JP6519088B2 - アンメリンを製造するプロセス - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
本発明は、アンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスに関する。本発明はさらに、本発明によるプロセスによって得ることができる生成物に関し、その生成物はアンメリンおよび/またはアンメリドを含む。
アンメリン(4,6−ジアミノ−2−ヒドロキシ−1,3,5−トリアジン)およびアンメリド(6−アミノ−2,4−ジヒドロキシ−1,3,5−トリアジン)は、例えば米国特許第4341694号明細書、特開55094953号公報、特開59029676号公報に記載の難燃性組成物において使用される、工業的関心の対象である1,3,5−トリアジン化合物である。しかしながら、それらは工業的大規模では現在、市販されていない。
アンメリンおよびアンメリドの製造について、いくつかの化学的経路が研究され、記述されている(E.M.Smolin and L.Rapoport.2008.Ammelide,Ammeline and Related Compounds.In:Chemistry of heterocyclic compounds:s−Triazines and Derivatives.Volume 13.Chapter 5.p.269−308)。かかる合成経路はかなり労力を要し、面倒である。さらにこれには、比較的高価な出発原料(例えば、ジシアンジアミドおよびビウレット)、厳しい反応条件(200℃を超える温度)、ハロゲン含有化合物、有毒な溶媒(例えば、フェノール、クレゾールまたはキシレノール)、および沈殿させるためのアルコール(例えば、メタノール)の添加、および溶媒からのアンメリンおよび/またはアンメリドの回収が必要である。さらに、これらの経路では、様々な量の副生成物、例えば、シアヌル酸と併せて、未制御の比率で、かつ限られた収率でアンメリンおよびアンメリドが形成される場合が多く、洗浄によるその副生成物の除去は、溶解性が非常に低いために難しく、かつ費用がかかる。したがって、メラミン(2,4,6−トリアミノ−1,3,5−トリアジン;sym−トリアミノ−トリアジンとも呼ばれる)などの安価出発原料から、アンメリンおよび/またはアンメリドへの代替の経路、好ましくはより対費用効果が高いプロセスが必要とされている。
本発明の目的は、上記の欠点のうちの1つまたは複数を克服し、その結果特に収率が高くなり、副生成物の量が少なくなり、それによって工業的に魅力的なプロセスが提供される、アンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスを提供することである。
本発明の目的は、アンメリン:アンメリド比を微調整することができる、アンメリンおよび/またはアンメリドの新規な製造プロセスを提供することでもある。
更なる本発明の目的は、制御された比でアンメリンおよび/またはアンメリドを含む生成物を提供することである。
これらの目的は、アンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスを含む、本発明によるプロセスであって、生体触媒を含む水性反応混合物中での固体間反応によって、メラミンがアンメリンへと、任意選択的にアンメリドへと転化され、その生体触媒が、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する、少なくとも1種類の酵素を含む、プロセスを用いて達成されている。
本発明によるプロセスにおいて、メラミンは、「固体間」反応によって、アンメリンへと、任意にアンメリドへと転化される。これは、前記反応において、ごく小さな割合の基質および/または生成物は常に溶解状態であるが、基質および/または生成物の残りの部分が固相にあることを意味する。出発固体メラミン基質は段々に溶解し、アンメリンおよび/またはアンメリドへ転化されるにしたがって溶液を通過し、次いで沈殿する。
本発明による固体間反応は、水相中に固体基質および/または生成物および生体触媒を含む「水性反応混合物」において行われる。前記水相は、主な溶媒が水である、液相である。
本明細書で定義される「生体触媒」は、本発明によるプロセスにおいて反応段階を触媒する、生体源に由来する生体物質または部位である。生体触媒は原則的に、あらゆる生物、例えば微生物、またはそれに由来する生体分子であり得る。生体触媒は特に、1種または複数種の酵素を含み得る。
「アミドヒドロラーゼスーパーファミリー」は、触媒ドメインにおいて折り畳まれたトリオースホスフェートイソメラーゼ(TIM)様バレルを含有する「金属依存性ヒドロラーゼ」酵素の構造ベースのクラスターである。このスーパーファミリーのメンバーは、有機化合物のC−N結合だけでなく、C−C、C−O、C−Cl、C−SおよびO−P結合の切断も触媒する(L.Aimin,L.Tingfeng,F.Rong.2007.Amidohydrolase superfamily.In:Encyclopedia of life sciences 2007)。
「1,3,5−トリアジン化合物に対するアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素」は、トリアジン環の炭素原子とアミノ置換基のN原子のC−N結合の加水分解によって、1つまたは複数のアミノ置換基をヒドロキシ置換基へと転化する能力と共に、アミノ置換1,3,5−トリアジン化合物に対する加水分解活性を有する酵素であるが、一方ではアンモニアを発生する(反応スキーム[1])。
Figure 0006519088
「1,3,5−トリアジン化合物に対するアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素」は、以下で「酵素」とも呼ばれる。
先行技術の方法と比較すると、本発明によるプロセスは、穏やかな条件を必要とする。そのプロセスは、生体触媒を活性な状態のままにするために、水相の存在下にて適度な温度で行われる。このプロセスはさらに、有毒な溶媒、ハロゲン含有化合物またはアルコールを使用しない、環境に優しいプロセスである。アンメリンおよび/またはアンメリドは、水性反応混合物中で直接沈殿し、それらの(その)回収には、水を使用する数回の洗浄段階のみ必要である。プロセスの他の利点は、収率の低下を生じる、副生成物、例えばシアヌル酸の形成がなく、目的の生成物が製造されることである。本発明による方法によって、先行技術に記述される化学経路よりも高い収率が可能となることが考えられる。アンメリンおよび/またはアンメリドへのメラミンの最大転化率(約99%までの)が達成される。化学経路に関する本発明によるプロセスのその他の利点は、アンメリン:アンメリド比を微調整する能力である。
アンメリンおよび/またはアンメリドへのメラミンの転化は、未反応基質および生体触媒が存在するにも関わらず、有意な反応が起こらない場合に、その「最大転化率」に達すると言われる。
一部の研究では、ヒトおよび動物におけるメラミン毒性への土壌細菌の寄与を調べ、細菌のメラミン代謝経路が同定され、メラミンは、逐次的な脱アミノ化によってアンメリンおよびアンメリドに加水分解されることが示された。これら2つの脱アミノ化段階に関与する遺伝子および酵素が同定されており、一部の場合には、酵素が精製され、特徴付けられている。後者は、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属することが判明している(反応スキーム[2];J.L.Seffernick,A.G.Dodge,M.J.Sadowsky,J.A.Bumpus and L.P.Wackett.2010.Bacterial ammeline metabolism via guanine deaminase.J.Bacteriology 192(4),1106−1112;A.G.Dodge,L.P.Wackett,M.J.Sadowsky.2012.Plasmid localization and organization of melamine degradation genes in Rhodococcus sp.strain Mel.Applied and environmental microbiology 78(5),1397−1403)。これらの研究は、本発明の技術分野には関係せず、つまり、生体触媒を含む水性反応混合物中での固体間反応により、メラミンからアンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスには関係せず、細菌のメラミン代謝経路において同定される酵素は、本発明によるプロセスで適切に使用することができるという指標はなかった。
メラミンの加水分解経路からの最初の2段階を反応スキーム[2]に示す。各段階を触媒する微生物酵素をコードする遺伝子を示す。triA、trzA、atzB遺伝子は、メラミンデアミナーゼ、s−トリアジンヒドロラーゼおよびヒドロキシアトラジンヒドロラーゼをそれぞれコードしている。GDAは、グアニンデアミナーゼの省略形である。この酵素のすべてが、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーである。
Figure 0006519088
本発明に従って、生体触媒を含む水性反応混合物中での「固体間」反応によって、メラミンは、アンメリンへと、任意にアンメリドへと転化される。反応パラメーター(例えば、生体触媒、水相、混合、pH、温度または基質ローディング)は、反応を最適化するため、かつ目的の生成物を得るために、変動し得る。
本発明による生体触媒はあらゆる形態で使用され得る。生体触媒は例えば、(部分)精製酵素、凍結乾燥酵素粉末、固定化酵素、全細胞(例えば、透過処理された、凍結乾燥された)、固定化全細胞、細胞溶解物または無細胞抽出物の形で使用され得る。
本発明によるプロセスにおいて、適切な活性を有する天然生体触媒(野生型)または天然生体触媒の変異体を利用することができることは、当業者には明らかであるだろう。天然生体触媒の特性は、例えば、分子進化または合理的デザイン(rational design)など、当業者に公知の生物学的技術によって向上され得る。野生型生体触媒の変異体は例えば、当業者に公知の突然変異誘発技術(例えば、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、定方向進化、遺伝子組換え)を用いて、生体触媒として作用することができる生物、または生体触媒部位を生成することができる生物(例えば、酵素)のコード化DNAを修飾することによって製造することができる。特に、野生型酵素と少なくとも1つのアミノ酸が異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を含む酵素をコードするように、あるいは変異体が2つ以上の親酵素の配列を併せ持つように、あるいはこのように修飾されたDNAを適切な(宿主)細胞において発現させることによって、DNAが修飾され得る。後者は、例えば国際公開第2008/000632号パンフレットに記載の方法に基づいて、コドン対最適化などの当業者に公知の方法によって達成され得る。
変異体生体触媒は、例えば以下の側面:基質に対する選択性、活性、安定性、溶媒耐性、pHプロファイル、温度プロファイル、基質プロファイル、阻害の受けやすさ、補助因子の利用および基質−親和性のうちの1つまたは複数に関して向上した特性を有し得る。向上した特性を有する変異体は、例えば、適切な高処理スクリーンングまたは当業者に公知のかかる方法に基づく選択方法を適用することによって同定することができる。
本発明によるプロセスにおいて反応工程を触媒するための1つまたは複数の酵素を含む細胞、特に組換え細胞は、それ自体が当技術分野で公知の分子生物学技術を用いて作製することができる。例えば、1つまたは複数の外来性酵素が組換え細胞において生成される場合、かかる技術を使用して、前記外来性酵素の1つまたは複数をコードする1つまたは複数の外来性遺伝子を含むベクター(例えば、組換えベクター)を提供することができる。1つまたは複数のベクターを使用してもよく、それぞれがかかる外来性遺伝子の1つまたは複数を含む。かかるベクターは、1つまたは複数の調節因子、例えば、酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結され得る、1つまたは複数のプロモーターを含み得る。
本明細書で使用される「外来性」という用語は、生体分子(例えば、DNA、RNA、タンパク質)が宿主細胞内に導入されることを意味することが意図される。生体分子は例えば、宿主細胞内に導入された後に相同(または異種)タンパク質をコードする相同(または異種)核酸であり得る。「異種」という用語は、宿主細胞以外のドナー源から単離された生体分子を意味するのに対して、「相同」という用語は、宿主細胞から単離された生体分子を意味する。したがって、本発明のコード化核酸の外来性発現では、異種または相同コード化核酸のいずれかまたは両方が利用され得る。
本発明者らが見出したように、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ1,3,5−トリアジン化合物(本発明によるプロセスで使用される)に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素は、メラミンデアミナーゼ(メラミンアミドヒドロラーゼとも呼ばれる)、s−トリアジンヒドロラーゼ(N−エチルアンメリンクロロヒドロラーゼとも呼ばれる)、ヒドロキシアトラジンヒドロラーゼ(アトラジンクロロヒドロラーゼとも呼ばれる)、グアニンデアミナーゼ(グアニンアミドヒドロラーゼとも呼ばれる)およびシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択される、いずれかの適切な酵素(つまり、1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有することを確認することができる場合にはその酵素は適している)であることができる。
一実施形態において、適切なメラミンデアミナーゼは、アシドボラックス(Acidovorax)、ケトグロニシゲニウム(Ketogulonicigenium)、シュードモナス(Pseudomonas)、ゴルドニア(Gordonia)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ミクロコッカス(Micrococcus)、クレブシエラ(Klebsiella)、ウィリアムシア(Williamsia)、ノカルジア(Nocardia)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ネステレンコニア(Nesterenkonia)、コクリア(Kocuria)、デルマコッカス(Dermacoccus)、キトコッカス(Kytococcus)およびエンテロバクター(Enterobacter)に由来するメラミンデアミナーゼからなる群から選択され得る。特に、前記メラミンデアミナーゼは、アシドボラックス・シトルリ(Acidovorax citrulii)(以前はシュードモナス・シトルリ(Pseudomonas・citrulii)と呼ばれた)、シドボラックス・アベナエ・シトルリ(Acidovorax avenae subspecies citrulii)(以前は、シュードモナス・シュードアルカリゲネス・シトルリ(Pseudomonas・pseudoalcaligenes subsp.citrulii)と呼ばれた)、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ(Ketogulonicigenium vulgare)、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス(Gordonia rubripertinctus)(ゴルドニア・ルブリペルチンクタ(Gordona rubripertincta)とも呼ばれ;ロドコッカス‐コラリナス(Rhodococcus corallinus)と同義語)、クレブシエラ・テラゲナ(Klebsiella・terragena)またはミクロコッカス属MF−1株から生じ得る。さらに詳しくは、前記メラミンデアミナーゼは、アシドボラックス・シトルリ(Acidovorax citrulii)NRRL B−12227またはケトグロニシゲニウム・ブルガレ(Ketogulonicigenium vulgare)Y25に由来し得る。
他の実施形態において、適切なs−トリアジンヒドロラーゼは、ゴルドニア(Gordonia)、ロドコッカス(Rhodococcus)、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、エンテロコッカス(Enterococcus)、アビトロフィア(Abiotrophia)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ルミノコッカス(Ruminococcus)、ゲメラ(Gemalla)、アトポビウム(Atopobium)、ストレプトベルティシリウム(Streptoverticillium)、アクチノプラーネス(Actinoplanes)、キタサトスポラ(Kitasatospora)、チャイニア(Chainia)およびアクチノスポランギウム(Actinosporangium)に由来するs−トリアジンヒドロラーゼからなる群から選択され得る。適切なs−トリアジンヒドロラーゼは特に、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス(Gordonia rubripertinctus)(ゴルドニア・ルブリペルチンクタ(Gordona rubripertincta)とも呼ばれ;ロドコッカス・コラリナス(Rhodococcus corallinus)と同義語)、さらに詳しくはロドコッカス・コラリナス(Rhodococcus corallinus)NRRL B−15444Rから選択され得る。
更なる実施形態において、適切なヒドロキシアトラジンヒドロラーゼは、アルスロバクター(Arthrobacter)、βプロテオバクテリウム(Beta proteobacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)、アミノバクター(Aminobacter)、ミクロコッカス(Micrococcus)、オウレオバクテリウム(Aureobacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、ノカルディオイデス(Nocardioides)、テラバクター(Terrabacter)、コマモナス(Comamonas)、バークホルデリア(Burkholderia)、ブレバンディモナス(Brevundimonas)、ボゲセラ(Vogesella)、デレヤ(deleya)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ヘルバスピリルム(Herbaspirillum)、ヒドロゲノファガ(Hydrogenophaga)またはシュードアルテロモナス(Pseudoalteromonas)に由来し得る。特に、適切なヒドロキシアトラジンヒドロラーゼは、シュードモナス(Pseudomonas)属ADPまたはアミノバクター・アミノボランス(Aminobacter aminovorans)に由来し得る。
また更なる実施形態において、適切なグアニンデアミナーゼは、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)、エシェリキア(Escherichia)、リゾビウム(Rhizobium)およびレクレルシア(Leclercia)に由来するグアニンデアミナーゼからなる群から選択され得る。特に、前記グアニンデアミナーゼは、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)または大腸菌(Escherichia coli)に由来し得る。さらに詳しくは、前記グアニンデアミナーゼは、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110または大腸菌(Escherichia coli)ETEC H10407に由来し得る。
また更なる実施形態において、適切なシマジンクロロヒドロラーゼは、ヘルバスピリルム(Herbaspirillum)に由来するシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択され得る。特に、前記シマジンクロロヒドロラーゼは、ヘルバスピリルム(Herbaspirillum)属B601に由来し得る。
特定の実施形態において、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号5(AAG41202.1)、配列番号6(YP_003963954.1)、配列番号7(Q52725.2)、配列番号8(NP_770520.1)および配列番号9(CBJ02579.1)によって表されるアミノ酸配列またはその相同体を含む。
「相同体」は特に、その参照タンパク質(つまり、配列番号5、6、7、8または9)と少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも65%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも75%、さらに好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも85%、さらに特には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチドに対して本明細書において使用される。相同体は一般に、参照タンパク質と類似の機能、好ましくは類似の構造を有するポリペプチドである。あるタイプの相同体は、同じ属の他の種からの遺伝子、または他の属からの遺伝子によってコードされる。「相同体」は、タンパク質の所望の特性を向上するために行われた突然変異誘発によって改変されたタンパク質を含むことも意図される。
配列同一性は本明細書において、配列を比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性は、配列の全長に関して比較されるが、互いに整列する配列の一部についても比較される。当技術分野において、「同一性」とは、場合により、かかる配列間のマッチによって決定される、ポリペプチド配列または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性を決定する好ましい方法は、テストされる配列間の最も大きなマッチを得るようにデザインされる。本発明の文脈において、2つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、BLASTPおよびBLASTN(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.1990,215,403−410(NCBIから公的に入手可能)および他の情報源(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894)が挙げられる。BLASTPを使用したポリペプチド配列比較の好ましいパラメーターは、ギャップ開始(gap open)10.0,ギャップ継続(gap extend)0.5,Blosum 62マトリックスである。BLASTNを使用した核酸配列の好ましいパラメーターは、ギャップ開始(gap open)10.0、ギャップ継続(gap extend)0.5,DNA完全マトリックスである(DNA同一性マトリックス)。
本発明のプロセスにおける水相は、主な溶媒が水である液相である。水相は、水のみ、水と1種または複数種の緩衝塩(例えば、リン酸カリウム緩衝剤)との混合物、水と有機溶媒(例えば、エチレングリコール、DMSO、THF)との混合物、または緩衝剤と有機溶媒(例えば、エチレングリコール、DMSO、THF)との混合物であり得る。当業者であれば、生体触媒の効率的な活性のために水相を選択し、かつ最適化することができるだろう。
固体間反応の性質のために、水性反応混合物の効果的な混合が、反応成分の良い輸送および接触を提供し、かつ粒子沈降を防ぐのに重要である。当業者であれば、商業的に利用可能な技術を用いて適切なミキサーデザインおよび混合条件を選択することができるだろう。効率的な混合は例えば、放射式ポンピング攪拌機によって行うことができ、粒子の沈降は、軸方向攪拌機によって反応容器の底に下向きにポンピングして、防ぐことができる。軸方向ポンピングインペラとして、幅が狭い水中翼が現況技術で使用されている。従来から、標準インペラとして傾斜ブレード付きタービンが使用されている。プロペラも、中心からそれた位置で使用することができる。中心にあるインペラを使用する場合、渦を巻く流れの向きをインペラの所望のパターンに変えるために、バッフル(baffling)を適用することができる。外部ループを介して水性反応混合物をポンピングすることによる混合を提供することも1つの選択肢である。意外なことに、本発明によるプロセスで使用される酵素は、未溶解固体の混合および存在のために生じる流体力学的剪断力に耐え抜くことが判明した。
原則的に、反応媒体のpHは、生体触媒が適用されるpH条件下にて活性である限り、広い範囲内で選択され得る。反応混合物のpHは適切には、4〜11、好ましくは5〜10である。AとBの間で選択されるpH、A〜Bの範囲のpHまたはA〜BのpH範囲は、終点AおよびBを含む。
本発明者らは驚くべきことに、そのpHがアンメリン:アンメリド比に対して顕著な影響を有することを見出した。実施例2および表3はこの影響を例示する。適用条件下およびpH範囲7〜10内では、pHが高いほど、アンメリン:アンメリド比が高くなった。特に、pHが7、8、9、9.5および10の時、アンメリン:アンメリド比はそれぞれ、3.5(アンメリン75.2モル%、アンメリド21.2モル%)、14.3(アンメリン90.0モル%、アンメリド6.3モル%)、56.8(アンメリン96.5モル%、アンメリド1.7モル%)、108.8(アンメリン97.9モル%、アンメリド0.9モル%)および164(アンメリン98.4モル%、アンメリド0.6モル%)となった。pH値7未満では逆の傾向が確認され、pHが高くなるほど、アンメリン:アンメリド比は低くなった。特に、pH5および6でのアンメリン:アンメリド比はそれぞれ、18.3(アンメリン91.5モル%、アンメリド5.0モル%)および8.8(アンメリン86.9モル%、アンメリド9.9モル%)であった。言い換えると、適用された条件下および6.5〜7.5の範囲のpH内では、高いアンメリド含有率の生成物が得られ、pH6.5未満、好ましくは6未満または7.5を超えるpH、好ましくは8を超えるpHにて、高いアンメリン含有率の生成物が形成された。したがって、このpHは、アンメリン:アンメリド比を微調整するための重要なパラメーターとして同定されている。
原則的に、使用される反応媒体の温度は、生体触媒が適用される温度条件下にて活性なままである限り、広い範囲内で選択され得る。本発明によるプロセスにおいて、反応温度は通常、0〜100℃、好ましくは10〜60℃である。
本発明によるプロセスにおいて、飽和を超えるローディングにて水性反応混合物にメラミン基質が添加されて、本発明において選択される温度およびpH範囲内で固体が形成される。選択される反応条件でメラミンが固体を形成する、メラミンローディングは、通常の実験によって決定することができる。
本明細書において意味される、「ローディング」という用語は、水性反応混合物の総質量に対して、反応混合物に最初に添加されるメラミンの総質量である。メラミンローディングは、質量パーセンテージ(質量%)と表される。
「飽和」は、メラミンの溶液が更なる量のメラミンをもはや溶解できず、かかる更なる量のメラミンが固体として現れる、最大ローディングのポイントとして本明細書において定義される。
本発明の一実施形態において、メラミンは、水性反応混合物の総質量に対して少なくとも1.0質量%、好ましくは少なくとも10質量%、さらに好ましくは少なくとも15質量%、またさらに好ましくは少なくとも20質量%、さらに好ましくは少なくとも30質量%のローディングで存在する。
本発明者らは驚くべきことに、その基質のローディングが最終生成物の組成に顕著な影響を及ぼし、メラミンローディングが高いほど、アンメリン:アンメリド比が高くなることを見出した。実施例3および表4はこの影響を例示する。適用される条件下にて、最初のメラミンローディングが約1質量%、9質量%および17.5質量%であると、アンメリン:アンメリド比はそれぞれ、108.8(アンメリン97.9モル%、アンメリド0.9モル%)、329.7(アンメリン98.9モル%、アンメリド0.3モル%)、494(アンメリン98.8モル%、アンメリド0.2モル%)となった。したがって、メラミンローディングは、アンメリン:アンメリド比を微調整するためのもう1つの重要なパラメーターとして同定される。
固体間反応が許容可能な転化レベルまで進行した後、従来の方法によって(例えば、濾過によって、遠心分離によって、またはデカンター遠心機にかけることによって)、水性反応混合物から固体生成物を単離することができる。その後、単離された生成物は、残留メラミン基質を除去するために水で洗浄され得る。アンメリン:アンメリド比は、これらの洗浄段階によって影響を受けない。
本発明によるプロセスによって得られる固体生成物は、高いアンメリンおよび/またはアンメリド含有率および低レベルの残留メラミンを有する。適切には、この生成物は、アンメリンおよび/またはアンメリドを少なくとも95質量%、メラミンを最大で5質量%含む。好ましくは、この生成物は、アンメリンおよび/またはアンメリドを少なくとも98質量%、メラミンを最大で2質量%含む。さらに好ましくは、生成物は、アンメリンおよび/またはアンメリドを少なくとも99質量%、メラミンを最大で1質量%含む。
原則的に、固体生成物のアンメリン:アンメリド比は、広い範囲内で微調整することができる。一般に、アンメリンは、アンメリドより多い。適切には、固体生成物は、1〜1000の範囲、さらに適切には2〜500の範囲のアンメリン:アンメリド比を有する。
本発明はさらに、本明細書に記述される本発明のプロセスに従って、様々な実施形態および/または好ましい特徴の可能性のあるすべての組み合わせに関する。
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるが、これらによって制限されることはない。
[実施例]
[材料および一般的な方法]
[1.メラミン基質;標準物質アンメリン、アンメリドおよびシアヌル酸]
99.9%を超える化学的純度を有するメラミン(OCl−窒素からの)が実施例に適用された。
化学的純度97.5%を有するアンメリン(Hicolからの)がHPLC分析における標準物質として使用された。
化学的純度99.7%を有するアンメリドがHPLC分析における標準物質として使用された。
99%を超える化学的純度を有するシアヌル酸がHPLC分析における標準物質として使用された。
[2.生体触媒の製造]
[2.a.組換え酵素のクローニングおよび発現]
1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする異なる生物からの5つの遺伝子が、本発明を例証するために選択された:つまり、配列番号5(AAG41202.1)、配列番号6(YP_003963954.1)、配列番号7(Q52725.2)、配列番号8(NP_770520.1)および配列番号9(CBJ02579.1)をそれぞれコードする、配列番号10(gi_11890745)、配列番号11(gi_310815990)、配列番号12(gi_4033703)、配列番号13(gi_27378991)および配列番号14(gi_309703244)(表1)。
Figure 0006519088
5つの標的遺伝子のうち4つ、つまり配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13は、大腸菌(Escherichia coli)において発現させるためにコドン対最適化され、その結果それぞれ、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4(配列表)が生じる。コドン対最適化は、国際公開第2008/000632号パンフレットに記載の手順に従って行われた。
より大規模な発現実験のために、Z−Competent(商標)大腸菌(E.coli)形質転換キット(Zymo Research,Irvine,CA,USA)を使用して、大腸菌(E.Coli)RV311細胞を化学的にコンピテントセルにし、大腸菌(E.coli)TOP10株から上述のように単離されたpBAD組換えベクターで形質転換した。形質転換体は、ネオマイシン100μg/mlを含有するLB寒天平板上で選択された。これらのプレートから、ネオマイシン50μg/mlを含有するLB培地における前培養物50mlを接種し、180rpmおよび28℃にてオービタルシェーカー上でインキュベートした。一晩インキュベートした後、前培養物を使用して、1L LB発現培養物(2Lバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ内)に0.05の開始OD620まで接種した。これらの発現培養物をオービタルシェーカー上で180rpmおよび28℃にてインキュベートした。培養物のうちの3分の1において、0.02%(w/v)L−アラビノースを添加することによって8時間後に、メラミンデアミナーゼ遺伝子の発現が誘発され、インキュベーションを一晩続けた。続いて、これらの培養物を10,000gで10分間遠心分離することによって、収集した。培養物のうちの他の3分の2も一晩インキュベートし、約24時間後に上述のように誘発された。4時間後および8時間後にそれぞれ、これらの培養物も遠心分離によって収集された。
[2.b.10L規模での生体触媒の発酵]
炭素源としてグルコースを使用して、10L規模で流加(fed−batch)発酵において、pBAD組換えベクターを発現する大腸菌(E.Coli)RV311の発酵を行った。
[2.c.小規模(1〜10ml)での無細胞抽出物の製造]
氷冷100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を使用して、細胞ペレットをその湿重量の2倍の体積に再懸濁した。Sonics(Meyrin/Satigny,Switzerland)Vibra−Cell VCX130音波発生器(出力100%,10秒オン/10秒オフ,10分間)を使用して、細胞浮遊液を音波処理し、氷/アセトン浴で冷却し、続いてエッペンドルフ(Eppendorf)5415R遠心機(Hamburg,Germany)で13,000×gおよび4℃にて30分間遠心することによって、無細胞抽出物(CFE)が得られた。上清(=CFE)を新しいチューブに移し、すぐに使用するために氷上に保存するか、または−20℃で保存した。
[2.d.大規模(10〜250ml規模)での無細胞抽出物の製造]
湿潤細胞(凍結された)76.3gに、リン酸カリウム緩衝液(100mM,pH=7)を添加した。細胞を懸濁し、氷上に置いた。続いて、リゾチーム1125mg、ベンゾナーゼ50μlを添加し、混合し、−20℃で一晩置いた。翌朝、懸濁液を37℃の部屋で振盪機上に2.25時間置いた。その後、懸濁液を氷上で冷却し、続いて50mlのチューブ8本に分け(それぞれ約28ml)、Sonics(Meyrin/Satigny,Switzerl)およびVibra−Cell VCX130音波発生器(出力100%,10秒オン/10秒オフ,10分間)を使用して、各懸濁液を2分間音波処理し、氷/アセトン浴で冷却した。続いて、懸濁液を4℃の部屋で氷上で4時間保存した。次に、懸濁液を15.000rpmにて15分間遠心分離した。得られた上清を回収し、−20℃で保存した。
[3.タンパク質の決定]
BradfordによりAnal.Biochem.72:248−254(1976)に記述される修飾タンパク質−色素結合法を用いて、CFEにおけるタンパク質の濃度を決定した。各試料のうち適切な希釈度の50μを試薬950μl(エタノール46mlおよび85%オルト−リン酸100mlに溶解されたブリリアントブルー(Brilliant Blue)G250 100mg、ミリQ水で1,000mlまで満たした)と共に室温で少なくとも5分間インキュベートした。Perkin Elmer Lambda35UV/VIS分光光度計で波長595nmでの各試料の吸収を測定した。既知の濃度のウシ血清アルブミン(BSA、0.0125mg/ml〜0.20mg/mlの範囲)を含有する溶液で決定された較正線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。
[4.SDS−PAGE分析]
大腸菌(E.coli)TOP10 CFEおよび大腸菌(E.coli)RV311CFEのSDS−PAGEによって、大腸菌(E.coli)における組換え発現を分析し、過剰発現された対照タンパク質とCFEを比較した。
[5.転化反応および生成物の単離]
[5.a.転化反応−概要]
転化反応は、プロペラ撹拌機を含有する80mlのガラス反応器内、またはタービン攪拌機およびpHスタット装置(Metrohm社製type718 Stat Titrino)を含有する1600mlガラス反応器内で行われた。約500rpmの攪拌機速度が適用された。
一般に、転化は以下のとおり行われた:特定量のメラミンを37℃の緩衝液(100mM KHPO/1mM MgSO.7HO)に添加して、所望のローディングを達成した。1M HPO(7以下のpHを得るために)または1M NaOH(8以上のpHを得るために)を使用して、pHを所望の値に調整した。続いて、生体触媒を添加して、転化を開始した。パラグラフ6に記載のHPLC分析のために、転化経路で試料を採取した。
[5.b.生成物の単離]
真空(約750ミリバール)を用いて、P3ガラスフィルター上に反応混合物を注ぐことによって、特定の反応時間の後に、生成物の単離を行った。濾過ケークを水で3回洗浄した。得られた生成物を一晩乾燥させた。
[6.HPLC分析]
[6.a.HPLC分析のための試料作製]
水性反応混合物の試料または単離された生成物の試料を最初に、1,3,5−トリアジン化合物総濃度約0.5質量%までギ酸で希釈し、続いて、HPLC分析にかける前に、水で50倍希釈した。
[6.b.HPLC分析法]
2つの250mm Prevail C18カラムが使用される。重要な分離がアセトニトリル0%にて行われる。勾配後に少なくとも8分間、カラムが平衡化される。
使用されたHPLCの具体的な分析条件は:
カラム:Prevail C18 2×(250mm×4.6mmID×5□m)
溶離剤A:HClO pH=2.0(70%HClO1.63g/水)
溶離剤B:アセトニトリル
流量:1.2ml/分
注入容積:5μl
カラム温度:15℃
検出波長:195nm
Figure 0006519088
[実施例1:水性反応混合物中での固体間反応による、メラミンからのアンメリンおよび/またはアンメリドの製造。]
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。
試験反応のために、メラミン555mgを37℃の緩衝液(100mM KHPO/1mM MgSO・7HO)47gに添加した。1M NaOH1.65gでpHを9.5に調整した。続いて、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物0.25mlを添加して反応を開始し、それによって無細胞抽出物の最終濃度0.5体積%が得られた。メラミンローディングは1.1質量%であった。1M NaOHで滴定することによって、pHを9.5で一定に維持した。
生体触媒を添加しないことを除いては、上述の手順と同じ手順を用いて、化学的ブランク反応を並行して行った。メラミンを転化することができない酵素(この場合には、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BM3由来のP450モノオキシゲナーゼ酵素)をコードする遺伝子挿入を有するpBAD組換えベクターを内部に持つ大腸菌(E.coli)RV311から無細胞抽出物が得られることを除いては、上述の手順と同じ手順を用いて、生物学的ブランク反応を並行して行った。
18時間の反応時間後、HPLC分析のために、3つの反応混合物から試料を採取した。結果を表2に示す。
Figure 0006519088
表2の結果から、アンメリンおよびアンメリドへのメラミンの転化率は、生体触媒(つまり、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物)の活性によるものである。反応混合物に最初に添加されるメラミンは、18時間以内にほぼ完全にアンメリンおよびアンメリドに転化される。シアヌル酸は形成されなかった。メラミンの有意な転化は、化学的ブランク反応混合物では起こらず、メラミンが適用条件下での反応中に化学的に安定であることが示された。さらに、メラミンの有意な転化は、生物学的ブランク反応混合物では起こらなかった。
[実施例2:アンメリン:アンメリド比に対するpHの影響。]
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。37℃の緩衝液(100mM KHPO/1mM MgSO・7HO)47gにメラミン555mgを添加した。1M HPO(7以下のpHを得るために)または1M NaOH(8以上のpHを得るために)を使用して、pHを所望の値に調整した。続いて、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物0.25mlを添加して反応を開始し、それによって、0.5体積%の無細胞抽出物の最終濃度が得られた。メラミンローディングは1.1質量%であった。1M HPOまたは1M NaOHで滴定することによって、pHを一定に維持した。HPLC分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表3に示す。
Figure 0006519088
表3の結果から、反応混合物において得られたアンメリン:アンメリド比は、pHによって微調整することができることが分かる。7〜10のpH範囲内では、pHが高いほど、アンメリン:アンメリド比が高くなる。7未満のpHでは逆の傾向が確認され、pHが高いほど、アンメリン:アンメリド比が低くなる。シアヌル酸が全く検出されなかったことは注目に値する。
[実施例3:アンメリン:アンメリド比に対するメラミンローディングの影響。]
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。37℃の緩衝液(100mM KHPO/1mM MgSO・7HO)47gにメラミンを1.1質量%、9質量%または17.5質量%のローディングまで添加した。1M NaOHを使用して、pHを9.5に調整した。続いて、反応を開始するために、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物をそれぞれ、濃度0.5体積%、5体積%または10体積%まで添加した。1M NaOHで滴定することによって、転化中、pHを一定に維持した。HPLC分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表4に示す。
Figure 0006519088
表4の結果から、選択された反応条件にて、アンメリン:アンメリド比は、メラミンローディングを調節することによって微調整することができることが分かり;選択された反応条件にて、メラミンローディングが高いほど、アンメリン:アンメリド比が高くなる。シアヌル酸が全く検出されなかったことは注目に値する。
[実施例4:1L規模での水性混合物中における固体間反応による、アンメリンおよび/またはアンメリドの製造。]
緩衝液(100mM KHPO/1mM MgSO・7HO)1050mlにメラミン125.2gを添加することによって、1.6L撹拌ガラス反応器内で反応混合物を調製した。メラミン固体基質を37℃で20分間撹拌し、その後、5M NaOH0.05gを添加することによって、pHをpH9.5に調整した。反応を開始するために、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物62.5mlを添加し(5体積%)、その後、5M NaOHをさらに0.1g添加することによって、pHをpH9.5に調整した。メラミンローディングは10.1質量%であった。転化中、pHスタット装置を適用して、1M HPOの溶液を滴定することによって、pH9.5で一定に維持した。HPLC分析のために、試料を採取した。5時間後、反応を止め、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。アンメリン98.6質量%、アンメリド0.4質量%、メラミン1質量%を含有する生成物が合計125g得られ、転化率99%に相当した。シアヌル酸は形成されなかった。

Claims (11)

  1. 生体触媒を含む水性反応混合物において、メラミンからアンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスであって、
    メラミンが、固体間反応によってアンメリンへと転化され、
    前記生体触媒が、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する、少なくとも1種類の酵素を含む、プロセス。
  2. 前記酵素が、メラミンデアミナーゼ、s−トリアジンヒドロラーゼ、ヒドロキシアトラジンヒドロラーゼ、グアニンデアミナーゼおよびシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
  3. 前記酵素が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9によって表されるアミノ酸配列、またはその相同体を含む、請求項1または2に記載のプロセス。
  4. メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも1.0質量%のローディングで存在する、請求項1から3のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも10質量%のローディングで存在する、請求項4に記載のプロセス。
  6. メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも20質量%のローディングで存在する、請求項5に記載のプロセス。
  7. メラミンが、5〜10で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
  8. メラミンが、6.5〜7.5で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
  9. メラミンが、6.5未満で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
  10. メラミンが、7.5を超えて選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
  11. 前記水性反応混合物が有機溶媒を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のプロセス。
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