TW201527285A - 用於製備二胺三聚氰酸之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種藉由固體至固體(solid-to-solid)反應，在包含生物觸媒的水性反應混合物中，從三聚氰胺製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的新型方法，其中該生物觸媒包含至少一種屬於醯胺水解酶超家族及具有朝向1,3,5-三□化合物的胺基水解酶活性之酵素。本發明進一步關於可藉由根據本發明之方法獲得的產物，其中該產物包含二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。

Description

用於製備二胺三聚氰酸之方法

本發明係關於一種用於製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸之方法。本發明進一步關於一種可藉由根據本發明之方法獲得的產物，其中該產物包含二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。

二胺三聚氰酸(4,6-二胺基-2-羥基-1,3,5-三)及一胺三聚氰酸(6-胺基-2,4-二羥基-1,3,5-三)係工業有興趣例如用以使用在阻燃性組成物中的1,3,5-三化合物，如例如在US4341694、JP55094953、JP59029676中提到。但是，它們至今無法以大工業規模商業獲得。

已經研究及描述出數種用於二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸之製備的化學途徑(E.M.Smolin及L.Rapoport.2008。Ammelide,Ammeline and Related Compounds.In：Chemistry of heterocyclic compounds：s-Triazines and Derivatives.Volume 13.Chapter 5.p.269-308)。此等合成途徑相當費力及麻煩。再者，這些需要相當昂貴的起始材料(例如，雙氰胺及縮二脲)、嚴苛的反應條件(溫度高於200℃)、含鹵素化合物、有毒溶劑(例如，酚類、甲酚類或二 甲苯酚)及加入醇類(例如，甲醇)，用以從溶劑析出及回收二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。額外的是，這些途徑經常導致以未經控制的比率及受限制的產率形成二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸，且組合著形成不同量的副產物例如三聚氰酸，其由於非常低的溶解度而難以藉由洗滌移除及昂貴。因此，對另一種至二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的途徑，較佳為更成本有效從便宜的起始材料，諸如三聚氰胺(2,4,6-三胺基-1,3,5-三；亦稱為對稱-三胺基-三)之方法有需求。

本發明的目標為提供一種用以製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的方法，其將克服一或多個上述提及的缺點，特別是產生高產率及低副產物量，因此提供一種具商業吸引力的方法。

本發明的目標亦為提供一種用以製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的新穎方法，其中該二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率可經微調整。

本發明的進一步目標為提供一種包含呈經控制比率的二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸之產物。

這些目標已經使用根據本發明的方法達成，其包括一種用以製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的方法，其中三聚氰胺係轉換成二胺三聚氰酸及選擇性一胺三聚氰酸，其係藉由固體至固體反應，在包含生物觸媒的水性反應混合物中，及其中該生物觸媒包含至少一種屬於醯 胺水解酶超家族及具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性之酵素。

在根據本發明的方法中，三聚氰胺係藉由”固體至固體”反應轉換成二胺三聚氰酸及選擇性一胺三聚氰酸。此意謂著在該反應中，在任何時間點僅有小比例的基質及/或產物係在溶液中，同時剩餘部分的基質及/或產物係呈固相。起始的固體三聚氰胺基質逐漸溶解，當其係通過溶液轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸時，然後析出。

根據本發明之固體至固體反應係在包含固體基質及/或產物及生物觸媒之”水性反應混合物”中，於水相中進行。該水相係一該佔支配溶劑係水的液相。

如於本文中所定義，”生物觸媒”係一種源自於生物來源的生物材料或部分，其催化在根據本發明的方法中之反應步驟。原則上，該生物觸媒可係任何有機體例如微生物，或從此衍生出的生物分子。其特別可包含一或多種酵素。

該”醯胺水解酶超家族”係一種”金屬相依性水解酶”酵素之結構基底的分子團，其在催化區段中包括類似磷酸三碳糖異構酶(TIM)的桶狀摺疊。此超家族的成員不僅催化有機化合物的C-N之斷裂而且亦C-C、C-O、C-Cl、C-S及O-P鍵(L.Aimin，L.Tingfeng，F.Rong.2007.Amidohydrolase superfamily.In：Encyclopedia of life sciences 2007)。

”具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性之酵素”係一種具有朝向胺基經取代的1,3,5-三化合物之水解活性，與藉由水解在三環之碳原子與胺基取代基之N原子間的C-N鍵，將一或多個胺基取代基轉換成羥基取代基，同時產生氨的能力(反應圖解[1])之酵素。

該”具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性之酵素”此後亦指為”酵素”。

與先述技藝的方法比較，根據本發明的方法需要溫和條件。該方法係在適當的溫度下，在用於該生物觸媒以保持活性的水相存在下進行。再者，該方法係環境友善，其無使用有毒溶劑、含鹵素化合物或醇類。該二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸在該水性反應混合物中直接析出，及其回收僅需要幾個使用水的洗滌步驟。該方法的另一個優點為製造出想要的產物而沒有形成導致失去產率之副產物，例如三聚氰酸。已熟視根據本發明的方法允許比在先述技藝中所描述的化學途徑好的產率。此達成三聚氰胺高度最大轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸(最高約99%)。根據本發明的方法超過化學途徑之額外優點為微 調整二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率的能力。

當雖然未反應的基質與生物觸媒係存在而無明顯反應發生時，該三聚氰胺轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸可說成達到其”最大轉換”。

某些研究已調查土壤細菌參與三聚氰胺在人類及動物中的毒性，及此已導致鑑別出細菌性三聚氰胺代謝途徑，其中三聚氰胺係顯示出藉由相繼地脫胺而被水解成二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸。包含於這二個脫胺步驟中的基因及酵素已經鑑別出，及在某些情況中，該等酵素已經純化及標出特徵。後者已經發現屬於醯胺水解酶超家族(反應圖解[2]；J.L.Seffernick，A.G.Dodge，M.J.Sadowsky，J.A.Bumpus及L.P.Wackett.2010。Bacterial ammeline metabolism via guanine deaminase。J.Bacteriology 192(4)，1106-1112；A.G.Dodge，L.P.Wackett，M.J.Sadowsky.2012。Plasmid localization and organization of melamine degradation genes in Rhodococcus sp.Strain Mel.Applied and environmental microbiology 78(5)，1397-1403)。這些研究與本發明的工藝範圍，即，用以在包含生物觸媒的水性反應混合物中藉由固體至固體反應從三聚氰胺製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的方法不相關，及尚未有跡象顯示出在細菌性三聚氰胺代謝途徑中所鑑別的酵素可合適地使用在根據本發明之方法中。

來自三聚氰胺的水解降解途徑之首先二個步驟 係顯示在反應圖解[2]中。其指示出編譯出催化每個步驟的微生物酵素之基因。該triA、trzA、atzB基因係各別編譯出三聚氰胺脫胺基酶、對稱-三水解酶及羥基莠去津(hydroxyatrazine)水解酶。GDA係鳥嘌呤脫胺基酶的縮寫。全部酵素係醯胺水解酶超家族的成員。

根據本發明，三聚氰胺係藉由”固體至固體”反應，在包含生物觸媒的水性反應混合物中轉換成二胺三聚氰酸及選擇性一胺三聚氰酸。可改變反應參數(例如，生物觸媒、水相、混合、pH、溫度或基質負載)來最佳化該反應及獲得想要的產物。

根據本發明的生物觸媒可以任何形式使用。該生物觸媒可例如以(部分)純化的酵素、冷凍乾燥的酵素粉末、固定酵素、全細胞(例如，經滲透、冷凍乾燥)、固定 化全細胞、細胞溶成物或無細胞萃取物形式使用。

將由熟練的人士清楚，在根據本發明的方法中可使用具有合適的活性之自然發生的生物觸媒(野生型式)或自然發生的生物觸媒之突變體。自然發生的生物觸媒之性質可藉由已由熟知技藝之人士已知的生物技術諸如分子演化或合理設計來改良。野生型生物觸媒之突變體可例如使用已由熟知技藝之人士知曉的致突變技術(例如，隨機突變、定點突變、定向演化、基因重組)，藉由修改有機體之能作用為生物觸媒或能產生生物催化部分(例如，酵素)的編碼DNA製得。特別是，該DNA可經修改使得其編譯出與野生型式酵素差異至少一個胺基酸的酵素；以便其編譯出包含一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入的酵素，與野生型式比較；或使得該突變體結合二或更多個親代酵素的序列或藉由在合適的(宿主)細胞中執行因此修改的DNA之表現性。後者可藉由熟練的人士已知之方法諸如密碼子對最佳化達成，例如以如在WO 2008/000632中所描述的方法為基準。

該突變型生物觸媒可例如關於下列一或多種態樣具有改良的性質：朝向基質的選擇性、活性、穩定性、溶劑耐受性、pH曲線、溫度曲線、基質曲線、對抑制的敏感性、輔因子使用及基質親和力。具有改良的性質之突變體可以此由熟練人士已知的方法為基準，藉由施用例如合適的高通量篩選或選擇方法來鑑別。

包含一或多種用以催化在根據本發明之方法中 的反應步驟之酵素的細胞特別是重組細胞，其可使用本身在技藝中已知的分子生物學技術建構。例如，若欲在重組細胞中產生一或多種外源酵素時，可使用此技術來提供一包含一或多種編譯出一或多種該外源酵素的外源基因之載體(例如，重組載體)。可使用一或多種載體，每種包含一或多種此外源基因。此載體可包含一或多個控制元素，例如一或多個啟動子，其可操作連結至編譯出該酵素的基因。

用語”外源”當其係使用於本文中時想要意謂著該生物分子(例如，DNA、RNA、蛋白質)係引進宿主細胞中。該生物分子可例如係一同源(或異種)核酸，其在引進宿主細胞中後編譯出同源(或異種)蛋白質。用語”異種”指為從非宿主細胞的供體來源分離出之生物分子，然而用語”同源”指為從宿主細胞分離出之生物分子。此外，本發明之編碼核酸的外源表現性可使用異種或同源編碼核酸的任一種或二者。

如本發明家已發現，該酵素屬於醯胺水解酶超家族及具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性(當使用在根據本發明的方法中時)，其可係選自於由下列所組成之群的任何合適的酵素(即，若其可經證實具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性時，該酵素係合適的)：三聚氰胺脫胺基酶(亦稱為三聚氰胺醯胺水解酶)、對稱-三水解酶(亦稱為N-乙基二胺三聚氰酸氯水解酶)、羥基莠去津水解酶(亦稱為莠去津氯水解酶)、鳥嘌呤脫胺基 酶(亦稱為鳥嘌呤醯胺水解酶)及西瑪三氯水解酶。

在一個具體實例中，合適的三聚氰胺脫胺基酶可係選自於由源自於下列所組成之群的三聚氰胺脫胺基酶：嗜酸菌屬(Acidovorax)、生酮基古龍酸菌屬(Ketogulonicigenium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、戈登氏菌屬(Gordonia)、赤球菌屬(Rhodococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、克留氏菌屬(Klebsiella)、威廉西亞菌屬(Williamsia)、土壤絲菌屬(Nocardia)、節桿菌屬(Arthrobacter)、涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)、庫克菌屬(Kocuria)、皮球菌屬(Dermacoccus)、蓋球菌屬(Kytococcus)及腸內桿菌屬(Enterobacter)。特別是，該三聚氰胺脫胺基酶可源自於西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulii)(以前稱為西瓜假單胞菌(Pseudomonas citrulii))、燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenae subspecies citrulii)(以前稱為類產鹼假單胞菌西瓜亞種(Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.citrulii))、普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)、暗紅戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)(亦稱為Gordona rubripertincta；與珊瑚紅球菌(Rhodococcus corallinus)係同義字)、土生克留氏菌(Klebsiella terragena)或細球菌(Micrococcus sp.)株MF-1。更特別的是，該三聚氰胺脫胺基酶可源自於西瓜嗜酸菌NRRL B-12227或普通生酮基古龍酸菌Y25。

在另一個具體實例中，合適的對稱-三水解酶可係選自於由源自於下列所組成之群的對稱-三水解 酶：戈登氏菌屬、赤球菌屬、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈黴屬(Streptomyces)、腸球菌屬(Enterococcus)、營養缺陷菌屬(Abiotrophia)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、捷馬拉菌屬(Gemalla)、阿托波菌屬(Atopobium)、鏈輪枝孢屬(Streptoverticillium)、遊動放線菌屬(Actinoplanes)、北裡孢菌屬(Kitasatospora)、欽氏菌屬(Chainia)及孢囊放線菌屬(Actinosporangium)。合適的對稱-三水解酶可特別選自於暗紅戈登氏菌(亦稱為Gordona rubripertincta；與珊瑚紅球菌係同義字)，更特別的是，來自珊瑚紅球菌NRRL B-15444R。

在進一步具體實例中，合適的羥基莠去津水解酶可源自於節桿菌屬、β-變形菌屬(Proteobacterium)、假單胞菌屬、胺基桿菌屬(Aminobacter)、細球菌屬、金桿菌屬(Aureobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、赤球菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、地桿菌屬(Terrabacter)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、藉伏氏菌屬(Vogesella)、德萊氏菌屬(Deleya)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)或假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。特別是，合適的羥基莠去津水解酶可源自於假單胞菌(Pseudomonas sp.)ADP或嗜胺基胺基桿菌(Aminobacter aminovorans)。

在更進一步具體實例中，合適的鳥嘌呤脫胺基酶可係選自於由源自於下列所組成之群的鳥嘌呤脫胺基酶：慢生型根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、大腸桿菌屬(Escherichia)、根瘤菌屬(Rhizobium)及勒克菌屬(Leclercia)。特別是，該鳥嘌呤脫胺基酶可源自於慢生性大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)或大腸桿菌(Escherichia coli)。更特別的是，該鳥嘌呤脫胺基酶可源自於慢生性大豆根瘤菌USDA 110或大腸桿菌ETEC H10407。

在更進一步具體實例中，合適的西瑪三氯水解酶可係選自於由源自於草螺菌屬的西瑪三氯水解酶類所組成之群。特別是，該西瑪三氯水解酶可源自於草螺菌(Herbaspirillum sp.)B601。

在特定具體實例中，該酵素屬於醯胺水解酶超家族及具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性，其包含由SEQ ID NO 5(AAG41202.1)、SEQ ID NO 6(YP_003963954.1)、SEQ ID NO 7(Q52725.2)、SEQ ID NO 8(NP_770520.1)及SEQ ID NO 9(CBJ02579.1)所表示之胺基酸序列，或其同系物。

”同系物”於本文中特別使用於具有與其參考蛋白質(即，SEQ ID NO 5、6、7、8或9)至少30%的序列同一性之多胜肽，較佳為至少40%，更佳為至少50%，更佳為至少60%，更佳為至少65%，更佳為至少70%，更佳為至少75%，更佳為至少80%，特別是至少85%，更特別是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少 95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。同系物通常係一種具有功能性的多胜肽，及較佳的是，其亦與其參考蛋白質具結構類似性。一種型式的同系物係由來自相同屬的另一種物種或甚至來自其它屬之基因編譯出。”同系物”亦想要包括已經藉由致突變技術改變的那些蛋白質，其中該技術已經進行以改良該蛋白質之想要的性質。

”序列同一性”於本文中係定義為在二或更多個多胜肽序列或二或更多個核酸序列間之關係，如藉由比較該等序列決定。通常來說，序列同一性係在該序列的全部長度上比較，但是亦可僅比較該等彼此對準的序列之一部分。在技藝中，”同一性”亦意謂著在多胜肽序列或核酸序列間之序列親緣程度，如該情況可係如由在此等序列間之匹配來決定。決定同一性的較佳方法係經設計以在所測試之序列間提供最大的匹配。在本發明的上下文中，決定在二個序列間之同一性的較佳電腦程式方法包括BLASTP及BLASTN(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.1990，215，403-410，可從NCBI及其它來源公開獲得(BLAST Manual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)。使用BLASTP用於多胜肽序列比較的較佳參數有gap open 10.0，gap extend 0.5，Blosum 62 matrix。使用BLASTN用於核酸序列比較的較佳參數係gap open 10.0，gap extend 0.5，DNA full matrix(DNA identity matrix)。

在本發明的方法中的水相係一該佔支配的溶劑 係水之液相。該水相可係僅有水、包含水與緩衝鹽之混合物的緩衝液(例如，磷酸鉀緩衝液)、水與有機溶劑(例如，乙二醇、DMSO、THF)之混合物或緩衝液與有機溶劑(例如，乙二醇、DMSO、THF)之混合物。為了該生物觸媒的效率活性，熟練的人士將能夠選擇及最佳化該水相。

由於該固體至固體反應的本質，該水性反應混合物的有效混合係重要的，以提供好的反應組分運輸及接觸且避免顆粒沉澱。熟練的人士將能夠使用可商業購得之技術選擇正確的混合器設計及混合條件。例如，可藉由徑向泵攪拌器完成有效率的混合，同時可藉由軸向攪拌器向下泵至反應容器底部來避免顆粒沉澱。至於軸向泵葉輪片，技術現況為使用窄葉片水翼。使用傳統斜葉槳渦輪機作為標準葉輪片。同樣地，可在偏離中心位置處使用螺槳。當使用中心葉輪片時，可施用阻板以讓該渦旋流返回該葉輪片之想要的模式。亦選擇性藉由將該水性反應混合物泵過外回路提供混合。已驚人地發現在根據本發明的方法中所使用的酵素在由於混合及未溶解的固體之存在而提升的水力剪切力下存活。

原則上，該反應媒質的pH可在寬的極限內選擇，只要該生物觸媒在所施用之pH條件下係有效。該反應混合物的pH係合適地在4至11間，較佳為在5至10間。該pH經選擇在A至B間、pH範圍從A至B或A至B的pH範圍包含該端點A及B。

本發明家已驚人地發現pH在二胺三聚氰酸：一 胺三聚氰酸比率上具有深遠的影響。實施例2及表3闡明此影響。在所施用之條件下及在pH範圍7至10內，較高的pH產生較高的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率。特別是，pH 7、8、9、9.5及10各別產生二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率3.5(75.2莫耳%二胺三聚氰酸、21.2莫耳%一胺三聚氰酸)、14.3(90.0莫耳%二胺三聚氰酸、6.3莫耳%一胺三聚氰酸)、56.8(96.5莫耳%二胺三聚氰酸、1.7莫耳%一胺三聚氰酸)、108.8(97.9莫耳%二胺三聚氰酸、0.9莫耳%一胺三聚氰酸)及164(98.4莫耳%二胺三聚氰酸、0.6莫耳%一胺三聚氰酸)。在pH值低於7下觀察到反向趨勢，其中較高的pH產生較低的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率。特別是，在pH 5及6下，二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率各別為18.3(91.5莫耳%二胺三聚氰酸、5.0莫耳%一胺三聚氰酸)及8.8(86.9莫耳%二胺三聚氰酸、9.9莫耳%一胺三聚氰酸)。換句話說，在所施用之條件下及在pH範圍6.5至7.5內，獲得具有高一胺三聚氰酸含量的產物，然而在pH低於6.5下，較佳為低於6或在pH大於7.5下，較佳為大於8，形成具有高二胺三聚氰酸含量的產物。因此，已鑑別出pH為用以微調二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率的重要參數。

原則上，所使用的反應媒質之溫度可在寬的極限內選擇，只要該生物觸媒在施用之溫度條件下仍然有效。在根據本發明的方法中，該反應溫度正常在0至100℃間，較佳為在10至60℃間。

在根據本發明的方法中，在本發明之經選擇的溫 度及pH範圍內，將三聚氰胺基質在大於飽和的負載下加入至該水性反應混合物以形成固體。可藉由例行實驗來決定三聚氰胺在所選擇的反應條件下形成固體之三聚氰胺負載。

如於本文中的意義，用語”負載”係初始加入至該反應混合物的三聚氰胺之總質量，相對於該水性反應混合物的總質量。該三聚氰胺負載係以質量百分比(質量%)表示。

”飽和”於本文中係定義為該三聚氰胺溶液可不再溶解任何額外的三聚氰胺量及此額外的三聚氰胺量將以固體顯露出之最大負載點。

在本發明的一個具體實例中，三聚氰胺係以至少1.0質量%的負載顯現，相對於該水性反應混合物的總質量，較佳為至少10質量%，更佳為至少15質量%，又更佳為至少20質量%，甚至更佳為至少30質量%。

本發明家已驚人地發現該基質負載在該最後產物的組成物上具有深遠的影響，其中較高的三聚氰胺負載產生較高的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率。實施例3及表4闡明此影響。在施用之條件下，約1質量%、9質量%及17.5質量%的初始三聚氰胺負載各別產生二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率108.8(97.9莫耳%二胺三聚氰酸、0.9莫耳%一胺三聚氰酸)、329.7(98.9莫耳%二胺三聚氰酸、0.3莫耳%一胺三聚氰酸)、494(98.8莫耳%二胺三聚氰酸、0.2莫耳%一胺三聚氰酸)。因此，已鑑別出三聚氰胺負載為用以微調二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率的另一 種重要參數。

在該固體至固體反應已進行至可接受的轉換位準後，該固體產物可藉由習知的方法(例如，藉由過濾、藉由離心或藉由施用傾析離心機)從該水性反應混合物中分離出。隨後，該經分離的產物可以水清洗用以移除殘餘的三聚氰胺基質。該二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率係不受這些洗滌步驟影響。

該可藉由根據本發明的方法獲得之固體產物具有高二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸含量及低殘餘三聚氰胺位準。合適的是，該產物包含至少95質量%二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸及至多5質量%三聚氰胺。較佳的是，該產物包含至少98質量%二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸及至多2質量%三聚氰胺。更佳的是，該產物包含至少99質量%二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸及至多1質量%三聚氰胺。

原則上，該固體產物的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率可在寬的範圍內微調整。典型上，二胺三聚氰酸係過量於一胺三聚氰酸。合適的是，該固體產物具有二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率在範圍1-1000內，更合適地在範圍2-500內。

本發明進一步關於根據本發明如於本文中所描述的方法之不同具體實例及/或較佳特徵的全部可能的組合。

較佳實施例之詳細說明

本發明係參照下列實施例來闡明，但是不由這些限制。

實施例 材料及一般方法 1.三聚氰胺基質；參考材料二胺三聚氰酸、一胺三聚氰酸及三聚氰酸

具有化學純度>99.9%的三聚氰胺(來自OCI-Nitrogen)係施用於該等實施例。

具有化學純度97.5%的二胺三聚氰酸(來自Hicol)係使用作為在HPLC分析中的參考材料。

具有化學純度99.7%的一胺三聚氰酸係使用作為在HPLC分析中的參考材料。

具有化學純度>99%的三聚氰酸係使用作為在HPLC分析中的參考材料。

2.生物觸媒之製備 2.a.重組酵素之選殖及表現性

選擇五種來自不同有機體而編譯出具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性之酵素的基因來例示出本發明；換句話說，SEQ ID NO 10(gi_11890745)、SEQ ID NO 11(gi_310815990)、SEQ ID NO 12(gi_4033703)、SEQ ID NO 13(gi_27378991)及SEQ ID NO 14(gi_309703244)，其各別編譯出SEQ ID NO 5(AAG41202.1)、SEQ ID NO 6(YP_003963954.1)、SEQ ID NO 7(Q52725.2)、SEQ ID NO 8(NP_770520.1)及SEQ ID NO 9(CBJ02579.1)(表1)。

五個標的基因的四個，即，SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12及SEQ ID NO 13係在大腸桿菌中的表現性最佳化之密碼子對，其各別產生SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4(序列表)。該密碼子對最佳化係根據在WO 2008/000632中所描述之程序進行。

對較大規模表現性實驗來說，大腸桿菌RV311細胞係使用Z-CompetentTM E.coli Transformation Kit(Zymo Research，Irvine，CA，USA)製成化學勝任，及以如上所述從大腸桿菌TOP10株分離出的pBAD重組載體轉化。在包含100微克/毫升新黴素的LB瓊脂板上選擇轉化 株。在包含50微克/毫升新黴素的LB媒質中接種來自這些板的50毫升預培養物，及在180rpm及28℃下於軌道搖動器上培養。在培養過夜後，使用該預培養物來接種1升LB表現性培養物(在2升裝有擋板的錐形瓶中)以開始0.05的OD₆₂₀s。這些表現性培養物係在180rpm及28℃下於軌道搖動器上培養。在該培養物的三分之一中，在8小時後，藉由加入0.02%(w/v)L-阿拉伯糖引發該三聚氰胺脫胺基酶基因表現，及繼續培養過夜。隨後，藉由在10,000克下離心10分鐘採集這些培養物。該培養物的其它三分之二亦培養過夜及如上所述在大約24小時後引發。各別在4及8小時後，亦藉由離心採集這些培養物。

2.b.以10升規模生物觸媒發酵

表現出pBAD重組載體的大腸桿菌RV311以10升規模，使用葡萄糖作為碳來源，以分批補料發酵來進行發酵。

2.c.小規模(1-10毫升)無細胞萃取物之製備

該等細胞丸粒係以冰冷的100mM pH 7.0磷酸鉀緩衝液，以其溼重的體積兩倍再懸浮。藉由使用Sonics(Meyrin/Satigny，Switzerland)Vibra-Cell VCX130超音波細胞破碎器(sonifier)(輸出100%，10秒開/10秒關，10分鐘)對該細胞懸浮液進行超音波處理，在冰/丙酮浴中冷卻，及隨後在Eppendorf 5415R離心機(Hamburg，德國)中以13,000x克及4℃離心30分鐘，獲得無細胞萃取物(CFEs)。將上層液(=CFEs)轉移至新鮮管子及貯存在冰上用於立即使用或貯存在-20℃下。

2.d.以較大規模(10-250毫升規模)製備無細胞萃取物

對76.3克溼細胞(冷凍)加入152.6克磷酸鉀緩衝液(100mM pH=7)。懸浮該等細胞及放到冰上。隨後，加入1125毫克溶菌酶(lysozym)及50微升苯若酶(benzonase)，混合及放在-20℃下過夜。隔天早晨，將該懸浮液放在37℃室中於搖動器上2.25小時。之後，在冰上冷卻該懸浮液，隨後將其分在8根50毫升管(每根~28毫升)中，及每種懸浮液係使用Sonics(Meyrin/Satigny，Switzerland)Vibra-Cell VCX130超音波細胞破碎器(輸出100%，10秒開/10秒關，10分鐘)進行聲波處理2分鐘，在冰/丙酮浴中冷卻。隨後，將該懸浮液貯存在4℃室中於冰上4小時。其次，以15,000rpm離心該懸浮液15分鐘。收集所獲得的上層液及貯存在-20℃下。

3.蛋白質決定

在CFEs中的蛋白質濃度係使用經修改的蛋白質染料結合方法決定，如由Bradford在Anal.Biochem.72：248-254(1976)中所描述般。將50微升呈適當稀釋的每個樣品與950微升試劑(100毫克溶解在46毫升乙醇及100毫升85%鄰-磷酸中的Brilliant Blue G250，以Milli-Q水填充至最高1,000毫升)在室溫下培養至少五分鐘。在PerkinElmer Lambda35 UV/VIS分光光度計上測量每個樣品在波長595奈米處的吸收度。使用以包含已知牛血清白蛋白濃度(BSA，範圍從0.0125毫克/毫升至0.20毫克/毫升)的溶液所決定之校正線，計算在該樣品中的蛋白質濃度。

4. SDS-PAGE分析

在大腸桿菌中的重組表現性係藉由大腸桿菌TOP10 CFEs及大腸桿菌RV 311 CFEs的SDS-PAGE分析，及與具有過度表現的對照蛋白質之CFE比較。

5.轉換反應及產物分離 5.a.轉換反應-一般說明

轉換反應係在80毫升包括螺旋槳攪拌器的玻璃反應器中或在1600毫升包括渦輪攪拌器及pH-stat設備(型式718 Stat Titrino，來自Metrohm)的玻璃反應器中進行。施用約500rpm的攪拌器速度。

通常來說，如下進行轉換：在37℃下，將某些量的三聚氰胺加入至緩衝液(100mM K₂HPO₄/1mM MgSO₄.7H₂O)以到達想要的負載。使用1M H₃PO₄(用以獲得pH 7或較低)或1M NaOH(用以獲得pH 8或較高)將pH調整至想要的值。隨後，加入生物觸媒以開始該轉換。在轉換期間採取樣品用於HPLC分析，如在第6段中所描述般。

5.b.產物分離

在某些反應時間後，藉由將該反應混合物傾倒在P3玻璃過濾器上，使用真空(約750毫巴)進行產物分離。以水清洗濾餅三次。乾燥所獲得的產物過夜。

6. HPLC分析 6.a.用於HPLC分析的樣品製備

在第一例子中，在接受HPLC分析前，以蟻酸將該水性反應混合物的樣品或經分離的產物之樣品稀釋至總 1,3,5-三化合物濃度約0.5質量%，隨後以水稀釋50倍。

6.b. HPLC分析方法

使用二根250毫米Prevail C18管柱。在0%乙腈處發生臨界分離。在梯度後，平衡該管柱至少8分鐘。 在HPLC上所使用的特定分析條件為：管柱：Prevail C18 2x(250毫米x4.6毫米IDx5微米)

沖提劑A：HClO₄ pH=2.0(1.63克70%HClO₄/升水)

沖提劑B：乙腈

流動：1.2毫升/分鐘

注射體積：5微升

管柱溫度：15℃

偵測波長：195奈米

實施例1：藉由固體至固體反應在水性反應混合物中從三聚氰胺製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。

在具有裝填體積約55毫升，包括攪拌器及pH-stat設備之80毫升反應器中進行反應。

對測試反應來說，在37℃下，將555毫克三聚氰胺加入至47克緩衝液(100mM K₂HPO₄/1mM MgSO₄.7H₂O)。以1.65克1M NaOH將pH調整至pH 9.5。隨後，加入0.25毫升的大腸桿菌RV311 pBAD_Meldeam_Aci之無細胞萃取物以開始該反應，因此獲得0.5體積%的最後無細胞萃取物濃度。該三聚氰胺負載係1.1質量%。藉由以1M NaOH滴定將pH保持固定在9.5。

使用如上所述的相同程序並列進行化學空白反應，除了無加入生物觸媒外。使用如上所述的相同程序並列進行生物空白反應，除了該無細胞萃取物係從懷有具有編譯出不能夠轉換三聚氰胺的酵素(於此情況中，來自巨桿菌(Bacillus megaterium)BM3的P450單氧化酶酵素)之插入基因的pBAD重組載體之大腸桿菌RV311獲得外。

在18小時反應時間後，從三種反應混合物採取樣品用於HPLC分析。結果係顯示在表2中。

在表2中的結果顯示出三聚氰胺由於生物觸媒(即，大腸桿菌RV311 pBAD_Meldeam_Aci的無細胞萃取物)之活性轉換成二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸。初始加入至該反應混合物的三聚氰胺幾乎在18小時內完全轉換成二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸。無三聚氰酸形成。在該化學空白反應混合物中無發生明顯三聚氰胺轉換，此顯示出該三 聚氰胺在施用之條件下，於反應時間期間係化學穩定。再者，在該生物空白反應混合物中無發生明顯三聚氰胺轉換。

實施例2：pH在二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率上的效應。

該轉換反應係在具有裝填體積約55毫升包括攪拌器及pH-stat設備之80毫升反應器中進行。

在37℃下，將555毫克三聚氰胺加入至47克緩衝液(100mM K₂HPO₄/1mM MgSO₄.7H₂O)。使用1M H₃PO₄(用以獲得pH 7或較低)或1M NaOH(用以獲得pH 8或較高)將pH調整至想要的值。隨後，加入0.25毫升的大腸桿菌RV311 pBAD_Meldeam_Aci之無細胞萃取物以開始該反應，因此獲得0.5體積%之最後無細胞萃取物濃度。三聚氰胺負載係1.1質量%。藉由以1M H₃PO₄或1M NaOH滴定將pH保持固定。隨著時間採取樣品用於HPLC分析。在最大轉換處，如在”材料及一般方法”中所描述般分離及分析該等固體產物。結果係顯示在表3中。

在表3中的結果顯示出在該反應混合物中所獲得 的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率可藉由pH微調整。在7至10的pH範圍內，pH愈高，二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率愈高。在pH值低於7時觀察到反向趨勢，其中較高的pH產生較低的二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率。值得注意需提到的是，從未偵測到三聚氰酸。

實施例3：三聚氰胺負載在二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率上的效應。

在具有裝填體積約55毫升包括攪拌器及pH-stat設備之80毫升反應器中進行轉換反應。

在37℃下，將三聚氰胺加入至47克緩衝液(100mM K₂HPO₄/1mM MgSO₄.7H₂O)至負載1.1質量%、9質量%或17.5質量%。使用1M NaOH將pH調整至9.5。隨後，為了開始反應，將大腸桿菌RV311 pBAD_Meldeam_Aci的無細胞萃取物各別加入至濃度0.5體積%、5體積%或10體積%。在轉換期間，藉由以1M NaOH滴定保持pH固定。隨著時間採取樣品用於HPLC分析。在最大轉換處，如在”材料及一般方法”中所描述般分離及分析該等固體產物。結果係顯示在表4中。

在表4中的結果顯示出在所選擇的反應條件下， 可藉由調整三聚氰胺負載來微調整二胺三聚氰酸：二胺三聚氰酸比率；在所選擇的反應條件下，三聚氰胺負載愈高，二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率愈高。值得注意需提到的是，從未偵測到三聚氰酸。

實施例4：藉由固體至固體反應在水性混合物中以1升規模製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。

在攪拌的1.6升玻璃反應器中，藉由將125.2克三聚氰胺加入至1050毫升緩衝液(100mM K₂HPO₄/1mM MgSO₄.7H₂O)製備一反應混合物。在37℃下攪拌該三聚氰胺固體基質20分鐘，在此之後，藉由加入0.05克5M NaOH將pH調整至pH 9.5。為了開始該反應，加入62.5毫升之大腸桿菌RV311 pBAD_Meldeam_Aci的無細胞萃取物(5體積%)，在此之後，藉由加入另外0.1克的5M NaOH將pH調整至pH 9.5。三聚氰胺負載係10.1質量%。在轉換期間，施用pH-stat設備，藉由滴定1M H₃PO₄溶液將pH保持固定在pH 9.5。採取樣品用於HPLC分析。在5小時後，終止該反應及如在”材料及一般方法”中所描述般分離及分析該固體產物。獲得總共125克產物，包括98.6質量%二胺三聚氰酸、0.4質量%一胺三聚氰酸及1質量%三聚氰胺，此與99%轉換相應。無三聚氰酸形成。

<110> DSM智慧財產有限公司

<120> 用於製備二胺三聚氰酸之方法

<160> 14

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<221> 來源

<222> 1..1422

<223> /有機體="人造序列" /注解=”用於大腸桿菌之密碼子對最佳化的西瓜嗜酸菌NRRL B-12227三聚氰胺脫胺基酶基因” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 1

<210> 2

<211> 327

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<221> 來源

<222> 1..327

<223> /有機體="人造序列" /注解=”用於大腸桿菌之密碼子對最佳化的普通生酮基古龍酸菌Y25三聚氰胺脫胺基酶基因” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 2

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<221> 來源

<222> 1..1431

<223> /有機體="人造序列" /注解=”用於大腸桿菌之密碼子對最佳化的珊瑚紅球菌NRRL B-15444R三水解酶基因” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 3

<210> 4

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<221> 來源

<222> 1..1395

<223> /有機體="人造序列" /注解=”用於大腸桿菌之密碼子對最佳化的慢生性大豆根瘤菌USDA 110鳥嘌呤脫胺基酶基因” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 4

<210> 5

<211> 474

<212> PRT

<213> 西瓜嗜酸菌

<220>

<223> 野生型式三聚氰胺脫胺基酶序列

<400> 5

<210> 6

<211> 109

<212> PRT

<213> 普通生酮基古龍酸菌Y25

<220>

<223> 野生型式三聚氰胺脫胺基酶序列

<400> 6

<210> 7

<211> 477

<212> PRT

<213> 珊瑚紅球菌NRRL B-15444R

<220>

<223> 野生型式三水解酶序列

<400> 7

<210> 8

<211> 465

<212> PRT

<213> 慢生性大豆根瘤菌

<220>

<223> 野生型式鳥嘌呤脫胺基酶序列

<400> 8

<210> 9

<211> 439

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 野生型式大腸桿菌鳥嘌呤脫胺基酶序列

<400> 9

<210> 10

<211> 1425

<212> DNA

<213> 西瓜嗜酸菌

<220>

<221> 來源

<222> 1..1425

<223> /有機體="西瓜嗜酸菌" /注解=”野生型式三聚氰胺脫胺基酶序列(triA)” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 10

<210> 11

<211> 330

<212> DNA

<213> 普通生酮基古龍酸菌Y25

<220>

<221> 來源

<222> 1..330

<223> /有機體="普通生酮基古龍酸菌Y25" /注解=”野生型式三聚氰胺脫胺基酶序列” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 11

<210> 12

<211> 1431

<212> DNA

<213> 珊瑚紅球菌NRRL B-15444R

<220>

<221> 來源

<222> 1..1431

<223> /有機體="珊瑚紅球菌NRRL B-15444R" /注解=”野生型式三水解酶序列” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 12

<210> 13

<211> 1398

<212> DNA

<213> 慢生性大豆根瘤菌

<220>

<221> 來源

<222> 1..1398

<223> /有機體="慢生性大豆根瘤菌" /注解=”野生型式鳥嘌呤脫胺基酶序列” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 13

<210> 14

<211> 1317

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 來源

<222> 1..1317

<223> /有機體="大腸桿菌" /注解=”野生型式大腸桿菌鳥嘌呤脫胺基酶序列” /分子_型式=”未指定DNA”

<400> 14

Claims (12)

1. 一種用以從三聚氰胺，在包含一生物觸媒的一水性反應混合物中製備二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸的方法，其中- 三聚氰胺係藉由一固體至固體反應轉換成二胺三聚氰酸；- 該生物觸媒包含至少一種屬於醯胺水解酶超家族及具有朝向1,3,5-三化合物的胺基水解酶活性之酵素。
2. 如請求項1之方法，其中該酵素係選自於由下列所組成之群組：三聚氰胺脫胺基酶、對稱-三水解酶、羥基莠去津水解酶、鳥嘌呤脫胺基酶及西瑪三氯水解酶。
3. 如請求項1或2之方法，其中該酵素包含由SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9所表示之胺基酸序列，或其同系物。
4. 如請求項1-3之任一項的方法，其中三聚氰胺係以至少1.0質量%之負載呈現，相對於該水性反應混合物的總質量。
5. 如請求項4之方法，其中三聚氰胺係以至少10質量%之負載呈現，相對於該水性反應混合物的總質量。
6. 如請求項5之方法，其中三聚氰胺係以至少20質量%之負載呈現，相對於該水性反應混合物的總質量。
7. 如請求項1-6之任一項的方法，其中三聚氰胺係在經選擇於5至10間的pH下轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。
8. 如請求項7之方法，其中三聚氰胺係在經選擇於6.5至7.5間之pH下轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。
9. 如請求項7之方法，其中三聚氰胺係在經選擇低於6.5的pH下轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。
10. 如請求項7之方法，其中三聚氰胺係在經選擇大於7.5的pH下轉換成二胺三聚氰酸及/或一胺三聚氰酸。
11. 如請求項1-10之任一項的方法，其中該水性反應混合物包含一有機溶劑。
12. 一種可藉由如請求項1-11之任一項的方法獲得之產物，其中該產物包含至少95質量%二胺三聚氰酸及一胺三聚氰酸及至多5質量%三聚氰胺，及其中該產物具有二胺三聚氰酸：一胺三聚氰酸比率在2-500的範圍內。