PT81227B - Celulas vegetais resistentes a inibidores herbicidas de glutamina sintetase - Google Patents
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- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
- A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- A01H1/123—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8277—Phosphinotricin
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Description
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
O invento será melhor compreendido pela referência as Figuras juntas em que
A Figura 1 mostra o ciclo da glutamina sintetase/ glutamato sintetase em que se mostra que GS catalisa a formação de glutamina a partir de ácido glutâmico e amónia ou numa reacção em que se dá a hidrólise de ATP em ADP e fosfato inorgânico. 0 azoto amido da glutamina constitui a fonte de azoto para muitas reacções de biossíntese indicando um papel central para o GS no metabolismo do azoto. 0 inibidor de GS herbicida, ao inibir GS, evita a biossíntese da glutamina evitando deste modo a desintoxi cação em relação a amónia.
A Figura 2 mostra as caracteristicas de crescimento da linha celular de alfafa tipo selvagem (sensível ao PPT) na ausência (o) e na presença de 25(^), 50 (®) e 100 ( D ) Jim de L-PPT.
A Figura 3 mostra as caracteristicas de crescimento de uma linha celular de alfafa variante resistente ao PPT na ausência (o) e na presença de 100 (^. ), 200 (®) e 500 (Q) pm de L-PPT.
-10-
TftBÍT
MELHOR MANEIRA DE REALIZAR O INVENTO
Na descrição que se segue são extensivamente usados uma serie de termos empregues em tecnologia de DNA recombinante e de genetica de plantas. Com o fim de fornecer um entendimento daro e consistente da especificação e reivindicações, incluindo o âmbito em que são usados tais termos, são dadas as definições que se seguem:
Nucleotídeo . Uma unidade monomérica de DNA ou de RNA con sistindo num açúcar, um fosfato e uma base heterocíclica azotada. A base está ligada a porção açúcar através de um carbono glicosídico (carbono 1' da pentose). A combinação de uma base e de um açúcar é designado por nucleosídeo. Cada nucleotídeo é caracterizado pela sua base. As quatro bases do DNA são a adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) . As qiatro BASES DÓ RNA são A, G, C e uracilo (U).
Sequência genetica . Um arranjo linear de nucleotídeos ligados una aos outros por ligações fosfodiéster entre os carbonos 3' e 5' de pentoses adjacentes.
Sequência genetica funcional . Uma sequência genetica codificadora de um polipeptideo tendo a actividade pretendidz, independentemente da sequencia ser menor ou maior do que a sequencia de tamanho completo de poliopeptideo. É também definido como "gene funcional".
Codão ou tripleto . Uma sequencia de DNA com três núcleo tídeos que codifica através do mRNA um aminoácido, um .sinal de iniciação de tradução ou um sinal de terminação da tradu' ção. Por exemplo, os codões TTA, TTG, CTT, CTC, CTA e
-11CTG codificam o aminoácido leucina. TAG, TAA e TGA são sinais de paragem da tradução e ATG é um sinal de iniciação da tradução.
Fase de. Leitura. 0 agrupamento de codões durante a traduçao do mRNA na sequência de aminoácidos. Durante a tradução deve-se manter a fase de leitura correcta. Por exemplo, a sequencia GCTGGTTGTAAG pode ser tratada e traduzida em três fases de leitura ou frases dependendo se começa com G, com C ou com T podendo assim dar três produtos peptidicos diferentes.
Duas sequências estão em ligação operacional quando a fase de leitura de uma sequencia está ligada a outra de modo a ambas operarem em combinação como se estivessem presentes independentemente.
Transcrição 0 processo de produção de mRNA a partir de um gene funcional.
Tradução. O processo de produção de um polipeptídeo a partir de mRNA.
Expressão. 0 processo, iniciado com um gene funcional, para produzir o seu polipeptídeo, sendo uma combinação de trans. crição e tradução.
Veiculo de clonagem. Um plasmideo, DNA fágico ou outras se quências de DNA que sejam capazes de se replicarem numa célula hospedeira, que se caracteriza por possuir um ou um pequeno número de locais de reconhecimento por endonucle ases nos quais esses sequências de DNA podem ser cortadas de modo determinado sem perda de uma função biologica essencial do DNA e que possui uma marca adequada ao uso na
-12csSíCsr
identificação de células transformadas. Um exemplo tipico é uma marca de resistência a um antibiótico. A palavra "vector" é por vezes usada para um veiculo de clonagem.
Veiculo de expressão . Um veiculo, analogo a um veiculo de clonagem, que é particularmente util para produção em célu las hospedeiras de um polipeptideo, por expressão do gene funcional codificador do referido polipeptideo, presente no veiculo.
Veiculo de replicação . Um veiculo de clonagem ou de espres^ são.
Fago ou bacteriófago. Um virus bacteriano que pode consisitr em sequencia de DNA encapsidadas num invólucro ou revestimento proteico.
Plasmídeo . Uma sequência de DNA de cadeia dupla são cromos: sómico compreendendo um "replicão" intacto, de tal modo que o plasmideo é replicado ou incorporado no genoma de uma célula hospedeira. Quando o plasmídeo é colocado num organismo celular-uni ou multicelular, as caracteristicas desse organismo podem ser alteradas ou transformadas como resultado do DNA do plasmideo. Por exemplo um plasmideo tendo o gene da resistência a canamicina transforma uma célula previamente sensível a canamicina numa que é resis tente a esta droga.
Clonagem. 0 processo de obtenção de uma população de organismos ou sequências de DNA derivados de um desses organismos ou sequências por reprodução assexuada.
Sequência de controle da expressão. Uma sequência genética que controla e regula a expressão de sequências genéticas funcionais, quando operacionalmente ligada aquelas
sequências. Nelas estão incluídas sequências que se sabe controlarem as regiões que regulam a expressão. Incluem sequências promotoras e de terminação.
Promotor Vegetal. Uma sequência de controle de expressão que é capaz de causar a expressão na referida planta de quaisquer sequências geneticas homólogos ou heterólogas operacionalmente ligadas ao referido promotor.
Promotor vegetal de superprodução (OPP). Um promotor vegetal capaz de provocar a expressão, numa célula vegetal transformada, de qualquer sequência ou sequências genéticas funcionais operacionalmente ligadas em níveis (medidos pelos quantidades de mRNA ou de polipeptídeo) substancialmente superiores aos niveis naturalmente observados em células hospedeiras não transformadas com o referido OPP.
Degeneração. Uma caracteristica informativa de acordo com a qual um aminoácido na natureza pode ser codificado, por mais de um codão. Por exemplo, leucina pode ser cod_i ficada por TTG, TTA, CTA, CTT, CTC ou CTG.
Por variações degenerativas , conforme usado no presente pedido e reivindicação, pretende-se significar qualquer variação dos fragmentos polinucleotidios do invento devido a degeneração do codigo genético. Por exemplo, desde que o material resultante ainda codifique GS funcional, ou suas partes, tal material deve ser incluído no presente invento.
Glutamina Sintetase (GS): A definição desta enzima é fun cional e inclui qualquer glutamina sintetase capaz de funcionar numa dada planta pretendida para transformar áci do glutâmico em glutamina no ciclo da GS. 0 termo inclui portanto não apenas a enzima da especie de planta especi fica envolvida na transformação genética mas pode incluir GS de outras especies vegetais ou microorganismos ou mesmo dos outros eucariotas, se essas GS fôr capaz do funcio nar nas células vegetais transformadas. Os termos incluem proteinas ou polipeptídeos tendo mais ou menos o comprimento estrutural total da GS vegetal natural, tais como fragmentos parciais funcionais da GS ou os seus análogos.
Glutamina Sintetase (GS) . A definição desta enzima é funcional e inclui qualquer glutamina sintetase, capaz de funcionar numa dada planta pretendida para transformar ácido glutâmico em glutamina no ciclo da GS. 0 termo inclui portanto não apenas a enzima da especie de plantas especifica envolvida na transformação genética mas pode incluir GS de outras especies vegetais ou microorganismos ou mesmo de outros eucariotas, se essa GS fôr capaz de funcionar nas células vegetais transformadas. Os termos incluem proteinas ou polipeptídeos tendo mais ou menos o comprimento estrutural total da GS vegetal natural, tais como fragmentos parciais funcionais da GS ou os seus análogos.
Fosfinotricina (PPT). O composto com a fórmula (1) supra , na sua forma biologicamente activa. Podem ser as formas L, D, ou L,D e podem ser isolados ou em combinação com outros compostos inertes ou activos que não interfiram com a actividade de PPT.
0 invento compreende no seu nivel mais fundamental numa célula vegetal que é resistente a um inibidor da glutamina sintetase herbicida em que a resis-
tência é provocada por níveis de actividade de GS que, quan do presentes uma célula de outro modo sensível ao inibidor de GS herbicida, torna a célula substancialmente resistente ao inibidor de GS herbicida.
Os termos "inibidor da glutamina sintetase herbicida" pretendem incluir qualquer inibidor, competitivo ou não competitivo, que diminua significantemente a actividade de glutamina sintetase de uma célula vegetal de uma determinada especie, e como consequência disso, para provocar efeitos herbicidas na célula vegetal. A célula vegetal ou planta total resistente ao herbicida sobrevive sem danificação irreversível a uma concentração de inibidor de GS herbicida queé letal para iridividuos selvagens da mesma especie. Normalmente, um aumento:, de cinco vezes ou superior na resistência ao inibidor de GS herbicida é considerado signif icante. No entanto, ?este numero varia de especie vegetal e de herbicida para herbicida. Não é portanto correcto fornecer um nível unico para todas as diferentes especies vegetais e herbicidas englobados no presente invento. Tal nível, pode no entanto ser facilmente acertado pelos entendidos na maté ria.
Entre os inibidores de GS herbici^ das xobertos pelo invento encontram-se a fosfinotricina a metionina, sulfoximina, assim como outros análogos do ácido glutâmico.
A glutamina sintetase pode ou não ser da célula vegetal especifica a ser transformada. Tudo o que é necessário é que a sequência genética da enzima a ser expressa e produzida, seja um enzima funcional na célula vegetal final. Assim, o invento compreende células vegetais possuindo tanto genes GS homólogos como genes GS heterólogos ( e os seus sais respectivos produtos de expressão). De um modo geral , a enzima poderá também ser de outro especie
vegetal, ou mesmo enzimas de organismos diferentes, como sejam microorganismos ou animais. São preferidos os genes de glutamina sintetase vegetal e os seus produtos de expressão. São:' de particular interesses os genes da glutamina sintetase da especie vegetal particular que serve como hospedeiro na manipulação genética, i.e., genes GS homólogos. Um desses grupos genes de glutamina sintetase utiliza vel nas moléculas de rDNA do invento está ilustrado no Exemplo 2.
Qualquer célula vegetal sensível aos inibidores de GS herbicidas, que seja capaz de sofrer manipulação genética pelas construções genéticas ou métodos do invento e capaz de expressar as referidas construções, pode ser usada no presente invento. Entre as plantas dicotiledóneas estão incluídas varias especies de batata (solanum tuberosum); tomate (Lycopersicon esculentum); pimenta (Capsicum cennumm); tabaco (Nicotiana tabacum) ; varias especies de Barssica, especialmente colza (Brassica napus) vários legumes,por exemplo alfafa (Medicago sativa), trevo (TRifolium spp) soja (Glycine max), amendoim (Arachis hypogae), várias especies de feijão (Phaseolus spp. Vicia sp., Vigna sp.), ervilhas (Pisum sativum) culturas de raízes como seja a beterraba (Beta vulgaris), cenouras (Dancus carota) e batata doce (Ipomoea batatus).
Existe uma variedade de realização incluidas no conceito largo do invento. A célula vegetal resistente ao inibidor de GS herbicida pode possuir níveis significantemente superiores de actividade de GS através de qualquer um de uma variedade de mecanismo e/ou construções genéticas.
Por exemplo o invento compreende numa das suas execuções, uma combinação de duas sequências genéticas: (a) uma primeira sequência genética codificando
*
-17uma glutamina sintetase funcional numa dada célula vegetal operacionalmente ligada a jusante de (b) uma segunda sequên cia genética capaz de aumentar os níveis do produto genético da referida primeira sequência de modo que quando a combinação está presente numa célula vegetal de outro modo sensível ao inibidor de GS, a referida célula é substancialmente resistente ao referido inibidor de GS herbicida.
A segunda sequência genética pode ser um promotor ou uma sequência amplificadora. Se fôr um promotor pode ser um promotor de GS ou um promotor de outro gene estrutural. Nestes dois últimos casos o promotor util na combinação é um promotor vegetal de super-produção. A única característica essencial deste promotor é que, quando numa ligação operacional com a sequência gené tica da glutamina sintetase, seja capaz de promover a expressão da referida glutamina sintetase em níveis tais que quando o combinação está pressente numa célula vegetal de outro modo sensível ao inibidor de GS herbicida, a célula torna-se substancialmente resistente ao referido inibidor de GS.
Assim, a escolha do promotor vegetal a usar é regulada por considerações funcionais. 0 promotor vegetâl será heterélogó ou homólogo da célula hospedeira.
0 promotor endógeno nativo da referida célula hospedeira será incapaz de causar resistência através de superprodução de GS, uma vez que o promotor nativo normalmente promove a expressão de GS a niveis tão baixos que são substancialmente ou completamente inibidos pelas concentrações de herbicida de controle vegetal normalmente usadas. Assim, numa execução do presente invento, o promotor nativo é substituído por um OPP.
-18-
Entre os PPs úteis encontram-se o promotor da subunidade pequena (ss) da ribulose bi-fosfato carboxilase e da proteina de ligação a clorofila a/b. A expressão destes dois genes verificou-se ser induzido pela luz a nível transcrição no tecido verde (ver, por exemplo, Genetic Engineering of Plants, An Agricultural Perspective
A. Cashmore, Plénum, New York 1983, paginas 29-38, Coruzi G. et al The Journal of Biological Chemistry 258:1399 (1983) ou Dunsmuir P. et al. , Journal of Molecular and Applied Genetics 2:285(1983).
0 invento estende-se a qualquer célula vegetal modificada de acordo com os métodos descritos ou modificada por quaisquer outros métodos que confiram resistência ao inibidor de GS herbicida. A célula vegetal pode estar viva ou não por si só em cultura de tecidos ou como parte de uma planta multicelular ou parte dela. Tal planta, multicelular que no seu estado não transformado é sensivel ao inibidor de GS herbicida, será resistente quan do as suas células forem resistentes de acordo com o invento.
Partes obtidas de plantas, como sejam as flores, sementes, folhas, ramos, frutos e similares também estão cobertas pelo invento, desde que estas partes possuam células resistentes ao inibidor de Gs herbicida como foi dito. Em particular, as partes de plantas podem estar vivas ou não. Assim, um tomate, cenoura ou folha de tabaco modificados geneticamente obtidos de um tomate, cenou ra ou planta do tabaco estão englobados no invento mesmo se separados da planta de origem.
Processo de Produção e Intermediários nele usados.
-19Várias metodologias são aplicáveis para efectuar as diferentes execuções do invento. Por exem: pio, se a resistência ao inibidor de GS herbicida fôr conseguida através do aumento significativo do número de copias de um gene estrutural (em oposição a super-produção, atrás mencionada, do gene selvagem), as metodologias disponíveis incluem selecção de uma célula que seja resistente devido a amplificação do gene GS ou, como alternativa, introdução de múltiplas cópias do gene GS no genoma ou um elemento de replicação extracromossómica.
A selecção é efectuada num meio de cultura apropriado através do cultivo de cálulas vegetais na presença de aumentos graduais do inibidor de Gs herbicida no meio. Após um determinado periodo de tempo decorrido, como seja, por exemplo, entre algumas semanas a .vários meses, é possivel seleccionar uma população de células que seja várias vezes mais resistente ao inibidor de GS herbicida dos que as células vegetais originais. Por exemplo, quando as células são de alfafa eo inibidor é PPT, é possível obter uma linha celular de alfafa resistente ao PPT após um ano de aumentos graduais de PPT, linha de essa vinte vezes mais resistente ao PPT do que a linha original. Quando a linha resistente foi subcultivada durante vários meses na ausência do inibidor, observou-se um lento decrésci. mo na percentagem de célula resistentes em experiências de sementeira sobre meio de agar contendo inibidor, mas após mais de seis meses foi possivel seleccionar clones de células altamente resistentes. Isto nunca foi possivel através da sementeira de células do tipo selvagem.
A regeneração de calli e plantas crescidas a partir de células em cultura de tecidos é conheci, da nos entendidos na matéria e varia de especie para espeVer, por exemplo Sheperd, Scientific
American, 1982, aqui incluido como referência. De um modo
geral é dado, primeiro uma suspensão de protoplastos contendo múltiplas cópias do gene GS ou possuindo a combinação
de sequências genéticas.
A formação de embriões pode então ser induzida a partir de suspensões de protoplastos até ao estado de maturação e germinação como embriões naturais.
Os meios de cultuar conterão de um modo geral vários aminoácidos e hormonas tais como auxina e citocininas. É vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para especies tais como milho e alfafa.
Os rebentos de raizes desenvolvem-se normalmente em simultâneo. A regeneração eficaz dependerá do meio, do genótipo e da historia de cultura. Se estas três variáveis forem controladas então a regeneração será totalmente reprodutjú vel e repetível.
Para os genótipos de algumas especies, tais como tabaco, alfafa, batata, tomate, petumias, soja, colza e algumas árvores de fruto e cenouras, a regeneração foi claramente demonstrada em trabalhos anteriores. Tal regeneração está dentro do âmbito da matéria se o genótipo e historia adequados forem escolhidos por rasteio. Geralmente, após cerca de mais de um ano de sub cultura e eficacia da regeneração de plantas decresce a partir de uma dada cultura de células. Portanto, a regeneração tem normalmente mais sucesso se fôr iniciada após a obtenção de uma cultura de células resistentes adequada.
Como alternativa, e especialmente útil em culturas celulares que tenham mais de alguns meses
ou um ano, o gene GS amplificado pode ser levado para um sistema regenerador por cruzamento e/ou fusão. Ver, por exemplo, Coking et al., Nature, 293:268 (1981) aqui inclui do como referência. Neste método, uma linha celular resistente ao inibidor de GS herbicida é conseguida por selecção e uma cultura em suspensão de células em divisão rápida é obtida por métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Os protoplastos são isolados a partir delas e de preferência irradiados com uma quantidade de radiação e durante um tempo suficientes para inactivar, se não mesmo causar alterações irreversíveis, as células hospedeiras.
Por exemplo, radiação de raios X de 20 Krads pode ser usada vantajosamente. Após irradiação dos protoplastos dadores, os mesmos são usados com protoplastos aceitadores de células susceptíveis adequadas. Existem várias métodos para se obter fusões, tais como, por exemplo, fusão com poli_ etilenoglicol, tratamento com concentração alta de cálcio, combinações de ambos, do mesmo recentemente electrofusão. Após ter-se dado a fusão, o crescimento selectivo do produto de fusão pode ser efectuado uma vez que o produto de fusão deverá ser feito e resistente ao inibidor de GS herbicida. Em particular se se usar um dador que já não seja morfogenético (i.e., a história da cultura dadora, é tal que já tenha passado vários meses ou até uma ano desde a selecção original), pode-se então efectuar uma selecção simples em meio contendo inibidor de GS herbicida.
Um outro método para introduzir material genético em células vegetais e infectar uma folha de planta com uma incisão com a bactéria, A_. tumefaciens transformada. Em condições de crescimento adequado forma-se um anel de callii a volta da incisão. Os callii são então transferidos para meio de crescimento, deixa-se que formem rebentos, ra_í zes e finalmente plantas. Como alternativa também se pode efectuar enxertos em plantas completas.
Um método alternativo para introdu zir múltiplas copias do gene GS na célula vegetal é por auto-ligação de uma copia de um gene estrutural GS funcional (DNA genomico ou cDNA) utilizando métodos bem conhecidos dos familiarizados com a tecnologia de DNA recombinante. Os genes estruturais, cada um contendo o seu promotor individual são ligados operacionalmente uns aos outros por meio de adaptadores apropriados podendo-se introduzir em certos casso 10-30 copias dz cada gene num veiculo de expressão replicável aJequado, como seja um plasmideo Ti.
Como alternativa o material genético pode ser microinjectado directamente em células do embrião vegetal. No caso de plantas monocotiledóneas, o polén pode ser transformado com DNA total ou com um clone funcional adequado que dê resistência e o pólen utilizado então para produzir progénie por reprodução sexuada.
Claro que podem ser utilizados quaisquer outros métodos para aumentar a actividade GS numa dada célula para níveis tais que tornem a a célula resisten te ao inibidor de GS herbicida. É de interesse particular neste invento a ligação operacional de uma sequência genética codificadora de um gene GS estrutural a uma outra sequência genética capaz de produzir super-produção do produto genetico de onde deriva. Esta ligação de sequências genéticas pode ser introduzida nas células vegetais adequadas, por exemplo, por meio do plasmideo Ti.
A introdução do material genético nas células vegetais, especialmente usando o chamado plasmideo indutor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens é uma tecnologia reprodutível e previsível (ver, por exemplo, Caplan, A. et al "Introduction of Genetic Material into Plant Cells" Science .815-821 (November 1983);
-23
Schell, J. and Van Montagu, M., "The Ti Plasmid as Natural
and as Praticai Gene Vector for Plants" , Bio/Technology;
Abril 1983, pps. 175-180; Horsch et al., "Inberitance
of Functional Foreign Genes in Plants"; Science:233, 4964-98
(1984); FRaley R.T. et al.,Proce. Natu. Acad. Seis, USA,
80, 4803 (1983) Watqon, et al. Recombinant DNA: Ã Short Course, Scientific American Books, 1982, pp 164-173; e Old e Primrose, Principies of Gene Manipulation , 2ã. edição V. Cal. Press. 1981,pp. 138-156 aqui incluídos como referência).
Os plasmideos Ti possuem duas regiões essenciais para a produção de células transformadas.
Um destes designado DNA de transferência (TDNA) induz a for mação de tumores. A outra designada região virulenta é essencial para a formação mas não manutenção de tumores.
O DNA de transferência que transfere para o genoma vegetal pode ser aumentado em tamanho pela inserção dos múltiplos genes GS ligados uns aos outros ou da combinçaõ de genes do invento sem que a sua capacidade de transferência seja afectada. Através da remoção dos genes que provocam tumores de modo o que não mais interferaiji o plasmideo Ti modifi cado pode então ser usado como vector para a transferência das construções de genes do invento para uma célula vegetal adequada. O DNA estranho a ser inserido é normalmente introduzido entre as sequências terminais que ladeiam a região T.
Um vector plasmideo Ti particularmente útil é o pGV3850, um derivado não oncogénico do plasmideo Ti nopalina C58. (Ver Caplan et al. supra). Este vector utiliza as propriedades de transferência naturais do plasmideo Ti. Os genes de T-DNA internos que determinam o fenotipo de galha em coroa indeferenciado foram eliminado e substituídos por qualquer veiculo de clonagem vulgarmente usado (como seja o pBR322). A sequência do veiculo de clona
gem contida entre as regiões delimitantes do T-DNA serve como região de homologia para a recombinação introduzir de novo o DNA estranho clonado num derivado do mesmo veículo de clonagem. Qualquer construção genética do invento clonadi nesse plasmideo pode assim ser inserida no pGV3850 através de uma simples recombinação das sequências homologas. Pode-se adicionar ao plasmideo marcas de resistência a antibióticos para seleccionar os recombinantes. A resistência ao herbicida pode certamente ser também usada concomitante ou independentemente. A presença do gene do nopalina sintetase (nos) neste vector torna fácil controlar a eficacia de transformação usando pGV3850. Um callus em cultura de tecidos póde então ser -.testado quanto a presença de riopálina.
Após transformação da célula vegetal ou planta, a mesma pode ser seleccionada com a ajuda de uma marca adequada, como seja a resistência a antibióticos, ou mais relevante, resistência a herbicidas, e depois crescimento pelas viás convencionais. Em tabaco, culturas3. de protoplastos com três a cinco dias após isolamento dos protoplastos são adequados a transfprmação por Agrobacterium tendo o plasmideo Ti adequado o qual que contem na sua região de T-DNA o gene GS hibrido descrito. Após dois dias de co-cultura das células derivadas de protoplastos e com Agrobacteria, as células vegetais podem ser lavadas por? centrifugação e ressuspensas em meio novo vários vezes. Isto remove a maior parte das bacetrias. As restantes bactérias são mortas por um antibiótico adequado, por exemplo cefotaxima (400-1000 ug/ml), adicionado ao meio de cultura de protoplastos. As células são cultivadas em meio não selectivo até formarem agregados de células visiveis (calli). Em seguida são nomeadas em meio contendo a concentração de herbicida adequada que mata todas as células do tipo selvagem. Apenas os transformantes que expressem o gene hibrido GS incorporado sobrevivem e continuam a crescer.
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Estes celli podem ser facilmente induzidos para regenerarem rebentos quando transferidos para meio de Murashige e Shoog contendo lmg/1 de 6-benzilademina e 0,1 mg/1 de naftaleno ácido acético. Os rebentos podem desenvolver raizes em meio MS sem hormonas ou directamente em perlite ou vermiculite e transferidos para vasos. As plântulas estão prontas para crescerem na estufa e podem ser testadas quanto a resistência ao herbicida.
Também podem ser usados outros sistemas tais como o virus do mosaico da couve-flore, CaMV(Hohn,
B. et al., em "Molecular Biology of Plant Tumors", Academic Press , New York 1982, pps. 549-560; e Howell , Patente dos Estados Unidos 4.407.956). A totalidade do genoma de DNA virai do CAMV é inserida num plasmideo bacteriano paren tal criando uma molécula de DNA recombinante que pode ser propagada em bacetrias. Após clonagem, o plasmideo recombinante é cortado com enzimas de restrição tanto ao acaso como em locais únicos da parte virai do plasmideo recombinan te para inserção da combinação de genes do invento.
Também se pode inserir um pequeno oligonucleotideo, descrito como adapatdor, tendo um local de restrição unico. O plasmideo recombinante modificado pode ser clonado de novo e ainda modificado pela introdução de pedaços maiores de uma construção de genes no local de restrição unico do adaptador.
A parte virai modificada do plasmideo recombinante é então excisada do plasmideo bacteriano parental, e usada para inocular as células vegetais ou plantas .
Este virus esta'descrito na patente Howell acima referida como sendo partieularmente bom para a inserção de genes capazes de aumentar a produção de proteina, maior tolerân cia a tensão, resistência a pragas e pesticidas, fixação de azoto, e similares.
Normalmente, as sequências GS pretendidas são operacionalmente ligadas in vitro umas as outras ou a um promotor de super-produção, por metodologia recombinante conhecida. Por exemplo, o gene estrutural de GS, normalmente a sua versão genómica, é separado do seu promotor normal por restrição na região entre tal promotor e o codão de iniciação AUG. Uma função de transcrição com, e.g., a súbunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase é então efectuada. Em seguida a construção é inserida num local de restrição adequado do veículo vegetal.
Por exemplo, quando se usa DNA de CaMV como veiculo, a construção genética é inserida num local ou locais do DNA virai, sem destruir a infecciosidade do DNA virai ou o seu movimento através de planta. Assim, a construção pode ser inserida numa serie de locais de restrição seguido de clonagem do produto e determinação da manutenção das características essenciais do virus. Deste modo pode-se rapidamente isolar uma quantidade relativamente grande de virus modificado que pode ser testado quanto a infecciosidade e movimento. Após ter sido modificada a parte virai do plasmideo de DNA hibrido o virus modificado pode ser excisado do plasmídêo de DNA hibrido e pode ser usado para inocular plantas direetamente na forma linear ou ligado em circular.
Várias técnicas podem ser empregues para infecção de células vegetais com veiculos de CaMV. As folhas novas podem ser suavemente esfregadas com um abrasi-
vo e depois postas em contacto com o DNA virai. Após infecção o DNA virai pode ser transmitido por afídeos, quando o gene transmissível pelo afídeo seja operacional. Também podem ser usadas técnicas mecanicas. Como alternativa os tecidos ou células individuais podem ser infectadas.
Utilizações
A utilização de veiculos contendo as construções de genes do invento é como intermediários na preparação de células vegetais e plantas resistentes a herbicidas. Assim não so as células vegetais tornadas resistentes de acordo com os métodos, do invento mas também todos os veiculos ou vectores, derivam a sua utilidade da utilidade do produto final, a planta na sua totalidade.
A utilização de uma planta completa tornada resintes de acordo com os métodos do invento é obvio. Tal planta, quando posta em contacto com quantidades de herbicida de outro modo controladoras ou supressoras de plantas, ser-lhe-ão resistentes. Isto permitira que o tratamento com herbicida seja selectivo para qualquer planta ou grupos de plantas pretendidos.
Em adição, a resistência ao herbicida permitirá a sua utilização como marca selectiva na transferência de outros genes para a planta ou suas células
Com os termos "quantidades de inibidcr de GS herbicidas controladoras de plantas" pretende-se incluir funcionalmente uma quantidade de herbicida capza de afectar o crescimento ou desenvolvimento de uma dada planta. Assim, a quantidade pode ser suficientemente pequena para apenas retardar ou suprimir o crescimento :ou desenvolvimento ou a quantidade pode ser suficientemente grande para destru
ir irreversivelmente a planta sensivel. Normalmente, a maior parte das plantas dicotiledóneas e sementes pode ser controlada com taxas entre 0,5 e 1,5 kg/ha ia. Para as plantas monocotiledóneas, as taxas entre 0,5 kg/ha ia e até cerca de 2,0 kg/ha ia são as normalmente usadas. O herbicida pode certamente ser posto em contacto com a planta adequada usando métodos de pulverização ou de disseminação bem conhecidos. Por exemplo, a administração foliar usada em trabalhos anteriores para controle de ervas daninhas por PPT pode ser usada com plantas resistentes ao PPT que estejam dentro do âmbito do invento.
O invento também engloba um método para controle de plantas que se caracteriza por se pôr em contacto uma célula vegetal ou planta sensivel ao inibidor de GS herbicidas controladoras de plantas em que o contacto é efectuado enquanto a célula vegetal ou planta está presente conjuntamente com células vegetais ou plantas resistentes ao inibidor de GS herbicida do invento. Assim, o tratamento de plantas com herbicida foliar num campo ou cultivar, plantas essas que incluem tanto células vegetais sensíveis ao herbicida como células resistentes ao herbicida e em que ambas são simultaneamente postas em contacto com o inibidor de GS herbicida durante a operação de tratamento, constitui um método incluído no presente invento.
Tendo agora descrito de um modo geral este invento, o mesmo será melhor entendido por referencia a certos exemplos específicos que aqui são incluídos com fins ilustrativos apenas não pretendendo ser limitan tes a menos que de outro modo seja especificado.
Exemplo 1
Isolamento e Caracterização de Cultura de Células de Alfafa Resistentes ao PPT
Foi seleccionada uma linha celular de alfafa capaz de crescer na presença de L-fosfinotricina 3mM no meio de cultura. Escolheu-se a alfafa uma vez que é uma das plantas modelo em que a regeneração da planta completa a partir de célula isoladas ou protoplastos pode ser facilmente conseguida.
A selecção da linha de alfafa resistente a fosfinotricina foi feita por aumento gradual de concentração de inibidor no meio de cultura liquida. Dentro de 6 meses uma população de células foi seleccionada sendo 20 vezes mais resistente a fosfinotricina que a linha celular original. Medindo o volume de células sedimentadas das culturas em suspensão verificou-se que as células do tipo
selvagem eram completamente inibidas por L-fosfinotricina -5
2,5 x 10 M. As células resistentes cresciam tão bem na presença de 5 x 10-^M do composto como na sua ausência (Figuras 2 e 3).
Quando os padrões proteicos dos extractos celulares brutos de linhas celulares susceptiveis e resistentes foram comparados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, pode-se observar a superprodução de um polipeptideo na gama de pesos moleculares 40-42 KD na linha celular resistente ao PPT. GS purificada de alfafa possui o mesmo peso molecular. A actividade enzimática dos extcactos celulares foi determinada em paralelo. A actividade especifica de GS nas células resistentes era
5-10 vezes superior a das células do tipo selvagem. A actividade especifica de GS nas linhas celulares resistentes ao PPT é da mesma ordem da grandeza do tecido dos nódulos da raiz de alfafa, o qual, como todos os tecidos de nódulos
de legumes que fazem uma fixação eficaz de azoto, tem uma actividade de GS elevada. As medições da actividade de GS na presença de varias quantidades de fosfinotricina revelaram o mesmo grau de inibição da enzima pelo PPT em ambos os tipos celulares, sugeridos não haver ocorrido alteração estrutural da proteína GS durante a selecção da variante resistente.
Isolou-se RNA mensageiro do tipo selvagem e de células resistentes usando um método de extracção de RNA com isotiocianato de guanidinio, seguida de separação do mRNA em coluna de oligo dT-celulose. Puderam-se isolar 4 microgramas de RNA por grama, de material celular. A tradução in vitro do mRNA isolado de ambas as
linhas celulares deu padrões de polipeptídeos semelhantes 35
ao padrão obtido in vivo em extractos marcados, com S-metionina. Isto indicou que o mRNA isolado estaria pouco degradado. Enquanto que as proteínas marcadas in vivo apresentavam uma diferença marcante na quantidade do polipep tideo 40-42KD, a diferença entre o tipo selvagem e a linha celular variante nos padrões de proteina traduzida in vitro não era pronunciada.
Sintetizou-se a primeira e a segunda cadeia do cDNA a partir da população de mRNA da variante resistente ao PPT. Após clivagem com SI e colocação de caudas poli C no cDNA, o DNA foi ligado a DNA vector pBR322 com caudas poliG. A estirpe MG1061 de E.coli foi transformada com o vector recircularizado.
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Obtiveram-se 3,5 x 10 colonias por mg de DNA vector ligado. 80% das colonias eram sensiveis a ampicilina (amp) e 50% dos clones sensiveis a ampicilina tinham inserções que podiam ser detectadas por digestão dos plasmideos com Pst.10% das inserções tinham mais de 1000 pares de bases.
-31Cultivaram-se 1800 colonias em
filtros de nitrocelulose e os filtros foram sondados com
uma sonda consistindo na primeira cadeia de cDNA marcada com 32
P tendo uma percentagem aumentada de seguencias especificas de GS.
Entre tais clones esperou-se encontiar um clone de cDNA especifico para GS. Um clone de cDNA de GS de uma biblioteca de cDNA de Phaseolus preparada a partir de mRNA de nodulos de raiz foi obtido de uma fonte diferente. Este clone de cDNA de GS permitiu a identificação de um clone de cDNA de alfafa na biblioteca de cDNA gue hibridou fortemente com o DNA de GS de Phaseolus.
O DNA inserido do clone de cDNA GS de alfafa foi sequenciado. Os cDNAs de GS de alfafa e de Phaseolus foram então usados como sondas para caracterizar a diferença entre as células selvagem de alfafa e as células variantes superprodutoras de GS.
Preparou-se DNA genómico total a partir de folhas de alfafa, a partir de linha celular selvagem e a partir de três sublinhas de uma linha de células resistentes que foram seleccionadas na presença de L-fosfinotricina 6 x 10^ M, 2 x 10 e 3 xlO o DNA foi
digeredo com BamHI, EcoRI, e HindIII e uma combinação de duas enzimas. Após electroforese em gel de agarose dos" DNAs digeridos, os fragmentos de DNA foram transferidos para filtros de nitrocelulose por transferencia Southern.
O DNA ligado aos filtros foi hibridado com inserções de
cDNA dos clones de GS de alfafa e de Phaseolus marcados 32
com P. DNA do mesmo tamanho hibridos com ambas as sondas Uma banda predominante hibrida com a mesma intensidade em todas as 5 amostras de DNA com a sonda de alfafa. Uma segunda banda, que mal se vê no DNA tipo selvagem digerido, hibrida fortemente com DNA das linhas celulares resistentes
-32-
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0 maior grau de hibridação foi observado com DNA das linhas celulares altamente resistentes, indicando a amplificação de um fragmento de DNA durante· o desenvolvimento da resistência. A sonda de cDNA de alfafa hibridou fortemente com o fragmento de DNA amplificado e, em menor grau com o DNA não amplificado com homologia de GS.
Para confirmar a razão pela qual a linha celular variante de alfafa se tornou resistente ao PPT, repetiram-se ambas as transferências Northern e Southern usando linhas celulares tipo selvagem e variantes. A transferencia Northern indicou que há um aumento de cerca de 8 vezes no mRNA da glutamina sintetase do tipo selvagem. Quando se fizeram as transferências Southerr usando DNA genomico de ambas as linhas celulares, houve uma indicação clara de duplicação do gene da glutamina sintetase na linha celular mutante de alfafa. A duplicação parece ser 5 a 15 vezes acima do gene da glutamina sintetase não duplicado conforme estimado por hibridação. Parece igualmente ser uma duplicação exacta, ou seja, apenas uma banda aumentar na hibridação entre 7 e 11 vezes.
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-33Exemplo 2
Isolamento e Caracterização da Glutamina Sintetase da Cultura de células Resistentes ao PPT
Materiais e Métodos
Clivagem com CNBr
Glutamina sintetase (12 mmoles) foi dissolvida em 1 ml de ácido fórmico a 70% 5 mg de CNBr foi adicionado e a clivagem deu-se durante 24h a temperatura ambiente (Gross, Meth. Enzymol. 11 : 238-255(1967). Após diluição com água destilada (16 ml), a mistura foi liofilizada duas vezes.
Cromatografia Liquida de Alta Resolução dos Peptídeos de CNBK
A cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa (HPLC) foi efectuada num Ultrapore RPSC (0,46 DIx 7,5 cm) a 40°C usando ácido trifluoroacético (TPA) a 0,1% (Bennett et al, Biochem. J 168 :9-13(1977) e um gradiente linear de 0-60% de acetonitrilo (30 min. fluxo 0,5 ml/min). Os peptídeos de CNBr foram dissolvidos no volume minimo de hidroclsreto de guanidina
6M em TFA a 0,1%.
Os picos cromatograficos de vários separações foram colhidos manualmente, reunidos e liofilizados. A detecção foi feita a 214 nm usando um detector Beckman 160.
-34-
1
Análise de Aminoácidos
As composições em aminoácidos foram determinados após hidrólise acida das amostras em tubos fechados e com vácuo (Pyrex , cultura , inquebrável, 6 x 55mm) a 110°C durante 24 h com ebulição constante de HC1 (0,025 ml) (Moore, Chemistry and Biology of Peptides. Ann Arbor Science, Ann Arbor, Michigan, 629-653(1972). Usando um analisador de aminoácidos Beckman 6300 com dois integrados Hewlett-Packard 3390A, ninidrina e dois canais (440 e 570 nm) de integração obteve-se a análise de tosos os aminoácidos excepto o triptofano, cisteina, asparagina e glutamina, com valores de confiança de 1-7% a 100 pmoles/aminoácido e com um limite inferior de detecção de 25 pmoles. As análises foram feitas 3-5 vezes para cada amostra e controles do fundo.
Análise da Sequência Proteica:
Fez-se dagradação de Edman Automatizada com um sequenciador Applied Biosystems 47pA. O programa de sequenciação foi desenvolvido anteriormente para o sequenciador de peptideos e proteínas em fase gasosa-liquida solida (Hewick et al., J. Biol. Chem. 256-:7990-7997 (1981). O programa possui um passo de acoplamento (44°C)
26 min e um passo de clivagem simples (44°C, 6,7 min). A conversão automatizada dos derivados de 2-anilino-5-triazolinona (aminoácidos Pth) utiliza ácido trifluoroacético a 25% (50C, 33 min). Polybrene R (1,5 mg) (tarr et al,
Anal. Biochem. 84: 622-627 (1973) ; Klapper et al ibid 85, : 126-131 (1978) foi adicionado ao disco de filtração em vidro no cartucho antes da degradação da proteína ou peptideos e
fizeram-se cinco ciclos de sequenciação para reduzir contamiR
nantes derivados de Polybrene . Adicionou-se angiotensina II (1 nmole) ao cartucho de filtração e completaram-se dez ciclos de degradação. A sequenciação da angiotensina permi-
tiu testar a operacionalidade quimica e mecânica do sequenciador antes da sequencia de uma proteína desconhecida. A análise de sequencia proteica da apomioglobina de esperma de baleias (100-2oo pmoles) de rotina demosntrou um rendimen to inicial de 45-55%, rendimento inicial de 45-55%, rendimento repetitivo médio de 92-93% e um eclipse medio por ciclo de 2-3%.
Todos os aminoácidos Pth foram identificados por cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa numa coluna de ciano (0,45 x 25 cm) usando tampão acetato de sodio 15 mM (pH 5,5) e um gradiente comple xo de acetonitrilo/metanol (92,5:7,5 v/v), baseado num sistema desenvolvido por Hunkapiller e Hood, Methods Enzymol.
91: 486-493(1983) Este sistemd de HPLC separou os Pth-aminoácidos e o padrão interno (éster metilico de PthGlu) dos principais contaminantes: um aditivo de ditiotreitol,, N-dimetil-N1-fenil-tioureia e difeniltioureia. A metionina e a prolina não foram separadas por rotina, mas uma modificação do gradiente separou estes dois aminoácidos Pth. O padrão interno foi adicionado (200 pmoles) a cada conjunto de ciclos e as amostras foram secas num Speedvac Concentrator com um rotor RH-100-6. As amostras secas foram dissolvidas em 0,025 ml de água/acetonitrilo (80:20 v/v) e uma pequena quantidade (0,017 ml) (68% da amostra totaDfoi injectada automáticamente. Os Pth-aminoácidos foram detectados por absorvância de UV a 254 nm usando um detector Beckman 160.
0 processo de purificação está bre
vemente resumido no seguinte esquema:
100 g de células congeladas
Esquema de Purificação
adicionar Tris 50mM-pH7,5
Usar misturador baixa velocidade (30 segundos)
(Alta velocidade )(2 minutos) Centrifugar 8 K rpm, 5°, 10 minutos
Sobrenadante 7,5% v/v de sulfato de protamina a 1%, 15 minutos, 4°
Centrifugar 8k rpm, 5°, 10 minutos
Sobrenadante
1,5% v/v de MgSO4lM
pH até 6,8 com ácido acético IN Me para 7 mM
Ligar a H.A., 4 , 15 minutos
Lavar H.A. 5xT com Tris 50 mM pH 7,5 MgSO4 0,28M etilenoglicol 10%
Eluir GS 6 x com Tris 50 mM pH 7,5 MgSO4 0,5M etilenoglicol 16,7%
reunir as fracçoes eluidas, dialisar contra Tris lOmM pH 6,8 Mg lOmM MgSO4
Coluna G-110, reunir as fracçoes do pico de actividade
•37100 gramas de células em cultura de tecidos de aLfafa variante foram misturadas com neve carbónica e trituradas num misturador até se obter um pó fino. Após descongelação, a mistura foi centrifugada a 8000 rpm a 4°C durante 20 minutos. O sobrenadante foi precipitado com sulfato de protamina para remover o ácido nucleico. A concentração de MgSO^ foi levada até 10 mM, o p Me até 7 mM e o pH ajustado a 6,8 com ácido acético IN. O extracto bruto foi ligado a H.A. A. H.A. foi lavada 5 vezes com Tris 10 mM, pH 7,5 MgSO^ 0,28M e etilenoglicol a 10%. A glutami, na sintetase foi eluida aumentando a concentração de MgSO^ para 0,5M. Foram feitas cinco eluições. Após diálise contra Tris lOmM, pH 7,5, MgSO^ lOmM, foi aplicado uma coluna G-200. Reuniram-se as fracções com boa actividade de glutamina sintetase. Por electroforese em gel de SDS e acrilamida e coloração com prata observou-se um grau de pureza superior a 95%. A composição em aminoácidos mostrou que a composição da glutamina sintetase de alfafa é praticamente a mesma de uma composição publicada para a soja (Tabela 1)
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-38TABELA 1
Composição em aminoácidos da Glutamina Sintetase
de alfafa
Aminoácj. Soja* Folha de er Alfafa
do_ Raiz(mole%) vilheira (%)__(mole % +CV)
| Ala | 8,4 | 6,9 | 8,7 (+0,4) |
| Arg | 5,6 | 4,0 | 5,0 (+0,5) |
| Asx | 10,4 | 10,7 | 11,4 (+0,6) |
| Cis | 0,8 | N.D | N.D. |
| Glx | 10,0 | 10,1 | 9,9 (+0,5) |
| Gli | 10,6 | 19,1 | 13,5 (+0,7) |
| His | 2,2 | 3,6 | 3,1 |
| Ile | 6,6 | 5,6 | 8,4 (+0,4) |
| Leu | 6,7 | 6,5 | 7,6 (+0,9) |
| Lis | 5,9 | 5,7 | 6,8 (+0,3) |
| Met | 1,6 | N.D | 0,6 (+0,3) |
| Fen | 2,8 | 2,6 | 2,3 |
| Pro | 6,1 | 8,8 | 8,0 (+0,6) |
| Ser | 5,4 | 7,8 | 6,5 (+0,4) |
| Tre | 5,1 | 4,9 | 5,6 (+0,3) |
| Trp | 1,5 | N.D. | N.D. |
| Tir | 3,9 | 0,5 | 3,4 (+0,7) |
| Vai | 6,3 | 4,8 | 4,4 (+1,5) |
| R.H. McParland, | et al., | Biochem.J. (1976) | 153:597-606 |
N.D. = Não eliminado
C.V. = Valor de confiança (D.P./média)
cffla'S^4ícs3cta
-39Sequênciação
Uma primeira tentativa de sequenciação foi iniciada usando a proteina nativa purificada.
Não se obteve qualquer sequência indicando que a terminação NH2 estava naturalmente bloqueada. Efectuou-se clivagem com CNBr e os fragmentos foram separados por HPLC. A composição de aminoácidos da proteina indicou haver apenas duas a cinco metioninas. Dois dos fragmentos de CNBr separados por HPLC deram informação útil sobre a sequencia.
A sequenciação do fragmento de gluta mina sintetase purificada foi então efectuada. Os resultados são como se segue:
Arg-Glu-Asp-Gli-Gli-Tir-Glu-Val-IleLeu-Lis-Ala-Ile-Glu-Lis-Leu-Gli-LisLis-(Glu/His)-Lis-Glu-His-Ile-AlaAla-Tir-Gli-Gli-Gli-Asn
Esta sequência corresponde a parte da sequência obtida do clone completo de cDNA de alfafa variante. A sequencia proteica deduzida é apresentada na página seguinte.
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1
PREPARAÇAO DE UMA SEQUENCIA GENOMICA FUNCIONAL CODIFICADORA DE GLUTAMINA SINTETASE
DNA genomico total foi obtido de cultura de tecidos de alfafa usando um protocolo semelhante ao usado para obter o dos módulos da raiz de Phaseolus (Cullimoure J.D. e Miflin, B.J. FEBS Letters, 158:107-112 (1983) e digerido totalmente com BamHI. O material foi então fraccionado de acordo com o tamanho num gradiente de 5-20% de acetato de potássio e separado em pequenas quan tidades. Cada uma destas migron num gel de 1% de agarose e hibridada num sistema de transferência Southerns com uma sonda de cDNA de glutamina sintetase obtida por corte com Pst da sonda da sequência codificadora apresentada atrás.
As hibridações positivas foram então seleccionadas relativameite a fragmentos superioe a 4 Kb. Estes foram ligados a um vector lambda BV-2, 100 000 fagos foram semeados e ssondados com a sonda de cDNA da glutamina sintetase como acima. Obtiveram-se quatro placas positivas. Estas foram então expandidas e purificadas por hibridação de placas durante 3-4 voltas. Um clone genómico de 4Kb purificado foi isolado e ligado de novo ao H13mp9. Este clone foi sequênciado a partir de ambas as extremidades. Em adição,o clone foi também fragmentado com HaelII, subclonado em MP-9 e de novo sequenciado.
Deste modo, este fragmento 5' é de 4KB (assim como um fragmento 3' de 8kb também obtido a partir de digestão do DNA genómico) pode ser totalmente sequen ciado. Estes dois fragmentos em conjunto dão um gene funcic> nal completo, sendo a fase de leitura prevista a partir da informação sobre a sequência proteica, o peso molecular conhecido da GS e a incidência relativa dos tripletos de paragem nas três fases de leitura possiveis. Com uma sequên cia funcional completa da GS a.mesma pode ser expressa por
qualquer dos métodos descritos anteriormente.
Tendo agora descrito exaustivamente este invento compreender-se-^a que o mesmo pode funcionar dentro de uma gama de estruturas, produtos, processos e utilizações larga e equivalente sem afectar o espirito ou objectivo do invento ou de qualquer execução sua.
-43-
Claims (19)
- REIVINDICAÇÕESla.- Célula vegetal caracterizada por ser resistente a um inibidor herbicida de glutamina sintetase (GS) e por a referida resistência ser causada por niveis de actividade da GS na célula vegetal, que, quando presentes numa célula vegetal sendo sensivel a inibidores herbicidas de GS, tornam a referida célula substairialmente resistente ao referido inibidor herbicida de GS.
- 2ê.- Célula vegetal resistente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos níveis de actividade da GS estarem presentes em virtude da referida célula vegetal ter um numero significativamente maior de copias do gene "selvagem" da GS, do que a correspondente célula vegetal sensível.
- 3a._ Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o num® de copias do gene "selvagem" da GS na referida célula vegetal ser tal que os niveis de actividade da GS produzidos tornam a referida célula substancialmente resistente ao referido inibidor herbicida de GS.
- 4a.- Célula vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por o gene "selvagem" da GS, na referida célula vegetal, estar substancziaLmente amplificado.
- 5ã.- Célula vegetal de acordo coir a reivindicação 1, caracterizado por transportar uma combinçaõ de sequências genéticas que compreende:-44-a) uma primeira sequencia genética codificadora de glutamina sintetase (GS) funcional na referida célula vegetal, operavelmente ligada ab) uma segunda sequencia genética capaz de aumentar os niveis da expressão da referida primeira sequencia genética tal que,! quando tal combinação está presente numa célula vegetal sensível a inibidores herbicidas de GS, a referida célula é substancialmente resistente ao referido inibidor herbicida de GS.
- 6ã.- Célula vegetal de acordo com< a reivindicação 5 caracterizado por a referida combinação estar integrada no genoma da referida célula vegetal.
- 7ã.- Célula vegetal de acordocom a reivindicação 5, caracterizado por a referida combinação estar presente num plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens.
- 8§.- Célula vegetal de acordocom qualquer uma das reivindicações 1,2,3,5,6 ou 7, caracterizado por o referido inibidor herbicida de GS ser fosfinotricina (PPT).
- 9B.~ Célula vegetal transformada resistente a inibidores herbicidas de GS, caracterizado por, no seu estado, não transformado, ser sensível a inibido res herbicidas de GS.
- 10ã.- Célula vegetal de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o inibidor herbicida de GS ser PPT.115.- Combinação de sequênciasgeneticas operável numa determinada célula vegetal caracterizada por compreender:a) uma primeira sequencia genetica codificadora de glutamina sintetase furrional na referida célula vegetal, operavelmente ligada ab) uma segunda sequencia genetica capaz de aumentar os níveis da expressão da referida primeira sequencia genética tal que, quando tal combinação está presente uma célula vege tal sensível a inibidores herbicidas de GS, a referida célula é substancialmente resistente ao referido inibidor herbicida de GS.125,- Combinação da sequências geneticas de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por a segunda sequencia genetica ser um promotor.135.- Combinação de sequências genéticas de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12 caracterizada por estar integrada no genoma da referida célula vegetal.
- 14a._ Combinação de sequênciasgeneticas de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12 caracterizada por estar presente num plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens.155.- Combinação de sequências geneticas de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12 caracterizadas por o referido inibidor herbicida de GS ser PPT.-4616^.- Método para conferir resistência a inibidores herbicidas de GS, a uma célula vegetal sensivel a inibidores herbicidas de GS, caracterizado porcompreender o aumento das copias devgene "selvagem" da GSpresentes na referida célula vegetal sensível.
- 17§.- Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por a referida resistência a inibidores herbicidas de GS ser uma resistência à PPT.
- 18ê.- Método paa conferir resis tência a inibidores herbicidas de GS, a células vegetais, caracterizado por compreender a transformação da referida célula com a combinação de seguencias geneticas de acordo com a reivindicação 11.
- 19ã.- Método de acordo com areivindicação 21 caracterizado por o referido inibidor herbicida de GS ser PPT.
- 20a.- Método para controlarselectivamente plantas sensíveis a inibidores herbicidas de GS caracterizado por compreender o contacto de uma planta sensivel a inibidores herbicidas de GS, e por o referido contacto ser efectuado enquanto simultaneamente se contacta a planta resistente a inibidores herbicidas de GS, de acordo com a reivindicação 16.
- 21a.- Método de acordo com areivindicação 23, caracterizado por o referido inibidor herbicida de GS ser PPT.
- 22ã.- Processo para a obtenção de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por sei.-47incluir na referida molécula uma sequencia genética que codifica a glutamina sintetase.
- 23ê.- Processo de acordo coma reivindicação 25 caracterizado por se obter uma molécula que é um veiculo capaz de transformar a célula vegetal.
- 24ê.- Processo para a obtenção duma molécula de DNA recombinante (rDNA) caracterizado por se incluir na referida molécula uma sequencia generica codificadora de glutamina sintetase e por a referida glutamina sintetase consistir na seguinte fórmula de polipeptideo:Me t-Ser-L eu -L eu-Ser -A sp -L eu -I le-A s n Leu-Asp-Leu-Ser-Glu-Tre-Tre -Glu-L í sIle-Ile-Ala-Glu-Ti r-Ile-Trp-Ile-GliGli-Ser-Gli-Leu-Asp-Leu-Arg-Ser-LisAla-Arg-Tre-Leu-Pro-Gl»-Pro-Val-TreAsp-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-L i s-Trp-AsnTi r-Asp-Gl.i -Ser-Ser-Tre-Gli -Gln-Ala.Pro-Gl»-Glu-Asp-Ser-Glu-Val-Ile-IleT i r-Pro-Gln-Ala-Ile-Fen-Lí S-Asp-ProFen -Arg-Arg-Gli. -Asn-Asn-I le-Leu-Val. Met-Cj s-À sp-Ala-T í r-Tre -Pro-Ala-Glí Glu-Pro-Ile-Pro-Tir-Asn-LiS-Arg-HisAla-Ala-Ala-L ís-Ile-Fe« -Ser-His-ProAsp-Val-Val-Ala-Glu-Val-Pro-Trp-Tί rG1Í-Ile-Glu-Gln-Glu-Ti r-Tre-Leu-LeuGln-Li s-Asp-Ile-Asn-Trp-Pro-Leu-Gl»Trp-Pro-Val~Gl»’ -Glí-Fen-Pro-Gli-ProGln-Gli -Pro-T i r-Ti r-C»s-Gli -Ala-Gl» -48Ala-Asp-Lis-Ala-Fen-Gli-Arg-Asp-IleνβΙ-Αβρ-εβΓ-Ηίδ-Τίτ-Ι,ίΊϊ-ΑΐΛ-α.ίδ-ΙιβαT ir-Ala-Gli -Ile-Aisn-íle-Ser-Gli -IleAsn-Gli-Glu-Val-Met-Pro-Gli-Gln-TrpGlu-Fert-Gln-Val-Gl i -Pro-Ser-Val-Gl i Ile-Ser-Ala-Gli-Asp-Glu-Ile-Trp-ValA1 a-Ar g -T ι .r -1 le-Leu-Gl u-Arg-I le-T re Glu-Val-Ala-Gli-Val-Val-Leu-Ser-FènAsp-Pro-L is-Pro-Ile-L i s-Gli-Asp-TrpAsn-Glί-Ala-Gli-Ala-His-Tre-Asn-T»rSer-Tre-Li s-Ser-Met-Arg-Glu-Asp-GlÍGlí-Tir-Glu-Val-lle-Leu-Lis-Ala-IleGlu-Li s-Leu-Gli -L i 3—Lts—His—L is—Glu— His-Ile-Ala-Ala-Tír-Gli-Glu-Gli -AsnGlu-Arg-Arg-Leu-Tre-Gli -Arg-His-GluT r e -A la - As ρ -1 le - A s η - T r e - F e n -L eu -T r p G1 i -Val-Ala-Asn-Arg-Gli -AÍa-Ser-IleArg-Val-Gli -Arg-Asp-Tre-Glu-Lis-AlaGlí -Li s-Gli -Tir-Fan-Glu-Asp-Arg-ArgPro-Ser-Ser-Asn-Met-Asp-Pro-Ti r-ValVal-Tre-Ser-Met-Ile-Ala-Asp-Tre -TraIle-Leu-Trp-Lís-Pro
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