KR20160086844A - 아멜린의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물촉매가 포함된 수성 반응 혼합물중에서 고체-대-고체 반응에 의해 멜라민으로부터 아멜린 및/또는 아멜라이드를 제조하는 신규 방법에 관한 것이고, 여기서 생물촉매는 아미드가수분해효소 상과에 속하고 1,3,5-트리아진 화합물에 대해 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 적어도 1종의 효소를 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 생성물에 관한 것이고, 여기서 생성물은 아멜린 및/또는 아멜라이드를 포함한다.

Description

아멜린의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF AMMELINE}

본 발명은 아멜린 및/또는 아멜라이드의 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 생성물에 관한 것이고, 여기서 생성물은 아멜린 및/또는 아멜라이드를 포함한다.

아멜린(4,6-디아미노-2-하이드록시-1,3,5-트리아진) 및 아멜라이드(6-아미노-2,4-디하이드록시-1,3,5-트리아진)는, 예를 들면 US 제4341694호, JP 제55094953호, JP 제59029676호에 언급된 바와 같이 난연성 조성물에 사용하기 위한, 공업적으로 흥미로운 1,3,5-트리아진 화합물이다. 그러나 오늘날 이들은 큰 공업용 규모로 상업적으로 입수가능하지 않다.

수 개의 화학적 경로는 아멜린 및 아멜라이드의 제조를 위해 조사되고 기재되어 있다(E.M. Smolin and L. Rapoport. 2008 Ammelide, Ammeline and Related Compounds. In: Chemistry of heterocyclic compounds: s-Triazines and Derivatives. Volume 13. Chapter 5. p. 269-308). 이러한 합성 경로는 꽤 시간과 노력이 들고 까다롭다. 더욱이, 이들은 비교적 값비싼 출발 물질(예를 들어 디시안디아미드 및 뷰렛(biuret)), 엄격한 반응 조건(200℃ 초과의 온도), 할로겐-포함 화합물, 독성 용매(예를 들어 페놀, 크레졸 또는 자일레놀), 및 용매로부터의 아멜린 및/또는 아멜라이드의 침전 및 회수를 위한 알코올(예를 들어 메탄올)의 첨가를 필요로 한다. 추가적으로, 이들 경로는 종종 조절되지 않은 비율로의 아멜린 및 아멜라이드의 형성, 및 다양한 양의 부산물, 예를 들어 시아누르산의 형성과 조합된 제한된 수율을 유도하고, 세척에 의한 이러한 부산물의 제거는 그의 매우 낮은 용해도에 기인하여 어렵고 고가이다. 따라서, 아멜린 및/또는 아멜라이드에 대한 대안의 경로, 바람직하게는 저렴한 출발 물질, 예컨대 멜라민(2,4,6-트리아미노-1,3,5-트리아진; 또한 sym-트리아미노-트리아진으로 지칭됨)으로부터의 더욱 비용 효과적인 방법이 요구된다.

본 발명의 목적은 상기 언급된 하나 이상의 단점을 극복하고, 특히 높은 수율 및 소량의 부산물을 생성하여 상업적으로 매력적인 방법을 제공하는, 아멜린 및/또는 아멜라이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 아멜린:아멜라이드 비율이 미세-조정될 수 있는 아멜린 및/또는 아멜라이드를 제조하기 위한 신규 방법을 제공하는 것이다.

추가로 본 발명의 목적은 아멜린 및/또는 아멜라이드를 조절된 비율로 포함하는 생성물을 제공하는 것이다.

이들 목적은 멜라민을 생물촉매가 포함된 수성 반응 혼합물중에서 고체-대-고체(solid-to-solid) 반응에 의해 아멜린, 및 임의적으로 아멜라이드로 전환시키고, 생물촉매가 아미드가수분해효소 상과에 속하고 1,3,5-트리아진 화합물에 대해 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 적어도 1종의 효소를 포함하는, 아멜린 및/또는 아멜라이드를 제조하기 위한 방법을 포함하는 본 발명에 따른 방법에 의해 달성되었다.

본 발명에 따른 방법에서, 멜라민은 "고체-대-고체" 반응에 의해 아멜린, 및 임의적으로 아멜라이드로 전환된다. 이는 상기 반응에서 기질 및/또는 생성물의 단지 소량의 비율만이 임의의 시점에 용액으로 존재하는 반면, 기질 및/또는 생성물의 나머지 부분이 고체 상태로 존재함을 의미한다. 출발 고체 멜라민 기질은 점진적으로 용해되고, 아멜린 및/또는 아멜라이드로 전환될 때 용액을 거치고, 이어서 침전된다.

본 발명에 따른 고체-대-고체 반응은 수성 상에 고체 기질 및/또는 생성물 및 생물촉매를 포함하는 "수성 반응 혼합물"에서 실행된다. 상기 수성 상은 액체 상이고, 여기서 주된 용매는 물이다.

본원에 정의된 바와 같은 "생물촉매"는 본 발명에 따른 방법에서 반응 단계(들)를 촉매화하는 생물 자원으로부터 유래된 생물학적 물질 또는 잔기이다. 생물촉매는 주로 임의의 유기체, 예를 들어 미생물, 또는 이들로부터 유래된 생물분자일 수 있다. 이는 특히 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다.

"아미드가수분해효소 상과"는 촉매 도메인에서 폴딩된 트리오스포스페이트 이소머라아제(TIM: triosephosphate isomerase)-유사 배럴(barrel)을 포함하는 "금속-의존성 가수분해효소"의 구조-기반된 무리이다. 이러한 상과의 구성원은 유기 화합물의 C-N 뿐만 아니라 C-C, C-O, C-Cl, C-S 및 O-P 결합의 분열을 촉매화한다(L. Aimin, L. Tingfeng, F. Rong. 2007. Amidohydrolase superfamily. In: Encyclopedia of life sciences 2007).

"1,3,5-트리아진 화합물에 대한 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 효소"는 트리아진 고리중의 탄소 원자 및 아미노 치환기의 N-원자 사이의 C-N 결합의 가수분해에 의해 하나 이상의 아미노 치환기를 하이드록시 치환기로 전환시키는 능력을 갖는 한편 암모니아를 생성하는, 아미노-치환된 1,3,5-트리아진 화합물에 대한 가수분해 활성을 갖는 효소이다(반응식 1).

[반응식 1]

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 바람직하게는 NH₂ 기이다.

"1,3,5-트리아진 화합물에 대한 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 효소"는 이후 "효소"로서도 지칭된다.

선행 기술의 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 방법은 온화한 조건을 필요로 한다. 이 방법은 생물촉매가 활성을 유지하기 위해 수성 상의 존재하에 온화한 온도에서 실행된다. 이 방법은 추가로 독성 용매, 할로겐-포함 화합물 또는 알코올을 사용하지 않으면서 환경 친화적이다. 아멜린 및/또는 아멜라이드는 직접적으로 수성 반응 혼합물에서 침전되고 이들의(이의) 회수는 물을 사용하는 단지 소수의 세척 단계를 필요로 한다. 이 방법의 또 다른 이점은 수율의 손실을 초래하는 부산물, 예를 들어 시아누르산을 형성하지 않고 목적하는 생성물을 생산한다는 것이다. 본 발명에 따른 방법이 선행 기술에 기재된 화학 경로에 비해 더 우수한 수율을 허용할 것으로 예상된다. 멜라민의 아멜린 및/또는 아멜라이드로의 최고 전환율(약 99%까지)이 달성된다. 화학 경로에 비해 우수한 본 발명에 따른 방법의 추가의 이점은 아멜린:아멜라이드 비율을 미세-조정하는 능력이다.

멜라민의 아멜린 및/또는 아멜라이드로의 전환은, 반응되지 않은 기질 및 생물촉매의 존재에도 불구하고 유의적인 반응이 초래되지 않을 경우 그의 "최대 전환"에 도달된 것으로 일컬어 진다.

몇몇 연구는 인간과 동물에서 멜라민 독성에 대한 토양 세균의 기여도를 조사하고, 세균성 멜라민 대사 경로를 확인하였고, 여기서 멜라민은 일련의 탈아민화에 의해 아멜린 및 아멜라이드로 가수분해되는 것으로 보였다. 이들 두개의 탈아민화 단계에 관여된 유전자 및 효소가 식별되었고, 몇몇 경우에, 효소는 정제되고 특징화되었다. 후자는 아미드가수분해효소 상과에 속하는 것으로 밝혀졌다(반응식 2: J.L. Seffernick, A.G. Dodge, M.J. Sadowsky, J.A. Bumpus and L.P. Wackett. 2010. Bacterial ammeline metabolism via guanine deaminase. J. Bacteriology 192(4), 1106-1112; A.G. Dodge, L.P. Wackett, M.J. Sadowsky. 2012. Plasmid localization and organization of melamine degradation genes in Rhodococcus sp. strain Mel. Applied and environmental microbiology 78(5), 1397-1403). 이들 연구는 본 발명의 기술적 분야, 즉 아멜린 및/또는 아멜라이드를 멜라민으로부터 고체-대-고체 반응에 의해 생물촉매가 포함된 수성 반응 혼합물에서 제조하는 방법에 관한 것이 아니고, 세균성 멜라민 대사 경로에서 식별된 효소가 본 발명에 따른 방법에서 적합하게 사용될 수 있음을 지시하지 않았다.

멜라민의 가수분해적 분해 경로로부터의 처음 2개의 단계는 반응식 2에 제시된다. 각각의 단계를 촉매화하는 미생물 효소를 인코딩하는 유전자가 지시된다. triA, trzA, atzB 유전자는 멜라민 탈아미노효소, s-트리아진 가수분해효소 및 하이드록시아트라진 가수분해효소를 각각 인코딩한다. GDA는 구아닌 탈아미노효소의 약자이다. 모든 효소는 아미드가수분해효소 상과의 구성원이다.

[반응식 2]

본 발명에 따라서, 멜라민은 아멜린, 및 임의적으로 아멜라이드로 "고체-대-고체" 반응에 의해 생물촉매가 포함된 수성 반응 혼합물에서 전환된다. 반응 매개변수(예를 들어 생물촉매, 수성 상, 혼합, pH, 온도 또는 기질 적재량)는 반응을 최적화하고 원하는 생성물을 수득하기 위해 다양할 수 있다.

본 발명에 따른 생물촉매는 임의의 형태로 사용될 수 있다. 생물촉매는 예를 들면 (부분적으로) 정제된 효소, 동결건조된 효소 분말, 고정화된 효소, 전세포(예를 들어 투과성화됨, 동결건조됨), 고정화된 전세포, 세포 용해물 또는 무세포 추출액의 형태로 사용될 수 있다.

천연 발생 생물촉매(야생형) 또는 본 발명의 방법에 따른 방법에서 적합한 활성을 갖는 천연 발생 생물촉매의 돌연변이체를 사용할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 천연 발생 생물촉매의 특성은 숙련가에게 공지된 생물학적 기법, 예컨대 분자 진화 또는 합리적 고안에 의해 개선될 수 있다. 야생형 생물촉매의 돌연변이체는 예를 들면 생물촉매로서 작용할 수 있거나 생물촉매 잔기(예를 들어 효소)를 생산할 수 있는 유기체의 인코딩 DNA를 숙련가에게 공지된 돌연변이생성 기법(예를 들어 무작위 돌연변이생성, 부위-특이적 돌연변이생성, 유도 진화, 유전자 재조합)을 사용하여 개질시킴으로써 만들어질 수 있다. 특히, DNA는, 이것이 야생형 효소로부터 적어도 하나의 아미노산이 상이한 효소를 인코딩하도록, 이것이 야생형과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 효소를 인코딩하도록, 또는 돌연변이체가 둘 이상의 모 효소의 서열을 조합하도록, 또는 적합한 (숙주) 세포에서 이렇게 개질된 DNA의 발현에 영향을 줌으로써 개질될 수 있다. 후자는 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들어 WO 제2008/000632호에 기재된 방법에 기초하는, 예컨대 코돈 쌍 최적화에 의해 달성될 수 있다.

돌연변이체 생물촉매는 예를 들어 하나 이상의 하기 양상과 관련하여 개선된 특성을 가질 수 있다: 기질에 대한 선택성, 활성, 안정성, 내용매성, pH 프로파일, 온도 프로파일, 기질 프로파일, 저해에 대한 감수성, 보조인자 활용성 및 기질-친화도. 개선된 특성을 갖는 돌연변이체는, 예를 들어 숙련가에게 공지된 이러한 방법에 기초한 적합한 높은 처리량의 선별 또는 선택 방법을 적용함으로써 식별될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 반응 단계(들)를 촉매화하기 위한 하나 이상의 효소를 포함하는 세포, 특히 재조합 세포는 그 자체로 당분야에 공지된 분자 생물 기법을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 외래성 효소가 재조합 세포에서 생산되어야 한다면, 이러한 기법은 하나 이상의 상기 외래성 효소를 인코딩하는 하나 이상의 외래성 유전자를 포함하는 벡터(예를 들어 재조합 벡터)를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 벡터가 사용될 수 있고, 각각은 하나 이상의 이러한 외래성 유전자를 포함한다. 이러한 벡터는 하나 이상의 규칙적인 요소, 예를 들어 하나 이상의 프로모터(promoter)를 포함할 수 있고, 이는 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)에 작동적으로 연결될 수 있다.

용어 "외래성"은 본원에 사용될 경우 생물분자(예를 들어 DNA, RNA, 단백질)가 숙주 세포내로 도입됨을 의미하려는 것이다. 생물분자는, 예를 들면, 숙주 세포내로 도입된 후 동종성(또는 이종성) 단백질을 인코딩하는 동종성(또는 이종성) 핵산일 수 있다. 용어 "이종성"은 숙주 세포 이외의 공여자 공급원으로부터 단리된 생물분자를 지칭하는 반면, 용어 "동종성"은 숙주 세포로부터 단리된 생물분자를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 인코딩 핵산의 외래성 발현은 이종성 또는 동종성 인코딩 핵산중 하나 또는 이들 둘 다를 이용할 수 있다.

본 발명자들이 발견한 바와 같이, 아미드가수분해효소 상과에 속하고 1,3,5-트리아진 화합물(본 발명에 따른 방법에 사용될 경우)에 대한 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 효소는, 멜라민 탈아미노효소(또한 멜라민 아미드가수분해효소로서 지칭됨), s-트리아진 가수분해효소(또한 N-에틸아멜린 클로로가수분해효소로서 지칭됨), 하이드록시아트라진 가수분해효소(또한 아트라진 클로로가수분해효소로서 지칭됨), 구아닌 탈아미노효소(또한 구아닌 아미드가수분해효소로서 지칭됨) 및 시마진 클로로가수분해효소로 구성된 군에서 선택된 임의의 적합한 효소일 수 있다(즉, 1,3,5-트리아진 화합물에 대해 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 것으로 확인될 수 있다면 그 효소는 적합하다).

하나의 실시태양에서, 적합한 멜라민 탈아미노효소는 아시도보락스(Acidovorax), 케토굴로니시게늄(Ketogulonicigenium), 슈도모나스(Pseudomonas), 고르도니아(Gordonia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 클레브시엘라(Klebsiella), 윌리암시아(Williamsia), 노카르디아(Nocardia), 아르트로박터(Arthrobacter), 네스테렌코니아(Nesterenkonia), 코쿠리아(Kocuria), 더마코쿠스(Dermacoccus), 카이토코쿠스(Kytococcus) 및 엔테로박터(Enterobacter)로부터 기원된 멜라민 탈아미노효소로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 멜라민 탈아미노효소는 아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulii)(이전에 슈도모나스 시트룰리(Pseudomonas citrulii)로서 지칭됨), 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae) 하위종 시트룰리(이전에 슈도모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes) 하위종 시트룰리로서 지칭됨), 케토굴로니시게늄 불가레(Ketogulonicigenium vulgare), 고르도니아 루브리페르틴크투스(Gordonia rubripertinctus)(또한 고르도나 루브리페르틴크타(Gordona rubripertincta)로서 지칭됨; 로도코쿠스 코랄리누스(Rhodococcus corallinus)의 동의어), 클레브시엘라 테라게나(Klebsiella terragena) 또는 마이크로코쿠스 종 균주 MF-1로부터 기원될 수 있다. 더욱 특히, 상기 멜라민 탈아미노효소는 아시도보락스 시트룰리 NRRL B-12227 또는 케토굴로니시게늄 불가레 Y25로부터 기원될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 적합한 s-트리아진 가수분해효소는 고르도니아, 로도코쿠스, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 아비오트로피아(Abiotrophia), 락토코쿠스(Lactococcus), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 게말라(Gemalla), 아토포비움(Atopobium), 스트렙토베르티실리움(Streptoverticillium), 악티노플라네스(Actinoplanes), 키타사토스포라(Kitasatospora), 차이니아(Chainia) 및 악티노스포란기움(Actinosporangium)으로부터 기원된 s-트리아진 가수분해효소로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 적합한 s-트리아진 가수분해효소는 특히 고르도니아 루브리페르틴크투스(또한 고르도나 루브리페르틴크타로서 지칭됨; 로도코쿠스 코랄리누스의 동의어)로부터 선택될 수 있고, 더욱 특히 로도코쿠스 코랄리누스 NRRL B-15444R로부터 선택될 수 있다.

추가의 실시태양에서, 적합한 하이드록시아트라진 가수분해효소는 아르트로박터(Arthrobacter), 베타 프로테오박테리움(Beta proteobacterium), 슈도모나스, 아미노박터(Aminobacter), 마이크로코쿠스, 아우레오박테리움(Aureobacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 로도코쿠스, 브레비박테리움(Brevibacterium), 노카르디오이데스(Nocardioides), 테라박터(Terrabacter), 코마모나스(Comamonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 브레분디모나스(Brevundimonas), 보게셀라(Vogesella), 델레야(deleya), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum), 하이드로게노파가(Hydrogenophaga) 또는 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)로부터 기원될 수 있다. 특히, 적합한 하이드록시아트라진 가수분해효소는 슈도모나스 종 ADP 또는 아미노박터 아미노보란스(Aminobacter aminovorans)로부터 기원될 수 있다.

역시 추가의 실시태양에서, 적합한 구아닌 탈아미노효소는 브라디리조븀(Bradyrhizobium), 에스케리치아(Escherichia), 리조븀(Rhizobium) 및 레클레르시아(Leclercia)로부터 기원된 구아닌 탈아미노효소로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 구아닌 탈아미노효소는 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) 또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 기원될 수 있다. 더욱 특히, 상기 탈아미노효소는 브라디리조븀 자포니쿰 USDA 110 또는 에스케리치아 콜라이 ETEC H10407로부터 기원될 수 있다.

역시 추가의 실시태양에서, 적합한 시마진 클로로가수분해효소는 헤르바스피릴룸으로부터 기원된 시마진 클로로가수분해효소로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 시마진 클로로가수분해효소는 헤르바스피릴룸 종 B601로부터 기원될 수 있다.

특정 실시태양에서, 아미드가수분해효소 상과에 속하고 1,3,5-트리아진 화합물에 대해 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 효소는 서열 번호 5(AAG41202.1), 서열 번호 6(YP_003963954.1), 서열 번호 7(Q52725.2), 서열 번호 8(NP_770520.1) 및 서열 번호 9(CBJ02579.1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 동족체를 포함한다.

"동족체"는 특히 그의 기준 단백질(즉, 서열 번호 5, 6, 7, 8 또는 9)과 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 더욱 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 대해 본원에서 사용된다. 동족체는 일반적으로 그의 기준 단백질에 대해 기능적 및 바람직하게는, 또한 구조적 유사성을 갖는 폴리펩타이드이다. 동족체의 하나의 유형은 동일한 속의 또 다른 종으로부터, 또는 심지어 다른 속으로부터의 유전자에 의해 인코딩된다. "동족체"는 또한 단백질의 원하는 특성을 개선시키기 위해 수행되어진 돌연변이생성 기법에 의해 변경된 이들 단백질을 포함하고자 한다.

서열 동일성은 본원에서 서열을 비교함으로써 결정될 경우 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 핵산 서열 사이의 관계로서 정의된다. 대체적으로, 서열 동일성은 서열의 전체 길이에 대해 비교되지만, 또한 서로 정렬하는 서열의 일부에 대해서만 비교될 수 있다. 당분야에서, "동일성"은, 경우에 따라, 서열 사이의 부합성에 의해 결정될 경우, 폴리펩타이드 서열 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 또한 의미한다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이의 가장 큰 부합성을 제공하도록 고안된다. 본 발명과 관련하여, 두 서열 사이의 동일성을 결정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 BLASTP 및 BLASTN(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410, publicly available from NCBI) 및 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)을 포함한다. BLASTP를 사용하는 폴리펩타이드 서열 비교를 위한 바람직한 매개변수는 갭 개방 10.0, 갭 연장 0.5, 블로섬(Blosum) 62 매트릭스이다. BLASTN을 사용하는 핵산 서열 비교를 위한 바람직한 매개변수는 갭 개방 10.0, 갭 연장 0.5, DNA 완전 매트릭스(DNA 동일성 매트릭스)이다.

본 발명의 방법에서 수성 상은 액체 상이고, 여기서 주된 용매는 물이다. 수성 상은 단지 물로만 이루어지거나, 물 및 완충 염/완충 염들의 혼합물을 포함하는 완충액(예를 들어 인산 칼륨 완충액), 물과 유기 용매(예를 들어 에틸렌 글리콜, DMSO, THF)의 혼합물 또는 완충액과 유기 용매(예를 들어 에틸렌 글리콜, DMSO, THF)의 혼합물일 수 있다. 숙련가라면 생물촉매의 유효한 활성을 위한 수성 상을 선택하고 최적화할 수 있을 것이다.

고체-대-고체 반응의 성질에 기인하여, 수성 반응 혼합물의 효과적인 혼합은 반응 성분의 양호한 수송 및 접촉을 제공하고 입자의 침강을 방지하는데에 중요하다. 숙련가라면 상업적으로 이용가능한 기법을 사용하여 정확한 혼합기 고안 및 혼합 조건을 선택할 수 있을 것이다. 효율적인 혼합은 예를 들어 방사상 펌핑 교반기에 의해 실행될 수 있는 반면, 입자 침강은 반응 용기의 바닥으로 아래로 펌핑하는 축방향 교반기에 의해 방지될 수 있다. 축방향 펌핑 임펠러로서 좁은 날 수중익(narrow blade hydrofoil)이 최신 기술로서 사용된다. 전통적으로 표준 임펠러로서 경사진 날을 갖는 터빈이 사용된다. 프로펠러는 또한 중심밖 위치에서 사용될 수 있다. 중심에 있는 임펠러를 사용할 경우, 배플링(baffling)이 적용되어 임펠러의 원하는 패턴으로 흐름 소용돌이를 바꿀 수 있다. 수성 반응 혼합물을 위부 루프를 통해 펌핑함으로써 혼합을 제공하는 것은 또한 선택사항이다. 놀랍게도 본 발명에 따른 방법에 사용된 효소는 혼합 및 용해되지 않은 고체의 존재에 기인하여 발생하는 수력 전단력을 견뎌내는 것으로 밝혀졌다.

원칙적으로, 반응 매질의 pH는, 생물촉매가 적용된 pH 조건하에 활성인 한, 넓은 제한 범위 내에서 선택될 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 적합하게는 4 내지 11, 바람직하게는 5 내지 10이다. A 및 B 사이에 선택된 pH, A 내지 B 범위의 pH 또는 A 내지 B의 pH 범위는 종점 A 및 B를 포함한다.

본 발명자들은 놀랍게도 pH가 아멜린:아멜라이드 비율에 상당한 영향을 미치는 것을 발견하였다. 실시예 2 및 표 3은 이러한 영향을 보여준다. 7 내지 10의 pH 범위내에서 적용된 조건하에, 더 높은 pH는 더 높은 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 특히, pH 7, 8, 9, 9.5 및 10은 각각 3.5(75.2 몰% 아멜린, 21.2 몰% 아멜라이드), 14.3(90.0 몰% 아멜린, 6.3 몰% 아멜라이드), 56.8(96.5 몰% 아멜린, 1.7 몰% 아멜라이드), 108.8(97.9 몰% 아멜린, 0.9 몰% 아멜라이드) 및 164(98.4 몰% 아멜린, 0.6 몰% 아멜라이드)의 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 반대 경향이 7 미만의 pH 값에서 관찰되었고, 여기서 더 높은 pH는 더 낮은 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 특히, 아멜린:아멜라이드 비율은 pH 5 및 6에서 각각 18.3(91.5 몰% 아멜린, 5.0 몰% 아멜라이드) 및 8.8(86.9 몰% 아멜린, 9.9 몰% 아멜라이드)이었다. 달리 말하면, 6.5 내지 7.5 범위의 pH 내에서 적용된 조건하에, 높은 아멜라이드 함량을 갖는 생성물이 수득된 반면, 6.5 미만, 바람직하게는 6 미만의 pH 또는 7.5 초과, 바람직하게는 8 초과의 pH에서 높은 아멜린 함량을 갖는 생성물이 형성되었다. pH는 따라서 아멜린:아멜라이드 비율을 미세-조정하기 위한 중요한 매개변수로서 확인되었다.

원칙적으로, 사용된 반응 매질의 온도는, 생물촉매가 적용된 온도 조건하에 활성으로 남아있는 한, 넓은 제한 범위 내에서 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 반응 온도는 정상적으로 0 내지 100℃, 바람직하게는 10 내지 60℃이다.

본 발명에 따른 방법에서, 멜라민 기질은 본 발명에서 선택되는 온도 및 pH 범위내에서 고체를 형성하도록 포화 이상의 적재량으로 수성 반응 혼합물에 첨가된다. 멜라민이 선택된 반응 조건에서 고체를 형성하는 멜라민 적재량은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 의미하는 바와 같이, 용어 "적재량"은 수성 반응 혼합물의 총 질량에 대한 반응 혼합물에 초기에 첨가되는 멜라민의 총 질량이다. 멜라민 적재량은 질량 백분율(질량%)로 표시된다.

"포화"는 멜라민의 용액이 멜라민의 임의의 추가량을 더 이상 용해시킬 수 없고 이러한 추가량의 멜라민이 고체로서 나타날 최대 적재량의 지점으로서 본원에 정의된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 멜라민은 수성 반응 혼합물의 총 질량에 대하여 적어도 1.0 질량%, 바람직하게는 적어도 10 질량%, 더욱 바람직하게는 적어도 15 질량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 20 질량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30 질량%의 적재량으로 존재한다.

본 발명자들은 놀랍게도 기질 적재량이 최종 생성물의 조성에 상당한 영향을 미치는 것을 발견하였고, 여기서 더 높은 멜라민 적재량은 더 높은 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 실시예 3 및 표 4는 이러한 효과를 보여준다. 적용된 조건하에서, 약 1 질량%, 9 질량% 및 17.5 질량%의 초기 멜라민 적재량은 각각 108.8(97.9 몰% 아멜린, 0.9 몰% 아멜라이드), 329.7(98.9 몰% 아멜린, 0.3 몰% 아멜라이드), 494(98.8 몰% 아멜린, 0.2 몰% 아멜라이드)의 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 따라서 멜라민 적재량은 아멜린:아멜라이드 비율을 미세 조정하기 위한 또 다른 중요한 매개변수로서 확인되었다.

고체-대-고체 반응이 허용가능한 전환 수준으로 진행된 이후, 고체 생성물은 종래의 방법에 의해(예를 들어 여과에 의해, 원심분리에 의해, 또는 경사 원심분리를 적용함으로써) 수성 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 후속적으로, 단리된 생성물은 잔여 멜라민 기질의 제거를 위해 물로 세척될 수 있다. 아멜린:아멜라이드 비율은 이들 세척 단계에 의해 영향받지 않는다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 고체 생성물은 높은 아멜린 및/또는 아멜라이드 함량 및 낮은 수준의 잔여 멜라민을 갖는다. 적합하게는 생성물은 적어도 95 질량%의 아멜린 및/또는 아멜라이드 및 많아도 5 질량%의 멜라민을 포함한다. 바람직하게는, 생성물은 적어도 98 질량%의 아멜린 및/또는 아멜라이드 및 많아도 2 질량%의 멜라민을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 생성물은 적어도 99 질량%의 아멜린 및/또는 아멜라이드 및 많아도 1 질량%의 멜라민을 포함한다.

원칙적으로, 고체 생성물의 아멜린:아멜라이드 비율은 넓은 범위내에서 미세-조정될 수 있다. 전형적으로, 아멜린은 아멜라이드의 과량으로 존재한다. 적합하게는, 고체 생성물은 1 내지 1000의 범위, 보다 적절하게는 2 내지 500의 범위의 아멜린:아멜라이드 비율을 갖는다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 발명의 방법에 따른 바람직한 특징 및/또는 상이한 실시태양의 모든 가능한 조합에 관한 것이다.

본 발명은 하기 실시예를 참고하여 자세히 설명되지만, 이들에 의해 제한되지 않는다.

실시예

재료 및 일반적 방법

1. 멜라민 기질; 기준 물질 아멜린, 아멜라이드 및 시아누르산

99.9% 초과의 화학 순도를 갖는 멜라민[OCI-니트로겐(OCI-Nitrogen) 제품]을 실시예에 적용하였다.

97.5%의 화학 순도를 갖는 아멜린[히콜(Hicol) 제품]을 HPLC 분석에서 기준 물질로서 사용하였다.

99.7%의 화학 순도를 갖는 아멜라이드를 HPLC 분석에서 기준 물질로서 사용하였다.

99% 초과의 화학 순도를 갖는 시아누르산을 HPLC 분석에서 기준 물질로서 사용하였다.

2. 생물촉매의 제조

2.a. 재조합 효소의 클로닝 및 발현

본 발명을 예시하기 위해 1,3,5-트리아진 화합물에 대해 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 상이한 유기체로부터 5가지 유전자를 선택하였다; 즉, 서열 번호 5(AAG41202.1), 서열 번호 6(YP_003963954.1), 서열 번호 7(Q52725.2), 서열 번호 8(NP_770520.1) 및 서열 번호 9(CBJ02579.1)를 각각 인코딩하는 서열 번호 10(gi_11890745), 서열 번호 11(gi_310815990), 서열 번호 12(gi_4033703), 서열 번호 13(gi_27378991) 및 서열 번호 14(gi_309703244)(표 1).

[표 1]

효소, 공여자 유기체, 수탁 번호 및 재조합 벡터에 대한 개요

5개의 표적 유전자중 4개, 즉, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12 및 서열 번호 13은 에스케리치아 콜라이에서 발현을 위해 코돈 쌍 최적화되어, 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 생성하였다(염기 서열). 코돈 쌍 최적화를 WO 제2008/000632호에 기재된 절차에 따라 수행하였다.

더 큰 규모의 발현 실험을 위해, Z-컴피턴트(Z-Competent: 등록상표) 에스케리치아 콜라이 형질전환 키트[자이모 리써치(Zymo Research), 미국 캘리포니아주 어바인 소재]를 사용하여 에스케리치아 콜라이 RV311 세포를 화학적으로 형질전환가능하게 만들고, 상기 기재된 바와 같이 에스케리치아 콜라이 TOP10 균주로부터 단리된 pBAD 재조합 벡터로 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 네오마이신이 포함된 LB 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 이들 플레이트로부터 50 ㎍/㎖의 네오마이신이 포함된 LB 배지중 50 ㎖의 예비배양액을 접종하고 회전 진탕기 상에서 180 rpm 및 28℃에서 항온처리하였다. 하룻밤 접종 후, 예비배양액을 사용하여 1 ℓ의 LB 발현 배양액을 접종하여(2 ℓ 들이 배플 엘렌메이어 플라스크(baffled Erlenmeyer flasks)에서) 0.05의 OD₆₂₀을 시작하였다. 이들 발현 배양액을 회전 진탕기 상에서 180 rpm 및 28℃에서 항온처리하였다. 배양액의 1/3에서, 0.02%(w/v) L-아라비노오스의 첨가에 의해 8 시간 이후 멜라민 탈아미노효소 유전자 발현을 유도하였고, 항온처리를 하룻밤 지속하였다. 후속적으로 이들 배양액을 10,000 g에서 10 분 동안 원심분리하여 수확하였다. 배양액의 나머지 2/3를 또한 하룻밤 접종하고 대략 24 시간 이후 상기 기재된 바와 같이 유도하였다. 각각 4 내지 8 시간 후, 또한 이들 배양액을 원심분리에 의해 수확하였다.

2.b. 10 ℓ 규모로의 생물촉매의 발효

pBAD 재조합 벡터를 발현하는 에스케리치아 콜라이 RV311의 발효는 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용하여 10 ℓ 규모로 유가식(fed-batch) 발효로 수행하였다.

2.c. 소규모(1 내지 10 ㎖)로의 무세포 추출액의 제조

세포 펠릿을 그의 습윤 중량의 2배 부피로 빙냉 100 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 재현탁시켰다. 얼음/아세톤 욕조에서 냉각시키면서 소닉스(Sonics)(스위스 메이린/사티그니 소재) 비브라-셀(Vibra-Cell) VCX130 초음파 분쇄기(sonifier)(출력 100%, 10 초 켜짐/10 초 꺼짐, 10 분 동안)에 의해 초음파처리하고 에펜도르프(Eppendorf) 5415R 원심분리기(독일 함부르그 소재)에서 13,000 × g 및 4℃하에 30 분 동안 후속적으로 원심분리함으로써 무세포 추출액(CFE)을 수득하였다. 상청액(=CFE)을 새로운 튜브에 옮기고, 즉시 사용하기 위해 얼음 상에서 저장하거나 -20℃에서 저장하였다.

2.d. 더 큰 규모(10 내지 250 ㎖ 규모)로의 무세포 추출액의 제조

76.3 g의 습윤 세포(동결됨)에, 152.6 g의 인산 칼륨 완충액(100 mM pH=7)을 첨가하였다. 세포를 현탁시키고 얼음 위에 놓았다. 후속적으로, 1125 mg의 라이소자임 및 50 ㎕의 벤조나아제(benzonase)를 첨가하고, 혼합하고, -20℃에서 하룻밤 놓아 두었다. 다음날 아침, 현탁액을 37℃ 방에서 진탕기 상에 2.25 시간 동안 놓아 두었다. 이후 현탁액을 얼음 위에서 냉각시키고 후속적으로 8개의 50 ㎖ 튜브에 나누고(각각 대략 28 ㎖), 각각의 현탁액을 얼음/아세톤 욕조에서 냉각시키면서 2 분 동안 소닉스(스위스 메이린/사티그니 소재) 비브라-셀 VCX130 초음파 분쇄기(출력 100%, 10 초 켜짐/10 초 꺼짐, 10 분 동안)에 의해 초음파처리하였다.

3. 단백질 결정

문헌[Bradford in Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)]에 기재된 바와 같은 변형된 단백질-염료 결합 방법을 사용하여 CFE중 단백질 농도를 결정하였다. 각각의 샘플중, 적절한 희석액중 50 ㎕를 950 ㎕의 시약[46 ㎖의 에탄올 및 100 ㎖의 85% 오르토-인산에 용해되고, 밀리-Q 워터(Milli-Q water)에 의해 1,000 ㎖로 채워진 100 mg의 브릴리언트 블루(Brilliant Blue) G250]과 함께 적어도 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 595 nm의 파장에서 각각의 샘플에 대한 흡광도를 퍼킨엘머 람다(PerkinElmer Lambda)35 UV/VIS 분광광도계에서 측정하였다. 공지된 농도의 소 혈청 알부민(BSA, 0.0125 mg/㎖ 내지 0.20 mg/㎖의 범위)을 포함하는 용액으로 결정된 검량선을 사용하여, 샘플중 단백질 농도를 계산하였다.

4. SDS-PAGE 분석

에스케리치아 콜라이에서의 재조합 발현을 에스케리치아 콜라이 TOP10 CFE 및 에스케리치아 콜라이 RV 311 CFE의 SDS-PAGE에 의해 분석하고 CFE를 과발현된 대조 단백질과 비교하였다.

5. 전환 반응 및 생성물 단리

5.a. 전환 반응 - 일반적 설명

프로펠러 교반기가 포함된 80 ㎖ 들이 유리 반응기에서 또는 터빈 교반기 및 pH-고정 장비[메트롬(Metrohm)으로부터의 타입 718 스타트 티트리노(Stat Titrino)]가 포함된 1600 ㎖ 들이 유리 반응기에서 전환 반응을 수행하였다. 약 500 rpm의 교반기 속도를 적용하였다.

일반적으로, 전환을 다음과 같이 수행하였다: 특정량의 멜라민을 완충액(100 mM K₂HP0₄/1 mM MgS0₄·7H₂0)에 37℃에서 첨가하여 원하는 적재량을 도달시켰다. 1 M H₃P0₄(pH 7 이하를 수득하기 위함) 또는 1 M NaOH(pH 8 이상을 수득하기 위함)를 사용하여 pH를 원하는 값으로 조정하였다. 후속적으로, 생물촉매를 첨가하여 전환을 개시하였다. 문단 6에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 위해 전환 과정중에 샘플을 채취하였다.

5.b. 생성물 단리

특정 반응 시간 이후 진공(약 750 mbar)을 사용하여 반응 혼합물을 P3 유리 필터 위에 부음으로써 생성물 단리를 수행하였다. 여과 케이크를 물로 3회 세척하였다. 수득된 생성물을 하룻밤 건조시켰다.

6. HPLC 분석

6.a. HPLC-분석용 샘플 제조

수성 반응 혼합물의 샘플 또는 단리된 생성물의 샘플을 첫번째 경우에 약 0.5 질량%의 총 1,3,5-트리아진 화합물 농도로 폼산으로 희석시키고, 후속적으로 HPLC 분석을 수행하기 전에 물로 50배 희석시켰다.

6.b. HPLC 분석 방법

2개의 250 mm 프리베일(Prevail) C18 칼럼을 사용하였다. 임계 분리가 0% 아세토니트릴에서 발생하였다. 칼럼을 구배 이후 적어도 8 분 동안 평형화시켰다.

사용된 HPLC 상에서의 특정 분석 조건은 다음과 같다:

칼럼: 프리베일 C18 2×(250 mm × 4.6 mm ID × 5 □m)

용리액 A : HCl0₄ pH = 2.0(1.63 g 70% HClO₄/ℓ 물)

용리액 B : 아세토니트릴

유속: 1.2 ㎖/분

주입 부피: 5 ㎕

칼럼 온도: 15℃

검출 파장: 195 nm

실시예 1: 수성 반응 혼합물중에서의 고체-대-고체 반응에 의한 멜라민으로부터의 아멜린 및/또는 아멜라이드의 제조

교반기 및 pH-고정 장비가 포함된, 약 55 ㎖의 충전 부피를 갖는 80 ㎖ 반응기에서 반응을 수행하였다.

시험 반응을 위해서, 555 mg의 멜라민을 47 g의 완충액(100 mM K₂HP0₄/1 mM MgS0₄·7H₂0)에 37℃에서 첨가하였다. pH를 1.65 g의 1 M NaOH에 의해 pH 9.5로 조정하였다. 후속적으로, 에스케리치아 콜라이 RV311 pBAD_Meldeam_Aci의 무세포 추출액 0.25 ㎖를 첨가하여 반응을 개시하고, 이로써 0.5 부피%의 무세포 추출액의 최종 농도를 수득하였다. 멜라민 적재량은 1.1 질량%였다. 1 M NaOH로 적정하여 pH를 9.5에서 일정하게 유지시켰다.

생물촉매를 첨가하지 않음을 제외하고, 상기 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 화학적 바탕 반응(blank reaction)을 동시에 실행하였다. 멜라민을 전환시킬 수 없는 효소(이 경우 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) BM3으로부터의 P450 일산소첨가효소)를 인코딩하는 유전자 삽입물을 갖는 pBAD 재조합 벡터가 함유된 에스케리치아 콜라이 RV311로부터 무세포 추출액을 수득함을 제외하고, 상기 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 생물학적 바탕 반응을 동시에 실행하였다.

18 시간의 반응 시간 후, HPLC 분석을 위해 3개의 반응 혼합물로부터 샘플을 채취하였다. 결과는 표 2에 제시된다.

[표 2]

18 시간의 반응 시간 후 반응 혼합물에 대한 HPLC 분석

표 2의 결과로부터, 멜라민의 아멜린 및 아멜라이드로의 전환이 생물촉매(즉, 에스케리치아 콜라이 RV311 pBAD_Meldeam_Aci의 무세포 추출액)의 활성에 기인함을 알 수 있다. 반응 혼합물에 초기에 첨가된 멜라민은 18 시간 이내에 아멜린 및 아멜라이드로 거의 완전히 전환된다. 시아누르산은 형성되지 않았다. 멜라민의 유의적인 전환이 화학적 바탕 반응 혼합물에서 전혀 발생되지 않았고, 이는 멜라민이 적용된 조건하에 반응 시간 동안 화학적으로 안정함을 보여준다. 더욱이, 멜라민의 유의적인 전환이 생물학적 바탕 반응 혼합물에서 전혀 발생되지 않았다.

실시예 2: 아멜린:아멜라이드 비율에 대한 pH의 영향

교반기 및 pH-고정 장비가 포함되고 약 55 ㎖의 충전 부피를 갖는 80 ㎖ 들이 반응기에서 전환 반응을 수행하였다. 555 mg의 멜라민을 47 g의 완충액(100 mM K₂HP0₄/1 mM MgS0₄·7H₂0)에 37℃에서 첨가하였다. 1 M H₃P0₄(7 이하의 pH를 수득하기 위해) 또는 1 M NaOH(8 이상의 pH를 수득하기 위해)를 사용하여 pH를 원하는 값으로 조정하였다. 후속적으로, 에스케리치아 콜라이 RV311 pBAD_Meldeam_Aci의 무세포 추출액 0.25 ㎖를 첨가하여 반응을 개시하였고, 이로써 0.5 부피%의 무세포 추출액의 최종 농도를 수득하였다. 멜라민 적재량은 1.1 질량%였다. 1 M H₃P0₄ 또는 1 M NaOH로 적정하여 pH를 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석을 위해 샘플을 시간이 지남에 따라 채취하였다. 최대 전환율에서, 고체 생성물을 "재료 및 일반적 방법"에 기재된 바와 같이 단리하고 분석하였다. 결과는 표 3에 제시된다.

[표 3]

단리된 고체 생성물의 최대 전환율 및 분석 결과

표 3의 결과로부터 반응 혼합물에서 수득된 아멜린:아멜라이드 비율이 pH에 의해 미세 조정될 수 있음을 알 수 있다. 7 내지 10의 pH 범위내에서, pH가 높을 수록 아멜린:아멜라이드 비율이 더 높다. 반대 경향이 7 미만의 pH 값에서 관찰되었고, 여기서 더 높은 pH는 더 낮은 아멜린:아멜라이드 비율을 생성하였다. 시아누르산이 결코 검출되지 않았음이 주목할만 하다.

실시예 3: 아멜린:아멜라이드 비율에 대한 멜라민의 적재량 영향

교반기 및 pH-고정 장비가 포함되고 약 55 ㎖의 충전 부피를 갖는 80 ㎖ 들이 반응기에서 전환 반응을 수행하였다.

멜라민을 47 g의 완충액(100 mM K₂HP0₄/1 mM MgS0₄·7H₂0)에 37℃에서 1.1 질량%, 9 질량% 또는 17.5 질량%의 적재량으로 첨가하였다. 1 M NaOH를 사용하여 pH를 9.5로 조정하였다. 후속적으로, 반응을 개시하기 위해 에스케리치아 콜라이 RV311 pBAD_Meldeam_Aci의 무세포 추출액을 각각 0.5 부피%, 5 부피% 또는 10 부피%의 농도로 첨가하였다. 1 M NaOH로 적정함으로써 전환 동안 pH를 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석을 위해 샘플을 시간이 지남에 따라 채취하였다. 최대 전환율에서, 고체 생성물을 "재료 및 일반적 방법"에 기재된 바와 같이 단리하고 분석하였다. 결과는 표 4에 제시된다.

[표 4]

단리된 고체 생성물의 최대 전환율 및 분석 결과

표 4의 결과로부터 선택된 반응 조건에서 아멜린:아멜라이드 비율은 멜라민 적재량에 의해 미세 조정될 수 있고; 선택된 반응 조건하에 멜라민 적재량이 높을 수록 아멜린:아멜라이드 비율이 더 높음을 알 수 있다. 시아누르산이 결코 검출되지 않았음이 주목할만 하다.

실시예 4: 1 ℓ 규모의 수성 혼합물중 고체-대-고체 반응에 의한 아멜린 및/또는 아멜라이드의 제조

125.2 g의 멜라민을 1050 ㎖의 완충액(100 mM K₂HP0₄/1 mM MgS0₄·7H₂0)에 첨가함으로써, 교반중인 1.6 ℓ 들이 유리 반응기에서 반응 혼합물을 제조하였다. 멜라민 고체 기질을 20 분 동안 37℃에서 교반하였고, 이후 0.05 g의 5M NaOH를 첨가하여 pH를 9.5로 조정하였다. 반응을 개시하기 위해, 에스케리치아 콜라이 RV311 pBAD_Meldeam_Aci의 무세포 추출액 62.5 ㎖를 첨가하고(5 부피%), 이후 추가의 0.1 g의 5M NaOH를 첨가하여 pH를 9.5로 조정하였다. 멜라민 적재량은 10.1 질량%이었다. 전환 동안, pH-고정 장비를 적용하여 1 M H₃P0₄의 용액으로 적정함으로써 pH를 9.5로 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석을 위해 샘플을 채취하였다. 5 시간 후, 반응을 종결시키고, 고체 생성물을 "재료 및 일반적 방법"에 기재된 바와 같이 단리하고 분석하였다. 98.6 질량%의 아멜린, 0.4 질량%의 아멜라이드 및 1 질량%의 멜라민이 포함된 총 125 g의 생성물을 수득하였고, 이는 99%의 전환율에 상응한다. 시아누르산은 전혀 형성되지 않았다.

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tcaccgcgcg gtgcatcggg atgcggacgt gctgacccca 1080 gagaagattc ttgaaatggc gacgatcgat ggggcgcgtt cgttgggaat ggaccacgag 1140 attggttcca tcgaaaccgg caagcgcgcg gaccttatcc tgcttgacct gcgtcaccct 1200 cagacgactc ctcaccatca tttggcggcc acgatcgtgt ttcaggctta cggcaatgag 1260 gtggacactg tcctgattga cggaaacgtt gtgatggaga accgccgctt gagctttctt 1320 ccccctgaac gtgagttggc gttccttgag gaagcgcaga gccgcgccac agctattttg 1380 cagcgggcga acatggtggc taacccagct tggcgcagcc tctag 1425 <210> 11 <211> 330 <212> DNA <213> Ketogulonicigenium vulgare Y25 <220> <221> source <222> 1..330 <223> /organism="Ketogulonicigenium vulgare Y25" /note="Wild type melamine deaminase sequence" /mol_type="unassigned DNA" <400> 11 gtgcgcgaag tgctggaatt tgcgacgatc aatggcgcga aaggcctgcg tctggatcac 60 aaaaccggct cgctgacccc cggcaaagag gcggatatca tcctgctgga cgccaccgcc 120 ttgaacgtcg caccgctgaa caacgccccc ggcgccgtcg tgacgctgat ggagcgttcg 180 aacgtggaaa ccgtgctggt cgccggccag atcaagaaat ggcaaggcgc attgatcggt 240 caggatatcg cggcgctgcg cgatcagatc 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tagaccaact catcacccgc 600 cacgaccgca cagcagatgg ccgcatcagg gtgtggcccg cacccgccat ccccttcatg 660 gtcagtgaaa aaggaatgaa ggcagcgcaa gagatcgcag cgagccgcac cgacggctgg 720 accatgcacg tcagcgagga tcccatcgag gcccgagtgc actccatgaa cgccccggaa 780 tatttacacc acctcggctg cctcgacgac cgactccttg ccgcgcactg cgtgcatatc 840 gacagccgag acatccgcct gttccgccag cacgacgtaa aaatttctac ccaaccagta 900 tcgaacagct acctggcggc cggaattgca ccggtccccg aaatgctcgc ccacggcgtg 960 accgtgggca tcggtaccga cgacgccaac tgcaacgaca gcgtgaacct catctcggac 1020 atgaaagtgc tagcgctcat tcaccgagct gcacatcgag atgcctcaat catcacacct 1080 gaaaaaatca tcgaaatggc caccatcgac ggagcccgct gcatcggtat ggccgatcag 1140 attggttccc tcgaggcggg taaacgcgcc gacatcatca ccctcgacct tcgtcacgcc 1200 caaacaaccc cagcgcacga cttggcggcc accatcgtct ttcaggccta cggcaacgag 1260 gtcaacgacg tcctcgtcaa tggctcggta gtgatgcgcg atcgagtact ttcttttctg 1320 ccgactcccc aagaagaaaa agcgctctac gacgatgcgt cggagcgatc ggctgcaatg 1380 ctcgcacggg ccggcctcac cggcacacgc acatggcaaa cactgggatc g 1431 <210> 13 <211> 1398 <212> DNA <213> Bradyrhizobium japonicum <220> <221> source <222> 1..1398 <223> /organism="Bradyrhizobium japonicum" /note="Wild type guanine deaminase sequence" /mol_type="unassigned DNA" <400> 13 atgaccaccg tcggtattcg cggcacgttc ttcgatttcg tcgacgatcc ctggaagcac 60 atcggcaacg agcaggcggc tgcgcgcttt catcaggacg gcctcatggt cgtcaccgac 120 ggcgtcatca aggcgttcgg tccgtacgag aagatcgccg ccgcgcatcc gggcgttgag 180 atcacccata tcaaggaccg catcatcgtc ccgggcttca tcgacggcca catccatctg 240 cctcagaccc gcgtgctcgg tgcctatggc gagcagctct tgccgtggct gcagaagtcg 300 atctatcccg aggagatcaa gtacaaggat cgcaactacg cgcgcgaagg cgtgaagcgt 360 tttctcgatg cactgctcgc cgccggcacc accacctgcc aggccttcac cagctcctca 420 ccggtcgcga ccgaagagct gttcgaggag gcaagcaggc gcaacatgcg cgtgatcgcg 480 ggtctcaccg ggatcgaccg caacgcgccg gccgaattca tcgatacgcc cgagaatttc 540 tatcgcgaca gcaagcggct gatcgcgcag tatcacgaca agggccgtaa cctctacgct 600 atcacgccgc gcttcgcctt cggcgcctcg cccgagctgc tgaaggcgtg tcagcgcctc 660 aagcacgagc atccggactg ctgggtcaat acccacatct ccgagaaccc ggccgaatgc 720 agcggcgtgc tggtcgagca cccggactgc caggattatc tcggcgtcta cgagaagttc 780 gacctggtcg gcccaaagtt ctccggcggc cacggcgtct atctctcgaa caacgaattc 840 cgccgcatgt ccaagaaagg cgcggcggta gtgttctgcc cgtgctcgaa cctgttcctc 900 ggcagcggcc tgttccgtct cggccgcgcc accgatccgg agcatcgcgt gaagatgtcg 960 ttcggcaccg atgtcggcgg cggcaaccgc ttctcgatga tctccgtgct cgacgacgct 1020 tacaaggtcg gcatgtgcaa caacacgctg ctcgacggca gcatcgatcc gtcgcgcaag 1080 gacctcgcgg aagccgagcg caacaagctc tcgccctatc gtggcttctg gtcggtcacg 1140 ctcggcggcg ccgaaggcct ctacatcgac gacaagctcg gcaatttcga gcccggcaag 1200 gaggccgatt tcgtcgcgct cgatccgaac ggcggacaac tggcgcaacc ctggcaccag 1260 tcgctgattg ccgacggtgc aggtccgcgc acggttgatg aggccgcgag catgctgttc 1320 gccgtcatga tggtcggcga cgatcgctgc gtcgacgaga cctgggtgat gggcaagcgc 1380 ctctacaaga agagctga 1398 <210> 14 <211> 1317 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> source <222> 1..1317 <223> /organism="Escherichia coli" /note="Wild type Escherichia coli guanine deaminase sequence" /mol_type="unassigned DNA" <400> 14 atgatgtcag gagaacacac gttaaaagcg gtacgaggca gttttattga tgtcacccgt 60 acgatcgata acccggaaga gattgcctct gcgctgcggt ttattgagga tggtttatta 120 ctcattaaac agggaaaagt ggaatggttt ggcgaatggg aaaacggaaa gcatcaaatt 180 cctgacacca ttcgcgtgcg cgactatcgc ggcaaactga tagtaccggg ctttgtcgat 240 acacatatcc attatccgca aagtgaaatg gtgggggcct atggtgagca attgctggag 300 tggttgaata aacacacctt ccctactgaa cgtcgttatg aggatttaga gtacgcccgc 360 gaaatgtcgg cgttcttcat caagcagctt ttacgtaacg gaaccaccac ggcgctggtg 420 tttggcactg ttcatccgca atctgttgat gcgctgtttg aagccgccag tcatatcaat 480 atgcgtatga ttgccggtaa ggtgatgatg gaccgcaacg caccggatta tctgctcgac 540 actgccgaaa gcagctatca ccaaagcaaa gaactgatcg aacgctggca caaaaatggt 600 cgtctgctat atgcgattac gccacgcttc gccccgacct catctcctga acagatggcg 660 atggcgcaac gcctgaaaga agaatatccg gatacgtggg tacataccca tctctgtgaa 720 aacaaagatg aaattgcctg ggtgaaatcg ctttatcctg accatgatgg ttatctggat 780 gtttaccatc agtacggcct gaccggtaaa aactgtgtct ttgctcactg cgtccatctc 840 gaagaaaaag agtgggatcg tctcagcgaa accaaatcca gcattgcttt ctgtccgacc 900 tccaaccttt acctcggcag cggcttattc aacttgaaaa aagcatggca gaagaaagtt 960 aaagtgggca tgggaacgga tatcggtgcc ggaaccactt tcaacatgct gcaaacgctg 1020 aacgaagcct acaaagtatt gcaattacaa ggctatcgcc tctcggctta tgaagcgttt 1080 tacctggcca cgctcggcgg agcgaaatct ctgggccttg acgatttgat tggcaacttt 1140 ttacctggca aagaggctga tttcgtggtg atggaaccca ccgccactcc gctacagcag 1200 ctgcgctatg acaactctgt ttctttagtc gacaaattgt tcgtgatgat gacgttgggc 1260 gatgaccgtt cgatctaccg cacctacgtt gatggtcgtc tggtgtacga acgcaac 1317

Claims (12)

1. 생물촉매를 포함하는 수성 반응 혼합물에서 멜라민으로부터 아멜린 및/또는 아멜라이드를 제조하는 방법으로서,
   상기 멜라민을 고체-대-고체(solid-to-solid) 반응에 의해 아멜린으로 전환시키고,
   상기 생물촉매가 아미드가수분해효소 상과에 속하고 1,3,5-트리아진 화합물에 대한 아미노기가수분해효소 활성을 갖는 하나 이상의 효소를 포함하는,
   방법.
2. 제1항에 있어서,
   효소가 멜라민 탈아미노효소, s-트리아진 가수분해효소, 하이드록시아트라진 가수분해효소, 구아닌 탈아미노효소 및 시마진 클로로가수분해효소로 구성된 군에서 선택되는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   효소가 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 동족체를 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
   멜라민이 수성 반응 혼합물의 총 질량에 대하여 1.0 질량% 이상의 적재량으로 존재하는 방법.
5. 제4항에 있어서,
   멜라민이 수성 반응 혼합물의 총 질량에 대하여 10 질량% 이상의 적재량으로 존재하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   멜라민이 수성 반응 혼합물의 총 질량에 대하여 20 질량% 이상의 적재량으로 존재하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
   멜라민을 5 내지 10에서 선택된 pH에서 아멜린 및/또는 아멜라이드로 전환시키는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   멜라민을 6.5 내지 7.5에서 선택된 pH에서 아멜린 및/또는 아멜라이드로 전환시키는 방법.
9. 제7항에 있어서,
   멜라민을 6.5 미만에서 선택된 pH에서 아멜린 및/또는 아멜라이드로 전환시키는 방법.
10. 제7항에 있어서,
    멜라민을 7.5 초과에서 선택된 pH에서 아멜린 및/또는 아멜라이드로 전환시키는 방법.
11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
    수성 반응 혼합물이 유기 용매를 포함하는 방법.
12. 95 질량% 이상의 아멜린 및 아멜라이드 및 5 질량% 이하의 멜라민을 포함하고, 2 내지 500 범위의 아멜린:아멜라이드 비율을 갖는, 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 생성물.