷基)磺酰基或苯磺酰基，
其中苯基是未取代的或由选自以下的1至5个取代基取代：卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基和C1-C6-烷氧基；
包括它们的农业可用盐或N-氧化物。
优选地，本发明提供式(I)的吖嗪类化合物，其中
A是由1至4个取代基取代的2-氟-苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；
R1是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基、(C1-C6-烷基)磺酰基或苯磺酰基，
其中苯基是未取代的或由选自以下的1至5个取代基取代：卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基和C1-C6-烷氧基；
R2是H、卤素、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C2-C6-链烯基、C3-C6-炔基、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基、OH、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基；
R3是H、卤素、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
R4是H、卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或
R3和R4连同与它们连接的碳原子一起形成选自以下的部分：羰基、C2-C6-链烯基、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基和3元至6元杂环基，
其中C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基或和3元至6元杂环基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；和
R5是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基、(C1-C6-烷基)磺酰基或苯磺酰基，
其中苯基是未取代的或由选自以下的1至5个取代基取代：卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基和C1-C6-烷氧基；
包括它们的农业可用盐或N-氧化物。
包含至少一种式(I)的吖嗪和惯用于配制作物保护剂的助剂的农业化学组合物也可用于本发明。
本发明还提供式(I)的吖嗪作为除草剂、即用于控制有害植物的用途。
如果如本文所述的式(I)的吖嗪能够形成几何异构体，例如E/Z异构体，则可以在本发明的组合物中使用这两者、纯的异构体和其混合物。
如果如本文所述的式(I)的吖嗪具有一个或多个手性中心并且因而作为对映异构体或非对映异构体存在，则可以在可用于本发明的组合物中使用这两者、纯对映异构体和非对映异构体、和其混合物。
如果如本文所述的式(I)的吖嗪具有可离子化的官能团，它们也可以其农业可用盐形式使用。通常合适的是其阳离子和阴离子分别对活性化合物的活性不产生不良作用的那些阳离子的盐和那些酸的酸加成盐。
优选的阳离子是碱金属离子，优选地是锂、钠和钾离子；碱土金属离子，优选地是钙和镁离子；过渡金属离子，优选地是锰、铜、锌和铁离子；还是铵(NH4+)和其中1个至4个氢原子由C1-C4烷基、羟基-C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、羟基-C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、苯基或苄基替换的取代铵，优选地是铵、甲基铵、异丙基铵、二甲基铵、二异丙基铵、三甲基铵、庚基铵、十二烷基铵、十四烷基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丁基铵、2-羟乙基铵(醇铵盐)、2-(2-羟乙-1-氧基)乙-1-基铵(二甘醇胺盐)、二(2-羟乙-1-基)铵(二醇胺盐)、三(2-羟乙基)铵(三醇铵盐)、三(2-羟丙基)铵、苄基三甲基铵、苄基三乙基铵、N,N,N-三甲基乙醇铵(胆碱盐)，还是磷鎓离子、硫鎓离子，优选地是三(C1-C4烷基)锍，如三甲基硫鎓和氧化锍离子，优选地是三(C1-C4烷基)氧化锍，并且最后是多元胺(如N,N-双-(3-氨基丙基)甲胺和二亚乙基三胺)的盐。
有用的酸加成盐的阴离子主要是氯、溴、氟、碘、硫酸氢根离子、甲基硫酸根、硫酸根、磷酸二氢根、磷酸氢根、硝酸根、重碳酸根、碳酸根、六氟硅酸根、六氟磷酸根、苯甲酸根，并且还是C1-C4链烷酸的阴离子、优选地甲酸根、乙酸根、丙酸根和丁酸根。
在各变量(例如R1至R5)的定义中提到的有机部分，象术语卤素，是分别针对一系列基团成员的集合性术语。术语卤素在每种情况下指氟、氯、溴或碘。全部烃链、即全部烷基、卤代烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、(烷基)氨基、二(烷基)氨基链，都可以是直链或支链的，前缀Cn-Cm在每种情况下指基团中可能的碳原子数。
这类含义的例子是：
-C1-C4-烷基：例如CH3、C2H5、正丙基、CH(CH3)2、正丁基、CH(CH3)–C2H5、CH2–CH(CH3)2和C(CH3)3；
-C1-C6-烷基，和(C1-C6-烷基)羰基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基的C1-C6-烷基部分：如上文提到的C1-C4-烷基并且另外例如，正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基或1-乙基-2-甲基丙基、优选地甲基、乙基、正丙基、1–甲基乙基、正丁基、1,1–二甲基乙基、正戊基或正己基；
-C1-C4-卤代烷基：部分地或完全由氟、氯、溴和/或碘取代的如上文提到的C1-C4-烷基，例如，氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯一氟甲基、一氯二氟甲基、溴甲基、碘甲基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、2-碘乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氯-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、五氟乙基、2-氟丙基、3-氟丙基、2,2-二氟丙基、2,3-二氟丙基、2-氯丙基、3-氯丙基、2,3-二氯丙基、2-溴丙基、3-溴丙基、3,3,3-三氟丙基、3,3,3-三氯丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、七氟丙基、1-(氟甲基)-2-氟乙基、1-(氯甲基)-2-氯乙基、1-(溴甲基)-2-溴乙基、4-氟丁基、4-氯丁基、4-溴丁基、九氟丁基、1,1,2,2-四氟乙基和1-三氟甲基-1,2,2,2-四氟乙基；
-C1-C6-卤代烷基：如上文提到C1-C4-卤代烷基，以及还例如5-氟戊基、5-氯戊基、5-溴戊基、5-碘戊基、十一氟戊基、6-氟己基、6-氯己基、6-溴己基、6-碘己基和十二氟己基；
-C3-C6-环烷基：具有3至6个环成员的单环饱和烃，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基；
-C2-C6-链烯基：例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基；
-C3-C6-环烯基：1-环丙烯基、2-环丙烯基、1-环丁烯基、2-环丁烯基、1-环戊烯基、2-环戊烯基、1,3-环戊二烯基、1,4-环戊二烯基、2,4-环戊二烯基、1-环己烯基、2-环己烯基、3-环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、2,5-环己二烯基；
-C3-C6-炔基：例如1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1,1-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、2-甲基-4-戊炔基、3-甲基-1-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-1-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、1,1-二甲基-2-丁炔基、1,1-二甲基-3-丁炔基、1,2-二甲基-3-丁炔基、2,2-二甲基-3-丁炔基、3,3-二甲基-1-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基和1-乙基-1-甲基-2-丙炔基；
-C1-C4-烷氧基：例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基和1,1-二甲基乙氧基；
-C1-C6-烷氧基，以及(C1-C6-烷氧基)羰基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基的C1-C6-烷氧基部分：如上文提到的C1-C4-烷氧基以及例如，戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲氧基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1,1,2-三甲基丙氧基、1,2,2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基和1-乙基-2-甲基丙氧基。
-C1-C4-烷硫基：例如甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、1-甲基乙基硫基、丁基硫基、1-甲基丙基硫基、2-甲基丙基硫基和1,1-二甲基乙基硫基；
-C1-C6-烷硫基：如上文提到的C1-C4-烷硫基并且另外例如，戊基硫基、1-甲基丁基硫基、2-甲基丁基硫基、3-甲基丁基硫基、2,2-二甲基丙基硫基、1-乙基丙基硫基、己基硫基、1,1-二甲基丙基硫基、1,2-二甲基丙基硫基、1-甲基戊基硫基、2-甲基戊基硫基、3-甲基戊基硫基、4-甲基戊基硫基、1,1-二甲基丁基硫基、1,2-二甲基丁基硫基、1,3-二甲基丁基硫基、2,2-二甲基丁基硫基、2,3-二甲基丁基硫基、3,3-二甲基丁基硫基、1-乙基丁基硫基、2-乙基丁基硫基、1,1,2-三甲基丙基硫基、1,2,2-三甲基丙基硫基、1-乙基-1-甲基丙基硫基和1-乙基-2-甲基丙基硫基；
-C1-C6-烷基亚磺酰基(C1-C6-烷基-S(＝O)-)：例如，甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丙基亚磺酰基、1-甲基乙基亚磺酰基、丁基亚磺酰基、1-甲基丙基亚磺酰基、2-甲基丙基亚磺酰基、1,1-二甲基乙基亚磺酰基、戊基亚磺酰基、1-甲基丁基亚磺酰基、2-甲基丁基亚磺酰基、3-甲基丁基亚磺酰基、2,2-二甲基丙基亚磺酰基、1-乙基丙基亚磺酰基、1,1-二甲基丙基亚磺酰基、1,2-二甲基丙基亚磺酰基、己基亚磺酰基、1-甲基戊基亚磺酰基、2-甲基戊基亚磺酰基、3-甲基戊基亚磺酰基、4-甲基戊基亚硫酰基、1,1-二甲基丁基亚磺酰基、1,2-二甲基丁基亚磺酰基、1,3-二甲基丁基-亚磺酰基、2,2-二甲基丁基亚磺酰基、2,3-二甲基丁基亚磺酰基、3,3-二甲基丁基亚磺酰基、1-乙基丁基亚磺酰基、2-乙基丁基亚磺酰基、1,1,2-三甲基丙基亚磺酰基、1,2,2-三甲基丙基亚磺酰基、1-乙基-1-甲基丙基亚磺酰基和1-乙基-2-甲基丙基亚磺酰基；
-C1-C6-烷基磺酰基(C1-C6-烷基-S(O)2-)：例如甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、1-甲基乙基磺酰基、丁基磺酰基、1-甲基丙基磺酰基、2-甲基-丙基磺酰基、1,1-二甲基乙基磺酰基、戊基磺酰基、1-甲基丁基磺酰基、2-甲基丁基磺酰基、3-甲基丁基磺酰基、1,1-二甲基丙基磺酰基、1,2-二甲基丙基磺酰基、2,2-二甲基丙基磺酰基、1-乙基丙基磺酰基、己基磺酰基、1-甲基戊基磺酰基、2-甲基戊基磺酰基、3-甲基戊基磺酰基、4-甲基戊基磺酰基、1,1-二甲基丁基磺酰基、1,2-二甲基丁基磺酰基、1,3-二甲基丁基磺酰基、2,2-二甲基丁基磺酰基、2,3-二甲基丁基磺酰基、3,3-二甲基丁基磺酰基、1-乙基丁基磺酰基、2-乙基丁基磺酰基、1,1,2-三甲基-丙基磺酰基、1,2,2-三甲基丙基磺酰基、1-乙基-1-甲基丙基磺酰基和1-乙基-2-甲基丙基磺酰基；
-(C1-C4-烷基)氨基：例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、1-甲基乙基氨基、丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙基氨基或1,1-二甲基乙基氨基；
-(C1-C6-烷基)氨基：如上文提到的(C1-C4-烷基氨基)并且另外例如，戊基氨基、1-甲基丁基氨基、2-甲基丁基氨基、3-甲基丁基氨基、2,2-二甲基丙基氨基、1-乙基丙基氨基、己基氨基、1,1-二甲基丙基氨基、1,2-二甲基丙基氨基、1-甲基戊基氨基、2-甲基戊基氨基、3-甲基戊基氨基、4-甲基戊基氨基、1,1-二甲基丁基氨基、1,2-二甲基丁基氨基、1,3-二甲基丁基氨基、2,2-二甲基丁基氨基、2,3-二甲基丁基-氨基、3,3-二甲基丁基氨基、1-乙基丁基氨基、2-乙基丁基氨基、1,1,2-三甲基丙基氨基、1,2,2-三甲基-丙基氨基、1-乙基-1-甲基丙基氨基或1-乙基-2-甲基丙基氨基；
-二(C1-C4-烷基)氨基：例如N,N-二甲基氨基、N,N-二乙基氨基、N,N-二(1-甲基乙基)氨基、N,N-二丙基氨基、N,N-二丁基氨基、N,N-二(1-甲基丙基)氨基、N,N-二(2-甲基丙基)氨基、N,N-二(1,1-二甲基乙基)氨基、N-乙基-N-甲基氨基、N-甲基-N-丙基氨基、N-甲基-N-(1-甲基乙基)氨基、N-丁基-N-甲氨基、N-甲基-N-(1-甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(2-甲基丙基)氨基、N-(1,1-二甲基乙基)-N-甲氨基、N-乙基-N-丙基氨基、N-乙基-N-(1-甲基乙基)氨基、N-丁基-N-乙基氨基、N-乙基-N-(1-甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(2-甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1,1-二甲基乙基)氨基、N-(1-甲基乙基)-N-丙基氨基、N-丁基-N-丙基氨基、N-(1-甲基丙基)-N-丙基氨基、N-(2-甲基丙基)-N-丙基氨基、N-(1,1-二甲基乙基)-N-丙基氨基、N-丁基-N-(1-甲基乙基)氨基、N-(1-甲基乙基)-N-(1-甲基丙基)氨基、N-(1-甲基乙基)-N-(2-甲基丙基)氨基、N-(1,1-二甲基乙基)-N-(1-甲基乙基)氨基、N-丁基-N-(1-甲基丙基)氨基、N-丁基-N-(2-甲基丙基)氨基、N-丁基-N-(1,1-二甲基乙基)氨基、N-(1-甲基丙基)-N-(2-甲基丙基)氨基、N-(1,1-二甲基乙基)-N-(1-甲基丙基)氨基或N-(1,1-二甲基乙基)-N-(2-甲基丙基)氨基；
-二(C1-C6-烷基)氨基：如上文提到的二(C1-C4-烷基)氨基并且另外例如，N-甲基-N-戊基氨基、N-甲基-N-(1-甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(2-甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(3-甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(2,2-二甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1-乙基丙基)氨基、N-甲基-N-己基氨基、N-甲基-N-(1,1-二甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1,2-二甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1-甲基戊基)氨基、N-甲基-N-(2-甲基戊基)氨基、N-甲基-N-(3-甲基戊基)氨基、N-甲基-N-(4-甲基戊基)氨基、N-甲基-N-(1,1-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(1,2-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(1,3-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(2,2-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(2,3-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(3,3-二甲基丁基)氨基、N-甲基-N-(1-乙基丁基)氨基、N-甲基-N-(2-乙基丁基)氨基、N-甲基-N-(1,1,2-三甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1,2,2-三甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1-乙基-1-甲基丙基)氨基、N-甲基-N-(1-乙基-2-甲基丙基)氨基、N-乙基-N-戊基氨基、N-乙基-N-(1-甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(2-甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(3-甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(2,2-二甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1-乙基丙基)氨基、N-乙基-N-己基氨基、N-乙基-N-(1,1-二甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1,2-二甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1-甲基戊基)氨基、N-乙基-N-(2-甲基戊基)氨基、N-乙基-N-(3-甲基戊基)氨基、N-乙基-N-(4-甲基戊基)氨基、N-乙基-N-(1,1-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(1,2-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(1,3-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(2,2-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(2,3-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(3,3-二甲基丁基)氨基、N-乙基-N-(1-乙基丁基)氨基、N-乙基-N-(2-乙基丁基)氨基、N-乙基-N-(1,1,2-三甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1,2,2-三甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1-乙基-1-甲基丙基)氨基、N-乙基-N-(1-乙基-2-甲基丙基)氨基、N-丙基-N-戊基氨基、N-丁基-N-戊基氨基、N,N-二戊基氨基、N-丙基-N-己基氨基、N-丁基-N-己基氨基、N-戊基-N-己基氨基或N,N-二己基氨基；
-3元至6元杂环基：具有3至6个如上文提到的环成员的单环饱和烃或部分不饱和烃，所述烃除碳原子之外还含有一个或两个选自O、S和N的杂原子；
例如2-环氧乙烷基、2-氧杂环丁烷基、3-氧杂环丁烷基、2-氮丙啶基、3-硫杂环丁基、1-吖丁啶基、2-吖丁啶基，
例如2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩、3-四氢噻吩、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、3-异
Figure BDA0001990628130000811
唑烷基、4-异
Figure BDA0001990628130000812
唑烷基、5-异
Figure BDA0001990628130000813
唑烷基、3-异噻唑烷基、4-异噻唑烷基、5-异噻唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、5-吡唑烷基、2-
Figure BDA0001990628130000814
唑啉基、4-
Figure BDA0001990628130000815
唑啉基、5-
Figure BDA0001990628130000816
唑啉基、2-噻唑烷基、4-噻唑烷基、5-噻唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基；
例如2,3-二氢呋喃-2-基、2,3-二氢呋喃-3-基、2,4-二氢呋喃-2-基、2,4-二氢呋喃-3-基、2,3-二氢噻吩-2-基、2,3-二氢噻吩-3-基、2,4-二氢噻吩-2-基、2,4-二氢噻吩-3-基、4,5-二氢吡咯-2-基、4,5-二氢吡咯-3-基、2,5-二氢吡咯-2-基、2,5-二氢吡咯-3-基、4,5-二氢异
Figure BDA0001990628130000817
唑-3-基、2,5-二氢异
Figure BDA0001990628130000818
唑-3-基、2,3-二氢异
Figure BDA0001990628130000819
唑-3-基、4,5-二氢异
Figure BDA00019906281300008110
唑-4-基、2,5-二氢异
Figure BDA00019906281300008111
唑-4-基、2,3-二氢异
Figure BDA00019906281300008112
唑-4-基、4,5-二氢异
Figure BDA00019906281300008113
唑-5-基、2,5-二氢异
Figure BDA00019906281300008114
唑-5-基、2,3-二氢异
Figure BDA00019906281300008115
唑-5-基、4,5-二氢异噻唑-3-基、2,5-二氢异噻唑-3-基、2,3-二氢异噻唑-3-基、4,5-二氢异噻唑-4-基、2,5-二氢异噻唑-4-基、2,3-二氢异噻唑-4-基、4,5-二氢异噻唑-5-基、2,5-二氢异噻唑-5-基、2,3-二氢异噻唑-5-基、2,3-二氢吡唑-2-基、2,3-二氢吡唑-3-基、2,3-二氢吡唑-4-基、2,3-二氢吡唑-5-基、3,4-二氢吡唑-3-基、3,4-二氢吡唑-4-基、3,4-二氢吡唑-5-基、4,5-二氢吡唑-3-基、4,5-二氢吡唑-4-基、4,5-二氢吡唑-5-基、2,3-二氢咪唑-2-基、2,3-二氢咪唑-3-基、2,3-二氢咪唑-4-基、2,3-二氢咪唑-5-基、4,5-二氢咪唑-2-基、4,5-二氢咪唑-4-基、4,5-二氢咪唑-5-基、2,5-二氢咪唑-2-基、2,5-二氢咪唑-4-基、2,5-二氢咪唑-5-基、2,3-二氢
Figure BDA00019906281300008116
唑-3-基、2,3-二氢
Figure BDA00019906281300008117
唑-4-基、2,3-二氢
Figure BDA0001990628130000821
唑-5-基、3,4-二氢
Figure BDA0001990628130000822
唑-3-基、3,4-二氢
Figure BDA0001990628130000823
唑-4-基、3,4-二氢
Figure BDA0001990628130000824
唑-5-基、2,3-二氢噻唑-3-基、2,3-二氢噻唑-4-基、2,3-二氢噻唑-5-基、3,4-二氢噻唑-3-基、3,4-二氢噻唑-4-基、3,4-二氢噻唑-5-基、3,4-二氢噻唑-2-基、3,4-二氢噻唑-3-基、3,4-二氢噻唑-4-基；
例如2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1,3-二
Figure BDA0001990628130000825
烷-2-基、1,3-二
Figure BDA0001990628130000826
烷-4-基、1.3–二
Figure BDA0001990628130000827
烷–5–基、1,4-二
Figure BDA0001990628130000828
烷-2-基、1,3-二噻烷-2-基、1,3-二噻烷-4-基、1,4-二噻烷-2-基、1,3-二噻烷-5-基、2–四氢吡喃基、3-四氢吡喃基、4-四氢吡喃基、2–四氢噻喃基、3-四氢噻喃基、4–四氢噻喃基、3-六氢哒嗪基、4-六氢哒嗪基、2-六氢嘧啶基、4-六氢嘧啶基、5-六氢嘧啶基、2-哌嗪基、四氢-1,3-
Figure BDA0001990628130000829
嗪-2-基、四氢-1,3-
Figure BDA00019906281300008210
嗪-6-基、2-吗啉基、3-吗啉基；
例如2H-吡喃-2-基、2H-吡喃-3-基、2H-吡喃-4-基、2H-吡喃-5-基、2H-吡喃-6-基、3.6-二氢-2H-吡喃-2-基、3.6-二氢-2H-吡喃-3-基、3.6-二氢-2H-吡喃-4-基、3.6-二氢-2H-吡喃-5-基、3.6-二氢-2H-吡喃-6-基、3,4-二氢-2H-吡喃-3-基、3.4-二氢-2H-吡喃-4-基、3,4-二氢-2H-吡喃-6-基、2H-噻喃-2-基、2H-噻喃-3-基、2H-噻喃-4-基、2H-噻喃-5-基、2H-噻喃-6-基、5,6-二氢-4H-1,3-
Figure BDA00019906281300008211
嗪-2-基；
下本文提到的本发明的优选实施方案必需理解为是彼此独立地或彼此组合地优选的。
根据本发明的一个优选实施方案，还优选式(I)的那些吖嗪类化合物，其中变量彼此独立地或彼此组合地具有以下含义：
优选式(I)的吖嗪，其中
A是由2至5个取代基取代的苯基，其中所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选由2至5个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；尤其优选地选自F、Cl和CN；
特别优选由2至4个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还尤其优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
更优选由2个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还尤其优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还更优选由3个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还尤其优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还更优选由4个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还尤其优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000831
其中
Ra和Re彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选Ra和Re彼此独立地是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
尤其优选Ra和Re彼此独立地是卤素或CN；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；
更优选Ra和Re是卤素；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素或CN；
最优选Ra和Re是卤素；并且Rb、Rc和Rd是氢；
还最优选Ra、Rb、Rd和Re是卤素；并且Rc是氢；
还最优选Ra、Rb、Rc、Rd和Re是卤素。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000841
其中Ra是卤素或CN；Rb和Rd是H、卤素或CN；Rc是H或卤素；Re是卤素、CN或C1-C6-烷基；
特别优选Ra是卤素；Rb、Rc和Rd是H或卤素；并且Re是卤素或CN；
尤其优选Ra、Rb、Rd和Re是卤素；并且Rc是H或卤素；
更优选Ra、Rb、Rd和Re是F；并且Rc是H或F。
特别优选式(I)的吖嗪，其中A选自(A.1.1)、(A.1.2)和(A.1.3)；
更优选地选自(A.1.2)和(A.1.3)；
Figure BDA0001990628130000842
其中
Ra和Re彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选Ra和Re彼此独立地是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
尤其优选Ra和Re彼此独立地是卤素或CN；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；
更优选Ra和Re是卤素；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素或CN；
最优选Ra、Rb、Rd和Re是卤素。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000851
其中Ra、Rb、Rd和Re具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000852
其中Ra、Rb和Re具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000853
其中Ra和Re具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是由1至4个取代基取代的2-氟-苯基，其中所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选的是由1至4个取代基取代的2-氟-苯基，其中所述取代基选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；尤其优选地选自F、Cl和CN；
尤其优选的是由1至3个取代基取代的2-氟-苯基，其中所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
更优选由1个取代基取代的2-氟-苯基，其中所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还更优选由2个取代基取代的2-氟-苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还更优选由3个取代基取代的2-氟-苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基和(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；尤其优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000871
其中
Ra是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选Ra是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
尤其优选Ra是卤素或CN；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；
更优选Ra是卤素；并且Rb、Rc和Rd彼此独立地是氢、卤素或CN；
最优选Ra是卤素；并且Rb、Rc和Rd是氢；
还最优选Ra、Rb和Rd是卤素；并且Rc是氢；
还最优选Ra、Rb、Rc和Rd是卤素。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000872
其中Ra是卤素、CN或C1-C6-烷基；Rb和Rd是H、卤素或CN；并且Rc是H或卤素；
特别优选Ra是卤素或CN；并且Rb、Rc和Rd是H或卤素；
特别优选Ra、Rb和Rd是卤素；并且Rc是H或卤素；
还特别优选Ra、Rb和Rd是卤素；并且Rc是H、F、Br或I；
更优选Ra、Rb和Rd是F；并且Rc是F、Br或I；
还更优选Ra、Rb和Rd是F；并且Rc是H或F。
特别优选式(I)的吖嗪，其中A选自(A.1a.1)、(A.1a.2)和(A.1a.3)；
更优选地选自(A.1.2)和(A.1.3)；
Figure BDA0001990628130000881
其中
Ra是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；
特别优选Ra是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基或C1-C6-烷氧基；
特别优选Ra是卤素或CN；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素、CN、C1-C6-烷基或C1-C6-烷氧基；
更优选Ra是卤素；并且Rb和Rd彼此独立地是卤素或CN；
最优选Ra、Rb和Rd是卤素。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000882
其中Ra、Rb和Rd具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000891
其中Ra和Rb具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还特别优选式(I)的吖嗪，其中
A是
Figure BDA0001990628130000892
其中Ra具有如上文定义的含义、尤其优选的含义。
还优选式(I)的吖嗪，其中
R1是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、CH3、CH2OCH3、OCH3、COCH3或SO2CH3；
更优选氢。
还优选式(I)的吖嗪，其中
R2是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
特别优选卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
还特别优选H、F、Cl、CH3或CF3。
还优选式(I)的吖嗪，其中
R3和R4
彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或连同与它们连接的碳原子一起形成选自C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基和3元至6元杂环基的部分，其中C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基、或3元至6元杂环基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；
特别优选彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或连同与它们连接的碳原子一起形成选自C3-C6-环烷基和C3-C6-环烯基的部分，其中C3-C6-环烷基或C3-C6-环烯基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；
特别优选彼此独立地H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
更优选地彼此独立地是H、卤素或C1-C6-烷基。
还优选式(I)的吖嗪，其中
R2是H、卤素、C1-C6-烷基；并且R3和R4彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或连同与它们连接的碳原子一起形成C3-C6-环烷基；
特别优选R2是H、卤素或C1-C6-烷基；R3是C1-C6-烷基；R4是H、卤素或C1-C6-烷基；R3和R4连同与它们连接的碳原子一起形成C3-C6-环烷基；
特别优选R2是卤素或C1-C6-烷基；R3是C1-C6-烷基；R4是H或C1-C6-烷基；
更优选R2是卤素；并且R3和R4是C1-C6-烷基。
还优选式(I)的吖嗪，其中
R5是H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、CH3、CH2OCH3、OCH3、COCH3或SO2CH3；
更优选氢。
还优选式(I)的吖嗪，其中
A是
由2至5个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；特别优选地选自F、Cl和CN；
特别优选由2至4个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
特别优选由2个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还特别优选由3个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
还特别优选由4个取代基取代的苯基，所述取代基选自卤素、CN、NO2、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、OH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、(C1-C6-烷基)亚磺酰基、(C1-C6-烷基)磺酰基、氨基、(C1-C6-烷基)氨基、二(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-烷基)羰基、(C1-C6-烷氧基)羰基；特别优选地选自卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；特别优选地选自卤素和CN；还特别优选地选自F、Cl、CN和CH3；更优选地选自F、Cl和CN；
R1是
H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、CH3、CH2OCH3、OCH3、COCH3或SO2CH3；
更优选氢；
R2是
H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
特别优选卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
还特别优选H、F、CH3或CF3；
R3和R4
彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或连同与它们连接的碳原子一起形成选自C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基和3元至6元杂环基的部分，其中C3-C6-环烷基、C3-C6-环烯基、或3元至6元杂环基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；
特别优选彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；或连同与它们连接的碳原子一起形成选自C3-C6-环烷基和C3-C6-环烯基的部分，其中C3-C6-环烷基或C3-C6-环烯基是未取代的或由选自以下的1至3个取代基取代：卤素、CN、C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基；
特别优选彼此独立地是H、卤素、C1-C6-烷基或C1-C6-卤代烷基；
更优选的彼此独立地是H、卤素或C1-C6-烷基；且
R5是
H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、(C1-C6-烷基)羰基或(C1-C6-烷基)磺酰基；
特别优选H、CN、CH3、CH2OCH3、OCH3、COCH3或SO2CH3；
更优选氢。
特别优选式(I.a)的吖嗪，其对应于其中A是(A.1)并且R1和R5是H的式(I)的吖嗪：
Figure BDA0001990628130000921
其中变量Ra、Rb、Rc、Rd、Re、R2、R3和R4具有如上文定义的含义、尤其优选的含义；
特别优选表A的式(I.a.1)至(I.a.1406)的吖嗪，其中变量Ra、Rb、Rc、Rd、Re、R2、R3和R4的定义不仅在相互组合时而且在每种情况下各自也是对本发明化合物特别重要的：
表A
Figure BDA0001990628130000922
Figure BDA0001990628130000931
Figure BDA0001990628130000941
Figure BDA0001990628130000951
Figure BDA0001990628130000961
Figure BDA0001990628130000971
Figure BDA0001990628130000981
Figure BDA0001990628130000991
Figure BDA0001990628130001001
Figure BDA0001990628130001011
Figure BDA0001990628130001021
Figure BDA0001990628130001031
Figure BDA0001990628130001041
Figure BDA0001990628130001051
Figure BDA0001990628130001061
Figure BDA0001990628130001071
Figure BDA0001990628130001081
Figure BDA0001990628130001091
Figure BDA0001990628130001101
Figure BDA0001990628130001111
Figure BDA0001990628130001121
Figure BDA0001990628130001131
Figure BDA0001990628130001141
Figure BDA0001990628130001151
Figure BDA0001990628130001161
Figure BDA0001990628130001171
Figure BDA0001990628130001181
Figure BDA0001990628130001191
Figure BDA0001990628130001201
Figure BDA0001990628130001211
Figure BDA0001990628130001221
Figure BDA0001990628130001231
Figure BDA0001990628130001241
Figure BDA0001990628130001251
Figure BDA0001990628130001261
Figure BDA0001990628130001271
Figure BDA0001990628130001281
可用于本发明的除草化合物还可以与额外的除草剂组合使用，其中作物植物天然耐受或已经如上文描述通过诱变而耐受或通过表达如上文提到的一种或多种额外转基因而抵抗所述额外的除草剂。可用于本发明的除草剂经常最佳地与一种或多种其他除草剂联合施用，以获得对更广泛种类不想要的植物的控制。与其他除草剂(以下称作化合物B)组合使用时，本发明的化合物可以与其他除草剂或多种除草剂一起配制、与其他除草剂或多种除草剂罐混、或与其他除草剂或多种除草剂依次施用。
其他的除草化合物B(组分B)尤其选自类别b1)至b15)的除草剂：
b1)脂质生物合成抑制剂；
b2)乙酰乳酸合酶抑制剂(ALS抑制剂)；
b3)光合作用抑制剂；
b4)原卟啉原-IX氧化酶抑制剂，
b5)褪色性除草剂(bleacher herbicides)；
b6)烯醇丙酮莽草酸3-磷酸合酶抑制剂(EPSP抑制剂)；
b7)谷氨酰胺合成酶抑制剂；
b8)7,8-二氢蝶酸合酶抑制剂(DHP抑制剂)；
b9)有丝分裂抑制剂；
b10)极长链脂肪酸合成抑制剂(VLCFA抑制剂)；
b11)纤维素生物合成抑制剂；
b12)解偶联除草剂；
b13)植物生长素除草剂；
b14)植物生长素转运抑制剂；和
b15)选自以下的其他除草剂：溴丁酰草胺(bromobutid)、整形醇(chlorflurenol)、整形醇甲酯(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快甲基硫酸酯(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、DSMA、杀草隆(dymron)、草藻灭(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、麦草氟(flamprop)、麦草氟异丙酯(flamprop-isopropyl)、麦草氟甲酯(flamprop-methyl)、高效麦草氟异丙酯(flamprop-M-isopropyl)、高效麦草氟甲酯(flamprop-M-methyl)、芴醇(flurenol)、芴丁酯(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、杀木膦(fosamine)、杀木膦铵盐(fosamine-ammonium)、茚草酮(Indanofan)、茚嗪氟草胺(indaziflam)、马来酰肼、氟磺酰草胺(mefluidid)、威百亩(metam)、methiozolin(CAS 403640-27-7)、叠氮甲烷(methyl azide)、甲基溴(methylbromide)、甲基莎扑隆(methyl-dymron)、甲基碘(methyl iodide)、MSMA、油酸、氯
Figure BDA0001990628130001291
嗪草(oxaziclomefone)、壬酸、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)、灭草环(tridiphane)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-羟基哒嗪(CAS 499223-49-3)及其盐和酯；
包括其农业可用盐或衍生物如醚、酯或酰胺。
优选本发明的那些组合物，它们包含选自除草剂类别b1、b6、b9、b10和b11的至少一种除草剂B。
可以与本发明的式(I)化合物组合使用的除草剂B的例子是：
b1)来自脂质生物合成抑制剂类的以下除草剂：
ACC除草剂如禾草灭(alloxydim)、禾草灭钠盐(alloxydim-sodium)、丁氧环酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、炔草酸(clodinafop)、炔草酸炔丙酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop)、氰氟草丁酯(cyhalofop-butyl)、氯甲草(diclofop)、氯甲草甲酯(diclofop-methyl)、
Figure BDA0001990628130001301
唑禾草灵(fenoxaprop)、
Figure BDA0001990628130001302
唑禾草灵乙酯(fenoxaprop-ethyl)、精
Figure BDA0001990628130001303
唑禾草灵(fenoxaprop-P)、精
Figure BDA0001990628130001304
唑禾草灵乙酯(fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、吡氟禾草灵丁酯(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、精吡氟禾草灵丁酯(fluazifop-P-butyl)、氟吡禾灵(haloxyfop)、氟吡甲禾灵甲酯(haloxyfop-methyl)、精氟吡甲禾灵(haloxyfop-P)、精氟吡禾灵甲酯(haloxyfop-P-methyl)、
Figure BDA0001990628130001305
唑酰草胺(metamifop)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop)、喹禾灵乙酯(quizalofop-ethyl)、喹禾灵四氢糠酯(quizalofop-tefuryl)、精喹禾灵(quizalofop-P)、精喹禾灵乙酯(quizalofop-P-ethyl)、精喹禾灵四氢糠酯(quizalofop-P-tefuryl)、稀禾定(sethoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)、肟草酮(tralkoxydim)，
4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS1312337-72-6)；4-(2',4'-二氯-4-环丙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS1312337-45-3)；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS1033757-93-5)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3,5(4H,6H)-二酮(CAS1312340-84-3)；5-(乙酰氧基)-4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS1312337-48-6)；5-(乙酰氧基)-4-(2',4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮；5-(乙酰氧基)-4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS1312340-82-1)；5-(乙酰氧基)-4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS1033760-55-2)；4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS1312337-51-1)；4-(2',4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS1312340-83-2)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS1033760-58-5)；和非ACC除草剂如呋草磺(benfuresate)、苏达灭(butylate)、环草特(cycloate)、茅草枯(dalapon)、哌草丹(dimepiperate)、EPTC，禾草畏(esprocarb)、乙呋草黄(ethofumesate)、四氟丙酸(flupropanate)、草达灭(molinate)、坪草丹(orbencarb)、克草猛(pebulate)、苄草丹(prosulfocarb)、TCA、杀草丹(thiobencarb)、仲草丹(tiocarbazil)、野麦畏(triallate)和灭草猛(vernolate)；
b2)来自ALS抑制剂类的以下除草剂：
磺酰脲类如磺氨黄隆(amidosulfuron)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron)、苄嘧黄隆甲酯(bensulfuron-methyl)、氯嘧黄隆(chlorimuron)、氯嘧黄隆乙酯(chlorimuron-ethyl)、绿黄隆(chlorsulfuron)、醚黄隆(cinosulfuron)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、胺苯磺隆甲酯(ethametsulfuron-methy)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(flazasulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟啶黄隆(flupyrsulfuron)、氟啶黄隆甲酯钠盐(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰胺黄隆(foramsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、氯吡嘧磺隆甲酯(halosulfuron-methyl)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘黄隆甲酯钠盐(iodosulfuron-methyl-sodium)、iofensulfuron、iofensulfuron钠盐、甲磺胺黄隆(mesosulfuron)、嗪吡嘧磺隆(metazosulfuron)、甲磺隆(metsulfuron)、甲磺隆甲酯(metsulfuron-methyl)、烟黄隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环丙氧黄隆(oxasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氟嘧磺隆甲酯(primisulfuron-methyl)、丙嗪嘧磺隆(propyrisulfuron)、氟丙黄隆(prosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron)、吡嘧黄隆乙酯(pyrazosulfuron-ethyl)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、嘧黄隆甲酯(sulfometuron-methyl)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、噻磺隆甲酯(thifensulfuron-methyl)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron)、苯黄隆甲酯(tribenuron-methyl)、三氟啶黄隆(trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、氟胺磺隆甲酯(triflusulfuron-methyl)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)，
咪唑啉酮类如咪草酯(imazamethabenz)、咪草甲酯(imazamethabenz-methyl)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)和咪草烟(imazethapyr)、三唑并嘧啶除草剂和苯磺酰胺类如氯酯磺草胺(cloransulam)、氯酯磺草胺甲酯(cloransulam-methyl)、唑嘧磺胺(diclosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑草磺胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)、pyrimisulfan和吡唑磺草胺(pyroxsulam)，
嘧啶基苯甲酸类如双草醚(bispyribac)、双草醚钠盐(bispyribac-sodium)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、pyriftalide、pyriminobac、嘧草醚(pyriminobac-methyl)、嘧硫苯甲酸(pyrithiobac)、嘧硫苯甲酸(pyrithiobac)钠盐，4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧]苯基]甲基]氨基]-苯甲酸-1-甲基乙酯(CAS420138-41-6)、4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧]苯基]甲基]氨基]-苯甲酸丙酯(CAS 420138-40-5)、N-(4-溴苯基)-2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧]苯甲胺(CAS420138-01-8)，
磺酰氨基羰基-三唑啉酮类除草剂如氟酮磺隆(flucarbazone)、氟酮磺隆钠盐(flucarbazone-sodium)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、丙苯磺隆钠盐(propoxycarbazone-sodium)、噻酮磺隆(thiencarbazone)和噻酮磺隆甲酯(thiencarbazone-methyl)；和氟酮磺草胺(triafamone)；
在这些当中，本发明优选的实施方案涉及包含至少一种咪唑啉酮除草剂的那些组合物。
b3)来自光合作用抑制剂类的以下除草剂：
氨唑草酮(amicarbazone)、光系统II的抑制剂，例如三嗪类除草剂，包括氯三嗪类(chlorotriazine)、三嗪酮类、三嗪二酮类、甲基硫基三嗪类和哒嗪酮类如莠灭净(ametryn)、阿特拉津(atrazine)、杀草敏(chloridazon)、草净津(cyanazine)、敌草净(desmetryn)、戊草津(dimethametryn)、环嗪酮(hexazinone)、赛克津(metribuzin)、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、扑灭津(propazine)、西玛津(simazine)、西草净(simetryn)、特丁通(terbumeton)、特丁津(terbuthylazine)、去草净(terbutryn)和草达津(trietazin)、芳基脲类如氯溴隆(chlorobromuron)、绿麦隆(chlortoluron)、chloroxuron,
Figure BDA0001990628130001331
唑隆(dimefuron)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、异丙隆(isoproturon)、异唑隆(isouron)、利谷隆(linuron)、苯嗪草(metamitron)、噻唑隆(methabenzthiazuron)、吡喃隆(metobenzuron)、甲氧隆(metoxuron)、绿谷隆(monolinuron)、草不隆(neburon)、环草隆(siduron)、丁唑隆(tebuthiuron)和噻苯隆(thiadiazuron)、苯基氨基甲酸盐类如异苯敌草(desmedipham)、卡草灵(karbutilat)、苯敌草(phenmedipham)、苯敌草乙酯(phenmedipham-ethyl)、腈类除草剂如溴酚肟(bromofenoxim)、溴苯腈(bromoxynil)及其盐和酯、碘苯腈(ioxynil)及其盐和酯、尿嘧啶类如除草定(bromacil)、环草定(lenacil)和特草定(terbacil)和苯达松(bentazon)及苯达松钠盐(bentazon-sodium)、达草止(pyridate)、氯苯哒醇(pyridafol)、甲氯酰草胺(pentanochlor)和敌稗(propanil)，和光系统I的抑制剂，如敌草快(diquat)、敌草快二溴盐(diquat-dibromide)、百草枯(paraquat)、百草枯二氯盐(paraquat-dichloride)和百草枯二甲基硫酸酯(paraquat-dimetilsulfate)。在这些当中，本发明优选的实施方案涉及包含至少一种芳基脲除草剂的那些组合物。同样地，在这些当中，本发明优选的实施方案涉及包含至少一种三嗪除草剂的那些组合物。同样地，在这些当中，本发明优选的实施方案涉及包含至少一种腈除草剂的那些组合物；
b4)来自原卟啉原-IX氧化酶抑制剂类的以下除草剂：
氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚钠盐(acifluorfen-sodium)、唑啶草酮(azafenidin)、苯卡巴腙(bencarbazone)、双苯嘧草酮(benzfendizone)、治草醚(bifenox)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone)、氟酮唑草乙酯(carfentrazone-ethyl)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、吲哚酮草乙酯(cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟哒嗪草(flufenpyr)、氟哒嗪草乙酯(flufenpyr-ethyl)，氟烯草酸(flumiclorac)、氟烯草酸戊酯(flumiclorac-pentyl)，氟
Figure BDA0001990628130001332
嗪酮(flumioxazin)、羧氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet)、嗪草酸甲酯(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙
Figure BDA0001990628130001333
唑草(oxadiargyl)、恶草灵(oxadiazon)、氟硝草醚(oxyfluorfen)、戊
Figure BDA0001990628130001334
唑草(pentoxazone)、氟唑草胺(profluazol)、双唑草腈(pyraclonil)、碲酸钾盐(pyraflufen)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、磺胺草唑(sulfentrazone)、噻二唑草胺(thidiazimin)、tiafenacil、乙基[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧]乙酸酯(CAS 353292-31-6；S-3100)，N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]
Figure BDA0001990628130001341
嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪-2,4-二酮、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]
Figure BDA0001990628130001342
嗪-6-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]
Figure BDA0001990628130001343
嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]
Figure BDA0001990628130001344
嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮、甲基(E)-4-[2-氯-5-[4-氯-5-(二氟甲氧基)-1H-甲基-吡唑-3-基]-4-氟-苯氧基]-3-甲氧基-丁-2-烯酸酯[CAS948893-00-3]和3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 212754-02-4)；
b5)来自褪色性除草剂类的以下除草剂：
PDS抑制剂：氟丁酰草胺(beflubutamid)、吡氟草胺(diflufenican)、氟草同(fluridone)、氟咯草酮(fluorochloridone)、呋草酮(flurtamone)、达草灭(norflurazon)、氟吡酰草胺(picolinafen)和4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(CAS180608-33-7)，HPPD抑制剂：双环磺草酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、异恶草酮(clomazone)、fenquintrione、异
Figure BDA0001990628130001345
氟草(isoxaflutole)、硝磺酮(mesotrione)、磺酰草吡唑(pyrasulfotol)，吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、磺草酮(sulcotrione)、特糠酯酮(tefuryltrione)、环磺酮(tembotrione)、苯唑草酮(topramezone)和氟吡草酮(bicyclopyrone)、褪色剂，未知靶：苯草醚(aclonifen)、杀草强(amitrole)和伏草隆(flumeturon)；
b6)来自EPSP合酶抑制剂类的以下除草剂：
草甘膦(glyphosate)、草甘膦异丙基铵盐(glyphosate-isopropylammonium)、草甘膦钾盐(glyposate-potassium)和草甘膦三甲基硫盐(glyphosate-trimesium)(草硫膦(sulfosate))；
b7)来自谷氨酰胺合酶抑制剂类的以下除草剂：
双丙氨酰膦(bilanaphos)(双丙胺膦(bialaphos))、双丙氨酰膦钠盐(bilanaphos-sodium)、草铵膦(glufosinate)、高效草铵膦(glufosinate-P)和草铵膦铵盐(glufosinat-ammonium)；
b8)来自DHP合酶抑制剂类的以下除草剂：
黄草灵(asulam)；
b9)来自有丝分裂抑制剂类的以下除草剂：
K1类化合物：二硝基苯胺类如氟草胺(benfluralin)、双丁乐灵(butralin)、敌乐胺(dinitramine)、丁氟消草(ethalfluralin)、氯乙氟灵(fluchloralin)、黄草消(oryzalin)、胺硝草(pendimethalin)、氨基丙氟灵(prodiamine)和氟乐灵(trifluralin)；磷酰胺酯类如胺草磷(amiprophos)、胺草磷甲酯(amiprophos-methyl)和抑草膦(butamiphos)；苯甲酸类除草剂如敌草索(chlorthal)、敌草索二甲酯(chlorthal-dimethyl)；吡啶类如氟硫草定(dithiopyr)和噻氟啶草(thiazopyr)、苯甲酰胺类如戊炔草胺(propyzamide)和牧草胺(Tebutam)；K2类化合物：氯普芬(Chlorpropham)、苯胺灵(propham)和长杀草(carbetamide)；在这些化合物当中，优选K1类化合物，特别优选二硝基苯胺类；
b10)来自VLCFA抑制剂类的以下除草剂：
氯乙酰胺类如乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、克草胺(dimethachlor)、噻吩草胺(dimethenamid)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、精异丙甲草胺(metolachlor-S)、烯草胺(pethoxamid)、丙草胺(pretilachlor)、毒草安(propachlor)、异丙草胺(propisochlor)和噻醚草胺(thenylchlor)；氧乙酰苯胺类如氟噻草胺(flufenacet)和苯噻草胺(mefenacet)；乙酰苯胺类如草乃敌(diphenamid)、萘丙胺(naproanilide)和草萘胺(napropamide)和精草萘胺(napropamide-M)；四唑啉酮类如四唑草胺(fentrazamide)，和其他除草剂，如莎稗磷(anilofos)、唑草胺(cafenstrole)、fenoxasulfone、ipfencarbazone、哌草磷(piperophos)、派罗克杀草砜(pyroxasulfone)和式II.1、II.2、II.3、II.4、II.5、II.6、II.7、II.8和II.9的异
Figure BDA0001990628130001351
唑啉类化合物
Figure BDA0001990628130001361
式(I)I的异
Figure BDA0001990628130001362
唑啉化合物是本领域已知的，例如来自WO 2006/024820、WO 2006/037945、WO 2007/071900和WO 2007/096576的异
Figure BDA0001990628130001363
唑啉化合物。
在VLCFA抑制剂当中，优选氯乙酰胺类和氧乙酰胺类；
b11)来自纤维素生物合成抑制剂类的以下除草剂：
氯硫酰草胺(chlorthiamid)、敌草腈(dichlobenil)、胺草唑(flupoxam)、异恶草胺(isoxaben)和1-环己基-5-五氟苯氧基-14-[1,2,4,6]噻三嗪-3-基胺；
b12)来自解偶联除草剂类的以下除草剂：
地乐酚(dinoseb)、特乐酚(dinoterb)和DNOC及其盐；
b13)来自植物生长素除草剂类的以下除草剂：
2,4-D及其盐和酯如氯酰草膦(clacyfos)、2,4-DB及其盐和酯、氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)及其盐和酯、氯氨吡啶酸(aminopyralid)及其盐如氯氨吡啶酸-二甲基铵盐(aminopyralid-dimethylammonium)、氯氨吡啶酸三(2-羟丙基)铵盐(aminopyralid-tris(2-hydroxypropyl)ammonium)和其酯、草除灵(benazolin)、草除灵乙(benazolin-ethyl)、草灭平(chloramben)及其盐和酯、稗草胺(clomeprop)、二氯吡啶酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、2,4-滴丙酸(dichlorprop)及其盐和酯、精2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)及其盐和酯、氟草烟(fluroxypyr)、氟草烟丁氧甲酯(fluroxypyr-butometyl)、氯氟吡氧乙酸异辛酯(fluroxypyr-meptyl)、氟氯吡啶(halauxifen)及其盐和酯(CAS 943832-60-8)；MCPA及其盐和酯、MCPA乙硫酯(MCPA-thioethyl)、MCPB及其盐和酯、2甲4氯丙酸(mecoprop)及其盐和酯、精2-甲-4-氯丙酸(mecoprop-P)及其盐和酯、毒莠定(picloram)及其盐和酯、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹草酸(quinmerac)、TBA(2,3,6))及其盐和酯、和绿草定(triclopyr)及其盐和酯；
b14)来自植物生长素转运抑制剂类的除草剂：氟吡草腙(diflufenzopyr)、氟吡草腙钠盐(diflufenzopyr-sodium)、抑草生(naptalam)和抑草生钠盐(naptalam-sodium)；
b15)来自其他除草剂类的除草剂：溴丁酰草胺(bromobutide)、整形醇(chlorflurenol)、整形醇甲酯(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、cyclopyrimorate(CAS 499223-49-3)及其盐和酯、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快甲基硫酸酯(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、DSMA、杀草隆(dymron)、草藻灭(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、麦草氟(flamprop)、麦草氟异丙酯(flamprop-isopropyl)、麦草氟甲酯(flamprop-methyl)、高效麦草氟异丙酯(flamprop-M-isopropyl)、高效麦草氟甲酯(flamprop-M-methyl)、芴醇(flurenol)、芴丁酯(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、杀木膦(fosamine)、杀木膦铵盐(fosamine-ammonium)、茚草酮(Indanofan)、茚嗪氟草胺(indaziflam)、马来酰肼、氟磺酰草胺(mefluidid)、威百亩(metam)、methiozolin(CAS 403640-27-7)、叠氮甲烷(methyl azide)、甲基溴(methylbromide)、甲基莎扑隆(methyl-dymron)、甲基碘(methyl iodide)、MSMA、油酸、氯
Figure BDA0001990628130001371
嗪草(oxaziclomefone)、壬酸、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)和灭草环(tridiphane)。
具有羧基的活性化合物B和C可以在本发明的组合物中以酸的形式、以如上文提到的农业适用盐形式或以农业上可接受的衍生物形式使用。
在麦草畏(dicamba)的情况下，合适盐包括其中反离子是农业上可接受阳离子的那些盐。例如，麦草畏的合适盐是麦草畏-钠盐(dicamba-sodium)、麦草畏-钾盐(dicamba-potassium)、麦草畏-甲基铵盐(dicamba-methylammonium)、麦草畏-二甲基铵盐(dicamba-dimethylammonium)、麦草畏-异丙基铵盐(dicamba-isopropylammonium)、麦草畏-二甘醇胺盐(dicamba-diglycolamine)、麦草畏-乙醇胺盐(dicamba-olamine)、麦草畏-二乙醇胺盐(dicamba-diolamine)、麦草畏-三乙醇胺盐(dicamba-trolamine)、麦草畏-N,N-双-(3-氨基丙基)甲胺盐(dicamba-N,N-bis-(3-aminopropyl)methylamine)和麦草畏-二亚乙基三胺盐(dicamba-diethylenetriamine)。合适酯的例子是麦草畏甲酯(dicamba-methyl)和麦草畏丁氧基乙酯(dicamba-butotyl)。
2,4-D的合适盐是2,4-D-铵盐、2,4-D-二甲基铵盐、2,4-D-二乙基铵盐、2,4-D-二乙醇铵盐(2,4-D-diolamine)、2,4-D-三乙醇铵盐、2,4-D-异丙基铵盐、2,4-D-三异丙醇铵盐、2,4-D-庚基铵盐、2,4-D-十二烷基铵，2,4-D-十四烷基铵盐、2,4-D-三乙基铵盐、2,4-D-三(2-羟丙基)铵盐、2,4-D-三(异丙基)铵盐、2,4-D-三乙醇胺盐、2,4-D-锂盐、2,4-D-钠盐。2,4-D的合适酯的例子是2,4-D-丁氧乙酯、2,4-D-2-丁氧丙酯、2,4-D-3-丁氧丙酯、2,4-D-丁酯、2,4-D-乙酯、2,4-D-乙基己酯、2,4-D-异丁酯、2,4-D-异辛酯、2,4-D-异丙酯、2,4-D-异辛酯、2,4-D-甲酯、2,4-D-辛酯、2,4-D-戊酯、2,4-D-丙酯、2,4-D-糠酯(2,4-D-tefuryl)和氯酰草膦(clacyfos)。
2,4-DB的合适盐例如是2,4-DB-钠盐、2,4-DB-钾盐和2,4-DB-二甲基铵盐。2,4-DB的合适酯例如是2,4-DB-丁酯和2,4-DB-异辛酯。
2,4-滴丙酸的合适盐例如是2,4-滴丙酸钠盐、2,4-滴丙酸钾盐(dichlorprop-potassium)和2,4-滴丙酸二甲基铵盐(dichlorprop-dimethylammonium)。2,4-滴丙酸(dichlorprop)的合适酯的例子是2,4-滴丙酸丁氧乙酯(dichlorprop-butotyl)和2,4-滴丙酸异辛酯(dichlorprop-isoctyl)。
MCPA的合适盐和酯包括MCPA-丁氧乙酯、MCPA-丁酯、MCPA-二甲基铵盐、MCPA-二乙醇胺盐、MCPA-乙酯、MCPA-乙硫酯、MCPA-2-乙基己酯、MCPA-异丁酯、MCPA-异辛酯、MCPA-异丙酯、MCPA-异丙基铵盐、MCPA-甲酯、MCPA-乙醇胺盐、MCPA-钾盐、MCPA-钠盐和MCPA-三乙醇胺盐。
MCPB的合适盐是MCPB-钠盐。MCPB的合适酯是MCPB-乙酯。
二氯吡啶酸(clopyralid)的合适盐是二氯吡啶酸-钾盐、二氯吡啶酸-乙醇胺盐和二氯吡啶酸-三(2-羟丙基)铵盐。二氯吡啶酸的合适酯的例子是二氯吡啶酸-甲酯。
氟草烟(fluroxypyr)的合适酯的例子是氯氟吡氧乙酸异辛酯(fluroxypyr-meptyl)和氟草烟-2-丁氧基-1-甲基乙基酯，其中优选氯氟吡氧乙酸异辛酯。
毒莠定(picloram)的合适盐是毒莠定-二甲基铵盐、毒莠定钾盐、毒莠定-三异丙醇铵盐、毒莠定-三异丙铵盐和毒莠定-三乙醇胺盐。毒莠定的合适酯是毒莠定-异辛酯。
绿草定(triclopyr)的合适盐是绿草定-三乙基铵盐。绿草定的合适酯例如是绿草定-乙酯和绿草定-丁氧乙酯。
草灭平(chloramben)的合适盐和酯包括草灭平-铵盐、草灭平-二乙醇胺盐、草灭平-甲酯、草灭平-甲基铵盐和草灭平-钠盐。2,3,6-TBA的合适盐和酯包括2,3,6-TBA-二甲基铵盐、2,3,6-TBA-锂盐、2,3,6-TBA-钾盐和2,3,6-TBA-钠盐。
氯氨吡啶酸(aminopyralid)的合适盐和酯包括氯氨吡啶酸钾盐、氯氨吡啶酸-二甲基铵盐和氯氨吡啶酸三(2-羟丙基)铵盐。
草甘膦的合适盐例如是草甘膦-铵盐、草甘膦-二铵盐、草甘膦-二甲基铵盐、草甘膦异丙基-铵盐、草甘膦-钾盐、草甘膦-钠盐，草甘膦-三甲基硫盐(glyphosate-trimesium)以及-乙醇胺盐和-二乙醇胺盐、优选地草甘膦-二铵盐、草甘膦-异丙基铵盐和草甘膦-三甲基硫盐(草硫膦(sulfosate))。
草铵膦(glufosinate)的合适盐例如是草铵膦-铵盐。
精草铵膦(glufosinate-P)的合适盐例如是精草铵膦-铵盐。
溴苯腈(bromoxynil)的合适盐和酯例如是溴苯腈-丁酸酯、溴苯腈(bromoxynil)-庚酸酯、溴苯腈-辛酸酯、溴苯腈-钾盐和溴苯腈-钠盐。
ioxonil的合适盐和酯例如是ioxonil-辛酸酯、ioxonil-钾盐和ioxonil-钠盐。
2甲4氯丙酸(mecoprop)的合适盐和酯包括2甲4氯丙酸-丁氧乙酯、2甲4氯丙酸二甲基铵盐、2甲4氯丙酸-二乙醇胺盐、mecoprop-ethadyl、2甲4氯丙酸-2-乙基己酯、2甲4氯丙酸-异辛酯、2甲4氯丙酸-甲酯、2甲4氯丙酸-钾盐、2甲4氯丙酸-钠盐和2甲4氯丙酸-三乙醇胺盐。
精2-甲-4-氯丙酸(mecoprop-P)的合适盐例如是精2-甲-4-氯丙酸-丁氧乙酯、精2-甲-4-氯丙酸-二甲基铵盐、精2-甲-4-氯丙酸-2-乙基己酯、精2-甲-4-氯丙酸-异丁酯、精2-甲-4-氯丙酸-钾盐和精2-甲-4-氯丙酸-钠盐。
氟吡草腙(diflufenzopyr)的合适盐例如是氟吡草腙-钠盐。
抑草生(naptalam)的合适盐例如是抑草生-钠盐(naptalam-sodium)。
氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)的合适盐和酯例如是氯丙嘧啶酸二甲基-铵盐、氯丙嘧啶酸-甲酯、氯丙嘧啶酸-三异丙基铵盐、氯丙嘧啶酸-钠盐和氯丙嘧啶酸-钾盐。
二氯喹啉酸(quinclorac)的合适盐例如是二氯喹啉酸-二甲基铵盐。
喹草酸(quinmerac)的合适盐例如是喹草酸-二甲基铵盐。
咪草啶酸(imazamox)的合适盐例如是咪草啶酸-铵盐。
甲基咪草烟(imazapic)的合适盐例如是甲基咪草烟-铵盐和甲基咪草烟-异丙基铵盐。
灭草烟(imazapyr)的合适盐例如是灭草烟-铵盐和灭草烟异丙基-铵盐。
灭草喹(imazaquin)的合适盐例如是灭草喹铵盐。
咪草烟(imazethapyr)的合适盐例如是咪草烟-铵盐和咪草烟-异丙基铵盐。
苯唑草酮(topramezone)的合适盐例如是苯唑草酮-钠盐。
特别优选的除草化合物B是如上文定义的除草剂B；尤其下文表B中所列的除草剂B.1-B.189：
Figure BDA0001990628130001401
Figure BDA0001990628130001411
Figure BDA0001990628130001421
Figure BDA0001990628130001431
Figure BDA0001990628130001441
另外，与安全剂(safener)和任选地与一种或多种其他除草剂组合地施用式(I)的化合物,可以是有用的。安全剂是在不严重影响式(I)化合物对不想要的植物的除草作用情况下，防止或减少对有用植物的损伤的化学化合物。它们可以在有用植物的播种前(例如在种子处理、芽或籽苗上)或在出苗前施药或出苗后施药时施用。安全剂和式(I)化合物和任选地除草剂B可以同时或依次施用。
合适的安全剂例如是(喹啉-8-氧基)乙酸类、1-苯基-5-卤代烷基-1H-1,2,4-三唑-3-羧酸类、1-苯基-4,5-二氢-5-烷基-1H-吡唑-3,5-二羧酸类、4,5-二氢-5,5-二芳基-3-异
Figure BDA0001990628130001442
唑羧酸类、二氯乙酰胺类、α-肟基苯乙腈类、苯乙酮肟类、4,6-二卤-2-苯基嘧啶类、N-[[4-(氨基羰基)苯基]磺酰基]-2-苯甲酰胺类、1,8-萘二甲酐、2-卤-4-(卤代烷基)-5-噻唑羧酸类、硫代磷酸酯类和N-烷基-O-苯基氨基甲酸酯类及其农业可用盐和其农业上可接受的衍生物，如酰胺、酯和硫酯，条件是它们具有酸基团。
优选的安全剂C的例子是解草嗪(benoxacor)、解毒喹(cloquintocet)、cyometrinil、环丙磺酰胺(cyprosulfamide)、烯丙酰草胺(dichlormid)、dicyclonon、dietholate、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草安(flurazole)、肟草安(fluxofenim)、解草
Figure BDA0001990628130001452
唑(furilazole)、双苯
Figure BDA0001990628130001453
唑酸(isoxadifen)、吡唑解草酸(mefenpyr)、mephenate、萘二甲酐、解草腈(oxabetrinil)、4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660、CAS 71526-07-3)、2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1,3-
Figure BDA0001990628130001454
唑烷(R-29148、CAS 52836-31-4)和N-(2-甲氧基苯甲酰)-4-[(甲基氨羰基)氨基]苯磺酰胺(CAS129531-12-0)。
特别优选的安全剂C是以下化合物C.1至C.17。
Figure BDA0001990628130001451
类别b1)至b15)的活性化合物B和安全剂化合物C是已知的除草剂和安全剂，参见例如The Compendium of Pesticide Common Names(http://www.alanwood.net/pesticides/)；Farm Chemicals Handbook 2000第86卷,Meister Publishing Company,2000；B.Hock,C.Fedtke,R.R.Schmidt,Herbizide[Herbicides],Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1995；W.H.Ahrens,Herbicide Handbook,第7版,Weed Science Society ofAmerica,1994；和K.K.Hatzios,Herbicide Handbook,第7版增补,Weed Science Societyof America,1998。2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1,3-
Figure BDA0001990628130001461
唑烷[CAS编号52836-31-4]也称作R-29148。4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷[CAS编号71526-07-3]是也称作AD-67和MON 4660。
基于现有知识，可以将活性化合物归属于相应的作用机制。如果几种作用机制适用于一种活性化合物，则这种物质仅归属于一种作用机制。
通常优选与下述除草剂组合使用本发明化合物，所述除草剂对正在处理的作物有选择性并且在所用的施用率时对本发明化合物控制的杂草谱形成补充。通常还优选将本发明的化合物和其他互补性除草剂在相同时间，作为组合制剂或作为罐混物，施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过使用核酸编码的突变TriA鉴定除草剂的方法，所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列、或其变体或衍生物。
所述方法包括步骤：
a)产生包含编码突变TriA的核酸的转基因细胞或植物，其中表达突变TriA；
b)向a)的转基因细胞或植物并向相同品种的对照细胞或植物施用除草剂；
c)在施用所述除草剂后测定转基因细胞或植物和对照细胞或植物的生长或生存力，并且
d)与转基因细胞或植物的生长相比，选择赋予对照细胞或植物生长减少的“除草剂”。
如上文所述，本发明教导，与野生型品种的植物或种子相比，增加作物植物或种子的耐受性的组合物和方法。在一个优选的实施方案中，增加作物植物或种子的耐受性，从而植物或种子可以经受住除草剂施用，优选地大约1-1000g ai ha-1、更优选地1-200g ai ha-1、甚至更优选地5-150g ai ha-1和最优选地10-100g ai ha-1的除草剂施用。如本文所用，“经受住”除草剂施用意指这类施用不杀死或仅适度地损伤植物。本领域技术人员将理解，施用率可以根据环境条件如温度或湿度并且取决于选择的除草剂种类(即活性成分，ai)而变动。
可用于本发明多个实施方案中的出苗后杂草控制方法利用约>0.3x除草剂施用率；在一些实施方案中，这个比率可以是约例如>0.3x、>0.4x、>0.5x、>0.6x、>0.7x、>0.8x、>0.9x或>1x除草剂。在一个实施方案中，本发明的耐除草剂植物对按照约25至约200g有效成分/公顷的量在出苗后施用除草剂具有耐受性。在一些实施方案中，其中耐除草剂植物是双子叶植物(例如，大豆、棉)的情况下，除草剂按照约50g有效成分/公顷的量出苗后施用。在另一个实施方案中，其中耐除草剂植物是单子叶植物(例如，玉米、稻、高粱)的情况下，除草剂按照约200g有效成分/公顷的量出苗后施用。在其他实施方案中，其中耐除草剂植物是芸苔属植物(例如，卡诺拉油菜)的情况下，除草剂按照约25g有效成分/公顷的量出苗后施用。在本文的出苗后杂草控制方法中，在一些实施方案中，该方法可以在出苗后约7至10天利用除草剂施用率。在另一个实施方案中，施用率可以超过1x除草剂；在一些实施方案中，施用率可以是直至4x除草剂，但是更一般地，它是约2.5x或更小、或约2x或更小、或约1x或更小。
另外，本发明提供涉及使用至少一种除草剂的方法，所述除草剂任选地与如上文中详细描述的一种或多种除草化合物B和任选地安全剂C组合。
在这些方法中，除草剂可以通过本领域已知的任意方法施用，所述方法包括但不限于种子处理、土壤处理和叶处理。在施用之前，可以将除草剂转化成常用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、喷粉剂、粉剂、糊剂和粒剂。使用形式取决于具体的预期目的；在每种情况下，应当确保本发明化合物的精细和均匀分布。
通过提供具有增加的除草剂耐受性的植物，类型众多的制剂可以用于保护植物免受杂草影响，从而增强植物生长并且减少营养竞争作用。除草剂可以本身在本文所述的作物植物周围区域用于出苗前、出苗后、种植前和种植时控制杂草，或可以使用含有其他添加物的除草剂制剂。除草剂也可以用作种子处理剂。除草剂制剂中存在的添加物包括其他除草剂、去垢剂、辅助剂、铺展剂、粘合剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿式或干式制品并且可以包括但不限于可流动散剂(flowable powder)、乳油(emulsifiable concentrate)和浓液剂(liquid concentrate)。可以根据常规方法施用除草剂和除草剂制剂，例如通过喷洒、灌溉、拌合等。
PCT/EP2009/063387和PCT/EP2009/063386中详述了合适的制剂，所述文献通过引用的方式并入本文。
如本文中公开，本发明的TriA核酸用来增强植物的除草剂耐受性，其中所述植物在它们的基因组中包含编码耐除草剂的野生型或突变TriA蛋白的基因。如上文所述，这种基因可以是内源性基因或转基因。另外，在某些实施方案中，本发明的核酸可以与任何目的多核苷酸序列的组合堆叠以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的核酸可以与任何其它多核苷酸堆叠，所述的多核苷酸编码具有农药活性(pesticidal)和/或杀昆虫活性的多肽，例如，苏云金芽孢杆菌(Baccillus thuringiensis)毒素蛋白(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48:109中描述)、如WO02/068607中公开的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦(glyphosate)乙酰基转移酶(GAT)、细胞色素P450单加氧酶、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或ALS)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、八氢番茄红素去饱和酶(PD)、原卟啉原氧化酶(PPO)和麦草畏降解酶类，或如WO 2008141154或WO2005107437中公开的苯氧乙酸衍生物降解酶和苯氧丙酸衍生物降解酶。所产生的组合也可以包括任一种目的多核苷酸的多重拷贝。
因此，本发明的耐除草剂植物可以与其耐受的除草剂组合使用。可以使用本领域技术人员已知的任何技术，向本发明的植物施用除草剂。除草剂可以在植物栽培过程中的任何时点施用。例如，除草剂可以在种植前、种植时、出苗前、出苗后或其组合情况下施用。可以将除草剂施用至种子并且使其干燥，以在种子上形成一层除草剂。
在一些实施方案中，将种子用安全剂处理，随后在出苗后施用除草剂。在一个实施方案中，出苗后施用除草剂是在种植安全剂处理的种子后约7至10天。在一些实施方案中，安全剂是解毒喹(cloquintocet)、烯丙酰草胺(dichlormid)、肟草安(fluxofenim)或其组合。
控制杂草或不想要的植物的方法
在其他方面，本发明提供一种在植物或其植物部分生长的位置控制杂草的方法，所述方法包括：向该位置施用包含除草剂的组合物。
在一些方面，本发明提供一种在生长植物的位置控制杂草的方法，所述方法包括：向该位置施用包含除草剂的除草剂组合物，其中所述位置是(a)含有植物或能够产生所述植物的种子的位置；或(b)待在所述施用后包含该植物或种子的位置，其中所述植物或种子在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述启动子能够表达所述多核苷酸编码的突变TriA多肽，突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性。
可以施用本发明的除草剂组合物，例如，作为叶处理、土壤处理、种子处理或土壤浇灌施用(soil drenches)。可以例如通过喷洒、撒粉、播撒或本领域已知可用的任何其他模式进行施用。
在一个实施方案中，除草剂可以用来控制杂草的生长，其中可以发现所述杂草靠近本发明的耐除草剂植物生长。在这种类型的实施方案中，可以将除草剂施用至本发明耐除草剂植物靠近杂草生长的地块。随后可以将本发明耐除草剂植物耐受的除草剂按足以杀死杂草或抑制其生长的浓度施用至地块。足以杀死杂草或抑制其生长的浓度是本领域已知的并且在上文公开。
在其他实施方案中，本发明提供了一种控制本发明耐除草剂植物附近的杂草的方法。该方法包括向杂草和向耐受植物生长素除草剂的植物施用有效量的除草剂，其中与野生型植物相比，所述植物具有增加的植物生长素除草剂耐受性。在一些实施方案中，本发明的耐除草剂植物优选地是作物植物，其包括但不限于向日葵、苜蓿、芸苔属物种(Brassicasp.)、大豆、棉、红花、花生、烟草、番茄、马铃薯、小麦、稻、玉米、高粱、大麦、黑麦、粟和高粱。
在其他方面，(一种或多种)除草剂(例如，多种除草剂)也可以用作种子处理剂。在一些实施方案中，有效浓度或有效量的除草剂或包含有效浓度或有效量的除草剂的组合物可以在种子播种之前或在期间直接施用至种子。种子处理制剂可以额外地包含粘合剂和任选地包含色料。
可以添加粘合剂以改善处理后活性物质对种子的黏附。在一个实施方案中，合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，也可以是聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺、聚乙烯亚胺
Figure BDA0001990628130001491
聚醚、聚氨基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、纤基乙酸钠(tylose)和从这些聚合物衍生的共聚物。任选地，可以在制剂中还包含色料。用于种子处理制剂的合适色料或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红1 12、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。
术语“种子处理”包括本领域已知的全部合适的种子处理技术，如拌种(seeddressing)、种子包衣、药粉拌种、浸种和种子丸化。在一个实施方案中，本发明提供一种通过施用、尤其向种子条播沟中施用颗粒制剂来处理土壤的方法，所述颗粒制剂含有作为组合物/制剂(例如，颗粒制剂)的除草剂，任选地连同一种或多种固态或液态、农业可接受的载体和/或任选地连同一种或多种农业上可接受的表面活性剂。该方法有利地用于例如谷物、玉米、棉和向日葵的种床中。
本发明也包括用种子处理制剂包衣的种子或含有该种子处理制剂的种子，所述的种子处理制剂包含本发明除草剂和至少一种其他除草剂，例如，选自以下的AHAS抑制剂：磺氨黄隆(amidosulfuron)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron)、氯嘧黄隆(chlorimuron)、绿黄隆(chlorsulfuron)、醚黄隆(cinosulfuron)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(flazasulfuron)、氟啶黄隆(flupyrsulfuron)、甲酰胺黄隆(foramsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、甲磺胺黄隆(mesosulfuron)、甲磺隆(metsulfuron)、烟黄隆(nicosulfuron)、环丙氧黄隆(oxasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氟丙黄隆(prosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron)、三氟啶黄隆(trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、咪草酯(imazamethabenz)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、氯酯磺草胺(cloransulam)、唑嘧磺胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、唑草磺胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)、双草醚(bispyribac)、嘧草醚(pyriminobac)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、氟酮磺隆(flucarbazone)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalide)和嘧硫苯甲酸(pyrithiobac)。
术语“用…包衣”和/或“含有(containing)”通常表示在施用时绝大部分有效成分位于繁殖物的表面上，但取决于施用方法，或多或或少部分的成分可能渗入该繁殖物中。当该繁殖物(再)栽种时，它可以吸收该有效成分。
在一些实施方案中，在植物播种前和植物出苗前，通过喷雾或喷粉种子，用除草剂或用包含所述除草剂的制剂进行种子处理施用。
在其他实施方案中，处理种子时，通过用有效量的除草剂或包含除草剂的制剂处理种子，施用相应的制剂。
在其他方面，本发明提供用于对付不希望的植物或控制杂草的方法，所述方法包括使本发明耐除草剂植物的种子在播种前和/或出苗前与除草剂接触。该方法还可以包括播种所述种子，例如在大田的土壤中或在温室的盆栽介质中。该方法特别可以用于在紧邻所述种子的位置对付不希望的植物或控制杂草。控制“不想要的植物”理解为杀死杂草和/或迟滞或抑制杂草的正常生长。在最广泛的意义上，将杂草理解为是指在不希望它们存在的位置生长的全部植物。
本发明的杂草包括例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。
另外，本发明的杂草可以包括例如在不希望它们存在的位置生长的作物植物。例如，如果大豆植物田中不希望有玉米植物，则在主要包含大豆植物的大田中存在的自生玉米植物可以视为一种杂草。
在其他实施方案中，处理种子时，通过用有效量的除草剂或包含除草剂的制剂处理种子，施用相应的制剂。
又在其他方面，处理本发明的位置、植物、植物部分或种子包括施用不含有A.I.的农艺学可接受组合物。在一个实施方案中，处理包括施用不含有除草剂A.I.的农艺学可接受组合物。在一些实施方案中，处理包括施用不含有除草剂A.I.的农艺学可接受组合物，其中组合物包含一种或多种农艺学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、植物生长调节剂等。在其他实施方案中，处理包括施用不含有除草剂A.I.的农艺学可接受组合物，其中组合物包含辅助剂。在一个实施方案中，辅助剂是表面活性剂、展布剂(spreader)、粘着剂、渗透剂、漂移控制剂、作物油、乳化剂、兼容剂或其组合。
还应当理解前文涉及本发明的优选实施方案并且可以在其中进行众多改变而不脱离本发明的范围。通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当以任何方式解释为对本发明的范围加以限制。相反，应当清楚地理解，可以采用多种其他实施方式、修改及其等同物，其中所述多种其他实施方式、修改及其等同物是本领域技术人员在阅读本说明书后可以想到的且不脱离本发明精神和/或权利要求的范围。
实施例
实施例1：细菌菌株
转化实验中使用化学感受态大肠杆菌TOP10(Life Technologies；US)和BL21(DE3)Gold(Agilent Technologies；德国)作为受者。如Maniatis等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Habor Laboratory Press,Cold SpringHabor；N.Y.(1982)所描述进行转化。使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将T-DNA区域引入拟南芥、玉米和大豆。
将细菌培养物在Luria培养液(LB)上或在37℃在混有琼脂(15％w/v)的LB上常规培育。在需要时，LB还补充有抗生素卡那霉素和/或氯霉素。使用GeneJet质粒微量制备试剂盒(Thermo Scientific,US)，制备质粒DNA。通过基因合成产生TriA及其变体(Eurofins,德国)。将携带XhoI和NcoI限制性位点的所合成基因克隆入具有卡那霉素抗性的pET24d N-HIS载体。从TaKaRa(日本)获得带氯霉素抗性的伴侣蛋白质粒pGro7(伴侣蛋白groEL和groES)。
实施例2：基因合成、限制性酶切消化和克隆。
由Eurofins(德国)进行基因合成、向pMK-RQ载体克隆。限制性酶购自NewEngland。根据生产商的说明，使用限制性酶。
实施例3：蛋白质纯化。
在大肠杆菌BL21(DE3)Gold(Agilent Technologies,德国)中产生TriA及其变体。因此，将大肠杆菌用适宜的pET24d N-HIS标签表达载体和伴侣蛋白质粒pGro7(伴侣蛋白groEL和groES)转化。将细菌菌株在30℃于100mL LB中培育20小时并且用0.1mM IPTG在25℃诱导蛋白质表达20小时。根据生产商的说明书，将细胞通过在4℃按3000转/分钟离心20分钟收获、重悬于Bug Buster蛋白质提取试剂(Novagen,德国)中。通过离心澄清裂解物。将通过光密度测定法分析的样品牛血清白蛋白(5、10和20g)加载于每块凝胶上，以提供内标物。根据生产商的说明(Thermo Scientific；美国)，使用考马斯蛋白质分析染料，验证蛋白质测定结果。遵循生产商的说明，使用Ni-IDA1000试剂盒(Macherey-Nagel,德国)通过金属离子亲和色谱纯化加HIS标签的酶。使用NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris预制凝胶(LifeTechnologies；美国)进行SDS-PAGE，通过考马斯亮兰(Serva、德国)染色，评估蛋白质纯度。使用Lambda Bio+(Perkin Elmer,美国)，通过测量280nm处的吸光度，估计蛋白质浓度。
实施例4：酶动力学。
将含有triA基因的静息细胞悬液与多种吖嗪类化合物、蜜胺和阿特拉津温育并且通过UPLC-HR-MS分析培养物滤液。底物自Sigma-Aldrich获得或内部合成。通过UPLC-HR-MS(偶联于QExactive高分辨质谱仪的Thermo/Dionex UPLC UltiMate3000)分析合成的标准品和酶反应产物。使用Waters Acquity HSS T3柱(2.1mm；100mm；1.8uM)，流动相水/乙腈(0.1％甲酸)，流速0.6ul min-1。在30℃，使用酶，溶解在25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中，底物浓度为1nM至10nM。随时间推移，最初的吖嗪峰消失，而形成的OH-代谢物(反应产物)增加。通过测定确切的分子式和通过分析精确的MS-MS片段，鉴定产物。另外，对于一些形成的产物，共同洗脱可靠的标准品。相对于作为对照的携带空载体的细胞，以％计算降解。结果示于表3。
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Figure BDA0001990628130001551
Figure BDA0001990628130001561
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Figure BDA0001990628130001601
实施例5：酰胺水解酶的定向进化
通过将分子叠加到蜜胺上，将吖嗪化合物对接入triA模型(基于TrzN和AtzA晶体结构)的活性部位。在此基础之上，鉴定到形成活性部位和底物结合袋的残基。不改变负责活性部位金属离子配位的主要区域；不改变已知是酰胺水解酶活性必需的残基；不改变形成活性部位中疏水“基础”或对水解酶活性必需的残基；不改变与底物的芳环相互作用的残基。但是，修饰氨基酸以扩大酶口袋。使用该模型在一方面预测远离活性部位的可能一般影响三嗪类化合物接受的氨基酸靶；在另一方面该模型用来鉴定酶口袋中需要空间的氨基酸，可能所述氨基酸改变成具有相似疏水性的更小氨基酸，以在不改变酶活性的情况下容纳体积更大的吖嗪化合物。
实施例6：耐除草剂模式植物的产生
产生具有突变型酰胺水解酶序列的耐吖嗪的拟南芥属植物。为了转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，将基于SEQ ID NO:1的、编码SEQ ID NO:2的野生型序列或酰胺水解酶序列用如Sambrook等人,(Molecular cloning(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的标准克隆技术克隆在双元载体中，所述双元载体在遍在蛋白启动子(PcUbi)和胭碱合酶终止子(NOS)序列之间含有抗性标记基因盒(AHAS)和突变型酰胺水解酶序列(标为GOI)。将双元质粒引入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)用于植物转化。通过如McElver和Singh描述的“花浸法”，用突变型酰胺水解酶序列转化拟南芥(WO 2008/124495)。转基因拟南芥植物接受TaqMan分析以分析整合基因座的数目。
实施例7：对耐除草剂模式植物的检验
为了选择吖嗪抗性，使用表达triA及其变体的拟南芥植物。在48孔平板中对选择的拟南芥株系分析改善的吖嗪类化合物(如6-环戊基-N4-(2,3,4,5,6-五氟苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)抗性。因此，将T2种子通过在乙醇+水(以体积计70+30)中搅拌5分钟，用乙醇+水(以体积计70+30)淋洗一次并且用无菌去离子水淋洗两次，进行表面消毒。将种子重悬于溶解在水中的0.1％琼脂中(w/v)。将每孔四至五颗种子铺种在由半浓度murashigeskoog营养液pH 5.8(Murashige和Skoog(1962)Physiologia 40Plantarum 15:473-497)组成的固态营养培养基上。将化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中并在培养基固化前添加至培养基(DMSO终浓度0.1％)。将多孔平板在生长箱中在22℃、75％相对湿度和110μmol Phot*m-2*s-1温育，14小时:10小时的光:暗光周期。播种后七天至十天，与野生型植物相比，评价生长抑制作用。基于转化的拟南芥植物相对于未转化拟南芥植物的生长抑制作用IC50值，计算耐受系数。另外，温室研究中对转基因T2或T3拟南芥植物检验针对抑制纤维素生物合成的除草剂的改善耐受性。
实施例8：产生和检验耐除草剂作物
如实施例9中所述，生成双元载体。如Siminszky等人,Phytochem Rev.5:445-458(2006)先前所描述，转化大豆栽培品种Jake。再生后，将转化体移栽至小花钵中的土壤内，置于生长箱中(16小时昼/8小时夜；25℃昼/23℃夜；65％相对湿度；130-150microE m-2s-1)并且随后通过Taqman分析法检验T-DNA的存在。在几周后，将健康、转基因阳性单拷贝事件移栽至较大花钵并允许其在生长箱中生长。用于插枝的最佳枝条高约3-4英寸，同时存在至少两个节。每个插枝取自原始转化体(母本植物)并浸入生根激素粉(吲哚-3-丁酸，IBA)中。随后将插枝置于bio-dome内的绿洲楔块(oasis wedge)中。在温室中使母本植株长至成熟并且收获种子。还同时取得野生型插枝以充当阴性对照。将插枝在bio-dome中保持5-7天。在转移至绿洲楔块后7-10天，用含除草剂的营养液处理根。处理后3-4天评价常见的植物毒性症状如杵状根(club shaped root)。与野生型植物相比，转基因植物损伤较少或无损伤解读为除草剂耐受性。
对于出苗前处理，使用的培养容器是含有壤砂土、具有约3.0％的腐殖质作为底物的塑料花盆。对于每个物种/事件，分开播种测试植物的种子。在播种后通过精细分散的喷嘴直接施用已经悬浮或乳化在水中的所用活性成分。轻轻地灌溉容器以促进萌发和生长，随后用透明塑料罩覆盖容器，直到植物生根。这种覆盖物导致测试植物均匀发芽，除非它受到活性成分损伤。
结果显示在图1和表4中
表4
Figure BDA0001990628130001621
Figure BDA0001990628130001631
根据Peng等人(WO2006/136596)中概述的程序，转化不成熟的玉米胚。通过Taqman分析，对植物检验T-DNA的存在，靶是存在于全部构建体中的nos终止子。外观健康植株送至温室，进行硬化和后续喷洒试验。将植株各自移栽入4”盆钵的MetroMix 360土壤中。一旦在温室(昼/夜循环27℃/21℃，采用600W高压钠灯支持14小时昼间长度)，则允许它们生长14天。栽培转基因玉米植物至T1结种供除草剂耐受性检验。在转移后14天，通过含除草剂的营养液处理根。处理后3-4天评价常见的植物毒性症状如杵状根。与野生型植物相比，转基因植物损伤较少或无损伤解读为除草剂耐受性。
对于出苗前处理，使用的培养容器是含有具有约3.0％的腐殖质作为底物的壤砂土的塑料花盆。对于每个物种/事件，分开播种测试植物的种子。在播种后通过精细分散的喷嘴直接施用已经悬浮或乳化在水中的所用活性成分。轻轻地灌溉容器以促进萌发和生长，随后用透明塑料罩覆盖容器，直到植物生根。这种覆盖物导致测试植物均匀发芽，除非它受到活性成分损伤。
对于出苗后处理，首先取决于植物习性，将试验植物培育至3cm至15cm高度，并随后仅用除草剂处理。为此目的，将试验植物直接播种，在同一个容器中培育，或首先将它们分别培育并在处理之前数天移栽至试验容器中。在处理后2周和3周进行除草剂损伤评价。植物损伤按0％至100％的评分排序，0％表示无损伤并且100％表示彻底死亡。100表示植物没有出苗或至少地上部分完全破坏，0表示没有损伤或正常的生长过程。温和的除草活性以至少60的值给出，良好的除草活性以至少70的值给出，非常好的除草活性以至少85的值给出。
玉米的结果显示在图2和表5中
表5 Phyto
Figure BDA0001990628130001641
实施例9：双元载体构建
如Sambrook等人(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN0-87965-309-6)中所述，实施克隆方法，例如，使用限制性核酸内切酶在特定位点切割双链DNA、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、转移核酸到硝酸纤维素膜和尼龙膜上，连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞和培养细菌。使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)，根据生产商的说明，进行聚合酶链反应。通常，设计在PCR中使用的引物，从而该引物3'端的至少20个核苷酸与模板完全退火以扩增。通过连接识别位点的相应核苷酸至引物5'端，添加限制性位点。使用例如由K.Heckman和L.R.Pease,Nature Protocols(2207)2,924-932描述的融合PCR，作为备选方法，以连接两个目的片段，例如，连接启动子至基因或连接基因至终止子。例如由Czar等人(Trends in Biotechnology,2009,27(2):63-72)描述，由LifeTechnologies使用其
Figure BDA0001990628130001651
服务，实施基因合成。
对基因评估密码子选择和可能阻碍克隆工作的限制性位点的存在。根据需要，使用标准方案将基因进行密码子优化，以在作物植物中表达最高(例如，参见Puigbo等人,2007和Gasper等人，2012)以及移除不希望有的限制性位点。由GeneArt(雷根斯堡)合成基因，或使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)根据制造商的说明书以PCR从cDNA扩增基因。在两种情况下，在5'末端引入NcoI和/或AscI限制性位点，并在3’末端引入PacI限制性位点，以便能够利用这些限制性位点，将这些基因克隆在功能性元件如启动子和终止子之间。通过以下方式产生启动子-终止子模块或启动子-内含子-终止子模块：由GeneArt(雷根斯堡)完全合成，或使用融合PCR连接相应的表达元件并且根据制造商的说明将PCR产物克隆入TOPO-载体pCR2.1(Invitrogen)。通过合成完整盒或使用融合PCR，将终止子序列连接至启动子序列或启动子-内含子序列的同时，将限制性核酸内切酶的识别序列添加至这些模块的任一侧，并且将限制性核酸内切酶NcoI、AscI和PacI的识别位点在启动子和终止子之间或内含子和终止子之间引入。为了获得最终表达模块，将PCR扩增的基因经NcoI和/或PacI限制性位点克隆在启动子和终止子之间或内含子和终止子之间。
备选地，例如，如Czar等人(Trends in Biotechnology,2009,27(2):63-72)所述，基因合成可以由Life Technologies使用其
Figure BDA0001990628130001652
服务执行。标准方法如克隆、限制性切割、分子分析、大肠杆菌细胞转化和细菌培养可以如Sambrook等人(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press:ISBN 0-87965-309-6)中所述进行。可以使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)，根据生产商的说明，进行聚合酶链反应。融合PCR可以如K.Heckman和L.R.Pease,Nature Protocols(2207)2,924-932所述进行。在两种情况下，可以在5'末端引入NcoI和/或AscI限制性位点并在3’末端引入PacI限制性位点，以便能够将这些基因克隆在功能性元件之间。通过以下方式产生启动子-终止子模块或启动子-内含子-终止子模块：由GeneArt(雷根斯堡)完全合成，或使用融合PCR连接相应的表达元件并且根据制造商的说明将PCR产物克隆入TOPO-载体pCR2.1(Invitrogen)。通过合成完整盒或使用融合PCR，将终止子序列连接至启动子序列或启动子-内含子序列的同时，可以将限制性核酸内切酶的识别序列添加至这些模块的任一侧，并且可以将限制性核酸内切酶NcoI、AscI和PacI的识别位点在启动子和终止子之间或内含子和终止子之间引入。为了获得最终表达模块，可以将PCR扩增的基因经NcoI和/或PacI限制性位点克隆在启动子和终止子或内含子和终止子之间。目的基因可以使用标准方案作密码子优化以便在作物植物中最高表达(例如，参见Puigbo等人,2007和Gasper等人，2012)以及移除不利的限制性位点，并且由GeneArt(雷根斯堡，德国)合成。
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Figure IDA0001990628180000011
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Figure IDA0001990628180000421

Claims (9)

1.在生长植物的位置控制杂草的方法，所述方法包括：
(a)向该位置施用包含除草剂的除草剂组合物；和
(b)在该位置处播种种子，
其中所述种子能够产生植物，所述植物在其至少一些细胞中包含与植物细胞中可工作的启动子有效连接的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的TriA多肽，其中所述突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性，且
其中所述突变TriA多肽具有蜜胺脱氨酶活性，且所述突变TriA多肽的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2中进行如下氨基酸替换：
Q71N_L92A_Y93F_Q96T_D128G；
L92A_Y93L；
L92A_Y93F；
Q71N_L92A_Y93L；
L92A_Y93L_M155T_F157L；或
L92A_Y93L_F157L。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将除草剂组合物施用至杂草和由种子产生的植物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中除草剂包含抑制纤维素生物合成的化合物。
4.产生具有除草剂耐受性的植物的方法，所述方法包括从植物细胞再生出植物，所述植物细胞用与植物细胞中可工作的启动子有效连接的重组多核苷酸转化，所述重组多核苷酸包含编码突变TriA多肽的核酸分子，其中所述突变TriA多肽的表达向植物赋予除草剂耐受性，且
其中所述突变TriA多肽具有蜜胺脱氨酶活性，且所述突变TriA多肽的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2中进行如下氨基酸替换：
Q71N_L92A_Y93F_Q96T_D128G；
L92A_Y93L；
L92A_Y93F；
Q71N_L92A_Y93L；
L92A_Y93L_M155T_F157L；或
L92A_Y93L_F157L。
5.分离的和/或重组产生的和/或合成的核酸分子，包含编码突变TriA多肽的核酸分子，其中所述突变TriA多肽具有蜜胺脱氨酶活性，且所述突变TriA多肽的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2中进行如下氨基酸替换：
Q71N_L92A_Y93F_Q96T_D128G；
L92A_Y93L；
L92A_Y93F；
Q71N_L92A_Y93L；
L92A_Y93L_M155T_F157L；或
L92A_Y93L_F157L。
6.表达盒，其包含如权利要求5中所述的核酸分子和在植物细胞中可工作的启动子。
7.根据权利要求6所述的表达盒，其中启动子是根特异性启动子。
8.载体，其包含如权利要求5中所述的核酸分子或如权利要求6或7中所述的表达盒。
9.分离的、重组的和/或化学合成的突变TriA多肽，其中所述突变TriA多肽具有蜜胺脱氨酶活性，且所述突变TriA多肽的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2中进行如下氨基酸替换：
Q71N_L92A_Y93F_Q96T_D128G；
L92A_Y93L；
L92A_Y93F；
Q71N_L92A_Y93L；
L92A_Y93L_M155T_F157L；或
L92A_Y93L_F157L。
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