UA127406C2 - Рослини, які мають підвищену толерантність до гербіцидів - Google Patents

Рослини, які мають підвищену толерантність до гербіцидів Download PDF

Info

Publication number
UA127406C2
UA127406C2 UAA201901538A UAA201901538A UA127406C2 UA 127406 C2 UA127406 C2 UA 127406C2 UA A201901538 A UAA201901538 A UA A201901538A UA A201901538 A UAA201901538 A UA A201901538A UA 127406 C2 UA127406 C2 UA 127406C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
amino acid
mutant
tgia
sequence
Prior art date
Application number
UAA201901538A
Other languages
English (en)
Inventor
Дорін Шахтшабель
Дорин Шахтшабель
Єва Холленбах
Ева Холленбах
Міхірет Текесте Сізай
Михирет Текесте Сизай
Біргіт Штайнхардт
Биргит Штайнхардт
Крістін Ханзлік
Кристин Ханзлик
Штефан Треш
Флоріан Фогт
Флориан Фогт
Денні Гірдінк
Дэнни Гирдинк
Original Assignee
Басф Се
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Басф Се filed Critical Басф Се
Publication of UA127406C2 publication Critical patent/UA127406C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Винахід стосується рослини або частини рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид ТrіА, де експресія зазначеного полінуклеотиду надає рослині або частині рослини стійкість до гербіцидів.

Description

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Представлений винахід стосується, в загальному, способів надання рослинам толерантності до гербіциду на сільськогосподарському рівні. Зокрема, винахід стосується рослин, які мають підвищену толерантність до гербіцидів, більш конкретно до гербіцидів, які інгібують біосинтез целюлози, таким чином, перешкоджають біосинтезу клітинної стінки.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Мікроорганізми часто реагують на введення ксенобіотиків у навколишнє середовище шляхом розвитку механізмів для їх використання як джерел поживних речовин та енергії для їх росту. Оскільки структура гербіцидів на основі 5-триазинового кільця відрізняється від сполук, які зустрічаються в природі (Еззег еї аї. 1975), мікроорганізми повільно розвивали ферменти та шляхи, здатні їх руйнувати. Надродина амідогідролази включає феноменальний набір ферментів, які каталізують гідроліз широкого спектру субстратів, які несуть амідні або складноефірні функціональні групи в вуглецевих та фосфорних центрах. В усіх випадках молекула нуклеофільної води активується шляхом комплексоутворення з моноядерним або двоядерним металевим центром. У моноядерних металевих центрах субстрат активується шляхом перенесення протона від активного місця, та вода активізується шляхом лігування металів та загального каталізу основи. Металеві центри розташовуються на С-термінальному кінці ядра бета-баррель в межах 8-го структурного домена (бета-альфа). Одним з яскравих прикладів є атразинхлоргідраза (Аї2А) Бе (1І)-залежною гомогексамера (ЗепПетіскК еї аї. 2002;
Умаскей еї а. 2002а), який каталізує гідролітичне дехлорування атразину, гербіциду, отримуючи негербіцидний продукт 2-гідроксіатразин (де 5оцза еї аї. 1996; ЗепПетіскК еї аІ. 2002; Задом5Ку апа У/аскен 2000). Найближчий відомий родич Аї2А представляє собою меламіндеаміназу (ТгіА з Рзендотопавз 5р. штаму МКК. В-12227; 98 95 ідентичність послідовності). Незважаючи на їхню високу подібність послідовності, Аї2А та ТтіА каталітично відрізняються; ТгіА представляє собою деаміназу з дехлориназною активністю на кілька порядків нижче за фізіологічну активність деамінази, тоді як АЇА - дехлориназа не здатна виявляти деаміназної активності. Попередня робота показала, що три з дев'яти амінокислот, які відрізняються між двома протеїнами (5331;
М3280; та БЕ84! АА) в значній мірі є відповідальними за відмінності в каталітичній специфічності.
Зо Представлений винахід передбачає нові способи підвищення стійкості до гербіцидів у рослинах шляхом введення бактеріальних генів, які кодують цільові протеїни, які біологічно руйнують гербіцид, зокрема, інгібіторів біосинтезу целюлози, які називаються азинами.
Бактеріальний фермент ТгіА був розроблений у формі, щоб залишати або збільшувати активність амідогідралази та розширювати ферментну кишеню у напрямку до прийняття більшої об'ємного субстрату. Автори представленого винаходу несподівано виявили, що надмірна експресія форм ТгіА з немутантного типу або мутантними меламіндеаміназами забезпечує толерантність/резистентність рослин до певних класів гербіцидів у порівнянні з нетрансформованими та/або немутагенізованими рослинами або рослинними клітинами, відповідно. Більш конкретно, автори представленого винаходу виявили, що експресія ТгіА забезпечує толерантність/резистентність до азинів.
Проблема представленого винаходу може розглядатись як забезпечення нових властивостей шляхом ідентифікування поліпептидів-мішеней, маніпуляції з якими роблять рослини стійкими до гербіцидів.
Три основні стратегії є доступними для того, щоб зробити рослини толерантними до гербіцидів, тобто: (1) детоксикація гербіциду ферментом, який перетворює гербіцид, або його активний метаболіт, в нетоксичні продукти, такі як, наприклад, ферменти для толерантності до бромоксинілу або до баста (ЕР242236, ЕРЗ37899); (2) мутування цільового фермента в функціональний фермент, який є менш чутливим до гербіциду, або його активного метаболіту, такого як, наприклад, ферменти щодо толерантності до гліфосату (ЕР293356, Раддецне 5. К. еї а!., У.Віої. Спет., 266, 33, 1991); або (3) надекспресування чутливого фермента, таким чином, щоб продукувати певні кількості цільового фермента в рослині, які є достатніми по відношенню до гербіцида, з огляду на кінетичні константи даного фермента, таким чином, щоб мати достатню кількість доступного функціонального фермента, незважаючи на наявність його інгібітора.
Проблема вирішується з використанням об'єкта представленого винаходу.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Відповідно, в одному аспекті, представлений винахід передбачає рослину або частину рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид ТА, експресія зазначеного полінуклеотиду надає рослині або частині рослини стійкість до гербіцидів.
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає насінину, здатну до проростання в рослину, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослинам стійкість до гербіцидів.
В одному аспекті, представлений винахід передбачає рослинну клітину здатну до регенерації рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаних з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослинам стійкість до гербіцидів, де рослинна клітина містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором.
В іншому аспекті, представлений винахід передбачає рослинну клітину, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в клітині, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТтіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
В інших аспектах, представлений винахід передбачає рослинний продукт, отриманий з рослини або частини рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаних з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТгтіА надає рослинам стійкість до гербіцидів.
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає потомство або нащадка рослинного походження з рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де потомство або рослина-нащадок містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин рекомбінантний полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, де експресія мутантного поліпептида
ТА надає потомству або рослині-нащадку стійкість до гербіцидів.
В інших аспектах, представлений винахід передбачає спосіб контролю за бур'янами в місці вирощування рослини, де спосіб включає: (а) застосування гербіцидної композиції, яка містить гербіциди, до ділянки; та (р) посів насінини на ділянці, де насінина є здатною до продукування рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослинам стійкість до гербіцидів.
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає спосіб контролю за бур'янами в місці вирощування рослини, де спосіб включає: застосування гербіцидної композиції, яка містить гербіциди, до ділянки; де зазначена ділянка представляє собою: (а) ділянку, яка містить: рослину або насінину здатну до продукування зазначеної рослини; або (Б) ділянку, яка має бути після зазначеного застосування, яка містить рослину або насінину; де рослина або насінина містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгтіА надає рослинам стійкість до гербіцидів.
В одному аспекті, стадію (а) здійснюють перед, після або одночасно зі стадією (б).
В інших аспектах, представлений винахід передбачає спосіб продукування рослини, яка має стійкість до гербіцидів, де спосіб включає регенерування рослини з рослинної клітини, трансформованої полінуклеотидом, функціонально зв'язаним з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослинам стійкість до гербіцидів. В одному аспекті, представлений винахід передбачає спосіб продукування потомства рослини, яка має стійкість до гербіцидів, де спосіб включає: схрещення першої рослини стійкої до гербіцидів з другою рослиною, щоб продукувати потомство рослини, стійкої до гербіцидів, де перша рослина та потомство рослини містять, щонайменше, в деяких зі своїх клітинах полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослинам стійкість до гербіцидів.
Крім того, представлений винахід стосується способу індефікування гербіцида з використанням немутантного типа або мутантного ТА за представленим винаходом, який кодується нуклеїновою кислотою, яка містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, або її варіант, гомолог, паралог або ортолог.
Зазначений спосіб включає стадії: а) генерування трансгенної клітини або рослини, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує мутантний ТтгіА за представленим винаходом, де мутантний ТгіА за представленим винаходом експресується; р) застосування гербіциду до трансгенної клітини або рослини з а) та до контрольної клітини або рослини такого самого сорту; с) визначення росту або життєздатності трансгенної клітини або рослини та контрольної клітини або рослини після застосування зазначеної досліджуваної сполуки, та а) відбір досліджуваних сполук, які забезпечують знижений ріст контрольної клітини або рослини в порівнянні з ростом трансгенної клітини або рослини.
Інший об'єкт стосується способу ідентифікування нуклеотидної послідовності, яка кодує мутантний ТтгіА, яка є резистентною або стійкою до гербіциду, де спосіб включає: а) генерування бібліотеки нуклеїнових кислот, які кодують мутантний ТтгіА, р) скринінг популяції отриманих в результаті нуклеїнових кислот, які кодують мутантний ТтіА, шляхом експресування кожної із зазначених нуклеїнових кислот в клітині або рослині та обробку зазначеної клітини або рослини гербіцидом, с) порівняння рівнів стійкості до гербіциду, які забезпечуються зазначеною популяцією нуклеїнових кислот, які кодують мутантний ТгіА з рівнем стійкості до гербіциду, який забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТА, а) відбір, щонайменше, однієї нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний ТтіА, який забезпечує значно підвищений рівень стійкості до гербіциду в порівнянні 3 тим, який забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТА.
В переважному варіанті здійснення, нуклеїнова кислота, яка кодує мутантний ТгіА, який вибирається на стадії 4), забезпечує, щонайменше, 2-разове збільшення стійкості до гербіциду в порівнянні з тим, який забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТтгіА.
Резистентність або стійкість може бути визначеною шляхом створення трансгенної рослини, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти з бібліотеки зі стадії а), та порівняння зазначеної
Зо трансгенної рослина з контрольною рослиною.
Інший об'єкт стосується виділеної рекомбінантно та/або хімічно синтезованої нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний ТгтіА, причому нуклеїнова кислота містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 1, або її варіант, як визначено в даному документі далі.
Переважний варіант здійснення стосується виділеної, та/або рекомбінантно отриманої, та/або синтетичної молекули нуклеїнової кислоти, яка включає молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТтгіА, вибраний з групи, яка складається з: (а) молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТгіА, який містить послідовність БЕО ІЮ МО: 2, або її варіанта, паралога, ортолога або гомолога; (Б) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, або її варіанта, паралога, ортолога або гомолога; (с) молекули нуклеїнової кислоти, яка внаслідок виродження генетичного коду, може бути отримана з поліпептидної послідовності ТА ЗЕО ІЮО МО: 2, або її варіанта, паралога, ортолога або гомолога, та забезпечує підвищену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, наприклад, нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частинами; (4) молекули нуклеїнової кислоти, яка має 30 95 або більшу ідентичність, переважно 40 95, то, 60 то, 70 Чо, 79 о, 80 то, 85 то, 90 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 то, 99,5 Фо, або більше з послідовністю молекули нуклеїнової кислоти полінуклеотида, який містить молекулу нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 1, або її варіант, паралог, ортолог або гомолог, та забезпечує збільшену 50 стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, наприклад нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; (є) молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТгіА, який має 30 95 або більшу ідентичність, переважно, щонайменше 40 95, 50 95, 60 Зо, 70 о, 75 95, 80 95, 85 95, 90 9, 9595, 9695, 97 95, 98 95, 9995, 99,595 або більше, з амінокислотною послідовністю ТА поліпептидної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, та забезпечує збільшену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, наприклад, нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; (ЇЇ молекули нуклеїнової кислоти, яка гібридизує з молекулою нуклеїнової кислоти (а), (Б), (с), (4) або (є) за жорстких умов гібридизації та забезпечує збільшену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, наприклад нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; де амінокислотна послідовність мутантного поліпептида ТтгіА відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності поліпептида ТгіА в одному або більше положеннях відповідною до наступних положень ЗЕО ІО МО: 2: 69, 70, 71, 74, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 96, 126, 128, 129, 130, 131, 155, 157, 160, 167, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 220, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328.
Інший об'єкт стосується касети експресії, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за представленим винаходом та промотор, який функціонує в рослинних клітинах.
Переважно, промотор представляє собою корень-специфічний промотор або покращуючий корень промотор з СіІусіпе тах.
Інший об'єкт стосується виділеного, рекомбінантного та/або хімічно синтезованого мутантного поліпептида ТтгіА, при цьому поліпептид містить послідовність, представлену в ЗХЕО
ІО МО: 2, її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, як визначено в даному документі далі.
Переважно, амінокислотна послідовність мутантного поліпептида ТгіА відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності поліпептида ТгіА, в одному або більше положеннях, які є відповідними до наступних положень з ЗЕО ІЮ МО: 2: 69, 70, 71, 74, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 96, 126, 128, 129, 130, 131, 155, 157, 160, 167, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 220, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328.
В ще наступних аспектах, представлений винахід передбачає рослину або частину рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослині стійкість до гербіцидів, причому рослина або частина рослини додатково демонструє другу або третю властивість стійкості до гербіциду.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується рослинної клітини трансформованої та яка експресується немутантного типу або мутантною нуклеїновою кислотою ТгіА відповідно до представленого винаходу, або рослини, яка є мутантною, щоб отримати рослину, яка
Зо експресується, переважно, яка надекспресується немутантного типу або мутантною нуклеїновою кислотою ТА відповідно до представленого винаходу, де експресія зазначеної нуклеїнова кислота в рослинній клітині в результаті призводить до підвищеної резистентності або стійкості до гербіциду в порівнянні з немутантного типу сортом рослинної клітини.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується рослини, яка містить рослинну клітину відповідно до представленого винаходу, в якій експресія нуклеїнової кислоти в рослині в результаті призводить до підвищеної резистентності рослини до гербіциду в порівнянні з немутантного типу сортом рослинної клітини.
Переважно, експресія нуклеїнової кислоти за винаходом в рослині в результаті призводить до підвищеної резистентності рослини до гербіцидів в порівнянні з немутантного типу сортом рослинної клітини.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується насінини, отриманої з використанням трансгенної рослини, яка містить рослинну клітину за представленим винаходом, де насінина представляє собою розведення гомозигот для підвищеної резистентності до гербіциду в порівнянні з немутантного типу сортом насінини.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу продукування трансгенної рослинної клітини з підвищеною резистентністю до гербіциду в порівнянні з немутантного типу сортом рослинної клітини, який включає трансформування рослинної клітини з касетою експресії, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом. В іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу продукування транс генної рослини, який включає, (а) трансформування рослинної клітини з касетою експресії, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, та (Б) генерування рослини з підвищеною резистентністю до гербіциду з рослинної клітини.
Переважно, касета експресії додатково містить регуляторну ділянку ініціації транскрипції та регуляторну ділянку ініціації трансляції, яка є функціональною в рослині.
ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1 показує оцінку стійкості перед проростанням соєвих рослин, оброблених азинами. бо Фенотиповий розвиток немутантного типу (А) та трансгенної події, що експресує мутантний варіант їіА з БЕО ІО МО: 2, який містить амінокислотні заміщення в чотирьох положеннях, а саме! 92А М93ІЇ М155Т Е1571 (В). Вказані значення відображають кількість б-диклопентил-М4- (2,3,4,5,6-пентафторфеніл)-1,3,5-триазин-2,4-діаміну в ГІг/гаї Верхня частина кожної рослини показує уражені пагони, нижня частина показує уражений корінь.
Фігура 2 показує оцінку стійкості перед проростанням кукурудзяних рослин оброблених азинами. Фенотиповий розвиток немутантного типу (А) та трансгенної події, що експресує мутантний варіант йіА з 5ЕО ІО МО: 2, який містить амінокислотні заміщення в чотирьох положеннях, а саме 192А У93| М155Т Г157І (В). Вказані значення відображають кількість 6- циклопентил-Ма4-(2,3,4,5,6-пентафторфеніл)-1,3,5-триазин-2,4-діаміну в г/га).
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Однина, як використовується в даному документі, стосується одного або більше, ніж одного (тобто, щонайменше одного) граматичного об'єкта. Як приклад, "елемент" означає один або більше елементів.
Як використовується в даному документі, вираз "який містить, " або варіації, такі як "містить" або "яка містить, " слід розуміти як такий, що означає включення заявленого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключає наявність будь- якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Термін "контроль за небажаною вегетацією або бур'янами" слід розуміти як такий, що означає знищення бур'янів та/або іншим чином уповільнення або пригнічення нормального росту бур'янів. Бур'яни, в широкому сенсі, слід розуміти як такі, що означають всі такі рослини, які ростуть в місцях, де вони є небажаними. Бур'яни за представленим винаходом включають, наприклад, дводольні та однодольні бур'яни. Дводольні бур'яни включають, але не обмежуються цим, бур'яни родів: 5біпаріб5, І еріадішт, Сайт, 5(еїПагіа, Маїйгісагіа, Апіпетів,
Саїїпзода, Спепородіит, Опіса, Зепесіо, Атагапіпив, Рогпішаса, Хапіпішт, Сопмоїмши5, Іротова,
Роїудопит, 5езрапіа, Атбговіа, Сігвішт, Сагацив5, Зопспи5, ЗоЇапит, Вогірра, Ноїаїа, І іпаєтіа,
Гатішт, Мегопіса, АБшійоп, Етех, Оаїшйга, Міоїа, СаІєорвзіз5, Рарамег, Сепіацтєа, Тит,
Капипсиїц5, та Тагахасит. Однодольні бур'яни включають, але не обмежуються цим, бур'яни родів: Еспіпоспіса, Зеїагіа, Рапісит, Рідйагіа, РпІеит, Роа, Резішса, ЕІеизіпе, Вгаспіагіа, Гоїйшт,
Вготив, Амепа, Суреги5, Зогопит, Адгоругоп, Суподоп, Мопоспогіа, Рітрбгівіузіїв, ЗадіНагіа,
ЕІеоспагі5, Зсігри5, Разраїшт, Ізспаетит, Зрпепосієа, Юасіуосієепішт, Аадговії5, АІоресигив, та
Арега. Крім того, буряни за представленим винаходом можуть включати, наприклад, сільськогосподарські рослини, які ростуть в небажаному місці. Наприклад, рослина кукурудзи, яка росте самовільно, що знаходиться на полі, яка, головним чином, включає рослини сої, може вважатись бур'яном, якщо рослина кукурудзи є небажаною на полі з рослинами сої.
Термін "рослина" використовується в найширшому сенсі, як такий, що стосується органічного матеріалу та призначений для охоплення еукаріотичних організмів, які є членами
Царства рослин, приклади яких включають, але не обмежуються цим, судинні рослини, овочі, зерно, квіти, дерева, трави, чагарники, трави, виноград, папороті, мохи, гриби та водорості, і т. д., а також клони, пагони та частини рослин, які використовуються для безстатевого розмноження (наприклад, черешки, канти, пагони, кореневища, підземні стебла, грудки, коронки, цибулини, бульбоцибулини, бульби, підземні пагони, рослини/тканини, продуковані в культурі тканини і т. д.). Термін "рослина", крім того, охоплює цілі рослини, попередники та потомство рослин та частин рослин, в тому числі насіння, пагони, стебла, листя, коріння (включаючи бульби), квіти, суцвіття, плоди, плодоніжки, квітконоси, тичинки, пиляки, стигму, маточку, зав'язь, пелюстку, чашолистки, плодолистик, кінчик кореня, ковпачок кореня, кореневий волосок, волосок листя, волосок насіння, пилок зерна, мікроспори, сім'ядолі, гіпокотиль, епікотиль, ксилему, флоему, паренхіму, ендосперм, клітину-супутник, захисну клітину, а також будь-які інші відомі органи, тканини та клітини рослини, а також тканини та органи, де кожен із зазначеного вище включає ген/нуклеїнову кислоту, який викликає зацікавленість. Термін "рослина" охоплює також рослинні клітини, суспензійні культури, калусні тканини, ембріони, меристематичні області, гаметофіти, спорофіти, пилок та мікроспори, де знову кожен із зазначених вище включає ген/нуклеїнову кислоту, що викликає зацікавленість.
Рослини, які є особливо корисними в способах за винаходом включають всі рослини, які відносяться до надродини Мігідіріапіае, зокрема однодольні та дводольні рослини, включаючи кормові або кормові бобові культури, декоративні рослини, сільськогосподарські культури, дерева або чагарники, вибрані за списком, який включає Асег 5рр., Асііпідіа 5рр., Абеіто5спив5 5рр., Адаме 5ізаіапа, Адгоругоп 5рр., Аадговіїв віоіопітега, АПит 5рр., Атагапіпив 5рр., Атторнпіїа агепагпа, Апапаб5 сото5иб5, Аппопа 5рр., Арішт дгамеоіеп5, Агаспіє 5рр, Апосагри5 5рр.,
Азрагадих опПісіпаїй5, Амепа 5рр. (наприклад, Амепа 5заїїма, Амепа ГТаша, Амепа Бугапііпа, Амепа 60 Таша маг. займа, Амепа пурііда), Аметноа сагатброїа, Ватриза 5р., Вепіпсаза Пізріда, Веппоїейа ехсеівеа, Веїа миїдагі5, Вгазвзіса 5рр. (наприклад, Вгаззіса пари, Вгаззіса гара 55р. Іканола, насіння олійного ріпаку, олійний ріпак!), Садаба ГТагіпоза, СатецЦа бвіпепві5, Саппа іпаїса,
Саппабів заїїма, Сарзісит в5рр., Сагех еіаіа, Сагіса рарауа, Сагізва тасгосагра, Сагуа 5рр.,
Сапнатив (ііпсіопи5, Савіапеа 5рр., Сеєїра репіапага, Сіспопцт епаїміа, Сіппатотит 5рр.,
Сів Іапашв, Сйги5 5рр., Сосов 5рр., Соїєа 5рр., Соіосазіа езсшепіа, Соїа 5рр., СогсНогив в5р.,
Сопапагит заїїмит, Согуїй5 в5рр., Стаїаєдив 5рр., Стосив заїїми5, биситЬйа 5рр., Сиситів в5рр.,
Супага 5рр., Оаийсив сагоїа, Оевзтодійт 5рр., Оітосагрив Іопдап, Оіозсогєа 5рр., Оіозругоз зрр.,
ЕсПпіпоспіоа зрр., Еіаєї5 (наприклад, ЕІаеї5 диїіпеепві5, ЕІаеї5 оїейега), ЕІеизіпе согасапа,
Егадговіїв їеї, Епапіпив 5р., Епобоїгуа |(аропіса, Еисаїуріи5 5р., Єндепіа ипійога, Гадоругит 5рр.,
Еадиз в5рр., ГРезішса агипаіпасєа, Ріси5 сагіса, ЕопипеїІа 5рр., Егадапла 5рр., Ссіпкдо Бііоба, Спусіпе 5рр. (наприклад, Сіусіпе тах, 5о|а пізріча або Зо|а тах), соз5урішт ВПігешит, Неїїапійи5 5рр. (наприклад, Неїїапіпи5 аппии5), Нетегосаїйй5 їшШіма, Нірізси5 5рр., Ногдешт 5рр. (наприклад,
Ногдеит мпїідагеє), Іротоєа бБаїаїах, дидіапе в5рр., І асіиса заїїма, І аїпуги5 в5рр., Геп5 сиїпагів,
Мпит изіаїіввітит, І йспі спіпепвів, І оїи5 5рр., ша асшапдшіа, І иріпи5 5рр., І и2Мціа зуїмаїса,
Гусорегзісоп 5рр. (наприклад, Гусорегвісоп езсціепішт, І усорегвісоп Іусорегвзісит, І усорегвісоп ругптопте), Масгоїуюта 5рр., Мах 5рр., МаїІрідпіа етагдіпаїа, Маттєа атегісапа, Мападіїтега іпаїса, Мапіної 5рр., МапіїКага 2ароїа, Медісадо заїїма, Меїйоїш5 5рр., Мепіпа 5рр., Мізсапійив віпепвіз, Мотогаїса 5рр., Могив підга, Мивза в5рр., Місоїйапа 5рр., ОІєа 5рр., Орипійа 5рр.,
Отйпориз з5рр., Огуга 5рр. (наприклад, Огула заїїма, Огуга Іаййоїа), Рапісит тійасеит, Рапісит мігдашт, Раззійога еєдиїййв5, Равііпаса заїїма, Реппізешт 5р., Регзєа 5рр., Ремкозеїїпит сгігрит,
РНаїагі5 агипадіпасєа, Рпазеоиз 5рр., Рпієит ргаїепзе, Рпоеєпіх в5рр., Ригадтіїез аивзігаїї5, Рпузаїї5 5рр., Ріпив в5рр., Рібвіасіа мега, Різит в5рр., Роа 5рр., Роршив 5рр., Ргоз5оріб5 з5рр., Ргипив5 врр.,
Рвідішт врр., Рипіса агапашт, Ругиє соттипіх, Оцетсив 5рр., Варпапив заїмив5, Впєит пабагтагт, НВірез врр., Вісіпив5 соттипів, Вибив 5рр., засспагит з5рр., Заїїх 5р., Затрисив 5рр.,
ЗесаІє сегєеаіїє, безатит бз5рр., біпаріє 5р., Боіїапит 5рр. (наприклад, Зоїапит (шрегозит, 5оЇапит іпіедгіюйшт або Зоіапит Іусорегзісшт), 5огдпит бісоїог, Зріпасіа 5рр., Зугудішт 5рр.,
Тадеїе5 зврр., Татагіпдиє іпаіса, Тпеобгота сасао, Тийоїйшт 5рр., Пірзасит дасіуоідев,
Ттйсозесаїе гітраці, Т"ійісит 5рр. (наприклад, Тгйсит аевіїмит, Тгйсит аигит, Т/"йсит їшгдідит,
Тійсит пуретит, Тгйісит таспа, Тгйісит 5займит, Тгйісит топососсцит або Тгйісит миЇдаге),
Ттораєоїшт тіпих, Тгораевоїшт та)ши5, Массіпішт 5рр., Місіа 5рр., Мідпа 5рр., Міоїа одогаїа, Міїі5 5рр., 7еа тау», 2і7апіа раїшивігів, 2і7ірпив5 5рр., амарант, артишок, спаржу, броколі, брюссельську капусту, капусту, ріпак, моркву, цвітну капусту, селеру, зелень, льон, капусту, сочевицю, насіння олійного ріпаку, бамія, цибулю, картоплю, рис, сою, полуницю, цукрові буряки, цукрову тростину, соняшник, помідори, кабачки, чай та водорості, серед іншого. Відповідно до переважного варіанта здійснення представленого винаходу, рослина представляє собою сільськогосподарську рослину. Приклади сільськогосподарських рослин включають зокрема, сою, соняшник, канолу, люцерну, ріпак, бавовник, томат, картоплю або тютюн. До того ж, переважно, рослина представляє собою однодольну рослину, таку як цукрова тростина. До того ж, переважно, рослину представляє собою зернові рослини, такі як рис, кукурудза, пшениця, ячмінь, просо, жито, сорго або овес.
Як правило, термін "гербіцид", як використовується в даному документі, Є для позначення активного інгредієнта, який знищує, контролює чи іншим чином негативно модифікує ріст рослин. Переважна кількість або концентрація гербіциду представляє собою "ефективну кількість" або "ефективну концентрацію". Під терміном "ефективна кількість" та "ефективна концентрація" мається на увазі кількість та концентрацію, відповідно, яка є достатньою, щоб знищити або пригнічувати ріст подібного, немутантного типу, рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або клітини-господаря, але при цьому вказана кількість не знищує або сильно не пригнічує ріст резистентних до гербіциду рослин, тканин рослин, клітин рослин та клітин- господарів за представленим винаходом. Як правило, ефективна кількість гербіциду представляє собою кількість, яка зазвичай використовується в системах сільськогосподарського виробництва для знищення бур'янів, що викликають зацікавленість. Така кількість, є відомою кваліфікованим фахівцям в даній галузі. Гербіцидна активність проявляється за допомогою гербіцидів, прийнятних для представленого винаходу, коли вони застосовуються безпосередньо до рослин або місця росту рослини на будь-якій стадії росту або перед посівом, або появою.
Спостережуваний ефект залежить від видів рослин, які підлягають контролюванню, стадії росту рослини, параметрів застосування розведення та розміру крапель розпилення, розміру часток твердих компонентів, умов навколишнього середовища під час застосування, конкретної використовуваної сполуки, конкретних використовуваних ад'ювантів та носіїв, типу грунту, тощо, а також кількість хімічної речовини, яку застосовують. Ці та інші чинники можуть бути 60 відрегульовані, як це є відомим в даній галузі для сприяння неселективної або селективної б гербіцидної дії. Як правило, обробки гербіцидами можуть застосовувати РРІ (передпосадкове внесення), РРЗА (післяпосадкове поверхневе внесення), перед або після появи сходів. Обробку після появи сходів, як правило, здійснюється до відносно незрілої небажаної вегетації для досягнення максимального контролю над бур'янами.
Під "стійкою до гербіциду" або "резистентною до гербіциду" рослиною, слід розуміти рослину, яка є стійкою або резистентною, щонайменше, до одного гербіциду на рівні, який зазвичай знищував би, або пригнічував би ріст, нормальної або немутантного типу рослини.
Рівні гербіциду, які зазвичай пригнічують ріст нестійкої рослини, є відомими та легко визначаються кваліфікованим фахівцем в даній галузі Приклади включають кількості, рекомендовані виробником для застосування. Максимальний показник є прикладом кількості гербіциду, яка зазвичай пригнічувала б ріст нестійкої рослини. Для представленого винаходу, терміни "стійка до гербіциду" та "резистентна до гербіциду" використовуються як взаємозамінні та мається на увазі, що вони мають еквівалентні значення та еквівалентний обсяг. Аналогічним чином, терміни "стійкість до гербіциду" та "резистентність до гербіциду" використовуються як взаємозамінні та мається на увазі, що вони мають еквівалентні значення та еквівалентний обсяг. Аналогічним чином, терміни "стійка" та "резистентна" використовуються як взаємозамінні та мається на увазі що вони мають еквівалентні значення та еквівалентний обсяг. Як використовується в даному документі, по відношенню до гербіцидної композиції, використовуваної в різних варіантах здійснення даного документа, терміни, такі як гербіциди, та подібні, стосуються таких агрономічно прийнятних гербіцидних активних інгредієнтів (А.1І.), визнаних в даній галузі. Аналогічним чином, терміни, такі як фунгіцид, нематицид, пестицид, тощо, відносяться до інших агрономічно прийнятних активних інгредієнтів, визнаних в даній галузі.
При використанні по відношенню до конкретного мутантного ферменту або поліпептиду, терміни, такі як стійкий до гербіциду та стійкість до гербіциду стосуються здатності такого ферменту або поліпептиду, щоб виконувати свою фізіологічну активність в присутності деякої кількості А.І. гербіцидів, які, як правило, інактивують або пригнічують активність версії немутантного (дикого) типу зазначеного ферменту або поліпептиду. З іншого боку, коли конкретно використовується по відношенню до ТгіА ферменту, то стосується конкретно
Зо здатності метаболізувати, та, тим самим, інактивувати гербіциди, які інгібують біосинтез целюлози, так звані інгібітори біосинтезу целюлози (СВІ). Під терміном "стійкий до гербіциду мутантний ТгіА протеїн" або "резистентний до гербіциду мутантний ТА протеїн", мається на увазі, що такий ТгіА протеїн показує більш високу метаболізуючу активність, по відношенню до метаболізуючої активності немутантного типу ТгіА протеїну, коли в присутності, щонайменше, одного гербіциду, який, як відомо, перешкоджає біосинтезу целюлози, та при концентрації або рівні гербіциду, який, як відомо, пригнічує біосинтез целюлози. Крім того, активність ТгіА такої стійкого до гербіциду або резистентного до гербіциду мутантного ТтіА протеїну може зазначатись в даному документі як активність "стійкого до гербіциду" або "резистентного до гербіциду" ТгіА.
Як використовується в даному документі, "рекомбінантний, " коли мова йде про нуклеїнову кислоту або поліпептид, вказує на те, що такий матеріал був змінений в результаті застосування людиною рекомбінантного методу, такого як шляхом полінуклеотидої рестрикції та лігування, шляхом полінуклеотидного розширення, що перекривається, або шляхом геномної вставки або трансформації. Відкрита рамка зчитування генної послідовність є рекомбінантною, якщо нуклеотидна послідовність є видаленою з її природного тексту та клонованою в будь-який тип штучного вектора нуклеїнова кислота. Термін рекомбінантний також може стосуватися організму, який має рекомбінантний матеріал, наприклад, рослина, яка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту може вважатись рекомбінантною рослиною.
Термін "трансгенна рослина" стосується рослини, яка містить гетерологічний полінуклеотид.
Переважно, гетерологічний полінуклеотид є стабільно інтегрованим в геном, таким чином, що полінуклеотид передається на наступні покоління. Гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрованим в геном самостійно або у вигляді частини рекомбінантної касети експресії. "Трансгенні" як використовується в даному документі стосується будь-якої клітини, клітинної лінії, каллуса, тканини, частини рослини або рослини, генотип якої був настільки зміненим наявністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, включаючи ті трансгенні організми або клітини, які спочатку були зміненими таким чином, а також ті, які були створені шляхом схрещення або безстатевим поширенням з вихідного трансгенного організму або клітини. В деяких варіантах здійснення "рекомбінантний" організм представляє собою собою "трансгенний" організм. Термін "грансгенний" як використовується в даному документі не є призначеним для того, щоб бо охоплювати зміну генома (хромосомного чи екстра-хромосомного) за допомогою традиційних способів селекції рослин (наприклад, схрещення) або за допомогою подій, які зустрічаються в природі, таких як, наприклад, самозапилення, випадковим чином перехресне запилення, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація.
Як використовується в даному документі, "мутагенізований" стосується організму або його
ДНК, який має альтерацію(ї) в біомолекулярній послідовності його нативного генетичного матеріалу в порівнянні з послідовністю генетичного матеріалу відповідного немутантного типу організму або ДНК, де альтерація(ї) в генетичному матеріалі були викликані та/або вибрані діяльністю людини. Приклади діяльності людини, які можуть бути використані для отримання мутагенізованого організму або ДНК включають, але не обмежуються цим, обробку хімічним мутагеном, таким як ЕМ5, та подальший відбір з гербіцидом(ами); або обробку рослинних клітин рентгенівським випроміненням та подальший відбір з гербіцидом(ами). Будь-який спосіб, відомий в даній галузі, може бути використаний для індукування мутацій. Способи індукування мутацій можуть викликати мутації в випадкових положеннях в генетичному матеріалі або можуть викликати мутації в специфічних положеннях в генетичному матеріалі (тобто, можуть представляти собою способи спрямованого мутагенезу), такі як шляхом застосування техніки генопластики.
Як використовується в даному документі, "генетично модифікований організм" (ГМО) представляє собою організм, чиї генетичні характеристики містять альтерацію(ї), які були зроблені зусиллями людини, які викликають трансфекцію, яка в результаті призводить до трансформації організму-мішені з генетичним матеріалом від іншого або "вихідного" організму, або з синтетичним або модифікованим нативним генетичним матеріалом, або організм, який є його нащадком, який зберігає введений генетичний матеріал. Вихідний організм може представляти собою інший тип організму (наприклад, ГМО рослина може містити бактеріальний генетичний матеріал) або з того ж самого типу організму (наприклад, ГМО рослина може містити генетичний матеріал з іншої рослини). Як використовується в даному документі по відношенню до рослин та інших організмів, "рекомбінантний, " "трансгенний, " та "ГМО" вважаються синонімами та вказують на наявність генетичного матеріалу з іншого джерела; на відміну від цього, "мутагенізований" використовується для позначення рослини або іншого
Зо організму, або його ДНК, в яких такий трансгенний матеріал є відсутнім, але в яких нативний генетичний матеріал став мутантним, таким чином, щоб відрізнятися від відповідного організму немутантного типу або ДНК.
Як використовується в даному документі, "немутантний тип" або "рослина відповідного немутантного типу" означає типову форму організму або його генетичного матеріалу, як це зазвичай здійснюють, на відміну від, наприклад, мутагенізованих та/або рекомбінантних форм.
Аналогічним чином, під терміном "контрольна клітина" або "подібна немутантному типу, рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або клітина-господар" мається на увазі рослина, рослинна тканина, рослинна клітина, або клітина-господар, відповідно, яка не демонструє характеристики щодо резистентності до гербіциду та/або конкретного полінуклеотиду за винаходом, який є розкритим в даному документі. Використання терміна "немутантний тип", таким чином, не має на увазі те, що рослина, рослинна тканина, рослинна клітина, або інша клітина-господар не має рекомбінантної ДНК в своєму геномі, та/або не демонструє характеристики резистентності до гербіциду, що відрізняє її від тих, які розкриті в даному документі.
Як використовується в даному документі, "нащадок" стосується будь-якого покоління рослин. В деяких варіантах здійснення, нащадок представляє собою перше, друге, третє, четверте, п'яте, шосте, сьоме, восьме, дев'яте або десяте покоління рослини.
Як використовується в даному документі, "потомство" стосується першого покоління рослини.
Термін "насіння" включає насіння всіх типів, такі як, наприклад, справжні насіння, каріопси, однонасіневі плоди, плоди, бульби, саджанці та інші подібні форми. В контексті Вгазх5іса та зіпарі5 5ресіе5, "насіння" стосується справжнього насіння, якщо не зазначено інше. Наприклад, насінина може представляти собою насінину трансгенних рослин або рослин, отриманих за традиційними способами селекції. Приклади традиційних способів селекції можуть включати кросбрідинг, самозапилення, зворотне схрещення, ембріональне спасіння, з схрещенням, без схрещення, інбридинг, селекцію, безстатеве розмноження, та інші традиційні способи, які відомі в даній галузі.
Хоча на прикладі з посиланнями на конкретні рослини або сорти рослин та їх гібридів, в різних варіантах здійснення, на даний час описані способи, які використовують гербіциди, бо можуть бути використані з різними комерційно цінними рослинами. Рослинні лінії, стійкі до гербіцидів, описані як корисні в даному документі, можуть бути використані в способах боротьби з бур'янами або безпосередньо або опосередковано, тобто або як обробка гербіцидом сільськогосподарських культур, або як донорні лінії для розробки з властивістю стійкості до гербіцидів, для отримання інших сортових та/або гібридних сільськогосподарських культур, які містять таку властивість або властивості. Всі такі отримані в результаті сорти або гібриди сільськогосподарських культур, які містять спадкову властивість або властивості щодо стійкості до гербіцидів в даному документі можуть бути віднесені як до потомства або нащадків лінік(ій) зі спадковою стійкістю до гербіцидів. Такі отримані в результаті рослини можуть бути зазначеними для збереження "характеристики(0) щодо стійкості до гербіцидів" спадкової рослини, тобто це означає, що вони мають та експресують спадкові генетичні молекулярні компоненти, які відповідають за властивість.
В одному аспекті, представлений винахід передбачає рослину або частину рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид ТгіА, експресія зазначеного полінуклеотида надає рослині або частині рослини стійкість до гербіцидів.
В переважному варіанті здійснення, рослину отримували раніше за способом, який включає рекомбінантно отриману рослину шляхом введення та надекспресування немутантного типу або мутантного трансгену ТгіА відповідно до представленого винаходу, як описано більш детально в даному документі нижче.
В іншому варіанті здійснення, полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид поліпептид
ТА, містить послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 1, або її варіант або похідну.
В інших варіантах здійснення, мутантний поліпептид ТгіА відповідно до представленого винаходу представляє собою функціональний варіант який має, повнодовжинний варіант, щонайменше з приблизно 80 95, ілюстративно, щонайменше, з приблизно 80 95, 90 Фо, 95 95, 98 925, 99 95 або більше амінокислотною ідентичністю послідовності до ЗЕО ІЮО МО: 2.
В іншому варіанті здійснення, мутантний поліпептид ТгіА для застосування відповідно до представленого винаходу представляє собою функціональний фрагмент поліпептида, який має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 2.
Визнано, що молекули полінуклеотида ТгіА та поліпептиди ТгіА відповідно до винаходу включають полінуклеотидні молекули та поліпептиди, які містять нуклеотид або амінокислотну послідовність, яка є в достатній мірі ідентичною до нуклеотидних послідовностей, визначених в
ЗЕО ІЮ Мо: 1, або до амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ Мо: 2. Термін "в достатній мірі ідентичний", як використовується в даному документі, стосується першої амінокислотної або нуклеотидної послідовностей, які містять достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних (наприклад, з подібним боковим ланцюгом) амінокислотних залишків або нуклеотидів до другої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, таким чином, що перша та друга амінокислотна або нуклеотидна послідовності мають загальний структурний домен та/або загальну функціональну активність.
Як правило, "ідентичність послідовності" стосується ступеня, до якого дві оптимально вирівняних ДНК або амінокислотні послідовності є інваріантними по всьому вікну вирівнювання компонентів, наприклад, нуклеотидів або амінокислот. "Фракційна ідентичність" для вирівняних сегментів досліджуваної послідовності та еталонної послідовності представляє собою кількість ідентичних компонентів, які спільно використовуються двома вирівняними послідовностями, поділену на загальну кількість компонентів в сегменті еталонної послідовності, тобто, всієї еталонної послідовності або менше визначеної частини еталонної послідовності. "Відсоткова ідентичність" представляє собою фракційну ідентичність помножену на 100. Оптимальне вирівнювання послідовності для вирівнювання вікна порівняння є добре відомими кваліфікованому фахівцю в даній галузі та може бути проведена за допомогою інструментів, таких як алгоритм локальної гомологічності за тій та Умаїегтап, алгоритм вирівнювання гомологічності за Меєдіеєтап та М/пп5сй, пошук способу подібності за Реагхоп та Гіртап, та переважно з використанням комп'ютерних реалізацій даних алгоритмів, таких як АР, ВЕЗТРЇТ,
ЕАБЗТА, та ТЕАЗТА доступних як частина СО. УмМізсопзіп РасКкаде. (Ассеїгуз Іпс. Вигіїпогп,
Маз55.)
Полінуклеотиди та олігонуклеотиди
Термін "виділений полінуклеотид", включаючи ДНК, РНК, або комбінацію з даних, одно- або дволанцюгові, в сенсовій або антисенсовій орієнтації або комбінації з обох, длРНК або іншим чином, ми маємо на увазі полінуклеотид, який є, щонайменше, частково відокремленим від полінуклеотидної послідовності, з якою він є асоційованим або зв'язаним в своєму нативному стані. Переважно, виділений полінуклеотид є, щонайменше, на 6095 вільним, переважно, 60 щонайменше, на 75 95 вільним, та найбільш переважно, щонайменше, на 90 95 вільним від інших компонентів, з якими вони є природним чином асоційованими. Як досвідчений одержувач знатиме, виділений полінуклеотид може представляти собою екзогенний полінуклеотид присутній, наприклад, в трансгенному організмі, який, як правило, не містить полінуклеотид.
Крім того, терміни "полінуклеотид(и)", "послідовність(ості) нуклеїнової кислоти", "нуклеотиднакї) послідовність(ості)", "нуклеїноваїйї) кислота(и)", "молекула нуклеїнової кислоти" використовуються взаємозамінно в даному документі та стосуються нуклеотидів, або рибонуклеотидів, або дезоксирибонуклеотидів, або комбінації обох, в полімерній нерозгалуженій формі будь-якої довжини.
Термін "мутантна нуклеїнова кислота ТгіА" стосується нуклеїнової кислоти ТгіА, яка має послідовність, яка є мутантною з нуклеїнової кислоти немутантного типу ТгіА, та яка надає підвищену стійкість до гербіциду рослині, в якій вона експресується. Крім того, термін "мутантний меламіндеаміназа (мутантний ТтіА)" стосується заміщення амінокислоти первинної послідовності немутантного типу 5ЕО ІЮО МО: 2, або її варіанта, похідної, гомолога, ортолога, або опаралога, на іншу амінокислоту. Експресія "мутантної амінокислоти", як буде використовуватись нижче, означає амінокислоту, яка є заміщеною на іншу амінокислоту, тим самим визначаючи сайт мутації в первинній послідовності протеїну.
В переважному варіанті здійснення, ТгіА нуклеотидна послідовність, яка кодує мутантний
ТПА включає послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, або її варіант або похідну.
Більш того, кваліфікованому фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ТгіА нуклеотидні послідовності охоплюють гомологи, паралоги та ортологи 5ЕО ІЮО МО: 1, як визначено в даному документі далі.
Термін "варіант" по відношенню до послідовності (наприклад, поліпептидної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти, такої як - наприклад - нуклеотидні послідовності, які регулюють транскрипцію за винаходом), як мається на увазі, означає фактично подібні послідовності. Для нуклеотидної послідовності, яка містить відкриту рамку зчитування, варіанти включають такі послідовності, які, через виродження генетичного коду, кодують ідентичну амінокислотну послідовність нативного протеїну. Алельні варіанти, які зустрічаються в природі, такі як ті, які можуть бути ідентифікованими з використанням добре відомих методик молекулярної біології, як, наприклад, спосіб полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та гібридизації. Варіанти нуклеотидної послідовності також включають синтетичного походження нуклеотидні послідовності, такі як ті, які генеруються, наприклад, з використанням сайт- спрямованого мутагенезу та для відкритих рамок зчитування, кодують нативний протеїн, який містить послідовність зБЕО ІЮО МО: 2, а також ті, які кодують поліпептид, який має амінокислотні заміщення по відношенню до нативного протеїну, наприклад, мутантного ТгіА відповідно до представленого винаходу, як розкрито в даному документі. Як правило, варіанти нуклеотидної послідовності за винаходом будуть мати, щонайменше 30, 40, 50, 60, до 70 95, наприклад, переважно 71 95, 72 905, 7З Фо, 74 90, 75 90, 7690, 77 Зо, 78 905, до 79 95, як правило, щонайменше, 80 95, наприклад, 81 95-84 96, щонайменше, 85 95, наприклад, 86 95, 87 Зо, 88 95, 89 90, 90 о, 9195, 92 96, 9395, 9495, 9595, 96 о, 97 96, до 98595 та 99905 нуклеотидну "ідентичність послідовності" до нуклеотидної послідовності 5622 ІЮ МО: 1. 95 Ідентичності полінуклеотиду визначають за САР (МееаІетап апа УуУшпзсй, 1970) аналізом (5 програма) зі штрафом за створення гепа - 5, та штрафом за продовження гепа - 0,3. Якщо не зазначено інше, послідовність, яка запитується, становить щонайменше 45 нуклеотидів в довжину, та сАР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 45 нуклеотидів. Переважно, послідовність, яка запитується, становить, щонайменше, 150 нуклеотидів в довжину, та САР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 150 нуклеотидів. Більш переважно, послідовність, яка запитується, становить, щонайменше, 300 нуклеотидів в довжину, та СЗАР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 300 нуклеотидів. Ще більш переважно, СЗАР аналіз вирівнює дві послідовності над їх всією довжиною.
Поліпептиди
Термін "фактично чистий поліпептид" або "чистий" поліпептид означає, що відокремлений від одного або більше ліпідів, нуклеїнових кислот, інших поліпептидів, або інших забруднюючих молекул, з якими він є пов'язаним в своєму нативному стані. Переважним є той факт, що фактично чистий поліпептид є, щонайменше, на 60 95 вільним, більш переважно, щонайменше, на 75 95 вільним, та більш переважно, щонайменше, на 90 95 вільним від інших компонентів, з якими він є природно пов'язаним. Як досвідчений одержувач оцінить, чистий поліпептид може представляти собою рекомбінантно отриманий поліпептид. Терміни "поліпептид" та "протеїн" загалом використовуються взаємозамінно та стосуються одинарного поліпептидного ланцюга, бо який може або не може бути модифікованим шляхом додавання неамінокислотних груп. Буде зрозумілим, що такі поліпептидні ланцюги можуть з'єднуватись з іншими поліпептидами або протеїнами або іншими молекулами, такими як ко-фактори. Терміни "протеїни" та "поліпептиди", як використовується в даному документі, також включають варіанти, мутанти, модифікації, аналоги та/або похідні поліпептидів за винаходом, як описано в даному документі. до ідентичності поліпептида визначають за САР (Мееаіетап апа М/шп5сй, 1970) аналізом (Со програмою) зі штрафом за створення гепа - 5, та штрафом за продовження гепа - 0,3.
Послідовність, яка запитується, становить, щонайменше, 25 амінокислот в довжину, та САР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 25 амінокислот. Більш переважно, послідовність, яка запитується, становить, щонайменше, 50 амінокислота в довжину, та сСАР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою 3, щонайменше, 50 амінокислот. Більш переважно, послідовність, яка запитується, становить, щонайменше, 100 амінокислот в довжину та САР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 100 амінокислот. Ще більш переважно, послідовність, яка запитується, становить щонайменше 250 амінокислот в довжину та СЗАР аналіз вирівнює дві послідовності над ділянкою з, щонайменше, 250 амінокислот. Ще більш переважно, САР аналіз вирівнює дві послідовності над їх повною довжиною.
По відношенню до визначеного поліпептиду, слід мати на увазі, що 95 ідентичність фігур більш висока, ніж та, яка передбачається вище, буде охоплювати переважні варіанти здійснення. Таким чином, де це має сенс, в світлі мінімальної 95 ідентичності фігур, переважним є те, що поліпептид ТтгіА за винаходом містить амінокислотну послідовність, яка є, щонайменше, 40 95, більш переважно, щонайменше, 45 95, більш переважно, щонайменше, 50 95, більш переважно, щонайменше 5595, більш переважно щонайменше, 6095, більш переважно, щонайменше, 65 95, більш переважно, щонайменше, 70 95, більш переважно, щонайменше, 7595, більш переважно, щонайменше, 80 95, більш переважно, щонайменше, 85 95, більш переважно, щонайменше, 90 95, більш переважно, щонайменше, 91 95, більш переважно, щонайменше, 92 95, більш переважно, щонайменше, 93 95, більш переважно, щонайменше, 94 95, більш переважно, щонайменше, 95 95, більш переважно, щонайменше, 96 95, більш переважно, щонайменше, 97 956, більш переважно, щонайменше, 98 95, більш переважно, щонайменше, 99 95, більш переважно, щонайменше, 99,1 95, більш переважно, щонайменше,
Зо 99,2 95, більш переважно, щонайменше, 99,3 95, більш переважно, щонайменше, 99,4 95, більш переважно, щонайменше, 99,5 95, більш переважно, щонайменше, 99,6 95, більш переважно, щонайменше, 99,7 95, більш переважно, щонайменше, 99,8 95, та ще більш переважно, щонайменше, 99,9 95 ідентичною до 5ЕО ІЮ МО: 2.
Під "варіантом" поліпептида мається на увазі поліпептид, який походить з протеїну ЗЕО І
МО: 2, шляхом делеції (так зване усікання) або додавання однієї або більше амінокислот до М- термінального та/або С-термінального кінця нативного протеїну; делеції або додавання однієї або більше амінокислот в одному або більше сайтах в нативному протеїні; або заміщення однієї або більше амінокислот в одному або більше сайтах в нативному протеїні. Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або маніпуляцій людини. Способи для таких маніпуляцій є, як правило, відомими в даній галузі з рівня техніки. "Похідні" протеїну охоплюють пептиди, олігопептиди, поліпептиди, протеїни та ферменти, які мають амінокислотні заміщення, делеції та/"або вставки по відношенню до немодифікованого протеїну, який розглядається, та який має аналогічну біологічну та функціональну активність як у немодифікованого протеїну, з якого вони отримані. Таким чином, функціональні варіанти та фрагменти поліпептидів ТгіА та молекул нуклеїнових кислот, які кодують їх, також знаходяться в межах обсягу представленого винаходу, та, якщо спеціально не вказано інше, незалежно від походження зазначеного поліпептиду та незалежно від того, чи відбувається це природним шляхом. Різні аналізи можуть бути використані для визначення функціональності поліпептиду
ТИПА. Наприклад, функціональний варіант або фрагмент поліпептиду ТгіА може бути проаналізований, щоб визначити його здатність надавати детоксифікацію до гербіцидів. Як ілюстрація, показник детоксифікації до гербіцидів може бути визначений як каталітичний показник на достатньому рівні для того, щоб забезпечити здатне щодо визначення збільшення стійкості до гербіцидів в рослині або частині рослини, яка містить рекомбінантний полінуклеотид, який кодує варіант або фрагмент поліпептида ТгіА, де рослина або частина рослини експресує варіант або фрагмент аж до приблизно 0,5 95, ілюстративно, від приблизно 0,05 до приблизно 0,595, від приблизно 0,1 до приблизно 0,4 95, та від приблизно 0,2 до приблизно 0,3 95, від загального клітинного протеїну по відношенню до аналогічним чином оброблених контрольних рослин, які не експресують варіант або фрагмент.
В переважному варіанті здійснення, мутантний поліпептид ТгіА представляє собою бо функціональний варіант або фрагмент меламіндеамінази, який має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 2, де функціональний варіант або фрагмент має, щонайменше, приблизно 80 95 ідентичність амінокислотної послідовності до 5ЕО ІЮ МО: 2.
В інших варіантах здійснення, функціональний варіант або фрагмент крім того, має показник детоксифікації гербіцидів, визначений як каталітичний показник в достатній мірі для того, щоб забезпечити здатну до збільшення стійкість до гербіцидів в рослині або частині рослини, яка містить рекомбінантний полінуклеотид, який кодує варіант або фрагмент, де рослина або частина рослини експресує варіант або фрагмент аж до приблизно 0,595 від загального клітинного протеїну по відношенню до аналогічним чином оброблених контрольних рослин, які не експресують варіант або фрагмент. "Гомологи" протеїну охоплюють пептиди, олігопептиди, поліпептиди, протеїни та ферменти, які мають амінокислотні заміщення, делеції та/(або вставки по відношенню до немодифікованого протеїну, який розглядається, та який має аналогічну біологічну та функціональну активність, як і немодифікований протеїн, з якого вони отримані.
Крім того, кваліфікованому фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що зміни можуть вводитись шляхом мутації в нуклеотидні послідовності за винаходом, тим самим, призводячи до змін в амінокислотній послідовності кодованих протеїнів без зміни біологічної активності протеїнів. Таким чином, наприклад, виділена полінуклеотидна молекула, яка кодує мутантний поліпептид ТтіА, який має амінокислотну послідовність, що відрізняється від тих, що ЗЕО ІЮ МО: 2, можуть бути створені шляхом введення одного або більше нуклеотидних заміщень, додавань, або делецій у відповідній нуклеотидній послідовності, таким чином, що одне або більше амінокислотних заміщень, додавань або делецій є введеними в протеїн, який кодується.
Мутації можуть бути введеними з використанням стандартних методик, таких як сайт- спрямований мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Такий варіант нуклеотидних послідовностей, також охоплюються представленим винаходом. Наприклад, переважно, консервативні амінокислотні заміщення можуть бути зроблені в одному або більше прогнозованих переважно несуттєвих амінокислотних залишках. "Несуттєвий" амінокислотний залишок представляє собою залишок, який може бути змінений у порівнянні з послідовністю немутантного типу протеїну, без зміни біологічної активності, в той час як "суттєвий" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності.
Зо Делеція стосується видалення однієї або декількох амінокислот з протеїну.
Вставка стосується одного або більше амінокислотних залишків, які вводяться в попередньо визначений сайт в протеїні. Вставки можуть включати М-термінальні та/або С-термінальні злиття, а також вставки всередині послідовності однієї або декількох амінокислот. Як правило, вставки в межах амінокислотної послідовності будуть меншими, ніж М- або С-термінальні злиття, порядку від приблизно 1 до 10 залишків. Приклади М- або С-термінальних протеїнів або пептидів злиття включають домен зв'язування або домен активації активатора транскрипції, як використовується в дріжджах дигібридної системи, протеїнах фагового покриття, (гістидин)-6- тегах, глутатіон-5-трансфераза-тегах, протеїні А, мальтоза-зв'язуючому протеїні, дигідрофолатредуктазі, тег 100 епітопі, с-тус епітопі, РІГ АС-епітопі, Іас7, СМР (кальмодулін- зв'язуючому пептиді), НА епітопі, протеїн-С-епітопі та М5М епітопі.
Заміщення стосується заміни амінокислот протеїну на інші амінокислоти, які мають аналогічні властивості (такі як аналогічна гідрофобність, гідрофільність, антигенність, схильність до утворення або руйнування а-спіральних структур або р-листкових структур). Амінокислотні заміщення є, як правило, з одиничних залишків, можуть бути згрупованими в залежності від функціональних обмежень, що накладаються на поліпептид та можуть знаходитись в діапазоні від 1 до 10 амінокислот; вставки, як правило, будуть становити порядку від приблизно 1 до 10 амінокислотних залишків. Консервативні амінокислотні заміщення є такими, в яких амінокислотний залишок є заміненим на амінокислотний залишок, який має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, які мають подібні бічні ланцюги, були визначені в даній галузі. Дані родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (такими як, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (такими як, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (такими як, гліцин, аргінін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (такими як, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (такими як, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (такими як, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Такі заміни не були б зроблені для консервативних амінокислотних залишків, або для амінокислотних залишків, що знаходяться в межах консервативного мотиву. Таблиці консервативних заміщень є добре відомими в даній галузі (дивіться, наприклад Стеідптоп (1984) Ргоїеїіп5. М.Н. Егеетап апа Сотрапу (Ед5).
Амінокислотні заміщення, делеції та/або вставки можуть легко бути отримані з використанням пептидних синтетичних методик, добре відомих в даній галузі, таких як твердофазний пептидний синтез та подібний, або шляхом маніпулювання рекомбінантною ДНК.
Способи маніпулювання ДНК послідовностями, щоб отримати варіанти заміщення, вставки або делеції протеїну є добре відомими в даній галузі. Наприклад, способи здійснення мутацій заміщення в попередньо визначених сайтах в ДНК є добре відомими кваліфікованому фахівцю в даній галузі та включають М13 мутагенез, Т7-бсеп іп міго мутагенез (Ш5В, СіІемеїапа, ОН),
ОціскСпапде сайт-спрямований мутагенез (5ігаїадепе, зап Оієдо, СА), ПЛР;-опосередкований сайт-спрямований мутагенез або інші протоколи сайт-спрямованого мутагенезу. "Похідні" додатково включають пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які можуть, у порівнянні з амінокислотною послідовністю форми протеїну, що зустрічається в природі, такою як протеїн, який викликає зацікавленість, включають заміщення амінокислот на амінокислотні залишки, які не зустрічаються в природі, або додавання амінокислотних залишків, які не зустрічаються в природі. "Похідні" протеїну також включають пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які включають змінені, які зустрічаються в природі (глікозильовані, ацильовані, пренильовані, фосфорильовані, міристильовані, сульфатовані, тощо), або змінені, які не зустрічаються в природі, амінокислотні залишки в порівнянні з амінокислотною послідовністю форми, яка зустрічається в природі, поліпептиду. Похідна може також включати одне або більше неамінокислотних заміщень або додавань в порівнянні з амінокислотною послідовністю, з якої є отриманим, наприклад молекулу-репортер або інший ліганд, ковалентно або нековалентно зв'язаний з амінокислотною послідовністю, такою як молекула-репортер, яка зв'язується для того, щоб полегшити його виявлення, та амінокислотні залишки, які не зустрічаються в природі, по відношенню до амінокислотної послідовності протеїну, яка зустрічаються в природі. Крім того, "похідні" також включають злиття форм протеїну, які зустрічаються в природі, з міченими пептидами, такими як
ЕГАС, НІ5б або тіоредоксин (для огляду мічення пептидів, дивіться Тегре, Аррі. Місгобіо|.
Віотесппої!. 60, 523-533, 2003). "Ортологи" та "паралоги" охоплюють еволюційні концепції, які використовуються для опису родових відносин генів. Паралоги представляють собою гени в межах одних і тих самих видів, що виникли за рахунок дублювання пращурного гена; ортологи представляють собою гени з різних організмів які, відбуваються через видоутворення, та є похідними від загального пращурного гена.
Варіанти, ортологи та паралоги 5ЕО ІО МО: 2, охоплені представленим винаходом показані, але не обмежуються поліпептидами, які містять ЗЕО ІЮО МО: 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, або 31.
Добре відомим в даній галузі є те, що паралоги та ортологи можуть спільно використовувати різні домени, що несуть прийнятні амінокислотні залишки в наданих сайтах, таких як зв'язуючі кишені для конкретних субстратів або зв'язуючих мотивів для взаємодії з іншими протеїнами.
Термін "домен" стосується набору амінокислот, які зберігаються в певних положеннях уздовж вирівнювання послідовностей еволюційно споріднених протеїнів. У той час як амінокислоти в інших положеннях можуть варіювати між гомологами, амінокислоти, які є високо консервативними в конкретних положеннях, показують амінокислоти, які Є можливо суттєвими в структурі, стабільності або функції протеїну. Ідентифікованими за їх високим ступенем консервативності в вирівняних послідовностях родини протеїнових гомологів, вони можуть бути використані як ідентифікатори, щоб визначити, чи належить який-небудь поліпептид, про який йде мова, до раніше ідентифікованої поліпептидної родини.
Термін "мотив або "консенсусна послідовність" стосується короткої консервативної ділянки в послідовності еволюційно споріднених протеїнів. Мотиви часто представляють собою високо консервативні частини доменів, але можуть також включати тільки частину домену, або бути розташованими за межами консервативного домену (якщо всі амінокислоти мотиву виходять за межі певного домену).
Існують спеціалізовані бази даних для ідентифікації доменів, наприклад, ЗМАКТ (Зспи!ийА еї аї. (1998) Ргос. Маї!. Асайд. 5сі. ОБА 95, 5857-5864; І емшпіс еї аї. (2002) Нуклеїновою кислотоюз
Вез 30, 242-244), ІпіегРго (Миїдег єї а!., (2003) Мисі. Асідв5. Нев5. 31, 315-318), Ргозіе (Виснпег та
Ваїгосії (1994), узагальнений профіль синтаксису для мотивів послідовностей біомолекул та їх функцій в автоматичній інтерпретації послідовностей. (Іп) ІЗМВ-94; Ргосеєдіподзв 2па Іпегаїйопаї
Соп'іегепсе оп Іпівїїїдепі Зубзівт5 ог МоїІесшціаг Віоіоду. Айтап В., Вишад 0., Кагр Р., Гаїпгор Н., зЗеагів О., Едв., рр53-61, АДАЇ Ргев5, Мепіо Рак; Нио еї аї., Мисі. Асіабє. Вевз. 32:0134-0137, (2004)), або Ріат (Вагетагп еї аїІ., Нуклеїновою кислотою Кезеагсп 30(1): 276-280 (2002)). Набір інструментів для аналізу протеїнових послідовностей методом комп'ютерного моделювання є бо доступним на протеомічному сервері ЕХРАЗу (Швейцарський Інститут біоінформатики (Зм/і55
Іпбійше ої Віоіпіогтаїйс5 (Сабвівідег еї аі., ЕхРАБу: Ше ргоїеотіс5 5егуег ог іп-дерій ргоївіп
Кпом/едде апа апаїузіб5, Мисієїс Асідє Невз. 31:3784-3788(2003)). Домени або мотиви також можуть бути ідентифіковані з використанням рутинних методик, наприклад, шляхом вирівнювання послідовностей.
Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі фахівцям, такі способи включають САР, ВЕЗТРЇІТ, ВГА5Т, ЕА5ТА та ТЕА5ТА. САР використовує алгоритм Меедіетап та ММип5сейп (1970) У Мої Віої! 48: 443-453) щоб знайти глобальне (тобто таке, що охоплює повні послідовності) вирівнювання двох послідовностей, яке максимізує число збігів та зводить до мінімуму кількість пропусків. Алгоритм ВІАБТ (Айбспи! еї а. (1990) 9У Мої! Віо! 215: 403-10) обчислює відсоток ідентичності послідовності та виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями. Програмне забезпечення для проведення аналізу ВІА5Т є загальнодоступним через Майопаї Сепіге їТог ВіоїесппоІоду Іптогтайоп (МСВІ). Гомологи можуть бути легко ідентифіковані з використанням, наприклад, множинного алгоритма СіиєїаімМу/ вирівнювання послідовності (мегвіоп 1.83), з параметрами вирівнювання пар за замовчуванням, та способу вимірювання у відсотках (дивіться Фігуру 1). Глобальні відсотки подібності та ідентичності можуть бути також визначені з використанням одного зі способів, доступних в програмному пакеті МаїзЗАТ (Сатрапеїіа еї аІ., ВМС Віоіптоптпаїйіс5. 2003 и! 10; 4:29. МаізАТ: ап арріїсанйоп їпаї депегаїе5 5ітйагу/аепійу таїйгісез5 изіпуд ргоїеіп ог ОМА зедиепсев.). Незначне редагування вручну може бути виконаний, для оптимізації вирівнювання між консервативними мотивами, які є очевидними фахівцеві в даній галузі. Крім того, замість того щоб використовувати послідовності повної довжини для ідентифікації гомологів, також можуть бути використані специфічні домени. Значення ідентичності послідовностей може бути визначене по всій послідовності нуклеїнової кислоти або амінокислотної послідовності або більшому кількості вибраних доменів або консервативному мотиву(вам), з використанням програм, згаданих вище, з використанням стандартних параметрів. Для локальних вирівнювань, особливо корисним є алгоритм Зтіййп-Умаїегтап (5тійй ТЕ, Умаїепгтап М5 (1981) 9. Мої. Віої. 147(1); 195-7).
Протеїни за винаходом можуть бути змінені в різні способи, включаючи амінокислотні заміни, делеції, усічення та вставки. Зазвичай, способи таких маніпуляцій є добре відомими в даній галузі. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей можуть бути отримані за
Зо допомогою мутацій в ДНК. Способи мутагенезу та змін нуклеотидних послідовностей є добре відомими в даній галузі з рівня техніки. Дивіться, наприклад, КипКеї! (1985) РМА5, 82:488-492;
КипкКеї! еї аї. (1987) Меїпоа5 іп Епгутої. 154:367-382; патент США Мо 4,873,192; УмаЇКег апа
Саазіга, ед5. (1983) Тесппіднез іп МоїІесціаг Віоїоду (Масмінйап Рибріїзпіпд Сотрапу, Мем! ок) та наведені там посилання. Керівництво щодо відповідних амінокислотних заміщень, які не впливають на біологічну активність протеїну, що представляє зацікавленість, може бути знайдено в моделі Оаупйоїї еї аї. (1978) Айазх ої Ргоївіп Зедиепсе апа 5ігисіиге (Маї!. Віотеа. Кев.
Еошипа., Умахпіпоїоп, 0. С), який включено в даний документ у вигляді посилання Переважними можуть бути консервативні заміщення, такі як заміщення однієї амінокислоти іншою, які мають подібні властивості.
В якості альтернативи, варіанти нуклеотидної послідовності можуть бути отриманий шляхом введення мутацій випадковим чином вздовж її всієї або частини кодуючої послідовності, наприклад, шляхом мутагенезу насичення, та отримані в результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу для ідентифікації мутантів, які кодують протеїни, які зберігають активність.
Наприклад, наступний мутагенез, який кодує протеїн може бути експресований рекомбінантно, таактивність протеїну може бути визначена з використанням стандартних методів аналізу.
Автори представленого винаходу виявили, що шляхом заміщення одного або декількох з ключових амінокислотних залишків в ХЕО ІЮ МО: 2 ферменту ТтгіА, наприклад із застосуванням одного з описаних вище способів мутувати ТгіА, яка кодує нуклеїнові кислоти, стійкість або резистентність до конкретних гербіцидів може бути значно збільшена. Переважними заміщеннями мутантних ТгтгіА є ті, які підвищують стійкість рослини до гербіцидів, але біологічна дія активності деамінази в значній мірі залишається незмінною.
Відповідно, в іншому об'єкті представлений винахід стосується мутантного поліпептиду ТА, який містить послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, ключові амінокислотні залишки якого є заміщеними будь-якою іншою амінокислотою.
Кваліфікованому фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що амінокислоти, розташовані в безпосередній близькості від положень амінокислот, зазначених нижче, також можуть бути заміщеними. Таким чином, в іншому варіанті здійснення варіант 5ЕО ІО МО: 2, її варіанта, похідної, ортолога, паралога або гомолога включає мутантний ТгіА, де амінокислота х3, 52 абожі амінокислотних положень з ключової амінокислоти є заміщеною будь-якою іншою бо амінокислотою.
На основі методик, добре відомих в даній галузі, високохарактерна картина послідовності може бути розроблена, за допомогою засобів, в яких знайденими можуть бути додатково мутовані кандидати ТтгіА з бажаною активністю.
Пошук додатково мутантних кандидатів ТгіА шляхом застосування відповідного шаблону послідовності буде також охоплюватися представленим винаходом. Кваліфікованому читачу має бути зрозуміло, що представлений шаблон послідовності не обмежується точними відстанями між двома сусідніми амінокислотними залишками зазначеного шаблону. Кожна з відстаней між двома сусідами в зазначених вище шаблонах може, наприклад, змінюватися незалежно один від одного аж до ж 10, ж 5, - 3, ж 2 або т 1 амінокислотних положень без істотного впливу на бажану активність. Крім того, шляхом застосування способу сайт- спрямованого мутагенезу, наприклад насичення мутагенів (дивіться, наприклад, Зспепк еї аї.,
Віозрекітит 03/2006, раде5 277-279), автори представленого винаходу визначили та згенерували специфічні амінокислотні заміщення та їх комбінації, які - при введенні в рослину шляхом трансформування та експресування відповідного мутантного ТгіА, який кодується нуклеїновою кислотою - надають підвищену резистентність до гербіцидів або стійкість до гербіциду у вказаної рослини.
Таким чином, в особливо переважному варіанті здійснення, варіант або похідна мутантного
ТПА стосується поліпептиду ТА, який містить зЗЕО ІЮО МО: 2, її ортолог, паралог, або гомолог, де амінокислотна послідовність відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності поліпептида ТгіА в одному або більше положеннях відповідною до наступних положень ЗЕО ІО МО: 2: 69, 70, 71, 74, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 96, 126, 128, 129, 130, 131, 155, 157, 160, 167, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 220, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328.
Приклади відмінностей в даних амінокислотних положеннях включають, але не обмежуються цим, один або більше з наступних: амінокислота, яка відповідає положенню 69, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 70, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 71, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 74, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 82, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 84, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 85, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 87, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 88, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 89, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 91, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 92, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 93, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 96, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 126, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 128, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 129, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 130, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 131, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 155, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 157, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 160, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 167, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 170, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 174, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 180, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 182, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 216, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 217, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 219, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 220, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 246, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 247, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 248, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; 60 амінокислота, яка відповідає положенню 249, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту;
амінокислота, яка відповідає положенню 250, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 251, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 298, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 301, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 302, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 304, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 328, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту.
Приклади відмінностей в даних амінокислотних положеннях включають, але не обмежуються цим, один або більше з наступних: амінокислота, яка відповідає положенню 69, представляє собою іншу, ніж Валін; амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 74, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 82, представляє собою іншу, ніж Аргінін; амінокислота, яка відповідає положенню 84, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 85, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 87, представляє собою іншу, ніж Триптофан; амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою іншу, ніж Фенілаланін; амінокислота, яка відповідає положенню 91, представляє собою іншу, ніж Валін; амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 126, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою іншу, ніж Аспарагінову кислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 129, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 130, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 131, представляє собою іншу, ніж Ізолейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою іншу, ніж Метіонін; амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою іншу, ніж Фенілаланін; амінокислота, яка відповідає положенню 160, представляє собою іншу, ніж Метіонін; амінокислота, яка відповідає положенню 167, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 170, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 174, представляє собою іншу, ніж Лізин; амінокислота, яка відповідає положенню 180, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 182, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 216, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 217, представляє собою іншу, ніж Ізолейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 219, представляє собою іншу, ніж Пролін; амінокислота, яка відповідає положенню 220, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 246, представляє собою іншу, ніж Глутамат; амінокислота, яка відповідає положенню 247, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 248, представляє собою іншу, ніж Аспартат; амінокислота, яка відповідає положенню 249, представляє собою іншу, ніж Гістидин; амінокислота, яка відповідає положенню 250, представляє собою іншу, ніж Аспартат; амінокислота, яка відповідає положенню 251, представляє собою іншу, ніж Глутамат; амінокислота, яка відповідає положенню 298, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 301, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 302, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 304, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 328, представляє собою іншу, ніж Аспартат.
В переважному варіанті здійснення, мутантний ТтіА містить послідовність ХЕО ІЮО МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою ТПг, Сув, Су, Маї, або Зег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою ТПг, Маї, Су, Суб, або Зег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ 60 МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій:
амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою мМаї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою ТПНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою ТПг, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою мМаї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою ТПг, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою ТПНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою су, Рго, або Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою 5ег.
Зо В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою ТпНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою ТПг, Аа, Меї або 5ег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Іі еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Пе, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Пе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Іе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою мМаї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 60 92, представляє собою Пе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Пе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою МаїЇ.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою Не, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою і еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою
Пе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою І еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 91, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою І еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 91, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Маї.
Зо В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою І еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 91, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою
Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Іе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 69, представляє собою Ліа, І еи, або Зег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 74, представляє собою Маї, або Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 74, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою Іі еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Пе.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 82, представляє собою І ем, Меї, або су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: 60 амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою сіни, Ар, Аа, Тиг або Авп.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 126, представляє собою Аа, Меї, 5ег, або Авр.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою 5ег, Аа, або Авп.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою су, Аа, або Си.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Меї, або Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 167, представляє собою Пе, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 167, представляє собою Пе, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 84 представляє собою Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 167, представляє собою Іе, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 84 представляє собою ТпНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 216, представляє собою 5ег, або су.
Зо В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 217, представляє собою лЛіа, Зег, або ТНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 219, представляє собою су, та амінокислота, яка відповідає положенню 249 представляє собою Авп.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО І
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 219, представляє собою су, та амінокислота, яка відповідає положенню 249 представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 217, представляє собою мМаї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 220, представляє собою ТпНг, Зег, або Спу.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 220, представляє собою су, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
БО МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 246, представляє собою 5ег, Тпг, Сіп, або Азр.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 247, представляє собою Аа, Азп, Маї, су, або Рго.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 248, представляє собою 5ег, Азп, або су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: 60 амінокислота, яка відповідає положенню 249, представляє собою Маї, Пе, або Авп.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 250, представляє собою сім, або Авп.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 251, представляє собою Авр.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 251, представляє собою Абхр, та амінокислота, яка відповідає положенню 248 представляє собою си.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 298, представляє собою Суб, Азп, Тпг, або 5ег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 301, представляє собою Аа, ТПпг, або Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 302, представляє собою сіи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 304, представляє собою І ув.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 87, представляє собою ТНг.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа.
Зо В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Ре.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою Су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою бо Ї еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою
РНє.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою
Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Ре, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою Су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Ре, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє
Зо собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою І еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою І еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
БО МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Азвп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Маї.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авп, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 328, представляє собою (у.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 160, представляє собою ау.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою І еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Ре.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою Ліа, Маї, або Г еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Аа, Маї, І ем, або Ріє.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 217, представляє собою су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність зЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 160, представляє собою су.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 250, представляє собою 5ег.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 328, представляє собою су, або Аа.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 129 та/або положенню 130 є видаленою.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
БО МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 130 та/або положенню 131 є видаленою.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 170 та/або положенню 182 є видаленою.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 174 та/або положенню 180 є видаленою.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій:
амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою ЛА|Па, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою І еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 85 представляє собою і ей, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і еи.
В іншому переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 85 представляє собою і ей, та амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Маї.
В особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТтіА містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою І еи.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТтіА містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Гени, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157,
Зо представляє собою і еи.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Гени, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою МаїЇ, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою і еи.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і ен, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою і еи.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авп, амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою РпПе, та амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою
Тиг, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою су.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2 або її варіант, похідну, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою Авзп, амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою і еи, та амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою
Тиг, та амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою су.
Інші переважні варіанти здійснення, тобто комбінації мутацій є показаними в наступній таблиці 1.
Таблиця 1 аміно- аміно- аміно- аміно- аміно- аміно- аміно- аміно- аміно- кис- кис- кис- кис- кис- кис- кис- кис- кис- біна- поло- важне поло- важне поло- важне поло- замі- поло- важне поло- важне поло- важне поло- важне поло- важне . ження | замі- | ження | замі- |ження | замі- | ження ження | замі- | ження | замі- |ження | замі- | ження | замі- | ження | замі- ця |в 5ЕО щення|в ЗЕО |щення |в БЕО |щення|в ЗЕО щен |в 5ЕО щення|в ЗЕО |щення |в ЗЕО |щення |в БЕО |щення| в ЗЕО |щення
ІЮ МО: ІЮ МО: І МО: мо: мя ро Мо: ІЮ МО: І МО: ІЮ МО: ІЮ МО: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 То71| М 01192) М |М155І А РІ57,Ї А (мо МІ Її 7/1 ЇЇ її її 2 (07) М 01192) М |Мі55| А РІ А Мо! 1 ЇЇ ЇЇ | Її її 1
З |р128|Ї 1 |ми55| М |м70) с Той 1 57 - ЇЇ 171711 1 1 1 1 4 Олі (1М9 | А (192) М І88| А (РІЗ | | ЇЇ | Її її її 507) М (188| А (192) А /х93! І Па АЇ | | ЇЇ | Її | її 6071) М (188| А (192) А 93) є |і57 Її | | | | 7 7 (о7л| мМ (188) А (192) А м93| є ріг | | | | |/ / |! 8 071) М (192) А |М93) є рігв с (096 т | | | | / | її 9 |х85| І. |г89| А (192) А 193! Її | | | | 7 ЇЇ 1 її її ло |м85| І (192) А |М93) г робо 5| | | | | | 7 її її 1 |м85| 1 (192) А |М93| г рі28Ї А р2ебо| 5. | | | | / | її 12 (1192| А |М93) Ії ро! 51 | ЇЇ 1 1 1 її 1 11 130188 А 0ГІ92| А (93 Її. ЇЇ 1 1 ЇЇ 1 1 її 14088 | А 0ГІ92| А (93 МІ ЇЇ ЇЇ ЇЇ ЇЇ ЇЇ Її її 1585) І (188| А (192 А 1х93! Її | | | | | | 7 Її її 1685) І (188| А (192 Ах! М| | | | | | 7 її її 17 |М85| І (188) А (192) А 93) І ріг | | | | | / |! ( 1885) 1. (188) А (192) А /х93| М |(рігв |. | | | | / | її 19 |м85| І. (188) А (192) А /х93| І (096) т ріг с 20 |х85| І (188| А (192) А /М93| М (096)! т ріг с. | | | | ї 21 |М85| І (188) А |Бг89| А 192) А /|х93| І 096) т |рігвЇ | | | / 22 |х85| І (188) А |г89) А 0192) А |Мх93| М |096| т ріг! | | | | ( 23 |071| М (192) А |М93) і (096Ї т |(рігв | | | | / | 7 24|192| А |М93| І (096! т ріг С! | | | | | 7 | її 25|192| А (ху М! Її Її Її Її Її ЇЇ ЇЇ її її 26 |1192| А |М93! 1 |. Її Її 1 1 1 1 1 1 її 1 11 27 |192| А |М93| М |Мі55і т РІЗ | | Її ЇЇ Її її 28 |1192| А |М93| І |МІ55І т іІ57 | | Її ЇЇ ЇЇ Її її 29 |192| А |М93| І |і ЇЇ Її ЇЇ Її Її Її її 30 |188| А (192) А |М93| І РІ ЇЇ | Її | ЇЇ ЇЇ її її зі (|Мм87| є (92 А |З! ЇЇ ЇЇ 1111111 1171711
За |м87| н Гі92| А |М93 Її ЇЇ 1 1 1 11 1 111
З3|М87| А 0І92| А |У93 Її. ЇЇ 111 17171111 11 34 |х85| І (188) А |г89| А 0192) А |М93| І (096) т рі28| с |мі55| М |е157| 1 (35 |М85| І (188) А |г89| А )192| А |М93| М |096| т (рі28| с |мі55| М |е157| 1
В межах знань кваліфікованого фахівця буде визначити консервативні ділянки та мотиви, розподілені між гомологами, ортологами та паралогами, кодованими 5ЕО ІЮО МО: 1. Маючи ідентифіковані такі консервативні ділянки, які можуть представляти прийнятні мотиви зв'язування, амінокислоти можуть бути вибрані таким чином, щоб бути заміщеними будь-якою іншою амінокислотою, наприклад, консервативними амінокислотами, переважно, амінокислотними заміщеннями, описаними БОРКА з використанням 5ЕО ІЮ МО: 2 як еталону.
Інший об'єкт стосується способу ідентифікації нуклеотидної послідовності, яка кодує мутантний ТгіА, який є резистентним або стійким до гербіциду, причому зазначений спосіб включає: а) створення бібліотеки мутантних нуклеїнових кислот, які кодують ТтгіА, р) скринінг популяції отриманих в результаті мутантних нуклеїнових кислот, які кодують ТтгіА, шляхом експресії кожної із зазначених нуклеїнових кислот в клітині або рослини, та обробку зазначеної клітини або рослини гербіцидом, с) порівняння рівнів стійкості до гербіциду, які забезпечуються популяцією мутантних нуклеїнових кислот, які кодують ТА, з рівнем стійкості до гербіциду, який забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТтіА,
а) вибір, щонайменше, однієї мутантної нуклеїнової кислоти, яка кодує ТтіА, яка забезпечує значно вищий рівень стійкості до гербіциду в порівнянні з тим, що забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТгіА.
Рівні стійкості до гербіциду, крім того, можуть бути визначеними шляхом вимірювання показника детоксифікації в клітині, тканині, або рослині.
Показник детоксифікації представляє собою показний розкладання гербіциду в межах певного проміжку часу у відповідній тканині. Розкладання та утворення продукту може визначатись аналітичним способом, наприклад, з використанням рідинного хроматографа (РХ) разом з мас-спектрометром (МС) з високою роздільною здатністю (НК). Продукт може бути визначений шляхом порівняння аутентичних стандартів та/(або шляхом ідентифікації структури.
У переважному варіанті здійснення, мутантна нуклеїнова кислота, яка кодує ТА, вибрана на стадії 4) забезпечує, щонайменше, в 2 рази більшу резистентність або стійкість клітини або рослини до гербіциду в порівнянні з тією, що забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТтгіА.
В ще одному переважному варіанті здійснення, мутантна нуклеїнова кислота, яка кодує ТтгіА, вибрана на стадії а) забезпечує, щонайменше, в 2 рази, щонайменше, в 5 разів, щонайменше, в 10 разів, щонайменше, в 20 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів, щонайменше в 500 разів, більшу резистентність або стійкість клітини або рослини до гербіциду в порівнянні з тією, яка забезпечується контрольною нуклеїновою кислотою, яка кодує ТтіА.
Резистентність або стійкість може бути визначена шляхом створення трансгенної рослини або клітини-господаря, переважно рослинної клітини, яка містить послідовність з бібліотеки нуклеїнових кислот зі стадії а) та порівнянні трансгенної рослини з контрольною рослиною або клітиною-господарем, переважно рослинною клітиною.
Багато методів, добре відомих фахівцеві в даній галузі є доступними для отримання прийнятних кандидатів нуклеїнових кислот для ідентифікації нуклеотидної послідовності, що кодує мутантний ТгіА з безлічі різних потенційних джерел організмів, включаючи мікробів, рослин, грибів, водоростей, змішаних культур і т.д., а також джерел навколишнього середовища
ДНК, таких як грунт. Дані методи включають в себе, серед іншого, отримання кКДНК або геномних ДНК-бібліотек, застосування відповідним чином вироджених олігонуклеотидних
Зо праймерів, застосування зондів, які грунтуються на відомих послідовностях або аналізах комплементації (наприклад, для росту в присутності тирозину), а також з використанням мутагенезу та шафлінгу для того, щоб забезпечити рекомбіновані або змішані мутантні послідовності, які кодують ТА.
Нуклеїнові кислоти, які містять кандидатні та контрольні послідовності, які кодують ТА, можуть бути експресовані в дріжджах, в бактеріальному штамі хазяїна, у водоростях або у вищих рослинах, таких як тютюн або Агарідорсіх, та відносні рівні властивої стійкості послідовностей, які кодують ТтіА, скринінговані відповідно до видимого індикатором фенотипу трансформованого штаму або рослини в присутності різних концентрацій вибраного гербіциду.
Залежні від дози відповіді та відносні зсуви в залежних від дози відповідях, пов'язані з даними індикаторними фенотипами (утворення коричневого кольору, пригнічення росту, гербіцидний ефект і т.д.) зручно виражаються в термінах, наприклад, значення ОК50 (концентрація для 50 95 зменшення росту) або МІС (мінімальна інгібуюча концентрація), де збільшення значень відповідає збільшенню властивої резистентності експресованого ТгіА. Наприклад, в порівняно швидкій системі аналізу, яка грунтується на перетворенні бактерії, такої як Е. соїї, кожна мутантна послідовність, яка кодує ТгіА, може бути виражена, наприклад, як послідовність ДНК під контролем експресії відповідного промотора, такого як їІас2 промотор, та приймаючи відповідний облік, наприклад, шляхом застосування синтетичної ДНК, таких питань, як частота застосування кодона, для того, щоб отримати співставимий рівень експресії по-можливості різних послідовностей ТгіА. Такі штами, які експресують нуклеїнові кислоти, які містять альтернативні кандидатні ТгіА-послідовності, можуть бути розкриті на різних концентраціях вибраного гербіциду в необов'язково доповненому тирозином середовищі, та відносні рівні властивості стійкості експресованих ферментів ТгіА, оцінених на основі ступеня та МІС для пригнічення утворення коричневого, охронозного пігменту або шляхом вимірювання розкладання гербіцидів з використанням РХ-НАВ-МС (рідинна хроматографія з мас- спектрометрією з високою роздільною здатністю).
В іншому варіанті здійснення, кандидатні нуклеїнові кислоти є трансформованими в рослинному матеріалі для створення трансгенної рослини, регенерованої в морфологічно нормальних фертильних рослинах, які потім вимірюються щодо диференціальної резистентності до вибраних гербіцидів, як це описано в розділі Приклади далі в даному бо документі. Багато прийнятних способів трансформації з використанням відповідних селективних маркерів, таких як канаміцин, бінарні вектори, такі як від Адгобасіегішт, та регенеровані рослини, як, наприклад, від дисків тютюнового листя, є добре відомими в даній галузі техніки.
Необов'язково, контрольні популяції рослин є аналогічним чином трансформованими з нуклеїновою кислотою, яка експресує контрольний ТгіА. Середня величина та розподіл рівнів стійкості до гербіцидів цілого ряду подій первинної трансформації рослин або їх потомства до гербіцидів, які описано вище, оцінюються звичайним способом на основі пошкодження рослини, симптомів меристемного відбілювання і т.д. в діапазоні різних концентрацій гербіцидів. Ці дані можуть бути виражені в термінах, наприклад, значення ОК50, отримані з кривих доза/відповідь, які мають "дозу", відкладену на осі абсцис, та "відсоток знищення", "гербіцидний ефект", "число зелених рослин, що проросли" і т.д., нанесені на осі ординат, де підвищені значення ЗК50 відповідають підвищеним рівням резистентності, властивої експресованому ТтіА. Гербіциди можуть бути відповідним чином застосовуваними перед проростанням або після появи сходів.
Інший об'єкт за представленим винаходом стосується виділеної, рекомбінантної та/або хімічно синтезованої нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний ТгіА, як розкривається БОРКА, де нуклеїнова кислота включає нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, або її варіант або похідну.
Приклади відмінностей даних амінокислотних положень включають, але не обмежуються цим, одну або декілька з наступних: амінокислота, яка відповідає положенню 69, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 70, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 71, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 74, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 82, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 84, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 85, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 87, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 88, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 89, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 91, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 92, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 93, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 96, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 126, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 128, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 129, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 130, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 131, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 155, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 157, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 160, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 167, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 170, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 174, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 180, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 182, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 216, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 217, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 219, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 220, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 246, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 247, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 248, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 249, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 250, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 251, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 298, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 301, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 302, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; амінокислота, яка відповідає положенню 304, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту; 60 амінокислота, яка відповідає положенню 328, є заміщеною на будь-яку іншу амінокислоту;
В переважному варіанті здійснення, кодований мутантний ТгіА представляє собою варіант
ЗЕО ІЮ МО: 2, який включає одну або декілька з наступних: амінокислота, яка відповідає положенню 69, представляє собою іншу, ніж Валін; амінокислота, яка відповідає положенню 70, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 71, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 74, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 82, представляє собою іншу, ніж Аргінін; амінокислота, яка відповідає положенню 84, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 85, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 87, представляє собою іншу, ніж Триптофан; амінокислота, яка відповідає положенню 88, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 89, представляє собою іншу, ніж Фенілаланін; амінокислота, яка відповідає положенню 91, представляє собою іншу, ніж Валін; амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 96, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 126, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 128, представляє собою іншу, ніж Аспарагінова кислота; амінокислота, яка відповідає положенню 129, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 130, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 131, представляє собою іншу, ніж Ізолейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою іншу, ніж Метіонін; амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою іншу, ніж Фенілаланін; амінокислота, яка відповідає положенню 160, представляє собою іншу, ніж Метіонін; амінокислота, яка відповідає положенню 167, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 170, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 174, представляє собою іншу, ніж Лізин; амінокислота, яка відповідає положенню 180, представляє собою іншу, ніж Лейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 182, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 216, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 217, представляє собою іншу, ніж Ізолейцин; амінокислота, яка відповідає положенню 219, представляє собою іншу, ніж Пролін; амінокислота, яка відповідає положенню 220, представляє собою іншу, ніж Аланін; амінокислота, яка відповідає положенню 246, представляє собою іншу, ніж Глутамат; амінокислота, яка відповідає положенню 247, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 248, представляє собою іншу, ніж Аспартат; амінокислота, яка відповідає положенню 249, представляє собою іншу, ніж Гістидин; амінокислота, яка відповідає положенню 250, представляє собою іншу, ніж Аспартат; амінокислота, яка відповідає положенню 251, представляє собою іншу, ніж Глутамат; амінокислота, яка відповідає положенню 298, представляє собою іншу, ніж Глутамін; амінокислота, яка відповідає положенню 301, представляє собою іншу, ніж Серин; амінокислота, яка відповідає положенню 302, представляє собою іншу, ніж Аспарагін; амінокислота, яка відповідає положенню 304, представляє собою іншу, ніж Тирозин; амінокислота, яка відповідає положенню 328, представляє собою іншу, ніж Аспартат;
В особливо переважному варіанті здійснення, мутантний ТгіА, кодований нуклеїновою кислотою за представленим винаходом, містить варіант БЕО ІЮО МО: 2, в якому амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 92, 93, 155, та 157 з ЗЕО ІЮО МО: 2 є заміщеними на будь-яку іншу амінокислоту.
В особливо переважному варіанті здійснення, кодований мутантний ТА містить послідовність БЕО ІЮО МО: 2 або її варіант, похідна, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Маї, та амінокислота, яка відповідає положенню 155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою І еи.
В іншому особливо переважному варіанті здійснення, кодований мутантний ТА містить послідовність БЕО ІЮО МО: 2 або її варіант, похідна, ортолог, паралог або гомолог, в якій: амінокислота, яка відповідає положенню 92, представляє собою Аа, та амінокислота, яка відповідає положенню 93, представляє собою Іі еи, та амінокислота, яка відповідає положенню
155, представляє собою Тпг, та амінокислота, яка відповідає положенню 157, представляє собою Г еи.
В інших аспектах, представлений винахід охоплює потомство або нащадка рослини, резистентної до гербіциду, за представленим винаходом, а також насіння, отримане з рослин, резистентних до гербіциду, за винаходом та клітини, отримані з рослин, резистентних до гербіциду, за винаходом.
В деяких варіантах здійснення, представлений винахід передбачає потомство або нащадка рослини, отриманого з рослини, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин, полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, де потомство або нащадок рослини включає, щонайменше, в деяких зі своїх клітин, рекомбінантний полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, де експресія мутантного поліпептида ТгтіА надає потомству або нащадку рослини стійкість до гербіцидів.
В одному варіанті здійснення, насіння за представленим винаходом переважно має характеристики резистентності до гербіцидів рослини, резистентної до гербіциду. В інших варіантах здійснення, насінина є здатною до проростання в рослину, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгіА надає потомству або нащадку рослини стійкість до гербіцидів.
В деяких варіантах здійснення, рослинні клітини за представленим винаходом є здатними до регенерування рослини або частини рослини. В інших варіантах здійснення, рослинні клітини не є здатними до регенерування рослини або частини рослини. Приклади клітин, не здатних до регенерування рослини, включають, але не обмежуються цим, ендосперм, покриття насінини (кожуру насінини та навколоплідник), та кореневий чехлик.
В іншому варіанті здійснення, представлений винахід передбачає рослинну клітину або здатну регенерування рослину, яка містить, щонайменше, в деяких зі своїх клітин, полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослині стійкість до гербіцидів, де рослинна клітина містить рекомбінантний полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором.
В інших варіантах здійснення, представлений винахід передбачає рослинну клітину, який містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТА надає клітині стійкість до гербіцидів.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується рослинної клітини, трансформованої нуклеїновою кислотою, яка кодує мутантний поліпептид ТгіА відповідно до представленого винаходу, де експресія нуклеїнової кислоти в рослинній клітині в результаті призводить до підвищеної резистентності або стійкості до гербіциду в порівнянні з сортом немутантного типу рослинної клітини. Переважно, мутантний поліпептид ТгіА, який кодує нуклеїнова кислота, включає полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з: а) полінуклеотида, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 1, або його варіанта або похідної; р) полінуклеотида, який кодує поліпептид, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 2, або його варіанта або похідної; с) полінуклеотида, який містить щонайменше 60 слідуючих один за одним нуклеотидів з будь-якого а) або Б); та а) полінуклеотида комплементарного до полінуклеотида з будь-якого від а) до с).
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає рослинний продукт, отриманий з рослин, резистентних до гербіциду. В деяких варіантах здійснення, приклади рослинних продуктів включають, без обмеження, зерно, олію та борошно. В одному варіанті здійснення, рослинний продукт представляє собою рослинне зерно (наприклад, зерно, прийнятне для використання у вигляді корму або для обробки), рослинну олію (наприклад, олію, прийнятну для використання як харчового продукту або біодизельного палива), або рослинне борошно (наприклад, борошно, прийнятну для використання як їжі).
В одному варіанті здійснення, передбаченим є рослинний продукт, отриманий з рослини або частини рослини, в якому рослина або частина рослини містить, щонайменше в деяких зі своїх клітин, полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТгіА надає рослині або частині рослини стійкість до гербіцидів.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу продукування трансгенної рослинної клітини з підвищеною резистентністю до гербіциду в порівнянні з сортом немутантного типу рослинної клітини, який включає трансформування рослинної клітини з касетою експресії, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТгіА, який кодується полінуклеотидом.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу продукування трансгенної рослини, який включає, (а) трансформування рослинної клітини з касетою експресії, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТА, який кодується полінуклеотидом, та (б) генерування рослини з підвищеною резистентністю до гербіциду з рослинної клітини.
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає спосіб отримання рослини, резистентної до гербіциду. В одному варіанті здійснення, спосіб включає: регенерування рослини з рослинної клітини, трансформованої з полінуклеотидом, функціонально зв'язаним з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТтіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
Термін "експресія/експресування" або "експресія гена" означає транскрипцію конкретного гена або специфічних генів або конкретного генетичного конструкта. Термін "експресія" або "експресія гена", зокрема, означає транскрипцію гена або генів, або генетичного конструкта в структурну РНК (рРНК, тРНК) або мРНК з або без трансляції послідовності останньої в протеїн.
Процес включає в себе транскрипцію ДНК та вироблення в результаті отриманого продукту
МРНК.
Для того, щоб отримати бажаний ефект, тобто рослини, які стійкі або резистентні до гербіцидів похідну гербіциду за представленим винаходом, слід розуміти, що щонайменше одна нуклеїнова кислота є "надекспресованою" за допомогою способів та засобів, відомих кваліфікованим фахівцям в даній галузі.
Термін "підвищена експресія" або "надекспресія", як використовується в даному документі,
Зо означає будь-яку форму експресії, яка є додатковою до рівня експресії немутантного типу.
Способи посилення експресії генів або генних продуктів є добре описаними в даній галузі та включають, наприклад, надекспресію, що керується прийнятним промотором, використання енхансерів транскрипції або енхансером трансляції. Виділені нуклеїнові кислоти, які служать як промоторні або енхансерні елементи, можуть бути введені у відповідне положення (як правило, проти ходу транскрипції) негетерологічної форми полинуклеотида таким чином, щоб підвищити експресію нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який викликає зацікавленість. Наприклад, ендогенні промотори можуть бути змінені іп мімо шляхом мутації, делеції та/або заміщення (дивіться, Кітіес, О5 5,565,350; 7апіпу еї аІ., М/09322443), або виділені промотори можуть бути введені в клітину рослини у властивій орієнтації та з відстанню від гена за представленим винаходом, з тим, щоб контролювати експресію гена. Якщо експресія поліпептиду є бажаною, в загальному випадку є бажаним включати ділянку поліаденілювання на 3'-кінці полінуклеотидної кодуючої ділянки. Ділянка поліаденілювання може бути отримана з природного гена, з безлічі інших рослинних генів, або з Т-ДНК. Слід додати, що 3' кінцева послідовність може бути отримана з, наприклад, ген-нопалінсинтази або ген-октопінсинтази, або як альтернатива з іншого рослинного гена, або, менш переважно, з будь-якого іншого еукаріотичного гену.
Послідовність інтрону також може бути додана в 5' нетрансльовану ділянку (ОТЕ) або кодуючої послідовності часткової кодуючої послідовності, щоб збільшити кількість зрілого повідомлення, яке акумулюється в цитозолі. Включення здатного до сплайсінгу інтрону в одиницю транскрипції в рослинних та тваринних експрисуючих конструктах, як було показано, збільшує експресію гена в обох рівнях мРНК та протеїну аж до в 1000-разів (Висптап апа Вегод (1988) Мої. Сеї! ріої. 8: 4395-4405; Саїїв єї а). (1987) Сепез Оєм 1: 1183-1200). Таке інтронне посилення експресії гена, як правило, є найбільшим, коли розташоване близько 5' кінця одиниці транскрипції.
Використання інтронів кукурудзи Аап1-5 інтрони 1, 2 та 6, інтрону Вгоп7е-1, є відомими в даній галузі. Для отримання загальної інформації дивіться: Те Маї7е Напарсок, Спарієг 1 16, ЕРгееїїпд апа Маїрої, Еав5., Зргіпдег, М.М. (1994).
Там, де це доцільно, послідовності нуклеснових кислот можуть бути оптимізовані для збільшення експресії в трансформованій рослині. Наприклад, передбаченими можуть бути кодуючі послідовності, які містять переважні рослинні кодони для покращення експресії в рослині. Дивіться, наприклад, Сатррбеї! апа Сомлті (1990) Ріапі Рпубзіо!., 92: 1-11 для обговорення 60 використання господар-переважних кодонів. Крім того, відомими в даній галузі техніки є способи отримання переважних рослинних генів. Дивіться, наприклад, патенти США МоМо 5,380,831 та 5,436,391, а також Миггау еї аї. (1989) Мисієїс Асіаз Ке5. 17: 477-498, які включені в даний документ у вигляді посилання.
Таким чином, передбаченими є нуклеїнові кислоти немутантного типу або мутантного ТгіА за даним винаходом в касетах експресії для експресії в рослині, яка викликає зацікавленість.
Касета буде включати регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю нуклеїнової кислоти мутантного ТгіА за даним винаходом. Термін "регулюючий елемент", як використовується в даному документі, стосується полінуклеотиду, який здатний регулювати транскрипцію функціонально зв'язаного полінуклеотида. Він включає, але не обмежується цим, промотори, енхансери, інтрони, 5 ТК та 3 ОТК. Під терміном "функціонально зв'язаний" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором та другою послідовністю, в якій послідовність промотора ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, яка відповідає другій послідовності. Як правило, функціонально зв'язаний означає, що послідовності нуклеїнових кислот, які є зв'язаними, є суміжними та, якщо необхідно з'єднувати дві кодують протеїнові ділянки, суміжні в тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, щоб бути котрансформірованою в організм. Альтернативно, додатковийі) ген(и) може(уть) бути передбачений) на декількох касетах експресії.
Така касета експресії забезпечується безліччю ділянок рестрикції для вставки послідовності нуклеїнової кислоти немутантного типу / мутантного ТгіА, щоб бути під транскрипційним контролем регуляторних ділянок. Касета експресії може додатково містити селективні маркерні гени. Касета експресії за представленим винаходом буде включатися в 5-3 напрямку транскрипції, транскрипційну та трансляційну ділянку ініціації (тобто промоторні ділянки), нуклеїнову кислоту, яка кодує немутантного типу / мутантний ТгіА відповідно до винаходу, та транскрипційну та трансляційну ділянку термінації (тобто ділянку термінації), яка функціонує в рослинах. Промотор може бути нативним або аналогом, або чужорідним або гетерологічним до рослини-господаря та/або до послідовності нуклеїнової кислоти немутантного типу / мутантного
ТИПА за даним винаходом. Крім того, промотор може бути природною послідовністю або, альтернативно, синтетичною послідовністю. Там, де промотор є "чужорідним" чи "гетерологічним" до рослини-господаря, передбачається, що промотор не є знайденим в
Зо нативній рослині, в яку вводять промотор. Там, де промотор є "чужорідним" чи "гетерологічним" до послідовності нуклеїнової кислоти немутантного типу / мутантному ТгтіА відповідно до даного винаходу, передбачається, що промотор не є нативним або промотором, що зустрічається в природі для функціонально зв'язаної послідовністі нуклеїнової кислоти немутантного типу / мутантного ТтгіА за винаходом. Як використовується в даному документі, химерний ген містить кодуючу послідовність, функціонально зв'язану з ділянкою, ініціації транскрипції, яка є гетерологічною по відношенню до кодуючої послідовності. У той же час, переважним може бути експресувати немутантного типу або мутантний ТгіА нуклеїнових кислот за винаходом з використанням гетерологічних промоторів, використаними можуть бути нативні послідовності промотора. Такі конструкти будуть змінювати рівні експресії немутантного типу / мутантного протеїну ТгіА в рослині або рослинній клітині. Таким чином, змінюється фенотип рослини або рослинної клітини.
Термінальна ділянка може бути нативною з ділянкою ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю немутантного типу або мутантного ТгіА, що викликає зацікавленність, може бути нативною з рослиною-господарем, або може бути отриманою з іншого джерела (тобто, чужорідного або гетерологічного по відношенню до промотора послідовності нуклеїнової кислоти немутантного типу/мутантного ТгіА, що викликає зацікавленність, рослини-господаря, або будь-якої їх комбінації). Зручні термінальні ділянки є доступними з Ті-плазмідою або з А. Шшптегїасіеп5, такі як термінальні ділянки октопінсинтази та нопалінсинтази. Дивіться також Сиегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262: 141-144; Ргоцагтої (1991) СеїІ 64:671-674; Запіасоп вї а. (1991) Сепевз Оеєм. 5: 141-149; Модеп вї а). (1990) Ріапі СеїЇ 2:1261-14272; Мипгоєе евї а!. (1990) Сепе 91: 151-158; Ваїаз ї аї. (1989) Мисівїс Асід5 Нев. 17:7891- 7903; та дозі єї аї. (1987) Мисівїс Асіа Ке5. 15:9627-9639. Там, де це прийнятно, ген(и) можуть бути оптимізовані для підвищеної експресії в трансформованій рослині. Таким чином, гени можуть бути синтезовані з використанням переважно рослинних кодонів для посилення експресії. Дивіться, наприклад, СатрбреїЇ апа Сом/угі (1990) Ріапі РПузіоЇ. 92: 1-11 для обговорення використання переважних кодонів господаря. Способи є доступними в даній галузі з рівня техніки для синтезу переважних рослинних генів. Дивіться, наприклад, патенти США
МоМо 5,380,831, та 5,436,391, та Миггау еї аІ. (1989) Мисієїс Асідй5 Кев5. 17:477-498, який включений в даний документ у вигляді посилання.
Зо
Таким чином, представлений винахід передбачає касету експресії, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти мутантного ТгтіА, нуклеїнову кислоту відповідно до представленого винаходу та промотор, функціонуючий в рослинних клітинах.
В переважному варіанті здійснення, промотор представляє собою корень-специфічний або покращуючий корень промотор.
В особливо переважному варіанті здійснення, промотором представляє собою корень- специфічний промотор або покращуючий корень від Сіусіпе тах. (наприклад, р-СІіута04934080, дивіться приклади 8 та 9).
Ще більш переважно, промотор включає послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 32.
У той час як полінуклеотіди за винаходом можуть знайти застосування як селективні маркерні гени для трансформації рослин, касети експресії за винаходом можуть включати інший селективний маркерний ген для селекції трансформованих клітин. Селективні маркерні гени, в тому числі, ті, які за представленим винаходом, використовуються для селекції трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають, але не обмежуються цим, гени, які кодують резистентність до антибіотиків, такі як ті, які кодують неоміцинфосфотрансферазу ІЇ (МЕО) та гігроміцин-фосфотрансферазу (НРТ), а також гени надають резистентність до гербіцидних сполук, таких як глюфосинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони та 2,4- дихлорфеноксіацетат (2,4-О0). Дивіться загалом Магтапіоп (1992) Сигт. Оріп. Віоїесп. 3: 506-511;
Спгівіорнегз оп еї аї. (1992) Ргос. Май). Асад. 5сІ ОСОБА 89:6314-6318; Мао еї аї. (1992) Сеї| 71:63- 72; Келпікоїї (1992) Мої Місгобіої! 6: 2419-2422; Ватжівєу еї аї!. (1980) іп Тне Орегоп, рр. 177-220;
Ни єї а!. (1987) Сеї! 48: 555-566; Вгомлп еї аї!. (1987) Сеї! 49:603-612; Рідде еї аї. (1988) Сеї! 52: 713-722; Оеизспіе еї аї. (1989) Ргос. Маї! Асад. Асі ОСОБА 86: 5400-5404; Ецегві єї а. (1989) Ргос.
Май Асад. 5сі ОБА 86: 2549-2553; ЮОеизсНіе єї аї. (1990) Зсієпсе 248: 480-483; Совззеп (1993)
РА.О. Тневів, Опімегзйу ої Неіде!Ірего; Неїпез еї а. (1993) Ргос. Маї! Асад. сі ОБА 90: 1917-1921;
ІГарому еї аї. (1990) Мої Сеї! Віо! 10:3343-3356; 7атьгенцйі єї аї. (1992) Ргос. Маї! Асад. 5сі О5А 89:3952-3956; Ваїтп еї аї. (1991) Ргос. Май! Асад. 5сі ОБА 88:5072-5076; М/урогзкі єї аї. (1991)
Мисівїс Асіає Нев. 19:4647-4653; НіПепапа-ууіз5тап (1989) Торіс5 Мої! 5ігис. Віо! 10: 143-162;
Оедепкої еї аї. (1991) Апіїтістоб. Адепів СпетойїШег. 35: 1591-1595; КієїпвеНпіаї еї аї. (1988)
Віоспетівігу 27: 1094-1104; Вопіп (1993) РИ.О. Тневзів, Опімегейу ої НеїдеІрегу; Соззеп 6ї аї. (1992) Ргос. Маї! Асад. 5сі ОБА 89: 5547-5551; Оїїма єї а. (1992) Апіітістор. Адепів СпетоїНег. 36:913-919; Ніамка єї аї. (1985) Напарсок ої Ехрегітепіа! Рпаптасоіоду, Мої. 78 (бргіпдег-Мепад,
Вепіп); СІЇЇ еї аІ. (1988) Маїште 334:721-724. Такі розкриття є включеними в даний документ у вигляді посилання. Зазначений вище перелік селективних маркерних генів, як зазначено, не є обмежуючим. Будь-який селективний маркерний ген може використовуватись в представленому винаході.
Крім того, додаткові модифікації послідовностей є відомими для посилення експресії генів в клітині-господарі. До них відносяться видалення послідовностей, які кодують паразитні сигнали поліаденілювання, сигналів сайтів сплайсингу екзон-інтрон, транспозон-подібних повторів та інших подібних добре характеризованих послідовностей, які можуть бути шкідливими для експресії генів. Зміст 5-С послідовності може бути відрегульований таким чином, щоб середні рівні для даного клітинного господаря, як розраховано відносно відомих генів, які експресуються в клітині-господарі. Крім того, при бажанні, послідовності можуть бути легко змінені, щоб уникнути прогнозованих шпильок вторинних мРНК структур. Нуклеотидні послідовності, для посилення експресії генів також можуть бути використані в рослинних векторах експресії. До них відносяться, наприклад, інтрони гена ап кукурудзи Аан1-5 інтрони 1, 2 та 6 (Саїїї5 еї аІ. Сепе5 апа Оемеортепі 1: 1 183-1200, 1987), та лідерні послідовності (М/- послідовність) з вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ), з вірусу хлоротичної плямистості кукурудзи та вірусу мозаїки люцерни (Сайе єї аї. Мисієїс Асіа Ве5. 15: 8693-8711, 1987 та ЗКилезкКі еї аї. Ріапі Мої. Віої. 15: 65-79, 1990). Перший інтрон з 5пгипКеп-1 локусу кукурудзи, як було показано, збільшує експресію генів в химерних генних конструктах. У патентах США МоМо 5,24,412 та 5,593,874 розкрито використання специфічних інтронів в експресії генних конструктів, та в Саїе еї аї. (Ріапі Рпузіої. 106:929-939, 1994) також показано, що інтрони можуть бути використані для регуляції експресії генів на тканинноспецифічній основі. Для подальшого підвищення або оптимізації експресії гену, рослинні вектори експресії, згідно даного винаходу, також можуть містити послідовності
ДНК, які містять матрицю прикріплення ділянок (МАК). Таким чином, рослинні клітини, трансформовані такими модифікованими системами експресії, можуть проявляти надекспресію або конститутивну експресію нуклеотидної послідовності за винаходом.
Крім того, винахід стосується виділеного рекомбінантного вектору експресії, який містить експресійну касету, яка містить нуклеїнову кислоту немутантного типу або мутантного ТгіА, де 60 нуклеїнова кислота є такою, як описано вище, де експресія вектора в клітинах-господарях в результаті призводить до підвищеної резистентності до гербіциду в порівнянні з немутантного типу соттом клітини-господаря. Як використовується в даному документі, термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, З якою вона є зв'язаною. Один тип вектора представляє собою "плазміду", яка відноситься до кільцевої дволанцюгової петлі ДНК, в яку лігованими можуть бути додаткові сегменти ДНК.
Інший тип вектора представляє собою вірусний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані в вірусний геном. Деякі вектори є здатними до автономної реплікації в клітині- господарі, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, які мають бактеріальний сайт ініціації реплікації та епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) інтегруються в геном клітини-господаря при введенні в клітину-господар, і таким чином, реплікуються разом з геномом господаря. Більш того, деякі вектори є здатними спрямовувати експресію генів, з якими вони є функціонально зв'язаними. Такі вектори називаються в даному документі, як "вектори експресії". У загальному випадку, вектори експресії, які використовуються в методах рекомбінантних ДНК, часто знаходяться в формі плазмід. В представленому описі терміни "плазміда" та "вектор" можуть бути використані як взаємозамінні, оскільки плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора. Проте, даний винахід призначений включати інші форми векторів експресії, такі як вірусні вектори (наприклад, дефектні по реплікації ретровіруси, аденовіруси та адено-асоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.
Рекомбінантні вектори експресії за винаходом містять нуклеїнову кислоту за винаходом у формі, прийнятній для експресії нуклеїнової кислоти в клітині-господарі, що означає, що рекомбінантні вектори експресії включають одну або більше регуляторних послідовностей, вибраних на основі клітин-господарів, які будуть використовуватися для експресії, яка є функціонально зв'язаною з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка повинна бути експресованою. Регуляторні послідовності включають зв себе як ті, які спрямовують конститутивну експресію нуклеотидної послідовності в багатьох типах клітинах-господарів, так і ті, які спрямовують експресію нуклеотидної послідовності тільки в певних клітинах-господарях або за певних умов. Зрозуміло, що кваліфікованим фахівцям в даній галузі буде очевидно, що конструкція вектора експресії може залежати від таких факторів, як вибір клітини-господаря для того, щоб бути трансформованими, рівень експресії бажаного поліпептиду і т.д. Вектори експресії за винаходом можуть бути введені в клітини-господарі, таким чином, щоб виробляти поліпептиди або пептиди, включаючи злиті поліпептиди або пептиди, які кодуються нуклеїновими кислотами, як описується в даному документі (наприклад, мутантний поліпептид
ТА, злиті поліпептиди, тощо).
Вектори експресії можуть додатково містити 5' лідерні послідовності в конструкті експресії.
Такі лідерні послідовності можуть діяти для посилення трансляції. Лідери трансляції є відомими в даній галузі та включають: лідери пікорнавірусів, наприклад, лідер ЕМСМ (енцефаломіокардит 5 некодуюча ділянка) (ЕіІгоу-бієїп еї а). (1989) РМАБ5б, 86:6126-6130); лідери потівірусів, наприклад, лідер ТЕМ (вірус гравірування тютюну) (Саїйе еї аЇ. (1995) Сепе 165(2):233-238), лідер МОММ (вірус карликової мозаїки кукурудзи) (Мігоїюду 154:9-20), та людського імуноглобуліну зв'язування важкого ланцюга протеїну (ВІР) (Масеак еї а. (1991) Маиге 353:90- 94); нетрансльований лідер з мРНК протеїну оболонки вірусу мозаїки люцерни (АММ КМА 4) (Чобіїпу єї а. (1987) Маїше 325:622-625); лідер вірусу тютюнової мозаїки (ТММ) (Сайіе еї аї. (1989) іп Моїесшіаг Віооду ої АМА, єд. Сесп (г іб5, Мем Мої), рр. 237-256); та лідер вірусу хлоротичні плямистості кукурудзи (МСММ) (Готітпеї еї аї. (1991) Мігоїюду 81: 382-385). Дивіться також, Оеїа-Сіорра еї а. (1987) Ріапі Рпузіої. 84: 965-968.
Інші способи, відомі для того, щоб посилити трансляцію, також можуть бути використані, наприклад, інтрони, тощо. При отриманні вектора експресії можуть маніпулювати різними фрагментами нуклеїнових кислот, таким чином, щоб забезпечити послідовності нуклеїнових кислот, у властивій орієнтації, та, в разі необхідності, у властивій рамці зчитування. З цією метою, адаптери або лінкери можуть бути використані для з'єднання фрагментів нуклеїнових кислот, або інші маніпуляції можуть бути залучені для забезпечення зручних сайтів рестрикції, видалення надлишкової нуклеїнової кислоти, видаленням сайтів рестрикції, або тому подібне.
Для цієї мети, іп міго можуть бути залучені мутагенез, відновлення праймеру, рестрикція, ренатурація, перезаміщення, наприклад, транзиціїта трансверсії.
Ряд промоторів можуть бути використаний в практиці цього винаходу. Промотори можуть бути вибрані на основі бажаного результату. Нуклеїнові кислоти можуть бути об'єднані з конститутивним, тканино-переважним, або іншими промоторами для експресії в рослинах.
Конститутивні промотори включають, наприклад, ядерний промотор К5уп7 промотора та бо інші конститутивні промотори, розкриті в М/О 99/43838 та патенті США Мо 6,072,050; ядерний
Самм 355 промотор (Оаеї! еї аІ. (1985) Маїшге 313:810-812); рисовий актин (МеЕїгоу еї аї. (1990)
Ріапі Сеї! 2: 163-171); убіквітин (Спгістепзеп еї а!. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619-632 та Спгібїепзеп еї а. (1992) Ріапі Мої. Віо!. 18:675-689); РЕМИ (І аві евї аї. (1991) Тнеєог. Аррі. Сепеї. 81:581-588);
МА5 (Мепцеп еї а. (1984) ЕМВО 4). 3:2723-2730); АІ 5 промотор (Патент США Мо 5,659,026), тощо.
Інші конститутивні промотори включають, наприклад, патенти США МоМо 5,608,149; 5,608, 144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; таб,177,611.
Тканино-переважні промотори можуть використовуватися для цільової підвищеної експресії в межах конкретної рослинної тканини. Такі тканино-переважні промотори включають, але не обмежуються цим, листок-переважні промотори, корень-переважні промотори, насіння- переважні промотори, та стебле-переважні промотори. Деякі приклади тканино-переважних промоторів є описаними в, наприклад, УХататоїйо еї а!. (1997) Ріапі 9. 12(2): 255-265; Кажатаїа еї а. (1997) Ріапі Сеї! Рнузіо!. 38(7): 792-803; Напзеп еї а. (1997) Мої. Сеп Сепеї. 254(3):337-343;
Визз5еїЇ єї аї. (1997) Тгтапздепіс Нев. 6(2): 157-168; Віпепаїй еї аї. (1996) Ріапі Рпувіої. 1 12(3): 1331-1341; Мап Сатр еї а!. (1996) Ріапі РНузіої. 112(2): 525-535; Сапемавсіпі єї а. (1996) Ріапі
РНузіо!ї. 1 12(2): 513-524; Мататоїо еї аї. (1994) Ріапі СеїЇ Рпузіої. 35(5):773-778; ат (1994)
Везиїйв5 Ргорі. Се! Оійег 20:181-196; Ого7со еї аІ. (1993) Ріапі Мої! ВіоЇ. 23(6): 1 1299-1138;
Маїзиока еї а!. (1993) Мос Маїй!. Асад. 5сІ ОБА 90(20): 9586-9590; та сцемага-Сагсіа єї а. (1993)
Ріапі У 4(3): 495-505. Промотори можуть бути модифікованими, якщо необхідно, для слабкої експресії.
В переважному варіанті здійснення, промотор представляє собою корень-специфічний або покращуючий корень промотор.
В особливо переважному варіанті здійснення, промотором включає послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 32.
В деяких варіантах здійснення нуклеїнові кислоти, які викликають зацікавленість, можуть бути націлені на хлоропласт для експресії. Таким чином, коли нуклеїнова кислота, яка викликає зацікавленість, не є безпосередньо вставленою в хлоропласт, вектор експресії буде додатково містити хлоропласт-націлюючу послідовність, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, щоб спрямувати продукт гена, який викликає зацікавленість, на хлоропласт. Такі транзитні пептиди є відомими в даній галузі з рівня техніки. Стосовно
Зо хлоропласт-націлюючих послідовностей, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує транзитний пептид (тобто хлоропласт-націлююча послідовність) є зв'язаною з необхідною кодуючою послідовністю за винаходом, таким чином, що дві послідовності є суміжними, та в одній і тій самій рамці зчитування. Дивіться, наприклад, Моп
Неїпе еї аї. (1991) Ріапі Мої. Віо!. Кер. 9: 104-126; Сіаїк єї а. (1989) У Вісі. Спет. 264:17544- 17550; Реїа-Сіорра єї аї. (1987) Ріапі РНузіо!. 84:965-968; Вотег" єї аї. (1993) Віоспет. Віорнуз.
Вез. Сботтип. 196: 1414-1421; та 5пан єї а!. (1986) 5сієпсе 233:478-481. Наприклад, транзитний пептид хлоропласта, відомий в даній галузі, може бути злитий з амінокислотною послідовністю поліпептида ТгіА за винаходом шляхом функціонального зв'язування хлоропласт-націлюючої послідовності на 5'-кінці нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид ТА.
Хлоропласт-націлюючі послідовності є відомими в даній галузі та включають хлоропластні малі субодиниці рибулоза-!, 5-бісфосфаткарбоксилази (Кибібсо) (де Савіго Зіїма ЕйНо еї аї. (1996) Ріапі Мої. Віо!. 30:769-780; 5еНпеї! єї аї. (1991) У Віої. Снет. 266(5):3335-3342); ЕРБР5 (Агепег єї аї. (1990) У Віоєпег9. Віотетрь. 22(6):789-810); триптофансинтазу (2Ппао еї аї. (1995) У
ВіоІ. Снет. 270(11):6081-6087); пластоціанін (І ауутепсе еї аї. (1997) У ВіоІЇ. Снет. 272(33):20357- 20363); хорисматсинтазу (Зсптіді ей аЇ. (1993) 9 ВіоЇї Спет. 268(36)27447-27457); та та зв'язуючий протеїн хлорофілу, який утворюється на світлі а/р, (І НВР) (Гатрра еї аї. (1988) 9
ВіоІ. Спет. 263: 14996-14999). Дивіться також Моп Неї|пе еї а. (1991) Ріапі Мо!. Віо!. Кер. 9: 104- 126; Сіаїк єї аї. (1989) У Віої. Спет. 264: 17544-17550; ОеПа-Сіорра еї аї. (1987) Ріапі Рпузіо!. 84:965-968; ВКотег вї а. (1993) Віоспет Віорпуз. НКе5. Соттип. 196: 1414-1421; та 5папй еї аї. (1986) Зсієпсе 233:478-481.
Способи трансформації хлоропластів є відомими в даній галузі з рівня техніки. Дивіться, наприклад, 5маб еї аї. (1990) Ргос. Май. Асад. 5сІ. ЮОБА 87:8526-8530; 5маб та Маїїда (1993) Ргос.
Маї!. Асад. осі. ОБА 90:913-917; 5маб апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Спосіб грунтується на частках доставки ДНК, яка містить селективний маркер та націленні ДНК на пластидний геном шляхом гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформація пластиди може бути досягнута шляхом трансактивації мовчазних трансгенів, які переносять пластиди, за допомогою тканино-переважної експресії ядерно-кодованої та пластид-орієнтованої РНК-полімерази. Такі системи є описаними в МевВгіає еї а!. (1994) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 91:7301-7305.
Нуклеїнові кислоти, які викликають зацікавленість, що спрямовані в хлоропласт, можуть бо бути оптимізовані для експресії в хлоропластах для того, щоб врахувати відмінності у використанні кодонів між рослинним ядром та даною органелою. Таким чином, нуклеїнові кислоти, які викликають зацікавленість, можуть бути синтезовані з використанням хлоропласт- переважних кодонів. Дивіться, наприклад, патент США Мо 5,380,831, який є включеним в даний документ у вигляді посилання.
Доступними є численні вектори трансформації рослин та способи трансформації рослин.
Дивіться, наприклад, Ап, 0. еї аї. (1986) Ріапі Рузіої, 81:301-305; Егу, «., єї а. (1987) Ріапі Сеї!
Вер. 6:321-325; ВіоскК, М. (1988) Тнеог. Аррі. Сепеї. 16: 161-11 А; Ніпснее, єї а!. (1990) егадіег.
Сепеї. Зутр.20322.203-22; Соивіпв, єї аї. (1991) Айві. 9. Ріапі РНузіо!. 18:481-494; Спеє, Р. Р. апа зБідніот, у. Г. (1992) Сепе.ІІ 8: 255-260; Спгівои, єї аї. (1992) Ттепавз. Віотесппої!. 10: 239-246;
Нагїініп, єї а!. (1992) Віо/ТесНпої. 10:309-314; ОпНіг, єї аї. (1992) Ріапі Рпузіої. 99: 81-88; Савзаз вї аї. (1993) Ргос. Маї. Асай 5а. ОА 90: 11212-11216; СНгівіои, Р. (1993) Іп Міо Сеїї. Оєм. Віо!. - Ріапб; 29Р.119-124; баміев, еї а!. (1993) Ріапі Сеї! Вер. 12: 180-183; опа, 9. А. та Меспиднеп, А. (1993)
Ріапі 5сі 91: 139-148; ЕгапкКіїп, С. І. апа Тгівеи, Т. М. (1993) Ріапі. Рпувіої!. 102: 167; Соіоукіп, еї аї. (1993) Ріапі 5сі.. 90: 41-52; Со Спіп сі ВиїІ. 38: 2072-2078; Азапо, еї аї. (1994) Ріапі Сеї! Нер. 13; Ауєге5 М. М. апа Рак, МУ. 0. (1994) Ст. Нем. Ріапі. Зсі. 13: 219-239; Вагсеїйо, еї аї. (1994)
Ріапі. 9. 5: 583-592; ВескКег", єї аї. (1994) Ріапі. У. 5:299-307; ВоїКомвхкКа еї аї. (1994) Асіа. Рпузіо
Ріапі. 16: 225-230; Співи, Р. (1994) Адго. Роса. Іпа. Ні Тесп. 5: 17-27; Еареп еї аї. (1994) Ріапі
Сеї! Вер. 13: 582-586; Наптанп, єї а!. (1994) Віо-Тесппоіоду 12: 919923; Війаїа, еї аї. (1994) Ріапі.
Мої. Віої. 24:317-325; та УМап, У. С. апа І етаих, Р. б. (1994) РіІапі Рпузіої. 104: 3748.
В деяких варіантах здійснення, способи за винаходом включають введення в рослину полінуклеотидного конструкту. Термін "введення" означає для надання рослині полінуклеотидного конструкту, таким чином, що конструкт отримує доступ до внутрішності клітини рослини. Способи за винаходом не залежать від конкретного способу введення полінуклеотидного конструкту в рослину, тільки для того, щоб отримати доступ полінуклеотидного конструкту до внутрішньої частини щонайменше однієї клітини рослини.
Способи введення полінуклеотидних конструктів в рослини є відомими в даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись ними, способи стійкої трансформації, способи перехідної трансформації та вірус-опосередковані способи. Термін "введення" або "перетворення", які згадуються в даному документі далі означають передачу екзогенного полінуклеотида до клітини-господаря, незалежно від способу, який використовується для передачі. Рослинна тканина, здатна для подальшого клонального розмноження будь-яким шляхом або органогенезу, або ембріогенезу, може бути трансформована генетичним конструктом за представленим винаходом, та ціла рослина є регенерованою від неї. Конкретна вибрана тканина буде варіюватися в залежності від доступних клонових систем поширення, та найкраще підходить для того, щоб трансформувати конкретні види. Ілюстративні тканини-мішені включають листкові диски, пилок, зародки, сім'ядолі, гіпокотілі, мегагаметофіти, калусні тканини, існуючі меристематичні тканини (наприклад, верхівкові меристеми, пазушні бруньки та кореневі меристеми) та індуковані меристематичні тканини (наприклад, меристеми сім'ядолей та меристеми гіпокотиля). Полінуклеотид може бути тимчасово або стабільно введеним в клітину- господар, та може підтримуватися неінтегрованим, наприклад, як плазміда. Альтернативно, він може бути інтегрований в геном господаря. Отримані в результаті трансформовані рослинні клітини можуть бути потім використані для регенерації трансформованої рослини за способом, відомим фахівцям в даній галузі.
Під терміном "стабільна трансформація" мають на увазі, що полінуклеотидний конструкт, який введений в рослину, інтегрується в геном рослини та є здатним бути успадкованим її нащадком. Під терміном "транзиторна трансформація" мають на увазі, що полінуклеотидний конструкт, який введений в рослину, не інтегрується в геном рослини.
Для трансформації рослин та рослинних клітин, нуклеотидні послідовності за винаходом вводяться з використанням стандартних методів, відомих в даній галузі, в будь-який вектор, який є прийнятним для експресії нуклеотидної послідовності в рослині або рослинній клітині.
Вибір вектора залежить від пріоритетного способу трансформації та виду рослини-мішені, яка трансформується. В одному з варіантів здійснення за винаходом, кодуюча нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з рослинним промотором, наприклад промотором, відомим в даній галузі для високого рівня експресії в рослинній клітині, та даний конструкт потім вводять в рослинну клітину, яка є чутливою до гербіцидів; та трансформована рослина регенерується. В деяких варіантах здійснення, трансформована рослина є стійкою до впливу на рівень гербіцидів, які повинні знищувати або в значній мірі пошкоджувати рослину, регенеровану з нетрансформованої клітини. Даний спосіб можуть застосовувати до будь-яких видів рослин або сільськогосподарських культур.
Методології побудови рослинних векторів експресії та введення чужорідних нуклеїнових кислот в рослини, як правило, відомі в даній галузі. Наприклад, чужорідна ДНК може бути введена в рослини, з використанням плазмідних векторів, які індукують пухлини (Ті). Інші способи, використовувані для доставки чужорідної ДНК включають в себе використання РЕС- опосередкованої трансформації протопластів, електропорації, мікроін'єкції вусів та біолистики або бомбардування мікрочастинками для безпосереднього поглинання ДНК. Такі способи є відомими в даній галузі. (Патент США Мо 5,405,765-Мавії єї а)!.; Віїапа еї а! (1991) Сепе 100: 247- 250; ЗеНеїйа еї аї.а!, (1991) Мої. Сеп. Сепеї., 228: 104-1 12; Сцегсне евї аї., (1987) Ріапі Зсієпсе 52: 111-116; Мешнаизе евї а!., (1987) Тнеог. Аррі Сепеї. 75: 30-36; Ківїп єї а!., (1987) Маїшиге 327: 70-73;
Номеї! еї а!., (1980) бсіепсе 208: 1265; Ногзгсп вї а!., (1985) Зсівєпсе 227: 1229-1231; Оевіоск еї аї., (1989) Ріапі РНузіоїоду 91: 694-701; Меїйпоа5 То Ріапі МоїІесшаг Віооду (М/еіїв5баси апа
М/еіз5расі, еавз.) Асадетіс Ргев55, Іпс. (1988) та Метод іп Ріапі МоїІесшаг Віоіоду (Зспшег апа гЛеїїп5кКі, сд5.) Асадетіс Ргевзв, Іпс. (1989).
Інші прийнятні способи введення нуклеотидних послідовностей в рослинні клітини включають мікроін'єкції, як описано, наприклад, Сто55мау еї аї!. (1986) Віоїесппіднев5 4:320-334, електропорацію, як описано, наприклад, Кіддз еї аІ. (1986) Ргос. Маї!. Асад. с О5А 83: 5602- 5606, трансформацію, опосередковану агробактеріями, як описано, наприклад, Томпзепа еї аї., патент США Мо 5,563,055, 7пао єї аї., патент США Мо 5,981,840, безпосередній перенос гена, як описано, наприклад, в Раб52Кому:кКі еї аІ. (1984) ЕМВО 3. 3:2717-2722, та балістичне прискорення частинок, як описано в, наприклад, патентах США МоМо 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; та 5,932,782; Тотев еї а. (1995) "Оігесї ОМА Ттапвіег іпіо Іпіасі Ріапі СеїЇє міа МісгоргоіЇесійе
Вотбрагатенпі, " в Ріапі СеїІ, Тізвие, апа Огдап Сийиге: Гипдатепіа! МеїШтоа», еа. сатрогд апа
РАийШір5 (Зргіпдег-Мепад, Вепіп); МеСаре єї аїЇ. (1988) Віоїесппоіоду 6:923-926); та І ей їапетоптайоп (МО 00/28058). Крім того, дивіться, Ууеїззіпдег еї аї.,, (1988) Апп. Кеу. Сепеї. 22:421-477; Запога еї аї, (1987) Рапісціайе бсієпсе апа Тесппоіоду 5:27-37 (цибуля); Спгівіои еї аї, (1988) Ріапі РНузіо!. 87: 671-674 (соя); МсСарбе еї аї., (1988) ВіоЛесппоіоду 6:923-926 (соя);
Еіпег апа МеМиїеп (1991) Іп Міго Сеї! Оєм. ВіоІ. 27Р: 175-182 (соя); Зіпой еї аї, (1998) Тпеог.
Аррі. Сепеї. 96: 319-324 (соя); бана еї аї., (1990) Віоїесппоіоду 8: 736-740 (рис); Кіеїп еї аї., (1988) РМАБ5, 85:4305-4309 (кукурудза); Ківєїп єї аї., (1988) Віоїесппоіоду 6:559-563 (кукурудза); патентах США МоМо 5,240,855; 5,322,783; та 5,324,646; Тотез еї аї., (1995) "рігесї ОМА Тгапетег іпто Іпіасі Ріапі СеїІ5 міа Місгоргоїеснйе Вотбвагатепі, " іп Ріапі Сеї!Ї, Тізвиє, апа Огдап Сипиге:
Еппдатепаї! Меїнодв», єд. Сатбого (Зргіпдег-Мепад, Вепіп) (кукурудза); Кіеїп еї аї., (1988) Ріапі
РпузіоІ. 91:440-444 (кукурудза); Еготт еї аї., (1990) ВіоїесппоІоду 8: 833-839 (кукурудза);
Ноосукааз-Мап Зіодієгеп еї аї., (1984) Майшге (Гопаоп) 31 1:763-764; Вомжеп еї аї, патенті США Ме 5,736,369 (злакові); Вугебієг еї аї, (1987) РМАБЗ 84: 5345-5349 (І асеає); Оє МУ/еї сеї а!., (1985) іп
ТНне Ехрегітепіа! Мапіршіайоп ої Омціе Тізвйцез, вед. Спартап еї аї, ( опдтап, Мем Мо), рр. 197- 209 (пилкові); Каеррієг еї аї., (1990) Ріапі Сеї! Веропів 9:415-418 та Каерріег еї аї., (1992) Тпеог.
Арри Сепеї. 84: 560-566 (волосково-опосередкована трансформація); О'Наїчніп еї аї., (1992)
Ріапі Сеї! 4: 1495-1505 (електропорація); Гі еї а!., (1993) Ріапі СеїІ Керогі5 12:250-255 та СНгівіои апа Рога (1995) Аппаї5 ої Воїапу 75:407-413 (рис); О5|ода єї аї, (1996) Маїиге ВіоїесппоІоду 14:745-750 (кукурудза за допомогою пухлиноутворюючих агробактерій); кожна з який є включеною в даний документ у вигляді посилання.
Трансгенні рослини, в тому числі трансгенні сільськогосподарські культури рослин, переважно отримують за допомогою трансформації, опосередкованої агробактеріями.
Переважний спосіб трансформації представляє собою трансформацію в польових умовах. З цією метою можливим є, наприклад, дозволити агробактеріям діяти на насіння рослин або інокулювати меристеми рослин за допомогою агробактерій Особливо доцільним відповідно до даного винаходу, є дозволити суспензії трансформованих агробактерій діяти на інтактну рослину або, щонайменше, на зачатки квіток. Рослину потім вирощують до тих пір, поки не отримують насіння обробленої рослини (Сіоцдп апа Вепі, Ріапі -). (1998) 16, 735-743). Способи трансформації рису, опосередкованої агробактеріями, включають добре відомі способи трансформації рису, такі як ті, які описані в будь-якому з наступних джерел: заявка на європейський патент ЕР 1198985 А1, АІдетіа апа Ноддез (Ріапіа 199: 612-617, 1996); СНнап єї аІ. (Ріапі Мої Віо! 22 (3): 491-506, 1993), Нієї еї аї. (Ріапі 9 6 (2): 271-282, 1994), описи яких включені у вигляді посилання в даний документ, так, якби були повністю викладені. У випадку трансформації кукурудзи, переважний спосіб є таким, як описано в будь-якому з наступних джерел ІзПпіда еї аї. (Маї. Віотесппої 14(6): 745-50, 1996) або Егате еї аї!. (Ріапі Ріувзіої! 129(1): 13- 22, 2002), описи яких включені у вигляді посилання в даний документ так, якби були повністю викладені. Зазначені способи, крім того, описані як приклади в В. Уепез еї аї., Тесппідоев5 ог бо Сепе Тгтапвіетг, іп: Тгапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпд апа ії2айноп, едв5. 5.0. Кипд апа В. Уи,
Асадетіс Ргез5 (1993) 128-143 та в Роїгуки5 Аппи. Кем. Ріапі Рпузіо!. Ріапі Моїес. Віо!ї. 42 (1991) 205-225). Нуклеїнові кислоти або конструкт, що експресуються, є переважно клонованими в вектор, який є прийнятним для трансформування пухлиноутворюючих агробактерій, наприклад рВіп19 (Вемап еї аї., МисіІ. Асід5 Ке5. 12 (1984) 8711). Агробактерії трансформовані таким вектором можуть бути використані у відомому способі для трансформації рослин, таких як рослини, які використовуються як моделі, наприклад, арабідопсис (Агабідорбві5 Ійаійапа в межах обсягу представленого винаходу, не розглядається як сільськогосподарська культурна рослина), або сільськогосподарські культурні рослини, такі як, наприклад, рослини тютюну, наприклад, занурюючи синці листя або рубані листя в агробактеріальний розчин, а потім культивуючи їх в прийнятному середовищі. Трансформація рослин за допомогою пухлиноутворюючих агробактерій є описаними, наприклад, Ноїдеп та УМШптй»ег в Мисі. Асіа Вев. (1988) 16, 9877 або є відомими серед іншого з Р.Р. М/пйе, Месіоге Тог Сепе Тгапеїег іп Нідпег
Ріапів; іп Тгтапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпуд апа Ші2айоп, едв. 5.0. Кипд апа В. Ум, Асадетіс
Ргез5, 1993, рр. 15-38.
Один із способів трансформації, відомих фахівцям в даній галузі, є занурення квітучих рослин в розчин агробактерій, в якому агробактерії містять нуклеїнову кислоту ТгіА, з подальшим розведенням трансформованих гамет. Трансформація рослин, опосередкована агробактеріями, може бути здійснена з використанням, наприклад, 5МУ3101 (рРМРОО) (Копсл та
Зепеїї, 1986, Мої. Сеп. Сепеї. 204:383-396) або штаму пухлиноутворюючих агробактерій
І ВА4404 (СіІопіесі). Трансформація може бути здійснена з використанням стандартних методик трансформації та регенерації (Оебіаєге еї аїІ., 1994, Мисі. Асіа5. Ке5. 13:4777-4788; Се/міп,
Зіапіоп В. апа 5спіїрегоогі, Нове А, Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду Мапиаї, 2па Еа. - Оогагесні: Кіимег
Асадетіс Рибі., 1995. - іп бесі., Віпдрис 7епігаіє бідпаїшг: ВТ11-Р ІЗВМ 0-7923-2731-4; СІЇсК,
Ветага ВА. апа Тпотрзоп, Чдопп Е., Меїнподв іп Ріапі МоїІесшаг Віоіоду апа Віоїесппоіоду, Воса
Ваюп: САС Ргезз, 1993 360 5., ІЗВМ 0-8493-5164-2). Наприклад, насінина ріпака може бути трансформованої за допомогою трансформації сім'ядолі або гіпокотиля (Моіопеу еї аї., 1989,
Ріапі Се Верой 8:238-242; Ое ВіоскК єї аїЇ., 1989, Ріапі РНузіо!ї. 91:694-701). Використання антибіотиків для агробактерій та селекція рослин залежить від бінарного вектора та штаму агробактерій, який використовувався для трансформації. Селекція насіння ріпаку зазвичай виконується з використанням канаміцину як маркера рослин, прийнятного для селекції.
Перенесення генів льону, опосередковане агробактеріями, може бути здійснено з використанням, наприклад, методики, описаної Міупагома еї а!., 1994, Ріапі Сеї! Вероп 13: 282- 285. Крім того, трансформація сої може бути здійснена з використанням, наприклад, методики, описаної в європейському патенті Мо 0424 047, патенті США Мо 5,322,783, Європейському патенті Мо 0397 687, патенті США Мо 5,376,543, або патенті США Мо 5,169,770. Трансформація кукурудзи може бути досягнута шляхом бомбардування частинками, опосередковане ДНК захоплення поліетиленгліколю, або за допомогою методик з волокнами карбіду кремнію. (Дивіться, наприклад, Егееїїпуд апа Умаїрої "Тне таїге НнНапароок" Зрііпдег Мепад: Мем Хогк (1993)
ІЗВМ 3-540-97826-7). Конкретний приклад трансформації кукурудзи знайдений в патенті США Мо 5,990,387, та конкретний приклад трансформації пшениці можна знайти в заявці РСТ Мо УМО 93/07256.
В деяких варіантах здійснення, полінуклеотиди за представленим винаходом можуть бути введені в рослини шляхом контактування рослин з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Як правило, такі способи включають в себе включення полінуклеотидного конструкта за винаходом в межах молекули вірусної ДНК або РНК. Визнаним є те, що поліпептиди за можуть бути спочатку синтезовані як частина вірусного поліпротеїну, який згодом може бути оброблений з використанням протеолізу іп мімо або іп міго з отриманням бажаного рекомбінантного поліпептида. Крім того, визнаним є те, що промотори за винаходом також включають промотори, які використовуються для транскрипції з використанням вірусної
РНК полімерази. Способи введення полінуклеотидних конструктів в рослинах та експресії протеїну, кодованого в ньому, за участю молекул вірусних ДНК або РНК, є відомими в даній галузі. Дивіться, наприклад, патенти США МоМо 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 та 5,316,931; які включені в даний документ у вигляді посилання. Клітини, які були трансформовані, можуть бути вирощені в рослинах відповідно до традиційних способів.
Дивіться, наприклад, МеСогтіск еї аї. (1986) Ріапі СеїІ Керогі5 5: 81-84. Дані рослини можуть потім бути вирощені, та або запилені тим самим трансформованим штамом або іншими штамами, та ідентифікують одержаний в результаті гібрид, який має конститутивну експресію бажаної фенотипічної особливості. Два або більше поколінь можуть бути вирощені, щоб гарантувати, що експресія бажаної фенотипічної особливості стабільно зберігається та
Зб успадковується, а потім досягалось зібране насіння, щоб забезпечити експресію бажаної фенотипічної особливості.
Представлений винахід може використовуватись для трансформації будь-яких видів рослин, в тому числі, але не обмежуючись лише ними, однодольних та дводольних. Приклади видів рослин, що викликають зацікавленість, включають, але не обмежуються ними, кукурудзу або маїс (2еа таух), Вгазвіса 5р. (наприклад, В. пари», В. гара, В. |ипсеа), особливо ті види капусти, які використовуються як джерело рослинної олії, люцерну (Меадісадо заїїма), рис (Огуа заїма), жито (ЗесаїІе сегеаІє), сорго (Зогупит бБісоїог, Зогупит миїЇдаге), просо, наприклад, просо американське (Реппізеїшт діаийсит), просо звичайне (Рапісшт тійасецт), могар (зеїагіа йаїїіса), пальчате просо (ЕІеизіпе согасапа), соняшник (Неїїапіпи5 Аппи), сафлор (Саппатизг (іпсіогіи5), пшеницю (Тгйісит аевзіїмит, Т. Тигдійит 55р. дигит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місомпапа
ІїІабасит), картоплю (Боїагішт їибрегозицт), арахіс (Агаспіх Ппуродаєа), бавовник (Со55урійт раградепзе, (зо55урішт Пігиішт), солодку картоплю (Іротоеа бБаїа(ш5), маніок (Мапіпої езсціепіа), каву (Соїїєа 5рр.), кокос (Сосоз5 писітега), ананас (Апапа5 сотозив5), цитрусові дерева (Сйги5 5рр.), какао (ТПеобгота сасао), чай (СатейЦа 5іпеп5іб), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 савзіса), гуава (Рзіаїшт диаізама), манго (Мапоїїега іпаїіса), олія (ОЇІєа еигораєа), папайя (Сагіса рарауа), кешью (Апасагаїшт оссідепіаве), макадамії (Масадатіа іптедгігоїйа), мигдаль (Ргипи5 атудаайв5), цукрові буряки (Веїа уцідагібє), цукрову тростину (Засспагит 5рр.), овес, ячмінь, овочі, декоративні рослини, та хвойні дерева. Переважно, рослини за представленим винаходом представляють собою сільськогосподарські культурні рослини (наприклад, соняшник, Вгаз5іса 5р., бавовник, цукровий буряк, соя, арахіс, люцерна, сафлор, тютюн, кукурудза, рис, пшениця, жито, ячмінь, тритікале, сорго, просо, тощо).
На додаток до трансформації, соматичні клітини, які потім повинні бути регенеровані в інтактні рослини, також можливим є трансформувати в клітини рослинних меристем та, зокрема, в ті клітини, які розвиваються в гамети. В цьому випадку трансформовані гамети прямують за розвитком природних рослин, породжуючи трансгенні рослини. Таким чином, наприклад, насіння арабідопсиса обробляють агробактеріями, та насіння отримують з рослин, які розвиваються, певна частина яких є трансформованою та таким чином трансгенною
ІБеідтап, КА апа Магк5 МО (1987). Мої! Сеп Сепеї 208:274-289; Беідтапп К (1992). Іп: С Копсл,
М-Н Спа апа у 5пеїІ, дв, Меїйодз іп Агарідорвзі5 Незеагсй. УМога 5сієпійіс, Зіпдароге, рр. 274- 289). Альтернативні способи грунтуються на повторному видаленні суцвіть та інкубування сайта висічення в центрі розетки з трансформованими агробактеріями, таким чином, трансформоване насіння також може бути отримане в більш пізній момент часу (Спапа (1994). РіІапі 9. 5: 551-558;
Каїаміс (1994). Мої Сеп Сепеї, 245: 363-370). Проте, особливо ефективним способом є спосіб вакуумної інфільтрації з його модифікацією, наприклад, спосіб "квітковий провал". У випадку вакуумної інфільтрації арабідопсиса, інтактні рослини обробляють агробактеріальною суспензією при зниженому тиску (І(ВеспїпоЇЯ, М (1993). СК Асай 5Зсі Рагіз І Ше зсі, 316: 1 194-1 199), в той час як у випадку способу "занурення квіткових бруньок" квіткові тканини, які розвиваються, коротко інкубують з обробленою поверхнево-активною речовиною агробактеріальною суспензією (Сіоцди, 5У апа Вепі АЕ (1998) Те Ріапі .). 16, 735-743). Деяку частину трансгенного насіння збирають в обох випадках, та це насіння можна відрізнити від нетрансгенного насіння шляхом вирощування в селективних умовах, описаних вище. Крім того, стабільна трансформація пластид має переваги, тому що пластиди, які материнські успадковуються, є в більшості культур, що зменшує або усуває ризик передачі трансгенів через пилок. Трансформація геному хлоропласта, як правило, досягається за допомогою способу, який був схематично зображено в Кіаи5 еї а!І., 2004 |Маїшге Віоїесппоіоду 22 (2), 225-229).
Коротко кажучи, послідовності, які повинні бути трансформованими, клонують разом з вибираним маркерним геном між фланкуючими послідовностями, гомологічними геному хлоропласта. Дані гомологічні фланкуючі послідовності безпосередньо сайт-специфічно інтегровані в пластому. Пластидну трансформацію було описано для багатьох різних видів рослин, а також огляд наведено в Воск (2001) Тгапздепіс ріабіцазвз іп Бабхіс гезеагоп апа ріапі
БіоїесппоЇІоду. У Мої! ВіоІї. 2001 Зер 21; 312 (3):425-38 або Маїїда, Р (2003) Ргодге55 улагав5 соттегсіаїі2айоп ої ріавій ігапетоптаїйоп їесппоіоду. Тгтепаз Віоїеснпої. 21, 20-28. Подальший біотехнологічний прогрес, як було недавно повідомлено, у вигляді маркерних вільних пластид трансформантів, які можуть бути отримані за допомогою перехідного спільно інтегрованого ген- мейкера (Кіаи5 еї аї.,, 2004, Маїшге Віоїесппоїоду 22(2), 225-229). Генетично модифіковані рослинні клітини можуть бути регенеровані за допомогою всіх способів, які є відомими кваліфікованим фахівцям. Відповідні способи можна знайти в зазначених вище публікаціях 5.0.
Кипа апа Кк. УМи, Роїгуки5 або Ноїдеп апа УМіПШтйгег.
Як правило, після трансформації, рослинні клітини або клітинні угруповання вибираються за наявністю одного або більше маркерів, які кодуються здатними до експресії генами рослини, які спільно перенесені з геном, який викликає зацікавленість, після чого трансформований матеріал регенерують в цілу рослину. Для вибору трансформованих рослин, рослинний матеріал, отриманий в процесі трансформації, як правило, піддають селективним умовам так, що трансформовані рослини можна відрізнити від нетрансформованих рослин. Наприклад, насіння, отримане в описаному вище порядку, може бути висаджено та, після початкового періоду вегетації, піддають відповідному відбору з використанням розпилення. Ще одна можливість полягає у вирощуванні насіння, при необхідності, після стерилізації, на чашках з агаром з використанням відповідного агенту відбору, таким чином, що тільки трансформоване насіння може вирости в рослини. Альтернативно, трансформовані піддають скринінгу на присутність селективних маркерів, таких як описані вище.
Після перенесення ДНК та регенерації, передбачувано трансформовані рослини також можуть бути оцінені, наприклад, за допомогою Саузерн-аналізу, на наявність гену, який викликає зацікавленість, число копій та/або геномну організацію. Альтернативно або додатково, рівні експресії знову введеної ДНК можуть контролюватися за допомогою нозерн та/або вестерн-аналізу, обидві методики добре відомі фахівцям, які мають звичайну кваліфікацію в даній галузі.
Сформовані трансформовані рослини можуть бути розмножені різними способами, наприклад, шляхом клонального розмноження або класичними методами селекції. Наприклад, перше покоління (або Т1) трансформованої рослини може бути самозапилене та вибрані гомозиготні трансформанти другого покоління (або 12), та Т2 рослини потім можуть бути додатково розмножені за допомогою класичних методів селекції. Сформовані трансформовані організми можуть набувати різних форм. Наприклад, вони можуть бути химерами трансформованими клітинами та нетрансформованими клітинами; клональними трансформантами (наприклад, всі трансформовані клітини містять касети експресії); трансплантати трансформованих та нетрансформованих тканин (наприклад, в рослинах, трансформованих кореневищах, прищеплених до нетрансформованого пагона).
Переважно, експресія нуклеїнової кислоти в рослині в результаті призводить до підвищеної
Зо резистентності рослини до гербіциду в порівнянні з сортом немутантного типу рослинної клітини.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується рослини, яка містить рослинну клітину відповідно до представленого винаходу, де експресія нуклеїнової кислоти в рослині в результаті призводить до підвищеної резистентності рослини до гербіциду в порівнянні з сортом немутантного типу рослинної клітини.
Рослини, описані в даному документі, можуть представляти собою або трансгенні культурні рослини або нетрансгенні рослини.
На додаток до загального визначення, зазначене ЗиРКА, "трансгенний", "трансген" або "рекомбінантний" означає по відношенню до, наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти, касети експресії, генного конструкта або вектора, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, або організму трансформованого з послідовностями нуклеїнових кислот, касетами експресії або векторами відповідно до винаходу, всі дані конструкти зроблені рекомбінантними способами, в яких або (а) послідовності нуклеїнових кислот, які кодують протеїни, використовуються в способах за винаходом, або (Б) генетична(ї) контрольна(ї) послідовність(ності), яка(ї) функціонально зв'язана(ї) з послідовністю нуклеїнової кислоти, відповідно до винаходу, наприклад, промотором, або (с) а) та Б) не перебувають в їх природному генетичному середовищі або модифіковані рекомбінантними способами, причому можливою є модифікація, щоб прийняти форму, наприклад, заміщення, додавання, делеції, інверсії або вставки одного або декількох нуклеотидних залишків з метою дозволити експресію мутантного ТгіА за представленим винаходом. Під природним генетичним середовищем розуміється природний геномний або хромосомний локус у вихідній рослині або наявність в геномній бібліотеці. У випадку геномної бібліотеки, послідовність нуклеїнової кислоти природного генетичного середовища, переважно зберігається, щонайменше, частково. Середовище фланкує послідовність нуклеїнової кислоти, щонайменше, з однієї сторони, та має довжину послідовності, рівну щонайменше 50 пар основ, переважно щонайменше 500 пар основ, особливо переважно, щонайменше, 1000 пар основ, найбільш переважно, щонайменше, 5000 пар основ. Касета експресії, яка зустрічається в бо природі - наприклад, комбінація, яка зустрічається в природі, послідовностей нуклеїнових кислот природного промотора, з відповідною послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, застосовуваний в способах за представленим винаходом, як визначено вище, - стає трансгенного касетою експресії, коли дана касета експресії модифікується неприродними, синтетичними ("штучними") методами, такими як, наприклад, методи мутагенної обробки.
Відповідні способи описані, наприклад, в патенті США Мо 5,565,350 або МО 00/15815.
Таким чином, під трансгенними рослинами, для цілей винаходу, розуміють такі, як зазначені вище, де нуклеїнові кислоти за винаходом, знаходяться не в їх природному локусу в геномі зазначеної рослини, причому можливими є нуклеїнові кислоти, які експресуються гомологічно або гетерологічно. Проте, як згадувалося, трансгенний також означає те, що, в той час як нуклеїнові кислоти, відповідно до винаходу або використані в способі за винаходом, знаходяться в їх природному положенні в геномі рослини, послідовність була модифікованою щодо природної послідовності, та/або, що регуляторні послідовності природних послідовностей були модифікованими. Під трансгенними переважно розуміють експресію нуклеїнових кислот відповідно до винаходом в неприродному локусі в геномі, тобто відбувається гомологічна або, переважно, гетерологічна експресія нуклеїнових кислот. Переважно, в даному документі згадуються трансгенні рослини. Крім того, термін "трансгенний" відноситься до будь-якої рослини, рослинної клітини, калусу, рослинної тканини або частини рослини, яка містить всі або частину щонайменше одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках, весь або частина рекомбінантного полінуклеотиду стабільно інтегрують в хромосому або стабільний екстрахромосомний елемент, таким чином, що він передається до наступних поколінь. Для цілей винаходу термін "рекомбінантний полінуклеотид" відноситься до полінуклеотиду, який був змінений, перебудований, або модифікований за допомогою генної інженерії. Приклади включають будь-який клонований полінуклеотид або полінуклеотиди, які зв'язані або з'єднані з гетерологічними послідовностями. Термін "рекомбінантний" не відноситься до альтерацій полінуклеотидів, які є результатом природних явищ, таких, як спонтанні мутації, або неспонтанний мутагенез з подальшим селекційним розведенням. "Алелі" або "алельні варіанти" є альтернативними формами даного гена, розташовані в тому ж самому хромосомному положенні. Алельні варіанти включають одиночні нуклеотидні поліморфізми (ЗМР), а також невеликі вставки/видалення поліморфізмів (ІМОЕ). Розмір ІМОЕГ,
Зо як правило, становить менше, ніж 100 пар основ. ЗМР та ІМОЕГ утворюють найбільший набір варіантів послідовностей з поліморфних штамів, які зустрічаються в природі, більшості організмів.
Термін "сорт" означає групу рослин у межах одного виду, визначеного шляхом спільного використання загального набору характеристик або ознак, які приймаються кваліфікованими фахівцям в даній галузі як, достатній, щоб відрізнити один виведений сорт або сорт, від іншого виведеного сорту або сорту. До даного терміну не є включеним те, що всі рослини будь-якого виведеного сорту або сорту будуть генетично ідентичними або весь ген або молекулярний рівень або що будь-яка дана рослина буде гомозиготною за всіма локусами. Виведений сорт або сорт вважається "здатним надавати ознаку потомству" за конкретною ознакою, якщо, коли при самозапиленні чисто сортового виведеного сорту або сорту, все потомство містить ознаку.
Терміни "лінія схрещування" або "лінія" відносяться до групи рослин в межах одного виведеного сорту, визначеного спільним загальним набором характеристик або ознак, які приймаються кваліфікованим фахівцем в даній галузі як, достатньої для розрізнення однієї лінії схрещування або лінії від іншої лінії схрещування або лінії. До даного терміну не є включеним те, що всі рослини будь-якої конкретної лінії схрещування або лінії будуть генетично ідентичними або на всьому гені або на молекулярному рівні або, що будь-яка дана рослина буде гомозиготною за всіма локусами. Лінія схрещування або лінія вважається "здатною надавати ознаку потомству за конкретною ознакою, якщо, коли при самозапиленні чисто сортової лінії схрещування або лінії схрещування, все потомство містить ознаку. В представленому винаході, ознака виникає через мутації в гені ТА рослини або насінини.
Стійкі до гербіцидів рослини за винаходом, які містять полінуклеотиди, які кодують мутантний поліпептид ТгіА, також знаходять застосування в способах підвищення стійкості рослини до гербіцидів за допомогою традиційної селекції рослин за участю статевого розмноження. Способи включають схрещення першої рослини, яка є стійкою до гербіцидів, за винаходом, з другою рослиною, яка може бути або може не бути стійкою до того ж гербіциду або гербіцидів, як і перша рослина, або можуть бути стійкі до іншого гербіциду або гербіцидів, ніж перша рослина. Друга рослина може представляти собою будь-яку рослину, яка є здатною виробляти життєздатне рослинне потомство (тобто насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Як правило, але не обов'язково, перша та друга рослини є одного і того ж виду. 60 Способи можуть необов'язково включати в себе селекцію рослин-нащадків, які містять мутантний поліпептид ТА першої рослини та характеристики стійкості до гербіцидів другої рослини. Потомство рослин, отриманих за даним способом за представленим винаходом, мають підвищену резистентність до гербіциду в порівнянні з першою або другою рослиною або обома рослинами. Коли перша та друга рослини є стійкими до різних гербіцидів, потомство рослин будуть мати комбіновані характеристики резистентності до гербіцидів першої та другої рослин. Способи за винаходом можуть додатково включати одне або декілька поколінь зворотного схрещування потомства рослин першого схрещування з рослиною тієї ж лінії генотип першої або другої рослини. Альтернативно, потомство першого схрещування або будь- якого подальшого схрещування, може бути схрещене з третьою рослиною, яка має інші лінії або генотип, ніж перша або друга рослини.
Представлений винахід також передбачає рослини, органи рослин, тканини рослин, клітини рослин, насіння, та нелюдські клітини-господарі, які є трансформованими, щонайменше, з однією полінуклеотидною молекулою, касетою експресії, або вектором трансформації за винаходом. Такі трансформовані рослини, рослинні органи, тканини рослин, клітини рослин, насіння, та нелюдські клітини-господарі, мають підвищену стійкість або резистентність до щонайменше одного гербіциду, при рівнях гербіциду, які знищують або пригнічують ріст нетрансформованої рослини, рослинної тканини, рослинної клітини, або нелюдської клітини- господаря, відповідно. Переважно, трансформованими рослинами, рослинними тканинами, клітинами рослин, а також насінням за винаходом є арабідопсис та сільськогосподарські рослини.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується насінини, отриманої з використанням трансгенної рослини, яка містить рослинну клітину за представленим винаходом, де насінина представляє собою справжнє схрещування для підвищеної резистентності до гербіциду в порівнянні з сортом немутантного типу насінини.
В інших аспектах, рослини резистентні до гербіциду за представленим винаходом можуть бути використані як донорні лінії характеристик, резистентних до гербіцидів, для розвитку як за традиційним схрещуванням рослин, для виведення інших сортових та/або гібридних культур, які містять таку ознаку або ознаки. Всі такі отримані в результаті сорти або гібриди сільськогосподарських культур, які містять спадкові ознаки резистентності до гербіцидів, або
Зо ознаки можуть бути названі в даному документі як потомство або нащадок, лінікій) резистентних до гербіцидів.
В інших варіантах здійснення, представлений винахід передбачає спосіб отримання рослини, резистентної до гербіциду. Спосіб включає: схрещування першої рослини, резистентної до гербіциду з другою рослиною для виведення нащадка рослини резистентної до гербіцидів, в якому перша рослина та нащадок рослини містять, щонайменше, деякі з їх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, причому рекомбінантний полінуклеотид є ефективним в клітинах першої рослини для експресії мутантного поліпептиду ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТтіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
Застосовуватись може традиційне схрещення рослини, при якому вводиться ознака резистентності до гербіцидів потомству рослини, в результаті отриманому з неї. В одному варіанті здійснення, представлений винахід передбачає спосіб отримання потомства рослини з резистентністю до гербіцидів, де спосіб включає: схрещування батьківської рослини з рослиною, резистентною до гербіциду, для введення характеристик стійкості до гербіциду рослини, резистентної до гербіциду, в зародкову плазму потомства рослини, причому у потомства рослини підвищується стійкість до гербіцидів по відношенню до батьківської рослини.
В інших варіантах здійснення, спосіб додатково включає стадію інтогресування характеристик стійкості до гербіциду, застосовуючи традиційні способи схрещення рослини для того, щоб отримати рослину-нащадок, яка має характеристики стійкості до гербіциду.
В інших аспектах, рослини за винаходом включають ті рослини, які, на додаток до резистентність до гербіцидів, які інгібують біосинтез целюлози, були піддані подальшим генетичним модифікаціям шляхом схрещення, мутагенезу або генної інженерії, наприклад, була надана резистентність до застосування певних інших класів гербіцидів, таких як інгібітори
АНА5Б; ауксинові гербіциди; відбілюючі гербіциди, такі як інгібітори гідроксифенілпіруват діоксигенази (НРРОБ) або інгібітори фітоендесатурази (РОЗ); інгібітори ЕР5РЗ, такі як гліфосат; інгібітори глутамінсинтетази (55), такі як глюфосинат; інгібітори біосинтезу ліпідів, такі як ацетил-СоА-карбоксилази (інгібітори АССази); або оксиніл (тобто бромоксиніл або іоксиніл) гербіциди, в результаті традиційних методів селекції або генної інженерії. Таким чином, рослини резистентні до гербіциду за винаходом можуть бути зроблені стійкими до окремих класів 60 гербіцидів за допомогою множинних генетичних модифікацій, наприклад, резистентність як до гліфосату, так і глюфосинату, або як до гліфосату, так і гербіциду з іншого класу, такого як інгібітори НРРО, інгібітори АНАФ, або інгібітори АСсСази. Дані технології стійкості до гербіцидів є, наприклад, описаними Ре5ї Мападетепі Зсіепсе (том, рік, сторінка): 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Меєй 5сівепсе 57, 2009, 108; А!й:ігаійап Одошигпаї ої Адгісийига! Кезеагсп 58, 2007, 708; Зсіепсе 316, 2007, 1185; та посилання, які в них вказані. Наприклад, рослини резистентні до гербіциду за винаходом, в деяких варіантах здійснення, можуть бути резистентними до інгібіторів АССази, таких як "діми"
Інаприклад, ціклоксидім, сетоксидім, клетодім, або тепралоксидім), "фопи" «наприклад, клодінафоп, діклофоп, флуазифоп, галоксіфоп або хізалофоп), та "дени" (такі як піноксаден); до ауксинових гербіцидів, таких як дікамба; до інгібіторів ЕРБР5, такі як гліфосат; до інших інгібіторів біосинтезу целюлози; та до інгібіторів 55, такі як глюфосинат.
На додаток до даних класів інгібіторів, рослини, резистентні до гербіцидів за винаходом також можуть бути резистентними до гербіцидів, які мають інші способи дії, наприклад, інгібітори хлорофілу/каротиноїдного пігменту, руйнівники клітинних мембран, інгібітори фотосинтезу, інгібітори клітинного ділення, інгібітори коренів, інгібітори пагонів, та їх комбінації.
Наприклад, такі ознаки стійкості можуть бути експресовані: як мутантні або немутантного типу протеїни НРРО, як мутантні або немутантного типу протеїни РРО, як мутантні протеїни
АНАБІ, мутантні АССабзе протеїни, мутантні ЕРБРО протеїни або мутантні протеїни глутамінсинтетази; або як мутантна нативна, інбредна або трансгенна арилоксіалканоатдіоксигеназа (ААО або ОНТ), галогенарилнітрилаза (ВХМ), дегалогеназа 2,2- дихлорпропионової кислоти (ОЕН), гліфосат-М-ацетилтрансфераза (САТ), гліросатдекарбоксилаза (50), гліфосат оксидоредуктаза (СОХ), глутатюн-5-трансфераза (517), фосфінотрицинацетилтрансфераза (РАТ або раг), або СУР450 протеїни, які мають активність щодо розкладання гербіциду. Рослини, резистентні до гербіцидів за винаходом також можуть накопичуватися з іншими ознаками в тому числі, але не обмежуючись цим, пестицидні ознаки, такі як ВІ Сгу та інші протеїни, які мають пестицидну активність по відношенню до жуків, лускокрилих, нематод, або інших шкідників; харчові або нутрицевтичні риси, такі як модифікований склад олії або ознак профілю олії, з високим вмістом протеїну або з високою концентрацією амінокислот, а також інших типів ознак, відомих в даній галузі.
Крім того, в інших варіантах здійснення, рослини, резистентні до гербіцидів є також охоплені тим, що, з використанням методів рекомбінантної ДНК та/або шляхом селекції та/або іншим чином вибраних для таких характеристик, що надають здатність синтезувати один або більше інсектицидних протеїнів, особливо тих, які відомі з бактеріальних родів Васійн5, зокрема, Васійи5
Тпигіпдіепві5х, такі як Ідельта|-ендотоксини, наприклад, СтгуїА(Б), СтгуїіА(с), СтуІР, СтуІК(аг),
СтУПА(В), СтуПША, СтУПІВ(ЬІ) або Стгу9бс; вегетативні інсектицидні протеїни (МІР), наприклад, МІР,
МІР2, МІРЗ або МІРЗА; інсектицидні протеїни бактерій, які колонізують нематод, наприклад,
РПоїогпардив 5рр. або Хепогпарадив5 5рр.; токсини, які продукуються тваринами, такими як скорпіонові токсини, токсини павукоподібних, токсини ос або інші нейротоксини, специфічні щодо комах; токсини, які продукуються грибами, такими, як токсини стрептоміцетів; рослинні лектини, такі як лектини гороху або ячменю; аглютиніни; інгібітори протеїназ, такі як інгібітори трипсину, інгібітори серинових протеаз, інгібітори пататіну, цістатину або папаїну; рибосома- інактивуючі протеїни (КІР), такі як рицин, маїс-КІР, абріна, луфін, сапорин або бріодин; стероїдні ферменти метаболізму, такі як З-гідрокси-стероїд-оксидази, екдистероїдвмісні ІЮР- глікозил-трансфераза, холестериноксидази, інгібітори екдізону НМО- або СоА-редуктази; антагоністи іонів, такі як блокатори натрієвих або кальцієвих каналів; ювенільний гормон естерази; рецептори сечогінних гормонів (рецептор гелікокініну); стильбенсинтаза, бібензилсинтаза, хітиназа або глюканаза. У контексті за представленим винаходом дані інсектицидні протеїни або токсини слід розуміти спеціально також як пре-токсини, гібридні протеїни, усічені або іншим чином модифіковані протеїни. Гібридні протеїни характеризуються новою комбінацією протеїнових доменів, (дивіться, наприклад, УМО 02/015701). Подальші приклади таких токсинів або генетично модифікованих рослин, здатних синтезувати такі токсини, розкриті, наприклад, в ЕР-А 374 753, УМО 93/007278, МО 95/34656, ЕР-А 427 529, ЕР-А 451 878, МО 03/18810 па УМО 03/52073. Способи отримання таких генетично модифікованих рослин, як правило, є відомими кваліфікованим фахівцям в даній галузі та описані, наприклад, в зазначених вище публікаціях. Дані інсектицидні протеїни, які містяться в генетично модифікованих рослинах надають рослинам, які виробляють ці протеїни резистентність до шкідників з усіх таксономічних груп членистоногих, особливо жуків (Соеїіоріега), двокрилих (Пірієга), та молі (І ерідоріега) та до нематод (Метаїйода).
В деяких варіантах здійснення, експресія одного або декількох протеїнових токсинів бо (наприклад, інсектицидних протеїнів) в рослинах, резистентних до гербіцидів, є ефективною для боротьби з організмами, які включають, наприклад, члени класів та порядків: жорсткокрилі, такі як американський бобу довгоносик Асапіпозсеїїде5 обіесіи5; листоїди Адеїавіїса аїпі; щелкунів (Адгіоге5 Імпеайив5, Адгіоїез орз5сиги5, Адгіоїе5 Бісоїог); зернових жуків Апазмеги5 адмепа; хрущ червневий АтрпПітаййоп з5оїЇ5ійіайб; меблевий жук Апобрішт рипсіайшт; Апійопотив5 5рр. (довгоносики); бурякова крихітка Аютагіа І іпеагіє; килимові жуки (Апіпйгепи5 5рр., АНадепи5 5рр.); чотирьохплямистий зерноїд Саїозобгиспи5 тасціаїєх; сухофруктова блищанка
Сагроріийи5 Петіріеги5; ріпаковий прихованохоботник насіннєвий Сешогпупспи5 аввітіїїв; хрестоцвітний прихованохоботник Сешогпупспив5 рісйагеіє; клопики Соподеги5 мезрегпіпи» і
Соподегив Таїїї; чорний довгоносик Созтороїйев5 5огаїйи5; новозеландський трав'яний жук
Совіеїуїга 7еаіапаійсах; хрущ блискучий зелений Соїіпіз пйіда; соняшниковий довгоносик
Суїїпагосоріиги5 адерегзиб5; шинковий шкіроїд Юегтевіез Іагаагіиє; кукурудзяні жуки діабротика
Ріабгоїїса мігдітега, Оіарбгоїїса мігдітега мігудіїега і Оіабгоїїса Брагбегі; мексиканський бобовий жук
Ерйасипа магімевіїє; вусач хатній сірий НуїЇоїгоре5 Ба|ши5; люцерновий довгоносик Нурега робіїса; блискучий притвірник (зірбішт рохуПоіїдеє; тютюновий жук Іавзіодегта зеггісоте; колорадський жук Герііпоїагза аесептіїпеаїа; каптурник Гусіиз 5рр, ріпаковий квіткоїд Меїїдеїйев аепеци5; хрущ травневий МеїіоЇопіпа МепІоіопіпа; американський притвірник Мегішт атегісапит; золотий притвірник Міріи5 ПооІеиса; зернові жуки Огугаерпйи5 5игіпатеп5ві5 і Огугаерпіїи5
Мегсаїог; скосар борозенчастий Оїогпупспи5 зицісайш5; гірчичний жук Рпаєдоп соспПіеагіає, хрестоцвітна блішка РПуїоїгеїа сгисітегає; виїмчаста блішка Рпуоїгеїа 5ігіоіаза; ріпакова блішка
Рзуїйодев спгузосерпаїа; Ріїпи5 5рр. (притворяшки); зерновий точильник КПігорегійа аотіпіса; бульбочковий смугастий довгоносик 5йопа Ііпеаїши5; довгоносики рисові та комірний Зйорпіи5 огулає та Зйорпйи5 дгапагіеє; соняшниковий довгоносик бітісгопух їіми5; хлібний точильник
Зіедобішт рапісешт; хрущак борошняний Тепебгіо тоїйог, хрущаки булавовусий та борошняний
Тпроїїшт сазіапешт та Тгіроїшт сопіизит; капрові та кабінетні жуки (Ттододепта 5РР); листоїд амброзієвий 7удодгатта ехсіатаїцйіопіє; Юегптаріега (щипавки), такі як вуховертка звичайна
Еогіїсцшіа ашйгісціагіа і вуховертка прибережна Іарідига гірагіа;х тарганоподібні такі як тарган чорний Віаца огієпіаїїє; парникова багатоніжка Охідив5 дгасіїїє; бурякова муха Редотуїа бБеїає; шведська вівсяна муха Озсіпеїйа їі; дрозофіла (Оасив 5рр., Ого5зорпййа 5рр.); Ізорієга (терміти), включаючи види Нодоїегтіїдає, КаЇоїептйідає, Мазіоїептійдає, ВНіпоїептійдає, Зептіептпійаає,
Зо Тептпйідає, Теппорвзідає; клоп польовий ГГ удих Іпеоїай5; чорна попелиця бобова Арпі5 Табає; попелиця бавовняна або попелиця баштанна Арпйі5 доззурії; попелиця зелена яблунева Арпіб роті; шипувата чорна білокрилка АІеигосапійиз» 5ріпітеги5; белокрилка тютюнова Ветевіа їабасі; попелиця капустяна Вгемісогупе ргаззісає; листоблішка грушева Сасорзуїа ругісоіа; попелиця смородинова Сгуріотуи5 гіріє; виноградна філоксера Бакішіозрпаїга міїйоїйає; листоблішка цитрусова Оіарйогіпа Сійгі; цикадка картопляна Етроазса їТарае; цикадка бобова Етроазса боЇїапа; цикадка виноградна Етроавбса мій; попелиці кров'яна яблунева Епозота Іапідегит; акацієва несправжня щитівка Ешесапішт согпії попелиця запилена сливова Нуаїоріеги5 агипаїпіє; цикадка темна ГІ асдеІрпах зігіа?ФеПйи5; попелиця картопляна Масгозірпит еирпогбіає; зелена персикова попелиця Муи5 регзісае; цикадка зелена Мерпоїейіх сіпіїсер5; дельфацид коричневий Міїарагмаїа Ішдеп5; хмельова попелиця РІіогодоп Питиїї; черемхова попелиця
Кпора!Іозірпит раді; велика злакова попелиця ЗйобБіоп амепає; лускокрилі, такі як Адохорпуев5
Огапа (листокрутка сітчаста); Агопір5 родапа (листокрутка всеїдна); Виссціаїгіх ругімогеНПа (мушка мінуюча грушева); Виссціаїйгіх Іпигрегівйа (мінер бавовни); ВираїЇи5 ріпіагіиє (сосновий п'ядун);
Сагросарха ротопеїїа (плодожерка); Спіо з5ирргеззаїї5 (огнівка жовта рисова); СПогізіопешцга
Типтіїегапа (ялинова листокрутка); Соспуїїє Нозре5 (метелик кохіліда); Оіайаєа дгапаїіозейПа (огнівка кукурудзяна південно-західна); Еороесіїйа атбіднейПа (Листокрутка дволітна); Неїїсомегра аппідега (бавовняна совка); Неїїсомегра 76еа (бавовняна совка); Неїйоїйі5 мігезсеп5 (совка),
Нотеозота еїесіеПишт (соняшникова міль); Нотопа тадпапіта (листокрутка чайна); І КпосоїПеїів ріапсагаейа (литоколлетис яблуневий); І утапігіа дізраг (непарний шовкопряд); МаЇіасохзхота пеизігіа (коконопряд кільчастий); Матезіга Бгаззісаеє (совка капустяна); Матезвіга сопіїдигаса (совка латукова); Орегорпйега Бгитайа (п'ядун зимовий); Об5ігіпіа пибіїаійв5 (кукурудзяний метелик), Рапоїї5 Паттеа (совка соснова), Рпуїоспівіі5 сігеПа (цитрусовий мінер); Рієгі5 бгазвзіса (капусниця); Каспіріизіа Мі (соєва совка); бЗродорієга ехідча (буряк аптужопп); Зродорієга
ІЩЖогаїїє (єгипетська бавовна совка); ЗуІеріа дегодаїа (бавовняна листокрутка); Тгіспоріивіа пі (совка); Оппоріега, такі, як цвіркун домвий Аспеїа Ротезіїси5, сарана (Апасгідійт 5РР.), сарана перелітна Госизіа тідгайфгіа, смугастий коник МеїІапоріи5 БріміЧаси5, відмітний коник МеїІапоріи5 айегепііай5, червононогий коник МеїЇапоріи5 Тептиггибгит, мігруючий коника Меїапоріи5 запдиіпіре5, північна капустянка Меосигійа пехадесіуїа, червона сарана Мотадасгіб5 зеріетгіазсіаФа, капустянка короткокрила Зсаріегізсиб5 арбгеміайв5, південна капустянка бо зсаріегізсив рогеїіїї, руда капустянка Зсаріегізсив5 місіпиз та пустельна сарана 5спізіосегса дгедагіа; Зутрпуїа, такі як скутигерелла Зсціїдегейа іттасцшіага; Тпузапоріега, таких як тютюновий трипс ЕгапкіїпівіНа тизса, квітковий трипс ЕгапкіїпіеНа іпіопза, західний квітковий трипс
ЕгапкКіїпіеійа Оссідепіайбт, томатний трипс ЕгапкКіїпіенма 5спийлеї, декоративний трипс
Негсіпоїйгір5 Тетогаїй5, що соєвий трипс МеопудаїцоїПгір5 магіабій5, цитрусовий трипс Келлі
Регоїпгір5 КеПуапи5, авокадовий трипс Зсіпоїпгір5 регзеає, динний трипс ТПгір5 раїті та цибулевий трипс ТПгір5 їарасі; тощо, та їх комбінації, що містять один або декілька з вищезазначених організмів.
В деяких варіантах здійснення, експресія одного або декількох протеїнових токсинів (наприклад, інсектицидних протеїни) в рослинах, резистентних до гербіцидів є ефективною для контролю блішок, тобто членів родини блішок, родини листоїдів, переважно проти РПпуїПоїгеїа 5рр., таких як РПуїоїгега сгисітегаеє та/або РПуїоїгеїа ігіоіаїа. В інших варіантах здійснення, експресія одного або декількох протеїнових токсинів (наприклад, інсектицидних протеїнів) в рослинах, резистентних до гербіцидів є ефективною для боротьби з ріпаковим або насіннєвим прихованохоботником, совкою буро-сірою садовою, клопом трав'яним, або капустяною міллю.
Крім того, в одному з варіантів здійснення, рослини, резистентні до гербіцидів, охоплюють такі, які є, наприклад, виведеними використанням методів рекомбінантної ДНК, та/або шляхом селекції, та/або іншим чином вибрані для таких властивостей, що здатні синтезувати один або декілька протеїнів, для збільшення стійкості або резистентності цих рослин до бактеріальних, вірусних або грибкових патогенів.
Способи отримання таких генетично модифікованих рослин, як правило, відомі фахівцям в даній галузі техніки.
Крім того, в іншому варіанті здійснення, рослини, резистентні до гербіцидів, охоплюють такі, які є, наприклад, виведеними з використанням методів рекомбінантної ДНК, та/або шляхом селекції, та/або іншим чином вибрані для таких властивостей, що здатні синтезувати один або декілька протеїнів, щоб збільшити продуктивність (наприклад, вміст олії), резистентність до посухи, засоленості або інших чинників навколишнього середовища, які обмежують ріст, або резистентність до шкідників та грибків, бактеріальних або вірусних патогенів цих рослин.
Крім того, в інших варіантах здійснення, рослини, резистентні до гербіцидів, охоплюють такі, які є, наприклад, виведеними з використанням методів рекомбінантної ДНК, та/або шляхом
Зо селекції, талабо іншим чином вибрані для зміни таких властивостей, щоб утримувати модифіковану кількість однієї або декількох речовин або нових речовин, наприклад, для покращення харчування людини або тварини, наприклад олійних культур, які виробляють довголанцюжкові омега-3 жирні кислоти або ненасичені омега-9 жирні кислоти, які зміцнюють здоров'я (наприклад, Мехега(К) гаре, Оом Адго зЗсіепсе5, Сапада).
Крім того, в деяких варіантах здійснення, рослини, резистентні до гербіцидів, охоплюють такі, які є, наприклад, виведеними з використанням методів рекомбінантної ДНК, та/або шляхом селекції, та/або іншим чином вибрані для зміни таких властивостей, щоб містити підвищену кількість вітамінів, та/або мінералів, та/або покращені профілі нутрицевтичних речовин.
В одному варіанті здійснення, рослини резистентні до гербіциду за представленим винаходом, по відношенню до немутантного типу рослини, включають підвищену кількість, або покращений профіль, сполуки, вибраної з групи, яка складається з: глюкозинолатів (наприклад, глюкорафанін (4-метилсульфінілбутил-глюкосинолату), сульфорафану, З-індолілметил- глюкосинолатів (глюкобрассиціну), 1-метоксі-3-індолілметил-глюкозинолатів (неоглюкобрассиціну)); фенольних сполук (наприклад, флавоноїдів (наприклад, кверцетину, кемпферолу), похідних гідроксиціннамоіїлу (наприклад, 1,2,2'- трисинапоілгенциобіози, 1,2- диферулоілгенциобіози, 1,2-дисинапоіл-2-ферулоілгенциобіози, 3-О-кавоілхінної (неохлорогенної кислоти)), а також вітамінів та мінералів (наприклад, вітаміну С, вітаміну Е, каротину, фолієвої кислоти, нікотинової кислоти, рибофлавіну, тіаміну, кальцію, заліза, магнію, калію, селена та цинка).
В іншому варіанті здійснення, рослини резистентні до гербіциду за представленим винаходом, по відношенню до немутантного типу рослини, включають підвищену кількість, або покращений профіль, сполуки, вибраної з групи, яка складається з: прогоїтрину; ізотіоціанатів; індолів (продуктів гідролізу глюкозинолатів); глутатіону; каротиноїдів, таких як бета-каротин, лікопін, та ксантофілових каротиноїдів, таких як лютеїн та зеаксантин; фенольних сполук, що містять флавоноїди, таких як флавоноли (наприклад, кверцетин, рутин), флавани/дубильні речовини (такі як проціанідини, які містять кумарин, проантоціанідини, катехіни та антоціани); флавонів; фітоестрогенів, таких як куместани, лігнани, ресвератрол, ізофлавони, наприклад, генистеїн, даїдзеін та гліцитеїн; лактонів резорцилової кислоти; органічних сірковмісних сполук; фітостеринів; терпеноїдів, таких як карнозол, бо розмаринова кислота, гліциризин та сапоніни; хлорофілу; хлорофіліну, цукрів, антоціанів, та ваніліну. В інших варіантах здійснення, рослини резистентні до гербіциду за представленим винаходом, по відношенню до немутантного типу рослини, включають підвищену кількість, або покращений профіль, сполуки, вибраної з групи, яка складається з: вінкристину, вінбластину, таксанів (наприклад, таксолу (паклітакселу), баккатину І, 10-дезацетилбаккатину ПП, 10- дезацетилтаксолу, ксилозилтаксолу, 7-епітаксолу, 7-епібаккатину І, 10- дезацетилцефаломаніну, 7-епіцефаломаніну, таксотеру, цефаломанніну, ксилозилцефаломаніну, таксагіфін, 8-бензоілокситаксагіфіну, 9-ацетілоксітаксуліну, 9- гідрокситаксуліну, тайванксаму, таксану та, таксану 1р, таксану 14, таксану 1494, СМР паклітакселу, 9-дигідро-13-ацетілбаккатину Ії, 10-дезацетіл-7-епітаксолу, тетрагідроканнабінолу (ТНО), канабідіолу (СВО), генистеїіну, дайдзеїну, кодеїну, морфіну, хініну, шиконіну, аймалицину, серпентину, тощо.
В інших аспектах, передбаченим є спосіб обробки рослини за представленим винаходом.
В деяких варіантах здійснення, спосіб включає контактування рослини з агрономічно прийнятною композицією. В одному варіанті здійснення, агрономічно прийнятна композиція включає ауксиновий гербіцид А. І.
В іншому аспекті, представлений винахід передбачає спосіб отримання насіння-нащадка.
Спосіб включає посадку насіння або здатної до продукування рослини за представленим винаходом. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає вирощування рослини- нащадка з насінини; та збір насінини-нащадка з рослини-нащадка. В інших варіантах здійснення, спосіб додатково включає застосування гербіцидів, гербіцидної композиції до рослини-нащадка.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується прийнятних до збору частин трансгенної рослини відповідно до представленого винаходу. Переважно, прийнятні до збору частини включають ТтіА нуклеїнову кислоту або ТтіА протеїн за представленим винаходом. Прийнятні до збору частин можуть представляти собою насіння, коріння, листя та/або квітки, які містять ТА нуклеїнову кислоту або ТгіА протеїн або їх частини. Переважні частини соєвих рослин представляють собою соєві боби, які містять ТгіА нуклеїнову кислоту або ТгіА протеїн.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується продуктів отриманих з трансгенної рослина відповідно до представленого винаходу, її частин або прийнятних до збору її частин.
Зо Переважний рослинний продукт є кормом, шротом, олією або насінням у вигляді обробленого насіння з покриттям. Переважно, їжа та/або олії містять ТгіА нуклеїнові кислоти або ТгіА протеїни.
В іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу виготовлення продукту, де спосіб включає: а) вирощування рослин за винаходом або які можуть отримувати, застосовуючи способи за винаходом та р) отримання зазначеного продукту з або застосовуючи рослини за винаходом та/або їх частини, наприклад, насіння даних рослин.
В ще одному варіанті здійснення спосіб включає наступні стадії: а) вирощування рослин за винаходом, р) видалення прийнятних до збору частин, як визначено вище, з рослин, та с) отримання зазначеного продукту з або застосовуючи прийнятні до збору частин за винаходом.
Продукт може бути отриманий на місці, де рослина вирощується, рослини та/або їх частини можуть бути видалені з місця, де рослини були вирощені, для виробництва продукту. Як правило, рослина вирощується, бажані прийнятні для заготовки частини видаляються з рослин, якщо це можливо, в повторюваних циклах, та продукт отримують з прийнятних для заготовки частин рослини. Стадія росту рослин може бути виконана тільки одноразово кожен раз, коли виконуються способи за винаходом, в той же час дозволяючи повторювані за період часу стадії виробництва продукту, наприклад, шляхом повторного видалення прийнятних для заготовки частин рослин згідно з винаходом, та за необхідності подальшої обробки даних частин, щоб прийти до продукту. Також можливим є те, що стадія вирощування рослин згідно з даним винаходом повторюється, та рослини або прийнятні для заготовки частини зберігаються до тих пір, поки виробництво продукту не буде здійснюватись один раз для накопичених рослин або частин рослин. Крім того, стадії вирощування рослин та виробництва продукту можуть виконуватися з перекриттям в часі, навіть, у великій мірі, одночасно або послідовно. Зазвичай, рослини вирощують протягом деякого часу до того, як продукт виробляється.
В одному варіанті здійснення продукти, отримані за зазначеними способами за винаходом представляють собою рослинні продукти, такі як, але не обмежуються цим, продукти 60 харчування, кормові продукти, харчові добавки, кормові добавки, волокна, косметичні та/або фармацевтичні препарати. Продукти харчування розглядаються як композиції, використовувані для харчування та/або для доповнення харчування. Кормові продукти для тварин та кормові добавки, зокрема, розглядаються як продукти харчування.
В іншому варіанті здійснення способи за винаходом для виробництва використовуються для отримання сільськогосподарської продукції, такої як, але не обмежується цим, рослинні екстракти, протеїни, амінокислоти, вуглеводи, жири, олії, полімери, вітаміни, тощо.
Можливим є те, що рослинний продукт, в значній мірі, складається з одного або більше сільськогосподарських продуктів.
Гербіциди
Як описано вище, представлений винахід передбачає нуклеїнові кислоти, поліпептиди, які надають стійкість рослинам до сполук/ гербіцидів, які перешкоджають або інгібують біосинтез клітинної стінки (целюлози).
Приклади гербіцидів, які можуть бути застосовуваними відповідно до представленого винаходу, тобто до яких рослини відповідно до представленого винаходу є стійкими / резистентними, представляють собою сполуки, відомі кваліфікованим фахівцям в даній галузі, як азини. Приклади азинів, які метаболізуються мутантним поліпептидом ТгіАб, за представленим винаходом є описаними детально в наступних патентних заявках, представлені в наступній таблиці 2.
Таблиця 2
Номер заявки/міжнародне посилання;
Структурна формула номер публікації з В"
МЕ я
ОМ !
А РСТ/ЕР2014/065092 ще м РЕ75365; УХО2015/007711 ; ! чо Сторінки 2-7, рядок 21
Арки В
М "д М
М М и
ХК мм ЕР 14162309.0 і РЕ76068; М/О2015/144881 ; З Сторінка 3, рядок 4 - сторінка 5, нн В рядок З бемокод а вч
М М М
М
РЕ І
Х ше ок
В бу ї се
ЕР 14163356.0 а РЕ76069; МО2015/150541
А, я у ще
М М М
Н ще
М х
А
Ве - М і ЕР 14163742.1 й | а РЕ766357О2015/155129
А шк т те, - Кк
БУ М ве Кк Ух х ї
Кк І ре що
М М й В
ЕР 14163743.9 . -й РЕ76636; ЕР2930174
Ат и я М ок Ко ж с ! М
Є
Кк. І (А З й в п ШИ і ЕР 14165565.4 од й і ве РЕ768577МО2015/162166 пд Км як Кк ь я у їх Ж Ж ж М .-к в! М х
ПВ куту я я я . ЕР 14165624.9 РЕ76888; го у КО МОг015/162169 ша НН ! дж йо ія «В З ; що
В ме
К А. т ем ЕР 14164431.0 РЕ76890;
Її й й Й . УХО2015/155271 т - ее І А х в"
ГИ ки а ке о й У 7 ч М ! з А В
Кк К в
М Б ; бе Я Вш ЕР 14164434.4 и од і
І Ї Ї 7 р РЕ76930; УУО2015/155272
Й й ооню у Б . В . й Ки у М сх К ї с Кк і"
Вк й М
В М
З кр Гжно М
Бен че і до ша м ЕР 14164433.6 і | | РЕ77027; МО2015/155273
А лох Л зі їх З 15 і я я
Приклади переважних гербіцидів, які можуть використовуватися відповідно до представленого винаходу, представляють собою азини, які мають формулу (1).
В,
Ще йо В і д ТУ у и
А м Те в Бе М КЕ
Я М в якій
А представляє собою феніл, який є заміщеним від двох до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», С1-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, С2-Св-алкенілу,
С2-Св-галогеналкенілу, С2-Св-алкінілу, Сі-Св-галогеналкінілу, ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (Сі-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св-алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (Сі-Св-алкокси)карбонілу;
В' Н, СМ, С:-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкоксі-Сі-Св-алкіл, Сі--Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл, (Сі-Св-алкіл)усульфоніл або фенілсульфоніл, де феніл є незаміщеним або заміщеним від одного до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу та Сі-Св-алкокси;
В2 Н, галоген, СМ, С--Св-алкіл, Сі-Свє-галогеналкіл, С2-Св-алкеніл, Сз-Св-алкініл, Сз-Св- циклоалкіл, Сз-Св-циклоалкеніл, ОН, Сі-Св-алкокси або Сі-Св-алкоксі-С1-Св-алкіл;
ВЗ Н, галоген, СМ, С1-Св-алкіл, Сі--Св-галогеналкіл або Сі-Св-алкокси;
ВН, галоген, СМ, С1-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; або
ВЗ та КЕ" разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з карбонілу, Сг2-Св-алкенілу, Сз-Св-циклоалкілу, Сз-Св- циклоалкенілу та від трьох до шести -членного гетероциклілу, де Сз-Св-циклоалкіл, Сз-Св- циклоалкеніл, або три - шести --ленний гетероцикліл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та Сі-Св-алкокси; та
А» Н, СМ, С:-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкоксі-Сі-Св-алкіл, Сі--Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл, (Сі-Св-алкіл)усульфоніл або фенілсульфоніл, де феніл є незаміщеним або заміщеним від одного до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу та Сі-Св-алкокси; включаючи їх сільськогосподарсько прийнятні солі або М-оксиди.
Переважно представлений винахід передбачає азини формули (І), в якій
А представляє собою 2-фторфеніл, який є заміщеним від одного до чотирьох замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», С1-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН,
Сі-Св-алкокси, С1-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу та (Сі-Св-алкокси)карбонілу;
В' Н, СМ, С:-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкоксі-Сі-Св-алкіл, Сі--Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл, (Сі-Св-алкіл)усульфоніл або фенілсульфоніл, де феніл є незаміщеним або заміщеним від одного до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу та Сі-Св-алкокси;
В2 Н, галоген, СМ, С--Св-алкіл, Сі-Свє-галогеналкіл, С2-Св-алкеніл, Сз-Св-алкініл, Сз-Св- циклоалкіл, Сз-Св-циклоалкеніл, ОН, Сі-Св-алкокси або Сі-Св-алкоксі-С1-Св-алкіл;
ВЗ Н, галоген, СМ, Сі-Св-алкіл, Сі-Све-галогеналкіл або Сі-Св-алкокси;
В" Н, галоген, СМ, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; або
ВЗ та КЕ" разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з карбонілу, С2-Св-алкенілу, Сз-Св-циклоалкілу, Сз-Св- циклоалкенілу та від трьох до шести членного гетероциклілу, де Сз-Св-циклоалкіл, Сз-Све-циклоалкеніл або та від трьох до шести членний гетероцикліл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св- алкілу та Сі-Св-алкокси; та
А» Н, СМ, С:-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкокси-С1-Св-алкіл, Сі-Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл, (Сі-Св-алкіл)усульфоніл або фенілсульфоніл, де феніл є незаміщеним або заміщеним від одного до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу та Сі-Св-алкокси; включаючи їх сільськогосподарсько прийнятні солі або М-оксиди.
Корисними для представленого винаходу є також агрохімічні композиції, які містять, щонайменше, один з азинів формули (І) та стандартні допоміжні речовини для формулювання захисних агентів для сільськогосподарських культур.
Представлений винахід також передбачає застосування азинів формули (І) як гербіцидів, тобто для контролювання шкідливих рослин.
Якщо азини формули (І), як описано в даному документі, є здатними до утворення геометричних ізомерів, наприклад Е/7 ізомерів, то можливим є застосування обох, чистих ізомерів та їх сумішей, в композиції відповідно до винаходу. Якщо азини формули (І), як описано в даному документі, мають один або більше центрів хіральності та, як наслідок, є присутніми як енантіомери або діастереомери, можливим є застосування обох, чистих енантіомерів та діастереомерів та їх сумішей, в композиції відповідно до винаходу.
Якщо азини формули (І), як описано в даному документі, мають здатні до іонізації функціональні групи, вони також можуть застосовуватися у вигляді їх сільськогосподарсько прийнятних солей. Прийнятними є, загалом, солі таких катіонів та кислотно-адитивні солі тих кислот, чиї катіони та аніони, відповідно, не демонструють негативного ефекту на активність активних сполук.
Зо Переважні катіони представляють собою іони лужних металів, переважно літію, натрію та калію, лужноземельних металів, переважно кальцію та магнію, та перехідних металів, переважно марганцю, міді, цинку та заліза, крім того, амонію та заміщеного амонію, де від одного до чотирьох атомів водню є заміщеними на Сі-С--алкіл, гідроксі-Сі-Са-алкіл, С1-С4- алкоксі-Сі-Са-алкіл, гідроксі-С1-С--алкоксі-Сі-Са-алкіл, феніл або бензил, переважно амонію, метиламонію, ізопропіламонію, диметиламонію, діізопропіламонію, триметиламонію, гептиламонію, додециламонію, тетрадециламонію, тетраметиламонію, тетраетиламонію, тетрабутиламонію, 2-гідроксіетиламонію (оламінова сіль), 2-(2-гідроксіет-1-оксі)ет-1-іламонію (дигліколамінова сіль), ди(2-гідроксіет-1-іллуамонію (діоламінова сіль), три(2-гідроксіетил)уамонію (троламінова сіль), три(2-гідроксипропіл)яамонію, бензилтриметиламонію, бензилтриєетиламонію,
М, М,М-триметилетаноламонію (холінова сіль), крім того іони фосфонію, іони сульфонію, переважно три(С1-С4-алкіл)усульфонію, такі як триметилсульфонію, та іони сульфоксонію, переважно три(С1-С4-алкіл)усульфоксонію, та на завершення солі поліосновних амінів, такі як М,
М-біс-(З-амінопропіл)метиламін та діетилентриамін.
Аніони використовуваних кислотно-адитивних солей представляють собою в першу чергу хлорид, бромід, фторид, йодид, гідросульфат, метилсульфат, сульфат, дигідрофосфат, гідрофосфат, нітрат, бікарбонат, карбонат, гексафторсилікат, гексафторфосфат, бензоат та також аніони Сі-С--алканових кислот, переважно форміат, ацетат, пропіонат та бутират.
Органічні фрагменти, зазначені у визначені змінних, наприклад, від К' до ЕК», є -аналогічно до терміну галоген - загальними термінами для конкретних зазначень конкретних членів групи.
Термін галоген означає в кожному випадку фтор, хлор, бром або йод. Всі вуглеводневі ланцюги, тобто всі алкільні, галогеналкільні, алкенільні, алкінільні, алкокси, алкілтіо, алкілсульфінільні, алкілсульфонільні, (алкіл)аміно, ді(алкілламіно ланцюги можуть представляти собою лінійний ланцюг або розгалужений ланцюг, де префікс Си-Ст в кожному випадку означає можливу кількість атомів вуглецю в групі.
Прикладами таких значень є: - Сі-С.-алкіл: наприклад СН», СеН5, н-пропіл, СН(СНЗз)г2, н-бутил, СН(СНз)-СеаН5, СН--СН(СНЗ)2 та С(СнНЗ)з; - Сі-Св-алкіл та також Сі-Св-алкільні фрагменти (С1і-Св-алкіл)укарбонілу, Сі-Св-алкокси-С1-Св- алкілу: Сі-Сл--алкіл як зазначено вище, та також, наприклад, н-пентил, 1-метилбутил, 2- 60 метилбутил, З-метилбутил, 2,2-диметилпропіл, 1-етилпропіл, н-гексил, 1,1-диметил пропіл, 1,2-
диметилпропіл, 1-метилпентил, 2-метилпентил, З-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1- диметилбутил, 1,2-ди метил бутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил,
З,З-диметилбутил, 1-етилбутил, 2-етилбутил, 1,1,2-триметилпропіл, 1,2,2-триметилпропіл, 1- етил-1-метил пропіл або 1-етил-2-метилпропіл, переважно метил, етил, н-пропіл, 1-метилетил, н-бутил, 1,1-диметилетил, н-пентил або н-гексил; - С.-С.-галогеналкіл: Сі-С--алкільний радикал, як зазначено вище, який є частково або повністю заміщеним фтором, хлором, бромом та/або йодом, наприклад, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлорфторметил, дихлорфторметил, хлордифторметил, бромметил, йодметил, 2-фторетил, 2-хлоретил, 2- брометил, 2-йодетил, 2,2-дифторетил, 2,2,2-трифторетил, 2-хлор-2-фторетил, 2-хлор-2,2- дифторетил, 2,2-дихлор-2-фторетил, 2,2,2-трихлоретил, пентафторетил, 2-фторпропіл, 3- фторпропіл, 2,2-дифторпропіл, 2,3-дифторпропіл, 2-хлорпропіл, З-хлорпропіл, 2,3-дихлорпропіл, 2-бромпропіл, З-бромпропіл, 3,3,3-трифторпропіл, 3,3,3-трихлорпропіл, 2,2,3,3,3- пентафторпропіл, гептафторпропіл, 1-(фторметил)-2-фторетил, 1-(хлорметил)-2-хлоретил, 1- (бромметил)-2-брометил, 4-фторбутил, 4-хлорбутил, 4-бромбутил, нонафторбутил, 1,1,2,2,- тетрафторетил та 1-трифторметил-1,2,2,2-тетрафторетил; - Сі-Св-галогеналкіл: Сі-С--галогеналкіл, як зазначено вище, та також, наприклад, 5- фторпентил, 5-хлорпентил, 5-бромпентил, 5-йодпентил, ундекафторпентил, 6б-фторгексил, 6- хлоргексил, б-бромгексил, 6-йодгексил та додекафторгексил; - Сз-Св-циклоалкіл: моноциклічні насичені вуглеводні, які мають від З до 6 кільцевих членів, такі як циклопропіл, циклобутил, циклопентил та циклогексил; - Со-Св-алкеніл: наприклад етеніл, 1-пропеніл, 2-пропеніл, 1-метилетеніл, 1-бутеніл, 2- бутеніл, З-бутеніл, 1-метил-1-пропеніл, 2-метил-1-пропеніл, 1-метил-2-пропеніл, 2-метил-2- пропеніл, 1-пентеніл, 2-пентеніл, З-пентеніл, 4-пентеніл, 1-метил-1-бутеніл, 2-метил-1-бутеніл,
З-метил-1-бутеніл, 1-метил-2-бутеніл, 2-метил-2-бутеніл, З-метил-2-бутеніл, 1-метил-З-бутеніл, 2-метил-З-бутеніл, З-метил-З-бутеніл, 1,1-диметил-2-пропеніл, 1,2-диметил-1-пропеніл, 1,2- диметил-2-пропеніл, 1-етил-і-пропеніл, 1-етил-2-пропеніл, 1-гексеніл, 2-гексеніл, З-гексеніл, 4- гексеніл, 5-гексеніл, 1-метил-1-пентеніл, 2-метил-і-пентеніл, 3-метил-1-пентеніл, 4-метил-1- пентеніл, 1-метил-2-пентеніл, 2-метил-2-пентеніл, 3-метил-2-пентеніл, 4-метил-2-пентеніл, 1- метил-З-пентеніл, 2-метил-З-пентеніл, З-метил-З-пентеніл, 4-метил-З-пентеніл, 1-метил-4- пентеніл, 2-метил-4-пентеніл, З-метил-4-пентеніл, 4-метил-4-пентеніл, 1,1-диметил-2-бутеніл, 1,1-диметил-З-бутеніл, 1,2-диметил-1-бутеніл, 1,2-диметил-2-бутеніл, 1,2-диметил-З-бутеніл, 1,3-диметил-1-бутеніл, 1,3-диметил-2-бутеніл, 1,3-диметил-З-бутеніл, 2,2-диметил-З-бутеніл, 2,3-диметил-1-бутеніл, 2,3-диметил-2-бутеніл, 2,3-диметил-З-бутеніл, 3,3-диметил-1-бутеніл,
З,3-диметил-2-бутеніл, 1-етил-1-бутеніл, 1-етил-2-бутеніл, 1-етил-3-бутеніл, 2-етил-1-бутеніл, 2- етил-2-бутеніл, 2-етил-3-бутеніл, 1,1,2-триметил-2-пропеніл, 1-етил-1-метил-2-пропеніл, 1-етил- 2-метил-1-пропеніл та 1-етил-2-метил-2-пропеніл; - Сз-Св-циклоалкеніл: 1-циклопропеніл, 2-циклопропеніл, 1-циклобутеніл, 2-циклобутеніл, 1- циклопентеніл, 2-циклопентеніл, 1,3-циклопентадіеніл, 1,4-циклопентадіеніл, 2,4- циклопентадіеніл, 1-циклогексеніл, 2-циклогексеніл, З-циклогексеніл, 1,3-циклогексадіеніл, 1,4- циклогексадіеніл, 2,5-циклогексадіеніл; - Сз-Св-алкініл: наприклад 1-пропініл, 2-пропініл, 1-бутиніл, 2-бутиніл, З-бутиніл, 1-метил-2- пропініл, 1-пентиніл, 2-пентиніл, З-пентиніл, 4-пентиніл, 1-метил-2-бутиніл, 1-метил-З-бутиніл, 2- метил-З-бутиніл, З-метил-1-бутиніл, 1,1-диметил-2-пропініл, 1-етил-2-пропініл, 1-гексиніл, 2- гексиніл, З-гексиніл, 4-гексиніл, 5-гексиніл, 1-метил-2-пентиніл, 1-метил-З-пентиніл, 1-метил-4- пентиніл, 2-метил-3-пентиніл, 2-метил-4-пентиніл, З-метил-1-пентиніл, З-метил-4-пентиніл, 4- метил-1-пентиніл, 4-метил-2-пентиніл, 1,1-диметил-2-бутиніл, 1,1-диметил-З-бутиніл, 1,2- диметил-З3-бутиніл, 2,2-диметил-З-бутиніл, 3,3-диметил-1-бутиніл, 1-етил-2-бутиніл, 1-етил-3- бутиніл, 2-етил-З-бутиніл та 1-етил-1-метил-2-пропініл;
БО - Сбі-С--алкокси: наприклад метокси, етокси, пропокси, 1-метилетоксибутокси, 1- метилпропокси, 2-метилпропокси та 1,1-диметилетокси; - Сі-Све-алюкокси та також Сі-Св-алкоксильні фрагменти з (Сі-Св-алкокси)карбонілу, С1-Св- алкокси-Сі-Св-алкілу: Сі-С4--алкокси, як зазначено вище, та також, наприклад, пентокси, 1- метилбутокси, 2-метилбутокси, З-метоксилбутокси, 1,1-диметилпропокси, 1,2-диметилпропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-етилпропокси, гексокси, 1-метилпентокси, 2-метилпентокси, 3- метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметилбутокси, 1,2-диметилбутокси, 1,3- диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3-диметилбутокси, 1-етилбутокси, 2-етилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-триметилпропокси, 1-етил-1-метил пропокси та 1- етил-2-метилпропокси.
- С-С.-алкілтіох наприклад метилтіо, етилтіо, пропілтіо, 1-метилетилтіо, бутилтіо, 1- метилпропілтіо, 2-метилпропілтіо та 1,1-диметилетилтіо; - Сі-Св-алкілтіо: Сі-С--алкілтіо, як зазначено вище, та також, наприклад, пентилтіо, 1- метилбутилтіо, 2-метилбутилтіо, З-метилбутилтіо, 2,2-диметил пропілтіо, 1-етил пропілтіо, гексилтіо, 1,1-диметил пропілтіо, 1,2-диметил пропілтіо, 1-метилпентилтіо, 2-метилпентилтіо, 3- метилпентилтіо, 4-метилпентилтіо, 1,1-диметилбутилтіо, 1,2-диметилбутилтіо, 1,3- диметилбутилтіо0, 2,2-диметилбутилтіо, 2,3-диметилбутилтіо, З3,З3-диметилбутилтіо, 1- етилбутилтіо, 2-етилбутилтіо, 1,1,2-триметилпропілтіо, 1,2,2-триметилпропілтіо, 1-етил-1- метилпропілтіо та 1-етил-2-метилпропілтіо; - Сі-Св-алкілсульфініл о (Сі-Св-алкіл-5(-0)-): 7.8. метилсульфініл, етилсульфініл, пропілсульфініл, 1-метилетилсульфініл, бутилсульфініл, 1-метилпропілсульфініл, (:2- метилпропілсульфініл, 1,1-диметилетилсульфініл, пентилсульфініл, 1-метилбутилсульфініл, 2- метилбутилсульфініл, З-метилбутилсульфініл, 2,2-диметилпропілсульфініл, 1-етил пропілсульфініл, 1,1-диметилпропілсульфініл, 1,2-диметил пропілсульфініл, гексилсульфініл, 1- метилпентилсульфініл, 2-метилпентилсульфініл, З-метилпентилсульфініл, 4- метилпентилсульфініл, 11-диметилбутилсульфініл, 1,2-диметилбутилсульфініл, 1,3- диметилбутилсульфініл, 2,2-диметилбутилсульфініл, 2,3-диметилбутилсульфініл, 3,3- диметилбутилсульфініл, 1-етилбутилсульфініл, 2-етилбутилсульфініл, 1,1,2-триметил пропілсульфініл, 1,2,2-триметилпропілсульфініл, 1-етил-1-метилпропілсульфініл та 1-етил-2- метилпропілсульфініл; - Сі-Св-алкілсульфоніл (С1-Св-алкіл-5(0)2-): наприклад, метил сул ьфоніл, етилсульфоніл, пропілсул ьфоніл, 1-метилетилсульфоніл, бутил сул ьфоніл, 1-метилпропілсульфоніл, 2- метилпропілсульфоніл, 1,1-диметилетилсульфоніл, пентилсульфоніл, 1-метилбутилсул ьфоніл, 2-метилбутилсульфоніл, З-метилбутилсульфоніл, 1,1-диметилпропілсульфоніл, 1,2- диметилпропілсульфоніл, 2,2-диметилпропілсульфоніл, 1-етилпропілсульфоніл, гексилсул ьфоніл, 1-метилпентилсульфоніл, 2-метилпентилсульфоніл, З-метилпентилсульфоніл, 4- метилпентилсульфоніл, 1,1-диметилбутилсульфоніл, 1,2-диметилбутилсульфоніл, 1,3- диметилбутилсульфоніл, 2,2-диметилбутилсульфоніл, 2,3-диметилбутилсульфоніл, 3,3- диметилбутилсульфоніл, 1-етилбутилсульфоніл, 2-етилбутилсульфоніл, 1,1,2-триметил
Зо пропілсул ьфоніл, 1,2,2-триметилпропілсульфоніл, 1-етил-1-метилпропілсульфоніл та 1-етил-2- метилпропілсульфоніл; - (Сі1-С.-алкіллуаміно: наприклад метиламіно, етиламіно, пропіламіно, 1-метилетиламіно, бутиламіно, 1-метилпропіламіно, 2-метилпропіламіно або 1,1-диметилетиламіно; - (Сі-Св-алкіллуаміно: (Сі-С4-алкіламіно), як зазначено вище, та також, наприклад, пентиламіно, 1-метилбутиламіно, 2-метилбутиламіно, З-метилбутиламіно, 2,2- диметилпропіламіно, 1-етилпропіламіно, гексиламіно, 1,1-диметилпропіламіно, 1,2- диметилпропіламіно, 1-метилпентиламіно, 2-метилпентиламіно, З-метилпентиламіно, 4- метилпентиламіно, 1,1-диметилбутиламіно, 1,2-диметилбутиламіно, 1,3-диметилбутиламіно, 2,2-диметилбутиламіно, 2,3-диметилбутиламіно 3,3-диметилбутиламіно, 1-етилбутиламіно, 2- етилбутиламіно, 1,1,2-триметилпропіламіно, 1,2,2-триметилпропіламіно, 1-етил-1-метил пропіламіно або 1-етил-2-метилпропіламіно; - ді(Сі-С--алкілламіно: наприклад М, М-диметиламіно, М, М-діетиламіно, М, М-ди(1- метилетил)аміно, М, М-дипропіламіно, М, М-дибутиламіно, М, М-ди(1-метилпропіл)аміно, М, М- ди(2-метилпропіл)аміно, М, М-ди(1,1-диметилетил)аміно, М-етил-М-метиламіно, М-метил-М- пропіламіно, М-метил-М-(1-метилетил)аміно, М-бутил-М-метиламіно, М-метил-М-(1- метилпропіл)аміно, М-метил-М-(2-метилпропіл)аміно, М-(1,1-диметилетил)-М-метиламіно, М- етил-М-пропіламіно, М-етил-М-(1-метилетил)аміно, М-бутил-М-етиламіно, М-етил-М-(1- метилпропіл)аміно, М-етил-М-(2-метилпропіл)аміно, М-етил-М-(1,1-диметилетил)аміно, -М-(1- метилетил)-М-пропіламіно, М-бутил-М-пропіламіно, /М-(1-метилпропіл)-М-пропіламіно, /- М-(2- метилпропіл)-М-пропіламіно, М-(1,1-диметилетил)-М-пропіламіно, М-бутил-М-(1- метилетил)аміно, М-(1-метилетил)-М-(1-метилпропіл)аміно, М-(1-метилетил)-М-(2- метилпропіл)аміно, М-(1,1-диметилетил)-М-(1-метилетил)аміно, М-бутил-М-(1- метилпропіл)аміно, М-бутил-М-(2-метилпропіл)аміно, М-бутил-М-(1,1-диметилетил)аміно, М-(1- метилпропіл)-М-(2-метилпропіл)аміно, М-(1,1-диметилетил)-М-(1-метилпропіл)аміно або М-(1,1- диметилетил)-М-(2-метилпропіл)аміно; - ді(Сі-Св-алкіл)даміно: ді(Сі-С--алкіллуаміно, як зазначено вище, та також, наприклад, М- метил-М-пентиламіно, М-метил-М-(1-метилбутил)аміно, М-метил-М-(2-метилбутил)аміно, /-М- метил-М-(З-метилбутил)аміно, М-метил-М-(2,2-диметилпропіл)аміно, М-метил-М-(1- етилпропіл)аміно, М-метил-М-гексиламіно, М-метил-М-(1,1-диметилпропіл)аміно, М-метил-М-(1,2- 60 диметилпропіл)аміно, М-метил-М-(1-метилпентил)аміно, М-метил-М-(2-метилпентил)аміно, М-
метил-М-(З-метилпентил)аміно, М-метил-М-(4-метилпентил)аміно, М-метил-М-(1,1- диметилбутил)аміно, М-метил-М-(1,2-диметилбутил)аміно, М-метил-М-(1,3-диметилбутил)аміно,
М-метил-М-(2,2-диметилбутил)аміно, М-метил-М-(2,3-диметилбутил)аміно, М-метил-М-(3,3- диметилбутил)аміно, М-метил-М-(1-етилбутил)аміно, М-метил-М-(2-етилбутил)аміно, М-метил-М- (1,1,2-триметилпропіл)аміно, / М-метил-М-(1,2,2-триметилпропіл)аміно, / М-метил-М-(1-етил-1- метилпропіл)аміно, М-метил-М-(1-етил-2-метилпропіл)аміно, М-етил-М-пентиламіно, М-етил-М- (1-метилбутил)аміно, М-етил-М-(2-метилбутил)аміно, М-етил-М-(З-метилбутил)аміно, М-етил-М- (2,2-диметилпропіл)аміно, М-етил-М-(1-етилпропіл)аміно, М-етил-Мм-гексиламіно, М-етил-М-(1,1- диметилпропіл)аміно, М-етил-М-(1,2-диметилпропіл)аміно, М-етил-М-(1-метилпентил)аміно, М- етил-М-(2-метилпентил)аміно, М-етил-М-(З-метилпентил)аміно, М-етил-М-(4-метилпентил)аміно,
М-етил-М-(1,1-диметилбутил)аміно, М-етил-М-(1,2-диметилбутил)аміно, М-етил-М-(1,3- диметилбутил)аміно, М-етил-М-(2,2-диметилбутил)аміно, М-етил-М-(2,3-диметилбутил)аміно, М- етил-М-(3,3-диметилбутил)аміно, М-етил-М-(1-етилбутил)аміно, М-етил-М-(2-етилбутил)аміно, М- етил-М-(1,1,2-триметилпропіл)аміно, М-етил-М-(1,2,2-триметилпропіл)аміно, М-етил-М-(1-етил-1- метилпропіл)аміно, (М-етил-М-(1-етил-2-метилпропіл)аміно, М-пропіл-М-пентиламіно, М-бутил-М- пентиламіно, М, М-дипентиламіно, М-пропіл-М-гексиламіно, М-бутил-М-гексиламіно, М-пентил-М- гексиламіно або М, М-дигексиламіно; - від трьох до шести членний гетероцикліл: моноциклічний насичений або частково ненасичений вуглеводень, який має від трьох до шести кільцевих членів, як зазначено вище, які, на додаток до атомів вуглецю, містять один або два гетероатоми, вибрані з О, 5 та М; наприклад 2-оксираніл, 2-оксетаніл, З-оксетаніл, 2-азириденіл, З-тієтаніл, 1-азетидиніл, 2- азетидиніл, наприклад 2-тетрагідрофураніл, З-тетрагідрофураніл, 2-тетрагідротієніл, З-тетрагідротієніл, 2-піролідиніл, З-піролідиніл, З-ізоксазолідиніл, 4-ізоксазолідиніл, 5-ізоксазолідиніл, 3- ізотіазолідиніл, 4-ізотіазолідиніл, 5-ізотіазолідиніл, З-піразолідиніл, 4-піразолідиніл, 5- піразолідиніл, 2-оксазолідиніл, 4-оксазолідиніл, 5-оксазолідиніл, 2-тіазолідиніл, 4-тіазолідиніл, 5- тіазолідиніл, 2-імідазолідиніл, 4-імідазолідиніл; наприклад 2,3-дигідрофур-2-іл, 2,3-дигідрофур-3-іл, 2,4-дигідрофур-2-іл, 2,4-дигідрофур-3-іл, 2,3-дигідротієн-2-іл, 2,3-дигідротієн-З-іл, 2,4-дигідротієн-2-іл, 2,4-дигідротієн-З-іл, 4,5- дигідропірол-2-іл, 4,5-дигідропірол-З-іл, 2,5-дигідропірол-2-іл, 2,5-дигідропірол-З-іл, 4,5- дигідроіїзоксазол-З-іл, 2,5-дигідроіїзоксазол-З-іл, 2,3-дигідроїзоксазол-3-іл, 4,5-дигідроізоксазол-4- іл, 2,5-дигідроізоксазол-4-їіл, 2,3-дигідроіїзоксазол-4-іл, 4,5-дигідроізоксазол-5-іл, 2,5- дигідроїзоксазол-5-іл, 2,3-дигідроізоксазол-5-іл, 4,5-дигідроізотіазол-З-іл, 2,5-дигідроізотіазол-3- іл, 2,3-дигідроізотіазол-З-іл, 4,5-дигідроізотіазол-4-іл, 2,5-дигідроізотіазол-4-іл, 2,3- дигідроізотіазол-4-іл, 4,5-дигідроізотіазол-5-іл, 2,5-дигідроіїзотіазол-5-іл, 2,3-дигідроізотіазол-5-іл, 2,3-дигідропіразол-2-іл, 2,3-дигідропіразол-З-іл, 2,3-дигідропіразол-4-іл, 2,3-дигідропіразол-5-іл,
З,4-дигідропіразол-З-іл, 3,4-дигідропіразол-4-іл, 3,4-дигідропіразол-5-іл, 4,5-дигідропіразол-З-іл, 4,5-дигідропіразол-4-іл, 4,5-дигідропіразол-5-іл, 2,3-дигідроїмідазол-2-іл, 2,3-дигідроімідазол-3- іл, 2,3-дигідроімідазол-4-їіл, 2,3-дигідроіїмідазол-5-іл, 4,5-дигідроімідазол-2-іл, 4,5- дигідроіїмідазол-4-іл, 4,5-дигідроіїмідазол-5-іл, 2,5-дигідроіїмідазол-г2-іл, 2,5-дигідроімідазол-4-їіл, 2,5-дигідроімідазол-б-іл, 2,3-дигідрооксазол-З-іл, 2,3-дигідрооксазол-4-іл, 2,3-дигідрооксазол-5- іл, 3,4-дигідрооксазол-З-іл, 3,4-дигідрооксазол-4-іл, 3,4-дигідрооксазол-5-іл, 2,3-дигідротіазол-3- іл, 2,3-дигідротіазол-4-іл, 2,3-дигідротіазол-5-іл, З3,4-дигідротіазол-З-іл, З,4-дигідротіазол-4-їіл,
З,4-дигідротіазол-5-іл, 3,4-дигідротіазол-2-іл, 3,4-дигідротіазол-З-іл, 3,4-дигідротіазол-4-іл; наприклад 2-піперидиніл, З-піперидиніл, 4-піперидиніл, 1,3-діоксан-2-іл, 1,3-діоксан-4-іл, 1,3- діоксан-5-іл, 1,4-діоксан-2-іл, 1,3-дитіан-2-іл, 1,3-дитіан-4-іл, 1,4-дитіан-2-іл, 1,3-дитіан-5-іл, 2- тетрагідропіраніл, З-тетрагідропіраніл, 4-тетрагідропіраніл, 2-тетрагідротіопіраніл, 3- тетрагідротіопіраніл, 4-тетрагідротіопіраніл, З-гексагідропіридазиніл, 4-гексагідропіридазиніл, 2- гексагідропіримідиніл, 4-гексагідропіримідиніл, 5-гексагідропіримідиніл, 2-піперазиніл, тетрагідро-1,3-оксазин-2-іл, тетрагідро-1,3-оксазин-б-іл, 2-морфолініл, З-морфолініл; наприклад 2Н-піран-2-іл, 2Н-піран-З-іл, 2Н-піран-4-іл, 2Н-піран-5-іл, 2Н-піран-б-іл, 3,6- дигідро-2Н-піран-2-іл, 3,6-дигідро-2Н-піран-3-іл, 3,б-дигідро-2Н-піран-4-іл, 3,6б-дигідро-2Н-піран-
Б-іл, 3,6-дигідро-2Н-піран-б-іл, 3,4-дигідро-2Н-піран-З-іл, З3,4-дигідро-2Н-піран-4-іл, 3,4-дигідро- 2Н-піран-6-іл, 2Н-тіопіран-2-іл, 2Н-тіопіран-3-іл, 2Н-тіопіран-4-іл, 2Н-тіопіран-5-іл, 2Н-тіопіран-б- іл, 5,6-дигідро-4Н-1,3-оксазин-2-іл;
Переважні варіанти здійснення за винаходом, зазначені в даному документі нижче, слід розуміти як такі, що є переважними або незалежно один від одного, або в комбінації один з одним.
Відповідно до переважного варіанту здійснення винаходу перевага також надається тим азинам формули (І), де змінні, або незалежно один від одного, або або в комбінації один з одним, мають наступні значення:
Переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою феніл, який є заміщеним від двох до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; особливо переважним є феніл, який є заміщеним від двох до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св -алкілу та Сі-Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, Сі та СМ; особливо переважним є феніл, який є заміщеним від двох до чотирьох замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу,
ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-
Св-алкіл)аміно, ді(С1-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкіл)карбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема, переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та С--
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; більш переважним є феніл, який є заміщеним двома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі-Св-алкокси, С1-Св- алкілтіо, (Сі-Св-алкіл)усульфінілу, (Сі-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1-Св- алкіл)аміно, (Сі-Св-алкіл)карбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ;
Зо також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також більше переважним є феніл, який є заміщеним трьома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св -алкілу, Сі-Свє-галогеналкілу, ОН, С1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також більш переважним є феніл, який є заміщеним чотирма замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ.
Також переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою дет ж ку те
Кк (АЛ) де
Ве та Ке незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МО», Сі-Св-алкіл, С-
Св-галогеналкіл, ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл; та
Ве, В: та КЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, МО», Сч-
Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, ОН, С:і-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (Сі-Св-алкіл)усульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл; зокрема переважні Ка та Ке незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ,
С-Св-алкіл або Сі-Св-алкокси; та
ВР, В: та КЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, МО», Сі-
Св-алкіл, С--Св-галогеналкіл або Сі-Св-алкокси; особливо переважні Кг та Бе незалежно один від одного представляють собою галоген або
СМ; та
ВЕ, В: та ВУ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, С1-Св- алкіл або Сі-Св-алкокси; більш переважні К2г та Ке представляють собою галоген; та
Ве, Ве та ВЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген або СМ; найбільш переважні К: та Кг представляють собою галоген; та
В, Ве та КУ представляють собою водень; також найбільш переважні Ка, ВР, ВУ та ве представляють собою галоген; та
В: - водень; також найбільш переважні Кае, Ве, Ве, ВУ та Ве представляють собою галоген.
Також переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою
В
ВВ и її даю ж це х (А.1) де Кг представляє собою галоген або СМ;
В? та ВЗ представляють собою Н, галоген або СМ;
В: представляє собою Н або галоген;
Зо Ве представляє собою галоген, СМ або С:-Св-алкіл; зокрема переважні Кг представляє собою галоген;
В», Ве та КЗ представляють собою Н або галоген; та КЕ» представляє собою галоген або СМ; особливо переважні Кае, Не, ВУ та Ве представляють собою галоген; та Кг представляє собою
Н або галоген; більш переважні Баг, НЄ, ВУ та Бе представляють собою Е; та В: представляє собою Н або Б.
Особливо переважними є азини формули (І), в якій А є вибраним з групи, яка складається з (А.1.1), (А.1.2) та (А.1.3); більш переважні є вибраними з групи, яка складається з (А.1.2) та (А.1.3); -е В о
В ї г . ї - 4 й В то ей Но ЕЙ КЗ ко ше Е х ша! Го ш о МК сій Й ра
КК НО ж ож
У й їх з що х
КЕ ге ЕК
ГАС АН АОЗ. де
Ве та Ке незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МО», Сі-Св-алкіл, С-
Св-галогеналкіл, ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл; та
В? та КУ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МО», С1-Св-алкіл, С1-
Св-галогеналкіл, ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл; зокрема переважні Кг та Ке незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ,
С-Св-алкіл або Сі-Св-алкокси; та
В та ВУ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МОг, Сі-Св-алкіл, Сч1-
Св-галогеналкіл або С--Св-алкокси; особливо переважні Кг та Бе незалежно один від одного представляють собою галоген або
СМ; та
В? та РЗ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, Сі-Св-алкіл або С.-
Св-алкокси; більш переважні Кг та Ке представляють собою галоген; та
В? та ВЗ незалежно один від одного представляють собою галоген або СМ; найбільш переважні Бе, В, ВУ та Ве представляють собою галоген.
Також особливо переважними є азини формули (І), де
А представляє собою ноші. ще к їх (А) де Рг, ВЕ, ВУ та ве мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також особливо переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою во
Ноя В як яки те а хх ше
Кк (А. 1.2) де Ра, Ре та Кг мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також особливо переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою гі нош ОВ ще веб : г де о х (А. 1.3) де Кг та Ке мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою 2-фторфеніл, який є заміщеним від одного до чотирьох замісниками,
Зо вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», С1-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН,
Сі-Св-алкокси, С1-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу та (Сі-Св-алкокси)карбонілу; зокрема, переважним є 2-фторфеніл, який є заміщеним від одного до чотирьох замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та Сі-Св -алкокси; зокрема переважні є вибраними з галогену та СМ; також зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНз; особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, Сі та СМ; особливо переважним є 2-фторфеніл, який є заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу,
ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-
Св-алкіл)аміно, ді(С1-Св-алкіл)аміно, (Сі-Св-алкіл)карбонілу та (С1-Св-алкокси)карбонілу;
зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, Сі та СМ; більш переважним є 2-фторфеніл, який є заміщеним одним замісником, вибраним з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі--Св-галогеналкілу, ОН, С1і-Св-алкокси, Сч1-
Св-алкілтіо, (С1і-Св-алкіл)сульфінілу, (С1і-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св-алкіл)аміно, ді(С1-Св- алкіл)аміно, (Сі-Св-алкіл)укарбонілу та (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також більш переважним є 2-фторфеніл, який є заміщеним двома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу та (Сі-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогенута СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також більш переважним є 2-фторфеніл, який є заміщеним трьома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу та (Сі-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси;
Зо особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ.
Також переважними є азини формули (І), в якій А представляє собою во
ВУ они віх й Ж. х ох ! (Аа) де
Ве представляє собою галоген, СМ, МО», Сі-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, ОН, С-і-Св-алкокси,
С1-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфініл, (С1-Св-алкіл)усульфоніл, аміно, (С1-Св-алкіл)аміно, ді(С1-
Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл; та
ВР, В: та КЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, МО», Сі-
Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, ОН, С:і-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (Сі-Св-алкіл)усульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл; зокрема, переважний Кг представляє собою галоген, СМ, С1-Св-алкіл або Сі-Св-алкокси; та
ВР, В: та КЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, МО», Сі-
Св-алкіл, С--Св-галогеналкіл або Сі-Св-алкокси; особливо переважний Кг представляє собою галоген або СМ); та
ВЕ, В: та ВУ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген, СМ, С1-Св- алкіл або Сі-Св-алкокси; більш переважний Кг представляє собою галоген; та
ВР, Аг та КЗ незалежно один від одного представляють собою водень, галоген або СМ; найбільш переважний Кг представляє собою галоген; та
В? Аг та КУ представляють собою водень; також найбільш переважні Ка, В? та КЗ представляють собою галоген; та
Ве: і5 водень;
також найбільш переважні Кае, Ве, В: та КУ представляють собою галоген.
Також переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою во боже В дал чо
ХМ
Е (Аа) де Кг представляє собою галоген, СМ або С.і-Св-алкіл;
В? та ВЗ представляють собою Н, галоген або СМ; та
В: представляє собою Н або галоген; зокрема переважні Кг представляє собою галоген або СМ); та
В, Ве та КЗ представляють собою Н або галоген; особливо переважні Кг, В? та КЗ представляють собою галоген; та
В: представляє собою Н або галоген;
Також особливо переважні Кг, В? та ВЗ представляють собою галоген; та
В: представляє собою Н, НЕ, Вг або І; більш переважні Ре, В? та БЕЗ представляють собою Е; та
В: представляє собою РЕ, Вг або І; також більш переважні Ра, В? та КЗ представляють собою ЕК; та
В: представляє собою Н або ЕК.
Особливо переважними є азини формули (І), в якій А є вибраним з групи, яка складається з (А.1а.1), (А.1а.2) та (А.1а.3); більш переважні є вибраними з групи, яка складається з (А.1.2) та (А.1.3); т
КЕ й ; і І й ех Кк г . Н Кк ше її М. . да Нед во ях її 1
Гей шк р з ря . ве щ
М Бо ж пиши ших
САЛЮТ Та ТАТА де
Ве представляє собою галоген, СМ, МО», Сі-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, ОН, С-і-Св-алкокси,
С1-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфініл, (С1-Св-алкіл)усульфоніл, аміно, (С1-Св-алкіл)аміно, ді(С1-
Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкіл)карбоніл, (С1-Св-алкокси)карбоніл; та
В та ВУ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МО», Сі-Св-алкіл, Сч1-
Св-галогеналкіл, ОН, Сі-Св-алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфініл, (С1-Св- алкіл)сульфоніл, аміно, (Сі-Св-алкіл)аміно, ді(С1і-Св-алкілламіно, (Сі-Св-алкіл)укарбоніл, (С1-Св- алкокси)карбоніл;
Зо зокрема переважний Кг представляє собою галоген, СМ, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-алкокси; та
В? та КУ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, МО», С1-Св-алкіл, С1-
Св-галогеналкіл або С--Св-алкокси; особливо переважний Кг представляє собою галоген або СМ; та
В? та РЗ незалежно один від одного представляють собою галоген, СМ, Сі-Св-алкіл або С.-
Св-алкокси; більш переважний Кг представляє собою галоген; та
ВЕ та ВЗ незалежно один від одного представляють собою галоген або СМ; найбільш переважні К2, В? та КЗ представляють собою галоген.
Також особливо переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою
В
Но А ши а їз г (А.1а.1) де Рг, РЕ та ВЗ мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також особливо переважними є азини формули (І), в якій
А представляє собою -
К з: ; - не Ех В них в К (Алаг) де 2 та Р? мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також особливо переважними є азини формули (І), в якій
М с і у
Е і в не кре Кк
НО ж
КЕ й (А.1а.3) де Кг має значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Також переважними є азини формули (І), в якій
В" представляє собою Н, СМ, С.і-Св-алкіл, Сі-Све-галогеналкіл, Сі-Св-алюкокси-С:1-Св-алкіл, С1-
Св-алкокси, (С1-Св-алкіл)/карбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; зокрема переважними є Н, СМ, Сі-Св-алкіл, С--Св-алкокси-С1-Св-алкіл, Сі--Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)укарбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; особливо переважними є Н, СМ, СНз, СНг2ОСсН», ОСН»з, СОСН» або 5О2СНз; більш переважним є водень.
Також переважними є азини формули (І), в якій
В: представляє собою Н, галоген, С1-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; зокрема переважними є галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; також зокрема переважними є Н, Е, СІ, СНз або СЕ.
Також переважними є азини формули (І), в якій
ВЗ та 2" представляють собою незалежно один від одного Н, галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; або разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з Сз-Св-циклоалкілу, Сз-Се-циклоалкенілу та три - шести-членного гетероциклілу, де Сз-Све-циклоалкіл, Сз-Све-циклоалкеніл або три - шести-ч-ленний гетероцикліл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св- алкілу та Сі-Св-алкокси; незалежно один від одного представляють собою особливо переважні Н,
Зо галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; або разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з Сз-Св-циклоалкілу та Сз-Све-циклоалкенілу, де Сз-Св-циклоалкіл або Сз-
Св-циклоалкеніл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та Сі-Св-алкокси; незалежно один від одного представляють собою особливо переважні Н, галоген, С1-Св- алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; незалежно один від одного представляють собою більш переважні Н, галоген або Сі-Св- алкіл.
Також переважними є азини формули (І), в якій
В: представляє собою Н, галоген, С1-Св-алкіл; та
ВЗ та КЕ" незалежно один від одного представляють собою Н, галоген, С1-Св-алкіл, або разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють Сз-Св-циклоалкіл; зокрема переважні ЕК? представляє собою Н, галоген або Сі-Св-алкіл;
ВЗ представляє собою С.-Св-алкіл;
В" представляє собою Н, галоген або С.і-Св-алкіл;
ВЗ та В" разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють Сз-Св- циклоалкіл; особливо переважні ЕК? представляє собою галоген або С:-Св-алкіл;
ВЗ представляє собою Сі-Св-алкіл;
В" представляє собою Н або С:-Св-алкіл; більш переважні К2 представляє собою галоген; та
ВЗ та Е" представляють собою Сі-Св-алкіл.
Також переважними є азини формули (І), в яких
В? представляє собою Н, СМ, С1-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкокси-С1-Св-алкіл, С1-
Св-алкокси, (С1-Св-алкіл)/карбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; зокрема переважними є Н, СМ, Сі-Св-алкіл, С--Св-алкокси-С1-Св-алкіл, Сі--Св-алкокси, (С1-Св- алкіл)укарбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; особливо переважними є Н, СМ, СНз, СНг2ОСН», ОСНз, СОСН» або 5О2СН; більш переважним є водень.
Також переважними є азини формули (І), в яких
А представляє собою феніл, який є заміщеним від двох до п'яти замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та С--Св-алкокси; зокрема переважні є вибраними з галогену та СМ; також зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНз; особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, Сі та СМ; зокрема переважним є феніл, який є заміщеним від двох до чотирьох замісниками, вибраний з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН,
Сі-Св-алкокси, С1-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу;
Зо зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; особливо переважним є феніл, який є заміщеним двома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі--Св-галогеналкілу, ОН, С1і-Св-алкокси, Сч1-
Св-алкілтіо, (С1і-Св-алкіл)сульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св-алкіл)аміно, ді(С1-Св- алкіл)аміно, (Сі-Св-алкіл)карбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також особливо переважним є феніл, який є заміщеним трьома замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», Сі-Св-алкілу, Сі-Св-галогеналкілу, ОН, Сі1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз; більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ; також особливо переважним є феніл, який є заміщеним чотирма замісниками, вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, МО», С:-Св-алкілу, Сі-Свє-галогеналкілу, ОН, С1-Св- алкокси, Сі-Св-алкілтіо, (С1-Св-алкіл)усульфінілу, (С1-Св-алкіл)усульфонілу, аміно, (С1-Св- алкіл)аміно, ді(Сі-Св-алкіл)аміно, (С1-Св-алкілукарбонілу, (С1-Св-алкокси)карбонілу; зокрема переважні є вибраними з групи, яка складається з галогену, СМ, С1-Св-алкілу та С-
Св-алкокси; особливо переважні є вибраними з галогену та СМ; 60 також особливо переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ, СМ та СНЗз;
більш переважні є вибраними з групи, яка складається з Е, СІ та СМ;
В' представляє собою Н, СМ, С1-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сі-Св-алкокси-С1-Св-алкіл, С1-
Св-алкокси, (С1-Св-алкіл/укарбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; зокрема переважними є Н, СМ, С1-
Св-алкіл, Сі-Св-алкокси-Сі-Св-алкіл, Сі-Св-алкокси, (Сі-Св-алкілукарбоніл або (Сі-Св- алкіл)усульфоніл; особливо переважними є Н, СМ, СНз, СНг8ОСН»з, ОСНз, СОСНз або 502СНз; більш переважним є водень.
В? представляє собою Н, галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; зокрема переважним є галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; також зокрема переважним є Н, Е, СНз або СЕ»;
ВЗ та Е" незалежно один від одного представляють собою Н, галоген, Сі-Св-алкіл або С1-Св- галогеналкіл; або разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з Сз-Св-циклоалкілу, Сз-Све-циклоалкенілу та три - шести-членного гетероциклілу, де Сз-Све-циклоалкіл, Сз-Све-циклоалкеніл або три - шести-ч-ленний гетероцикліл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св- алкілу та Сі-Св-алкокси; незалежно один від одного представляють собою зокрема переважні Н, галоген, Сі-Св-алкіл або Сі-Се-галогеналкіл; або разом з атомом вуглецю, до якого вони є приєднаними, утворюють фрагмент, вибраний з групи, яка складається з Сз-Св-циклоалкілу та Сз-Св-циклоалкенілу, де Сз-Све-циклоалкіл або Сз-Св-циклоалкеніл є незаміщеним або заміщеним від одного до трьох замісниками, вибраними з галогену, СМ, Сі-Св-алкілу та Сі--Св-алкокси; незалежно один від одного представляють собою особливо переважні Н, галоген, С1-Св- алкіл або Сі-Св-галогеналкіл; незалежно один від одного представляють собою більш переважні Н, галоген або С1-Св- алкіл; та
В? представляє собою Н, СМ, С.і-Св-алкіл, С--Све-галогеналкіл, Сі-Св-алюкокси-С:1-Св-алкіл, С1-
Св-алкокси, (С1-Св-алкіл)/карбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; зокрема переважними є Н, СМ, Сі-Св-алкіл, Сі-Св-алкокси-С1-Св-алкіл, Сі-Св-алкокси, (С1-Св-
Зо алкіл)укарбоніл або (С1-Св-алкіл)усульфоніл; особливо переважними є Н, СМ, СНз, СНг2ОСН», ОСНз, СОСН» або 5О2СН; більш переважним є водень.
Особлива перевага надається азинам формули (І.а), яка відповідає азинам формули (І), в якій А представляє собою (А.1) та КЕ! та КЕ? представляють собою Н: я БУХ
В до г до
Гай пре х
МК пор К Ме М дію мет
Іа, де змінні Кг, Ве, Ве, ВУ, Ве, В-г, ВЗ та Е" мають значення, зокрема, переважні значення такі, як визначено вище; особлива перевага надається азинам формул від (І.а. 1) до (І. а. 1406) з Таблиці А, в якій визначення змінних Бе, В", Ве, ВУ, Ве, Ве, ВЗ та В" є особливо важливими для сполук відповідно до винаходу не тільки в комбінації один з одним, але в кожному випадку також, самостійними:
Таблица А
Ме | Ве | В | в | в | в | в | в | ве" таб | є | н | н | ж | є | св | н | н тав | є | н | н | с | є | св | н | н
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | Вт | вє' | є їа9 | Сі | нн | в | в | св | н | н їа37 | в ЇЇ в | 1 | в | в | сн | н | н їабо в | жк | н | в | в | сн | Ст | н бо
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | вє | є їабб | Сі | в | Р | в | в | сн | Ст | н їаб9 в | СМ | Р | в | в | сн | Ст | н їал4 | в | в | 1 | в | в | сно | Ст | н їа980 їв | жк | Р | н | в | сні | Снз | сіз їа96 | СМ | в | є | н | Р | сні | Снз | сіз їа99 в | Сі | нн | в | в | сні | Снз | сСіз тал їв ОЇ в її 1 | в | в | сні | сСнз | сСіз
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | тт | в" | м їаляв Її в ЇЇ в Її 1 | в | в | в | в | в
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | тт | в" | м їал85 у в ЇЇ в ЇЇ 1 | в | в | в | Свв | в їа222 1 ж | в | 1! | в | є | в | ст | в
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | Вт | вє | є їа259 1 Є | в | 1! | в | є | в | ст | н
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | тт | вє | м їа296,1 є | в | 1! | в | є | в | Ст | сіз їаз33 в | в | 1! | в | в | с | сн | сіз
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | тт | вє' | м таз 1 в ЇЇ жк Її 1 | в | в | в | Се | сСіз
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | тт | вє' | м їа407 1 в | в Її 1 | в ЇЇ в | в | Сен | Се їа444 1 в | в | 1 | в ЇЇ в 7 но її -Сно»
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | Вт | є | є тїа4в! | в ОЇ в | 1 | в ЇЇ в 1 но СНО
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | є | є табів її в ЇЇ в Її 1 | в ЇЇ в 1 но СН таб Р ЇЇ в Її 1 | в ЇЇ в її но | -СНою
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | Вт | є | є оїабба її в ЇЇ в Її 1 | в | в | сні | СН)»
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | є | є їаб29 1 в | в | 1 | в | в | сні | -СНом їаббб 1 в ЇЇ в | 1 | в | в | сні | СН
Таблица А ме | Ве | Ве | В | В | в | В | є | є тато в ЇЇ в Її 1 | в | в | сні | -СНою
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | є | є їа740 1 в ЇЇ в Її 1 | в ЇЇ в 1 в | -Снох ота? 1 в ОЇ в її 171 в ЇЇ в 1 | СНО
Таблица А ме | Ве | Ве | В | В | в | Вт | є | є їаві4 1 в ЇЇ в Її 1 | в ЇЇ в 1 в | -Сноє
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | є | є тав! 1 в ЇЇ жк Її 1 | в ЇЇ в 1 в | -«СНою
І їа888 | в | в | 1! | ж | є | с | -Снох
Таблица А ме | Ве | Ве | В | в | в | В | є | є їа825 1 в ЇЇ в | 1 | в ЇЇ в 1 с | -СНом
Таблица А ме | Ве | В | В | В | в | В | є | є їабва 1 в ЇЇ в | 1 | в ЇЇ в 1 с | СН
Таблица А ме | Ве | В | В | ві | в | В | є | є їа8991. в | в | 1 | в ЇЇ в | с | -СНою їалотя у см | в | (| нн | в | Сяє | Ст | нН талоЗв у в | в | 1! | в | в | Сяє | Ст | нН
Таблица А ме | Ве | В | В | В | в | Вт | вв | є їало73 і в ЇЇ в Її 1 | в | в | Сен | Са | Н талоза у СОЇ 77777717 Р ЇЇ но в 01 Сенб | Сенб | сіз
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | тт | вє' | м їалто їв ЇЇ жк Її 1 | в | в | Сенб | Сен | сСіз їалт47 в ОЇ в Її 1 | в | в | Сен | Снз | сіз
Таблица А ме | Ве | В | В | В | в | В | вє | є талів! в ЇЇ в | 1 | в | є | с | ст | н
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | тт | вє | м їал22і 1 є ЇЇ в | 1 | в | в | сне | Сі | сіз їал258 1 Є ЇЇ в | 1! | в | в | см | сСнз | сСіз
Таблица А ме | Ве | В | В | в | в | Вт | є | є їаї295 Р | в | 1! | в | в (осн | н | н
Таблица А ме | Ве | В | В | ві | в | Вт | вє | є їалї3321 в | в | 1! | в | в | осн | Ст | нН їалї3691 в | в | 1! | в | в | осСнзі | сСнз | сіз
Таблица А ме | Ве | Ве | В | ві | в | В | вв | є їал3901.... | СМ | в ЇЇ н ЇЇ в | но | бно тал406| є | жк | 1 | в | в їн | осно
Гербіцидні сполуки прийнятні для представленого винаходу можуть додатково використовуватися в поєднанні з додатковими гербіцидами, до яких сільськогосподарська культурна рослина є, по своїй природі, стійкою або, до яких стали стійкими за рахунок мутагенезу, як описано вище, або до яких є стійкими через експресію одного або більше додаткових трансгенів, як зазначено вище. Гербіциди прийнятні для представленого винаходу найбільш часто застосовують в поєднанні з одним або більше іншими гербіцидами, щоб отримати контроль над більш широким розмаїттям небажаної рослинності. При використанні в поєднанні з іншими гербіцидами (далі в даному документі називається, як сполука В), заявлені на даний час сполуки можуть бути сформульованими з іншим гербіцидом або іншими гербіцидами, причому резервуар змішують з іншим гербіцидом або іншими гербіцидами, або застосовують послідовно з іншим або гербіцидами.
Додаткова гербіцидна сполука В (компонент В) є, зокрема вибраною з гербіцидів класу Б1) - р15):
БІ) інгібіторів ліпідного біосинтезу; рг) інгібіторів ацетолактатсинтази (інгібіторів АЇ 5);
БЗ) інгібіторів фотосинтезу; рі) інгібіторів протопорфіриноген-їЇХ оксидази, р5) гербіцидів відбілювачів;
Бб) інгібіторів енолпірувілишикимат 3-фосфатсинтази (інгібіторів ЕРЗР);
БО) інгібіторів глутамінсинтетази; р) інгібіторів 7,8-дигідроптероатсинтази (інгібіторів ОНР); ро) інгібіторів мітозу; 010) інгібіторів синтезу жирних кислот з дуже довгим ланцюгом (інгібіторів МІ СЕА); 011) інгібіторів біосинтезу целюлози; р12) гербіцидів розв'язання; р13) гербіцидів ауксинів; р14) інгібіторів транспорту ауксину; та 015) інших гербіцидів, вибраних з групи, яка складається з бромбутиду, хлорфлуренолу,
Зо хлорфлуренол-метилу, цінметиліну, кумилуррону, далапону, дазомету, дифензоквату, дифензокват-метилсульфату, диметипіну, ОМА, димрону, ендоталу та його солей, етобензаніду, флампропу, флампроп-ізопропілу, флампроп-метилу, флампроп-М-ізопропілу, флампроп -М-метилу, флуренолу, флуренолбутилу, флурпримідолу, фосейну, фосейн-амонію,
інданофану, індазифламу, гідразиду малеїнової кислоти, мефлуїдиду, метаму, метиозоліну (СА5 403640-27-7), метилазиду, метилброміду, метилдиморну, метилийодиду, МЗМА, олеїнової кислоти, оксазикломефону, пеларгонової кислоти, пірутикарбу, кінокламіну, триацифламу, тридіфану та 6 хлор-3-(2-циклопропіл-6-метилфенокси)-4-піридазинолу (СА5 499223-49-3) та його солі, та складних ефірів; включаючи їх сільськогосподарсько прийнятні солі або похідні, такі як прості ефіри, складні ефіри або аміди.
Перевага надається тим композиціям відповідно до представленого винаходу, які містять, щонайменше, один гербіцид В, вибраний з гербіцидів класу р1, Бб, 569, 610 та 011.
Приклади гербіцидів В, які можуть використовуватися в комбінації зі сполуками формули (І) відповідно до представленого винаходу, включають:
БІ) з групи інгібіторів біосинтезу ліпідів:
АСС-гербіцидів, таких як аллоксидим, аллоксидим натрію, бутроксидим, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргіл, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, диклофоп, диклофоп-метил, феноксапроп, феноксапроп-етил, феноксапроп-Р, феноксапроп-Р-етил, флуазифоп, флуазифоп-бутил, флуазифоп-Р, флуазифоп-Р-бутил, галоксифоп, галоксифоп- метил, галоксифоп-Р, галоксифоп-Р-метил, метаміфоп, піноксаден, профоксидим, пропаквізафоп, квізалофоп, квізалофоп-етил, квізалофоп-тефурил, квізалофоп-Р, квізалофоп-Р- етил, квізалофоп-Р-тефурил, сетоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим, 4-(4-хлор-4-етил-2'-фтор(|1,1"-біфеніл|-З-іл)-5-гідрокси-2,2,6,6-тетраметил-2Н-піран-3(6Н)-он (СА5 1033757-93-5); 4-(2',4-дихлор-4-етилі1,1"-біфеніл|-3-іл)-2,2,6,6-тетраметил-2Н-піран- 3,5(4Н, 6бН)-діон (САБ 1312340-84-3); 5-(ацетилокси)-4-(4-хлор-4-циклопропіл-2'-фтор(1,1"- біфеніл|-3-іл)-3,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-2Н-піран-3-он (СА 1312337-48-6); 5-«ацетилокси)- 4-(2',4"-дихлор-4-циклопропіл-(1,1"-біфеніл|-3-іл)-3,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-2Н-піран-3-он; 5- (ацетилокси)-4-(4"-хлор-4-етил-2'-фтор(1,1-біфеніл|-3-іл)-3,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-2Н- піран-З3-он (САБЗ 1312340-82-1); 5-(ацетилокси)-4-(2',4"-дихлор-4-етилі1,1"-біфеніл|-З-іл)-3,6- дигідро-2,2,6,6-тетраметил-2Н-піран-3-он (САБ 1033760-55-2); метиловий складний ефір 4-(42- хлор-4-циклопропіл-2"-фторі(1,1"-біфеніл|-3-іл)-5,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо-2Н-піран-3- іл карбонової кислоти (САБ5 1312337-51-1);) метиловий складний ефір 4-(2'4-дихлор-4-
Зо циклопропіл-|(1,1"-біфеніл|-3-іл)-5,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо-2Н-піран-З-іл карбонової кислоти; метиловий складний ефір 4-(4-хлор-4-етил-2'-фтор|(1,1"-біфеніл|-3-іл)-5,6-дигідро- 2,2,6,6-тетраметил-5-оксо-2Н-піран-З-іл карбонової кислоти (САЗ 1312340-83-2); метиловий складний ефір 4-(2'4"-дихлор-4-етил|(1,1"-біфеніл|-3-іл)-5,6-дигідро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо- 2Н-піран-З-іл карбонової кислоти (САЗ 1033760-58-5); та не АСС гербіцидів, таких як бенфуресат, бутилат, циклоат, далапон, димепіперат, ЕРТС, еспрокарб, етофумесат, флупропанат, молінат, орбенкарб, пебулат, просульфокарб, ТСА, тіобенкарб, тіокарбазил, триаллат та вернолат; рг) з групи інгібіторів АЇ 5: сульфонілсечовин, таких як амідосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, бенсульфурон-метил, хлорімурон, хлорімурон-етил, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етаметсульфурон-метил, етоксисульфурон, флазасульфурон, флуцетосульфурон, флупірсульфурон, флупірсульфурон-метил-натрію, форамсульфурон, галосульфурон, галосульфурон-метил, імазосульфурон, йодсульфурон, йодсульфурон-метил-натрію, іофенсульфурон, іофенсульфурон-натрію, мезосульфурон, метазосульфурон, метсульфурон, метсульфурон-метил, нікосульфурон, ортосульфамурон, оксасульфурон, примісульфурон, примісульфурон-метил, пропірисульфурон, просульфурон, піразосульфурон, піразосульфурон-етил, римсульфурон, сульфометурон, сульфометурон- метил, сульфосульфурон, трифенсульфурон, трифенсульфурон-метил, триасульфурон, трибенурон, трибенурон-метил, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, трифлусульфурон- метил та тритосульфурон, імідазолінонів, таких як імазаметабенз, імазаметабенз-метил, імазамокс, імазапік, імазапір, імазахін та імазетапір, триазолопіримідинові гербіциди та сульфонаніліди, такі як клорансулам, клорансулам-метил, диклосулам, флуметсулам, флорасулам, метосулам, пеноксулам, піримісулфан та піроксулам, піримідинілбензоатів, таких як біспірібак, біспірібак-натрію, пірибензоксим, пірифталид, піримінобак, піримінобак-метил, піритіобак, піритіобак-натрію, 1-метилетиловий складний ефір
А-ІЦ2-К4,6-диметокси-2-піримідиніл)окси|феніл|метиліаміно|-бензойної кислоти (СА5-420138-41- б), пропіловий складний ефір А-ІЩ2-(4,6-диметокси-2- піримідиніл)/окси|феніл|метилІаміно|бензойної кислоти (СА 420138-40-5),. М-(4-бромфеніл)-2- 60 4,6-диметокси-2-піримідиніл)окси|Їбензолметанамін (СА5З-420138-01-8),
сульфоніламінокарбоніл-триазолінонових гербіцидів, таких як флукарбазон, флукарбазон- натрію, пропоксикарбазон, пропоксикарбазон-натрію, тієнкарбазон та тієнкарбазон-метил; та триафамон; серед них, переважний варіант здійснення даного винаходу стосується таких композицій, які містять, щонайменше, один імідазоліноновий гербіцид;
ЮЗ) з групи інгібіторів фотосинтезу: амікарбазону, інгібіторів фотосистеми ІЇ, наприклад, триазинових гербіцидів, включаючи хлортриазин, триазинони, триазиндіони, метилтіотриазини та піридазинони, такі як аметрин, атразин, хлоридазон, ціаназин, десметрин, диметаметрин, гексазинон, метрибузин, прометон, прометрин, пропазин, сімацин, сіметрин, тербуметон, тербутилазин, тербутрин та триетазин, арилсечовин, таких як хлорбромурон, хлоротолурон, хлороксурон, димефурон, діурон, флуометурон, ізопротурон, ізоурон, лінурон, метамітрон, метабензтіазурон, метобензурон, метоксурон, монолінурон, небурон, сідурон, тебутіурон та тіадіазурон, фенілкарбаматів, таких як десмедифам, карбутилат, фенмедифам, фенмедифам-етил, нітрильних гербіцидів, таких як бромофеноксин, бромоксиніл та їх солі та складні ефіри, іоксиніл та їх солі та складні ефіри, урацилів, таких як бромацил, ленацил та тербацил та бентазон, та бентазон-натрію, піридат, піридафол, пентанохлор та пропаном, та інгібіторів фотосистеми І, таких як дикват, дикват- диброміду, паракват, паракват-дихлоретану та паракват-диметилсульфат. Серед них, переважний варіант здійснення за винаходом стосується таких композицій, які містять, щонайменше, одну гербіцидну арилсечовину. Серед них, також переважний варіант здійснення за винаходом стосується тих композиції, які містять, щонайменше, один триазиновий гербіцид.
Серед них, також переважний варіант здійснення за винаходом стосується тих, композицій, які містять, щонайменше, один нітрильний гербіцид; рі) з групи інгібіторів протопорфіриноген-ІХ-оксидази: ацірлуорфену, аціфлуорфену натрію, азефанідину, бенкарбазону, бензфендизону, біфеноксу, бутафенацилу, карфентразону, карфентразон-етилу, хлометоксифену, цинідон- етилу, флуазолату, флуфенпіру, флуфенпір-етилу, флуміклораку, флуміклорак-пентилу, флуміоксазину, флуороглікофену, флуороглікофен-етилу, флутіацету, флутіацет-метилу, фомесафену, галосафену, лактофену, оксадіаргілу, оксадіазону, оксифторфену, пентоксазону,
Зо профлуазолу, піраклонілу, пірафлуфену, пірафлуфен-етилу, сафлуфенацилу, сульфентразону, тидіазиміну, тіафенацилу, етил ІЗ3-(2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-б6-трифторметил-2,4-діоксо-1,2,3,4- тетрагідропіримідін-3-ілуфенокси|-2-піридилоксЦацетату (САБ-353292-31-6; 5-3100), М-етил-3- (2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-піразол-1-карбоксамід (САЗ 452098-92-9), М- тетрагідрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4--рифторметилфенокси)-5-метил-ТАХпіразол-1- карбоксаміду (САБ 915396-43-9),. М-етил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил- 1Н-піразол-1-карбоксаміду (САБ 452099-05-7), М-тетрагідрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4- трифторметилфенокси)-5-метил-1 Н-піразол-1-карбоксаміду (СА 452100-03-7), 3-(7-фтор-3- оксо-4-(проп-2-ініл)-3,4-дигідро-2Н-бензо|1,4оксазин-6-іл|-1,5-диметил-б-тіоксо-(1,3,5|гриазинан- 2,4-діону, 1,5-диметил-б-тіоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-ініл)-3,4-дигідро-2Н- бензо|(бІ1 «оксазин-6-іл)-1,3,5-триазинан-2,4-діону (САБ 1258836-72-4), 2-(2,2,7-трифтор-3- оксо-4-проп-2-ініл-3,4-дигідро-2Н-бензої|1,4|оксазин-6-іл)-4,5,6,7-тетрагідроізоіндол-1,3-діону, 1- метил-б6-трифторметил-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-ініл-3,4-дигідро-2Н-бензо|1,4оксазин- б-іл)-1Н-піримідин-2,4-діону, метил (Е)-4-(2-хлор-5-І(4-хлор-5-(дифторметокси)-1 Н-метилпіразол-
З-іл|-4-фторфенокси|-З-метоксибут-2-еноату ІСАБ 948893-00-3)Ї, та 3-(7-хлор-5-фтор-2- (трифторметил)-1Н-бензімідазол-4-іл|-1-метил-б6-(трифторметил)-1Н-піримідин-2,4-діону (САЗ 212754-02-4); р5) з групи гербіцидів відбілювачів:
РОБ інгібіторів, таких як: бефлубутамід, дифлуфенікан, флуридон, флурохлоридон, флуртамон, норфлуразон, піколінафен, та 4-(3-трифторметилфенокси)-2-(4- трифторметилфеніл)піримідин (САЗ 180608-33-7), інгібіторів НРРО, таких як: бензодициклон, бензофенап, кломазон, фенквінтрион, ізоксафлутол, мезотрион, пірасульфотол, піразолінат, піразоксифен, сулкотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезон та біциклопірон, відбілювачів, невідомої спрямованості: аклоніфен, амітрол та флуметурон; рб) з групи інгібіторів ЕР5Р синтази: гліфосату, гліфосат-ізопропіламонію, гліфосат-калію та гліфосат-тримезіуму (сульфосату); р) з групи інгібіторів глутамінсинтази: біланафосу (біаланафосу), біланафос-натрію, глуфозинату, глуфозинату-Р та глуфозинат- амонію; рв8) з групи інгібіторів ОНР синтази: бо асуламу;
ро) з групи інгібіторів мітозу: сполук групи КІ: динітроанілінів, таких як бенфлуралін, бутралін, динітрамін, еталфлуралін, флухлоралін, оризалін, пендиметалін, продіамін та трифлюралін, фосфороамідатів, таких як аміпрофос, аміпрофос-метил та бутаміфос, гербіцидів бензойної кислоти, таких як хлортал, хлортал-диметил, піридинів, таких як дитіопір та тіазопір, бензамідів, таких як пропізамід та тебутам; сполук групи К2: хлорпрофаму, профаму та карбетаміду, серед них, сполуки групи КІ, зокрема, динітроаніліни є переважними; 010) з групи інгібіторів МІ СЕА: хлорацетамідів, таких як ацетохлор, алахлор, бутахлор, диметахлор, диметенамід, діметенамід-Р, метазахлор, метолахлор, метолахлор-Р, петоксамід, претилахлор, пропахлор, пропісохлор та тенілхлор, оксіацетанілідів, таких як флуфенацет та мефенацет, ацетанілідів, таких як дифенамід, напроанілід, напропамід та напропамід-М, тетразолінонів, таких як фентразамід, та інших гербіцидів, таких як анілофос, кафенстрол, феноксасульфон, іпфенкарбазон, піперофос, піроксасульфон та ізоксазолінових сполук формул 1І.1, 11.2, 11.3, 11.4,
Ї.5, 1.6, 11.7, 11.8 та 1.9
Кей ах
Ку в чо г З а
Ко ОС М, ато КСВ, ї З нео Ох Х. М У
З ; з ві ве Зак Ї ; ех вкх
А і СК, рр х ОК СЕ.
Не С «М х ил її т я
НА і
У
Б м в «М Б В к ву УЗ уд х ск гу г М х Косі їз г їх їх
Кок СН, у МОВ, ой уЦИесн,
У хх УК хх Ку ШКТ, - зам яка т пан і НЕ ин а: буси р М ат х ТП і. На Й ! М Ноя ї
НК ем Не е М не їз М
Н.З ца сх я НЕ
КЕ, Ку У
З ї й М ї3 в чеоб, сш. х ши и ше З я ку 5
НЕ ях х "НЕ МН» Ко
ОА оо ЕК. й М КЕ нев «В КОКОСТТ, че З ВЕ п. ЦЯ мор Ке ;
Б м пз М хх о с Я і щ- М Га Ти ях і СИ. х Оля т Ех ет іа У хх Як я З
ТИ А яко і Я їз М в Б ОСНЕ, Вел .М КЕ от «з х - х м; я
М ев ху ізоксазолінові сполуки формули (ІІ є відомими в даній галузі з рівня техніки, наприклад з
МО 2006/024820, МО 2006/037945, МО 2007/071900 та УМО 2007/096576; серед МІ СРЕА інгібіторів, перевага надається хлорацетамідам та оксіацетамідам; 011) з групи інгібіторів біосинтезу целюлози: хплортіаміду, дихлобенілу, флупоксаму, ізоксабену та 1-циклогексил-5-пентафторфенілокси- 15-П1,2,4 б)гіатриазин-3-іламіну; 012) з групи гербіцидів розв'язання: диносебу, динотербу та ОМОС та їх солей; р13) з групи ауксинових гербіцидів: 2,А-О та його солей та складних ефірів, таких як клацифос, 2,4-ОВ та його солі та складні ефіри, аміноциклопіраклор та його солі та складні ефіри, амінопіраліду та його солей, таких як амінопіралід-диметиламоній, амінопіралід-три(2-гідроксипропіл)уамоній та їх складні ефіри, беназолін, беназолін-етил, хлорамбен та його солі та складні ефіри, кломепроп, клопіралід та його солі та складні ефіри, дикамба та його солі та складні ефіри, диклорпроп та його солі та складні ефіри, диклорпроп-Р та його солі та складні ефіри, флуроксипір, флуроксипір- бутометил, флуроксипір-мептил, галауксифен та його солі та складні ефіри (СА5 943832-60-8);
МОСРА та його солі та складні ефіри, МСРА-тіоетил, МСРВ та його солі та складні ефіри, мекопроп та його солі та складні ефіри, мекопроп-Р та його солі та складні ефіри, піклорам та його солі та складні ефіри, квінклорак, квінмерак, ТВА (2,3,6) та його солі та складні ефіри та триклопір та його солі та складні ефіри; 014) з групи інгібіторів транспорту ауксину: дифлуфензопіру, дифлуфензопір-натрію, напталаму та напталам-натрію; 015) з групи інших гербіцидів: бромбутиду, хлорфуренолу, хлорфуренол-метилу, цинметиліну, цумілурону, циклопіриморату (СА5 499223-49-3) та його солей та складних ефірів, далапону, дазомету, дифензоквату, дифензокват-метилсульфату, диметипіну, ОБМА, димрону, ендоталу та його солей, етобензаніду, флампропу, флампроп-ізопропілу, флампроп-метилу, флампроп-М- ізопропілу, флампроп-М-метилу, флуренолу, флуренол-бутилу, флурпримідолу, фосаміну, фосамін-амонію, інданофану, індазимфлану, гідразиду малеїнової кислоти, мефлуідиду, метаму, метіозоліну (САБ 403640-27-7), метилазиду, метилброміду, метил-димрону, метилиодиду, ММА, олеїнової кислоти, оксазикломефону, пеларгонової кислоти, пірибутикарбу, хінокламіну, триазифламу та тридифану.
Активні сполуки В та С, які мають карбоксильну групу можуть застосовуватись у вигляді кислоти, у вигляді сільськогосподарсько прийнятної солі, як зазначено вище або ще у вигляді сільськогосподарсько прийнятної похідної в композиції відповідно до винаходу.
У випадку дикамби, прийнятні солі включають ті, в яких противоїон представляє собою сільськогосподарськи прийнятний катіон. Наприклад, прийнятні солі дикамби представляють собою дикамба-натрію, дикамба-калію, дикамба-метиламонію, дикамба-диметиламонію, дикамба-ізопропіламонію, дикамба-дигліколаміну, дикамба-оламіну, дикамба-діоламіну, дикамба-троламіну, дикамба-М, М-біс-(З-амінопропіл)уметиламіну та дикамба-діетилентриаміну.
Зо Приклади прийнятного складного ефіру включають дикамба-метил та дикамба-бутотил.
Прийнятні солі 2,4-О включають 2,4-О0-амоній, 2,4-О-диметиламоній, 2,4-О-діетиламоній, 2,4-
О-діетаноламоній (2,4-О-діоламін), 2,4-О-триетаноламоній, 2,4-О-ізопропіламоній, 2,4-0- триїзопропаноламоній, 2,4-О-гептиламоній, 2,4-0О-додециламоній, 2,4-О-тетрадециламоній, 2,4-
О-триєтиламоній, 2,4-О-три(2-гідроксипропіл)амоній, 2,4-О-три(ізопропіл)амоній, 2,4-О-троламін, 2,4-О-літій, 2,4-О-натрій. Приклади прийнятних складних ефірів 2,4-О включають 2,4-О0О-бутотил, 2,4-0-2-бутоксипропіл, 2,4-0-3-бутоксипропіл, 2,4-О-бутил, 2,4-О-етил, 2,4-О-етилгексил, 2,4-0- ізобутил, 2,4-О-ізооктил, 2,4-О-ізопропіл, 2,4-ЮО-мептил, 2,4-О-метил, 2,4-О-октил, 2,4-ЮО-пентил, 2,А-О-пропіл, 2,4-Ю-тефуніл та клацифос.
Прийнятні солі 2,4-0ОВ включають, наприклад, 2,4-ОВ-натрію, 2,4-0ОВ-калію та 2,4-ОВ8- диметиламонію. Прийнятні складні ефіри 2,4-ЮВ включають, наприклад, 2,4-ОВ-бутил та 2,4- рВ-ізооктил.
Прийнятні солі диклорпропу включають, наприклад, диклорпроп-натрію, диклорпроп-калію та диклорпроп-диметиламонію. Прикладм прийнятних складних ефірів диклорпропу включають диклорпроп-бутотил та диклорпроп-ізооктил.
Прийнятні солі та складні ефіри МСРА включають МСРА-бутотил, МСРА-бутил, МСРА- диметиламоній, МСОСРА-діоламін, МСРА-етил, МСРА-тіоетил, МСОСРА-2-етилгексил, МСОРА- ізобутил, МСРА-ізооктил, МСРА-ізопропіл, МСРА-ізопропіламоній, МСРА-метил, МСРА-оламін,
МСРА-калію, МСРА-натрію та МСРА-троламін.
Прийнятна сіль МСРВ представляє собою МОСРВ натрію. Прийнятний складний ефір МСРВ
БО представляє собою МСРВ-етил.
Прийнятні солі клопіраліду представляють собою клопіралід-калію, клопіралід-оламіну та клопіралід-три-(2-гідроксипропіл)яамонію. Приклад прийнятного складного ефіру клопіраліду представляє собою клопіралід-метил.
Приклади прийнятних складних ефірів флуроксипіру включають флуроксипір-мептил та флуроксипір-2-бутокси-1-метилетил, де флуроксипір-мептил є переважним.
Прийнятні солі піклораму представляють собою піклорам-диметил амоній, піклорам-калію, піклорам-триізопропаноламоній, піклорам-триїзопропіламоній та піклорам-троламін.
Прийнятний складний ефір піклораму представляє собою піклорам-ізооктил.
Прийнятна сіль триклопіру представляє собою триклопір-триетиламоній. Прийнятні складні бо ефіри триклопіру представляють собою, наприклад, триклопір-етил та триклопір-бутотил.
Прийнятні солі та складні ефіри хлорамбену представляють собою хлорамбен-амоній, хлорамбен-діоламін, хлорамбен-метил, хлорамбен-метиламоній та хлорамбен-натрію.
Прийнятні солі та складні ефіри 2,3,6-ТВА включають 2,3,6-ТВА-диметиламоній, 2,3,6-ТВА- літію, 2,3,6-ТВА-калію та 2,3,6-ТВА-натрію.
Прийнятні солі та складні ефіри амінопіраліду представляють собою амінопіралід-калію, амінопіралід-диметиламоній, та амінопіралід-три(2-гідроксипропіл)амоній.
Прийнятні солі гліфосату представляють собою, наприклад, солі гліфосат-амонію, гліфосат- діамонію, гліфосат-диметиламонію, гліфосат-ізопропіламонію, гліфосат-калію, гліфосат-натрію, гліфосат-тримезиум, а також солі етаноламіну та діетаноламіну, переважно гліфосат-діамонію, гліфосат-ізопропіламонію та гліфосат-тримезиум (сульфосат).
Прийнятна сіль глюфосинату представляє собою, наприклад, глюфосинат-амонію.
Прийнятна сіль глюфосинату-Р представляє собою, наприклад, глюфосинат-Р-амонію.
Прийнятні солі та складні ефіри бромксинілу представляють собою, наприклад, бромксиніл- бутират, бромксиніл-гептаноат, бромксиніл-октаноат, бромксиніл-калію та бромксиніл- натрію.
Прийнятні солі та складні ефіри іоксонілу представляють собою, наприклад, іоксоніл- октаноат, іоксоніл-калію та іоксоніл-натрію.
Прийнятні солі та складні ефіри мекопропу включають мекопроп-бутотил, мекопроп- диметиламоній, мекопроп-діоламін, мекопроп-етадил, мекопроп-2-етилгексил, мекопроп- ізооктил, мекопроп-метил, мекопроп-калію, мекопроп-натрію та мекопроп-троламін.
Прийнятні солі мекопропу-Р представляють собою, наприклад, мекопроп-Р-бутотил, мекопроп-Р-диметиламонію, мекопроп-Р-2-етилгексил, мекопроп-Р-ізобутил, мекопроп-Р-калію та мекопроп-Р-натрію.
Прийнятна сіль дифлуфензопіру представляє собою, наприклад, дифлуфензопір-натрію.
Прийнятна сіль напталаму представляє собою, наприклад, напталам-натрію.
Прийнятні солі та складні ефіри аміноциклопіраклору представляють собою, наприклад, аміноциклопіраклор-диметиламонію, аміноциклопіраклор-метил, аміноциклопіраклор- триїзопропаноламоній, аміноциклопіраклор-натрію та аміноциклопіраклор-калію.
Прийнятна сіль квінклораку представляє собою, наприклад, квінклорак-диметиламоній.
Прийнятна сіль квінмераку представляє собою, наприклад, квінклорак-диметиламонію.
Прийнятна сіль імазамоксу представляє собою, наприклад, імазамокс-амонію.
Прийнятні солі імазапіку представляють собою, наприклад, імазапік-амонію та імазапік- ізопропіламонію.
Прийнятні солі імазапіру представляють собою, наприклад, імазапір-амонію та імазапір- ізопропіламонію.
Прийнятна сіль імазаквіну представляє собою, наприклад, імазаквін-амонію.
Прийнятні солі імазетапіру представляють собою, наприклад, імазетапір-амонію та імазетапір-ізопропіламонію.
Прийнятна сіль топрамезону представляє собою, наприклад, топрамезон-натрію. Особливо переважними є гербіцидні сполуки В представляють собою гербіциди В, як визначено вище; зокрема, гербіциди В.1 - В.189, наведені нижче в таблиці В:
Таблиця В: 11111111 гербіцидВ8///////////7711СсС1С
Вб 000000 |феноксапропРзетил./://О111111111111111111ссСсСсС
В. 0000000 фпрофоксидим7//77777777711111111111111111111111ссСсСсС
Таблиця В: 11111111 гербіцидВ8////////////711СсС1С
Таблиця В: 11111111 ГербіцидВ!.7/7/7/:/:///.::/3/::./:/З//:Д: етил ІЗ-(2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-б6-трифторметил-2,4-діоксо-1,2,3,4- " тетрагідропіримідин-3-ілуфенокси|-2-піридил-окси|асеїа(е (СА5 353292-31-6 1,5-диметил-б-тіоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-ініл)-3,4-дигідро-2Н-
І бензо|(5І01,4оксазин-б-іл)-1,3,5-триазинан-2,4-діон (САЗ 1258836-72-4 гліфосат-тримезію (сульфосат)
Таблиця В: 11111111 гербіцидВ8////////////711СсС1С
ВЛ76б 00000 Їдимрон//////7777771111111111111111111111111111111111111сСсС
Таблиця В: 11111111 гербіцидВ8////////////711СсС1С вІВЄ ШЩ6б6 11111111 вІВВ 08111111 вве Ще
Крім того, корисним може бути застосування сполук формули (І) в поєднанні із антидотами та, необов'язково, з додатковими одним або декількома гербіцидами. Антидоти представляють собою хімічні сполуки, які запобігають або зменшують пошкодження корисних рослин, істотно не впливає на гербіцидну дію сполук формули (І) по відношенню до небажаних рослин. Вони можуть бути застосовані, або перед посівами (наприклад, для обробки насіння, пагонів або розсади), або перед проростанням сходів або після появи сходів корисної рослини. Дані антидоти та сполуки формули (І), та необов'язково гербіциди В можуть бути застосовані одночасно або послідовно.
Прийнятні антидоти представляють собою, наприклад, (хінолін-8-окси)оцтові кислоти, 1- феніл-5-галогеналкіл-1Н-1,2,4-триазол-З-карбонові кислоти, 1-феніл-4,5-дигідро-5-алкіл-1Н- піразол-3,5-дикарбонові кислоти, 4,5-дигідро-5,5-діарил-3-ізоксазолкарбонові кислоти, дихлорацетаміди, альфа-оксимінофенілацетонітрили, ацетофеноноксими, 4,6-дигалоген-2- фенілпіримідини, М-(4-(амінокарбоніл/феніл|Ісульфоніл|-2-бензойні аміди, 1,8-нафталевий ангідрид, 2-галоген-4-(галогеналкіл)-5-тіазолкарбонові кислоти, фосфортіолати та М-алкіл-О- фенілкарбамати та їх сільськогосподарсько прийнятні солі та їх сільськогосподарсько прийнятні похідні, такі як аміди, складні ефіри, та тіоскладні ефіри, за умови, що вони мають кислотну групу.
Приклади переважних антидотів С включають беноксакор, клоквінтосет, ціометриніл, ципросульфамід, диклормід, дициклонон, дієтолат, фенклоразол, фенклорим, флуразол, флуксофенім, фурилазол, ізоксадифен, мефенпір, мефенат, нафталевий ангідрид, оксабетриніл, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро|(4.5)декан (МОМ4660, СА5 71526-07-3), 2,2,5- триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідин (К-29148, СА5 52836-31-4) та М-(2-метоксибензоїл)- 4-((метиламінокарбоніл)аміно|бензолсульфонамід (СА5 129531-12-0).
Особливо переважними є антидоти С, які представлені наступними сполуками С.1 - С.17 сі ення 00000001 162 фени 0000000
С.3 |клоквінтосет-мексил.ї | 0 |С4 |ципросульфамід.//:/ ССО б.5 |диклормд. 77777777 | 0 ЇС6 о |фенклоразол..7/:////бСССЗИ/
С.7 |фенклоразолетил.//////// | ЇС8 |фенклорим///:/ ( с.9 |фурилазол.///////////////////// | |СЛО (ізоксадибен//:/ СИ
С.11 ф|ізоксадифенетил.//////0 | |Сл212 |мефенпр//://////е4енби
С.13 |мефенпірдієтил. | |С14 (ангідриднафталевоїкислоти./-/-О сні ре (о
І азаспіро|4,5|декан І 1,3-оксазолідин
М-(2-метоксибензот)-4-
С.17 | (метиламінокарбоніл)аміно|бе нзолсульфонамід
Активні сполуки В з груп Б1) - 015) та сполуки-антидоти С є відомими гербіцидами та антидотами, дивіться, наприклад, Пе Сотрепаішт ої Ребвіісіде Соттоп Матев5
Зо (пнр/лумлму.аіапугоса.пекрезвіїсідев5/); Еапт СПетісаіє НапароокК 2000 моІште 86, Меївіег
Рибіїєпіпд Сотрапу, 2000; В. Носк, С. Редіке, В. В. 5сптіаї, Негтбігіає (Негбрісідев|, Сеогд Тпіете
Мепад, б5ішдап 1995; МУ. Н. АнНгепв, Негбісіде Напароок, 7їй еайіоп, М/еед Зсівепсе Босієїу ої
Атегіса, 1994; та К. К. Наїліо5, Негрісіде Напароок, З,ирріетепі ог (Ше 7 еайоп, Ууеей Зсіепсе зЗосієїу ої Атетгіса, 1998. 2,2,5- Триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідин |(САЗ Мо. 52836-31-41 є також відомим як К-29148. 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро|4,5|декан |(СА5 Мо. 71526-07-3 є також відомим як АО-67 та МОМ 4660.
Призначення активних сполук щодо відповідних механізмів дії грунтується на сучасних знаннях. Якщо декілька механізмів дії застосовуються до однієї біологічно активної сполуки, дана речовина була лише призначеною для одного механізму дії.
Зазвичай переважним є використовувати сполуки за винаходом в комбінації з гербіцидами, які є селективними щодо сільськогосподарських культур, що підлягають обробці, та які доповнюють спектр бур'янів, які контролюються, даними сполуками з показником застосування.
Крім того, зазвичай переважним є застосовувати сполуки за винаходом та інші додаткові гербіциди в той же час, або у вигляді комбінованого препарату, або у вигляді суміші, яка отримується в ємності.
В іншому варіанті здійснення, представлений винахід стосується способу індефікування гербіциду з використанням мутантного ТтіА, який кодується нуклеїновою кислотою, яка містить нуклеотидну послідовність ХЕО ІЮО МО: 1 або її варіант або похідну.
Зазначений спосіб включає стадії: а) генерування трансгенної клітини або рослини, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує мутантний ТтіА, де мутантний ТгіА експресується; р) застосування гербіциду до трансгенної клітини або рослини з а) та до контрольної клітини або рослини, такого самого сорту; с) визначення росту або життєздатності трансгенної клітини або рослини та контрольної клітини або рослини після застосування зазначеного гербіциду, та а) відбір "гербіцидів", які надають знижений ріст контрольної клітини або рослини в порівнянні з ростом трансгенної клітини або рослини.
Як описано вище, представлений винахід представляє композиції та способи підвищення стійкості сільськогосподарської культурної рослини або насінини в порівнянні з немутантного типу сортом рослини або насінини. В переважному варіанті здійснення, стійкість сільськогосподарської культурної рослини або насінини є підвищеною, таким чином, що рослина або насінина може протистояти гербіциду при застосуванні переважно приблизно 1-
Зо 1000 г на га", більш переважно 1-200 г а.і. га", ще більш переважно 5-150 г а.і. га", та найбільш переважно 310-100 г а. га". Як використовується в даному документі, "протистояти" застосуванню гербіциду означає, що рослина або не знищується, або тільки в незначній мірі пошкоджується таким застосуванням. Кваліфікованому фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що норми витрати можуть варіювати, в залежності від умов навколишнього середовища, таких як температура або вологість, та в залежності від вибраного виду гербіциду (активного інгредієнта - аї).
Перед- та/або після появи бур'янів способи, використовувані в різних варіантах здійснення в даному документі, застосовують приблизно х»0,3х норми витрати гербіцидів; в деяких варіантах здійснення, це може становити приблизно, наприклад, »0,3х, »0,4х, »0,5х. В одному варіанті здійснення, рослини резистентні до гербіциду за представленим винаходом мають стійкість до застосування після сходів гербіцидів в кількості від приблизно 25 до приблизно 200 г аї/га. В деяких варіантах здійснення, де рослина резистентна до гербіциду представляє собою дводольну рослину (наприклад, сою, бавовник), застосування гербіцидів після сходів знаходиться в кількості від приблизно 50 г аїі/га. В іншому варіанті здійснення, де рослина резистентна до гербіциду представляє собою однодольну рослину (наприклад, кукурудза, рис, сорго), застосування гербіцидів після сходів знаходиться в кількості від приблизно 200 г аїі/га. В інших варіантах здійснення, де рослина резистентна до гербіциду представляє собою Вгазвзіса (наприклад, канолу), застосування гербіцидів після сходів знаходиться в кількості від приблизно 25 г аі/га. Після появи бур'яну способи контролю за даним документом, в деяких варіантах здійснення, спосіб може застосовувати норми витрати гербіцидів через приблизно 7-10 днів після появи. В іншому варіанті здійснення, норми витрати можуть перевищувати їх гербіцидів; в деяких варіантах здійснення, норми витрати можуть становити аж до 4х гербіцидів, більш типово вона буде становити приблизно 2,5х або менше, або приблизно 2х або менше, або приблизно їх або менше.
Крім того, представлений винахід передбачає способи, які включають застосування, щонайменше, одного гербіциду необов'язково в комбінації з однією або декількома гербіцидними сполуками В, та, необов'язково, антидотом С, як детально описано вище.
В цих способах, гербіцид можуть застосовувати за будь-яким способом, відомим в даній галузі, включаючи, але не обмежуючись цим, обробку насінини, обробку грунту, та обробку бо листя. Перед застосування, гербіцид можуть перетворювати в звичайні композиції, наприклад розчини, емульсії, суспензії, тонкі порошки, порошки, пасти та гранули. Форма застосування залежить від мети застосування; в кожному конкретному випадку, вона повинна забезпечувати тонкий та рівномірний розподіл сполуки відповідно до винаходу.
При забезпеченні рослині, які мають підвищену стійкість до гербіциду, широкий спектр препаратів можуть застосовуватись для захисту рослин від бур'янів, з тим, щоб посилити ріст рослини та зменшити конкуренцію за поживні речовини. Гербіцид може використовуватись сам по собі для контролю за бур'янами перед проростанням, після проростання, перед посадкою, та під час посадки на ділянках, які оточують сільськогосподарські рослини, описані в даному документі, або препарат гербіциду може використовуватись, де препарат містить інші добавки.
Гербіцид також може використовуватись для обробки насінини. Добавки, найдені в препараті гербіциду включають інші гербіциди, детергенти, ад'юванти, добавки, що посилюють розтікання, загущуючи агенти, стабілізуючі агенти, або подібні. Препарат гербіциду може бути вологим або сухим препаратом, та може включати, але не обмежується цим, текучі порошки, здатні до утворення емульсій концентрати, та рідкі концентрати. Гербіцид та препарати гербіциду можуть використовуватись відповідно до загальноприйнятних способів, наприклад, шляхом розпилення, поливу, опилювання, тощо.
Прийнятні препарати детально описані в РСТ/ЕР2009/063387 та РСТ/ЕР2009/063386, які є включеними в даний документ у вигляді посилання.
Як розкрито в даному документі, ТА нуклеїнові кислоти за винаходом, як виявлено, застосовуються для посилення стійкості до гербіциду рослин, які містять в своїх геномах ген, який кодує стійкий до гербіцидів немутантного типу або мутантний протеїн ТгіА. Такий ген може бути ендогенним геном або трансгеном, як описано вище. Додатково, в певних варіантах здійснення, нуклеїнові кислоти за представленим винаходом можуть бути складеними з будь- якою комбінацією полінуклеотидної послідовності, яка викликає зацікавленість, для того, щоб створити рослини з потрібним фенотипом. Наприклад, нуклеїнові кислоти за представленим винаходом можуть бути складеними з будь-якими іншими полінуклеотидами, які кодують поліпептиди, які мають пестицидну та/або інсектицидну активність, такі як, наприклад, протеїни токсину Васійи5 ІПигіпдіепбоіз (описані в в патентах США МоМо 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; та Сеїбзег еї аі). (1986) Сепе 48: 109), 5-енолпірувілешикимат-3-
Зо фосфатсинтази (ЕРБР5Б), гліросатацетилтрансфераза (САТ), цитохром Р450 монооксигеназа, фосфінотрицин ацетилтрансфераза (РАТ), ацетогідроксикислотна синтаза (АНА5; ЕС 4.1.3.18, також відома як ацетолактатсинтаза або АЇ5), гідроксифенілпіруватдіоксигеназа (НРРБ), фітоєндесатураза (РО), протопорфіриноксигеноксидаза (РРО) та дикамба руйнуючі ферменти, які розкриті в М/о 02/068607, або похідні феноксиоцтової кислоти та феноксипропіонової кислоти, які руйнують ферменти, як розкрито в УМО 2008141 154 або МО 2005107437. Отримані комбінації можуть також включати безліч копій будь-якого одного з полінуклеотидів, який викликає зацікавленість.
Таким чином, стійкі до гербіцидів рослини за винаходом можуть використовуватися в поєднанні з гербіцидом, до якого вони є стійкими. Гербіциди можуть бути застосовані до рослин за винаходом з використанням будь-яких способів, відомих фахівцям в даній галузі техніки.
Гербіциди можуть бути застосовані в будь-який момент в процесі вирощування рослин.
Наприклад, гербіциди можуть бути застосовані перед посадкою, при посадці, перед або після появи сходів їх комбінації. Гербіциди можуть застосовувати до насіння та висушувати з утворенням шару на насінні.
В деяких варіантах здійснення, насіння обробляють антидотом, з подальшим застосуванням після появи сходів гербіцидів. В одному варіанті здійснення, застосування після появи сходів гербіцидів відбувається приблизно через 7-10 днів після посадки обробленого антидотом насіння. В деяких варіантах здійснення, антидот представляє собою клоквінтосет, диклормід, флуксофенім, або їх комбінації.
Способи контролювання бур'янів або небажаної рослинності
В інших аспектах, представлений винахід передбачає спосіб контролювання бур'янів на ділянках для росту рослин або їх частин рослин, де спосіб включає: застосування композиції, яка містить гербіциди, до ділянки.
В деяких аспектах, представлений винахід передбачає спосіб контролювання бур'янів в місці для вирощування рослини, де спосіб включає: застосування гербіцидної композиції, яка містить гербіциди, до ділянки; де зазначена ділянка представляє собою: (а) ділянку, яка містить: рослину або насінину, здатну до продукування зазначеної рослини; або (Б) ділянку, яка має бути після зазначеного застосування, як зроблено, містить рослину або насінину; де рослина або насінина включає, щонайменше, в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально бо зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептида ТгіА, який кодується полінуклеотидом, де експресія мутантного поліпептида ТтіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
Гербіцидні композиції за даним документом можуть застосовуватись, наприклад, для обробки листя, обробки грунту, обробки насіння, або просочення грунту. Застосування можуть здійснюватися, наприклад, шляхом розпилення, опудрювання, розкидування, або за будь-яким іншим способом, відомим корисним в даній галузі.
В одному з варіантів здійснення, гербіциди можуть бути використані для контролю росту бур'янів, які можуть бути знайдені, як такі, що ростуть в безпосередній близькості від рослин стійких до гербіцидів за винаходом. У варіантах здійснення цього типу, гербіцид може бути застосований до горщику, в якому стійкі до гербіцидів рослини за даним винаходом, ростуть в безпосередній близькості до бур'янів. Гербіцид, до якого рослини за винаходом є стійкими, потім може бути застосований до горщику в концентрації, достатній для знищення або пригнічення росту бур'янів. Концентрації гербіциду є достатніми, щоб знищити або пригнічувати ріст бур'янів, та є відомими в даній галузі техніки та розкриті вище.
В інших варіантах здійснення даний винахід передбачає спосіб боротьби з бур'янами в безпосередній близькості від стійких до гербіцидів рослин за даним винаходом. Спосіб включає застосування ефективної кількості гербіцидів до бур'янів та до стійкої до ауксинового гербіциду рослина, де рослина має підвищену стійкість до ауксинового гербіциду при порівнянні з немутантного типу рослиною. В деяких варіантах здійснення, резистентні до гербіциду рослини за винаходом представляють собою переважно сільськогосподарські культурні рослини, в тому числі, але не обмежуючись ними, соняшник, люцерну, Вгазвіса 5р., сою, бавовник, сафлор, арахіс, тютюн, томати, картоплю, пшеницю, рис, кукурудзу, сорго, ячмінь, жито, просо, та сорго.
В інших аспектах, гербіцид(и) (наприклад, гербіциди) можуть також використовуватись для обробки насінини. В деяких варіантах здійснення, ефективна концентрація або ефективна кількість гербіциду(ів), або композиції, яка містить ефективну концентрацію або ефективну кількість гербіциду(ів) можуть застосовуватись безпосередньо на насіння перед або під час висівання насіння. Препарати для обробки насіння можуть додатково містити зв'язуючі речовини та необов'язково барвники.
Зв'язуючі речовини можуть бути додані для покращення адгезії активних матеріалів на
Зо насінні після обробки. В одному з варіантів здійснення, прийнятні зв'язуючі речовини являють собою блок-співполімерні ЕО/РО поверхнево-активні речовини, але також полівінілові спирти, полівінілпіролідони, поліакрилати, поліметакрилати, полібутени, поліїзобутилени, полістирол, поліетиленаміни, поліетиленаміди, поліетилені міни (Гиразок(К), Роїутіп(К)), прості поліефіри, поліуретани, полівінілацетат, тилозу та співполімери, отримані 3 даних полімерів.
Необов'язково, також барвники можуть бути включеними в композицію. Відповідні барвники або пігменти для препаратів для обробки насіння представляють собою родамін Б, С.І. пігмент червоний 112, С.І. розчинний червоний 1, пігмент блакитний 15:4, пігмент блакитний 15:3, пігмент блакитний 15:2, пігмент блакитний 15:1, пігмент блакитний 80, пігмент жовтий 1, пігмент жовтий 13, пігмент червоний 1 12, пігмент червоний 48:2, пігмент червоний 48:1, пігмент червоний 57:1, пігмент червоний 53:1, пігмент помаранчевий 43, пігмент помаранчевий 34, пігмент помаранчевий 5, пігмент зелений 36, пігмент зелений 7, пігмент білий 6, пігмент коричневий 25, основний фіолетовий 10, основний фіолетовий 49, кислотний червоний 51, кислотний червоний 52, кислотний червоний 14, кислотний блакитний 9, кислотний жовтий 23, основний червоний 10, основний червоний 108.
Термін обробка насінини включає всі прийнятні способи обробки насінини, відомі в даній галузі, такі як протруювання насіння, покриття насіння, насіння цвітіння, замочування насіння, та пелетування насінини. В одному варіанті здійснення, представлений винахід передбачає спосіб обробки грунту шляхом застосування, зокрема, в сівалці: будь-якої гранульованої композиції, яка містить гербіциди, у вигляді композиції/препарату (наприклад, гранульованого препарату),
БО необов'язково з одним або більше твердих або рідких, сільськогосподарсько прийнятні носіїв та/або необов'язково з однією або більше сільськогосподарсько прийнятною поверхнево- активною речовиною. Даний спосіб вигідно використовувати, наприклад, на грядках зернових, кукурудзи, бавовника, та соняшнику.
Представлений винахід також включає насіння, покрите або яке містить насінину, оброблену композицією, яка містить гербіциди, та щонайменше один інший гербіцид такий як, наприклад,
АНАФ-інгібітор, вибраний з групи, яка включає амідосульфурон азимсульфурон, бенсульфурон, хлорімурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, бо оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон,
сульфометурон, сульфосульфурон, трифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам пеноксулам, біспірібак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталид та піритіобак.
Термін "покритий та/або який містить", як правило, означає, що активний інгредієнт займає найбільшу частину поверхні продукту розмноження під час застосування, хоча в більшій чи меншій частині інгредієнт може проникати в продукт розмноження, в залежності від способу нанесення. Коли згаданий продукт розмноження є (висаженим) посіяним, він може абсорбувати активний інгредієнт.
В деяких варіантах здійснення, обробку насінини шляхом застосування гербіцидів або препаратом, який містить гербіциди, здійснюють шляхом обприскування або опудрювання насіння перед висіванням рослин та перед проростанням рослин.
В інших варіантах здійснення, при обробці насіння, відповідні препарати застосовують шляхом обробки насіння ефективною кількістю гербіцидів або препарату, який містить гербіциди.
В інших аспектах, представлений винахід передбачає спосіб боротьби з небажаною рослинністю або контролювання бур'янів, який включає контактування стійкого до гербіцидів насіння рослини за представленим винаходом перед висіванням та/або після попереднього сходження, гербіцидами. Спосіб може додатково включати висівання насіння, наприклад, в грунті в полі або в середовище горщика в теплиці. Спосіб знайшов конкретне застосування в боротьбі з небажаною рослинністю або контролювання бур'янів в безпосередній близькості від насінини. Контроль небажаної рослинності слід розуміти, як знищення бур'янів та/або іншим чином уповільнення або пригнічення нормального росту бур'янів. Бур'яни, в широкому сенсі, слід розуміти як такі, що означають всі ті рослини, які ростуть в тих місцях, де вони є небажаними.
Бур'яни за представленим винаходом включають, наприклад, дводольні та однодольні бур'яни. Дводольні бур'яни включають, але не обмежуються цим, бур'яни родів: 5іпарів,
І ерісійт, «заїйт, 51еПага, Маїгісага, Апіпетів, Саїїпвода, Спепородійт, Ойіса, 5бепесіо,
Атагапіпив, Ропйшаса, Хапіпішт, Сопмоїмшив, Іротова, Роїудопит, Зезбрапіа, Атбговіа, Сігвійт,
Сагацив, бБопспив, боїагіит, Вогірра, Роїаїа, І іпаєтіа, І атішт, Мегопіса, АбшйШоп, Етех, Оайсшга,
Міоіа, СаІеорзі5, Рарамег, Сепіацгеа, Трпіоїїшт, Капипсин5, та Тагахасит. Однодольні бур'яни включають, але не обмежуються цим, бур'яни родів: Еспіпоспіоа, Зеїагіа, Рапісит, Оідкагіа,
Рпєит, Роа, Резішса, ЕІеизіпе, Вгаспіагіа, І оїшт, Вготив5, Амепа, Суреги5, Сорго, Адгоругоп,
Суподоп, Мопоспогіа, Рітргівіузії5х, Задічага, ЕІеоснагі5, Зсігриб5, Разраїшт, Ізспаєтит,
Ззрпепосієа, басіуіосіепіт, Адговії5, Аіоресигив5, та Арега.
Крім того, бур'яни за представленим винаходом можуть включати, наприклад, сільськогосподарські культурні рослини, які ростуть в небажаних місцях. Наприклад, рослина кукурудзи, яка росте самовільно, знаходиться на полі, що, головним чином, містить рослини сої, може вважатись бур'яном, якщо рослина кукурудзи є небажаною на полі з рослинами сої.
В інших варіантах здійснення, при обробці насіння, відповідні препарати застосовують шляхом обробки насіння ефективною кількістю гербіцидів або композиції, яка містить гербіциди.
В ще наступних аспектах, обробка ділянок, рослин, частини рослини, або насіння за представленим винаходом включає застосування агрономічно прийнятної композиції, яка не містить аї В одному варіанті здійснення, обробка включає застосування агрономічно прийнятної композиції, яка не містить гербіциди А.І. В деяких варіантах здійснення, обробка включає застосування агрономічно прийнятної композиції, яка не містить гербіциди а.і., де композиція містить один або більше агрономічно прийнятних носіїв, розріджувачів, ексципієнтів, регуляторів росту рослини, тощо. В інших варіантах здійснення, обробка включає застосування агрономічно прийнятної композиції, яка не містить гербіциди а.і., де композиція містить ад'ювант. В одному варіанті здійснення, ад'ювант представляє собою поверхнево-активну речовину, наповнювач об'єму, клейку речовину, проникаючу речовину, агент, що уповільнює плинність, рослинну олію, емульгатор, агент сумісності, або їх комбінації.
Крім того, слід розуміти, що вищевикладене відноситься до переважних варіантів здійснення представленого винаходу, та що численні зміни можуть бути зроблені в ньому без відступу від суті та обсягу даного винаходу. Винахід додатково ілюструється наступними прикладами, які не повинні бути витлумачені жодним чином як такі, що накладають обмеження на його обсяг.
Навпаки, слід чітко розуміти, що звернення може бути до різних інших варіантів здійснення, модифікацій та їх еквівалентів, які після прочитання опису в цьому документі, можуть бути запропоновані фахівцям в даній галузі, не відступаючи від суті представленого винаходу та/або обсягу формули винаходу, яка надається.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Бактеріальні штами. Хімічний компонент Ев5сПегіспіа соїї ТОРІ10 (Ше
Тесппоіодіеєб; 05) та ВІ21(0ЕЗ3) Со (Адіїепі Тесппоіодіе5; Сегтапу) використовували як реципієнт в експериментах з трансформації. Трансформацію проводили, як описано в Мапіаїйі5 еї а. МоіІесшіаг Сіопіпа: А І арогаїгу Мапиаї, Соїд Зргіпа Набог І арогаїогу Ргезв, Соїй Бргіпд
Набог; М.У. (1982). Адгорасієйут їштеїасієп5 використовували для введення ділянки Т-ДНК в араідопсис, кукурудзу та сою. Бактеріальні культури планомірно вирощували на бульйоні Лурія (8) або при 37"С на ІВ, змішаному з агаром (1595 мас/об.). ЇВ також доповнювали антибіотиком канаміцином та/лабо хлорамфеніколом, де це потрібно. Плазмідну ДНК отримували, використовуючи Сепедеї Ріазтій Міпіргер КИ (Тпегто зЗсіепійіс, 5). ТИПА та його варіанти генерували за рахунок синтеза генів (Еигоїп5, Септапу). Синтезовані гени, які містять сайти рестрикції ХпоЇ та МесоЇ, клонували у векторі рЕТ24а М-НІЗ із резистентністю до канаміцину. Шаперонна плазміда роОго/ (шаперони дгоЄїЇ та дгоЕ5) з резистентністю до хлорамфеніколу була отримана від ТаКаКа (дарап).
Приклад 2: Синтез генів, рестрикційні розщеплення та клонування. Синтез генів відповідне клонування в вектор рРМК-КО було здійснено компанією Еигоїп5 (Сегтапу). Рестрикційні ферменти були доставлені з Нової Англії. Рестрикційні ферменти використовували відповідно до інструкцій виробника.
Приклад 3: Очищення протеїну. ТгіА та його варіанти були отримані в Е. соїї ВІ 21(ОЕ3) Соїа (Адіїеп!і Тесппоїодіе5, Сеппапу). Тому Є. соїї трансформували з відповідним експресуючим вектором тег рЕТ24Я4 М-НІЗ5 та шаперонною плазмідою роОго7 (шаперони дгоЕїЇ та дгоЕб5).
Бактеріальні штами вирощували при 30 "С в 100 мл ЇВ протягом 20 годин, та експресію протеїну індукували 0,1 мМ ІРТО при 25"С протягом 20 годин. Клітини збирали шляхом центрифугування при 3000 об./хв. при 4 "С протягом 20 хв., повторно суспендували в реагенті для екстракції протеїну Вид Вивхіег (Момадеп, Септапу) відповідно до інструкцій виробника.
Лізати просвітлювали за рахунок центрифугування. Зразки бичачого сироваткового альбуміну (5, 10, та 20 г) завантажували в кожен гель, аналізували за допомогою денситометрії, щоб
Зо забезпечити внутрішній стандарт. Визначення протеїнів було підтверджено з використанням методу аналізу протеїну з Комассі барвником, відповідно до інструкції виробника (Тпепто
Зсіепіййс; ШИБА). НіІб-мічені ферменти очищали з використанням метал-іонної афінної хроматографії, застосовуючи набір Мі-ІЮСА 1000 (Маснегеу-Мадеї, Сепгтапу), дотримуючись інструкцій виробника. Очистка протеїну досягалась 505-РАСЕ з використанням МИРАСЕ Момех 4-12 965 біс-Тгіз заводського виробництва гелі (І їе ТесппоІодіе5; ОА), забарвлені Кумассі діамантовий блакитний (Зегма, Септапу). Концентрації протеїну оцінювали, вимірюючи поглинання при 280 нм, використовуючи І атбраа Віо-- (РегКкіп ЕІтег, ОБА).
Приклад 4: Кінетика ферментів. Суспензію клітин у фазі спокою, яка містить ген ТА, інкубували з різними азинами, меламіном та атразином, та культуральний фільтрат аналізували за допомогою УЕРХ-НА-МС. Субстрати були отримані або від бідта-Аїйагісп або синтезовані на місці. Синтетичні стандарти та продукти ферментативної реакції аналізували, використовуючи
УЕРХ-НА-МС (Тпеппо/Оіопех УЕРХ ШПіМагез000, сполучений з ОЄЕхасіїме мас-спектрометром з високою роздільною здатністю). Колонку Умаїег5 Асдийу Не ТЗ (2,1 мм; 100 мм; 1,8 мкМ) використовували з рухомою фазою вода/ацетонітрил (0,1 965 мурашиної кислоти) зі швидкістю потоку 0,6 мкл хв.7. Ферменти використовували розчиненими в 25 мМ натрію фосфатному буфері (рН 7,2) з концентрацією субстрату в діапазоні від 1 нМ до 10 нМ при 30 "С. З плином часу вихідний піковий азин зник, тоді як ОН-метаболіт (продукт реакції), який утворюється збільшився. Продукт ідентифікували шляхом визначення точної формули та застосовуючи аналіз точних фрагментів МСО-МС. Більше того, для деяких сформованих продуктах аутентичні стандарти були спільно елюйованими. Розкладання у 95 розраховували по відношенню до клітин, які містять пустий вектор як контроль. Результати показані в таблиці 3.
Таблиця З б-циклопентил-Ма4-(2,3,4,5,6- . Меламін пентафторфеніл)-1,3,5-
Мутація нази? 4 Діамін п мот 11110110 моє 1111110 ма 11110110 мМ 1111о11а бл 11111010
М 11110 бла 11111711 11111110 в 11116111 млбуотМ 11111110 млбуотт 11110110 мбТейМ 11111011 мі. Са ріал ріг рів 1111111 мубУМІББМ СГ муоуртавемМІБВМ 77777711
БИТ 111111во 11111110 мУОСО7ТівІ5ЯА 77111112 11111110
МУбЮЙТв УА 11110111 ввміяаі 11118110 ввміяаМ 11110110 ввміяаІвІВяМ 11116110 ввміяауІБТА 71111111 ява
М7оУСТіЯ2гУМІББАРІБТАЇГЛГ///77777777777777/Ї1111011Ї111111111111
М7бІО7Тія2ММІББАРІБТАЇГ/Г//7777777777777 ЇЇ мтосоутріавІМІБМ 77777779 11111110 мТосопрігвІМІББУвІВИЙ. 77777717 ЇЇ шлЛІМЯМА ГГ 7 8ВАМЯТАТЯ2М77777777777777717Г1111101Ї1111111111
ВВАРІБЯЇ 71111111 вВАРІБИЯ 777111111111111171С111121Ї1111111111101
МвЗА ССС111Г61 11101 ма 1111 м 1111111
А 11111
МТА ССС вва 71111010 шявЕ -(/-:ХСССССССССССССС77777777171111111111111С1о01111101 ево1111С1о01ї1а4 шявА11111Г011101 мам 11111113 11111110 мав 111111111111111111111011111111111101 рі2857771111111111111111111111111111111111111111111011111111111101 рдіавмМ 11111112
МІ 1111111111111111111111111114 11111110
МІББАГГ///1111111111111111111111111Ї1111101Ї11111111114
МІББЕ 11111110 0
БМ 11111111 11111110 я рен
Мутація Меламін пентафторфеніл)-1,3,5- триазин-2,4-діамін ня 186
ВВАМІЄЙЇ 77711111111111111111111111111Ї111121111111111101 ваТІеВАМІЄ 777777777777717111111111111171Ї1111719 11111114
АгІвА 11111111 11117164 11111110 рРОЛЯВНІЯЯМ 77111111111111111111Ї11112111111111111101 пет17мРгТЯвНнгЯЯМ 77777777777771111111111117111117181 11111101
АРТ 11111116 11111111
Аг 11111103
Агов 11111100
ІБ7ААДгОС 11111111111111Ї1111101Ї11111111111101
Бг465 -///11111111111111111111111111111101ї11111111111
БгвТ 1111111111111111111111111110ї11111111113
БО 111111111111111111111111140 11111110
Бг46О //////1111111111111111111111111110ї11111111115 щЩщ
ВАТА 11111110 вам 11111102 ват 11111118 11111110 ргеява11111111111111111111111111111717 11111110 нем гг111111111111111111111111111111111лою 11111101 неЮм 11111111111111111111111111111111111111111110 ям 11111115 11111110 беевТ777771111111111111111111111111111111117163 11111110 безв5///777771111111111111111111111111111117183 11111101
ВЗА 11111111111111111111111111Ї111110111111111116 1
ЗТ 11111101 я рен
Мутація Меламін пентафторфеніл)-1,3,5- триазин-2,4-діамін
БМ 11111111Ї1011111111111101
МЕ 77771118 11111111
ЯК 11111112 1111110
АВІ29 АТЗ 11110111111111111183
АТО МЗС 11118 11111110
ААТО ВІВ211111111111111111111111111111101111111111112
АвІЯ ВО 777777771111111111111111111111111711111111111111110
Ммо5 11111110 11111110
В 11111111 11111110 57571110 11111110 8 11111110 10 лМмягА 77777771 111178711111111171117199
ОлІМміягАУЯЯІ 77777771 111178911111171717171711110011111 лміягАрТаВа 77777771 11110111111111111716
ОлІМіягАрТаВА 77777711 111171017111111111117198
Олі МіввАГЯ2АУЯІІ 77777771 1111714111771717171717171719911
О7ІМіввАГЯ2АУЯЗНеТТА1111717171717171711111111111111112 1 17111717171717171717179911
О7ІМіВВАГЯ2АрТІВА 17771110 11111114
ОлІМіввАгяЯгАрТаВО 11171711 111101171111111111117191111
О71МіЯгАУЯЗРрТаВА 11171711 11110117111171717171717171719811
О7іМміягАуЯЗРрІгВа 11717171 11110111111111111171741
О71міягАуЯЗРрігваоЯ6Т 77777711 11117111717111171717171711719911
О71МіягАМІББТЕІ5И. 77777771 11117144 | 777777171717171719821
О71МіягАМІББТЕІ5ЯМ 77777771 11117152 1 |777717171717171717179911 лмягАрЗаВ 77777771 11110111111111111716 егАУЯЯІ 77777771 1111100 Ї7777171717171717171799
МаЗА 11111111 1111100 | 66 мМ 11111111 111100 17771111 98 маЗЕ 11111117 111198 11111183 пета 111111111111111111111111111111111171100 11111118 пета 7711111111111111111111111111111111117111898 11111116 рео////77711111111111111111111111111111017111111111117116 зав 77777711 1111101711111111111119
ЕВЗАГЯгАУЯЯІ 77777111 1111771111111117117991 ве ягАУЯЯІ 77777771 11117101171111111111117185....Ю...С увБІЯгАУУЗМ 77777111 1111011111111111117124
УВБІРВЗАГЯгАУЯІ 17777111 1111011711111111111115. увБІгегАУУЗІ Ого 11717171 111101111111111117196 увБІтегАМУЗІрІгВАравоВ 77777771 110111111111111718 11 егАУУЗМ Орг 77777771 1111710117111111111111799
ВВАГЯгАМУЯІ. 77777771 111101117111117171717171711785.......С 8ВАГЯгАМУЗМ 77711111 11110111111111111117125
УВБІТЯВАГЯ2АМОЯІ 77777717 11110111711111111111171131111С у
УвБІТЯВАГЯ2АМЯЗМ 11111111 1111011711111111111171131111 у увБІТеВАГОгАМОЗОТаВЯ11117171717111111111111111110111111111111111711111 у сувБІеВАГогАМОЗуУрІгВа 11111110 уві 8вАгогАУОЗІОЯ6ТрІ28а11111111111111Їо0111Ї1111111111111211СсС1С уві 8вАгогАУЯЗМсОЮЄТОТаВО 11111104
УВІ 8вАРВОАГогАУОЗІОЯ6ТрОТ2Ва11111111Їо011Ї1111111111191111сСс1 у
УВІ 8вАгВОАГогАУЗУСЯвТОТаВа 77777110
О71МміЗгАМУЗОЗ6ТОТаВа 17771710 111111111117185СсС21С пегАУоЗсЮвТОТаВа17777111111111111111111111Ї11110111111111111194с1 пегАУЯЗМ 11111110 11111111117158..7717С21 пегАУЯЯІ 71111111111111111111111111111111Ї1111101111111111111175 С егАУОЗУМІБУТРІВЙ. 777777777771111111111111Ї11111011117111117171717171717199121 егАУОЗІМІБ5ТРІ5Я. 777777777777111111111111Ї11114111111111111719981171 вВАГОгАУЯЗРІВЙ 7777777777111111111111111Ї1111111111111111719911171
МВТ ЯгАУЯЗІРІВЙ.777777771111111111111111Ї111111711111111111117199171
Мув7НніЯгАМОЗРІ5Й. 77777711 Ї11111011171111111111111118111 (Уві ВвАгВОАгогАУоЗУСобТрІгВаМІБ5УРІ5ИЯ 6117 Ї7777777717171113111
Приклад 5: Спрямований розвиток амідогідролази. Азини були вписані в активний сайт моделі ТгіА (на основі кристалічної структури Тг2М та Аї2А) шляхом накладання молекул на меламін. Грунтуючись на цьому, були ідентифіковані залишки, які утворюють активний сайт та кишеню, яка зв'язує субстрат. Зміненими не були основні ділянки, які відповідають за координацію сайт-активного іонного металу; залишки, які, як відомо, є суттєвими для активності амідогідролази; залишки, які утворюють гідрофобну "базу" активного сайта або є суттєвими для взаємодій гідролазної активності з ароматичним кільцем субстрату. Однак, амінокислоти були модифікованими для розширення ферментної кишені. Модель використовували, з одного боку, для прогнозування амінокислотних мішеней від активного сайту, що може впливати на прийняття триазинів взагалі, з іншого боку, модель використовували для того, щоб ідентифікувати простір, який потребує амінокислот в ферментній кишені, який може бути змінений в напрямку менших амінокислот, які мають подібну гідрофобність, щоб досягти розміщення більш об'ємних азинів без зміни ферментної активності.
Приклад 6: Створення моделі рослин стійких до гербіциду. Створення стійких до азину
Агарідорзіз рослин, які мають мутантні амідогідролазні послідовності. Бог трансформація немутантного типу Агабрідорзів Інаійапа або з амідогідролазними послідовностями на основі ЗЕО
ІО МО: 1, яка кодує 5ЕО ІЮ МО: 2, клонують з використанням стандартних способів клонування, як описано в ЗатрбгоокК еї аї. (МоїІесшаг сіопіпд (2001) Соїа 5ргіпд Нагброг І арогаїогу Ргез5) в бінарному векторі, який містить генну касету маркера резистентності (АНА5) та мутантну амідогідролазну послідовність (позначену як ЗОЇ) в послідовності між Уубіквітиновим промотором (Рсирі) та термінатором наполінсинтази (МОБ). Бінарні плазміди вводяться в
Адгорасієгит їштеїасієпє для рослинної трансформації. Агарідорвзіє Шайапа є трансформованою з мутантними амідогідролазними послідовностями, застосовуючи спосіб фарбування зануренням у флоральний барвник, як описано МеЕ|Їмег та 5іпдай (МО 2008/124495).
Трансгенні рослини арабідопсису піддаються аналізу ТадМап, для аналізу кількості інтеграційних локусів.
Приклад 7: Дослідження моделей рослин на стійкість до гербіцидів. Для відбору використовують стійкі до азину рослини Агарідорзів ІНаїіапа, які експресують ТА та їх варіанти.
Зо Вибрані лінії Агабідорзіз ІНна(йапа оцінювали щодо покращеної резистентності до азинів, таких як б-циклопентил-М4-(2,3,4,5,6-пентафторфеніл)-1,3,5-триазин-2,4-діамін в 48-лункових планшетах. Таким чином, Т2-насіння поверхню стерилізують шляхом перемішування протягом 5 хв. в етанолі - вода (70-30 за об'ємом), одноразово промиваючи сумішшю етанол ж вода (70-30 за об'ємом) та двічі з використанням стерильної деіонізованої води. Насіння повторно суспендували в 0,1 95 агарі, розчиненому у воді (мас/об.). Від чотирьох до п'яти насінин на лунку покривають твердим живильним середовищем, яке складається з напівсильного живильного розчину Мурасіге та Скуга, рН 5,8 (Мигазйпіде апа 5Ккоод (1962) Рпузіоодіа 40 Ріапіагит 15: 473- 497). Сполуки розчиняють в диметилсульфоксиді (ДМСО) та додають до середовища перед затвердінням (остаточна концентрація ДМСО - 0,1 95). Багатошарові планшети інкубують в камері зростання при 22 "С, відносній вологості 75 90 та 110 мкмоль Рпої 7 м-2 7 с-1 з 14: 10 годинним світлом: темним фотоперіодом. Інгібування росту оцінюють через від семи до десяти днів після посіву в порівнянні з немутантного типу рослинами. Коефіцієнти стійкості розраховують грунтуючись на значеннях ІС50 інгібування росту трансформованих по відношенню до нетрансформованих рослин Агарідорвхіє. Крім того, трансгенні Т2 або ТЗ рослини Агарідорхіє досліджують щодо покращеної стійкості до гербіцидів, які інгібують біосинтез целюлози, в процесі дослідження в теплиці.
Приклад 8: Створення та дослідження сільськогосподарських культур щодо стійкості до гербіциду. Бінарні вектори генерують, як описано в Прикладі 9. 5оуреап см ЧдакКе аге Ігапотоптеа аз ргеміоивіу дезстірейд ру бітіп52Ку єї аІ., Рпуюспет Веум. 5:445-458 (2006). Після регенерації трансформанти пересаджують в грунт у невеликих горщиках, які розміщають у камери росту (16 годин вдень/8 годин вночі, 25 "С вдень/23 "С вночі, 65 95 відносної вологості, 130-150 мікроЕ м-2 с-1) та згодом досліджували щодо присутності Т-ДНК за допомогою аналізу Такмана. Через кілька тижнів здорові, трансгенні позитивні, одноразові події пересаджують у більші горщики та дають можливість рости в камері зростання. Оптимальний проросток для різання становить близько 3-4 дюймів у висоту, щонайменше, з двома присутніми вузлами. Кожне зрізання береться з оригінального трансформанта (маточної рослини) та занурюється в порошок гормону утворення (індол-З3-масляна кислота, ІВА). Зрізання потім поміщається в оази клиноподібного всередині біо-купола. Маточна рослина дозріває в теплиці та збирають насіння.
Одночасно також проводять зрізання немутантного типу, які служать як негативні контролі.
Зрізання зберігаються в біо-куполі протягом 5-7 днів. Через 7-10 днів після перенесення в клиноподібні оази, коріння обробляють, застосовуючи живильний розчин з гербіцидом. Типові фітотоксичні ознаки, такі як клубовий корінь, оцінюються через 3-4 дні після обробки. Менші пошкодження або відсутність пошкоджень у трансгенних рослин у порівнянні з немутантного типу рослинами інтерпретують як стійкість до гербіциду.
Для обробки перед проростанням, використовувані контейнери культури представляли собою пластикові вазони, які містять супісковий грунт з приблизно 3,0 95 гумусу як субстрат.
Насіння досліджуваних рослин висівали окремо для кожного виду/події. Використовувані активні інгредієнти, які були суспендовані або емульговані у воді, наносили безпосередньо після посіву з використанням тонко розподіляючих форсунок. Контейнери обережно зрошували, щоб сприяти проростанню та росту, та згодом покривали прозорими пластиковими кришечками, поки рослини не вкоренилися. Дане покриття викликало однорідне проростання досліджуваних рослин, якщо це не було порушено активними інгредієнтами. Результати показані на фігурі 1 та
Зо в таблиці 4.
Таблиця 4 071 М І92А УОЗЕ 0обт 01280677 ІВАНОЛАГ/Г/З/ |. С 071М І92А УОЗЕ 096Т 01280111 ІВАНЕВЙГ/: |. С 071 М І92А УОЗЕ йобт рі2867 ВАНОУМГ/З( | -- 3 пяаА МУЗ 77777711 ІВАНОМ | 777777 -сСсС у пяаА МУЗ 77777711 ІВАНОМ | 777 -сСсС пеаА МУЗ 77777711 1ВАНЕАВ7Г/: ОЇ. 77-71 .,
Яга МУЗ 77777771 1ВАНЕЕМ | 7777771 .у пеаА МУЗ 77777711 1ВАНЕОМГ/Г/Г/// | 7777-71 . пяаА МОЗЕ 77711111 1ВАНЕЮЙ ГГ | 7777-71 . пягА МУЗ 77711111 ІВАНЕЮЮЄГ/Г///// | 7777771)
ягА МОЗ 77777111 ІВАНЕЮЄССГ/// | 77777711 егА МОЗ 77777711 1ВАНЕВЕ ГГ | 7/1 . егА МОЗ 77777711 1ВАНЕЮГ/: ОЇ 77777 -сСсС у 071МІ92А МУЗ 77777771 1ВАНСОТГ/Г///// | 777777 су 071МІ92А МУЗ 77777771 1ВАНОМГ/Г/Г/З/ | /- С 071МІ92А МУЗ 77777777 1ВАНОНТГ/Г/Г//Г/ | 7-1 071МІ92А МУЗ 77777771 91ВАНСОВГ/Г/// | 777-771 . 071МІ92А МУЗ 77777771 91ВАНОНЗГ/З |. 7/1 .у 92А МОЗ МІББМ ІБ. 77777777 1ВАНЕЮ ГГ | 7777771 .у 92А МОЗ МІББМ ІБ. 77777777 1ВАНІАТГ/Г/Г/Г///// | 7777771 . 92А МОЗ МІББМ ІБ. 77777777 ІВАНОМ ГГ | -- 92А МОЗ ІБ 77777711 ІВАВСМ | 7777771 .у 92А МОЗ ІБ. 77777711 І1ВАНІМК//// | 7777-71 .у 92А МОЗ ІБ. 77777711 ІВАН | 77777771 . 92А МОЗ ІБ. 77777711 1ВАНОСТГ/Г////// | 7777771 . 92А МОЗ ІБ. 77777711 І1ВАНЮКГ/Г/Г/Г///// | 7777-71 .у пегА МОЗ БІБ. 77777711 ІВАНІЮ ЇЇ 77777711
Незрілі ембріони кукурудзи були трансформовані відповідно до процедури, описаної в Репд еї аі. (М/О2006/136596). Рослини досліджуються щодо присутності Т-ДНК за допомогою аналізу
Такмана, причому ціль є термінатором по5, який є присутнім в усіх конструктах. Здорові на вигляд рослини відсилаються в теплицю для загартування та наступного дослідження на розпилення. Рослини індивідуально пересаджують в грунт МеїгоМіх 360 в 4" горщиках. Один раз в теплиці (цикл день/ніч 27 "С/217С з 14-годинною тривалістю дня, що підтримується за допомогою 600 Вт натрієвого освітлення високого тиску) їм давали рости протягом 14 днів.
Трансгенні рослини кукурудзи культивують до насіння Т1 для дослідження щодо стійкості до гербіциду. Через 14 днів після перенесення, коріння обробляють з використанням розчину поживної речовини з гербіцидом. Типові фітотоксичні ознаки, такі як клубовий корінь, оцінюються через 3-4 дні після обробки. Менші пошкодження або відсутність пошкоджень у трансгенних рослин у порівнянні з немутантного типу рослинами інтерпретують як стійкість до гербіциду.
Для обробки перед проростанням, використовувані контейнери культури представляли собою пластикові вазони, які містять супісковий грунт з приблизно 3,0 95 гумусу як субстрат.
Насіння досліджуваних рослин висівали окремо для кожного виду/події. Використовувані активні інгредієнти, які були суспендовані або емульговані у воді, наносили безпосередньо після посіву з використанням тонко розподіляючих форсунок. Контейнери обережно зрошували, щоб сприяти проростанню та росту, та згодом покривали прозорими пластиковими кришечками, поки рослини не вкоренилися. Дане покриття викликало однорідне проростання досліджуваних рослин, якщо це не було порушено активними інгредієнтами.
Для обробки після появи, досліджувані рослини спочатку вирощують до висоти від З до 15 см, в залежності від характеру розвитку рослини, та тільки потім обробляють гербіцидами. З цією метою, досліджувані рослини або безпосередньо висівають, вирощують в одних і тих самих контейнерах, або їх спочатку вирощують окремо та пересаджують в контейнери для дослідження за кілька днів до обробки. Оцінки пошкодження гербіцидом приймають через 2 та З тижні після обробки. Пошкодження рослини визначають за шкалою від 0 95 до 100 95, причому 095 представляє собою відсутність пошкодження, та 10095 представляє собою повне знищення. 100 означає відсутність проростання рослин, або повне знищення, щонайменше, повітряних фрагментів, та 0 означає відсутність пошкодження, або нормальний хід росту.
Помірна гербіцидна активність дається при значеннях, щонайменше 60, гарна гербіцидна активність дається при значеннях щонайменше 70, та дуже гарна гербіцидна активність дається при значеннях щонайменше 85.
Результати показані на фігурі 2 та в таблиці 5.
Таблиця 5
Фіто . росток росток росток росток росток я ее» 5 |» ою в/в в тип ний тип
ІГ92А У93І МІ звгтло (АНМХ оо 95) 15 35 ов 65 їв во) я
ІГ92А У93І МІ 5 ВАНІ МУ 15 5 45 5 10 5 Е1571.
ІГ92А У93І МІ звгтло (АНМО о 5 5) о во) о |в 5 во)
ІГ92А У93І МІ звгтло ПАН о о 95) 5 |ч5) | 20 в) я
ІГ92А У93І МІ звгнело Ан о| о || о || 5 |в) 5 |в) 5
Приклад 9: Конструкт бінарного вектора. Способи клонування, наприклад, використання рестрикційних ендонуклеаз, щоб вкоротити дволанцюгову ДНК в специфічних сайтах, електрофорез з агарозним гелем, очищення фрагментів ДНК, перенесення нуклеїнових кислот на нітроцелюлозні та нейлонові мембрани, з'єднання ДНК-фрагментів, трансформація клітин та культур бактерій Е.соїї проводили, як описано в ЗатбгооК еї аї. (1989) (Соїй бргіпд Натбог
Іарогайїогу Ргевзв: ІЗВМ 0-87965-309-6). Полімеразна ланцюгова реакція проводилась з використанням ДНК полімерази РІПизіоп'м Нідп-Рідешу ОМА Роїутегазе (МЕВ, Екапкіши,
Сегтапу) відповідно до інструкцій виробника. Загалом, праймери, які використовуються в ПЛР, були розроблені таким чином, що, щонайменше, 20 нуклеотидів з 3'-кінця праймера ідеально відтворюються з темплатою для посилення. Рестрикційні сайти були додані шляхом приєднання відповідних нуклеотидів ділянок розпізнавання до 5'-кінця праймера. ПЛР злиття, наприклад, описані К. НесКтап та Г. К. Реазе, Маїиге Ргоїосої5 (2207) 2, 924-932, використовували як альтернативний спосіб з'єднання двох фрагментів, які викликають зацікавленість, наприклад, промоторів до гена або гена до термінатора. Синтез генів, як, наприклад, описано в Слаг еї аї. (Ттєпав іп Віоїтесппоіоду, 2009, 27(2): 63-72), виконували за І їе Тесппоїодієз, використовуючи їх сервіс сепеагіф).
Зо Гени оцінювалися щодо використання кодонів та наявності сайтів рестрикції, які можуть перешкоджати зусиллям клонування. У разі необхідності гени були оптимізовані відносно кодонів, використовуючи стандартні протоколи для максимальної експресії в сільськогосподарській культурній рослині (наприклад, дивіться, Риїдбо еї а. 2007 та Сазрег еї аї. 2012), а також видалення небажаних сайтів рестрикції. Гени були або синтезовані з використанням СепеАгі (Кедеп5риго) або ПЛР-ампліфікували з використанням РПизхіоп'"м Нідн-
Еідеійу ДНК-полімерази (МЕВ, ЕгапкГигі, Ссептапу) відповідно до інструкцій виробників з КДНК. В обох випадках сайт рестрикції Мсо! та/або Авсі в 5'-кінці, та сайт рестрикції Рас І в 3'-кінці вводили для того, щоб дозволити клонування даних генів між функціональними елементами, такими як промотори та термінатори, з використанням даних сайтів рестрикції. Модулі промотор-термінатор або модулі промотор-інтрон-термінатора були створені шляхом повного синтезу з використанням СепеАгі (Кедепобиго) або шляхом приєднання відповідних елементів експресії з використанням злитого ПЛР та клонування ПЛР-продукту в ТОРО-вектор рСК2.1 (Іпмігодеп) відповідно до інструкцій виробника. В той же час, приєднання послідовностей термінатора до послідовності промотора або послідовностей промотор-інтрона або за рахунок синтезу цілих касет або з використанням злитого ПЛР, послідовності розпізнавання для рестрикційних ендонуклеаз додавали в обидва боки від модулів, та сайти впізнавання для ендонуклеаз рестрикції Мсої, АбсіІ та Расі вводили між промотором та термінатором або між інтронами та термінатором. Для того, щоб отримати остаточні модулі експресії, ПЛР- ампліфіковані гени були клоновані між промотором та термінатором або інтроном та термінатором з використанням сайтів рестрикції Мсої та/або Рас І.
Альтернативно, синтез генів, як, наприклад, описано Слаг єї аї. (Тгтепавз іп Віоїесппоіоду, 2009, 27(2): 63-72), може здійснюватися І їе ТесппоЇодіе5, використовуючи їх сервіс Сепеагіф)
Стандартні способи, такі як клонування, рестрикція, молекулярний аналіз, трансформація клітин
Е.соїї та культури бактерій, можуть бути виконані, як описано в затрьгоок еї аї. (1989) (І аротаюгу
Ргез5, Соїдй З5ргіпд Натог, ІЗВМ 0-87965-309-6). Полімеразна ланцюгова реакція може бути виконана з використанням ДНК полімерази РПизіоп'м Нідп-Рідейшу ОМА Роїутегазе (МЕВ,
Егапктигі, Сегтапу) відповідно до інструкцій виробника. ПЛР злиття може здійснюватися так, як описано в К. НесКтап апоа Г.. Б. Реазе, Майшиге Ргоїосої5 (2207) 2, 924-932. В обох випадках сайт рестрикції Мсої та/або Авсі в 5'-кінці, та сайт рестрикції Расі в 3'-кінці вводили для того, щоб дозволити клонування даних генів між функціональними елементами. Модулі промотор- термінатор або модулі промотор-інтрон-термінатора були створені шляхом повного синтезу з використанням СепеаАгі (Кедепориго) або шляхом приєднання відповідних елементів експресії з використанням злитого ПЛР та клонування ПЛР-продукту в ТОРО-вектор рСК2.1 (Іпмігодеп) відповідно до інструкцій виробника. В той же час, приєднання послідовностей термінатора до послідовностей промотора або послідовностей промотор-інтрона або за рахунок синтезу цілих касет або з використанням злитого ПЛР, послідовності розпізнавання для рестрикційних ендонуклеаз можуть додаватися з обох боків від модулів, та сайти впізнавання для ендонуклеаз рестрикції Мсої, АзсіІ та Расі можуть бути введені між промотором та термінатором або між інтронами та термінатором. Для того, щоб отримати остаточні модулі експресії, ПЛР-
Зо ампліфіковані гени були клоновані між промотором та термінатором або інтроном та термінатором з використанням сайтів рестрикції Мсо! та/(або Рас І. Гени, які викликають зацікавленість, можуть бути кодон-оптимізованими з використанням стандартних протоколів для максимальної експресії в сільськогосподарських культурних рослинах (наприклад, дивіться
Риїдбо еї аі. 2007 та Саврег еї аІ. 2012) а також за рахунок видалення небажаних сайтів рестрикції та синтезованих СепеаАгі (Кедепзригоу, сеппапу).
ПОСИЛАННЯ
Ебзег НО, Бириї5 б, Ебреп Е, Магсо с), Моде! С (1975) 5-ТПіаіпев. Іп: Кватеу РС, Каштап ру (едз) Небісіде5, спетівігу, дедгадайоп апа тоде ої асіп. Магсе! ОекКег, Мем МогїКк, рр 129- 208. зЗепПетіск Л., МеТамівй Н, О5рогпе УР, де 5оцйга МІ, ЗадомузКу МУ, УМаскей І Р (2002) Атгагіпе спіогопуадйгоїазе їот Рзейдотопах 5р. 5ігап АОР і5 а теїаПОепгуте. Віоспетівгу 41: 14430- 14437.
Маскеї! єї а).; Віодедгадацйоп ої аїгагіпе апа геїаївд 5-Шагіпе сотрошипав: їот епгутезв ю їієїй вішаїез, Арріїєд Місторіоіоду апа Віоїесппоіоду; 58 (1), 39-45, 2002. де 5о0цга МІ, ЗадомеКу МУ, УМасКей І Р (1996) Атгагіпе спіогопуагоїазе їтот Рзейдотопаз 5р взігаіп АОР: Сепе зедиепсе, епгуте ритгіїїсайоп, апа ргоївїіп спагасіевгігайоп. доштаї ої Васієегіоіоду 178: 4894-4900. зЗадомекі єї а; 05 6369299, Тгтапздепіс ріапіз ехргеззіпд Басівгіа! аїгагіпе дедгадіпд депе
АА Раддейе 5. В. еї аїЇ., 5Зйе аігесівд тиїадепевзіє ої а сопзегуей тедіоп ої Ше 5-
Епо!Іругиму!5піКітаїе-3-рпозрнаїе зупінавзе асіїме5-5іїе.; 9У.ВіоІ. Спет., 266, 33, 1991.
Мапіаїів єї аІ. МоїІесшаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї!ї, Соїд 5ргіпд Набог І абогаїюгу Ргезв,
Соїа 5ргіпу Набог; М.У. (1982).
Савзрег Р., Оїїмеїка 9У-Г., Еготтіеєї у., Запіо5 М.А.5., Моша с. (2012) ЕСепе: тахітігіпу зупіпеїйс депе дезідп тог пегіегоіїодоив ехргеззіоп. Віоіптоптаїйсв 28(20), 2683-2684.
Митгазнпіде апа 5Коод 1962 РНузіоіодіа 40 Ріапіагтит 15: 473-497, МоїІесшаг сіопіпа Со бргіпа
Нагбог І арогаюгу Ргев5 (2001).
Котогі Т., Ітауата Т., Кайо М., Ізпіда У., ОеїКі 9., Котагі Т. (2007) Ситепі Зайшв5 ої Віпагу
Месюгз апа 5ир-ріпагу Месіюг5. Ріапі Рпузіоіоду 145, 1155-1160.
Риїдбо Р., Сби2тап Е., Вотеи А., Сагсіа-Маме А. (2007) ОРТІМІ2ЕН: А Ме Зегмег ог
Оріїтігіпд Шіе Содоп Озаде ої ОМА бедиепсев. Мисівіс Асідх Везєагсі 35 мжшер 5егег еайіоп.
Му126-М/131. зітіп52Ку В., Ріапі суюоспготе Р4і50-теадіаїей Пегбісіде теїароїїзт, Рпуїюснпет Нем. 5:445- 458, 2006.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105» ВАБЕ ЗЕ «120» РОСЛИНИ, ЯКІ МАЮТЬ ПІДВИЩЕНУ ТОЛЕРАНТНІСТЬ ДО ГЕРБІЦИДІВ -130» 160566У/002 «1505 ЕР16179593.5 -1515 2016-07-15 -1605» 32 «170» ВІББАР 1.3 -2105 1 «2115 1425 «212» ДНК «213» Рзейдотопав «4005 1 втвсзавссК тозоквесся са сковосесва ас а ОЦ п стопа осіння сосссвозак сосснтвко Єтосаск аку сатоєа. їх аа с сосстссочс возекеосеєе астозтасзс ска сванах КОКС хо щит атса візсвсатас сов жвас сазасістоє осцішоа тесовекесях аа
Фа счсснОс Бабак зетосттааї пса соЗаїсвоа васаахасв а ссдозззато сосвОїтос зЗстсчесто атомна заосаоске снах ї5о вес сакта зтратаатеє зчавннесєс веттажссмчн пізасажтов все єе зи песо тата поза тоз тостсаакк За сссс зас сао «о чацюсчсв стсжщнюєта сабо соса стозачвсає псачсєя ско асо ва хна Ммнаацавис счсзаЕсЗсз зазозтєнта бтвссОаєВех зарсваксяя МюЮ татсвтдеїв свусавоцсяЗ состав твоЄ азс нєтв сассоосває сгвсвссвоєа БО зт века сон асао остов зсоазесцеос ау акОси и зессжоасажа сосен о совісті зазсстос зЕточоавинеа сс садаа «ВО їтасвіЗоває зкКасцессе остозатвав суЄсстеюан ссосаЄвВУкО сесеємЕеКх БО часи вка ас аТск сасзахОкка Ваза сома Зо аасватзсяє зЕсснниза сечо сова вай ов асо ся ко ЗО жсвщїсосіз іібсяссзЯа тзакоскаат собваїваа сс овасає пасе є 1926 зчзазїтв сщсссасак сао ЗК ксЗт і вкосазаци ста зов цавзазаттс созазеос аассатсах обсегасєзів песто доаЕсакува КО агтосФєвеаса ттовавссоу сзаасвсвся дасте що зер ОЮ сазасаасак сосатсатса КСспюКазасс ассяуиЕЕ КісЗОдеаса бозслагтода 1250 цщіївасасоз сто їоОа кобза згтаснюай абсо пак сто іх котссоцаяас зозаасмин асо стова дазшсасеня Зсососаає ссВаКску 1350 свисатзсаа тако тосє завтскодса бно аєє кова ї485 -21052
«2115 474 «212» РВТ «213» Рзейдотопав «40052
СІ які м : М а жук ких актуа й хх сил хім же ах ж
Ме обБіп Твг бен охег їі бів Ні бі ТВгоївиу Уді тТве Мет ав овій й з ТВ и
Х 5 ії 15
В с х ї 7 чи м ки ще ус КЕ ж хе че жу дети жодким жк вго Ага УВІ фев бі АБО баг їв о УВІ Ні УВі ів АВ оРУ АГ ! 7 "2 85 в : Я хз ен ко о мі АР КА фам ор мя фен А ках ких ї1й Уа ліз зви біу Уві ві АТа до Зеб уд! вго бе бро Аза ахр 35 | з 45 ках с За з і ве тк бал иа а рр трун ех; За жїв дек акц УВІ їі а55 АЇВ АгРО сію бух уд Уа! бе ве обу Ре жів дей жу о о ко 55 що І діа Мі ТнРОНів Узі Ап Бій хів сем ів ве сію і вгОо Заг іх ше м з. с ща У ях як; пі ага Бій іву Туг Ар оїго сви РБе дей ма? ви ТУ вро бі бів
Є х ех тю г
ХЕ Зо ЗУ ух Аїв Мет Ага го БІВ аз УВІ зів Узі Аїв Уа Ак Сев Туг Су т лу за ях г 100 5 що х 3, З У г кожи Ву тя Кам Ех а ох о іх х чу Можу дів сій дій УВІ де Беє шію хів тб Отве лів Ап Ар АВР АТ АВ
ЗЕ У К В З З
Я ї й. ем «сх я - с х ні ху се Й дог зе кі АТ ше жаук о й Я ма ШЕ ек йіз жів Туг вгОо бі ап о їів 5ів Аза Аа ме САТ У ЇЇ БУР Бу іа 155 АН чів уві біУ Уа Ако Уа! а! Тук віз аго Мет ве вне А5р Ага мех с . Й и - ко - т КК додеич їх Та 155 Ок
М Я КО ки 7 7 т с т. є го З що фо жміу б Се Ж Шу мух ав сі ага іє бів бі Ту мжі аа дія ви бух АЇВ Агд тег рге 7 щи т з ух з ЗК ва ко ЖК г ху м х ; є ї- кор до т, з З. шої я. рук ск жу
Зі УДі Бі бву Суб бас жів май бім бів тТВгбоаїа ма віз уз йхВ
З 185 Її дО АК М Ю х З а ух ух я ух зер соя т хі- тет кх г доку ака ші Те о АТа Сен бег ар обів Тує нів Зі Таг абз б» о1у ака шо 155 ШО Ох . : ОХ а с ху су Фу кю дах хі ве Зе зуа п їі дек уві тТРр ого лів Рго ліз їв ТАБ оРго ліз УВЕ тТВгоУДІ Фів сі мех аг Тг"в із бі» АіЗ вне ліз го АББОАГО Ліз УЖ мех НЕ їх - бюл ех зи є ях ту Ж БЖ ях М й же ї
У ХА с х ї їх Ф Зх ее: дю да КУ я. йду Ук с 3 23; З Жак ке
Твгоїва ніх мет дід біц бег Ахо ніх Ав бів аг фев ніх їв мех же ка 5
ЖЕ ам «А чт я мож су дю уча вх зм; їм да жи се їхні щеговко дія чін Туг Меж біз Сух Тув ІУ Бец о їво Ар пів АК Бец за Зх З я «З Б
ЗіБ Уві ліз ніх Суз Уві Туг Бе Акв аг Бук Аз УВІ ака оСви ев
БІігОома 18 ВОК З з х пе 275 ЗВ ав
Ж «БУ Ки о хо шк ; «ооктха 7. суду ж Кр їх З дк" ків ТЕ ні аку нНіз ахп о Уві БУХ Уві дій вк оФім У! ща Звг одхп вів ту!
Зо ща ЗО и шх ож в ке го шу, ки сну ев. жа ву Кк во шу БегобтУ УВІ діа вгОо УВІ ВР бів меКоУВЕ ств абрТу Ммеє за зІїй 5 2 ою ки х оЖх -б ж з ж с фу В кі М пом «їж кеку ЖЕ Ак ск іх акт діЗ УВІ Біу її біу Тнг Ав Ахр у АВ Сук АБИ АБЕОЗАЕ а Ай ! 325 330 335 я ах ка ;
КІ хх «5 шт УМ « дії м'я жі мік ве й ія віх
Мет Ті біу АБО Мет цу5 Ре Ме Аїа ні іє ні АР лій зді Ві 7" зав " за5 350 ка У З І я іх З вах Зако Мкечия є фр КТК зок 7 : Ек : дрох сх с
Аг АВ дів аз Уві це ТВеоРго Фів бух Зі бев бію мес дів ті по боже х зим ЗК
За ЗО 55 ж ОА 3 й че о 5 ее си жують Кок 7 ях ех ша Я її а5в ТУ Аїд аг его їжи біт мех азр нів бів Хів Бі Зав їв 37 355 ЗБО
З лещ пе г Чек шує їокуєі СК ої хі деж. Кл деку до гир сі ТВ ОБіУ ух АР дій АВ о Бец Лів во ве АВВ СВ АГРО СНІВ вав ко Є У хр зах г
І з Зх В ох 5 ад ій ау чому арх ЗК яю дя туї дов бів Тйк о тТвг оБРо ніх ніх нів бе аїв аів те оті Ущ! не о АВ у І ЕХ, ще Я Б
КЕ КХ оо ме дім . ше хека Я ки ЩЕ о заще тує йіу аз обі Уві АБО ОТГ Уа Би За АБУ У АХА ча чаї мех
Й Ї 428 425 о р» «Ох Ж ї. Ух о з х ; му КЕ Ух їх Ух Є те вх ож у г кх М а ій ази Ага ага дво Заг Бе сен о Бто Рг бій аге БІБ це Аа вве 435 й а 445
Мви сів бів Аа біб Бег АРО АЇВ ТвгРоАЇа тів Бе оп АРО АЇВ АЖ 35 455 З
ЧУ ї во ще «ух СЕ у ко ких лхуху» ії хм
Мет Узі від ха Бко дій Тк дез Жабо ви
ЗУ Ко ях й в М «2105 З «2115 473 «212» РАТ «213» Рзейдотопав
«4005 З сг ча сш КЗ у во а; ж Ум ке скізуз кнкує зе шлю
Ме ій тТнг оре его тів сів мів біу ТвВке о без Уа! Твге має Аб5р хай
З Ж З ж -- и і У ід М туя с ско в ком дамою чо х есе за жук де ує ери х.
ТУК АК ОАГО УВІ Сен бі АВ бек їгроуаі Ні за! бів ач Бі Ага 7 т Жов Є " ск ве 7 о 25 що.
Її УуЩі дів ев сіу Уді ніз дів бів его УВІ го Вго его АТв хаз
Зк 7 я Я 3 ЗО БЕК с ше вик їм ки їх вра ик зі сухо Езахух аа фі ж ех ага Уа тів Ав Аїй Ага 5іУ Бу УВІ УЗ! Бан рРгОо біУу БВе їв Хда ж Ми Са У си 7 за 55 5 х ї бух ва ки х усю ко в охзх «55 шу яти Ж фі дм Ей діа нів ТВгоніх уві Аза бій жів цец бе аг пі біу вка 5ек ніз їх: «Фі ЗЕ щд во о їх ЗО
Зіу Ага бій Рве Туг АБр о тТкроцви Ре Ажп уві Уві Туг го Фу хаз
З і З
Кг з Мк й бр й, КУ сидр су 53 З 1 дм хх же
МУ Аа мех аго кго бін ав; Уа! ліз уві АЇа Уа! Аго це Туг Сух т у т НУ Яка т я Ух 100 пи с ше «о дк ко гаї уж мо Кук же о жі жк ще сеї вх хх х й хх із Бі Аїа Уві Ааго Бегобіх Хі твРотТВг їв дав вів ахз АВ Хав
А ще те зрохе оту 133 що еЗ - шк че гі гу ух ех хи у жі са А суще З и кт жу
Баг оліз їі Туг Бко Бі ха щі бів аа 13 Ма Аа УЩІі тТук Хаа 135 о чів УяЯ: іх Уа! Ага маї Уві Туг вів аг Меб Ре ве АБО Ага неї 145 кв 155 16
ТУ бо 155 59
АБО ОБіУ Ага ів бів бі ТУук УБі Яков лів Кен гу АВ АгЕ ес его т З хе вро " я хе же 155 чи 175 чу см, ско кер фах ВК Не: НИ зує хх з ка фури м зіп УВІ бій Бер Су Зак Хі Ма біб біз Ве Аа Уваї діа ух ха 7 зу и зу 4 ОХ ЩО : ух а ще х кошт й ой вх жо я я ЗУ дра ага Хі Твгоаід іву Баг од бів Туб Ніз біу ТВе дів біуУ біУ Ага 155 з 05 її 5ег УВІ Тео вто ід Бгто дій Те отВрРотве діа Узі ТБ Уві ха
Хі «ваг уді ТР вка дій вга дів Те тТВвКоОтТВ, вів Уві ІРО УЩІіІ ХхЗ; 230 ії ТО яке - же хз і ха кі ж є З м їфБІю х З з ки АХ й й їх дк її ща тки зі Мет Ага оте віз Бій ій вне АТ А ЧАЮ АТО АЛІ УВІ ВЕК І г 225 я У и
ТВг ов ні меж лів бів бег ах нія зро сій Ага їі Ні бі Ме:
ЕВ ЗВ ЕЕ
У ЗМ КІ
«вк овко АіВ Бій ТУуг МОЖ пін Су Туг біу сво іву АБО біз ага Гео нш Шо зе х ї ЗщЕ 7 СК і «о Й | «БУ те ці уд! віз ніх Суб У! ТУК ВН ар дго ГУ ВВ Ма Ага ви ву паж У в туї 7 я п як КЕ Ко . і Км а з В є шою рі за з я х за да тТУув ніх дга нів дза узі іУу5 Уді іа Берг обій ха чаї хег азс дів туї ка 55 цю в оБіК его ТУ У дій во УВІ вго Ото Мек уві Фр АГРО БУ мех дод - х «ух хх тугу.
З05 316 ТЕ ЗО 7 сис 7 с я Вк Мою Ех ху кі Кома йду дош Іі х т стиЖ дів УВІ «Чі їі бі ТвК о АКо АБ бі Ай Зег АБИ АБО ВІ дів хай 7 зак 7 жави жк
Ек і За я хя ЯК. ява мак ха МІ ша мів ких кій а нів
Мет Хіє біу ази Меї вух БВе Меї Аз Ні ЇТе нії Ако Акта ув! нів боса З " за х ЗБЕ
КО й За . й за ; аг Азр Аа йхр Уа! Кец те оРго бів вух Те сем бін меє дія тне що пи м
Ті азр о біУ АЇЗ АгО Бег офюй бік Мек ах Міз біб Жіє біу 5ег Пе та 175 15о ім тТнг о біу су5 ака вів дев гео тів ген ібц Авроіви АК НІВ Бу ач ї 7 и Кк їх й дує
ІК щі 395 чо
«я ку їх
Іа ніх хів ніх ако діа Уві Ні «Я їх Хі ніх ака ет
Ух Ме ме аіз ніх хів Ян Тю. Мн; ів біт до Мат рук вве копає зи ме» дів ТР чт щі біу азо мех 345 тів іви бій ме дід тв
МЕЖ Ре а болях З І кл ріж т ів Се: ана кпоуяі ей ТВе Его чі Ку 365 тв та дав о УДІ Це СТВ зкй зви ж вії ка ОІВ ага дяв аТа Ак уд 3650 ; нів бін Ті бі 52 як З Ту» ЖЕК ех з МЕ З 5 В НІ щі Ге
КІ ча дгО БВ ОБвр обі Ме АБ ЗО з ні ів с Бі ід дгеа ще пе т іа Вч НІВ А т
ЩІ АХВ СТУ КіХ АгО за ї16 ви їву 50 во арго 0
ЗВ дія аеро і ів Бу; так І ТАКИ
За же с ТУ кУуз аго віз аАБроке Но с овне вія діа ту!
ЗО У щі хів АТа вк їі УВІ вве фі їх
ЗЕ : виб ща АВ Вій Ж їм хх м; ек нів НІК БО дів мо зе ма Уві МЕї ха зга ака ви без ак їв Ач ці деп май вч
Іі сюЮ є ім й 5 сх 2 Ух Ї в па о чі аз З г В та оУщі рев, ук хіх рми ви ; Зіц і АБ ОВ ах Ярі вів она і ви
ФУ АЖ Фів о го «и мг іш ієм АївВ еВ
ЗХ з в Я ов ВрО Бі Аа МО аск : й х . «в ве зву Б г о КгЗ 1 ЯКА їв ах п Мах дай Ага аго ів Заг | «і | "в вай сін я га дій а
УК КІ КЗ Бо ЕЕ ще де Ж КУ Х Її ГУ М роя ХХ
І Я я по заг ака АТа тв Аа 460 сів чів ав іп явг Ага 455 Що 89 «іа тТгВ АК АК ген - сх дк бе ТА ЕЕ хх ві вів ап орга в аа ях «2105 4 «2115 473 «2125» РАТ ав н- «213» Рведотоп І зи Уа тТйРе оМмежх дк дів зв ні «є1Уу Твк ів о уці ж «400» 4 зи хат бів ців нія в У тв Я : У дгй мех оБій Те од їх мини М, Ні ув з чів як МОЄБРуУу Аг
УЧИ А х ок ах зі В 5 5 » хг ; 1 мо є1у др хег тгр ув! зго дій ака
Б сіугх 4гх ККУ, Б зе) ів а
ТУК Ага Ага УВІ Шви 5) то ві вго вро РО Аа А
Б АСВ 7 УЖоогж яри: еще з М 5 т й у за Му ті нік вата Єв век уд 4 | Що сів УВІ дів ви біу маї ніх яв З ші вне Хв дк та 5 Бк МЖК 5 КУ ах зве ві ми
МІВ УК АХ ! У Уві їац РО Бі,
Зо чіт ув щі УВІ іде се се ї жін дк вові АгО ее Би ЗУ вра хак нів
Аг УВІ тів АБр. 5 і п ів; ака пі бі Бга зв 5е маше г . шу ку у. ви ММ кА я У 5 - шу З ОКХ хх ш я з крах З Е МВ ! АК Те Ї 16 В . шк зи я 5 | нн вів нів Те оніх Уві! В Узі жві тТУК БгОо піж ві шко 5 ТТ ен вв Аяп УВІ Ві ту Зх 5 - ІМиу Ст М 5 З ЕК МУ КТК сн дже пеоптуюв
Фу аго бів впе щКОля З УЗ Ага ев тує СУ кї Ух км х ху ур х З з У І а У - З : к й зі ве є ц де пдв ная 5 МАЮ ків ж «о і ді з Мет аг вро щу і 5 ; ча ін дей йаіа дв
МЕ ові МЖК го За тТве те Ії деп ОО й ще Заг Бі хів о тТаг отне х 125 Е м ух бом жх ЗЕ і З Де і -е З у 2 ча бів аз Узі АгО бе ї2а іх віз мет АТа за! тує Фу
Пе : сте св Аа аа шк
З Я "коВгБ щі а тів Є ї 140 но га мат щег АТа жів тує вгОо с 35 с овНе вав АФ; Аг мес хаг АТ ЗІ 135 іа вго Мет вне вне де зо хх З 5 х сх я й ОА т ре А ї ї чи зі» Уді РО Уві Уа З У 355 За Яка как о Бге ів УВІ ГУ ЯКЕ АГВ іх уж іви й АЛ Аг и коуч очко Уві ав АВ Бе хе ЗУ5 і45 їа бій біу Тур Уаї дев зи да ік дк х55 іт ага лів кій ше АВ тТвг аа Уа із У АВ павоіу 7 з - ЗЕ Бін Біб так оАТа Уг у гу «ве її ек б ой ММ їуУ два 5 її, хм -5 ВЕ яке зах . За і й у щі под І ві в: ї. ії - у їв З їн У Щі У тв г оАІВ КІ ЖОМУ хх
ХХ - З щу хг Жагує Вр х їх що
ЗУ ; Мав пів тує нія СТ зах 4 дя - а лам хі Я «іх , се ви їі таб» йіз іні ат й Ко г із ші їве У Її вка бів тАР й ов, тТве оАїа чі В
СО тк ід вро дід Тк ОтТНК ТВ де аа ве аід вго дів ТВ; зо З ве ек чаї грог А Вго ше ха Уві мак оя о:
З зак Ух ОМ 73 а лів УВІ ща в ї18 Бак УВІ а ха ага Аще йгоа Аа зай 7 зле нт іа вне дів ді шою х У
А хід Бі: вів вна зак з док ох ТЕ оміВ кА аз сі меж ака те 23
Зк «ка
Зіу меж
Зе мів су
ОК 255 зів ага Ж ох їжи 15 Ак іх Зі ага в шу М ХК са . С 5 1М мХ «У зі БеаБ Ахе ко Кв ви А КН рец ме АЇщ щи ТУ Фі ЖК З дк Я ви ме мех Б - м т м з МВ і тк а Ма 45 піц ув ЗЕ дав УЗ - арх тТвкобец В дк ак Б Ку З У А зи їв те;
НН в Тук мех ах Ага у ев зав АВ
Мід бів З е Би вх КОлеВ ії кег ам, зве обге дід У КО ще ТУук В пе а Узі ха Й ще
ЗОРІ пік сук УКОт о заг бів Уа НН мові Ме і З ніх ух я КА Заг ОБ Зх їн; ЕЕ Од? МОМ зай у АІіВ НІВ геї ЯЗ мохи ЕМ ОМ ях віп УВ! Ух Мов Уві. ів Мет ущ! хів лай
М 3 Ку т ХЕ А ху я руч СЯ сих Щек й о я х х Кк кп уд х а я ку в ГО кі ж З Бе ЖЕ Жах Кк : га нія й їж В т МД З - т Ж АХ М З я щі 5
Мк а: - жів КЗ І Баг КЗ і їх пе зо ЗУ Уві Зо шу що аа Уві ей ак м ЗАЗ Б ОХ іх Ж міш й а А З ,
Се Оу За ще ГАВАНІ х9 ків ніх кга зо ї8 тВг
МЕМ х . Бе ТЕ. За ке ЕЕ КІВ я сих а ід з
Фах т ау її» Оу ме дід Мі і мет а ха та Му Як мух РВЕ МЕЖ 345 се їв БІ: «їв ів У Я мкг і р ек КО ща ках КВ діІЗ Ура і зів іх з зро ЗБ
Тв іх аеро ве овко ві їв 18 ої» ве жав ВИ З за і арт Ту КЕ з ма РН і. ; Кен
Мах ї чу паї їв За кв ні бі б Ні ва у с іа Ар УМ ще Ме Ар Зо ЗМ ОА ОН; що рота Ан зи о іуУ М ха щен Ак а г да й су ОБ БЕ 5 х с іви що Зх тек
Кг Зв їз аа ча т сі їв ми зів аа м ів ДЕ У МК їх М за: хів в ій і іу АВ Ач хх Мав сте ЗИ І РН ях: «з 2 д З ах і хї а а Я "не Я ВОМ. . мет с НН ше в ага Аїа 18 Аа те Х 1 УВІ Мет фі У БУВ КЕН Й ОІВ Аа їй ща МАР УВ г та вк оБРУ и С: 40 Тіт йщп Ма 33 ді
ІРЦ; не іх їв : ке Во РУ 85 ве У вне фе тк щи о ЖЕ ж ЗІ до х жк
КЕ щу аг НІЗ ії вв 3 А ші ев АТ З рама Ме баці їч З Я ; РО в ЗЕ й сх с БоКе х ех
ХЕ їх я зріхж і й кг ще де її ли ЯК. прват
КО с В ОТВІ Я. ОА З Ко. 5 вал ме я ма АБ хво вів м'я іа ав ма щи ма! ен Ве ОВ Чіп аго й ах АВ БІ А сеї М хх ви ців, т У м Ж век Овна і: за Ці Зх ж щіву її а 7 Де ЕЕ. вк ві тів КО чі Ага вен хіа тв А: ок А що т х г КВ.
АУП, В "аз їх : г Я ШЕ й 7 ти пок п, ї З хів
З З ії . и В сі в М ЧК з с Ал тв'акиа 5 315 т З ож пррагоу 7 я імп вго аї8 а чаї піз ах ї
ЖЕ З ах
Ех 5 щк ій АшЙ со вої "аж вен А «211» вт «егоРна ще ІЗ ів кім у ха ка рю А «212» Р дотопаз бен вне зе; я ев їтВ 213» Рбєи ТВ ворКОа Ге 10 "й З а ще х й з - - Кей таа і МОЖ хег Аї; КІЄ зв су 00» 5 Ууді ТВБ ге ді МОЖ хе БЕ ав 1 «4 : Ми т Ууді Е з ак У щи х в вне ЕЕ
З жук ЗК ї . т БЕЗ ЗЕ зв дев й сх
АТВ БЕ хз а дв Аго С Ага КУ АК 45 чіх тів мех ч Й з р чує А І Зі фаи ді чі Аг ніх ї ж ри А БІ ух т ЖВровів | вотк в АгО кох
СБ тн хо т ответ їв Ні ТуК ТЕ ЗТ ту! 7 су меє Ті Зо, Тв он т Б. ЖЕО ща
КУ г их і м дом УЗ ! ! з т В т МЕ ОА з х х
Уущі ти Ук М ага АгО о щі ТВ; чі ів 7 вон хі й івц я я БЕ я тв побу пе й З м А Я. ів баг дія ми Зіж ТВ М. ів АК Є оте її її хе іп мів «1 в УВІ ій й Є зу ага щІВ й " хв ів ЗІ нт УЗ мія ав А х щі заг тів ех ЗЕ і х іч й 15 М : тк мем ол ИН г оїгв У за Бі ВгО я 4 пів тТВг оре Зо оже МО 7 ук 1 оБго рр і 5 іп дід
Б пі ДВ М со Кк "За де їх
КЕ Зовні г хі о с аг Ох і Я х
Бо ла окев ці Іа бів Бог ЗУ вве Хе що з ага уд о з дк Іа 5 чих вка су ще - щі щ дк А - Нк я ї ніх А о З івц га й: ї ях : ціх й у я Зі щі ні 1 чаї ре; тних КОН і дів рев 5 ой Яків у Га Я й ж кре
ЧУ АВ м чу у 358 ха БУ о Х
ЕЕ хів Аго 15 км їви Аго о зяй ї Хів ах Аї і їів баці
УВІ Же Е бів ж і жі КК ув Я дет З Зк та ТР Ні У шк що
Т жа Тук Бра 1 Сів С жз тросів вв АБа УВІ Уві Тук вБгРо ЗВ 15 чу фхішлю р с ЕЕ З УЗ -Ц ОКХ КЕ | а зва бій вве ї Ук АБО і х В Й ї5 й щ зи о ТУК бук дід їй з З М щі Кк я о заз д з а Уд і АК о щі Ж я 15 з «з і мій ді Ту 175
АК куки ох ід АВ УВІ Ді: ух . мох аіва Мет ага Бго бів АВ 178 ів дя" АВ АВ Зег сх МА МОЖ ЗК ; «т дк пі дк их ши 185 і жів тве тв» 3івз дя З дал чо й 1 ага бег іу Кв твЕ Те БМ дан
Зібж аа Уві ага бБег Біх що т аїй уд! тТУК бі Кін
У ЖК «і ох Ра два А З хІ Ж т
Б і: ША й" жів бін а)іа аія Меї кв зах «а жхїв ТУ ВЕБ щі ХОМ я Ек х зга Мет ар
КАТЯ БІВ ТУР ОО з вне вне йщо ага Меї йахк 7 155 1 зві ту? АТ дАгО Мек вне че Аяр " : о жи хо УМ 1. - ие У
УДІ ПІК УВІ АРЕ УВІ 215 туз Ай ага шеК Вго іп аа са дж й іа вер; овув аа Аг ВЕ
ОА хх се їз» щі д БА Зк ТК гер ТУ ТУРУ як нку щі ага їів бів у зоа хЗ я "а АВ МУ Ав агО п «Зо «б бу Тве віз за! АТ БУХ АХр
Е й З й сту Ждхуз й З Ме 5 і М З і У ї й зх і . я З з ще
Х т. зи ох Ви Ті Ж - щі ї хз
Ууаі сів іву Суз Зах се Твг їз «іУ біб ага ха
У ве «в ТУк нів Бім ТВК да КАХ
ТВг А іву баг ав бій Ту 5 с ще
Тів твг дів нев зе ' кВ хів Уді ТК жВі бів у
КУ Ох ефухо суха о в з м т Би
Ух 35 і - св ах ТК я Ех Га Ж. Тех : ій те : в хій Бгто аа тТве ТБеОТВ: 285 я кет ма я те в га від г. у до хх ч а в ж оЇВ в Тв
ЗЕ М т як пу жи АСВ А "ВК бе ех ЗЕ . я, й ку. ху дж дів КЗ
То кі кін АТ вне а Ага Або Аг Аза тутжу й м М Ж Рх т КУ у 3; Ваш ау мес ага тр Ата х аа шо ага тів мів РУ Меб бе і За зак ака Мі дав СТ ді ФЕВ ОНВ : ї820
Зі Ме аа Си дак АБ ОКІВ ОА 315 , ба Кік і ніх Ме дів ж ко Жов ц дп івиу сій х як Щі ЗО й Тук сіу ви їв ар вів Ага зх пра Аїа сті Гуг ме Ян ую т з3а Уві ака вн се ніх пт о СЯ28 рого вуж Аброуві РО Ген ях не дв ди У Ка « і Ста Уді Ту вне а Меч М т іви чаї діа Ні УЗ УМ 7 3 ї чаї «аг дай дід У кан км 33 ї кіз хаве опій УЩЖІ ді ще ан !
АЛ гуми і аїв вагобій У; 5 4
Ні Аква УВІ уз УВІ ді; М ке ке мат дк з
АР ОНІВ АБА УДІР У ї5о їв меб уві бій дго бі Меї дів
ТО ЗК рах зів ве УВ БИ кВ К;
ЗО - чи т З вто Бін Ме зе
ОЗ м 5. а й її Ї У ча Ї р Іво з Ка х зе . е е У а і де В щах хі сх Ке 5-5 З ще ча вх хв кі сил кй
Ж уд ай біУ деп хек КЕЙ ЯМ» й БЕН 37 ЗУ ТВг йков ой Бі дей ві зак Сх «кро ее | У ве ВЕ щей Х ак паї ця аг ха! сту пе ФВ 330 їх тт ціх в ку аАїВ УВІ Мі Аг
Зах ; сс Ме ї Аїв міх Хі ніх вк. КУ
Ж жк ко Мат У ВБИВ Му ДІВ їй За твк о їїв
Хі сі аа Мах яв їх хх Зі Мет вів ТВБ тів хо хх з В їх що. чн вк її І а У З ОСУНИ як є я ще їВе вро бів бух ів ву ЗО х ха МЕЖ хЕ я ОК а Б йо ее хво дів ав Уві ви 425 За їїв і зако ї1в с
ТАН АКТ В ! КК Я їж жо шоу ЗК.
Зо іви шіУу Мат Аж Ні щі ї х 45 м У да и Бу 5 Х Ом х МК и що я ах ЗіУ дій ага бек ве 49 ів фен ага нія ВБРО бів щі 7 ак і її бу рац до Бей А ми
МЕТУ м ос -к Б'є МО 5 хх с. Мк Де і йОА ХО ма В КІВ З Б сх жа тю м
Те ік де АВ ? зх З сх ів Кі х БУЄ ївгобіх Му ОАГЕ з 5 тів щі виг щі пола я с
КЕтї ший - Кк Зх ді сти ІБ ОМщі БЕ А ко
ЗО і Ні: ніх ви дів дід СтТвЕ ек САМ
ТВкотне Бто нів ніж ніж веб АЙ 455 са ма мекв Є
РОН їм ав ів да йіУ дяп мВ КЕ
Ве Ущі їви їі ав шу А: зах хо кур УК ою З ЕВ ЖАВ ОКМ аа а ВВ чи
Зі ач біз уд кв ме ЛИЙ із бер діа Ре го ххх й Е З о п де Вей о Її ц г БРВ КК кт зек Вйпае сей го го 5 мо
Ух ж гу г еуНе я - пок ОК «кі Вагу
МОП АР АГРО ев оБег ей Мо ів аго аїй дай Ммеї
Пе ОВ міа їйг Аїв сів ке бів Ага дій ха зів тег ад тів КЕ за бів заг ага аа тк ОА Зк пек «в 1: 4 а БІЙ ЗВГ АГ, 53 й ей тве о бга ів ів Кі
Що 515 іа тка дра бегоіен осів мех ва х а діз з та ОА КЕ ад що За дих вгО ліЗ го ух ях ку 5 є:
УМщі Аа Ай го Зх Мія ага ви бі ви хо м й . А о ге Є ЩОЛАЇ ОХ ОВК: пет
У і хів аіз Аа тів іец вія з Б пк во ви біц сій Хі аа дів ЕК : АТЯ Ах вто во го ее би МЕ ; ї ї в Аїа ек АФ АТ АЛІВ
Мх їу Ні5 дв іву дар шу уг АгОЗ одн пів щі біх нія шив ОБЕН А ЗО їі ів сію два реву
МІЖ МКУ у Ба годе зас обаО Уді сі Б жало звіех я ага У щіц за т хе 7 З
Хіза ШЕ й ЗО гМ 5; ЖЕ кец орг Заг Фр 5
М 5 . Фошкахо ха з : два дак Кі - Бак ЕІ ДІ її ЗК х - го вів Беб ага Аго кое т й і ща вге д І щ зго АГО БП 5 «21056 «2115 614 «2125» РВТ «213» Рхенпдотопав «400» 6 по тв оре мат Уді тк с аїя дег Мах В окни
Ук КІ а хоч се Ж. АК шк А МОУ з НК Гу че КІВ тТід МЕ «ж Ж ї оку Ку м хів ав жів | А 5 ТЕ Ак А де б Віа дів в чий КжБ тА. У мат Так - тера ем ШК Ам з ож ках В" 7 чі діа тих Е за і в ж ВЕ обук й УЖ аг дій й їх Же Її го Б з тп: сх .
МКГ КАТА А з КнпБ оБег в У руді тв хе с АРКИ т вн ваг ок секр КвБи жд ща Мід ве де В
ХЕ : їмІЇ» и тах фо ще ї у к я г ок Кола
Твого і я г АїВ ща ай ТУ мі СБ 8 ів бів
КН е Баг вів і БУ У ро ті Фі:
З ЛЕК а ХА Ат І Х І зак Кі. ; гу УК Мпа дав я У її г к ка з ваг оУВІ МЕ і ве Ба А Та тТВг ів ЗВ М
Хоч ЗА хх ке пу х ; х х гм
ЕМО т5 СУх Аг РА яет спот ХУ хи зв ГЕ СУК АГ 23 іх жів меж Ук ї св оіу як сів ву ді х ре НІ Іі їз Я УВІ Гвиу 5
Ма вів чук Аг ОВ чі аг У З З ту
ГО ТС АГЕ Ага А З МО о
Ех КІ поко ли зх тУк ге і мні
З ве нія Туз се ців ТУ й З Бі УВІ Ні. ооо мох т зав ців й В ОБіУ У іга уві ТЕ он г Ме АЩО В що і Вів лен ої» ; га од оч м УНК кдх хх ді За З.
І ві твЕ о зак ча ї УЖЕ у КЕ м Ж З з а х З чі шк кож т КОЖ я м ее ХУ
З тв коСБи ш х зу к го г . кт А і З А я
Нє 35 ГУ о І м дж с Х м п соя ї ! К УК т -
НІ Я що ря 3 й і пдаиь Ї ЖЕК аг й чУді їі х КІ . х«п ців бив У Од м ІВ АБ АГЕ ВЕ Ні УВІ Аз ху Є «Х с 43 5 шок їх о гу КУ У З Та тові У хх Ох сх те ї БІ
ЗО Я ї вро вРа В: в Мід Щі ; 4 т зав те
ХУ іх М рю Ак ВІВ В Я не Бе пре ів іч бег уд ії не їіе дя ій вве туї 15 ше ЩЕ м го щу ЖЕ ів 1У ага; «ік дв и іа Б 3 Мміз ві КОМ КЕ ве обі;
Тов хх 7 ще МІ 5 55 МО Ки «у Е тк ді У ЗУ га хе Я2» мех ага М.
УЖ х лу х м щі і « дід мах Я 2 З - й зу з ік У х Ух ді х: АН У
КУ Ж зи ака ші, ЕВ бро єв Гу ; 1 дк как 5 З - щі ви яко НЕ щоб Уу ча тро за Уже
Хів вв і. 1 тек вка сі я ефе їв аа Уа 196
ІВ - ТЕ Вр ж р ЕЕ Б ух
ЕЕ охо НВ ій «З ма ж, ДОКТ
АХ щх УК У В їй - св Аг 5 с Вр ві ДОН кю а АБИ щі з щи СТУК Су» ХР о тук вче ВЗ івИ БЕ ще га и Я З мк хі во | 51 м зі
МІУ х МТ т аа хх ших че їх Тож к гу У Кк вх У заг дій ЗЕ З ок і Ж з Щож ч хв Ба их чі У мів Уа ві їх вів КАВИ МК АВ Щх пе вія г вий ін йхай віз і єзїУ У " дід З 5 ТК ко іх А ж току сі У руку
М 0 З З дк у Ц й ТО кі с зд ! УЗ у є З У ї р тТви ТЕ те Ві отек ці Я Яежкти їі бів ва й 1 СТВ мо зів шві 7 Х соч ТР ях
ТТ 95 Мет Аа зак ЗБ Бу ага - хів зі їв Аа Ар ака МК АБ 235 Зв оіви бує Зк
ТІ іно . ве дя А; х а він ме о вий ще
Ко вва ве 5 зі Уді б ден щЗ ' о Ма Мет вва Є в сек о бга є по Уй Та рен Зак ААУ їжг вів агО М яке два ак Р: ЗХ тТвг дів Ук
ЇКг Кі СУ ЛІВ АК тк з ів т М 3 вро
ЗЕ «їди Бу ва ага ; Бечи дів Вч ма! Аве АТ цв о уві Аїх ів що УВІ Ттр вто
АКА Вк віз чаї ді жо тів Заг оУВ Зах зів вій
Зіц їв віЗ зі вки Тік 5 ою дів ів. ок цк т я ве й ї У А БУ ще ТР ІВ
МеК шу КН АВ цію За ЗУ меж деко ті За ках
І як У ТА ЖОЄ че З В кі У их Зх СН ід щі Ту Ух ке
Ом Кі Я . Ід З Б 7 ее дак ді ко Ж сів отут ще з отТнг ув і МН Мех ех аіпОТу ка їа уді тВг ЖК орец із в їв
Тв отвк о аїа Уд се ТгротаК вец тТУК Мат біц
Та тТввотви до і МаЖ ті : За ху АВ ТУ! зе діа к т "дк їз УЗ га ІЗ дах 5 тек
Фх 35 (3 шо з се ке х сао ші хе я Х ку гу АБвВ Аго З. Зі мех ваз і5 Си Уві ва А | Ол У Ку в ніх 5 ху йо о . а дк і З. Ні ЗЕ ко мих ім Ага ТІВ | ій ма А зв УВІ
НЯ. хв бін о ів ага фен бів в ШИ
У ТЕ ді З ух щоМ А КУ ЕОМ
ЗОНІ, Ж БМ АГ в 5 Ал
АхВОНія ви йев бін ям ЕН ЗЕ НІК а Ве вга 4 т й сода ЩІ АХ З о з ді хе Ж ох хі: у НК. чек Бі ви і. ів ін М ск зді дів 5 тм іх зав З вк ів зак Зі ж ЖІ З й ЗІЗ з зі ду У ху - З з Ж ях, «ев
Кв м хв УВІ ЗО Кам віу жах Ту ТНт АшЕ "з БУВ Ах ках ТУЄ Ка зви бе іш ТВ ані : АЖ АРГО КУ мет Ав ту жовч те БІ ЗО вве Авр ХІН Р Баг ак, Мід Уві біу її Еве т З Узі ді 5 У ск, мех Аїд зак мах уз кп зве ОІВ го ші Ме ЗК У АБИ МЕЖ тх ве А з. З: де ау кКх х І я: І ОО, т з ід ЗЕ ме Я ен Аг іх: т тів є Ж тА тве
В з, мек Уа 390 чаї дви мех хв У ви . че Р М 35 г КК ха М
З щи 5 - кт кр вх щи й і її 5 І а Ах ІЗ тре чі Вго У Ар БА те де ВОАТЯ А 5
Зк ії Заг де Ах і ніх ага а; їз
ЗА їе вки аг із Уі ві ШО я дк біу вх 5 Аіва ма 5
АП ОК . і ді Ол АК ' 15 жів Ні Ага ї йаід ніх а
МК АВ хм
Ук. с дк кр НИ даю жо ах де у А м ж Же ох
ВгО Бів бУух Хі ва бій Мет вліз тТйг їі Ар бі вів Ага Зег орви а 448 С
Ж чо КК т іх ко к Сов КкХ хх ці ї їі г Ех ок ті мові; ке і х че йкч М Зм кеку
ЩІ Мас АБ Мія бі жів Фіж За ТІВ НТК о БІ бух АБО ІЗ ЕВ ши У що
Зх щу СК кт х . со жхм сожзв с ак З же с з с ку су у т с ях ок ке ів жів се без дв іви Ага ніх го бів ТйгботТве вро нів ніх НІ ен ххх де кег яке а ща ЗУ5 що ів дів аіа тТВг їі Узі Бе о біп ліз Ту біу Аа бів Узі аз яв ща ах ах я аа пк щі дей души дах го Ж сулдю дк косу кох Фоучіч Моєї Жтрвух С Кік тУві фен їів ахв обі ай тд) Узі Меї бій аз аг ага во ве вне шо кову Зм 50 я ЗІ : о сю ик хх сви хи 4 ку А сем киш ль я, дО УТ ую ж чих івц вга ВР бів Аг Бі сви віз вне бен сів Біц АТа вій Зак Ага
Ме З п мя
ОВО. | кожен ше Й
Зів ТР о АїВ х18 рео бій Ага Аа Аа Мет Уві ід дя Бго ів ТРо пк м іх 53 535 54
Кок пяУ: пера УТ: хи СКМ їм Ж оєхія Її ХУ «ж мм їз Ух хх і ках ж т; в; ді еег цей Бін меж таб о вКО бео бацоні5 го ВР орга бем БР Бін
КБ ЗО 555 ЗО тах іх Її жЖта зи сл днем гра о йЗм фац Я у КЗ дію досто: її яз віз їі йбео Аза ага сво бі вец Бі Біу сіу Ні Ав ви «дк 52 ЗВ 25 ЗО За шодо У я ку ях сх шт Кк дух дуг ще КЕ у соя до БУВ у хі хі
Аа аіУу їуБ ага її йіз Маї ай ліз ій свв го баб ВВЕ вів АКО ї - у ха ке «грі 55 Зк м пк а птах їм ху меж дк жу ж» бук фосуї; дозою ж м ту в дові сома
Уві бів бегб сви Уві біб біз Зі ага Кев дгоа діа Рг А ів ек Ага 535 ОО 505
Аг шаг біц ака вге бі що -2105 7 «2115» 144 «212» РВТ «213» Рзендотопав «4005 7 га ніх БіУ аг бій вве ТУг ав їгб Бе вне АВ УдДі іа Тк Бга і 5 і 10 ї5 - ох г КК а хв -- дк вних ії; Аж 2. З х З з га АТАК З х ж щі чі бів уз дія мех Аз З го бін ар ові віз а: АВ УДІ Ага Бу во 25 3 ек Ям у
Туг Суз дід бів дій Уві аго бегобі Ті тТве оте тів аа біц Ап ще р те 33 3 ак я «ху би АТ жі суха їзучхх їж вх ух ве и КТ хх м кл уки
Зів аж Заг діа їі тТук вго бБіуУу вай її бів дії ліз Мет да Уві хо 55 КЕЙ ж «Ж кхВУ
ТУБ Бім бів Уа) Оу ув! Аго Узі Узі Ту та Аг Ме Ре Ре Ар ле 7 жид 7 жа мч й Ж З ви х т то жащЕ йоІУ теки йхтж КО хх ко ж зу ких чі з - х - до я Б «Ей ЗА з пж ага Ми АБО 5 іх аква жів Бій бі Туб Уа Ар Аїд ів ух Аа А й
М боже 7 - с ї А ре о . Ж «жа дачу й ще 1 З вх, ї хз хе ж ЗУ Мік. чу і 1 сх Зм у Тра сту й З З ваК ого бів Узі бі їівБи Су Мак бів мес бів па Таб жі УВІ діІВ чат че Зх
МО щх що ї с. й У У. ТК є тику Ще дез фо ямо жожзух в сту хх зо вт ги дом тв їх Ав ага ів ТНгР ОА сви Зак ащрр Бій ТУ Ні Бі ТВгРоаїв ТУ
І 15 я 125 ооо УМО бок я о іш ага їі 5ег УР Тер оБго дід Бгто дій ївгб о твВе ТВе о АТа УВІ ТВ 1 135 140 «2105 8 «2115» 144 «212» РВТ «213» Рзендотопав «400» 8 ев міх Фі Ага Чіп вве Тег ахо Тер орец вне ай Уді кеу тук РгЕ ї | й КО 15 ї т «й яких м ої їх й лу даху о локую уза Мк згід Ко шк ся км їі між бів їж в ів мат да КгО зів вх вд! Ага У Її АВ УДІ А; Я ви 7 7 зржУ - ЗЕ их «о З Зо - о а ж ЯК зу ж ху че шо пуск УС -йи яю Во Ж ши и: діт
Тук сСув діз біц АіЗ чаї Аг бек о біу ЗТ Так отВб ів Аа осів Ап ї5 я х І я Км ХІІ афосуі - КЕ Хм и вах хом У КУ кох АТ я вових дів ака баг Аді Ті Туг го бБіу дБ їіе бів лів яіз Мек дід У
УЧ х У Я яка,
Зо 55 БО чн м ИН ки «вух ІчУу Мих и р хр що м ох де За іх ХУ їхг біт фін Уві бу УВІ АГЕ УВІ Ма! Туб Аа Або мех РНе вве азр -х М ! че що ща 5 м х м М Кей Бе ще т 7 -к я у мкг ду пе й ду сг Кк ую агу мех ахо БіУу Аг їв бій бі Тк ВІ АБ ОТВг оце) бух а АгО зек вто бів уд! бів бе) Суб его їі Меб біб біз Тег оаїа худі віз ща і М ща цУх азо ато ів ТИР оаі8 Бец зег азо бій Ту мів дію ТБ о АТа щу 15 2 1255 ці Аге Хі бегоУЗ! їгО го віз го діз тТвг оТВе твг ат Уві тне аю 135 ї4о0 2105 9 «2115 144 «2125» РАТ «213» Рзендотопав «4005» 9
Веб оМії бі дко бій Ба ТК АБО Те ізц вна Ах о УДі щі Тук Бга ї я То ії віє віп вжа віз МеТ дго ВТО Бін ав Уві вів Уді йіз Уві дк ви о А За
Тут Суз віз біб віз Уві аго Беб сію їв ТВ о Твг о тів да б Ап їх БІВ 45 віз Ажхв Заг одів їі ТУуг Бгто бі а: їТе бів ата піз мех аїй уд! ща 55 | 5
ТУ Фі бів Уз' іу ув! Агар УВІ Узі ТК АЇ8 Аго мех вне вне дев їБ 7 їй | що ака внеїх АвО біу АгО їі цій бі Тук УВІ Ав АТа ви ув АТ Аг їх КВ 5 фак го бій Уаі бів фе Сух бек оїів меж бів бів тве АТ Уві АВ 18о їх 1 їУБ5 ар ака тів ТВг дія ви Звг ак офій ТУК Ні бі Те Аза 1у 115 що 125 біу аку Ті Зегб УВІ Те овБго віз вго АТ ТВг о твготйг дід у! тТве 135 35 10 210510 «2115» 145 «2125» РАТ «213» Рзендотопав «4005 10 загоні 5іу АБО бів Ме ту де Трроівь вве дай Уві Бей тує Рго
З 5 30 15 ці сіп їв від Мет аАго Рг б5іц Ав оУуді аа та! АТа УВІ ако ви о й ХО
Туг ся дів Зі: ія Щі га чат? Бі Хі тТвВе тТьг оті два іо Ай о яй 5 деп лій Ач Вегб Аів їі ТУб рго щіУу й5й жів Біб аа віз Меї Аа 50 Б ще ча! ТУК іУу віз таї сіу а! го ді ба! ук ЇВ АБО мес ВВЕ вне 55 та 75 ЩО
Ав агРо Ме Азросіу Аг бів бів біу Тук Ущі Ак о тТнг ів зуб да 5 КВ 5 дга Бег го бів Уді бів ве Сух беб біз мех біз біб ївг олій Уві цю 105 110 дів ух Як аАго їі тТВк оаіз ри баг аа бій тТеРоОНія бі; тТвРе Аа 155 о 155
Зі біу аг хів бевота! Тео Бгто із вга аіїва таб отвВе Тв АТ уд
Не М 149 «2105 11 «2115 144 «2125 РВТ «213» Рзендотопав «4005 11
1 тк та чаї Уа ту! щі ащи Мі у» Зк . ; в В їх да Є Кк ух ївв'вц хау їі дра хар Тр та Ущі Аг що : їжк ІВ 7 ЗЕ і дід ді, -
Км ви 8 ї У я й Ме УВ ож х я ще га вів Вп ме ді ді р т ЗО За; св с іш А СВ. че й Ако Ма Е Є зії дай «вк ні: 5 я в зва авг ців ще жи у ів дат в мах ага В Ук Зк Твк хе й «ї ож М КОХ же їду т Ж ще Бк х їв у5 щіа Ме фі їів тв З " із Ууді шк и поКухова два ще шт ід мех дід т У щі і: з НЕ . Уд я х ка КУ . к 3 З їх | З І тя я, зі УВІ Аді ож тро кіщ Ак Й із сів дів а «ев Зв щі хх вна аче їтк СУ дів ві ці ка: цО м оВва На по то М м - уч хх алу: ТІ ще:
Як із Хв тТук рго ві Ма АР Ме | що сх «Мід НЕ ЗУ о з ом бе К ау сю ук хзіз ав Бе лів ; зге Ук Уві Тут Зк сен г дів аго
ІЗ йо З ме од ОЗ Я «Я щу г.
Ї зо з Ві Бі Уа! Аг Ві Азов АтТа се що зе хі К -ї й У ЩО З хх д дія зе У ТЕ док і аа - ці 5 го х ги з Моїх Б же Кі Я тів Б'я 5 Ж. 15 За ЗТ о тТВе й І УЗ ех хіУу Ага ів ці зас сів біц тв 31 с,
З еб АБВ СХ А ї зав ожів Мет о Те їв У де В Ме де В що ви Су За ї 25 в « «і М ТЕ я . З з ув ї їх Ї поем т У є х Ух п Ту ніх ЗВ хх «Ж тв т ле З с щі Ку Мах Ей г Тк заг вка; ців хх з Мви Баг АБО З пр йід мат ТІ як ТВг Аа ву 323 із ївготТве тТвйК ой га тів ТВА А Я з овіа таг ТВ : АВ Ага Ті хі га БІВ 140 і Еш де М. КЗ тк 14. но
МЕ АХ 115 Р тТго вго Аїд
У сом пк МД їх сю зма їі заг оув 15 сі дга ів
І АГ
Ж ч У Не
М
«21051 а в же «2115 4 ж АВ Вій
РАТ і тн мае На «212» пав пе офі мі ТВ її 213» Рзенйдото їв щі ТВг ої З да т іх т «ші 51 іі « - ха Мі м ту з иа кру ЕЕ бі Х й чок 5 З То . Ж і (у ку «4005 12 ви Бег тів Є Уа! нів ув! б 3 щі ій ЗБЕ оре; ех чего УВІ В Ой дів АЮ мак в З Ту АЗОВ За: ще зчК в А ТЕ
Ва й З і ви б З у А З шоу дії Бр Є г
М чи ага ді ра я Ух Бак ОМ сх зе ї1в дав дк ага й із і КЕ : КО ОАХ
Тжк АГ Ага Зв їТ ніх аїз бу ЗУ бе тів ук Аг Мод ч"аї нія а я і овгОо шту ів ей діУ чи зай ТУТ ви го ік 16 У Аа ев З Їх йух чаї маї 1 бо реє Зак НІВ чл Я вх я ще х М Бак жу АК СЯ
МІЖ же зе п му У їі щі Вр хг х хи м. де ОО з зг і МЕ у І я. 5 о яаТа АГ 55 мовеу ага «і . 13В ві жів ах а фа фа о, а МІУ Бі
АГ УВІ КІ сів хів ве а 1 ТУк вгО ші
ЛК ту А Мао Х М аж КО зе
ЗО зу Уві гахн т оУді Уд 7 З я. хх «роги а ся -о ща ко ху х мух вх їв ніз їТВг о нів у о ів вве дхп Уд м отУК Ку
ІОНІВ ТВ дв тТгвБ'вн от З і Ага рев тк ою ко жа тук дк г В Ж є З 3 Уд і ге З я В
Сх ка бів вне 85 уві Аїа УВІ к асп АЇя АБУ ім А - хх Зерокшрх УК ЕЕ НН АБИ А ху чаш І АВ зах ча Б А зга БТ, ЕН їв див 1 х ; мет да врРЕ "отв жіє дей Є З кору з від Мак й й - а о твк отв 3 їк м Р тек ді У хо їх я го г В ОК хх М Ї мух 1 М а Бак бі її жк ; з дів Уа ? я я Ага в і із ід Мах. й ів єїн дів УЩі ага о пі АВ Аа їй дк МЕ
Ід і п їх у аа ціа І І Ко з» кв о й що пк 115 зга ціУ ка З Бра вне де В МБ
ЖЖ сх у" Вга щі Я зх Е ча Ме І ЕС за ще овлів ів ту ко Ттуг дів ага З КЕ з Зако вечх зв А се Зі ФВ Гм их ді ще ОК
У З лкдх З дка Уві 5 БЕ: " най 5 дій Ку ЗК ся Уа Ага уз ї а ав ад ев я іа мав хіх х паї Б МУ ак іх щ са дк В А тю ке Елі УЖ А му
Може : зі Тек ді а із Уві дїд ме: ча Чвощів «ї Ку жах тве дія уд Зк .
І хі ко ЩО 5 о З : М ІК 7 Її М С НК ка в щі АВ 163 в меж Фі є їі У АГ кВ еВ вд є ве жів МеК 85 ге ойів Бу «а ї т дрож хі А хх сиг м Но хх
Бі сви Суб В до Ні біу тв зак а Єв їв Уві бів р 5 х Зі тТУук ні ха ве ові ві сх ХВ - ож х Я У -жт хх
МІВ ж: 350 ги «чек а ХА жк зок ж УВ і їн у ів ТвкЕ аід ів хе ОО "Тв отвг дів Кк ем їі тТвР дів хі ответ гей І Меї їгв ша 1935 ма вко дід ті яки ід Уві Мех з Я мг і: Ходи вро вдів ГІ я аши Ак а о
Ма тт В 15 ів ага ах Є Є зі Мет а яаг Ууді тт ре дій Аго яке ів ні і Меж бів а; ів аз вве й кві тів Ні «і х яв ОМ с ОК ко пе ТІВ В зей
ОНИ Тер Аїа бів 5 ар БУ Аго Ж я і мех Ага ті Кк ж " дк ні А є їх " Зів ак: же пі МЕ т а авг де Мк КАН З Ах Бі: т
У а ів ща се зу АХМ 5 А ух о У щі і ке шя ща рем КІ пі
Ж сокі: В ЗЕ мех А і КЕ зе тек с ХК 5 ох х « вцогви твпг оба НУ 5 їОоБІМ СБ Ту к Уві ага Це шим А ЯК МО зх о вч Ущі Аз М
К зів тек меж Є 5 зга гук АО ее м хів щі з У о Ма Ві в МУ ех брх ж ок щі рану » о БНе де ВО У ех ха ВВ Ж загОокга БО Уві Туг вне А Уві хек дя В
Зх тк шо фе хі но туї В Зої У ЗЕ .
Зі аїв ніх Су діа зег сін Уві ЗВО щі МЕЖ - їх вої Я х - З З 2 й мух СЕ «ів жа йно з У дів ще М сів ага їй я в о ЕЕ оку Уві аж маі бів аго зо
Би зх ват ді МК ак 2 ВЕ щі . уч і: два НЕ дп У а. вге Бі че с туді Вп
НІВ Ві ЕН Мід его Уді РгЕ сок НИ У ЕМ, зт . 7 й г ї щ хр КА еВ Фет оп Уді мах їУу аЕйЙ Зак акй м Ж Я ЗА п щіУ вки З їв у У Ос я чи вип їх Ї
БМ З іу Тнг ар Ах я м пах іх ння аж : хитко Же Р
З ої а Осі де й зак зх Зо та
ЗК ою. со до чів ніє ка вів В ну
Мет їїв іч де з меж суб вно мех діа ніх Тіє нів 8 З ій
МК ЕК у я 7 Є ак ве ь зе З М З я ми Жішозер Тв шах йза ЖЕ з дрова зу отв щі фев бе БОБ осів ВЕК ІД От «ку ахи дід Аж маї вен те о вгО Фі БУ Хі ев Зх я зах З . и Кри шо тів сте дів деку свв ово сіб меж дев нів єї їв сі ет хів їїв аз бі Аа Аг бек оїео Фіу Меб АХВ ОН зе п : лк и Я з 75 З с
ТЕ. скла з Мен їі сви їз Ахробву ка Ні га
Фін таб обі бух аг А В АЖ Кей бів Ме Зо ню ма т й З я . щ . т ко шк ЗУ ц с та жі зх 1 вра У: т ді З
Ме . . 2 зшЖ Ні іви віз дів ТВЕР ої1в Ми І АТ
Бій тТнНе так овео нів ні нів їви віз дів Пів УЗ 435 і й в 5 І у й уко усе вет - се Є а дав кнк оз зи дів дао ві Ахи мві УДі МЕЖ
ТУР біу Ап бі Уві аБротаК мВ Бе Те Ахр ЄВ зв
З я да 4 ІЗ ких А с
Ж їЇ хх шк ж сем г со ех ХМ З -х ен їх ще Ва З щи Зк Ве АР МЕН Аа КВ зів Ав АгРО Суб ев хекб вве м вВгРО Рг Бій АР 4 ів ззІМм Зх ле Я Я В. А З . й дак лин я Тв Аа їв ів бій АК АТа дев зМеи віз Чі йїа Бій Заг асо Аза тн дів щих
ММ же - ак я а зх 4 - гу. у г кв Ії зо : з «вкоівн обі Мат Тв Бк вої ви ет у 315 тв» ат дом ; Ме яп кт меж Уа! дій лап вгО дії ТР АгО БеБ ви щі не ака вх виш аск я ще й їх ЕМ - - «ж кт . в и ЗУ п. и
ТКУ ; се ож кі» жів дім дл ід АВ АГ БО ву
Між ве веб го ву біб бів хів АТ аїа Хі Бен ке хо
ІК їх 485 ач т 210513 «2115» 496 «2125» РАТ 5 «213» Рзецдотопав «4005» 13 ; : 1 тва мет дав сів сх - ке Зах дя фу кр вд пе ОВет АВ ші
Ммеї Фів Тйг ген бак їі бів нія бу 1" МввоУДІ тн ти т 5 10 я ї : а Й ж кв ка» Ткв ум ні маї оп АБ біу Ага
ТуУуБ ако ака Уа їв біж Або а Ук КОНІ ма З
М . Зн Шев узі вро Бко га діа дев й м мк сім ій дя гуде хів з вт Кт вій Ах М
Ті6 УЗ аіз ів (1У ма! ні АТа бі бек Узі Рга сто ве
У 40 йо К с а 7 окр с оБечу Кі БНе тв дек а МА с о ее фагю вух УЩі фен Ба піУ вве тів дяй зга жа! їі азр Ав ага сі рух ді УВІ ген А Оу В
І МАН ОЗ я Мама їх . що З . й мн піу Вей дек оніє м ц У ря ше бух Ж ї ву Аа біМ бБіУ БЕ ваг 1
АїВ ніх Тк ніз Узі Аза бій їі ів ви ага Чжоу вв
АТ ! з 75 му ко, Ко с ет у
У - . є У фу зі: Кбнз дев зга их ТУ Вга щі У БІВ бі ага бій вве туг аб тТгр ов вв ви Уві Уві т ве я 5 вк За і к і що 4 за ів ахвр У! АТ УВІ АЇТя Уві асо іви туго бу іх АЇа мех Ага го Б ар Уа ще УВІ АЇїя Уві Ага їяе - зай МКК М зи же жі кжи пи щ к чім остьк о жі дет в: ча кі ар - я я що ха Ж тк те Тв нг їв ай бів Що дів і віз Фін Аа мі агу его ту З ни 325 115 Я й 4 ; ій ке їх,
Ж оси бум геї; кн СК в із віз із меї ків Уві 7 У оВгу аг дів Ті Тук Рг 5 КУ АБИ її біз діва кі о / " туди " ї35 В , , 13 пе з : "ба вве «св ага Мах ве - - чаї ма тек 533 пс ме Ба ще дж Ага мех ті УВІ сіу Уа! агу маї Уді тує 4Ї3 Аг їх ав РЕ АТА ех 150 мА З і з Ж де х У
АК ї й З о -к моя о дії джу Ше ва а у сів їй Бі тТуг УВІ дхв віз БО рух Аа ака Заг ОВНІ хв бік вага їів о 1 вобБіж тує У ЗІ Ах вій БМ Оу ше
Аб5 С єна тк кіх уві дід рух Ар - і ін ів бує ве о їів Ве БР ів твг Ат Уві дід Мух ам ів уві іч во Су Щек тів Ме схе СК та тв ЯК ч ей є с и - сив торф рю кв вк и Аг . : ін дег або бій їв ніх ші Ткг овід бі «і А-гО ага Щі Тпг о діЗ ів его аз бій ТУб ніх сію бу зе Ше ?
Її жди що ТвтотТве Твг Аїд У ТВ оті Є: їі его уві Тер овго Аз вко АВ ТР Твен АТОМ ТВ «ОК хх Ь. зах Ж зів і у зу дат три
КО - ч я ов із ака хв ака дід Уві Мет тТев
З з їх 7 23 ; і Кз є тів міх Її ме т мах У з «СЕ ву сУак дк іт5 ДАхЗ Ін; ага Ті ш зіз У чек
ТНК Бе нія Меб Ав бів БебБ дев нія вв РМ АТ КЕ ее по МО а ЗК; я
У се виз катки: кох год : ч ід іш СУ Ні бі сів сво азо Бін ага во
ХвкоБко АТЗ ій ТУє Меї бін Су5 Ні бі Бе ЗО АяЕ ів З жу КК АК МІМ ТЕЖ 7 - ЗзЕЕ ке
ЗЕ МО ОХ
Ба о ую зт; ач; ух дво УВІ АгТівц і ви
Зій жаі ліз ніх Суб уві Туг БЮ АЗЕ АРО бух АЗВ ув ЗО ЖК
МІК КЕ КК ве У зам Ж хр КЕ ЖМОя г
Кия ям що ож Шк п Кк хо куту ж Ж и зу ів как вів Уві бі «квг дай від жі
Ні АгГО НІВ Ак УФІ бух Ууа)і від бек бій уді У по ОБГ ОАХ 7
БЕ « ож а ха вка у, ваду З зі Б'з вага іє мех іви Фі Зег о біу уві ів его Уві Рго біо Мет Уа! бій ака обі;
Р вакк ях вк УВІ АВ по жен Аероже 335
Бар КВ з и оЗЕгОА чл чі: 3 г кі У БИ 5 Ах ча ? ши
З «а аа шу за . аг дів
ТУ тв дев В зач ів НІВ Ат ЗБ яке ха їі бі так . НВ ТІ. сук ко а ТИ 305 Зі їв Зак Мет вів о ніз зіЗ меж дів хз мех б 25. ух Вне Має 345 16 Ка; 5 з
ВІ МЕ я ру ВН М г ТР ів здк зак жів
РУ дк МК я що ів Ук Ж З З ці швк х хожів 5 Я ВЕ ожвкК Ве і " 5 Бі її 0
Ма ке шк а фе В: за ніз сн Я о ко ' ММ уд Ка З Ж АЕН: Б М нів БКО зав вів ОК . щі У МК А У Се АГРО НІ ай
ВО АхВ о іа Ага Заг ре м цен Ав т» їв
СУ АВ Аг З То уві їв і ви щен І вне ів А їв аз КУ АЙ дев сви їТе Т95 тів Уві вне 5
Кг мли ух. г і жк т х є яз ккщ. че ях В в Ак вів 13 Аїа тв Її т са Ме
ЗО і жа А з З я дії в 15 чі ді
З твРощшуУ цю ня Мер Ах мо зіх АБ Уві тн ні мі нів тів ав БК. о за вве зве ве; ні Те жів Ав зи АТО ВІ аа ТВЕ отв Ввго ак Тк оУузі їе 7 а ОН во; пів оте ОТ ке ва Уд Я зів Ага іш сш міт ще в тв ща Зк вт Вів А м Б з Кк а ахий "Зі кю я БЕ В їн МЕ Б о ну Ж ки А тек бі АЖ а зеговМнЕ ве М їв гер бів ук юту же ШІ ов 40 їв ЗЕ То свв ви " хг 124 З ей ве дід Ятх сх БМ КВ - ча ді їв тк од з с ра Бе ге ж АБ Аа АгО вера Ммаї їтВвг Бга У
Бім А ЕЕ їй аг й Ж рі Мах З сої щі яд діа дій аг ах зок ів БІ зва і ви щу . сій МІВ їх іх а ОМ Я із й Ох
ШО Зів ін, За їтр ага з Я зи дія Аго 355
ОВ Без віз ге хід в еВ Ше
М 45 їі зо « по; ху З У: а й і ОК кожи Аа АК Я ін їі Аа ЯЗ мет У Мво іш 16 З М з го їх туху ЇХ т к ціх го та ї Зх ніх й І «2105» 14 ка ців 11» 496 фе Мет дв тат об, УВІ ве нех ах 2125 пав ї Твері У; т Аг к идото і щі НІ : А КЕ Ж АГ
З «213» Рзе ІВ НІВ бі за і ств и,
ХтвоБіВй В пору Ех ле ії « тоб сви НН ТОМ! нів хе Я я з Азр « зх тв в оДеи х а ї і КОЖ МЗуг В года веж сій ТВ; З іш АЖ ЩІ Зх З в Гео Оо
НЕ з - їх хо гум хх х Ще : КЖ с . кош я Уа ей б із сін дек уд 5 зе їїв дкий
Ж. яка Ага У 5 : К ня « а 8 55 і мох ка є Я ч вна Х
ТЖУг Ага а і ЩА МІВ. ох . хх про у Не и КЕ зи б1У Уві чо Ві мді ео св ет нт і ах се я іш ді Уді ск сер овкух МО лУЄІ мух сів уві ів зго яті Ух УЗ Бі р овея І бів ж 5 ів га а1уУ із га біх " їв ї іє хв» АїВ Кк що рви АгО БИ хе бів 1 316 дк ді; ока тів ів ви Ук Гуго вБРО Ру б
Бо жі ів повій ЖІ із Шо маі Жуг 8 З5 зара У і дав 5 Уві чУд мих М х
БВ ща зах аж Аа 5 ча Уві 7 Ек су щі ївгоНніх Уві зегу вне АБ З Би ту" Су гоже х ха хів ВИ, х . хе Ко 7 мів мів тв яр Тер во о. В Ак ви дів Ні «чім АБОРТ як В ЇВ Моя ЗЕ іа дж р
ЩЕ Тв вна тук Її віх Узі; Ап дія Ар
МУ ме Бі вне ак Уві їх сім ат
Щі Ага БЕ В Зіч ахо жі тах Ла АВ СТЬ я кор
МІЖ вОоБІ Бі Аз Ал т В кох 1 що ї ЗЕ тоже офі у
ОО - : ть М ев УР ОТУ " від мех а а ЗУ жів От меж діа Уві З іш Ві; " М : Зк і ж ж ЛЕС гіх сах
Сук Аа у х зга Баг бБіу 150 їв ат від н в ча Ме и ме 5 - КХ, сук я 4 Ук й г КЕ ноя їн ад ма ке аз тів їв діз а У рі де В АГО За із їн в с чі аа лів ще пе вва І М вій овін ТІ кове щу кв іа вга Меб вве ває ВР та жів ТУ рр нас тУувБ Аіа АГО як ід ага дак в зів ів Я Ор ю їх Мід ді ЩО ЕЕ
К В З ч ку ї У - іх піз З аг млі ВІ М шко зі мі; В що
З хІХ « ОО Ущі їз в Ме 7 дк
М Уві га ЩЕ Її дхв діз | в їз фУу5 АЕВ о ЗіУ У Я, ЕЕ пу 5 см і віж Ух
Зім УВІ 5І1У їз мк тУуК УЗ! А Є 178 " від Уві зай
МОХ . ій іш я се, ТВг дв чо ; АГ вм с МЕ : зі ти ! Тиса АГ та іт ага Ще 5 Є " . вет і є тає В БУ АГЕ яев су. Ага Со чек тів Мет ТА Яу те АїВ о з
АЖ ; п осСув акті Її нік сіу тв 35 чаї їн 1 В ву Шо Чіп тб нік у тик ожаї б
За ких , їх . с шу КЕ хх За : чіп Ущі що «Баг дяо Зав вготйе яаїх уз тка
ТВ АТа вве 5 ее Тв ОТВгОтА ка Ош МАТ МЕ Ре зер Ж вот г ї - щштчх й и ск ОІВ Ма Ка
АГ БІВ яке шк КГ, Є З ять г.
БЕ 3 я Коррх їх БО до з о ЕМ ов За; МЕЖ
УДІ ТТ ВКО ; 215 іа аг ахв іх щі Ме че о УдіІ ТРА. ок вва діа Аг ях їіе ніх АХ її8 Зег Уд ії бій Аа вне дл Аг гів М Ол ох зі зе ді що і щі - де паз хх за ву я ТР ОК з3а МО МІЖ Ар 5 пе сін Ага і Мак АГ кт ЗВГ ОоАврОМ ЗИ вар АВ БВ її ї У КЕ Є х З х її і: З хе я ; ви КІ ке Б ді і и
Зах нік мех У дк ок Тек гу і дга ви є ко и НІЖ М ах Ти сСря ЖЕ хвоаї ага
Тнроцев нотук мес Єв З ШИ ув Ав ха, Ід оту за - моз КЗ , о Я га хх І «жк х ІД у
Зк ів в лох пек Он АхВ Мі как пап;
Заг ОКР я Уві тує зва їв омаї У ЗВ т Ма нія сух УВІ КТ кар Ів ма ів чаї 153 НіІЗ УЗ Вій хе п оУді 2У5 а ув Уві
З « 5 х Ей У й не ШЕ с вгй нія де
НІВ АГ
У МаЖ хв пс іх у мч зн; дк БУ ж сх ЗіБ ага 429 х їн мак Уді чаї Ач
ЗУ вро бів У ие ОВ ї ча уаї вго 5 5 МЕ а ща; з Й іа во уз заго А чаї ніх
Фк г ді і « ща Ба: Я. А КЗ З х ЩІ сам КЗ У УВІ З 3 й за піУ Бо Зх я , змивів у
ФУ Бек ФЛ) тик дев акт Б 3 ї18 нів ку ЯМ так і мі 5 еру х Му КЕ хо зів а ри З З ТВ це М тів оту тв шт АВ НІВ пфіш меж дів
Б їжу хів У на меж; їз | зи щі М . ках чаї ер Ж ВН В зах гів ви дек звко Тв дв У Мак бух в о В ІВ З ЗТ «ще І
КЗ до Ме жо В Гу ХХ я , У У БЕ іа віх дв Ве овеа з жів з
Мет іє сім з4й 1 рец оті; зад ніх 51з : Ма вка
Ме їз хв УМ ЖХ Ме др ще ги АРІ ОНИ я г й і З жо Ії ші У ее де й СМ А У ї З, кеху. пе ї г шах с 3. А я 3: З мМ о М ів
Мт А ЕЕ У ще ти ів ів ів біт А му Я хі З Ак й ХУ З у - 1 ішви х їх й і з вн З чі Е ге ЩІ - м ї і чі Ті Ж м'ікуУ г -ї - У
Ух І У хв ів Я їі У З вк гів АБ лід АяВ а ТВг х З ді мет
СІВ за іУї Аг з Ма аа тв пої Уві бкх ЗУ У, й ЗО і ів вів Щі і ВІ т й ів таб обіх У ніх ніх з ті Азо ЧУ я 430 іа вне
ЗіБ ТА Ме Мі ОЗ АХІ ів; під ВК тех Вк оВев ке І УДі в 35 Бе й ж ек су ТВ 8 ерЯдіх ма ук . хх ій . о т т ії не зав ТВ оУу ат вка чи А с лах кі а й
ЕМ їв Ущі. і і зЗг га й Я. "а дід. і У в о Вка ів А КУ піу ака оту ве ен ве іец ій Аг шк
Туг БІУу Ах я і зак вне КИ 18 хів ме за Би ви
ДЯ ро Бе ва Ні тТвеЕ діз їх За "Вр і ви е кй "а аг іа ВК, з ТВР ВО чо
З о аЖи А; шоп "вра де ін меж те БОБ
Би Ах 5 їй Кер. од; В зі и Беи су в, БІ зі хе а З аНЯ гоу чем
Зін Аза єї ре чго век із Яга з АТ Аг сх ке НАМ проце ки А г я ОБО А 55
Би Кі г захо А18 ТЕ ха же вх ше 4 Кк хх я ВЕ ле й хі ді і жа За де От ЗЕ З СЕК пуд
Уві Аїд що ще зів Кв, 490
Ма УЗ іви біб У ах Мао виО цвиу ча вро іаи ак ніх Вга
ІБР
2105 15 Мах АБ 11» 496 ЩЕ О тв мех їх та РАТ Твгоівц уд ФУ гу «212» дотопав ів щу тк З дів ав в 135 Рееи а о ха1 вів Ах со «2 15 ХІІ ЩІ, чаї ніх ого АїВ Ар зи Зак її ТтТктотаі В зе Аїд «4005 ТР ову й ЗБиОТКВ Ох: і вер о вучу ВЕе
Мо ТВ з ок З У АЖ ОЗЕ Ку й я В і го Я т З а я т У ше ОВ Та бів за ма сіу вве Ів «к "а АгО У а ї нів АТа ви Ого БІК сх тег ВЕ Б агУ о іУ шві Мі5 я зі їв о заг оніз ту: їец бу Уві тув ха! УВІ і ОО ет реа хе 50 зві ві грец Щі бу хі з ж У сн жі ча ЗЕ 5. ДЕ хі 7 7 ; 33 5 ГЕ хх їх 5
Кін уй ДИ лів ага Кк йо Се) Аг г" вка о1у Є 1 31в ах Олі зі пожів гер ОК І отуг а
ЗІ Уа і ТТ Ав Бій хи Уа мі ж СУЮ
ІЙ Е ВЗ Зах З і ку р з в ах я ; ща Ка З
З екв ні У за хви ВВ ох я х та я У : міх ї М їх Те Ма ВИ ех уд ох яз В дат ів НІВ ні дк і чаї йіз ув ма 515 Аза
І о хОжі с ЕВ і : аж а сах . за НІ З дя з й з хі їхх З Бій вна ЩІ «ка Уді д і «в ін дев а
Я я АГ що віз ЕВ У; ще Ве хів вах 35 1 тТук су
РУ АГЬ ог и Мін тТвг Ж ех гу Я чек АБО: тв стВ х дій тв м ху ВЕ а в Х «і х ї У Зжоов ОІЗЖ Х я куї сук Ах м МО ка квт ше ів та іа цеє зро лго мех
Що їз уаї ак 5 їїв біб А; ке вив Ар Аг 18 зів Аїа АБИ Тв 5 ШТ вва ВАВ пік мів «і й : Зі вк з ща зав ВКЕВ ді ща 5 і ; 115 тУуК га г Х 35 г З з де а Е з і дгц це й кг у ту У Ук ді. " 155 5 АЇїй А ор «Кіа Ів В ві УВІ ТУ їа іви рух АКТА 175 зев тег дів І Ага У! роАТа м 1 АТа гуУх АВ
Х зи Зі УВі я ща " Ущі дк М тру їх хв Уві й м я І : чі 5 ЇХ Мак ТУ уд ин те к і ву й ЗІ я ке і пів Уві іп Бі ту спі твРкЕ й Кк " Оу АГЕ зд за Діє 5 ков ; ек і Ве дія КУ
В АРа і вх СВИЩІ й ща мех 5 дк НН та шк то а дк і 15 їж Те ах о 5 я пу аг А. НК щі Х З ех У х Вимк у жук щи к с т щ М
Тв се о БВ сій ту не оАЇВ УЖ й : хіх Я - я ХАІ ря ве Кк ше її і пу Я і15О ву ще ож ї Я . В й |З п тр в г і МЕ ї Н г З 3 ре Ж ре ях ж т С и бе З заг ів ТвР Аїд і с від ТВі ре Аїа ув й М
НУ Га їз вва; АБО АГ» у Мет
Ка 1 гу . 5 З: ще А у ТУ ех
Ко 95 довго дів жк іа дев зак . їж Є У м 17 ГР | в вне дів й шо: а че бів ніх БЕ
Фа Ма Зх і й опе п; ков КИ іх с сек
Те ща за ій дів зв пі Арго ін два ід те ЗТ тро дів з1В з ніх ав о Бій АК
У Меї Ага г Кб Кег Аяр о Кви би А 22 зви гоже "АКТ у га ре суку о Б: шини ЕЕ з Ук х Мат Аід б 5 УК Кі Ж сід БОС
МЕ Ні мес зах Бів бух Ух з аза уві АР
ЗЕ шо зви і я ва Ух А тнеЕ МК А ту г Мат сх сво ї д кі У З т й г У . ж Аг
Рео Аа З З тує вав А
Фе КОМ, ВЕ я зв Ту і і 16 Ні ув
УК чаї сх ців уд
КЕТІ зх тТУк
Я ; від ТУ в вет АТА м з У ! се З 2 пе я
КО зе дій уд щюЮ Зі ага Бі) ко
З те Ех к с ох " ск т Аїд «ве т уд В чаї Аква суді й За Мет ше уд й З веж У: х з пі же УЖ ЕН ЗЖЕ з раї вух ге кН го 5 5 АБ АВ З а їх
С т вай Ух Ж з Удї КА ОА. Зд уУущі нів "Я нія ва і від Бра ; Аж ЗВ з щі же
І Аг В Зі віз іш ке іє дгв ет крук нів М їх «ТУ У чів зва Оу зча Че ніх ага зв «За так
ЗІ зм У сх ЗБ ОА хе ів Зк дід
Ж ВК 7 синіх ПИ віх зів КОМИ сі В ТУ тТвР од 3ід 5 йщіц мет Зе
КЕ Р» їщ і. ді ві . З щи оті км бе жів віх вва мех ак їі 18 Зх іїе аг тів ар Тк 5 Ка с Ве З че В З г У В
Мія УМ Є мех цух Фін щув іш ЖЕО о
Ай У зи Ме зга Бі і ів її па га 7 зіу дер В ОТКе ве В зр оніє бі й зга ні ЯН ша ціх за Мова ТВ 5 Меї ав. зву Сен ага аїа
ВЕ хі ра УЗ 7 же ОВ Е ем КЕ їв дід ше хід А У меш бі у їем Ахр зве бів А : ака й 15 а как ее к Уа в е З е | за вна 415
АР Ах 15. а Аг 5 а знов тв ів ува ак мак ох А Аа рові в ЇВ ої їжа з о шу А ча ар із аа пу. м їв АБо з Аг Аа зи Аа чів ЧіУу дей 433 вне 755 Ту уз Аг то із їв. Іо кв Оу. мен АЛ ВІ х ох її : З з как м в З гу ЗО 5. г ЗО п Те їх нів Н Її іви їв зов й сей
ІБ з в Е чі а Її ага 5 а хів ал
Зах ТвгоРге 305 Тв ОжВі ОН БІ АРГО ча лга Аа.
ЗІ тВг ТВ яму АВТ ці ч Вр СВ ді К , ців | їн Уві Ав у врРо се Б Си чи У Бін в Ве ру бів ву ац т еш їх - ІЗ ВЕ у чо. ТЕ ст ах М ака «їУ ха зов : Баг вве п: лів ї чо те ве їі чво рхтзх 3: Я А й ; жи -й їж щ ТВ - зкав С ох Е 5 пе го га ва з Зі Мет з Меч 51 з ага аАго " Аг й Се ів го кеи
Ти дяв Аг зв ощегх ей зем ож жк і аідз аге 485 цін а 15 ха дій 5 Я пове я З А: жо я Кк у Аа в 3 Тк Ага ів її. їв пін є Віа т зів віз ї решоє М оОвге Ах -З дів Ше: жо «Та АВР Р о Фів ів А яю т УВІ АВ сан бін є мех УЗ Рге во я чи вто Є 385 о
НІВ ОБР АН Зі й меК Азов б З жк ТА 5 ре «2105 1 рожі т ре ага 496 гої ув зр є у «211» Вт Ту тво і бій дев є ; щі хх В х ах Фе «2125 Р идотопавз їв нів і 7 нед нія Ві за хід Аве
Рзе Зв їв і УуВі нів ВБгє дї; 213» ск тів є та уд ЗЕ 5 ; 5 16 р Бек ї жк ОотквВ і ВрРе ВРе 5 хо. ще чо Бек г М орга КН 1 А 5500 вого З Зі Ар 5 я. зак Уві кї ве КЗ мет щи тв реро в З к аїв сін З шоее еко мів
Н з ді 1 Аа Її ее а ОЗеК ОН
А Ага ОМА і ніх г р освиу ді Їш Бе ко домо а ГЕ ОАГЬ 2 хі жд М во ві Уй У сік го , тек а З хх т 5 ді сх ау А ту! Та їв «у ЗУ Був уд М ТУ х Фу вів тд | БЕ ча с Х 5 Кен В Бр ВАК
Зв ді в е їх Ага шк еЗ бед 5 1 Ту вт: БЕ: З
Кіа У 5 кВ АТ Аг 55 ї)в'їво З чаї ту ще сУух
ЕЕ я. У ме ЕК 125 ча їж й хи хі в Ах Кк «а шій й дк щі кі щі у ї мг Уві їх уді йх з ВИ Зо Уві Ага 118 іх дкв як Ко МЕ ? НЕ ту їх х «Сл кі ї Ба ід я ! я І ОТВе ня а тк є ета кт ув ; як ІВ івоМів Ті т АЗИ " зх ші Зів вий й
ІВ МІВ НЕ тТуг дз ві віз ча бі ЗУ
МІ З . зна У УВІ. ух Стик д Ж пою щи Я З нг їв вра сеї ОЗ Уді за і Ті де Тк ор, г ІОВ ї . дк тах ТІВ З г ГУ о зу ців і За бін вав Тв тк Хта Уа !
М АГ З МЕЧ Я тако Від ув сих
ЩХ й ик уч . Ті т їв меблі д по Ме
Ме ех Аг Бу хів Та сАТВ ме хх Ага ік їз мех и дат їз з ків в 148 Ме а дз МБО х фі ЗК а ха: МК я В МІ 4 У; Ух ХМ
МУ їх і Ага 5 те в зве вив ке вка тя зі уд. КОЖ і Бек ВИ прове ін й в «У о із аг дек Зк дк ЗЕ із біМ 115 "вга щі 135 т дій АРе ї55 АТ АРІ же «в
ІВ М ТУ КОМ ге жд ТЖ М 2 і; чи ве р у ; г т : г я і. 4 Сів З ї Уві - 15 ви 1 дїх Б зіз ї я Уві і дхр дід і аа
ОА в. ві Аго Ув а а Ахво ши їв Уві ЩЮ ко ве ЗИ к., чі я ї а тек мді 17 хе ЗвВг а ху в 1 У АРХ іш маї ФУ іа Фу ту Тв бів ТЕ іа су ба ім ув їв кій бі Мас 1 твг Аа т ев віє іга жїв їкх їїє меї ІВ БУ ЕВ НИ чі є
МУ "в Аг М вгожіє я, У Б шк ТВ тов гу Ам се За й оту НІХ За Щі те ше
ШЕ п Су в вів гу вг ад У ча ТК
З єї їм "А 5 до ВЕ оТВ; за чері МЕ зай чі зе ЗЕ 5 Мт М че ТЕ. КК Та Щі: «І
Ж. З А зо ща кА Твої ж хи пд пі ма ; З з ви 5 ще а ТВ; Мет дів ; ма кКК іду де Ох "ий щі З Ух А КУ сім Ме ї тТвЕ ді: Їд ВР; Аг АВ, Ж су
За тв Та в ма Ар Зв ніх ЕЕ са зв т рго Аїд МО Мія Ага ЕД хо я ре
АГ: 195 їгтр Рго 513 РН ді сів ат Зв ода ву зве оУді Та бій а; ж да ві 5 3 Ага її ва кВ ві; І Ніх де В цен ай
ІК зій і ти ві С зак кВ «М С а. ме ги Сн зак. пів ев
У МЕЖ АГО дід 51 вот Ех вах їх Мах бах біч Кув ть шк БВ ОоМміх З МЕЖ б: тик а тув МЕ тк 1 За ат Бук
КоВіч» від б зе КгЕ ще мк «У а щій Уві від НІ Суб УВІ ТуУг Бе дк Ага бух АБр оті ага бец бе хм " 7 Уж " ие а 7 а я в З й ніх ага ніх яхп Уві рух тв! дій хек Бій йїва Усі! Бег аа ВІВ ту! с 7 нах зав
ЗК МУ ЗВ
ЖАХ же о : - кет МУ км кю х її хх ха «ко кі пути Ех как ит ен ди вік Мід іа бі баг біуУу уві дів вБго УВІ Бго бін Мет ді бін АБ єту мех
Ах 7 7 Зі РЕ ОВ
МР З ХК За віз щі біуУу хів Бі» їкгодхв ав біу б Зег вай АВ бак оУді АБИ 7 У зи з па ЗУ м
Мас їв бі до Меб ух ВНЕ Мет віз Ні ів Ні АгЕоАТа УДЬ НТя зд 7 зах ою а зх оз І зга Аве із дв УВІ Кей отвР оБее бів вух ТТ ву бів меє вів тве т Ех і ЗУ й век ї55 Зв ух її дв сі дії ага чвгоіву Сі меж аа ніх біц їі бі бек їте пух 7 7 Ух КК 37 375 ІВ шій ТВг обі уз йго вів аз ів їі бе) бву А Бен АР Ні Рг ху я Є х ри их чув ях
ЗБЕ Б ТІ й ОВ ния щк сій тТвге о ТВк о вго нНі5 ні ніх цеб віз а? Тк о її6 Узі вБе бів діа де а КК БА ще я С у. Ук ше дет ,ї се ази тує ЕТ зм ОХ. м, ко «Ех А г кл се
ТУ бі ав бів Мі а тїВНг УЗІ Бе) бів Або сту ахп Уді УЗ мех 7 т яз 7 але ЕІ ве че І с: Жах дачу ій ко хм; ее НІ: вн) их Виг і с му З. т: оз жк ді я вій ой Ага лго іву Баг ов ее ВгО вро Зі ага ші КО АроКАе х КЕ х Ух зах ау а 45
Ме у Бо мох що х У ко й р ніх ж що ж Мокух і Сбіш бін аїв бій бег аАга дів тв вій їі ви бій Ага дія АВ ав 55 4 ам КА Я ЗМ і 7 з аж ре чн Се дожж КН ту зе о врем мк ху В кк меж Уві аїв Аа вка дів Тго Аго 5ег сем біз Меї ТР ово Бе їво
Я ! дух ях щі
ЕВ 47 ЯЗ БЕ о в з ок ки ід одта ка Ж райо ха я іа
Мі вкОо Рг вто сво Фіб бів Те АТ АТа жів сво ліз сів беу бу
Я 430 а «210517 «2115 474 «2125» РАТ «213» Рзейдотопав «4005 17 мет сіп тк оїву 5еє ів бій НіБ5 бі ТвБ ов ові ТК ОМеЖ Ар оБій у г 35 че ї зх БО Я ї 5 о су оцту -її БАЧ г Ж ах їх ях а сх ще У хх о вх
Тег Аго вага Уа! ву бік ахв Заг о тТго УВІ Ні Ві бів Ао ШУ Аг ка 85 0 тів Ущі діва ви хі У міх із Бір бак Узі вро Бе вро іа дев
МІВ УНІ ІВ СЕ БІУ УР Ні вій зі Заг ЗР оКгО кг ОТО ЛІЯ АВК
Зк й я як з Б а с СА Яд: жаху Ул юю гу хах їз за дя 0 Мих Ж с Вих З ага Уаі! їів азв АВ Ага бі ух Уві Зі їец РРО бі Бе ЇТів Акв ооо х х СЕ а я со щі 33 зії діа міх Тне нія Узі ап Бій Ті бвб іво Аго бі Бію Вк ба нів ше щі В я 5 та ух 5 х ска дея. 5 оОам пе ут. я тугу х «А Хот я ху ер З бум як нету же ціт ага бів вне ТУує а5рБ отр во» Ре дя Уві ма) Тук бро біу бів
Й ак КН 35 е ЗБ ЯЗ с дя ше де суша У. п паху хі ха хі аа дозу Жив Кк ії-5 АЇв Мет Аго го бів йхроза! дія Уві Аа Уві аАго бву тут Куб 100 ї05 То
МВ М ЗО іа 5ів аіз Уві Ага Бак обі іє тТНг ОТГ хів Ах біз Ах» вів Азор їх 7 2 195 «ех як кА ких «Жир сжхкух о їі кт хол Ку дув, я да там ду хі смігує рік
Звг аїд їі їхжв о Бко бі аз їіе щів вів аія Меї Ав УВІ Тук Бі
КК 7 7 кою а що її5 140
Зі узі Фіж Уві ага ча) Узі Тує дів дку Меї Рре НЕ АЗо дги мех
Зах З Зх Ех ї в:
М 3 155 ї60 хе с соди сдуг зтраж их і А 3, ропжкках 35 ств Ах : сз4 пк й дз фхую р ту ази бі аг їі біз бі ТуБ Узі яв дів сец фу від Аг бак БгО т у 5 У ї КЗ: З 7 х
З КО | й с ; М
Бій УВІ Біб беб бух хек Хі Мет біб об о тїнгоАтТа УВІ АВ Муз Акр що її 190 де її те 38 ів дак дав ів Тек ні бі тТвк о аіз Бім ші др
Ага Я тТагодліЗ Бе Бак АВ ові тек Ні Бу Те дія і Бі Аг і 355 Зв зп ма ТЗ «КЗ
Хів Бек узі Тгр обра АфЇв вБго афїв тТве о тТве о тТвгоаіз ді Твг ові и
КІ га тк ух «А ка те пі мех Ако їго Аїа бів Аа Бйе аіа АгУу Аа Аго діа У) Мек то т25 230 2 що тв о сец нів Мет Аа біц бБег ар оМіз Ах сів ага бів нів бі Мах
258 сти да ви т ком сац сви АБ в Б де Ме 245 Зі Сух Тук бі ев їв Ав 7 ; Знотеую Ме ії ДУ ее - м хм ща зва дія є туго мех й ще ; мар о Уа АгО Бе СВО кави ра МеВ ому . р чи АК У і я
М 25о Уа Ту Вве АК АГРО УХ Ше: жа тер що фе ж и а Ж ОК шо я мех жу х бів УВІ дів Я15 Сук УДО За ів Ууйі Ух ак деп Аа ТУ
ІВ УЖЕ й Ук З вія свв є п ОУЖ УЯі тт Уа! бух фа! віз Зак б Б у МЕ пі дк ви Ку ї а я вер обі мАжх
Ні аго нів АБА УЖ ЦД 395 З1о мес Уа! ін Аг біх мех нт Аг С 5 ЖУК і; кдеку хі З п . си га і ВР 1 кю " жк х БЕН й г ойоїхх ху З З А ща кг Уд і з Ку 5 с щак В З дай іїви біу баг обіу Уві зів і дж" Чек ДЕЙ АКБ ОВ зе ему ЗМ У АР і дк щОг АХ За ти : тв йог 5 му са не
КІ Р бі Хі біу ТБг 5 АХ ЗВ іх ага дів ді Ні: «як її КОЖ жо 7 ше сфе мч г їі Пп дід уві су 325 Ме мет діа нів її нів го зЕВ 2оМех муз Ме Ме АТА НІ тв мех яіа тв з їЇтТа БіУ дюр Меї Гуз З ТІВ ви бів Меї аа ТІ мех її 5 Ж я м 3 фр Її Те ев ве
КК їй і 3 сви т г товВрко й З БО З ВЕ : 4 е
З кі Ка Ж у чи - ше г КУ кору ча ах Аїд Аз ув ІБ за дФіц Та біу бе
Кг В ХУЕК ж х я х іш жк дк Мі сх
ХО Зх 5 х Ше і їх Ма г кам ги че ах Ча де з Баби Ж За ака нія Вко хх ге 1 і ще хкжх . ех сх й г во В
Ті Ар і Аа Я ТІ фев іеий ко ен АКО яв
ПОууВ мій дав ви ХіЄ бе ре тах
М, КУБ Аг Аа АзвВ ви КЕШ ПЕ вне сій 818 ст о тве о ету мяз дова і зіз віз їТвБе тів УЩі вка ях з55 іх нів ніх ївц Аа рух т оз вет
Я Тнг вгО нів Ні Ні С іу лав ві Уві Мет
Бій тТве тНа | ща З во ів Аа біУ АВ а хх
Що у хжне УЗІ Бей ТВ де м: НИ д зі мі що твк УВ Я ів іви дід вна ху хх г У мап БІБ щі А і Я к- нку; дк сі пів ща тЖгову АТ В за гово бів Агов
А Ех З са Кк в щі вип овре хх аа 5 ча дв я хи во ваг ол ке Ач ча під да
ЗИ Аша ага го ви ще що іа бів їв сій го ді й іо с Ко рх ді жі і ма а
Бе зіп ощег Аг АВ ТИР Од: 450
Зів бів під бій 5 У - ів біб бін А а "ви
Хо МУх те й пт; лю 2 45о "Ро АТа їтв аку Бе ев сві В АБИ Вго Я ГЕ
Мас щі. щі «2105 18 «2115 474 «2125» РАТ й іот» ех карІіо зако кож і » 213» Бактерія «прокар і УВЇ ТР МЕТ акв фіЙй їв ніх іш ЖВЕоїви Узі ТВ тх «4005 18 - хів бів нія сі» г в ве - як ву о ОК БІВ З зо : ко вх ва і У Кі м меж аіБ Тнг орви м ст вк щі сів еВ м гУ Бі
Як ів БЕ х «щі між мх У х
МЕ 5 5 з Бер тт оУді НВ уд 3 з хх ск Мк ЕЕ І Х А щ холу х худу ЗО У ДАЖЕ БЕ ЗЕ БВго дід ак дев ага АгО Уді цец 615 Кі УВІ все вго Бга дій ї
ЖК оХАаєь рмуВ В і ні« віз бів Баг уд вра ще ке пік Уві ніж вів біє 5 45 : тів дж са оУщі Аа ву піх ув ай Зрєе їіч ВВЕ жів да т ї а ж кВ ХУ 1 са ї ; я І: КО Х ї5 їз ака бі фе ма БО . пі і УЗ дар А АГ У кеш и зав НТ хх зів й МО Ж зу ож ру БЕ ЕЕ
Агщ Ук Кк ж їв іє їв А; чо БО
З чі Уві ака 1 жів є: зи піу їв
Мідонік твеКоніх Уві ака є чаї Ма! ТУк Рг іх бів
ІД ОН З 73 Щ мец вна вай УВІ УДІ ТУ ак 55 х ви отут йо те ТЗ ККЗ шила а и обу
Біо да іт вбец тТуг а Сл аг Ага ев оту су
Фу аго бів 85 чаї АТа УЇ АЇВ МАї Ага їв 7 Ох сх зв оУщі дв КОЖ МАМ од ще З оБІМ АБО УВІ АТЗ -з ід дкв за дія мес аг Кго бій АВ ,: ЕД дав сої: ал АТа Ах
НК еВ Ту жів Те отв» їв деп а: у що зак іш ТЕТ КЗ Тон вв іа бів аїа УДІ АКо век су 335 : Аа УВІ Те фІу ів 5 МОКРІ ОМВ т щі тв аїз Аа мет Аїд З з
ТІ ЗЕ ті є в ІА. Сх 1 "з вга БіУ Аза 16 ботів віз 140 хг мех заг аа ів Ж т ча хг мех вна ве Аж АТЕ тк зав : Ма рук д ія АГ МОЖ Ух і г ДІ ТК - у тишу за З Зі УВІ ака ма КУРТ 155 ік від гий ер о Вга
УВІ «ТУ УЗ 50 Зі Ав АВ Сан СУух аів Аго їх тах ба жів бек ою вд аа з І ач ак сту Аге бе біб ФУ тугу: ї7о ма уві Аїа вух лев
АВК АГ 155 ів мет бін Бій тТве від зва брх жвк тів Мет Є бі з М сх і вів іо бух аг тів Мах га ; їз шіх Бі аг зу хи Во иу КУ мо їх5 о о, ть »" під У у У
З УВІ ФІ хі г Ту Ні ФК ТВ; Аж 7 хі З зи дак явВ ік ТуУуК Ні КІЗ зах єї: ; З соку ОЗ ІІ: но х Хо що ух її і ча ів ївб діа сво Зв 20 Мне отвгоАіа та! Твг Оу єї і МАЕ шоком У хз б фу пт оОКІд ої
ГЕ 155 у вів БР дід ТВг ОТ "ав З ват тнв : са же та АТВІ вк : сах уд Ме те їїв Бер уві і МК 5 35 ага ків Ма Ме ит ко їн а ба 8 а АГ АБО Ага А о 3 , із бі" Аїв на Аїд. 7 і« ТР МЕТ
Ту мет аго Тко Овід З М ким ін ніх ТР мех ї5іу Мек ага тт 3 онНіх ав щу АгБ ОЕМ МІ як
Зах іа бін Зеє аАВо ніх за Зах і щи
Те ів ні мет ліз бін Зв; | «5 ів 5 Бін КО це
Тк веб нів кеї 245 тут шіу ву во ав ОБ ' я і 8 іх ух УговтУ ве ів біз тує Вях Бін у заг овко лів зів тТуг их що чек чекд що «Я ЯМ я ї з «с ск ше и чи Музую її ех пл дою мошок хх ї з
Ззіз УВІ АЇз ні5 Суб У ТУГ Рпо Ах АгЯ бух Ар о УДІ Аг реч ке 2 | ЗЕ 25 я ВО «З : ке сем і ша Са ху Ж «З сгаЗ садку сту
Міх ак Мі дей УВі ух Уві Аїа хв обіп уві туаі хг оаяв Аа ту
Ко 535 м
З ся я да ще кл фе кі; ква А Ж кто а Ук іївиу Біу бек обіу Уві дів Бгто Уа Бгто біз Мет УЗ! бі аго Фі Мах
ЩО. І що 315 Зо
Аїа ма! бі ті віє ТК оазр АБИ сіу да его АБАаА Ар бак уві АР 325 330 ї35
Мет тів зу дер Мет уз бе меї дів ні Ті ніх аг дій УВІ зап 345 Бо ї х з ж худих м фак КЗ спрру 3: каху Зо же
Аги ав Аа азв Уві сец ТВг ово Фів фу ХВ ев Фів мех АТА ТВі - В ро т хат зх 55 ЗБ ІБ хи х 3 що Ж жа х ум фежух Ж ук о У ха дае КУ Зк т т : ї ВУ з й мо Жах і гу
ТІВ АхВ БІ дів Ага Баг обо бРУу МЕ А мо З іа Бі Бек гів ще я Є УК за хх З ЗУ ще Б У ке сих у А х се х ї ща: Как од: Кк МЕ тп іа; вки В З щ їз т йіч ТвР Обі» Бу Аго Вів ар он Тв ев СеО АХВ БО АГ НІя ї со 35 ши що зах щю я х х сей зве що ум се то рі за: кох З Ж З м мі Бма 5 й Я З
Фій о ТвРготТвР овБго ні Ні Ні сец атя лі Таг ТІВ УДЬ РНЕ ФІ Аа ях 10 ше
ТУ» ШІ Ап бів УВІ ах Тк охУщі веи Хі ар обі дев Уві Уві Мах 7 Й х ЩІ -к їх пи ху 7 Ех
БВ. 425 Я «і дж агО Аго ії8и Зег Рв рев го вро Бін Аг бі СВО Аа впе 8 мо я є цен - як хх С фс А ЖЖ у их дог Ж схоже іа Зін вію із бБіп бек о йга Ата те діа Її16 фе обів аг діа лев м. з МК
Я Ух не
Меї Уві Аіз Аха Вго АЇва ТР ага Зак ви ще я «2105 19 «2115 474 «2125» РАТ 213» Бактерія «прокаріот» «4005 19 кат ів ТВгоі ву бак тів щів ні бчіу ївВБораноУуВі їТВе Ме ак ів
Ма вів тп Се заг Кі хай нія бу РОК Ух Те ОМЖЕ ре о і 5 іб ї5 1 З на ;. хохжоуч й дов го «ах дови мА щи тя охо я ке ще ях» дже їУт АгУ Ага Уа! їву біу а5р бБегоїгро уд! Ні ма бів ака сіу Ага
ОВ 25 ЩО - дій х ше си ке за є км Ку дує ах рук зем їжи с мук їі ча! Аїд во біу уУуаї Ні5 дід біб зЗег о Уді го Бе вго АТ Ар ї5 40 45 са жі ки ко доки их х НА її фовмі фік сс Віз Ба Тл ев ага Уа! їі Ар аа АгРО біу Куб УБІ Уві еп РгО біЖ ВНЕ ув Аа 50 З що і лів ні ТВ» ніх уд! Аха бів їі гей ів Або Фіу Фіу вРО Зег нів щх то 75 ВО сік Аг бів о ББе Туг АБроїго цей вне ав Ууаі Узі Ту Бгто біу бій іїУ5 діа Меї го кгОо бів азромаі діа уві Аа УНР Ага бен о тТуг Су
З їв тах За з МКУ КК
Зщоті їх ї9 т сх Жак іх СК св М КІ ше жу Кк ї щі ї х шко м 3 З ач дія «іс йід Уді аг хви оБ'ю Зів о їве тТне їв ав Є в кап ожіа лав чую че 7 іх г ве Кк 515 Я Як
Зв аїа їі ТУук Рго бі ай бів сію дів із Ме аіз Уві тує СТУ ча " жк їв о 5 і ке піз УЖі біб Уві аго Уві ж! Тук дів ага Меї Бе ве ар аг мех 5 156 ї55 МО ще мя КК кл У З с я 5 У Ах «мії ї хук до Мои ум МУ дяв обі Ага лів бів бі ТуУук мі дав вів ів. бу Аа Ага тек га - ху я со чи їі065 155 75 х тек У Де жк жк. дк НК са КК: ме 5. ху Ек х гхї щл ки сш дк біп ма! бін се Су5 Зего зів 6 бі бів тег оАїв Уві кіз КУух ар чу тк 5 ут 150 5 щю х іс 5 я есюуш кош фу р Я жо вс ска а ре ек сік дм
Ага їі твгодід сви беБ АБе бій о тТуУуБ НІ Бі ТВЕ Аа Зі БУ Ку т х - суечах ЗЕ 1935 що З я з сих юта вим Я со я це кА В юр зи хів его УВі ТР овго Аа веб АТа твгОотТВе ТвВРОАТа УВІ ТВе ма! бін кое пе і
АВ во ЕК . м пф бі Ме ага Ттвоаід бій із Ба аіз ага азр одга вів Уві меж тео са Б «уже Му ху 5 В Зх з24й
ЖЖ. З . ож . Й що «Я тВгобева мі Меї діб бі Заг оав Мі5 А Бі ага ке ні тїго мех ке ка зкЕ 45 З З щеговго Аїа бів Тук мет біб Суз Ту біу беу Це АХВ Бій АГО Сеу а о ОЗ Он
АТ. їх З іще МЕ у жу хіх ек пев жу й кН Ж зн хх до козі Її ха іп оУВІ АїВ ні Сув Узі ТУК РНЕ Ар ага Бу АБО УВІ Ага Кен бе зе яка ка хїд тут
Я с З да о шуму шву зи хи ка па й оз Ж х с з ху КК дій ОО ОМ ХМК ЖАВ я й
МІ Ага Ні Аква УВІ Су хв дід ек бій Ух зав зад шо Уві Вго сти Ме Уа БІБ ага щіУ Мох сефіх кде сеіа кік Ах ет М КЕ Б БУК У: БІ АГ КІ кре іеноБіх Зегобім Уві ія Бгто Уа ге ФІ з15 32О
ЗЕ А Ух мав кожах з Ж су
За : й зба ці аква шег й дя дек Уві дар
АХ зе еру жа во вн» о йхк о фе в а Баг вх да щока ОВУ
Аїа Узі щіу 118 БУ ТВОЮ АЖ КУ 30 Є ! 335 о о зах зі віз уд нів - з Ме і ех БЕ Мат їв нія їв во З АгГОЯ АВ УДІ НІВ меж хів біу азр мех вуз вне мах зах нів тів і 7 зка шо ай Та - ов
Ж . ; ЗТ мує 165 ів Є мет АТ ОТВе із вч чаї ів ТВг ого Зі їу« Ті ін бін Мет АВ Оті ага зв а ів ар оУВІ Сен т с в Бі ку зах я жк за Ж ооруу жааче їз ма чів «6 їів іУу бер їв : зіу їв ака Жак їв) Сі Мет веб ні бін Т18 чі Бег тт їїє а5о бБіу ків дта Ж сем оту мес Ар он ЗВО
У их ел х
У мм я м зи ач ів ака мі Вев . я не «з ій дав іва тів ішн ви дзв вно А: чом го щі їВг щіу їх КВ ді А ВВ Ви ІБ М Е З в 4мЕ і; 400 пе 7 7 КН М ; Я х З 85 о З : й - Со сі тм хіх З Га й ш щі ВІД
Ух ; ші Зка» мі« чі мі ів; кіз й: КОЖ Р ВР ЯР жі ів Так ТВг вро Н ТОНІВ НІВ Би Аа х З я так Я х «їх
У ; тів -ї У хе бів вх Уві ува ії МЕ с хх їх зі дев Ве ка і Ак вам ому КМУ Ск У ВА
ТУ Ту ап біз жаі Ахю ТАК о Уді г Кк й 7 з я - а ЗА ка « я Я
АВ : м УА "ож: і жі й З вне х кіт с ак вив ви ве вка вів ка В Би АТ УК із ап АгГОЗ Аг беу ЗВ вве й Рг ВкО он Я ах
ЗЕ ж А ж ще
З . «т тв а жа іди ів го діЗ вай івим шін бів із бів Заг заго аз тав дів Щ18 ів КІМ ОАБВ МІ за Бі БІВ млі ІВ ше я 50 555 зве їеу Ши ет ті дів дп бго Аз Те» до кер г
Мех уві іа Азп РРО АЇЗ ТО АгО ЖеКОве чк ато «-2105» 20 «2115 474 «2125» РАТ «213» Бактерія «прокаріот» «4005» 20 я іх кіУ ТБтоівн оуді Тв мех дк СТВ чек бій Те овец Зеє тіє Фів мії бїу То дев ув! Тве мес ар оє
Межі Її ви ЗВГ Огів о тав 15
З З пе мік раї ків дет є іх дга х я Уаї без бі ав заг тк; Уві ніх У бій АВ обіх Аго
Тег дга Ага Ууаї бе бі Аз зе акї я " за
КМ : в ех аг Уущі вго вро У ді вав - с : тр сеї ДУ Щі міх діз і МОУ Вр РО КГ КІВ у їі У! АБ Бей Фту УВІ нів ків іш бег У зх
ЗЕ ай Х щ не шк ах й оч з орто Бі вва тів дев
КО і віз Ага сі ух маі Уші сви орга БіУу Бе їі дя ага У Ві ї і а дав Від щи 5 У У Лі Ух і 5 ки жу п Бай з й їх мч зо У А іа: ага бі» Бі ве аб віх : У д мія зі див кі Ж г Б АГ БЕРУ бу КО ЗЕ сх
Ата нів те нів ма ев ІРОД кед ве тк і) З ко
Бе 55 : вна дсюя МУ зм; Чуб ВЕБ шіУ бів же ів зані Тек айс Тв їв; айва де З ЗІ ЕІ ХКГ З бі два сів Бу Туб АБО ТР еВ бле ди У і цк
У: Щ ак 1 я й - . у Ж дя ім отв бо - ша ; гріхух ху ж а о ді: Ущі КО БОМ БУГ КУ
Мих від Меї АгРо РО січ Ав Уа аід Узі АВ У; 5
Му РА що В 155 ОКХ я й
З ТВ Баха . щк собів ака дів де» з с ч со дв сек м тва те тав їі АВ Бі А Кі АХВ аТа ств Аа УВІ ато ВК шт» зе баг жк 115 яке : Ок км ше жу се біУу дз її біз іа аа Меї лів УВІ Туг 81У
Заг Аїа ТТ тТуУуК БгОо біу а5а дів бів віз діа ча; :
УХА Ех з й я 7 5 ії Й свох що ший . че Її ТУР аз Ага меж ба ее Ар АгО мех - -х як хх Ха ї: ТЕ с Ух крою У й, т оку піз Уві піУ УВІ АгУ я оту 155 що
КУ я - Б Х
Зах Ко я у «З жу ую вка «МКК о х сх хх око са хв» да івріУхх від дв ще Р щ зе я : с їЕ З ВР: ВМ Ух Ж ол
АБ ТУ АгФф осів бів біу Тук уві Аве з ' Мт
ЗК . я ем егУщ а Уві Аїд ів дав ів Уа! Бім рез Су5 Жак жів мех бів бів тВг Аїд УЗ! АТЗ Су АВ ців Уді бів рез бух ве тів мех вів З тай с їй а МА г й кю КЗ М А з од «УЮ Й щ се м шо жов те да іх Ех А Ко кр чия Же зи Бак вх ій тек оніх Кі КЕ ІЗ Ів щі ФР АКО зка їі Тв Ат ву Зав АХВ Зий Уго у за й 195 ММ и «їв уді ТНК б В : СО ков з вій вгОо дія тТве те о твР дій Уді ТНК жа БВ її харчі ї Кв о вго вій є г З щі тп ота т 35 т
За я ов сову жи їв аїй вв о аї3 дк ах дга аїа3 Уді мех то - хх Зоо зів ВВЕ йіБ га АХ га віз УР Ме В
Прес го тв АТ Фо та ле ята АР дов АГ АТ 2 зах КО КА щої вро ах з мех я х сади ж чім его аво ні5 вар осів ака вБец вів Тер мех
ТВг ішц ні мет Аїа бій его АБроНіх Ів ФВ Ага зв
Ж -е . вод ть аг ви з хі суку фак 33: тю ік тки зх ви дя ОН аг МОСК
Зег о вго Аїз бів ТуУК мех бій Сув т їх віх сен кеш АБІ У «КМ хе - й - ях ОКО 73 я КА: в сер «во З де - зт аг іч вк Уві пк ви веи ще ся Е за Ух Уді ТУКкК Ва дев ага іт ВЕ о Уг кт ке
Зі Уа! Ав ніх суб маї тут ре А Аг ! ЗВ5
ЗЕ «М я Я, яю 5 . зі дій дек бій узі Уа хв ап дів туї ї. и щ- сІха че ві Ах Мою туї Я У ХЕ АК З
Ні ага Ні Ах Уві ух Уві Аїа бак овбіп УВІ ж ї мо гук М
ЗО -3 дк секх ру; двхух
УМО ж То яю вус зі ВР бів мат ай Бзів ак 5 І У ще ізн віу бат бі» Уді А а Ра чаї вРО В ї Уа т; й Хв ех ку У ж х У
КН що яко : сф с Кк
З тох : м код ик за вх квг ЗІ АХ
Ж зу п ер ок ща У ай аг Ап дк ВГ о УВІ АХ
Аїв Ууді БУ Тв Біу нг Ар ах БР с зро ! 35
З - их «й мух Ах зді 35 дя що Мес су БНе Мет вій мії їі ніх аку Аля Уві Ні мес тліє сі ар мес цує Рне Мет в ні Тіє Я ев зай З сх дох я чне
ТК що. ке он й в км ази та Ме дів тТиг вго ахр дід Ахр Ма! Цео ТвбоБго б5із бух Кі бе біо мех ява ті ага азо ІБ АБИ ДІ зка за 55 дО - Я уж кам КТ є: Та аж де ак оіви і їй мес аз нів бів Щі біу бего їв їі АВ Бі АВ АгО ща Би БІу мес АВ НІХ ЗАВ ;
Що ух Й ЗУ З як сг Фу хек, и міх У ; хе сок8. Кат Тра в за твк сім рух два дій дав сен їв фвд іву 5 ів де З ні го ій те сі вух АК З ще БВ КЖМ ЖІ ен 55 в Е зов дае ОН Я у що д -
Се ЗМ. мі вів тТве Ії УЩді ВБе бів віз ж ; є «а ії іфік зв жі Ос ? ор У МОХИ ЕК
ЩТв о твг те вКОо мів ніх Ніє без Ай Ваш 415 805 і а о кв і дей мя Уа Зк ях с ке, «а ожій шві дав твкЕ еВ Баецо жі З оАкВ БІіУ АЩА ЖІ У МЕТ
ТУР Б1іу Ал обів ВР Ар ТВ Уаі Бе Же АЖр о «й 7 7 ще ЖЕ - у : вх . - ее угоду -5 У г: . І кап іш дек Ве ій бто ВР бів вга бів ін дів пе пів азпо ага Ак п іви дегб Вле се ВтгО о Вт Бій й й зах Х я 5 дя кі : ли ка зів свк йка ха Те аАїЗ Хі ей бій ага АВ Ахп ів бів Бі Аа ій Зв аг Ар те АТВ Тіто У аа ура и дея как гав мех Уді дів а5п ого віз грог г сен
Я за «2105 21 «2115 474 «212» РВТ 213» Бактерія «прокаріот» «400» 21 . я . почат жвнЕк мот дев КІВ шок ц Заг дів ів ніх і тТвР осв; о УдІ ТВгЕ меж дв оБів
Ме бів ївгоієен зег лів фія нів щі ге МЕМ ох
Я З ; - їтв о заї Ні Уа) ій ав бі дев
Ме Що ма зм; 35, йжу дою су кх Зі У мат оз зу АР
ТУР Ага АгЯ ма! Беи БІУ АБрозакК ТгроУ а! ніх уві с я
КЕ Ка Мою З С хм ко з тех з за вВкем ки.» БВечу 51 асо ох шк я м Зх ма вес а мех ша и З ще їх Е та ве ід де її уві дів се о біу Уаї Ні вів піц вк оУв й.
За дви Те рек ма май ва вка бе вва її АВ де з Уві т З 2 к щі ях д 1 а аг в щі У Муз ча У Ї У Кк го щі у ЕКО Х г ха МАК М шк ГО «й За У зв шою Зх
У ; іх Уві дя Сів їі рец іви ага бі єї го жХве Мі ід ні тТвгонія ма де йонів ви ви го їх «Ту ка
КК ТІ СК ; х ща М ; Р рун жк с я І ях - ка зр де ту рі ВН кто яв ТУ Вч КЕР У ві:
Оу Ага бів Раз тує Ар ТО Бен вне вав ма! Уа! Тук вро де
Є - - 5 вен : "Ага бРо бів йхв узі дів Узі дів уд Яги свиту Ж уз Вів Меє аг Бгто бів а5в УВ! пі Узі Аїв У! ве
З що хх я
ЗО а хз хе де хх віз йхвз - ж, я кед дохо фл гук в а оте о тТвне жів ай Біз ай дід КЕ віз бів 8із Уа аг бег оіу в ТБРОТвЄ КА Ав ЕХ їх щи М ит зи
СНУ с туї ів; їз із Мак да ма щі «ак і 3. Її і ОТ мо 5 1 У дя Ява Ї у А І З ді З ме я вів жі Х Х ж жк те Ак У У м т жк 7 г 138 ї35 В й рве дхв ага Меє май сх сх дач КУ У сженую аа жк мот ві А мч ож и Мак піч УФ! Біу УВІ АгО Узі Уа! Туг Аа АгО Мет вна вне В Я ки мм У х З «в ЧЕ З іхЬ » де . м зу. ко іс« ка до оку в овЕа жк ше ях ви ки бе УЗ ст ді р шВ мій АТ аг Кг
Ач Оу Аго бів бів бію Туб Уві АК вів Мен оку АК о тУк
СК ття й ЕВ 1 КЗ і 5 Ж лик са ія ви»ук пс
Я З кл яв Су Бег жів мет бів бів Тве АТ та АТ Ух АБО ій Уа! сів ре Су ЗВГ ож Мах о ї Я ВІВ Так Оолів З тв їх 3 ь
Щі 150 155 | о 15 дра ех ; : сі ТУук ні щі тТвКк ів щі єї1У др г і ня сожую фо оо і ; з щі Ї кам ще ші ВЕ
Ага тів те одіз ре Бек хр вій Туг НІ БМ ТР й. ав :
М зах КЕ КК . - зах , ха Тв тве вк да ча Жве оваї тів как ча і Тте Бге й І ЩЕ ко вів о тТаготТВг Та в Ї з В І Твг ож 51 що й 10 є 15 гоже хід дз яке ів щі меж т "М 7 с с проб ЯК я Е ло Ех с т зх Бе ЕХ Ух Ко 5 се зі Меб ага Тк віч сій АВ рив АіЗ Агу АВ чу жк за чу З У ЗЕ а зи а бій бегодхо Ні дев СТВ дк ви НІ) тео МеУ
Твк ово) нів Ме АїВ бів Звг дв Ні д5о бів Ра сви В Ме з45 є а
Тк - З сфоокк Хі жу ) їні сх еЖі; кл му в; жк жк Лю кзкі ха а ів АБЗ фі вк рго дія бін Туг Меї бів сух їж ФУ ви су АФ; з
УЗ х У ока У 7 х ОК я 250 : з «5 я ага іУк й Уді ага ін оїви м х з НН тут ху ок Зх Ж АК М Х їх ї ех жожки ців чаї ів оНнтя Сух УХ її м щей 5 АВ ОАРГЕ БУХ ги за Е М ях Зо - КЗ З ре
Я о, їТаів ба» бій Узі УВІ хар ода дів туге : її шо г Ек х і ок м: З зе деп мів З
М Аго МНіз Аа УМІ ух жа! дій Бек Бій Хв! с х
КЗ Її ка Оу ї хів ага біУ Мих
А з ще за ит ца фе і; вад хіх щі Аг СОІУ МЕ ів іх баг" біу ма! АТ его Уві Без єї меж Узі бів Агро це 31о 315 2
Ку ря З яти те нету мух я кошти хви хе вх А УЮ (ну ск й жо ДУ ажух КИ док ух із жі бі жів дім ТВ АВ АБИ іт ах зе АК Аз Заг Уві АВ
З щу к є 3 З З 33 ся
ВД Я кі духо у чк ОО чи У ск Ав діа і Іо до б ану рі
Меї бів бі Ар Меї фу Не МеЖ ліз ні хів ніз ага дів УВІ нта
Зі 385 5 с хе Мох ха ше с му то жкджуюю ОД ха КВ угону СИ дк сю ух
Акш ахр ді ав УВІ еф ТВе обро б БУ ів ев біз Мет АВ ОтАг
З 3з65о 105 «Фа ке вх: Кк їм дамо фо сш ри жк - ат яю хх у че її ав біУу діа ака бек оівь бі Меї азвонії сіб їі біу хек жів туя. В з - у о зх гоЯ ту же СК Я щі8 ТвВг Бі руб дгз віз а5в ви тів ам ее Ахроіви га нтя РРО
ВЕ А Кк а зах що Б що сій тТвкК тТВе оБго нів нія ніх сен Аа дів Тег Хіт Уві вве бів дій ща щі жо ж сш я: ме Ааух Кук В сх 2 са се вік Ауг улі й є
ТУг Сі дхп сій Уді 555 тТВг УВІ ів оїів д5ов сту АВ УВІ УВІ мех за аз ях щу Яка Я
КУ 7 1: ск до ке ек бак біз її З їз; їх Є Т5; йо тк їх: й їх ВА гу зи Зп Ага дгЗ се зак о еп ам го о БгОо Бін Агб Бі Бу ді вив «ЗЕ аа ев
І ще ча
Фі З - З с ЕЕ ях з й шахи дв й З з тво їм рію хі ха АС дет ішь біц біб Аза бій хег арго дів таб дія їТе ви бів Ага вів АВ
Фх В ще 558 5 450 мес УВІ ліз ап РО АїВ Рв АГРО Заг о КВи
Я 470 «2105 22 «2115 474 «2125» РАТ 5 «213» Бактерія «прокаріот» «4005» 22 хи чем мух са де и жу фах; сії хе суч ую км Ки мет бій Таб обев о Бев Ті бій Мі5 біу тТвгосеу о уУуді ТР о Меж аБвобів х 5 10 їі
Жек о йк ага Мі іши бі аза Заг Тга УЩЗі ні УВІ біз да бі дк
ЖАГУ МКУ З МЕМ ошіЖ бом ок ТЕМ ох нів УЩІ біт дж Мо іх в Я 20 25 зо ке Ж АХ т т ді с є ета дл «ЗЕ Зх «ку с дк и Фу хх и НИ Можтух їїв Уві Аза Бан обіу уві Ні Аїд бін хеб УВІ ргОо Бгто БРо Аа АВ хх КК Ах
З Ся це дош її А ху КК ее нн КН: іш: ци, у ї вії ше р ке іс УК й:
Ага Уа! її А АТа ага бі бух Уві Уві феб бе бу Бе ї1Т5 АБ що 55 БО аіз нів Твг о Ні УВІ Ап бів (18 ібь іву ага бі ТУ РУБ Законі 5 ТО ме ко іх ага Біп іо Тук аж о тТероіви вве ав Уа УВІ Туб БрРо сі Фів
Ух За т
Б Я М. З х сем іх гомо іх їуче ЕТ: жу З кі 5 кущі жив ії єм; бек фе і дід мес ага Беб бів вв о УЩі дів Уві ав Уа ага бен о Тук Су що 05 що дв з кв 5 ща Ж дкую жи яки кв СТВ Чет дк и х М ак ше дій нів УдДі вага аг одіж жів Та тТНг осів а жі Аа вів АВ де дух ве 12 їх саке й ху С З мою ру З зо шт я м я їх Кк і що кт З хх З рух. г щ
ВК овів бів Туг ВР ФіЖ АВ дів жін дів ді ме АВ ЖВЬ БУК бу ак я де щО 135 М ех їх я де хх Хожх ги ке ло я х хм пи сх Км с пог ча ке
Зіц УВІ щіУу Уві аго УВІ Ві Туг Аїа Ага меб пе Ре ар Ага мех 155 30 МУ 13650 дев бі дпа бів біп бі Тек УВІ ар дів гей ух АТя йгРО ак реа ; КК з 7 жи 7 ох хх . . 155 178 5
Ух а не у сьїї зику Жтжу у СК ах дату Ж за с: іх о дія с ки гоже пу «іп оз! бін вен осСу5 бат їі меє бі: бів Тег о аїв У ІЗ уз АБЮ що 155 м шодо еф ух жо фо дьсї же ху су сита в сю скан в вхо іо дових
Ака ів твг о АіЗ бе) хек йазв обів Тук НІ бі тк о аіз біу біт Ака
В ОВ а сів Бек УВІ ТРО ого Аа го АТЗ ТНК ТВРотТнг АїВ УБІР ТКК У 1 в о Ах 2 іх а ее Ки ДІ духи Су ему охо ек їз а дії ки їх «ач а хг ке Са сіж Ве Аг Тго дід бів аїа Рне віз Аго АБО Ага АВ УР меж тро ку х - 7 у р з 53 т к ща й З ж ж ж шо кое і кмЕ Мк ВддУЮ Х З ж Ж; ще ді іє аку док ік ЗжЖ Жит тК їВвгобен ні МЕ Мій бів ЗК АБроніВ ар оБім АР Сен ніх їгвоМмес . В 5 -85 где жк Зм КУ; ке іхо как шт хх духи ім ки их: ік кока зд: щегобко від Бі ТУБ МОХ БіЦ Су ТУук бі се ів Абе о Ага Се суще 7 т служу
Ой ех я у а а ео з шУкахи до сум с ; ше о ч кдх Махує за Жов ї о 2Уугі хх зіп Уді дій нії Сух уві Тут РИ АхВ о ВгИ Буз ар ОУДІ Да беу ян та -8О 55
ІМ у ж ках союзу ки ЕЕ ї-ж Ж я пз ре де сих пожеж ОВ яю туту
НІ5 дга НіЗ дав Уві 15 УВІ ів хе оБів УВІ ді Зак ав Аїд Ту о Ка о ї да 5155 бач ух хі хх чи «уч хек сх ха ко Фо ШТ му дае іви «іу заг офі Уві ліз вро ма во біз Мет Узі Фі; дгО біУ Мех
ХЕ 7 7 тк ї г ЗЕ " - зе
УЗ з 35 ЗМ
З сгх с у ке ую тет Мох кг хо хх о ке жу ож дод Я жу АД ок віз Уві ЗіУу її віу ТВг Ах аха біу аа Хег Аба до бек Узі Ах зів та та них туту х Я гі сві д гії ді а УДІ НІВ
Зк етрих ЕЕ ТІВ НІ А Молю а іж5 ВВЕ мех дів ніх їв зі . ів Бі дов Ме зуУу5 Ба Ме зах зв Мет аів Те мес бів ФУ ща Ме 35 ув Хі сей бів Меж АВ т
МАХ за і ще ТІВ ве М я, З бе те вто В ув ТІВ З5 зв су із дк щ кВ уко пек хоБег ще
Ага Ар АЇй АБроУ ЯК довж лк нів біз Хі б1іу Бег 3 шо хх зак бе) біу Мет ахи нів ком
Зі ід ага дек її. МО БО з мі Вега х н пі КІВ оОАгИ У с вк НІ г тів АкВ і А: х ик їв ав ав АКО МІВ З нини В й рим ізо ів ін БВ АБ ву 7 я
З х агОо ді Аа іа ІБ із Зах хі А бів ТВг обі був аго ів і ючи Уві вне бів віз віш ТЯ З й зи дід від їйк зів УВі В їх
Хо х 13: х Ї Оу " Ко
Зх Й , го нів нія Міх іву дій я я мах ія те тк овга НІ ІЗ 1 іо дкап Уві Узі Мет
БІВ г я й і ін; їівр й«т МЕ ЖуУ ксух
ОМ 5 ТВг УВІ бен бів А Кк й ЗА тн і в БОТИ хо ора хх хі юка тет Є З У В 1 вн УдіІ в Ї в, щ шо, ага 5 ї з їжи щі В ва В ши 420 зак рве мем Рго Рг бів АгО ОТа ма АК ів ве Ве яку 5 т м щї з ДЕЙ піз а В ї що мх о ід тів ревно ів а Ат Я м м а я ві ТР оАТА ІВ ом; і коня п Баг яка дія ТР дів за сен віч бін із Бій 5 я "
Ма ан кі 355 що 7 аа а Тга аг: Заг ої в я, М: ого вів о Тго Аг ме Уві АТ Ази го я ве - кю «2105» 23 «2115 474 «212» РНТ ія «прокаріот» . в «213» Бактерія «пр узі тТвк мет дер бів . о ку ща д Та пе м? «4005» 23 Зего Те бів Ні бу ТНК ву Уз Сей чех іп те дво хегб Тв о Хо чаї він ар бу Аг
ВЕК БІ ОТ їх чаї ніх Ущі Бій 5 ЗИ
К З її» ар вк їтв уві Ні мі 3
Х сохи я ви щі БІК На хг Ух З ех тут агу ага УЗ цен 7 25 чаї вго вго Бго 5ів ав х яко і ЗЕ . З еу жшую к КО я
Я й З З У З щі з й 1 З вій ак Уді 45 ох кл ви У Ух М я й жа аж
Її УВІ Аїд зе ТУ Ух аа Ї РТізв ово бі ВВ їїв дкй манну 35 - Бак зії За М КО шу
З є "і уз Уві а 7 гу : са жк Кк З АГЦ зі ув То Зк же Жаи зіте ака уні Хі Ахв вів 7 кк зка бі іу Вр ЩО щі шо сів жів ев їв й пат у в ЩО
Се і Уаі дай сів ів Кер зе : с» я «іа Ні твгоОнів У ту пе і Жук ВкзУ фі У Б
АК ТЕМ о ко 2 в 5 вав Уді Б Ж ТМ
ТУук АБО От БО РНЕ АВ їй ; ї б заго сів ів 1 Ю АБО ІКЕ тні ! Аа УЗІ Ага іви Тук Суб
ЖЕ ах Ух ях й м в ж Її щік т; де з У Уві Ав УЗ АЇа Уа Аг ви . З пе НЕ де Уді Б тА Уді зо - у ще Мат два вго Ах із зх не зап вій Ах їж Аіа Ме АК ИН с кое цій А вій АХ
Сх кі. чу ех . «вчи тів жа щі А т зо Щі ів Те отТаг тів Ак 1235 . х ще я їй ща ЕХ жд ск с Я раю фр із Бію жів Уві Аг ЗВ ів від веж віз уві Тук сі
ЯКЕ КІМ мя в. ТК ши ій мапі МеЖ ЛІВ І ще УК вВго ві ах гів сін дів ді; я що ек і тів ТУГ БгО 5 Я ех пух іс кі й оче меж ще АВ ЇВ р. як . ЗК ху вва оо що
ЗЕ міх оо 313 ага мек епе у ей
У з тУаі Уві тТУуг вів 8 з Я ке ке я та ру щі га У т я жи ч чі как Вга сів Уві сту Уві АгО 158 і хі їв їх АїЗ дга те і чав яр и ро ЖЕД дар оаія а У ТТ5 о. З ів іа біу Туг УВІ Ар ЗА с та ее кажи ха БіУ Ага Лів п У МЕ "ід Узі аїз іжях дв
А «З Ж З за А Ко т " а У ух й
С 155 За Ме сін бів їве ді; чай
ЗіБ ін Су ВРУ Ті ож вія УМ. ке ій УВІ С: ев осук і ж ті ТВгоаів бів Сі АБО
С ї50 ій ту Ні ТУ ТВ шк
КАК» вк ча Бій ТукнНІія - ЕЕ
З ж А з'івн ат АБЕ І Туз На щі Є
Ага Хе ТВРоАЇВ вв 206 ве діа УЗ ТВ оуаї
АГ КК х ха ве отТвк ЖвеК та УЗ НЕ
Б зга ів ве АТа ТВготнк ТВ зв чаї їтв ВБго діа г У. Ко УЖ дауяю тів «ав ча те ВОК Е " віх ха Є ке в «ів Уві мах в
КО до кру МГ ОКО АГ КІ Х КЗ 21 - Зв аа сна аа ді ЩОКУ М - КМ кока ів ів ій іа вва ді: Поу . сек кт Мах дга Те АТа чіт Ав ТТ дви їжі НІ Тгр Ме:
ВІ аг В і а З ні ав бів АР бем Ні: Ех
ЖЕ з ін ет АЖ Н5 Ах Бу 7 й
КЗ ; чаї ака Бін хет ах М кг Зі; кт ра тТкгоїши нія ат й : й щих а . зв Ак БІВ ага ге
КОМ ! зак Тут Січ рвиівц левом 7
КІ хх УК «ів їУв Тут Ру п КУ р. ТВ їв вів тТев'мМаж 51 аж чохлом МЕ дае Р АВ бі я Ту! жах ів ар УДІ дк ви їж
Ми я вне дав Ага БУХ ДВ А х 1 Аїд ніх бує уді ТУук вна яю ев ідо остов ліп Уві Аів ні Сух Уді ту зво ів УВІ Ві Зак дав аіз туї
МЕ зе ча аа дою пові УВІ ще
Мі5 деп уз! уз ухі АіВ дег дів у: що я ва ні«к ака ніх а5ип Уді Ух зах бик іш ака пі меж ніж аг | СЯ шя вих бій мес щі І АКУ б жв
Ка х ка ді йовичУ щі ВР М ї є ЦО ЯЖ я ів У аг ТУ УДК Я до А п Ази Жег УВІ 458 зу Бі ща зій Зі дп аг дей де ОЗ х в
Зк 1У Тк дЕв ден Ру йят 5 Я дів Уа! б1уУ Хе ТУ ТР АБроАви В; 336 : і Аїв ма! нів із УВІ Б ЖЖ Ук - Пе ж нії Аг: від ма
А У: - вк ж щене ІЗ НІВ ІБ НІВ ще : і ДІВ Ще і у ВН Меж ді ке ж в А МК у меж їі «У де зЕе так СИМ зи ЗМ дк Я, зи АСУ Ге в. ТвгоБгОо Бій бу їів о їбеч бій мех аїв ТВ; іа йхи від Ар жа во Те ого бів Ск. зкК
Де с М ж дід Ах В хо ши Зк ж « во ку 7 З55 йо " ав ніх бів ЗіБ піу щвг їв
НВ зі Мет Ач нік БІ КОЛАХ . щі» аіз дго Заг ів у МеЄОАО НТ ах
ТІВ АБО ВІ АТЗ АГО ОБ як З ік в
І Ж п З Ки соку Кк ; зи; дев о іви дг З Ь З 5 В а па вх, за га від джв ай її у м АВ ОО 7 а сів Тнг обі був М п ТАК за5 НЕ
З тії КУ м за ВО й ЕЕ ох ім ах
За і ніх іви аіЗ від тТВгоїіє Узі БВ дій дів кое , Й о чн 153 У ВИ ОАКАІВ я З її ха ЗЕ зів тег о тТвК овге ні Мі нія ви дів ій ЯЗ
ЖЕ і і. 7 я кЕ хх я г
МЕ: Ех хг КАХ - о СЕ і Мах
У - як дах ціУу вва Уві уд ж і одн лер.ївг жа! ву Ті Ар осіу АЗИ як 7
ТУР біу вай біз Ууді АвроОТВІ аз Бе з я ОМ А я ях дачу туї зи ів впаЕ я его Бе іо вго Рг бів аг Фів без АТа Бе : . чі г ін шаг ЗВ ви Вр 5 "У ан сів ака Аг ага емо якові ЗВ 445 .
БО схухех Ж х Ех З х " монах я З - дк 435 ів хег аг їв ТВг Аїда їв рефобій АГЯ лтВ АЖА зі щі: біз дів бій бек й чаіД НН олія З я зіеа вів (ін дів ! я ат зл М ух Ко шр ем - ха туту дуг бак ої щу сви із всю дев» від тора Баг оку
Мет Уві Аа ав КгО вв ігрояга ав СЕне «210» 24 «2115 474 «2125» РАТ І : » «213» Бактерія «прокаріот «00» 24 Хів бів ні Бі ТВгозіев Уа ТВг ех зер ги зако у Так ово баб Ті бі ні Бі пЕОЕ ча мок 1 Тве бо Зеє Зі СВ іб Я ни
І ее зе ті ек жк З дев і З ви кт» дв заг Тер ув! нів уві бів АЖ Ту АгО
МАЙ с гу их х 85 г СК г зе М Мо хх т
Тжг АГРО Ага УЗ: ВО дію АВ 55 уд
Й щі ; «а 3 сек очаф вка рРИ вга3 дій Аза « Раш зі Ві нт дів ів щек Уві Ба | га їі Уді Аза БВ бі Уді НВ ВЕК 45
КУ ІМ ю й Я т. вка та ке і Зо лу і жа) бен вро бі ВМе Те дей
Уві тів ах дів Ага щі Ж Ж В УК ув х «га МБ ЖІ я ЗМО ще я що . м ше жа І й я обі ші г ха Мі зх ; 15 ма? дк іп Ті сец івгв о ак3 біу бі Бра ке «ВЗ дів міз таб оніях Уді в д ОМ АВ Б Ну реле Х не А тек мк сії їй
Бо : Ва гм тт рец ее ап Уа УВІ Тут Вга Бу зт й : піз Ви її? ав її ОК НЕ АБИ Х ЩІ пі ага бів БО Тут дБ БОМБ Оу а
МІК ЛЯ ТИ пк г пе оди фари яв чок о ки яки чаї АВ УВІ АТа УВІ АГРО ви ТУР Сув
Му віз Мас Аго РгО біо ар Уа їо5 ЩІ МО
Х - ях Ах т я хх МУЗ 109 у ів тик тТнРоїїв ай 5ів ахй Аїа Ав щ Уч «15 ма ака баг жа У РОТ ол лох я мій а аіа Уаї кто век Є їзо Б, с о з Зі аа тів біб дів Аіз мет вів таї Ту? З З зак аїа іа ТУР вго бім в зай м ху іа ши За; вки аг Мат ю - УВІ жі тує йїж до Мек вра вне АВ Аг ЗЕ ів Уа Бі Ууді А: о та є І 155 м я У й кя . ще я щі з ххс їх кх «г га ко. «З Хі бів біУ Тук УБТ ар АТа ее бух АТА Аго м г іч я хг. не З х кое їх Х в: В з 170 АН
І І ва . ші; кни ках ія Уа дав « те вок тів мет бів «іш тТвгоАїа ма! АЇв бух АБ
Зв Уві бін фен Сух бак оті Мах я чай щі УВІ Бін бен о сСУух їв5 щю. хо чух «я д . жа ші жі деки їі ст ти в ніх біу Те аїа У У Ага ага жі тагоаїа бе баг Ар З ЗО п Зх кщО . ; ч. щі те уд 1 ка шим Кк а ТВг о твк отТнг оАїа УВІ ТВгР УА бів
Т16 его Уа? тТгр ого Аїд Реб дія Я
Я о УЮ їх ОТОЖ хе - са мошок гів тн аїа оне АТя ар вер оАги Аа Бі мет Тер вия ст іх гію іх пи вій Хі о А м з аї іу Мек Аго те Аїа бій Аїва РНБ АТХ Ага з15 440 кВ - КІ я Не Я ж ох Маре зх Ж за зако дк м з ака Її Ї з ніх 5 і я Мат в нів мес ліз бів Зег йвв нік авробів АР тів із ЗУ
ТР івн Ні Мат В вові Ме ї Зк жа г: ех зу Ох дк «У Жв оду Її щі й не се те іб іш вно ахв зі аг СаО . кою З Н ту к мех її оС ї У ЕЕ у У МА і тв
Зак овго Аїа бів Туг мех бів с зи: аа с і аг жи де ки пір її -- ЧНИХ кю кох и хі УВІ АТ З ім ви х - кує ча Ж ож г вна ав кл моз аж де х
Бі" УВІ аі8 Ні Сух мВ ту ЗБК Ми Ах
У Ух ака і КО г Ж фак дев вів стек 4 З я про хи а а дат Сів тд УЗ і Зак ай а І аоту: нії ага Ні Ай маі рух маї Аа зе ох 500 пт ВУ м «З У с | Мо с дк їх мМаж га . З аїа вка Ууді вга сті мет Уа Єв АТ оту мех я сома ях і :маії від бр щі та БО. Є за і8и б їх ща Ж щі Ба й З 315 а ж рф чт шоком хм м зк Уві дз 305 . з ме 353 да сіє дав зег дк Ах Бозвг ота АБ хх т щі зів щі ТвЕ вав дев 5 ЖОЯКТЕ Я
І О УВІ БІ ЖІБ оту тп ОВ ща их їй ріж мет Ааїа ніх їїє нів Аг аїа Уві Віз - ; дог ек з Вип Ме пі НЕ тів НІХ, оту мет кіз б1у А5р Ме муз Ре мех Зах о ;
МЕ -х 48 З оч що вві: А ах я з тТНЕ
ТЕМ . тат о Вга Бі і Тіз ів йів Мат й15 тв чо Аїв ав УВі Бе Таб ово біш гу ТІВ їх «ТЦ АВ о Аід Ам УДІ БЦ хз
ЕЕ хи 16
Зх Зі дак у
Ів ТБ ОА з іх їн ї і5 го ще в ніх не: я ніх аа
Зк АВ ЗО зн Ага | Б
У ху КО Бей я СК ех ці Ма 5 Є зів дія щі ові т я 5; Мац п с в ве я й Що - БУХ хх ж т ех к г ЕК хх
Зх а АГ Се З їі їв 35 тів УВІ | зі5 з
ПУ АВ АРе хи цей унт хїе ї Уві мех мо Ту й 518 АБ | із аїв те пої УВ їв я ув аго ЕЙ сви Аз 43 лев БУ А 40 хта гне
З бі ух З БО я ща - зе Аїд «віах 5 зу ніх. М ше Ті де ня ЗХ м ч таРє : щі 5 НІХ х З чиї ! й доку щі Моке зп
СІ че ї ТЯ . за: ем з, х зи Ко зх во х вх ТжТвгЕ вто ща твг Уа З ча 1: де М 445 меч ДІВ дз их х тв ще к ТВ: Я з і ее
Її гу й тк КО й з й ЖІ т вет Бе її й ді - у Ів . з Ко, св КВУ а Км.
ЕЕ Зі У а івівц і хай о вне сей іа їїв ск зе ТУ деп УНІ аг Ре свв тве Аза її чо
Туг ет, хг ву з Ма тнК
У А го ля Ки А З їв кої КЕ, же і З 5 Як крої а
ІМ а «ЇВ щі ти га хв - кі ІМ 5 ти Аг в Біц й «дз В хі СІВ ща За дів й
Й 2 В З ді х 2: .
Мет У в обів чик г Зав 5 й ї З ат А хі 2105 25 я так ве ДИ з « 474 З У і м ч В Її 5 «9115» от? . св гів . 5 ЕК ЩІ Х
РТ окар іа щу Ж Р Ав 125 «пр Ма їх лох чаї в Ка «ев 2 ІЯ ж Р ОБ ІН ік ма З НН с А т 22155 Бактер іа шіпснія Уа ніх Уа га АВ Аз 5213 ще жів тТга У ЯКОБ - 00» 25 во щеї Щек тер Ковко ве ів дп «-4 й Твен в їУу дев хе 35 хе У | У зва тів, осів зем кі З яко яз МОЗ сту ква хо
МК чаї і - я ді рга б 2 Ні з гаях їЕ АВ . ЕОМ т вк ще ї мух ага х З ча ї ніх за - Ув і ви КЕ А Бк З й каш ММ Ка ім а І маї ша МТУ іш ве Ка
ТУР АКО меи б1Ж м цух УАї і пі Бі Я ів
УЗ З. «К. УЧИ мух ко ахрх іх Я хі що З й З ах ха у ву г ю кт і Є ях а ре З Ва ді У Кк ЕН р З ж ОБ тр що
МІЖ х 5 зп дів я Те ву КУ. чаї ту Я і х Тї6Б 85в, чів її1е з ув Тек
Уві Тв. БО сп В а ка т, га жа под пе А: БАК ки ек
І 5 КЕ щЯ МД а іБи кпх І З. Зі а: їх їй я дБ
ЗО твЕ Ні ка їга г ЖК - пі У: хх є ді З
Мах ТВ со т іх В стро ох зіва ні Тут А і міх ув Зі а ту ж в па туї Удід ти ей жи зе ЖК в к що пов Не ак . кв УдІ Я й 5 св ї З в'йФЕ 15 5 о : ТУ" 5 Я
Б З ві В ІВ АХ яв о Стве кт чи 7 пі ж В Б я ве З 5 спр че ВІ зе дід вва я МТ АГ ім Хі кі «ід ще КК Ме ях аа мех за ча Баг у ОО ів дів ща не АБО Аг ї1БО ув ан Ущ Ага зе тів сів й вне НЕ " ра зів Аїа У З1у да З хга мех їз аго Баг іа 515 ЗЕ ТО 15 135 зів Ага 155 х ВІВ Ага Кл шк п НК. ек х с о ХА го Я й Ех кі АХ е йх З о г ТІВ туї ТВі Ту їз ев жа хід Уж А зве дів її кг Уві ж З дв ії 7 паї дій 7 м г, за лі Аг тв чаї дхв ії ів уд В У АГВ і Зх т У З з сук ах У ї г чі І Й ие І хх а
У пРу УВ а У Тег У я ОТАК . іш «і У сіно! БВ М дія (у т ж іш бо г дія Є,» ше
Зак я їв я ве тів мах чих Зі ТНЕ Зах УВІ и іа с в г У і1655 ве о тІВ З 185 ніх ціх і З тику 5 - ги Змі и хг їж фах це і Фі пу шо іеу СУ з бій Ту? і аа Уа ак отр
З яв ві ЖЕ ЖАХ фе те тру зі ва зав
Її ж Їх хх ве ЕЕ «іх НУ у ща БЕ. вах ру щі 1 БО з Баг д ЩО Ук во М ЕМ г З З Уві 3 ги ЇХ 7 т х ї 5 що Зоя ї ху гу Сич щі ве дія ів га АТа з зви ага а зі МЕЖ ївпг д й ЗЕ еК "З в й За є У ті і п - х і В Р ща що. Ще СЕ: Ме А Я 5 зе дог ХХ зак Вреа ех тре х дій д 5 ро 5 що тр Та ха й о
Аг Я Ма ТвБОоВго с РЕ АТА з АБО ЖКІ ага маш заг Оу ФІ КАТЯ І АвО Я. Зі ак їв аг ді в з'нік хв Ко За ; її зід ТР Ві; за й яко НІВ за з ви АВ ЗВ їв ко ДЕ ум виг ах ка ву а кох іем і щЩЕї 5 х ів бів 5 бСер офі Як зі Аг ке туз нів мех за 5 Б ОБів сСув ЗБЕ ГУ АКО 255 Дід ту в Сем ні я Кові ро Аг кує вам АБ А; і У ярок ух Ме 5 д т А ща. їх тако т: їм мае й М ЗШ я її в З й ва ВХ СК ог ВХ З ща
Та і з Рота: ов: . ях МЕ БУ Ме м гово вів ВО Уві ту! зва я сіпп уд БІСТНЩІ С АКО І) го аг ге й бух Уг дей Зк Ооді ТЕ Зі Аге ех хі ТЕО СУх її хв щі В Аа 1 дів нів ма Аа їв мех ма пвкОомаї іп Уві 15 ЕВ У ле з Бі ще р Ще З піп оз 25 з Уві Гуз ке У Р вга в 5 хи Ар зх ні
З ні 5 АЙ з З его МВ п ОО А із Уві і ке Ше З х 15 ух дО ЗЕ г дід
І і КУ тах Кк т «сої КУ и їх де й ще: їх хо ніх ЗВ ву ма МО «в деп с о. 18 нія Агу 50 18 ТВ
Жох ка х пит М у і усу ЖК
ЗЕ ощімУ За Її тТВК де 7 із ні ї ЗВ Ме. й ач ту бів ау Ті мех ліз ви ов « їв
Зх зіж ЩІ 335 вве мет за5 з ів їв Зх їшж чат у 5 чув ії у ех З іж Ва Ко х БУВ т ЗУ з У
Х 1 я Ух т МЕТ І. я: зга її ЇВ я Ку З г Її РК т я ТУ ев ? і В У ро У ів «ТУ Ар оте Рг 5 нів 5 в її ФУ дев чаК ке тТнт вго мес дер ні
МЕ хм Як К сх Зк МК п З дк с фіви й КУ і АБр Аа з еко а
В го КУ З 5 Бе що з дга «З ж Ме І за Оу й тів ах М яко ле ях зе ще 370 КЗ ЗО зії ТВг обі уз ак АЇз дев бец тів ів бево ар рев Аг оОНнія кго 55 ЗО ща Я
У -ко бук як шх 1 де ій їм а Я яю ехо Ем з Збухх с в пох щЩів ТВ отвеовго Ні Ні ніх ішжу аів дій ТР Осі Уві Ве бій АВ а Вр яви «і 410 І Її сх я че ке 25 7 є тесву хх их хуя СЖ ж Ходх їх Жах я Ук ду їжт БіУ дк Бів Узі АБО ТВг о УВІ бео дів Аво бі ап УВІ Уві Мах зо иа а ч с зує ж її фах жі ко М оку м М само тк хх о йодкех же скії КОЖ ху туз бін дай аку Ага ву деговйе ви го Рте бі: або бів ву ків вне шк я ШО ча . іо бі: із аз бі» хг оаго ві тТвк о Аїя жів ву Фів Ак ві ал
Я 45О ме» Уа! іа дха Рго Аа ТБ АгО ак реву 470 «2105» 26 «2115 481 «2125» РАТ 5 «213» Бактерія «прокаріот» «4005» 26
Мет тн отв о тТнгРосен о Туг ТвР обі вве нів бій ем оз Те сту Ар ї 5 о її чаї Аїд бік ТВгоУВІ Ме Ах БіУ УВІ Ар ОСТ Беца У: АгО АВ ОСІ1У і 23 3 чін їі тів бію зу бі вгб дах реу го ага таб ген ав во хів
З чо ЗУ
Ж ож ех оо жу ких Ен: ху Ж ктуз пк в су чи пі Ууді Бі Бій ЗБ бій шіУ Узі Бі Узі ді Ай Су АБО бі Це ка 55 5 те аїв тек Рго бФіу бео тів абБап твгонів міх ні вве внеобів да йо | 7 Та Б рн Уві Ага ап Бен дів вгО їв Ар о їге ТВ обі їв аброуаі ве й В. зе «ж - г з же ї ж чи су хх. і ут хх у а Ка й й хе. х і 4 ЧК: Оу КО їх УЖ
Мі ТК оцез Ако ух Щі тТук Рго маї Бе Ав веб Уві а5в Бі Ар о ще що шт СИ о рак Ка шо дока Ж хохоу зе аву жан АС хуя: газі З яке мі
Ка 18 ТУР Ні Зає ТР УЗ! УЗ его мес АВ піц ів Ті фу Ні шіу сСжх їйгє ТВгоАїв вйе аво Ні Сів Туг аби Ту 5вг Ага АК дію - ай Ух - зх М - юю М ОВ ну с А бе осі з я зх нт жк їз Фуко ж ж КЕ уз щи ве г щі вВРО вне ор УВІ Ав Ага біз БНе ав дів ів Ав би гео Ех о 159 ї535 їБ5 к сх хх й м етркж оку шт хх ж ви чі 2: же пре км я ви Ага вве нії аіа сіу заго біу ух Щі ТБР бе ррРБ ОМех дій у г ї85 Бо 175 щік хак ТвЕ тів вро Аз оаїв меж ага бід ав оте аеро отвг ве бен і 159 Ще І
КУ Ж шко кжяжую КТ Усгу М пу хи Ук ню жк УК зах мох Ку Мате БУ їі: вів Ах Су БМ Аг Бей УВі заг одкО Ба ніх або бго ага га Ба кує я гі их, - тк 7 ка щю ОВ іа ме: бів ага УЗ! УЗ! Узі 815 Бго бег бее Бгто Уді їів а1я Туг де мм З 2 Іа й .
Бго бін ТВг оба узі щі чего Аїа ага вен віз аго Ні іо віу ув! пе І вх У й в; , , ке що що 5. І уко сб ях З ук во шю кхлрух вих луг ух у у мучк АТР аку» - й загоіву нія тТВг нів свв БіУу Біб бБіу бів Тйг Бго АТа Мет Уа! АВ «35 280 вав : хх ке т: ди Как фо жутї воунує фам ча хи хи ді сту мах сла
АР Бйе піУу біб Аг Бе БИ АБ То СУБ біб ве АгО бі» вве Уві 7 ЗО зх я сх У щи ЖЖ ох : . ЖЕ
Чі Бге ар Уві ТеБорев аів Ні бі їкробів вне тТвгоаїа АТ АВ 275 «БО еВ - ще - що я «А хо жо Й я Кі ж пт дик чи тож ст ту В її ліз ага се) дій Аїа о тТвк обі Тве обі УДі АїВ НІ Сех вго АВ 29 295 в хущихує ди сік дві и Ж Кк рух сх шу м мухи СВ м Ку че
ВК УщІ Ве бен Уві бі Ді бів ма тТвгБ оди їі его аа МеЖ лі
Ех ех мх - х тру 5 що з ї2а дО я Кк а зе д г ке мих шко ту хи точ З жожук о ЖУК меш хіх пт ушжк Довхах
Аїа вів сіу Уві Ако УВІ Шіу вве Сіу Уві або боту Ні Яїя 5вг о АВИ і 325 330 355 ази Заг его деп ви мів сів Сб Ті агави ав ТУР в о беи обій
І зай о сза5 з
ЗО З АК
СУБ ши ву5 дія Бек бів Ага бів нія го УВІ Бго дів БРО ТуУуг АБЮ 55 ї5О 35 «кі 5 о ху Км ву Ах хека ах їх А й чих зму Мам йони Журчку вве ізи Аг Меї дії ТВгРобіп ЗіУ біх віз а) Суб Бер АХ" АКОУ вго ср З То
Зав оіжо сі діа зву мів Узі піу вка аа вів дов вве вве дій жа заг дах зак зах зах 353 З ОО пк ; суд і ою жа ки: яЗа хх мік ат вия дня см ащо іву аа дга Ті бів тує їі біб Аїз да нія АБО вро ав ща ща що 15 чн ї 5 не уч дош ШИ фо мч ие ха кі. хо чи ук ім о Бго ліз бух УВІ Зім ВПО бегосту Рго УВР Ар мех ТВеоУя ів
З У ЗА жо , 8 2 ж 000 з лап пі іме Ущі Уа! тТгОо га аа йіУу біб ва БгбБосіу іо ав вів 7 яз ! 7 хава зах 43 ОО І аз о
Мет Біб зви віз Ага ліз аба азробіу Щі вве Аго ага ожаф КТ тує я | 455 ЯН.
Зі АВ веб бен Уві ліз дів ей Ак Ага о бту ТВЕ ді УТ ТВ го дм їх 7 луг до КУ ке Бе 375 КО
КУ
«2105» 27 «2115 403 «2125» РАТ «213» Бактерія «прокаріот» «4005» 27 ; 5 х у Уж в х зх де хіх рута її сх: Шум утіх мех баг огух дво вп АхвВ ен їі Ті А го АВ ВІВ їЖг ів зеговім і З а їх м З Ам 7 коту чут ке ві ву шо р ж ЖК я тек іт Ав зак Уві Тує вар ів біу їі У! бі йхв ака тів їв су т Ше Й ср я 7 х ра жк 2 а 50 - о кре - ках о вх еф сао каш і; Стук у ке їі Бі Аїз вуз ЯХТ бій Ту ТР УЖ ву АВ Бін бів Ар АТ бух 35 40 45
ТУ ак сей Уа бек вро бБРУу Бйе УВІ Ар о аїа Ні ТВгОНія МЕЖ дер а У ЕН іеж Щек оРНе ТВе охегб тв обі Біб аб бен о бго вух Бае ТК; без ге
Кк «у ЕЕ в ї
ХХ ї М З зе во Ту Твг ага АхО АВ АЇВ іє біб АВробіУ бе) мя Туз Тег Ух
З З 5 зап дів те мі біб біз Ті вуз др Ні Уді тів Бу ні іа нів
ЗЕгні ї г ж цю що 30
Ме бів ті ів мів ШТу ТР он тек ТК одка тер ніх Уві дв оУВі ча 7 Ол, З ща Б БЕ, зв очаг Уві йід уз ТВгб обу Вів Уа! сід йаів Узі ев бім ді Гує
У осех я ке чай ща о КН хіх і р одаї хо дже гл їв дев її вів ді узі дів вне вів бій піч жін БМ Бу Ах Бен сте АБ Сів бій УДІ УЗі вів кпе сві віп зак іх 155 ТБ «ККУ кае НКУ КМ м у в сміх 459 Ж хек хо де зд я Кі ккох щдеї Ж дачі 23 Жак фев оФіу Бе Ре Уві Ахв без бів бек бів бег бее Ще АгО сув ка 165 НЯ 175 іо ах Меє бі Сух а5восев Уві сіу бБіу баї А БгРОо дів тТВгодгу
ВО | їх | м
Бін ази азай Узі Бін бі ЗБ оби зр Бен о Сух Бе рух Кей дів ух і ча: і Но | ОЗ зок хе СК ху кі оче ВЕ рі арфи жк ох ве Еко ге зів Тег а Уві ав їі дев о тТуг Ні їі ні ав ої біу ТВг ові - яю ху хутх що ій . . я й . ві УВІ Туг Зак Кі дв ар Би віз бій руб ТВ Кв СТИ Ав вік я 7 тут я ЗК ха ве . 3 З СО си х с важ юр а сх їй АТ» сет ах джин еф Коб кое до
Тек У Бім ага Узі тТВе ТВ «ет Ні: Аа Тк Суб рве ат АВ АВ 7 І й Ра з 255 «КЗ 3 шо А вго ек БІВ Тер обез аАхр Зіч Аїа сіє вБго рен їук бу Або озек бу а я ж ЩО
МЕТ Су на Узі ТВК сСух ре заго обек ТВК овго Вега тТвВгомМеж га У маш лих Бо худих зр, «кої «ох « - м КО тику а хмрї - жк гум « Ж сю Жим її5 бух ем бер Фіз Аіа обі бів дхвозвгн о біу Суз АїВ бак дк деп
За а За їі Аг Ар оРВе Ті УВІ РКО вне сі дев щу хв мат Уві БІВ Фу
За . що 5 | о я ї ям ер Гай че ее жає. ії мії з туф фо шо жк хау кож із ев їі біб твгб оБів аг ів бі рец бух ТВК да" вго Ааровец
МЕ хх ж Бе зе За Кк соіу ви тів Тго обу Ме Хі тТВгРобек бів ЗРУу АТа агф ма еВ оту ад Й ОН я ще
Та чи фу або ТуУуК бі Жів біз Уві біу бух бух аз Аяр їв УВІ! ї35 ї65О й . ОН .
Уа їво АеМ дек ім Бе о бгз бій Тр оАїа кі Кі хр Бі Аа бух
З щЕ Б
ЗЕ МЕ яе й га їву ув Узі Хів бух аво бі Аго їі і Узі Ух ав бі уд їв М 5 щюЮ са ма аа їБВ УЗ! МІВ
«2105» 28 «2115 363 «2125» РАТ 213» Бактерія «прокаріот» «400» 28 сао с ж Фк У фу з з ж су дурно сх ва ех фкмех 87 й меж їуб нія Ті АБ Уві Бне АБО сів го Суб ні щеб го У Аз я ї ї 7 В їх
БА сера би жк іі жа ль Ох ці аа узі вла рго дід
Тьв охег біу ізо біз Ахр зву їі бі Таб обіу ака о Уді ка око АТ о ах СЕ яз жо - я. сто ав її Уаї АТа Уа! Мек сіу ву тн бів біб Аза бік кує Уві кл ! Зх З 45 п кет н г хай З дек о ка я аорта тк узі ех
Ав оїУК ТВг ого біб тТуК дій твговів мек беи йіз АТа Сух ев су 5 іо ЩО зу ; мет хх ї2ує с їх зії ж, жк 253 8 є со йучя ма АТ ще сх ка нів іви бій сем его вБго нів бій УЗІ бів бух АГРО жі АТ пе 55 ЕЕ 75 | ВО
У Меї бег біу Фіу тв обів бБіу уві сей Зак оБго Мі5 ніх Те Уві
Тов зе ах
У КІ І Б
Бе аїа Ага аг Бгто ів їі аА5роаїв із аг вго лій і бух заго 105 135 МО . ско яки «Я м фімозу о жк ух сія 8 їжі Муоху УЗ за т: ше
Мем ївг Кен біу Хі АТЗ Ре таб о АгО АБр Овна кец го бін 5 ім їв 115 5-0 125 сіу ага ніх вів бій тів таб біб тб оАТа СіУ дата У БУуБ АРО вів мо не . МЕ ше с соче чи Є Кум ТК у М зу кож ки «кг ах Ж хх цих ЕТ ке мех Ага ав; яв ФіУ ів АТа хег їїв ар ази зви нія ВВЕ озаї сій
ЕС НН ї5о їз; що п їзіжо фо ий рімі ім КМ їхРиа лю руд х їв аід «ет дів два кат
Уві Був Сук Гб Бей іш тТаг ого вія БУХ ІБ АР ЗВГ а АГрое
Ух 175 ТЯ вс овБіу суб дія Бгто УВР ТИР ОТНе АБротве Туб біч Бек мес чу Тут це 155 . М, ев Ага ціу дії 5ег Аїа Сем сіу Х16 АЇВ без АТа ТР Обі бій Уві 5 в вч
Бк бак баг Меб ів У Кер Зі баг оУЗі бер 5 АБИ тра Баг о кец за зх з
Я ху Й . - ж Си ше .
Зак бег б5ег сеи Аїз Заг одіз бЗвг АТЗ оіУ тів бів б обі ніх дай 225 230 ЗБ . 240
Ууді Узі Хе аа їі біб мет хаб бів бій із ТК деб бів Сем ча
КО 5 ех
Ті та ні фіу Уві Меб Зег ар віз Хі АБр о Аїх ді Бек Уа АК ав 5 о жУВ
АК тТвК хі бін Зеє без бі тіє Яго Зак Ахр АКО біб Ме ав АБО
І вух е5о зх
Ті Уді АБ маї Бе Аїа вух йіва бін лів бекб вто Ар ОЗ1У ма Ма я Я НЕ дка бБіу Мет аг Ні ТНК ОМеї іву бек АБО хаб оаяр зів Ай щас Те 305 що 515 80 мо х - х жах АЛ зн жу їі кох СК А ух и 4 ефе ага міх діз Аг вій ві ТВг обі дід та Ті вій зак Уді Уа іх
КУ кути Ж
УЗ 2 Я
НіБ ФК Мет узі Туг щі Бек обіу Фу Аїд ЗЕ Ні бі сту ве АТа
З У У у ще з: ковки ях хз су п рак тії іх же їз
Фі 5іу Зі вто вне лів Уві Хі дія Ако Аїд х Я ук и З
ЗА цю «2105» 29 «2115 457 «2125» РАТ 213» Бактерія «прокаріот» «400» 29
Щек бух їй" Уі Фін їТе жів бів бі бів Ат Зеб біу Ага текоЗве 1 | 5 о їх
НМ. и як. . -
АТа ага аАзр узі КСух бі: 5 жія Се) АтТа ТВе Хі Ту дід таг АЖ
Ж ЗЕ З
«ки ях «а т вет С ну сюіхахо фас дану Ст з і жк ж дмут й х сту Мей бів Ай АТ БА ТИР оСУу АГРО ОТВг УВІ ФО АРО ВІВ АгО АТА 5 Бе 5
; -у АЮ їож ух о соску «ту 1 3; Ї 1ї5иу ГО З : « с 3 й вузу А де щі У БР ХВ ХМ є СЯ дя м й із о іх А її Я Є щі ОКХ З ху іш Ат Ар дія тів дев Є В т Аг Аг а тв їй З . 5. | хй ів не дев тів єї
З о, іви оРго туго Аїд Узі фув ах гео вне ар Їїв А вго сев ода іх Се ще ТУГ дів у ш. Ей
КОХ 2 . же й зі ую в ща З В т їх и ж з їі дахи Ага ТР ор ан о йеч БгО
КУ . . се ху Ж хо с ха г о ро с шіУ узі ТВкЕ Твт іви дї18 їі ег гу бо Мом З5
БУ з ких ау 3. - ее г Не
М : . БОШ зе з діз вів іш Аїд ака віз дов АїВ ді ви Уві бій ага мен вух кій діа мі
МІ ХА та вів Ах В І чх ЗК ї З 5 З ї їй : ж ЗЕ КО - «ек ву сх СК х
М, мо мех аз бін не дід тТуУуБ Ту БВ ТВ; «Віва вен і і ів дай Ме зво киш А ЗЕ щі а цу т ях чн ик
Жах мА КУ їх Ко х за а х і даті м
ЗЕ КК їй ща ж ит ти гу
ОО Мі ТУ бі БКО ТК ага Ази о рго ої аз тве Є
ТНг бів Аа ТВвК нів тує Ту го т 7 о сн та ді 133 ЖЖ я шу шк я, дів аів ї1ю ав дів вх я чів і і квр ща їз Ту ві Баг цаі х дів дід За А: зай ака щі дів ФіЖ сту др 15 15 ж КУ - З Яней з о. пох Фр у ї г дго їх п с «о; Жак дсрСт В оо є 1 Ж ЗЕ В АХ її а» ще КАЛ зх Кох «аед Бовці зі а КЕ сх Ох зр
ФУ біп уві го іву Бег йже ЗУ 5 179 сш ни
І 1655 ТУ уві тка ге я ів бух вВгоОо Ттвк ва сії У 4 з вгорі бує 1 ув Мову ж Кух м мок чві веб аїв баг орви бух Бі У їй; ТО її з ЕУ Я . ох щ й дить віє ї В і м сек рих у о ех с вів сх 5 д З щі « ха г ХК І її Аа В ї 4 ї х з щег го АгО бБію ТВготУє Вр вве УЗ Зах дев Бе о А З БУ ше . зва Й
ИТОяя З ку м : ка сти дик і95 . зав щі ЛЬ є іу вец діш сви діа ТУР АВ : ге ів віз ах Бек ті Бі піу ке дів ква бі вра ів від Аз М озеЕ ув 7 Мк
МО му ! іх яко М з звкоАга лу Км о нич поЖ ух втра віх ІВ БЕ х І як ех 5іу Рг Ар БгОо Се) ах овго бір Суб Заг Аа зай лів мес Фів бу кго Ар вго | 235 фор бив пох СО ще і: - ху тс вх й їх ках З вия й ї сво Бак біп бі 16 АВ 5 ту х см АРІ ів ів рга Хвг оті Бга шві ів ще 5 ей г зе .
От т " / жа кю - т х | І Ах Аа діє ко ав дід ян Її вн біу 5іу тг вне дго ар одяв дів бі» зад їі фі У ів ді Оу вок ди я и
З х ЗХ тку . до й и З боку ТІ
Є що теща ск : й ожне ви ці У вів Баг і МОЖ м'я дів аївй Уві А УВІ ІЗ дія ви ТНК ге 75
Ага Аїн аа уві АзроУв ЗВ «Я, Уві хів я Я МЕ ; шк За із аз ша о ЖЕ щи х5в о аїа бів жів бі Ага АТа Аа АВ ВА тв тУЩжі Майї те око 5 млі: З с Кк» З Б по
Ух 5 кшт ої щи дви тів Ак 2 Чу Сух ви нія сви дар о йжо ви РО ІВ аге . Ло фу их ів: Бі біУу СУух ге ні реш Можу я х 33 їВе о вів баг бів бу Ки 4ї5 ТЯ хіх з чо х щ х ЗА : : шко жі ра тів саке Ом зго бій Ав РМ Ті РКО цен дек омці І АН вго о бів аз вне о т ГОМ за ве ,
Тез Тук івн Ага їв цій ага Ре аго дра ма кл х Зо зуруоке ча їх ІЗ З І КУЄ З хх «ж ДУ іви ів ве УВІ ді її ПОТУ Кеш У 45 3353 4
МК КО зай Я че гія рем» тів о с зна о й дк) їв до тів 18 тів з аз Ся Уді Ах лів Сей Рв аг АБ гр хо я
ТУК АГ ОАЗ БУХ УДІ АБИ ЛІВ БУ 53 я
Я км я я тк. же єс сте тд заз їі «ек Аа вВкОо Аа їв пі ТР обів тр тів дід вго дій ТВе орго тів дк ЗЩО
АК КМ ик хх ско вам ов
З7о Фе ніх Ро бух зва бро віз Меє сіб ів о
ЯМ іУ ТВйг ага мні ка бух й Я ЗЕ
Зів маї ав ді т я 395 чи шк і й ЗХ ОЇ ща дія дія пе ТЕ 85 й їх У іа ІТ» СУ ВР Уві ді віз Віз В ї : тп я - . у слу Фах А і Ж е ї ач твкоБіп вгоОо Узі Зак Ве АТ Бі С яїа а з. 5.
МК я, зае я шк заці тіє« аа ча : гхеча СК ах ку хр ЕПОС КРБ ДІМ твого біУ Бій ах АБ сі Ме вто їі бі ха! дій Кі
Тер ого ік бів АБО А Я 35 436 сін
У ал Ж З шоку вуж дих іо
Кк й З н іви бух зечі Дт а д | З шу М 5 УЩЯЕ БЕ їд веб їкОо да би 5ВР огви сСув Се ді ВО " ад від ге їКОо ах Бі ОЗ вий 4
Я я «ев р; их в й ага фен Ух ух азвотаг 5іу Ті вій Аго ск
Я Ше -2105» 30 5 «2115 605 «2125» РАТ І «213» Бактерія «прокаріот» кри док Ук Кіру Ме «400» 30 . й їж вв бів дгй дак об у Аг щі М го ї Ахп Ар Ага лів БгОо ніх го бів вагу Зв З 5 їх мекї ах р гц М 18 - -Е кл і ії їв яете тує шіп аіз АЇа Туг ав аїа У м Ей 5 т г " ав г дів Ме ТУГА АВ. У ах
Аве онт5 ав тт АВ ВО А зх М З
М ско г. й с Жах фею Ох
В Уаї її хек Ар цео Тук дій ага Тв цу 16
Сх хх джу хх з ЗЕ яжМм о МАшМ З «дх
Тнг Авр аїа ліз ар уві Ті 5е ! Мо : їн пі СІВ ! зе» ши бів ев дів жа ч тв ті как і івВн ве ів ОІВ ек, ну зів да Ву жів Те В обів хви гав КВ У дать щі Бі АЖ Вч ІВ й щи
ВЕК ВХ КК КЕ М ка я і ді В ше їз бів сій авн ік дк рук ТУ БІВ ЗїЗ та із Аїа ав дів зів віп аа Ух Ах БУХ пі БИ в їм вів Ме бец Мій АБ АТЕ УК У
МАМ ЖК РКК ТЯГ, за 5 щи а зга ті І Ак ха і рух йо Ак З В
ЗУ Уві ОА ївпге вга вна осі у сут Ту НЕ жів вко вне з5іх Зо зіУ вва Аїд ча оз си 3 і В чі» і У ї а м хх 4 І я
Не м ів СУ ТАК 15 зі щі т
З ів не Е із сім су ДІД ТУ з у ух М 7 - З ех Кк код 2 53 7 й м вг і я ТвеоВіЖ Я ги чаї до Зх сії що іорго ТВ Тв Агов ме що меч АБ
Я Ех ж их З є ОАГУ аг оіУу х Я В ЗУ ї ма «є іх тт х хе
МІВ У СК Ві ді з : 15 т ке дів В 10 Бе узі 120 й вве 15 їв ТІВ дятла Тук що щі ФІЗ дав щі ех м ат а АХ З ОО щі с 5 од т со о я, ма сій ЗЕ ща В АВЕ лі вне Ам пу
АГ 135 а Те Ав че ме еВ іа джа сту : Зі Гу ТК я хх ит й гою ї55 і Аїд йод, її 5 я Ж ЖІ Вр. г хх іа Уві 4 195 туту Са 7 . - ї КХ ЧИ КК 7 кс чех
ВЕф яхт з Врпе ту Х хід Уві А. іх ка їїв
З пе овга вра ЗО їу хер АТа кові А мо док г ОКгО я шо ех у ЗК ху 1 бек щі Х ее А ги З ії не во м ЯМ хх ях Ж ОК З їз і щі
БІБ У їУу Кат ЗЕ У кі мій є є ва; ух З м Бе м мія в іч сх се з 7 че їі 145 Чім біу ТЕ5 ТНК Авр тВ тн ОБУ мч щі ух ж з ех КА кажу І оз
УР Заг Ф З и Ту тя 165 Був и аЄ її жк Фі АХА т. я Я М Х щі пе ті, ї га ВВ шаг і зі і іви | 7 КЗ АВ СУ
Уві вто чек СМ У Ех хг ОКеМ АЖ
С Я х ЗХ У, й с КУ ух по - те Ух НК й ав М КНУ : де її оОЗеї тозя і
Тв: - ай А я Мі АК ще їз вка зв із вве ап прнох 18 АВ. пе і віх ага зам ; ів Ві ет Уві кко дів х іа ді дів я й нг А 55 сі ів у х Мія Кец лі ід біх 818 . Кі» вк ау ж Мер о АЩща Мі Зх ішжкх Від іх ва аг із та дв, є ім ЗЕ вза ще г ва с тв воУВІ ДЕ 7 м од Не Ку 7 Со чі
І НЕ їв ніх в ів БВ кет, 7 Ух ім уз
З Без АВ ОН МЕ ж Вів. пе ОРЕ Ту
Кк ОУВі Бе сф х ЗАХО. с з Би дай ск 4
Заг хе хів А Е ко га Вп я ЗК НК
За Ахр да АР АГО їх З Бе
Ух 5 Кей пи "о к зу В ГЕ АГ ОТ З: к і щу во їв вію з й 245 гОоТкБ І «а із бін ді; із а! 5 мочаНиИ ща 7 здЕ з АТ ВІ х си
Ід й - ех З : заг А зе : їми х Кк. Ту Ж У Я їз ду 7 « М х
ТІ ОВ ЕЯВ ве я хх: вар сх їв У тв шу Я ; вне і Аа 7 се іУу те є 7 іх Аїд ви А зів с ева ВБе з оБіш ОТ ча дів їх за мя БЕ пе дів мак сі же
ДІВ. с щі з Ага а ня б ші т в щи ек в і Іі 5 в КО Ж. чої пу щЯ Її паї х
За ТОМ шо емо Мо З ОК 3 їх ів Ти КО їм ев Ак ів КЕ Зк речу Аа Ух іа УВІ яко у ів аїа Аа в дів
ККУ Ж Фр ЗУ «ДИ ек а 7 г й 7 БЕ чУЕ ді може 5 . де їв ще катів ді; зе вжи КУБ З ях пе го 15 ів'єїв хе; жк вип Ах Ярковеа Ін в тіж Ох 5
Мем опе Тв Так вга із ів 318 тів ви зав Не дк ТУ: за ви вів й їі їі їе - Е Овна АБІ ТЗ Б «їв ак ча; З3й З дга дз Ж в ті КЕ ї аз З Зі У чле чаї я ГУ УКЕ Зх 7 ших
ІК кох ке ст І; Бе І рт г
Зах з тгругі а і: Бко УВІ ма ТУ ЇВ Тук аг
ЗИ У вгаОтгі зе ви Мт Вга У КО іа ві ге ЯЗ УЖі сви ні зах Рне аб" Ту се
Я іш уві Є дк ТйК вне а 365 її2г Ах» зі в ТК бі . її акв Ї п З з і ; Ук ів. се Я пр їж 3 ою с ЕІ мя
Ав Бі. НІ 340 чак дів вк тТВЕ ча з
М се г Ве За ЗМУ ке Ба" тв 38 В ч ах ща Ку . ЧЕКУ ях я «АХ Б Зоя, ТУ Я
Ма був Аг мів аїв пів 5 сих Уа! їв Ах 409 дод дів ще . З ДІМ А; а жи ОО дек
ЗВГ, 355 Ві Ага ух ТТв оту ЗВг дкв дв ів: У я "а так їв Зак Ве ту ТВг я з Аїа Ар із Кгояїва ве ті їео бІУ РНЕ ТЗ ЛІ се і Бех са зх Те й я де у ШУ Вей ЗКУ ша Х МЕ ви Ка ХА х ЗІ Ха впли іжвь Кї й З ! У в
МИ зви оку ЗИ зщпОХеї га Ж жк ГО де ще ма меж Ге Кодак ім а ВАЄ зів уд ї аа фе, ча Ме Узі ага я їв ге діа м дп дід вив а, з ав ге Ох ц Баг дів ів і Аг А
Кави ді п В ев іви 5 ак іа тів мі Е сг
МБ. Мет а5р ее Те вне ї ха їн нія де В . і-ї З пе; За «ех Гі Х та Б НІ З ї кед вв й іш Ві ; Уві кі
Бве уді дев г ет ВНа в їх їв вва о Ууді їй я
МЕ. ЗК - г С й хе їх Ку кла очи 4 БО Кг ні я їжа ДІВ во тп ох за іш ви их іх Бу 450 - дат зай їВг одха 5 7 Заг СВ Бу ргО БУЄ АБ 5
Ко амх ОК СК у КЗ з; перс " мк хе
АБО 435 Т3ів5 вів 5 ях із вго вга ка ніх я ТУ Аа їв ак із дів 75 гівно джй
У дів че г овів г ; Ра Бе; ЗЕ із дк т За дів ТВ: поІзій Бг 45 зх в Ах х У вх дів ді заг ав ві віх А1а 459 соді акй ів - ВО Ав тА; сій фу в З я хів НІХ Кез за вк ОтТНе я і ІВ тя і 1 ківі яю хід Ву БІВ І
МЖМ ї жа Ж. че ві Ок У Вр рн ях - з З ї іх У о АТ 5 Мт Кк ЩО КК
Я ери дід Уа 185 ТУ цуУ5 ви, ТВ? вро дів а
Ж ! а д ак щ і у в 5 З Ма дах ГУ х і КН х ї КЕ хе ОХ І як и як а я ек Ох Ох Кох п ЗХ 7 тТвкоБів У Щ МвВу Ага А . т ув ще о Ба т ки ек щі БЖ з КО ГІВ и зр
Кік кох зи Сл Зх хх хх псвІх дя хї Я х ко ЗУ її
Беж з їв ви ту ЕМ чі хв зай зів ків ов г суху й ОК Ве зо хх Я р о я БР Ж ща гою жк ї З . не КЯ Її щоОже тд х и ХК г ос у На зій ав А іа вне УВІ ке : ії
ЕК ОККО 515 з аз ців х 55 з зі вна Ніч У ви дке АБ М іу ата где у Баг МіЗ
Ві Од За У кН 4 РАК РУ шо а ве з ве мен У В У ик .
ЗІ ВЕК |. о ів ЩІ ї Ух АБ Бі ЗЕ с
І т х жк чаї дів кі г Беца АВ «хр ків як ЗІ і БЕ ді Кк ча ТВ іа х іви ще У мА Кок їх м, ЗК хх : Ж з аа фе а У М сх г оїта з С З 5 . В У ді ї ка ска жим кое хх КЕ ма тку ї їх Кк НЯ
КМ ОА їу З д г З . тів ін З
Мах ки ОКУ У й хх БЕ и я
Ах ев ту как ні дід . ЯН
Ма вто їец Б кро ніх ВХ їв аа вів
МІВ ОР Су ТМ В Зо Си А Та В мВ хх о си У М жу хх ж хх их : Бе фе А Та Тур іє
Ух ФУ вне у, ко троагу аїв ту мух ФІ» ХУ с1У ткродее вію
Ї ТУК БІРЖУ т же ОоВ ще «210» ЗІ 5 «211522 1» НТ 135
213» Бактерія «прокаріот» «4005 31 мес Аго Звг обег фу АЗВ Ома тів був січ бе Меж ака вне фу У! ї 5 10 їх до как тре ву вк хе Усіх ж жи КУ ух ух ва Кз тії, ух с ау мех біз сбіуУу ТР оУЗВІ ав біу Ні бе РВе біз Тів бів бу и о о ЗО ет пе уяв жи фути бус й г з ко пах рух ли У «хг єкхі г хх ги щ-1У сів Бі Аг Бгто Ту бів бі ніх АБИ ТнгоУВ! уз би вух У ї5 Бе У че о 3 ух жжхутих р хіх Уїзхз біду А я аг дах «Я їжу Хаус 7 с
ТБ обУу5 фіУ бБіУ Бго бви Бгто о Бне лів тгв ар; тів фев бек обге сів 55 БО вве бій ТУ" бі Заг орУ Ма! Тук уд! Був Ні Вко аїд ахв їі о вго
Б. ТВ Та о 50 Туг кує ух ін бвг ке вРОо бів бі ве Ух твер обі ака мВ 5 НВ Зх мет ап вне бід ахо Зі сіу Уві У! ТМНтг Узі ТВгоЗій а5о 5еБоЗек 105 105 Що іву Бій Ар біу Суб вне Ті ту рух УВІ бух Ре Ті іх узі дхв 5 ї2О 125 вве ВГ бек ащр сіу ВгОо Уві меж бій рух вух Те Меє біУу ТР бів ща ща 140 ат бек ТНК Бі Ага їеб ТУБ РгРе АгРЯ АБО КшіУ УР Бецу т ТУ БІВ 145 30 155 МО т зі те АЛ Кк зе її кі; вом в жо ху віх жу її хг и їі Нік фт5 із оц бе бе УББ АБ СіУ біУу Ні ТУуБ веб чаї о
ОО ТО 175 вне гу Жег ожбіє Ту Мет АЇЗ ух ух Реб сУуВі Фів Сец обро бу тТук іо 15 щі зії тую вх ких Щи їм плід тік сім Юа зі шо де я де хх их
ТМ" туї Уді ах Бе" іуВ Бу АХ Хі тик Бек нів Аши ЗІіЮ АВ Ту ще ЦО аз
Тнтг тів УЩЗЕ Бін бів ТК Щі АРЕОТВІ Зі «Ту дра нт НІВ Бе вра цеи
ЕВ
5 «2105 32 «2115 3199 «212» ДНК -213» Гліцин тах «4005 32 аваїтттаажс дсттохсзаа Завзтксазаз савсасвис козазваесх Ес З кн и ки м а а А а и и и и пк акуратну ж у в Я ск ссс закзсзаазу тОтЕсзавци веб бо СЕК КВК що са свсдааа ска сзаааа стад саосє газах зесксавсвс ВССУ іо сфоинопржх их ин ж ж же их жк кк ку св ку у МОВО ки хи смутку век очі Зх ее З звсашсстста содсасазах вв ннещасвз сота страсті засаМааоо 3 зесзсвжєте стетоозЕта пЕжстаствоа зоЗзосасаєс састаЧетіє зазавщннсв юЮ сим и пк ф ух вйхуУю УміуУх Ми М и ру і» сю З юю прю КУ та еп и ву: висозсота сатсссЕоах поз ас ссвслазаа СЕК ОКУНЯ ЗО зах Е св ВеЕсТНіяЕ ен х траси гає ЩЕ аж де Ве ВІХ ЖЕ есе й З й автскксозаа зиск с Вс сеча ЕицОЯ ЄвВеВшешессеє усе в ку сін ту ту уліво Сир р жур су КВ ик дк фу ух у В аг застава МОСК КЕОКеТТЄКх сс сНеК ЄС СОС я тав СКК хстотзаВЕ шКетЕтста сісссВЕКес сте авсВаК БЕ какао єсттаоваза пезаєестЕа акероаао з зп3аа ааскавукея що вс стквастаЕ сОвнссає тсозсссаас зЗзаасоаса екс МО поствнов тозоозаоВа жнюазалов соска тяа стаж х обекааво То се сссоОЗ октава сасЗаасазо зсзасасеєю ЄКЕстхааво завер ЩО
ТІВ тас затока св тс зааасссоає Заст гас тває йо звссовОстте сазтаассовВ боса си ссзазокказ саеєеех зов ЩЕ чЧакттазсви свасскоасв асан гісвазааєє озібїтавет задпееавех ЗО ажсттзссваа зідссвсскає ста всабтєвастс сссзазаває сватаїтадо Мо ект кЕ зе зх уж ж ах зва ке ктукаифк хуфугуюа ку ж кіу окт сі ові ку з, пап сова базаісваКа зажматаОота зас засо КО звеазасста ОО ззавозакзих стасвавоз зоавїскказа сасаасаваї заз тав затока що всатеуксоЗ тсавассаКо засто сстассасх ваза сасеВО ВА КаККу зе акті васо сзпвссіца зллазаваза їсвовсвсай вататсвнає зсажнясаса 15 сижЕкнаст скасоїта стасажссЕ зесазавева ссановетсв оз свВЕся 132 тхазЗзасвся вагажстКЕ ствВстсзаса вата асс Зевса СОУС ї135о
Кк міч хо р урн я йду осуд рив ди ких дк дк фс уз фр их ин лк ех ую вних зах света а сКаасЕКНС зась С Є Сеат кеВ 1450 чавсстовав звствааасо таоссстсвї свіча стовісвіза засвивадів М тататсзиа асо сах заз шнниниа стаз зас аса час МО азаїїтсваєс стссскттЧсЄ сззстЕсає зазсостатоз ззавіаакаєс свт ого а и в ВК АК а и НН НН ЧК ча вссаттскекк скзтазсасеа сЗзасвасат гасссовкК сесссаск сао жо зав сстла стхзаїссв заасссвЕах вісті осай песазас спр ТУ ттостаїкве саатстасва стссВтсЕсЕ зсассзозаа Ввбавалатає сві снау ТК тсвавевсва ствах сассттсвсая ВЕсТсСТТЄке ссттттОооах піл 18550 сами: іа тОва соска заасоЯсстас заз сок скяя 333о су ту фу фу ми ку р у лі ку м КИ НК и НН З гм шскааЕскаазав зкВЕЗааКаОо НТК зга са ста саке ЗЕМНІ іо суток у мух Уфа фо ах ах ам ух зу ша и на о о а КИ о я ги зІсасєтас ссетааксжоє сесссссс ЕКО ЄКсс са Ка тара БВ татазасяиє затаОвскхв закататттт ТЕжтаКтЕЖх звуазааитажЕ тОааТТаО аю кит теКзЗої затавіїВЕЕ сгускастсзаа сстКгзатаз заїваако стае ка ЛО тс автає тест вста ово Вста азвХ ЕК азКса ЖЕСТ ВВІВ жккИ ззсхазацва ЕІ звссстоаста зсаятазаса зааазаааеє зсааоаає ЕВ сек кущ ВК рик ту с пухку Коко з пр гу фу Ух ча ак зизизсвВава ЕКС АнаЄ КаКОозЗОЗцаК свазааЗКЗ ссазаазиа яв. НИ ук міх я піцу ужив дух пулу ту туту у ки Кк ока о кю туту бух ду и. Ж ех мк я каф ваша іще с засвказава Засн аасаааааа вавакадаак -О асстатеззз звезтззавк агаастазцзс сізазізака сєстатазваа сема в а ааєткКЕсВІ састестВах стека ах саке сюка стаз соЗсааее аа зстсосвосх сасзсвазВах сатасассаЯ весен айви таза ХВО ттаватваох госзаєтвоє естобсвсса звзоростас ассстсазаз тЕзатстазав «НИ таїєссовзаов ататазвівох зактеееЕЕЕ госзсіакою сатбтчевода ааксееенаа У хвасасчниеа сіЗсЗізізЗ ззассннас вовставова веассозааас ззааовасая БО
ЗаСЕІЕЕЕЕ стстстстКу ЄсЕЕТЕВКЦЕЄ СТІК сТсК ЄЗеЕтовпнає зтосаєщеЦ 2820 тс авя зжстаассє сзазасїцоао засасастоає оазсзасасеа сзосаивеЕ еВВО «квозаачаЄ паст Все сссиасасасє Касстзаака саВсКаНе «ЗО сстстсК сксссасся веттотсїка зкстстеех соадтссссаЗ сатсастаос о шик тсстТЕх сТорсзсвсаст стасавсссс Ззсствосве вісястізах каб зов зквісєтлтза сезатква Вест с стазстваК поста аККК саван шАЄ зо тастассзасє їсавстасата стави та поатЕсвсса ткаоакітаз зас ках ліхо тЕЖасктатак асп ОцО 3199

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рослина або частина рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид ТИПА, який має повнодовжинний варіант, щонайменше з приблизно 80, 90, 95, 98, 99 95 або більше ідентичністю амінокислотної послідовності до 52ЕО ІО МО: 2, де кодований поліпептид ТА має активність меламіндезамінази та де амінокислотна послідовність відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності в одному або більше положеннях відповідно до положень 69, 74, 82, 84, 85, 87, 89, 93, 130, 131, 160, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328 з 5ЕО ІО МО: 2, причому експресія зазначеного полінуклеотиду надає рослині або частині рослини стійкістьдо гербіцидів групи триазинів.
2. Рослина або частина рослини за п. 1, де рослина або частина рослини додатково демонструє другу або третю ознаку стійкості до гербіциду.
З. Рослина або частина рослини за п. 1 або 2, де полінуклеотид, який кодує мутантний поліпептид ТгіА, включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щонайменше приблизно 80 до ідентичності з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1.
4. Насінина, здатна до проростання в рослину, яка містить щонайменше в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТгіА, як визначено в п. 1, та який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептиду ТгіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
5. Рослинна клітина, яка містить полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в клітині, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТтгіА, як визначено в п. 71, та який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептиду ТгіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
6. Спосіб контролювання бур'янів в місці для вирощування рослини, де спосіб включає: (а) застосування гербіцидної композиції, яка містить гербіциди групи триазинів, до ділянки; та (Б) посів насінини на ділянці, де насінина є здатною продукувати рослину, яка містить Зо щонайменше в деяких зі своїх клітин полінуклеотид, функціонально зв'язаний з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТгіА, як визначено в п. 1, та який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептиду ТгтіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
7. Спосіб за п. 6, причому гербіцидну композицію застосовують до бур'янів та рослин, отриманих з насінини.
8. Спосіб продукування рослини, яка має стійкість до гербіциду групи триазинів, де спосіб включає регенерування рослини з рослинної клітини, трансформованої з рекомбінантним полінуклеотидом, функціонально зв'язаним з промотором, функціонуючим в рослинних клітинах, промотором, здатним до експресування мутантного поліпептиду ТгіА, як визначено в п. 1, та який кодується полінуклеотидом, причому експресія мутантного поліпептиду ТгіА надає рослині стійкість до гербіцидів.
9. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТгіА, який має активність меламіндезамінази, вибраний з групи, яка складається з: (а) молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТгіА, який містить варіант послідовності ФЕО ІЮ МО: 2; (Б) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить варіант послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; (с) молекули нуклеїнової кислоти, яка, як результат виродження генетичного коду, може бути отримана з поліпептидної послідовності ТА ЗЕО ІЮО МО: 2 та забезпечує підвищену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; (4) молекули нуклеїнової кислоти, яка має 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 95 або більше ідентичності з послідовністю молекули нуклеїнової кислоти полінуклеотиду, який містить молекулу нуклеїнової кислоти ЗЕО 10 МО: 1 та забезпечує підвищену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною, нетрансформованою, немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; (є) молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує мутантний поліпептид ТтіА, який має 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 95 або більше ідентичності з амінокислотною послідовністю ТгіА поліпептидної послідовності зЗЕО ІО МО: 2 та забезпечує підвищену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; (Її молекули нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти з (а), (Б), (с), (4) або (е) за жорстких умов гібридизації та забезпечує підвищену стійкість або резистентність до гербіцидів, в порівнянні з відповідною немутантного типу рослинною клітиною, рослиною або її частиною; де варіант амінокислотної послідовності мутантного поліпептиду ТтіА відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності поліпептиду ТгіА в одному або більше з положень, які відповідають наступним положенням ЗЕО ІЮО МО: 2, 69, 74, 82, 84, 85, 87, 89, 93, 129, 130, 131, 160, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328.
10. Касета експресії, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено в п. 9, та промотор, функціонуючий в рослинних клітинах.
11. Касета експресії за п. 10, де промотор являє собою корінь-специфічний промотор.
12. Вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено в п. 9, або касета експресії, як визначено в п. 10 або 11.
13. Мутантний поліпептид ТгіА, який має активність меламіндезамінази, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, як заявлено в п. 9, або поліпептид, який має щонайменше 80, 90, 95, 98, 99 95 ідентичність до послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2, де амінокислотна послідовність мутантного поліпептиду ТгтіА відрізняється від немутантного типу амінокислотної послідовності поліпептиду ТгіА в одному або більше положеннях, які відповідають наступним положенням ЗЕО ІЮ МО: 2, 69, 74, 82, 84, 85, 87, 89, 93, 129, 130, 131, 160, 170, 174, 180, 182, 216, 217, 219, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 298, 301, 302, 304, 328.
МЕ М ОКХ с М В с. 0. о. МУК КК КК хх . се о З о. о. Б В : Б ОО й ЗВ ще ща ЗО ООО Б ОБ І ОББВ М с с Я с ОО В. ОО
С . . о.
КК . З З о. ОХ ща З че зе че
Фіг. 1
ОККО КК о» ОО а ОО ММ М М М А ВОК ВК о ОО ВХ і МК ВК ОО КВК я С М М М ОКО о. ОО с х І ХХ х КА М СО ОК ох В ТО . ОО С п ОХ ОО КО КК о. З . ОЗ КВ ОК ОО х ХК КК ОХ ОО Ки З ММ МОЯ ЗМО с с с о ХО ОКХ ОО ХОМ її с ОКО о ооооооХ з ОС ПК ОО ОЕМ о ОМ ! С ох ОО й Зх й їаЕ ЕІ ОК В ОО ОО М ЗО ОККО ОКА и М КК ОКХ ОКОМ с зляк ОО КК В Я с 5 ЕЕ во с 5 : о. с,
о. КОН п. КК ХК З ОВ. ж х Кї еКХуи о. . . З ОК Ж ХХ п МОХ БО К ЗК ха КК КУ Ох ос ОК с ОО М М М М М М М М М М І с ОО М ПО В ВО Ко КК КО
Фіг. 2
UAA201901538A 2016-07-15 2017-07-13 Рослини, які мають підвищену толерантність до гербіцидів UA127406C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16179593 2016-07-15
PCT/IB2017/054246 WO2018011750A1 (en) 2016-07-15 2017-07-13 Plants having increased tolerance to herbicides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127406C2 true UA127406C2 (uk) 2023-08-16

Family

ID=56418402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201901538A UA127406C2 (uk) 2016-07-15 2017-07-13 Рослини, які мають підвищену толерантність до гербіцидів

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11499162B2 (uk)
EP (1) EP3484278A4 (uk)
JP (1) JP7264805B2 (uk)
CN (1) CN109688807B (uk)
AR (1) AR109074A1 (uk)
AU (1) AU2017294685B2 (uk)
BR (1) BR112019000741A2 (uk)
CA (1) CA3030803A1 (uk)
CR (1) CR20190081A (uk)
EA (1) EA201990308A1 (uk)
IL (1) IL264157A (uk)
MX (1) MX2019000665A (uk)
PH (1) PH12019500110A1 (uk)
UA (1) UA127406C2 (uk)
WO (1) WO2018011750A1 (uk)
ZA (1) ZA201900830B (uk)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3043986A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Basf Se Herbicidal phenyltriazolinones
EA202091721A1 (ru) * 2018-01-17 2020-11-27 Басф Се Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
BR8600161A (pt) 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
BE1000563A6 (fr) 1987-05-18 1989-02-07 Cedres Castro Herminio S Dispositif accessoire, retractable dans un wc du type traditionnel destine a l'hygiene du corps.
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
FR2629098B1 (fr) 1988-03-23 1990-08-10 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimerique de resistance herbicide
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
NZ231804A (en) 1988-12-19 1993-03-26 Ciba Geigy Ag Insecticidal toxin from leiurus quinquestriatus hebraeus
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ES2074547T3 (es) 1989-11-07 1995-09-16 Pioneer Hi Bred Int Lectinas larvicidas, y resistencia inducida de las plantas a los insectos.
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
PL295547A1 (uk) 1990-04-26 1992-10-05 Plant Genetic Systems Nv
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
CA2112676C (en) 1991-08-02 2007-07-03 Michio Ohba Novel microorganism and insecticide
AU2515592A (en) 1991-08-23 1993-03-16 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
CA2116449C (en) 1991-08-27 2005-04-05 Vaughan Alan Hilder Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
WO1993007256A1 (en) 1991-10-07 1993-04-15 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (uk) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
BR9306802A (pt) 1992-07-27 1998-12-08 Pioneer Hi Bred Int Processo independente de genótipos para produção de planta de soja transgénica e processo de regeneração de plantas de soja a partir de nodos cotiledonais
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5530195A (en) 1994-06-10 1996-06-25 Ciba-Geigy Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a toxin active against insects
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
AU768243B2 (en) 1998-11-09 2003-12-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Transcriptional activator LEC1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US6369299B1 (en) * 1999-06-10 2002-04-09 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic plants expressing bacterial atrazine degrading gene AtzA
AU775233B2 (en) 1999-07-22 2004-07-22 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for superrapid transformation of monocotyledon
WO2001064912A2 (en) * 2000-02-29 2001-09-07 Maxygen, Inc. Triazine degrading enzymes
ES2243543T3 (es) 2000-08-25 2005-12-01 Syngenta Participations Ag Hibridos de proteinas cristalinas de bacillus thurigiensis.
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
AU2002361696A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 Syngenta Participations Ag Novel corn event
CN100497638C (zh) * 2003-12-12 2009-06-10 南开大学 含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建及转基因水稻的制备
CA2897475C (en) 2004-04-30 2018-07-10 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
US8680290B2 (en) 2004-09-03 2014-03-25 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
EP1799657B1 (en) 2004-10-05 2009-12-02 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
ATE495265T1 (de) 2005-06-23 2011-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verbesserte verfahren zur herstellung stabil transformierter und fruchtbarer buntmais-pflanzen
GB0526044D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0603891D0 (en) 2006-02-27 2006-04-05 Syngenta Ltd Novel herbicides
VN21892A1 (en) 2007-04-04 2010-01-25 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
MX2009012120A (es) 2007-05-09 2010-02-12 Dow Agrosciences Llc Genes novedosos con resistencia a herbicidas.
WO2009076711A1 (en) * 2007-12-19 2009-06-25 Sugar Industry Innovation Pty Ltd Enzymes and methods for degrading chlorinated s-triazines
CA2741138A1 (en) 2008-10-29 2010-05-06 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal action
CN102954959B (zh) * 2011-08-29 2016-09-14 中国科学院上海有机化学研究所 一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法
JP2014094909A (ja) * 2012-11-08 2014-05-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 除草用組成物
AU2014203893B2 (en) * 2013-01-04 2017-11-02 Ginkgo Bioworks, Inc. Microorganisms engineered to use unconventional sources of nitrogen
AU2014292193B2 (en) 2013-07-16 2018-04-26 Basf Se Herbicidal azines
CN105745328A (zh) * 2013-11-21 2016-07-06 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 制备三聚氰酸二酰胺的方法
WO2015144881A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Basf Se Diaminotriazine derivatives as herbicides
US20170144985A1 (en) 2014-04-03 2017-05-25 Basf Se Diaminotriazine compound useful as herbicide
WO2015155129A1 (en) 2014-04-07 2015-10-15 Basf Se Diaminotriazine compound
EP2930174A1 (en) 2014-04-07 2015-10-14 Basf Se Diaminotriazine derivatives as herbicides
CN106458937A (zh) 2014-04-11 2017-02-22 巴斯夫欧洲公司 作为除草剂的二氨基三嗪衍生物
CN106164057A (zh) 2014-04-11 2016-11-23 巴斯夫欧洲公司 作为除草剂的二氨基三嗪衍生物
CN106164058A (zh) 2014-04-11 2016-11-23 巴斯夫欧洲公司 作为除草剂的二氨基三嗪衍生物
JP6538077B2 (ja) 2014-04-23 2019-07-03 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 除草剤としてのジアミノトリアジン化合物
US10029992B2 (en) 2014-04-23 2018-07-24 Basf Se Diaminotriazine compounds and their use as herbicides
AT516750B1 (de) 2014-12-18 2016-08-15 Zizala Lichtsysteme Gmbh Verfahren zur Voidreduktion in Lötstellen
MX2017009541A (es) 2015-01-21 2018-05-07 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas.
CN107567278A (zh) 2015-04-24 2018-01-09 巴斯夫欧洲公司 苯氧基‑或吡啶‑2‑氧基‑氨基三嗪化合物及其作为除草剂的用途
EP3544962B1 (en) 2016-11-28 2021-07-28 Basf Se Diaminotriazine compounds

Also Published As

Publication number Publication date
CN109688807B (zh) 2023-04-28
EP3484278A4 (en) 2020-02-19
WO2018011750A1 (en) 2018-01-18
US20190367939A1 (en) 2019-12-05
AU2017294685A1 (en) 2019-01-31
US20230145692A1 (en) 2023-05-11
EA201990308A1 (ru) 2019-07-31
MX2019000665A (es) 2019-10-30
JP2019524096A (ja) 2019-09-05
CR20190081A (es) 2019-05-22
CA3030803A1 (en) 2018-01-18
AU2017294685B2 (en) 2023-10-26
BR112019000741A2 (pt) 2019-07-30
IL264157A (en) 2019-02-28
PH12019500110A1 (en) 2019-10-14
JP7264805B2 (ja) 2023-04-25
ZA201900830B (en) 2020-10-28
US11499162B2 (en) 2022-11-15
AR109074A1 (es) 2018-10-24
CN109688807A (zh) 2019-04-26
EP3484278A1 (en) 2019-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11965171B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US10538782B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US20220025392A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
UA127971C2 (uk) Спосіб контролю за небажаною рослинністю на ділянці вирощуванння рослини
US20230145692A1 (en) Plants Having Increased Tolerance to Herbicides
US20190078114A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US11365426B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
CA3230261A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US11939587B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides