JP6519088B2 - アンメリンを製造するプロセス - Google Patents
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Description
[材料および一般的な方法]
[1.メラミン基質;標準物質アンメリン、アンメリドおよびシアヌル酸]
99.9%を超える化学的純度を有するメラミン(OCl−窒素からの)が実施例に適用された。
化学的純度97.5%を有するアンメリン(Hicolからの)がHPLC分析における標準物質として使用された。
化学的純度99.7%を有するアンメリドがHPLC分析における標準物質として使用された。
99%を超える化学的純度を有するシアヌル酸がHPLC分析における標準物質として使用された。
[2.a.組換え酵素のクローニングおよび発現]
1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする異なる生物からの5つの遺伝子が、本発明を例証するために選択された:つまり、配列番号5(AAG41202.1)、配列番号6(YP_003963954.1)、配列番号7(Q52725.2)、配列番号8(NP_770520.1)および配列番号9(CBJ02579.1)をそれぞれコードする、配列番号10(gi_11890745)、配列番号11(gi_310815990)、配列番号12(gi_4033703)、配列番号13(gi_27378991)および配列番号14(gi_309703244)(表1)。
炭素源としてグルコースを使用して、10L規模で流加(fed−batch)発酵において、pBAD組換えベクターを発現する大腸菌(E.Coli)RV311の発酵を行った。
氷冷100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を使用して、細胞ペレットをその湿重量の2倍の体積に再懸濁した。Sonics(Meyrin/Satigny,Switzerland)Vibra−Cell VCX130音波発生器(出力100%,10秒オン/10秒オフ,10分間)を使用して、細胞浮遊液を音波処理し、氷/アセトン浴で冷却し、続いてエッペンドルフ(Eppendorf)5415R遠心機(Hamburg,Germany)で13,000×gおよび4℃にて30分間遠心することによって、無細胞抽出物(CFE)が得られた。上清(=CFE)を新しいチューブに移し、すぐに使用するために氷上に保存するか、または−20℃で保存した。
湿潤細胞(凍結された)76.3gに、リン酸カリウム緩衝液(100mM,pH=7)を添加した。細胞を懸濁し、氷上に置いた。続いて、リゾチーム1125mg、ベンゾナーゼ50μlを添加し、混合し、−20℃で一晩置いた。翌朝、懸濁液を37℃の部屋で振盪機上に2.25時間置いた。その後、懸濁液を氷上で冷却し、続いて50mlのチューブ8本に分け(それぞれ約28ml)、Sonics(Meyrin/Satigny,Switzerl)およびVibra−Cell VCX130音波発生器(出力100%,10秒オン/10秒オフ,10分間)を使用して、各懸濁液を2分間音波処理し、氷/アセトン浴で冷却した。続いて、懸濁液を4℃の部屋で氷上で4時間保存した。次に、懸濁液を15.000rpmにて15分間遠心分離した。得られた上清を回収し、−20℃で保存した。
BradfordによりAnal.Biochem.72:248−254(1976)に記述される修飾タンパク質−色素結合法を用いて、CFEにおけるタンパク質の濃度を決定した。各試料のうち適切な希釈度の50μを試薬950μl(エタノール46mlおよび85%オルト−リン酸100mlに溶解されたブリリアントブルー(Brilliant Blue)G250 100mg、ミリQ水で1,000mlまで満たした)と共に室温で少なくとも5分間インキュベートした。Perkin Elmer Lambda35UV/VIS分光光度計で波長595nmでの各試料の吸収を測定した。既知の濃度のウシ血清アルブミン(BSA、0.0125mg/ml〜0.20mg/mlの範囲)を含有する溶液で決定された較正線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。
大腸菌(E.coli)TOP10 CFEおよび大腸菌(E.coli)RV311CFEのSDS−PAGEによって、大腸菌(E.coli)における組換え発現を分析し、過剰発現された対照タンパク質とCFEを比較した。
[5.a.転化反応−概要]
転化反応は、プロペラ撹拌機を含有する80mlのガラス反応器内、またはタービン攪拌機およびpHスタット装置(Metrohm社製type718 Stat Titrino)を含有する1600mlガラス反応器内で行われた。約500rpmの攪拌機速度が適用された。
真空(約750ミリバール)を用いて、P3ガラスフィルター上に反応混合物を注ぐことによって、特定の反応時間の後に、生成物の単離を行った。濾過ケークを水で3回洗浄した。得られた生成物を一晩乾燥させた。
[6.a.HPLC分析のための試料作製]
水性反応混合物の試料または単離された生成物の試料を最初に、1,3,5−トリアジン化合物総濃度約0.5質量%までギ酸で希釈し、続いて、HPLC分析にかける前に、水で50倍希釈した。
2つの250mm Prevail C18カラムが使用される。重要な分離がアセトニトリル0%にて行われる。勾配後に少なくとも8分間、カラムが平衡化される。
使用されたHPLCの具体的な分析条件は:
カラム:Prevail C18 2×(250mm×4.6mmID×5□m)
溶離剤A:HClO4 pH=2.0(70%HClO41.63g/水)
溶離剤B:アセトニトリル
流量:1.2ml/分
注入容積:5μl
カラム温度:15℃
検出波長:195nm
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。37℃の緩衝液(100mM K2HPO4/1mM MgSO4・7H2O)47gにメラミン555mgを添加した。1M H3PO4(7以下のpHを得るために)または1M NaOH(8以上のpHを得るために)を使用して、pHを所望の値に調整した。続いて、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物0.25mlを添加して反応を開始し、それによって、0.5体積%の無細胞抽出物の最終濃度が得られた。メラミンローディングは1.1質量%であった。1M H3PO4または1M NaOHで滴定することによって、pHを一定に維持した。HPLC分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表3に示す。
攪拌機およびpHスタット装置を含む約55mlの充填容積を有する80ml反応器において転化反応を行った。37℃の緩衝液(100mM K2HPO4/1mM MgSO4・7H2O)47gにメラミンを1.1質量%、9質量%または17.5質量%のローディングまで添加した。1M NaOHを使用して、pHを9.5に調整した。続いて、反応を開始するために、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物をそれぞれ、濃度0.5体積%、5体積%または10体積%まで添加した。1M NaOHで滴定することによって、転化中、pHを一定に維持した。HPLC分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表4に示す。
緩衝液(100mM K2HPO4/1mM MgSO4・7H2O)1050mlにメラミン125.2gを添加することによって、1.6L撹拌ガラス反応器内で反応混合物を調製した。メラミン固体基質を37℃で20分間撹拌し、その後、5M NaOH0.05gを添加することによって、pHをpH9.5に調整した。反応を開始するために、大腸菌(E.coli)RV311pBAD_Meldeam_Aciの無細胞抽出物62.5mlを添加し(5体積%)、その後、5M NaOHをさらに0.1g添加することによって、pHをpH9.5に調整した。メラミンローディングは10.1質量%であった。転化中、pHスタット装置を適用して、1M H3PO4の溶液を滴定することによって、pH9.5で一定に維持した。HPLC分析のために、試料を採取した。5時間後、反応を止め、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。アンメリン98.6質量%、アンメリド0.4質量%、メラミン1質量%を含有する生成物が合計125g得られ、転化率99%に相当した。シアヌル酸は形成されなかった。
Claims (11)
- 生体触媒を含む水性反応混合物において、メラミンからアンメリンおよび/またはアンメリドを製造するプロセスであって、
メラミンが、固体間反応によってアンメリンへと転化され、
前記生体触媒が、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ1,3,5−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する、少なくとも1種類の酵素を含む、プロセス。 - 前記酵素が、メラミンデアミナーゼ、s−トリアジンヒドロラーゼ、ヒドロキシアトラジンヒドロラーゼ、グアニンデアミナーゼおよびシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記酵素が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9によって表されるアミノ酸配列、またはその相同体を含む、請求項1または2に記載のプロセス。
- メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも1.0質量%のローディングで存在する、請求項1から3のいずれか一項に記載のプロセス。
- メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも10質量%のローディングで存在する、請求項4に記載のプロセス。
- メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも20質量%のローディングで存在する、請求項5に記載のプロセス。
- メラミンが、5〜10で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
- メラミンが、6.5〜7.5で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
- メラミンが、6.5未満で選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
- メラミンが、7.5を超えて選択されるpHにて、アンメリンおよび/またはアンメリドへと転化される、請求項7に記載のプロセス。
- 前記水性反応混合物が有機溶媒を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のプロセス。
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