CN105745328A - 制备三聚氰酸二酰胺的方法 - Google Patents
制备三聚氰酸二酰胺的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105745328A CN105745328A CN201480063458.XA CN201480063458A CN105745328A CN 105745328 A CN105745328 A CN 105745328A CN 201480063458 A CN201480063458 A CN 201480063458A CN 105745328 A CN105745328 A CN 105745328A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ammeline
- tripolycyanamide
- ammelide
- enzyme
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
- C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
- C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
- C07D251/40—Nitrogen atoms
- C07D251/48—Two nitrogen atoms
- C07D251/52—Two nitrogen atoms with an oxygen or sulfur atom attached to the third ring carbon atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
- C12Y305/04003—Guanine deaminase (3.5.4.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/99—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in other compounds (3.5.99)
- C12Y305/99003—Hydroxydechloroatrazine ethylaminohydrolase (3.5.99.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y308/00—Hydrolases acting on halide bonds (3.8)
- C12Y308/01—Hydrolases acting on halide bonds (3.8) in C-halide substances (3.8.1)
- C12Y308/01008—Atrazine chlorohydrolase (3.8.1.8)
Abstract
本发明涉及一种通过在包含生物催化剂的含水反应混合物中进行固体至固体反应,来由三聚氰胺制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的新方法,其中所述生物催化剂包含至少一种属于酰胺水解酶超家族并且具有针对1,3,5?三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶。本发明还涉及一种能够通过根据本发明的方法获得的产品,其中所述产品包括三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
Description
本发明涉及制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的方法。本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的产品,其中所述产品包括三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
三聚氰酸二酰胺(4,6-二氨基-2-羟基-1,3,5-三嗪)和三聚氰酸一酰胺(6-氨基-2,4-二羟基-1,3,5-三嗪)是具有工业意义的1,3,5-三嗪化合物,例如用于例如在US4341694、JP55094953、JP59029676中提及的阻燃组合物中。然而,它们现今不能以大的工业规模商业获得。
已经针对三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺的制备研究和描述了若干化学路线(E.M.Smolin and L.Rapoport.2008.Ammelide,Ammeline andRelated Compounds.In:Chemistry of heterocyclic compounds:s-Triazinesand Derivatives.Volume 13.Chapter 5.p.269-308(E.M.斯莫林和L.拉波波尔,2008年,“三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺以及相关的化合物”,《杂环化合物化学:均三嗪及其衍生物》,第13卷,第5章,第269-308页))。此类合成路线是非常费力和麻烦的。此外,这些需要相对昂贵的起始材料(例如,双氰胺和双缩脲)、严格的反应条件(高于200℃的温度)、含卤素化合物、有毒溶剂(例如,苯酚、甲酚或者二甲酚),以及加入醇类(例如,甲醇)以从溶剂中沉淀沉淀和回收三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。另外,这些路线往往导致以不受控的比率形成三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺,并且导致有限的产率,以及形成不同量的副产物例如三聚氰酸,由于三聚氰酸的溶解度极低,所以通过洗涤除去三聚氰酸是困难和昂贵的。因此,需要用于三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的替代路线,优选由便宜起始材料例如三聚氰胺(2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪;也被称为三氨基均三嗪)的更经济有效的方法。
本发明的一个目的是提供制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的方法,所述方法将克服上述缺陷中的一个或多个,特别导致高产率和低含量的副产物,由此提供具有商业吸引力的方法。
本发明的另一目的是提供制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的新方法,其中可对三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺的比率进行微调。
本发明的又一目的为提供包括可控比率的三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的产品。
利用根据本发明的方法已经实现了这些目的,所述方法包括用于制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的方法,其中三聚氰胺通过在包含生物催化剂的含水反应混合物中发生固体至固体反应,而转化为三聚氰酸二酰胺和任选地三聚氰酸一酰胺,并且其中生物催化剂包括至少一种属于酰胺水解酶超家族并且具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶。
在根据本发明的方法中,三聚氰胺通过“固体至固体”反应而转化为三聚氰酸二酰胺和任选地三聚氰酸一酰胺。这表示:在所述反应中,在任何时候均仅有小比例的底物和/或产物处于溶解状态中,而剩余部分的底物和/或产物为固相。起始固态三聚氰胺底物逐渐溶解,在其转化成三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺时穿过溶液,然后三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺沉淀沉淀。
根据本发明的固体至固体反应是在包含固态底物和/或产物和水相中的生物催化剂的“含水反应混合物”中进行的。所述水相是其中主要溶剂为水的液相。
如本文所定义的“生物催化剂”是来源于生物来源的生物材料或部分,所述生物材料或部分催化根据本发明的方法中的一个或多个反应步骤。所述生物催化剂原则上可为任何生物体例如微生物,或者来源于生物体的生物分子。所述生物催化剂可特别包括一种或多种酶。
所述“酰胺水解酶超家族”是在催化结构域中含有磷酸丙糖异构酶(TIM)样桶状折叠的“金属依赖性水解酶”的基于结构的酶簇。此超家族的成员催化有机化合物的不仅C-N键还有C-C键、C-O键、C-Cl键、C-S键和O-P键的裂解(L.Aimin,L.Tingfeng,F.Rong.2007.Amidohydrolasesuperfamily.In:Encyclopedia of life sciences 2007(L.艾曼,L.挺锋,F.蓉,2007年,“酰胺水解酶超家族”,《生命科学百科全书》,2007年))。
“具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶”是具有针对经氨基取代的1,3,5-三嗪化合物的水解活性的酶,其能够通过水解三嗪环中的碳原子和氨基取代基的N原子之间的C-N键来将一个或多个氨基取代基转化为羟基取代基,同时产生氨(反应流程[1])。
“具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶”还在下文中被称为“所述酶”。
相较于现有技术中的方法,根据本发明的方法需要温和的条件。所述方法是在用于使生物催化剂保持活性的水相存在的情况下在中等温度下进行的。所述方法还是环境友好的,不使用有毒溶剂、含卤素化合物或者醇类。三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺在含水反应混合物中直接沉淀并且其回收仅需要很少的使用水的洗涤步骤。所述方法的另一个优点是产生期望的产物,不会形成副产物例如三聚氰酸而造成产率损失。可以设想到,根据本发明的方法允许相较于现有技术中描述的化学路线更好的产率。实现了三聚氰胺至三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的最高转化率(高达约99%)。根据本发明的方法相较于所述化学路线的另一优点为能够微调三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。
据称,不论是否存在未反应的底物和生物催化剂,当无明显反应发生时,三聚氰胺至三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的转化率达到其“最高转化率”。
一些研究已经调查了土壤细菌对人和动物体内的三聚氰胺毒性的作用并且已经鉴定了三聚氰胺细菌代谢途径,在三聚氰胺细菌代谢途径中三聚氰胺被示为通过连续脱氨基作用水解为三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺。已经鉴定出了这两个脱氨基步骤中所涉及的基因和酶,并且在一些情沉中所述酶已经经过纯化和表征。已经发现所述酶属于酰胺水解酶超家族(反应流程[2];J.L.Seffernick,A.G.Dodge,M.J.Sadowsky,J.A.Bumpusand L.P.Wackett.2010.Bacterial ammeline metabolism via guaninedeaminase.J.Bacteriology 192(4),1106-1112(J.L.谢佛尼克、A.G.道奇、M.J.萨多夫斯基、J.A.邦珀斯和L.P.瓦克特,2010年,“经由鸟嘌呤脱氨酶的三聚氰酸二酰胺细菌代谢”,《细菌学杂志》,第192(4)卷,第1106-1112页);A.G.Dodge,L.P.Wackett,M.J.Sadowsky.2012.Plasmidlocalization and organization of melamine degradation genes in Rhodococcussp.strain Mel.Applied and environmental microbiology 78(5),1397-1403(A.G.道奇、L.P.瓦克特、M.J.萨多夫斯基,2012年,“三聚氰胺降解基因在红球菌属菌株Mel中的质粒定位和组织”,《应用与环境微生物学》,第78(5)卷,第1397-1403页))。这些研究不涉及本发明的技术领域,即通过在包含生物催化剂的含水反应混合物中进行固体至固体反应来由三聚氰胺制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的方法,并且未指示在三聚氰胺细菌代谢途径中鉴定出的酶可适用于根据本发明的方法。
在反应流程[2]中示出了三聚氰胺水解降解途径中的前两个步骤。指示了编码催化各步骤的微生物酶的基因。triA、trzA、atzB基因分别编码三聚氰胺脱氨酶、均三嗪水解酶和羟基阿特拉津水解酶。GDA是鸟嘌呤脱氨酶的缩写。所有所述酶为酰胺水解酶超家族的成员。
根据本发明,通过在包含生物催化剂的含水反应混合物中的“固体至固体”反应,三聚氰胺转化成三聚氰酸二酰胺和任选地三聚氰酸一酰胺。可改变反应参数(例如,生物催化剂、水相、混合、pH、温度或者底物负荷),以便优化反应和获得期望的产物。
可以以任何形式使用根据本发明的生物催化剂。生物催化剂可例如以(部分)纯化酶、冻干酶粉末、固定化酶、全细胞(例如,渗透化细胞、冻干细胞)、固定化全细胞、细胞裂解物或者无细胞提取提取物的形式使用。
技术人员将清楚认识到,可在根据本发明的方法中使用天然存在的生物催化剂(野生型)或者天然存在的生物催化剂的具有适当活性的突变体。可通过技术人员已知的生物技术例如分子进化或者合理设计来改良天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用技术人员已知的诱变技术(例如,随机诱变,定点诱变,定向进化,基因重组)修饰能够充当生物催化剂或者能够产生生物催化部分(例如,酶)的生物体的编码DNA,来制造野生型生物催化剂的突变体。具体地,可修饰所述DNA以使得其编码与野生型酶相差至少一个氨基酸的酶,以至于其编码相较于野生型包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶,或者以至于突变体组合两个或者更多个亲本酶的序列或者影响如此修饰的DNA在合适的(宿主)细胞中的表达。后者可通过技术人员已知的方法来实现,诸如密码对优化,例如基于如在WO 2008/000632中所描述的方法。
突变生物催化剂可例如在以下方面中的一个或多个方面具有改善的特性:针对底物的选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子的利用,以及底物亲和性。可通过基于技术人员已知的此类方法,应用例如适当的高通量筛选或者选择方法来鉴定具有改善特性的突变体。
可使用本领域中原本已知的分子生物学技术来构造包含用于催化根据本发明的方法中的一个或多个反应步骤的一种或多种酶的细胞,尤其是重组细胞。例如,如果要在重组细胞中产生一种或多种外源酶,那么可使用此类技术来提供载体(例如,重组载体),所述载体包含编码所述外源酶中的一种或多种的一种或多种外源基因。可使用一种或多种载体,所述载体各自包含一种或多种此类外源基因。此类载体可包括一个或多个调控元件,例如一个或多个启动子,所述调控元件可以与编码所述酶的基因可操作性地相连。
如本文所使用的术语“外源”意指将生物分子(例如,DNA、RNA、蛋白质)引入宿主细胞。所述生物分子可为例如在引入宿主细胞之后编码同源(或异源)蛋白质的同源(或异源)核酸。术语“异源”是指从与宿主细胞不同的供体来源分离的生物分子,而术语“同源”是指从宿主细胞分离的生物分子。因此,本发明的编码核酸的外源表达可利用异源编码核酸或同源编码核酸,或者异源编码核酸和同源编码核酸两者。
如本发明人已经发现的,所述属于酰胺水解酶超家族并且具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶(如在根据本发明的方法中所使用的酶)可为选自由以下项组成的组的任何合适的酶(即,如果可确认所述酶具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性,则所述酶是合适的):三聚氰胺脱氨酶(也称为三聚氰胺酰胺水解酶)、均三嗪水解酶(也称为N-乙基三聚氰酸二酰胺氯水解酶)、羟基阿特拉津水解酶(也称为阿特拉津氯水解酶)、鸟嘌呤脱氨酶(也称为鸟嘌呤酰胺水解酶),以及西玛三嗪氯水解酶。
在一个实施方式中,合适的三聚氰胺脱氨酶可选自由以下项组成的组:来源于食酸菌属(Acidovorax)、生酮基古龙酸菌属(Ketogulonicigenium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、威廉姆斯氏菌属(Williamsia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌属(Arthrobacter)、涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)、考克氏菌属(Kocuria)、皮生球菌属(Dermacoccus)、盖球菌属(Kytococcus),以及肠杆菌属(Enterobacter)的三聚氰胺脱氨酶。具体地,所述三聚氰胺脱氨酶可来源于西瓜食酸菌(Acidovoraxcitrulii)(以前称为西瓜假单胞菌(Pseudomonas citrulii))、燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subspecies citrulii)(以前称为类产碱假单胞菌西瓜亚种(Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.citrulii))、普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)、戈登氏菌(Gordoniarubripertinctus)(也称作暗红戈登氏菌(Gordona rubripertincta);与珊瑚红球菌(Rhodococcus corallinus)同义)、土生克雷伯菌(Klebsiellaterragena)或者微球菌属菌株MF-1。更具体地,所述三聚氰胺脱氨酶可来源于西瓜食酸菌NRRL B-12227或者普通生酮基古龙酸菌Y25。
在另一个实施方式中,合适的均三嗪水解酶可选自由以下项组成的组:来源于戈登氏菌属(Gordonia)、红球菌属(Rhodococcus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、肠球菌属(Enterococcus)、乏养菌属(Abiotrophia)、乳球菌属(Lactococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、革兰菌属(Gramella)、奇异菌属(Atopobium)、轮枝链霉菌属(Streptoverticillium)、游动放线菌属(Actinoplanes)、北里孢菌属(Kitasatospora)、钦氏菌属(Chainia)和孢囊放线菌属(Actinosporangium)的均三嗪水解酶。合适的均三嗪水解酶可具体地选自戈登氏菌(也被称为暗红戈登氏菌;与珊瑚红球菌同义),更具体地选自珊瑚红球菌NRRL B-15444R。
在又一实施方式中,合适的羟基阿特拉津水解酶可来源于节杆菌属(Arthrobacter)、β-变形细菌(Beta proteobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、氨基杆菌属(Aminobacter)、微球菌属(Micrococcus)、金杆菌属(Aureobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、地杆菌属(Terrabacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、福格斯氏菌属(Vogesella)、德莱氏菌属(deleya)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、噬氢菌属(Hydrogenophaga),或者假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。具体地,合适的羟基阿特拉津水解酶可来源于假单胞菌ADP或者嗜氨基氨基杆菌(Aminobacter aminovorans)。
在又一实施方式中,合适的鸟嘌呤脱氨酶可选自由以下项组成的组:来源于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、根瘤菌属(Rhizobium)以及勒克氏菌属(Leclercia)的鸟嘌呤脱氨酶。具体地,所述鸟嘌呤脱氨酶可来源于慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)或者大肠杆菌(Escherichia coli)。更具体地,所述鸟嘌呤脱氨酶可来源于慢生型大豆根瘤菌USDA 110或者大肠杆菌ETEC H10407。
在又一实施方式中,合适的西玛三嗪氯水解酶可选自由以下项组成的组:来源于草螺菌属的西玛三嗪氯水解酶。具体地,所述西玛三嗪氯水解酶可来源于草螺菌B601。
在一个具体实施方式中,属于酰胺水解酶超家族并且具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶包含由SEQ ID NO 5(AAG41202.1)、SEQ ID NO 6(YP_003963954.1)、SEQ ID NO 7(Q52725.2)、SEQ ID NO8(NP_770520.1)和SEQ ID NO 9(CBJ02579.1)表示的氨基酸序列,或者它们的同源物。
“同源物”在本文中具体用于与参照蛋白(即,SEQ ID NO 5,SEQID NO 6,SEQ ID NO 7,SEQ ID NO 8或者SEQ ID NO 9)具有至少30%,优选至少40%,更优选至少50%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,特别地至少85%,更特别地至少90%,至少9l%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或者至少99%的序列同一性的多肽。同源物一般为与其参照蛋白具有类似的功能以及优选地还有类似结构的多肽。一种类型的同源物是由来自同一属中的另一物种或者甚至来自其它属的基因编码的。“同源物”还旨在包括已经通过已执行以改善蛋白质的期望特性的诱变技术改变的那些蛋白质。
在本文中序列同一性被定义为两个或更多个多肽序列或者两个或更多个核酸序列之间的关系,如通过比较序列所测定的。通常,序列同一性是在序列全长上比较的,但是也可仅针对相互比对的序列的部分进行比较。在本领域中,“同一性”还视情况而定意指多肽序列或核酸序列之间的序列相关程度,如通过此类序列之间的匹配所测定的。用于测定同一性的优选方法被设计用于产生测试序列之间的最大匹配。在本发明的上下文中,用于测定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.1990,215,403-410,publiclyavailable from NCBI and other sources(阿特舒尔,S.F.等人,《分子生物学杂志》,1990年,第215卷,第403-410页,可从NCBI和其它来源公开获得)(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894(《BLAST手册》,阿特舒尔,S.F.等人,贝塞斯达的美国国家卫生研究所,美国国家医学图书馆,美国国家生物技术信息中心,MD20894)))。用于使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为空位开放10.0,空位延伸0.5,Blosum 62矩阵。用于使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为空位开放10.0,空位延伸0.5,DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。
本发明方法中的水相是其中主要溶剂是水的液相。水相可为单独的水,包含水和一或多种缓冲盐的混合物的缓冲液(例如,磷酸钾缓冲液),水与有机溶剂(例如,乙二醇、DMSO、THF)的混合物,或者缓冲液与有机溶剂(例如,乙二醇、DMSO、THF)的混合物。技术人员将能够选择和优化适合于生物催化剂的有效活性的水相。
由于固体至固体反应的性质,含水反应混合物的有效混合对于提供反应组分的良好输送和接触和避免颗粒沉降来说是重要的。技术人员将能够使用可商业获得的技术来选择恰当的混合器设计和混合条件。有效混合可例如用径向泵搅拌器实行,同时可用轴向搅拌器避免颗粒沉降,向下泵送到反应容器的底部。如现有技术,使用窄叶翼型桨作为轴向泵叶轮。使用传统斜叶刀片式涡轮作为标准叶轮。也可在偏心位置中使用螺旋桨。当使用定心叶轮时,可应用挡板来使液流旋流至所述叶轮的期望图案。通过经由外层循环泵送含水反应混合物来提供混合也是一种选择。令人惊奇地发现,在根据本发明的方法中使用的酶在由于混合而出现的流体动力学剪切力和不溶固体的存在下保存活性。
原则上,反应介质的pH可在宽范围内选择,只要生物催化剂在所应用的pH条件下有活性即可。反应混合物的pH适当地在4和11之间,优选地在5至10之间。选择在A与B之间的pH、在从A至B的范围内的pH或者A至B的pH范围包含端点A和B。
本发明人已经惊讶地发现了pH对三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率具有深远影响。实施例2和表3说明了此影响。在所应用的条件下且在7至10的pH范围内,较高的pH导致较高的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。具体地,pH为7、8、9、9.5和10分别导致三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率为3.5(75.2mol%的三聚氰酸二酰胺,21.2mol%的三聚氰酸一酰胺)、14.3(90.0mol%的三聚氰酸二酰胺,6.3mol%的三聚氰酸一酰胺)、56.8(96.5mol%的三聚氰酸二酰胺,1.7mol%的三聚氰酸一酰胺)、108.8(97.9mol%的三聚氰酸二酰胺,0.9mol%的三聚氰酸一酰胺),以及164(98.4mol%的三聚氰酸二酰胺,0.6mol%的三聚氰酸一酰胺)。在pH值低于7处观测到了相反的趋势,其中较高的pH导致较低的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。具体地,在pH为5和6处,三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率分别为18.3(91.5mol%的三聚氰酸二酰胺,5.0mol%的三聚氰酸一酰胺)和8.8(86.9mol%的三聚氰酸二酰胺,9.9mol%的三聚氰酸一酰胺)。换句话说,在所应用的条件下且在从6.5至7.5的pH范围内,获得了具有高三聚氰酸一酰胺含量的产物,而在pH低于6.5,优选地低于6处或者在pH高于7.5,优选地高于8处,形成了具有高三聚氰酸二酰胺含量的产物。因此pH已经被确定为用于微调三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率的重要参数。
原则上,所使用的反应介质的温度可在宽范围内选择,只要生物催化剂在所应用的温度条件下保持活性即可。在根据本发明的方法中,反应温度一般在0℃和100℃之间,优选地在10℃和60℃之间。
在根据本发明的方法中,将三聚氰胺底物以超过饱和的负荷加入含水反应混合物中,以在本发明中将选择的温度和pH范围内形成固体。使三聚氰胺在所选反应条件下形成固体的三聚氰胺负荷可通过常规实验确定。
如本文所指,术语“负荷”是相对于含水反应混合物的总质量,最初加入反应混合物中的三聚氰胺的总质量。三聚氰胺负荷被表示为质量百分比(质量%)。
“饱和”在本文中被定义为三聚氰胺溶液无法再溶解任何附加量的三聚氰胺并且此附加量的三聚氰胺将作为固体出现时的最大负荷点。
在本发明的一个实施方式中,三聚氰胺是以相对于含水反应混合物的总质量,至少1.0质量%,优选地至少10质量%,更优选地至少15质量%,更优选地至少20质量%,甚至更优选地至少30质量%的负荷存在的。
本发明人已经惊讶地发现,底物负荷对最终产物的组成具有深远的影响,其中较高的三聚氰胺负荷导致较高的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。实施例3和表4说明了此影响。在所应用的条件下,约1质量%、9质量%和17.5质量%的初始三聚氰胺负荷分别导致108.8(97.9mol%的三聚氰酸二酰胺,0.9mol%的三聚氰酸一酰胺)、329.7(98.9mol%的三聚氰酸二酰胺,0.3mol%的三聚氰酸一酰胺)、494(98.8mol%的三聚氰酸二酰胺,0.2mol%的三聚氰酸一酰胺)的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。因此三聚氰胺负荷已经被确定为用于微调三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率的另一重要参数。
在固体至固体反应已经进行至可接受的转化水平之后,可通过常规方法(例如,通过过滤,通过离心分离或者通过应用卧螺离心机)从含水反应混合物中分离固态产物。随后,可用水洗涤所分离的产物以除去残余的三聚氰胺底物。三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率不受这些洗涤步骤的影响。
能够通过根据本发明的方法获得的固态产物具有高三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺含量和低水平的残余三聚氰胺。适当地,所述产物包含至少95质量%的三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺,以及至多5质量%的三聚氰胺。优选地,所述产物包含至少98质量%的三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺,以及至多2质量%的三聚氰胺。更优选地,所述产物包含至少99质量%的三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺,以及至多1质量%的三聚氰胺。
原则上,可在宽范围内微调所述固态产物的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。通常,三聚氰酸二酰胺超过三聚氰酸一酰胺。适当地,所述固态产物具有在1-1000范围内,更适当地在2-500范围内的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。
本发明还涉及根据如本文所描述的本发明方法的不同实施方式和/或优选特征的所有可能组合。
本发明参考以下实施例阐明,但是本发明不受这些实施例限制。
实施例
材料和一般方法
1.三聚氰胺底物;参照材料三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸
化学纯度>99.9%的三聚氰胺(购自奥克艾氮有限公司(OCI-Nitrogen))应用于实施例。
化学纯度为97.5%的三聚氰酸二酰胺(购自Hicol公司)用作HPLC分析中的参照材料。
化学纯度为99.7%的三聚氰酸一酰胺用作HPLC分析中的参照材料。
化学纯度>99%的三聚氰酸用作HPLC分析中的参照材料。
2.生物催化剂的制备
2.a.重组酶的克隆和表达
选择来自不同生物体、编码具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶的五种基因来例示本发明;即分别编码SEQ ID NO 5(AAG41202.1)、SEQ ID NO 6(YP_003963954.1)、SEQ ID NO 7(Q52725.2)、SEQ ID NO 8(NP_770520.1)和SEQ ID NO 9(CBJ02579.1)的SEQ ID NO 10(gi_11890745)、SEQ ID NO 11(gi_310815990)、SEQ IDNO 12(gi_4033703)、SEQ ID NO 13(gi_27378991)和SEQ ID NO 14(gi_309703244)(表1)。
表1:酶、供体生物体、登记号以及重组载体的概述。
(*)用于在大肠杆菌中表达
所述五种靶基因中的四种,即SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQID NO 12和SEQ ID NO 13,分别是针对在大肠杆菌中表达而优化的密码对,从而产生SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO4(序列表)。根据在WO2008/000632中描述的工序进行密码对优化。
对于较大规模的表达实验,使用Z-CompetentTM大肠杆菌转化试剂盒(Z-CompetentTM E.coli Transformation Kit)(Zymo Research,Irvine,CA,USA(美国加利福尼亚州欧文的Zymo研究公司))使大肠杆菌RV311细胞成为化学感受态细胞,并用从大肠杆菌TOP10菌株中如上所述分离的pBAD重组载体进行转化。在含有100μg/ml新霉素的LB琼脂平板上选择转化体。从这些平板将含有50μg/mi新霉素的LB培养基中的50ml预培养物在180rpm和28℃的定轨摇床上接种和孵育。孵育过夜后,将预培养物用于接种1L LB表达培养物(在2L带挡板的Erlenmeyer烧瓶中)至起始OD620s为0.05。将这些表达培养物在180rpm和28℃的定轨摇床上孵育。在三分之一的所述培养物中,加入0.02%(w/v)L-阿拉伯糖8h后诱导了三聚氰胺脱氨酶基因表达,并且继续孵育过夜。随后通过以10,000g离心10分钟来收获这些培养物。将另外三分之二的培养物也孵育过夜并且在大约24h后如上所述进行诱导。还分别在4h和8h后,通过离心收获这些培养物。
2.b.生物催化剂的10L规模发酵
使用葡萄糖作为碳源,以补料分批发酵执行表达pBAD重组载体的大肠杆菌RV311的10L规模发酵。
2.c.无细胞提取物提取物的小规模制备(1-10ml)
用pH为7.0、冰冷的100mM磷酸钾缓冲液将细胞团块重悬为其湿重体积的两倍。无细胞提取物(CFE)是通过以下步骤获得的:使用Sonics(Meyrin/Satigny,Switzerland(Meyrin/Satigny公司,瑞士))Vibra-CellVCX130超声波仪(输出100%,10秒开/10秒关,持续10分钟)对细胞悬液进行超声波处理同时在冰/丙酮浴中冷却,然后在Eppendorf 5415R离心机(Hamburg,Germany(德国汉堡))中以13,000x g和4℃进行离心分离30分钟。将上清液(=CFE)转入新试管中,并在冰上储存以供直接使用,或者在-20℃下储存。
2.d.无细胞提取物的较大规模(10-250ml的规模)制备
向76.3g湿细胞(冷冻的)中加入152.6g磷酸钾缓冲液(100mM,pH=7)。将细胞悬浮并置于冰上。然后,加入1125mg溶菌酶和50μL核酸酶,混合并使其在-20℃下过夜。次日早晨将悬浮液置于摇床上的37℃室处达2.25h。然后将悬浮液在冰上冷却并随后分配到8个50ml试管中(每个试管中约28ml),使用Sonics(Meyrin/Satigny公司,瑞士)Vibra-Cell VCX130超声波仪(输出100%,10秒开/10秒关,持续10分钟)对各个悬液进行超声波处理达2分钟同时在冰/丙酮浴中冷却。随后,将悬浮液储存在4℃室处的冰上达4h。接着,将悬浮液以15.000rpm离心15分钟。收集所获得的上清液并储存在-20℃下。
3.蛋白质测定
使用如Bradford(布雷福德)在Anal.Biochem.72:248-254(1976)中所描述的改进的蛋白质染料结合法来测定CFE中的蛋白质浓度。将适当稀释的50μl每种样品与950μl试剂(溶于46ml乙醇和100ml 85%的正磷酸中的100mg Brilliant Blue G250,用Milli-Q水定容至1000ml)一起在室温下孵育至少五分钟。用PerkinElmer Lambda35UV/VIS分光光度计测量各样品在595nm波长处的吸光度。使用利用含有已知浓度的牛血清白蛋白(BSA,在0.0125mg/ml至0.20mg/ml的范围中)的溶液确定的校正线来计算样品中的蛋白质浓度。
4.SDS-PAGE分析
通过大肠杆菌TOP10 CFE和大肠杆菌RV 311 CFE的SDS-PAGE来分析大肠杆菌中的重组表达,并与含有过表达对照蛋白的CFE进行比较。
5.转化反应和产物分离
5.a.转化反应-一般说明
在内含螺旋桨搅拌器的80ml玻璃反应器中或者在内含涡轮搅拌机和pH恒定滴定仪(型号718Stat Titrino,购自瑞士万通公司(Metrohm))的1600ml玻璃反应器中进行转化反应。应用约500rpm的搅拌器转速。
一般说来,转化是如下执行的:在37℃下将一定量的三聚氰胺加入到缓冲液(100mM K2HPO4/1mM MgSO4.7H2O)中以达到期望的负荷。使用1M H3PO4(用于获得7或更低的pH)或者1M NaOH(用于获得8或更高的pH)将pH调节至期望值。随后,加入生物催化剂以开始转化。在转化过程中取样以进行如在第6节中所描述的HPLC分析。
5.b.产物分离
在一定的反应时间后,通过使用真空(约750mbar)将反应混合物倾倒在P3玻璃滤器上,来进行产物分离。用水洗涤滤饼三次。将所获得的产物干燥过夜。
6.HPLC分析
6.a.用于HPLC分析的样品制备
将含水反应混合物的样品或者所分离产物的样品首先用甲酸稀释至总1,3,5-三嗪化合物浓度为约0.5质量%,然后用水稀释50倍,之后再进行HPLC分析。
6.b.HPLC分析方法
使用两个250mm的Prevail C18柱。临界分离发生在0%乙腈处。在梯度洗脱后,将所述柱平衡至少8分钟。
所使用的HPLC的特定分析条件为:
柱:Prevail C18 2x(250mm×4.6mm ID×5m)
洗脱液A:HClO4pH=2.0(1.63g 70%HClO4/l水)
洗脱液B:乙腈
流率:1.2ml/min
进样体积:5μl
柱温:15℃
检测波长:195nm
时间(分) | B% |
0 | 0 |
12 | 0 |
12.5 | 80 |
13.5 | 80 |
14 | 0 |
22 | 停止 |
实施例1:通过在含水反应混合物中进行固体至固体反应来由三聚氰胺制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
在具有约55ml的填充体积、内含搅拌器和pH恒定滴定仪的80ml反应器中进行反应。
对于测试反应,在37℃下将555mg三聚氰加入47g缓冲液(100mMK2HPO4/1mM MgSO4.7H2O)中。用1.65g 1M NaOH将pH调节至pH 9.5。然后,加入0.25ml大肠杆菌RV311pBAD_Meldeam_Aci的无细胞提取物以开始反应,从而获得0.5体积%的无细胞提取物最终浓度。三聚氰胺负荷为1.1质量%。通过用1M NaOH滴定来使pH保持恒定为9.5。
使用如上所述的相同工序平行进行化学空白反应,区别为未加入生物催化剂。使用如上所述的相同工序平行进行生物学空白反应,区别为无细胞提取物是从携带pBAD重组载体的大肠杆菌RV311获得的,所述pBAD重组载体具有编码不能转化三聚氰胺的酶(在这种情况下为来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM3的P450单加氧酶)的基因插入物。
18h的反应时间后,从三种反应混合物中取样进行HPLC分析。结果示出于表2中。
表2:18h反应时间后对反应混合物的HPLC分析
表2中的结果显示:三聚氰胺向三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺的转化是由于生物催化剂(即,大肠杆菌RV311pBAD_Meldeam_Aci的无细胞提取物)的活性。最初加入反应混合物中的三聚氰胺在18h内几乎完全转化为三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺。无三聚氰酸形成。在化学空白反应混合物中未发生明显的三聚氰胺转化,表明在所应用的条件下,在反应时间期间三聚氰胺是化学稳定的。此外,在生物学空白反应混合物中未发生明显的三聚氰胺转化。
实施例2:pH对三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率的影响。
在具有约55ml的填充体积、内含搅拌器和pH恒定滴定仪的80ml反应器中进行转化反应。
在37℃下将555mg三聚氰加入47g缓冲液(100mM K2HPO4/1mMMgSO4.7H2O)中。使用1M H3PO4(用于获得7或更低的pH)或者1MNaOH(用于获得8或更高的pH)将pH调节至期望值。然后,加入0.25ml大肠杆菌RV311pBAD_Meldeam_Aci的无细胞提取物以开始反应,从而获得0.5体积%的无细胞提取物最终浓度。三聚氰胺负荷为1.1质量%通过用1M H3PO4或1M NaOH滴定来使pH保持恒定。随着时间的推移取样进行HPLC分析。在最高转化率处,将固态产物分离并如在“材料和一般方法”中所述进行分析。结果示出于表3中。
表3:最高转化率和所分离固态产物的分析结果
表3中的结果显示:可通过pH来微调反应混合物中所获得的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。在7至10的pH范围内,pH越高,则三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率越高。在pH值低于7处观察到了相反的趋势,其中较高的pH导致较越低的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率。值得注意的是,从未检测到三聚氰酸。
实施例3:三聚氰胺负荷对三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率的影响。
在具有约55ml的填充体积、内含搅拌器和pH恒定滴定仪的80ml反应器中进行转化反应。
在37℃下将三聚氰胺加入47g缓冲液(100mM K2HPO4/lmMMgSO4.7H2O)中,以达到1.1质量%、9质量%或者17.5质量%的负荷。使用1M NaOH将pH调节至9.5。随后,为了开始反应,将大肠杆菌RV311pBAD_Meldeam_Aci的无细胞提取物加入分别达0.5体积%、5体积%、或者10体积%的浓度。通过用1M NaOH滴定来使pH在转化期间保持恒定。随着时间的推移取样进行HPLC分析。在最高转化率处,将固态产物分离并如在“材料和一般方法”中所述进行分析。结果示出于表4中。
表4:最高转化率和所分离固态产物的分析结果
表4中的结果显示:在所选反应条件下,可通过调节三聚氰胺负荷来微调三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率;在所选反应条件下,三聚氰胺负荷越高,则三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率越高。值得注意的是,从未检测到三聚氰酸。
实施例4:通过在含水混合物中进行固体至固体反应来以1L规模制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
通过将125.2g三聚氰胺加入1050ml缓冲液(100mM K2HPO4/1mMMgSO4.7H2O)中,来在搅拌中的1.6L玻璃反应器中制备反应混合物。在37℃下搅拌三聚氰胺固态底物20分钟,然后通过加入0.05g 5M NaOH将pH调节至pH 9.5。为了开始反应,加入62.5ml大肠杆菌RV311pBAD_Meldeam_Aci的无细胞提取物(5体积%),之后通过添加另外0.1g5M NaOH来将pH调节至pH 9.5。三聚氰胺负荷为10.1质量%。在转化期间,通过应用pH恒定滴定仪以1M H3PO4溶液滴定来使pH保持恒定为pH 9.5。取样进行HPLC分析。5h后反应停止,并将固态产物分离和如在“材料和一般方法”中所述进行分析。获得了总共125g产物,其含有98.6质量%的三聚氰酸二酰胺,0.4质量%的三聚氰酸一酰胺和1质量%的三聚氰胺,这对应于99%的转化率。无三聚氰酸形成。
Claims (12)
1.在包含生物催化剂的含水反应混合物中由三聚氰胺制备三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺的方法,其中
-三聚氰胺通过固体至固体反应而转化成三聚氰酸二酰胺;
-所述生物催化剂包含至少一种属于酰胺水解酶超家族并且具有针对1,3,5-三嗪化合物的氨基水解酶活性的酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述酶选自由以下项组成的组:三聚氰胺脱氨酶、均三嗪水解酶、羟基阿特拉津水解酶、鸟嘌呤脱氨酶和西玛三嗪氯水解酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述酶包含由SEQ ID NO5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9所表示的氨基酸序列,或其同源物。
4.根据权利要求1到权利要求3中任一项所述的方法,其中三聚氰胺以相对于所述含水反应混合物的总质量,至少1.0质量%的负荷存在。
5.根据权利要求4所述的方法,其中三聚氰胺以相对于所述含水反应混合物的所述总质量,至少10质量%的负荷存在。
6.根据权利要求5所述的方法,其中三聚氰胺以相对于所述含水反应混合物的所述总质量,至少20质量%的负荷存在。
7.根据权利要求1到权利要求6中任一项所述的方法,其中三聚氰胺在选自5和10之间的pH下转化为三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
8.根据权利要求7所述的方法,其中三聚氰胺在选自6.5和7.5之间的pH下转化为三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
9.根据权利要求7所述的方法,其中三聚氰胺在选择为低于6.5的pH下转化为三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
10.根据权利要求7所述的方法,其中三聚氰胺在选择为高于7.5的pH下转化为三聚氰酸二酰胺和/或三聚氰酸一酰胺。
11.根据权利要求1到权利要求10中任一项所述的方法,其中所述含水反应混合物包括有机溶剂。
12.一种能够通过根据权利要求1到权利要求11中任一项所述的方法获得的产品,其中所述产品包括至少95质量%的三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺以及至多5质量%的三聚氰胺,并且其中所述产品所具有的三聚氰酸二酰胺∶三聚氰酸一酰胺比率在2-500的范围内。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13193770 | 2013-11-21 | ||
EP13193770.8 | 2013-11-21 | ||
PCT/EP2014/074967 WO2015075048A1 (en) | 2013-11-21 | 2014-11-19 | Process for the preparation of ammeline |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105745328A true CN105745328A (zh) | 2016-07-06 |
Family
ID=49596193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480063458.XA Pending CN105745328A (zh) | 2013-11-21 | 2014-11-19 | 制备三聚氰酸二酰胺的方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10590447B2 (zh) |
EP (1) | EP3071701A1 (zh) |
JP (1) | JP6519088B2 (zh) |
KR (1) | KR20160086844A (zh) |
CN (1) | CN105745328A (zh) |
WO (1) | WO2015075048A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018011750A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105745281B (zh) | 2013-11-21 | 2018-03-09 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 阻燃聚酰胺组合物 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001064912A2 (en) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Maxygen, Inc. | Triazine degrading enzymes |
US20110008809A1 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Joseph Francis Krebs | Method and system for enzymatic detection of melamine |
CN102954959A (zh) * | 2011-08-29 | 2013-03-06 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0046344B1 (en) * | 1980-08-19 | 1985-06-19 | Imperial Chemical Industries Plc | Fermentation process |
US4745064A (en) * | 1983-11-04 | 1988-05-17 | Ciba-Geigy Corporation | Process for the degradation of s-triazine derivatives in aqueous solutions |
JP2676099B2 (ja) * | 1988-02-02 | 1997-11-12 | 日本精化株式会社 | 脂肪酸エステルの合成法 |
JP3134037B2 (ja) * | 1995-01-13 | 2001-02-13 | 太陽インキ製造株式会社 | メラミンの有機酸塩を用いた熱硬化性もしくは光硬化性・熱硬化性コーティング組成物 |
US6627086B2 (en) * | 2001-03-21 | 2003-09-30 | Polymer Ventures, Inc. | Methods of producing polyarylamines and using them for detackifying paint and removing color from aqueous systems |
US8323956B2 (en) * | 2001-06-01 | 2012-12-04 | Colorado State University Research Foundation | Distal tip of biosensor transducer comprising enzyme for deamination |
US7704724B1 (en) * | 2006-01-26 | 2010-04-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Catalytic buffering systems |
CN105745281B (zh) | 2013-11-21 | 2018-03-09 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 阻燃聚酰胺组合物 |
-
2014
- 2014-11-19 CN CN201480063458.XA patent/CN105745328A/zh active Pending
- 2014-11-19 WO PCT/EP2014/074967 patent/WO2015075048A1/en active Application Filing
- 2014-11-19 KR KR1020167013229A patent/KR20160086844A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-11-19 EP EP14799784.5A patent/EP3071701A1/en not_active Withdrawn
- 2014-11-19 JP JP2016527311A patent/JP6519088B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-11-19 US US15/033,949 patent/US10590447B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001064912A2 (en) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Maxygen, Inc. | Triazine degrading enzymes |
US20110008809A1 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Joseph Francis Krebs | Method and system for enzymatic detection of melamine |
CN102954959A (zh) * | 2011-08-29 | 2013-03-06 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
ANTHONY G. DODGE 等: "Plasmid Localization and Organization of Melamine Degradation Genes in Rhodococcus sp. Strain Mel", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
JENNIFER L. SEFFERNICK 等: "Bacterial Ammeline Metabolism via Guanine Deaminase", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY,》 * |
JENNIFER L. SEFFERNICK 等: "Melamine Deaminase and Atrazine Chlorohydrolase: 98 Percent Identical but Functionally Different", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
涂追 等: "三聚氰胺脱氨酶基因克隆表达及活性测定", 《食品与生物技术学报》 * |
许迁 等: "三聚氰胺饱和溶解度与温度和 pH值关系研究", 《化学世界》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018011750A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
US11499162B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-11-15 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10590447B2 (en) | 2020-03-17 |
JP6519088B2 (ja) | 2019-05-29 |
WO2015075048A1 (en) | 2015-05-28 |
US20180282775A1 (en) | 2018-10-04 |
JP2016536986A (ja) | 2016-12-01 |
EP3071701A1 (en) | 2016-09-28 |
KR20160086844A (ko) | 2016-07-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Friedrich et al. | Formate and oxalate metabolism in Alcaligenes eutrophus | |
Henne et al. | Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate | |
Monti et al. | Characterization of an industrial biocatalyst: Immobilized glutaryl‐7‐ACA acylase | |
CN105745328A (zh) | 制备三聚氰酸二酰胺的方法 | |
CN108949652B (zh) | 一种工程菌及其生产咖啡酸的应用 | |
CN105745281B (zh) | 阻燃聚酰胺组合物 | |
JP2001037469A (ja) | エピクロロヒドリンの微生物分解 | |
CN109722459B (zh) | 一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法与应用 | |
CN104673734B (zh) | 用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法 | |
EP3653708A1 (en) | Isomaltulose production | |
CN104130967A (zh) | 一株共表达l-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
US10053716B2 (en) | 4-amino cinnamic acid production method using enzyme | |
Yoshida et al. | Production and application of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase by a strain of Plesiomonas | |
Gaur et al. | Immobilization of xylan-degrading enzymes from Scytalidium thermophilum on Eudragit L-100 | |
Trakarnpaiboon et al. | Integrated whole-cell biocatalysis for trehalose production from maltose using permeabilized Pseudomonas monteilii cells and bioremoval of byproduct | |
CN115247158B (zh) | 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用 | |
US7572612B2 (en) | Method of production of para-hydroxycinnamic acid using a thermostable TAL enzyme | |
Peter et al. | Production optimization and partial purification of laccases from bacterial consortium | |
Heydari et al. | Highly stable L-lysine 6-dehydrogenase from the thermophile Geobacillus stearothermophilus isolated from a Japanese hot spring: characterization, gene cloning and sequencing, and expression | |
US8569036B2 (en) | Immobilized TAL biocatalyst for production of para-hydroxycinnamic acid | |
TW201527285A (zh) | 用於製備二胺三聚氰酸之方法 | |
Suzuki et al. | Purification and Properties of Thermostable Tryptophanase from an Obligately Symbiotic Thermophile, Symbiobactevium thermophilum | |
MIYATAKE et al. | Study on Arsenic Methyltransferase Expressed in Recombinant E. coli | |
CN116731989B (zh) | 漆酶突变体、基因工程菌及其应用 | |
JP2007110913A (ja) | 新規インジゴ還元微生物及び当該微生物を用いたインジゴの還元方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160706 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |