PT100805B - Acido nucleico isolado a partir de um gene da heliantinina e genes quimericos de plantas com base em elementos da heliantinina reguladores a montante - Google Patents

Description

DSM-6 — MOOREF

Acido nucleico isolado a partir de um gene da heliantinina

E GENES QUIMÉRICOS DE PLANTAS COM BASE EM ELEMENTOS DA HELIANTININA REGULADORES A MONTANTE

A heliantinina é uma proteína de armazenamento dos embriões do girassol de sementes 11S. A presente invenção visa as regiões reguladores 5' dos genes da heliantinina. Mais parti cularmente, a presente invenção visa os elementos reguladores cis específicos desta região reguladora que dirige a expressão do gene específico dos tecidos, temporariamente regulado ou responsivo ao ãcido abscíssico. A presente invenção proporciona genes quiméricos aue compreendem os elmentos reguladores cis ligados a uma sequência de codificação proveniente de uni gene heterólogo para controlar a expressão destes genes. Os genes quiméricos proporcionados pela presente invenção· são úteis para conferir resistência aos herbicidas e para conferirem uma melhor qualidade lipídica ãs sementes das plantas- transgénicas.

O desenvolvimento de sementes; singular para as plantas superiores, implica o desenvolvimento embrionar e bem assim os processos de adaptação fisiológica que ocorrem no interior da semente de modo a garantir a sobrevivência do rebento aue se desenvolve depois da germinação. Após a fertilização ocorre um rãnido crescimento e diferenciação do embrião e do endosperma , após o que se acumul am reservas nutritivas durante a fase de maturacao do desenvolvimento da semente. Estas reservas são armazenadas durante um período de interrupção do desenvolvimento para utilização posterior pelo rebento em crescimento. Este período de interrupção ocorre antes da fase de dessecação do desenvolvimento da semente.

Durante a embriogenése acumulam-se várias classes de proteínas das sementes, incluindo as proteínas de armazenamento, as lecitinas e os inibidores da tripsina. A função principal das proteínas de armazenamento nas sementes consiste em acumularem-se durante a embriogénese armazenando reservas de carbono e de azoto para o rebento que se desenvolve após a germinação. Estas proteínas e bem assim muitos dos genes que as codifcam têm sido intensamente estudadas £ para uma recapitulação ver Shotwell e colaboradores (1989) em The Biochemistry of Plants,' 15, Academic Press, NY, 297_7Os genes que codificam as proteínas de armazenamento nas sementes são altamente regulados e diferencialmente expressados durante o desenvolvimento das sementes. A expressão é temporariamente regulada com ARNm que se acumula rapidamente durante a fase de maturação da embriogénese. Esta expressão é também específica dos tecidos, ocorrendo principalmente nos cotilédones ou no endosperma das sementes em crescimento. As proteínas de armazenamento resultantes são processadas e encaminhadas para corpos proteicos nos quais as proteínas de armazenamento permanecem durante a dessecação e durante o período-de inactividade do embrião .“Após.....a germinação, o rebento utiliza estas proteínas de armazenamento como fontes de carbono e de azoto /^^iggins (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 191_7.

As proteínas das sementes, incluindo as proteínas de armazenamento, as lectinas e os inibidores da tripsina são codificadas por famílias multigénicas não homólogas que não são amplificadas ou estruturalmente alteradas durante o desenvolvimento ff para uma recapitulação ver Goldberg e colaboradores (1989) Cell 56, 149_7- Estes genes são temporal e espacialmente regulados mas não necessariamente ligados. Embora os mecanismos põs-transcricionais actuem de modo a controlar a acumulação de algumas destas proteínas, a regulação ocorre principalmente ao nível transcricional. Em consequência, os genes das proteínas das sementes propiciam um sistema excelente para proporcionar elementos reguladores genéticos, especialmente os elementos que conferem especificidade tecidual, regulação temporal e conformidade com os estímulos ambientais e químicos.

As observações sobre a regulação temporal e espacial dos genes das proteínas das sementes sugerem que esses genes são parcialmente regulados por factores celulares comuns conhecidos pela designação de factores transactuantes. Todavia, uma vez que existem diferenças quantitativas e qualitativas nos padrões de expressão dos genes das proteínas das sementes individuais, devem existir também factores mais específicos que proporcionem um meio para os padrões de expressão diferencial entre estes grupos de proteínas de sementes. Foram observados padrões de expressão diferencial entre as principais proteínas de armazenamento nas sementes de colza, a cruciferina e a napina ff Crouch e colaboradores (1981) Planta 153, 64; Finkelstein e colaboradores (1985) Plant Physiol. 78, 630fj e entre os componentes individuais da família dos. .genes inibidores ..da ...tripsina de Kunitz na soja /”Jofuku e colaboradores (1989) Plant Cell 1, 1079_7. Uma comparação entre os genes das principais proteínas de armazenamento das sementes de soja demonstrou a existência de uma diferença de carácter temporal e da especificidade de tipo celular da expressão da P-conglicinina (7S) e da glicinina (11S). A subunidade ARNm 7S apa

receu vários dias antes da ARNm 11S. Por outro lado; enquanto os componentes da família dos genes da glicinina foram todos activados simultaneamente /. Nielsen e colaboradores (1989) Plant Cell 1, 313__7, os membros da família dos genes da ^-conglicinina foram regulados diferencialmente Barker e colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 85, 458; Chen e colaboradores (1989) Dev. Genet. 10, 112J. Cada um destes genes contém uma disposição diferente de elementos reguladores cis que conferem padrões de expressão diferencial entre estas famílias de genes e dentro delas.

A heliantinina é a principal oroteína de globulina 11S de armazenamento nas sementes do girassol (Helianthus annuus). A expressão da heliantinina, tal como sucede com outras proteínas de armazenamento nas sementes, é específica dos tecidos e está sob controlo no que diz respeito ao seu desenvolvimento. Contudo, os elementos reguladores da heliantinina que conferem essa especificidade nunca foram até agora identificados. 0 ARNm da heliantinina é detectado primeiro em embriões com 7 dias pós-floração (DPF) atingindo-se os níveis máximos de ARNm entre 12 e 15 DPF, após o que o nível dos produtos de transcrição da heliantinina começa a declinar. Nas sementes maduras ou nos rebentes em germinação não existem produtos de transcrição da heliantinina. A acumulação dos polipeptidos da heliantinina é rápida a partir do 7- DPF até 19DPF mas abranda à medida que a semente atince as fases mais avançadas da maturação . 2TAllen e colaboradores. (.1985) Plant Mol. Biol. 5, 165 J7.

A heliantinina, tal como a maioria das proteínas de sementes, é codificada por uma pequena família de genes. São conhecidas pelo menos duas sub-famílias divergentes designadas por Ha2 e HalO. Foram' isolados dois clones, HaG3-A e HaG3-D, representando membros não alélicos da sub-família Ha2 e foram parcialmente caracterizados £ Vonder Haar e colaboradores, (1988) Gene 74 , 433 J. Contudo, não

se conhece até agora uma análise pormenorizada dos elemntos reguladores destes ou de quaisquer outros genes da heliantinina.

De acordo com a presente invenção descobriu-se que os elemntos reguladores dos genes da heliantinina podem dirigir a expressão dos genes específicos das sementes, a expressão dos genes específicos das raízes, a expressão dos genes responsivos ao ácido abscíssico e/ou a expressão dos genes temporariamente alterados. Estes elementos reguladores possibilitam a expressão controlada de produtos génicos específicos em plantas transgénicas. A presente invenção proporciona um maior controlo da expressão dos genes em plantas transgénicas, proporcionando consequentemente uma melhor qualidade das sementes, uma melhor tolerância ãs condições ambientais tais como as situações de seca e um melhor controlo dos genes com resistência aos herbicidas.

A presente invenção visa a região reguladora em 5¹ de um gene da heliantinina. Esta região é dorovante designada por conjunto regulador a montante (CRM) e é útil para dirigir a expressão de proteínas heterólogas. A CRM é constituída por múltiplos elementos reguladores que conferem padrões distintos de expressão regulada quando acoplados a regiões codificadoras de genes heterõlogos que são expressados em plantas transgénicas.

Em particular, a presente invenção proporciona ADN isolado contendo elementos reguladores da heliantinina os quais dirigem a expressão dos genes específicos das sementes, a expressão dos genes específicos das raízes, a expressão dos genes responsivos ao ácido abscíssico (ABA) e/ou a expressão dos genes temporariamente alterados.

Outro aspecto da presente invenção visa genes de plantas quiméricas contendo estes elementos reguladores. Os elementos reguladores encontram-se funcionalmente acoplados ã sequência codificadora

de um gene heterõlogo de tal modo que o elemento regulador é capaz de controlar a expressão do produto codificado pelo gene heterõlogo. Se necessário, incorpora-se nas estruturas do gene quimérico elementos promotores adicionais ou partes desses elementos. São também proporcionados vectores de transformação das plantas que contêm os genes quiméricos da presente invenção, proporcionando-se ainda as células vegetais transformadas por esses vectores e as plantas e a sua progenia que contém os genes quiméricos.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção proporciona-se um método para produzir uma planta com sementes de melhor qualidade lipídica. Os genes quiméricos são construídos em conformidade com a presente invenção ligando-se um elemento regulador que dirige a expressão específica das sementes ã região de codificação de um gene que codifica uma enzima do metabolismo dos lípidos. Quando as células vegetais são transformadas com este gene quimérico, é possível regenerar plantas com sementes de melhor qualidade lipídica.

De acordo com um outro aspecto a presente invenção proporciona um método para produzir uma planta resistente aos herbicidas. De acordo com a presente invenção é possível construir, por exemplo, genes quiméricos em que um elemento regulador específico das raízes dirige a expressão do gene da resistência aos herbicidas. As células vegetais são transformadas com este gene quimérico de modo a regenerar plantas resistentes aos herbicidas.

A Figura 1 representa uma sequência nucleotídica do CRM do gene da heliantinina HaG3-A. Os números dos nucleótidos -2377 a +24 da Figura 1 correspondem aos números dos nucleótidos 1 a 2401 da Sequência ID η-. 1.

A Figura 2 representa a sequência nucleotídica de uma parte do CRM do gene da heliantinina HaG3-D. Os números dos nucleóti

dos -2457 a 726 da Figura 2 correspondem aos números dos nucleotidos 1 a 1732 da Sequência ID n-. 2.

A Figura 3 representa a sequência nucleotídica de parte do CRM do gene da heliantinina HaG3-D. Os números dos nucleotidos -725 a -322 da Figura 3 correspondem aos números dos nucleotidosil a 404 da Sequência ID n-. 3. No gene da heliantinina HaG3-D, a sequência nucleotídica da Figura 3 encontra-se imediatamente a jusante (3') da sequência da Figura 2.

A Figura 4 representa a construção HaG3-A FL/GUS e as construções de controlo pBI121.1 e pBIlOl.l.

A Figura 5 representa uma carta de restrição dos clones genómicos da heliantinina HaG3-A e HaG3-D e os fragmentos de restrição utilizados para a construção dos plasmidos congéneres.

A Figura 6 representa as construções derivadas de HaG3-A e HaG3-D em relação ã construção de comprimento completo.

A Figura 7 demonstra a localização histoquímica da actividade de GUS em rebentos transgénicos que contêm as construções HAG3-D-N e HaG3-A-SB/R. A: HaG3-D-404N, 8 dias pós-embebimento (DPE);

B: HaG3-A-SB/R, 8 DPE; C: HaG3-D-404N, 14 DPE; D: HaG3-A-SB/R, 14 DPE;

E: HaG3-A-SB/R, 8 DPE; F: HaG3—A-SB/R, 6 DPE.

A Figura 8 ilustra por um processo gráfico a indução da actividade de GUS em folhas de tabaco transgénicas contendo HaG3-D-404N durante a dessecação progressiva e subsequente recuperação da insuficiência em água.

A Figura 9 representa um gráfico ilustrativo da indução com ABA da expressão de GUS em folhas de tabaco contendo HaG3-404N.

A presente invenção compreende elementos reguladores cis do conjunto regulador a montante (CRM) dos genes da heliantinina do girassol. Estes elementos reguladores cis são regiões discretas do

CRM que conferem expressão regulada ao gene sob o seu controlo. Em particular, a presente invenção proporciona ácido nucleico isolado contendo pelo menos um elemento regulador de um gene da heliantinina que dirige pelo menos uma das expressões seguintes: expressão do gene específico das sementes, expressão do gene específico das raízes, expressão do gene responsivo ao ABA ou expressão do gene temporalmente alterado. Qualquer gene da heliantinina pode proporcionar os elementos reguladores, incluindo os genes Ha2 e HalO, os quais representam duas sub-famílias divergentes dos genes da heliantinina. De acordo com um aspecto preferencial, os genes da heliantinina são HaG3-A e HaG3-D os quais são membros da sub-família Ha2.

Um dos elemntos reguladores em questão dirige a expressão específica das sementes. Um elemento regulador específico das sementes representa uma sequência nucleotídica particular que ê capaz de fazer com que ocorra na semente a expressão do gene sob o seu controlo, isto é, permite a detecção do gene produzido na semente. A expressão que é específica das sementes pode eventualmente ocorrer em qualquer parte da semente, por exemplo, nos cotilédones e no eixo do embrião e no endosperma, sem que isso constitua qualquer limitação. Não se detecta qualquer expreesão de genes nos rebentos ou nos tecidos somáticos das plantas adultas para genes sob controlo específico das sementes.

Para identificar os elementos reguladores que dirigem a expressão específica das sementes é possível efectuar uma análise de supressão da totalidade do CRM de um gene da heliantinina. Numa análise de supressão os nucleotidos são sucessivamente removidos de todo o CRM e os fragmentos resultantes são unidos ã sequência de codificação de um gene repórter ou de outro gene heterõlogo. Depois procede-se à análise das estruturas construídas para determinação da sua ca

pacidade de dirigirem a expressão específica das sementes por detecção da presença do produto génico repórter nos tecidos das sementes e não noutros tecidos. Os elemntos específicos das sementes que forem identificados também podem ser modificados, por exemplo por mutagénese dirigida ao local. Depois é possível submeter a ensaios os elementos reguladores modificados para determinação da sua capacidade para dirigirem a expressão das sementes, identificando-se consequentemente sequências alternativas que conferem expecificidade ãs sementes. Estas técnicas para a identificação dos elementos reguladores são aplicáveis a todos os genes da heliantinina. Por exemplo, de acordo com uma variante preferencial, uma análise do CRM do gene HaG3-A da heliantinina indica que os elementos reguladores específicos das sementes são proporcionados pelos nucleotidos 851 a 2401 e pelos nucleotidos 1 a 2401 da Sequência ID η-. 1.

Outros elemntos reguladores proporcionados pela presente invenção propiciam a expressão específica das raízes. A expressão específica das raízes é de particular interesse e importância. Normalmente, o gene da heliantinina do girassol é expressado apenas nas sementes. Quando regiões particulares do CRM da heliantinina são isolados a partir do CRM total de acordo com a presente invenção, a expressão é exclusivamente localizada nas raízes das plantas. Um elemento regulador específico das raízes apresenta uma sequência nucleotídica particular que é capaz de fazer com que a expressão do gene sob o seu controlo ocorra nas raízes das plantas e não noutros tecidos das plantas. Os elementos reguladores que dirigem a.expressão específica das raízes são identificados analisando a capacidade dos fragmentos de um CRM da heliantinina para conferirem expressão específica das raízes tal como descrito antes para a identificação dos elementos reguladores específicos das sementes, com a excepção de a

expressão ser detectada nos tecidos das raízes. Identificam-se também, como se descreveu anteriormente, as modificações das sequências nucleotídicas que permitem a expressão específica das raízes. Os elementos reguladores específicos das raízes provenientes de qualquer gene da heliantinina podem ser identificados por recurso a essas técnicas. Por exemplo, de acordo com um aspecto preferencial, uma análise do CRM do gene HaG3-A da heliantinina indica que os nucelotidos 1 a 1639 e os nucleotidos 851 a 1639 da Sequência ID n? 1 representam elementos reguladores específicos das raízes.

A expressão da heliantinina encontra-se sob estrito controlo temporal, com o ARNm detectado primeiro a 12 DPF. Em consequência, descobriu-se que existem elementos reguladores cis que conferem expressão genica temporalmente alterada a qual é detectãvel por volta de 4 DPF.

Para se identificar os elementos reguladores que conferem expressão genica temporalmente alterada é cossível efectuar uma análise de supressão do CRM completo de um gene da heliantinina. Os fragmentos do CRM são ligados ã sequência de codificação de um gene heterõlógo e utiliza—se a construção quimérica resultante para transformar as plantas. As sementes das plantas transformadas são mantidas em repouso durante vários dias põs-floração e depois submete-se essas sementes .. a um....ensaio, .para a..detecção da ..expressão do aene heterõlogo. Os elementos que dirigem a expressão do gene heterõlogo antes de cerca de 10 DPF são identificados como elementos que conferem expressão temporalmente alterada. As modificações das sequências nucleotídicas desses elementos que conferem o fenõtipo desejado podem ser identificadas tal como descrito antes. Estas técnicas para a identificação dos elementos reguladores que conferem a expressão

V.— / I do gene temporalmente alterado são aplicáveis a todos os genes da heliantinina. De acordo com um aspecto preferencial, uma análise do CRM do gene HaG3-A da heliantinina indica que os elementos que conferem a expressão do gene temporalmente alterado são proprocionados pelos nucleótidos 1 a 851 e 1639 a 2303 da Sequência ID n9 1.

De acordo com um outro dos seus aspectos a presente invenção visa as regiões do CRM da heliantinina que conferem expressão génica responsiva ao ácido abscíssico (ABA). Um elemento responsivo ao ABA representa uma sequência nucleotídica particular que ê susceptível de fazer com que o gene sob o seu controlo seja expressado em resposta ao ABA. A expressão do gene sob o controlo do elemento responsivo ao ABA pode ser induzida por tratamento com ABA ou por estímulos externos sobre os quais se sabe que originam a iniciação da biossíntese do ABA. Por exemplo, a biossíntese do ABA é iniciada como sequência da perda de turgor provocada por factores ambientais tais como a insuficiência de água, o impacto da água e o impacto salino /7para uma revisão veja-se Zeevaart e colaboradores (1988) Annu. Rev. Plant Physiol. 39, 439^7. Os níveis de ABA também aumentam em resposta a lesões /^Pena-Cortes e colaborador(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 9851 J⁷· Os elementos responsivos ao ABA são identificados tal como descrito antes para o caso de a identificação de outros elementos reguladores. Por exemplo, é possível recorrer ã análise de supressão para se identificar sequências de nucleótidos de qualauer gene da heliantinina que induza a expressão de um gene sob o seu controlo em resposta ao ABA. Essas sequências podem ser modificadas tal como descrito antes e é possível proceder a ensaios para a identificação de sequências alternativas que confiram expressão responsiva ao ABA. De acordo com um aspecto preferencial, uma análise do CRM do gene HaG3-A da heliantinina indica que os nucleótidos 1 a 2401 da Sequência ID n<? 1 proporcionam um elemento que confere nas sementes expressão responsiva ao ABA. De acordo com um outro aspecto preferencial, os nucleótidos

851 a 1639 ou 1639 a 2303 da mento que confere nas folhas

Seq das uência ID n° 1 proporcionam um eleplantas adultas expressão responsiva ao

ABA. Ainda de acordo com um outro aspecto preferencial, uma análise do CRM do gene HaG3-D da heliantinina indica que os nucleotidos 1

404 da Sequência ID n-. 3 conferem nos tecidos não embriõnicos das plantas expressão responsiva ao ABA.

Em consequência, os elementos responsivos ao

ABA possuem utilidade devido ao facto de situações ambientais específicas poderem iniciar a biossíntese do

ABA e também pelo facto de induzirem a expressão dos genes sob o controlo de um elemento responsivo ao ABA.

A expressão dos genes heterõlogos accionada pelos vos ao ABA do CRM da heliantinina não se encontra elementos responsirestringida ãs sementes, observando-se também nas folhas das plantas adultas e nos te cidos dos rebentos.

É possível obter um ácido nucleico isolado que codifica o conjunto regulador a montante de um gene da heliantinina conforme se descreve a seguir. Os clones genõmicos recombinantes da heliantinina são isolados por rastreio de uma biblioteca de ADN genómico do girassol com um ADNc recombinante representando o ARNm da heliantinina £Vonder Haar (1988) Gene 74, 433J. Existem métodos úteis para a obtenção de ADN recombinante genómico da heliantinina descritos por Sambrook e colaboradores, 1989, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, ou descritos em qualquer dos milhares de manuais de laboratório sobre tecnologia do ADN recombinante, amplamente divulgados. Para se determinar as sequências nucleotídicas existem bastantes técnicas disponíveis e conhecidas pelos especialistas na matéria. Por exemplo, é possível efectuar a subclonagem dos fragmentos de restrição que contêm um CRM da heliantinina no interior do sítio do poliligador de um vector de sequenciação tal como o pBluescript (Stratagene). Estes subclones do pBluescript podem ser depois se13

quenciados pelo método didesoxi do cordão duplo Chen e Seeburg (1985) DNA, 4, 165J7.

A sequência nucleotídica para o ADN que codifica o CRM do clone HaG3A do gene da heliantinina encontra-se representada na Figura 1 e corresponde ã Sequência ID η-. 1. De um modo idêntico, a sequência nucleotídica para o ADN que codifica uma região do CRM do clone HaG3D da heliantinina estã representada na Figura 2 e corresponde ã sequência nucleotídica identificada por Sequência ID n-. 2. Os diversos CRM de outros genes da heliantinina podem ser obtidos recorrendo ã mesma estratégia. Em alternativa, é possível obter clones representativos de outros membros da família dos genes da heliantinina utilizando os clones HaG3A e HaG3D ou as sequências do CRM da presente invenção como sondas de hibridação para o rastreio de uma biblioteca genómica de heliantinina e para identificar outros genes da heliantinina.

A identificação das sequências reguladoras cis que dirigem a regulação temporal específica dos tecidos e responsiva ao ABA pode ser efectuada por fusões transcricionais de sequências específicas com a sequência de codificação de um gene heterólogo, transferência do gene quimérico para o interior de um hospedeiro adequado e detecção da expressão do gene heterólogo. O ensaio utilizado para a detecção da expressão depende da natureza da sequência heterõloga. Por exemplo, os genes repórteres, exemplificados pela cloranfenicol-acetil-transferase e pela -glucuronidase (GUS), são frequentemente utilizados para a avaliação da competência transcricional e traducional das construções quiméricas. Existem ensaios normalizados para detectar com bastante sensibilidade a enzima repórter num organismo transgênico. O gene -glucuronidase (GUS) é utili como repórter de uma actividade promotora em plantas do tabaco transgénicas devido à elevada estabi

lidade da enzima nas células do tabaco, devido à falta de actividade -glucuronidase intrínseca nas plantas superiores e devido à disponibilidade de um ensaio fluorimétrico qualitativo e devido a uma técnica de localização histoquímica. Je.fferson e os seus cola boradores (1987) EMBO J, 6_. 3901) _7definiram procedimentos norma lizados para a detecção bioquímica e histoquímica da actividade GUS em tecidos vegetais. Realiza-se os ensaios bioquímicos misturando lisados de tecidos vegetais com 4-metil-umbeliferil--D-glucuronido, que é um substrato fluorimétrico para a GUS, efectuando-se a imcubação durante 1 hora à temperatura de 37°C e medindo depois a fluorescência do composto resultante 4-metil-umbeliferona. A localização histoquímica para a actividade GUS é determinada incubando amostras de tecidos vegetais em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronido (X-Gluc) durante 18 horas ã temperatura de 37°C e observando o padrão de coloração do X-Gluc. A construção desses genes quiméricos permite a definição de sequências reguladoras específicas necessárias para a regulação da expressão e demonstra que estas sequências podem dirigir a expressão de genes heterólogos segundo o processo em análise.

De acordo com um outro dos seus aspectos a presente invenção visa um gene quimérico de uma planta possuindo um elemento regulador proveniente de um gene da heliantinina o qual dirige a expressão do gene específico das sementes, a expressão do gene específico das raízes, a expressão do gene responsivo ao ABA ou a expressão do gene temporalmente alterado, acoplado à sequência de codificação de um gene heterólogo de tal modo que o elemento regulador é capaz de controlar a expressão do produto codificado pelo gene heterólogo. O gene heterólogo pode ser qualquer gene diferente dos genes da heliantinina. Se necessário, incorpora-se nas estruturas quiméricas elementos promutores adicionais ou partes desses elementos promutores adi

cionais suficientes para provocarem a expressão que resulta na pro dução de uma quantidade eficaz do polipeptido codificado pelo gene heterõlogo.

Em consequência, a presente invenção proporciona genes quiméricos constituídos por regiões do CRM da heliantinina que conferem expressão específica das sementes em conformidade coma presente invenção, as quais são acopladas a uma sequência que codifica uma enzima do metabolismo dos lípidos tal como uma dessaturase. De acordo com uma variante preferencial, as regiões do CRM contêm os nucleõtidos 851 a 2401 ou 1 2401 do HaG3-A conforme representado na Sequência ID n° 1. Considera-se contemplada qualquer modificação destas sequências que confira expressão específica das sementes. As sementes acumulam e armazenam proteínas e lípidos, assumindo qualquer destas substâncias importância agronómica. Uma vez que os elementos do CRM da heliantinina podem dirigir uma elevada expressão regulada nas sementes em desenvolvimento, então esses elementos são úteis para melhorar a qualidade lipídica e/ou proteica das sementes. Estes elementos sâo úteis para regular a expressão dos genes que codificam as enzimas do metabolismo dos lípidos tais como aquelas que se encontram associadas â elongação e â desnaturação dos ácidos qordos e/ /ou proteínas, especialmente daquelas com elevado teor em lisina e em metionina. Os genes quiméricos que contêm estes elementos podem ser utilizados para proporcionar linhas de plantas transgênicas que acumulam e armazenam quantidades significativas de classes específicas de lípidos e/ou proteínas.

De acordo com um outro dos aspectos da presente invenção proporcionam-se genes quiméricos que possuem uma região do CRM da heliantinina que confere expressão específica das raízes, fundida com um gene heterõlogo. Esta construção confere expressão especialmente dis

tinta da expressão da heliantinina normal pelo facto de o gene heterólogo ser expressado exclusivamente nas raízes das plantas. Por outras palavras, no caso de se remover uma sequência específica do contexto do CRM global, a regulação específica dos tecidos é alterada. De acordo com um aspecto preferencial, a região do HaG3-A do CRM é constituída pelos nucleotidos 1 a 1639 ou 851 a 1639 da Sequência ID n-. 1 e encontra-se fundida segundo uma orientação inversa ã do promotor embora estes elementos funcionem numa orientação qualquer. De acordo com um outro aspecto preferencial, a sequência que propor ciona resistência herbicida ê pelo menos uma parte do gene aroA. A presente invenção contempla qualquer modificação destas sequências desde que tal modificação confira expressão específica das raízes.

Considera-se de importância particular a utilização destas construções quiméricas para conferirem resistência aos herbicidas. Uma vez que a maior parte dos herbicidas não distingue entre ervas daninhas infestantes e plantas de cultura, a concepção de plantas de cultura resistentes aos herbicidas assume uma importância agronómica considerável uma vez que isso vai permitir a utilização de herbicidas de espectro largo. Em consequência, a presente invenção proporciona genes quiméricos que incorporam elementos de um CRM da heliantinina que confere expressão específica das raízes, fundido com pelo menos parte de um promotor que funciona nas plantas e também fundido com pelo menos parte do gene aroA ou com uma sequência que codifica um polipeptido que confere resistência aos herbicidas. Os polipeptidos que conferem resistência ao glifosato e aos inibidores afins da enzima ácido 5-enol-pirovil-chiquímico-3-fosfato-sintase (EPSP-sintase), sulfonil-ureias, imidazolinonase inibidores da acetolactase-sintase (ALS) e da aceto-hidroxi-sintase ácida (AHS) são também contemplados pela presente invenção. De acordo com um aspecto preferencial as regiões do CRM são os nucleotidos a 1639 do HaG3-A, conforme se mostra na Sequência tram-se fundidas segundo uma orientação inversa ã

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ID η-. 1 e encondo promotor. A presente invenção contempla qualquer modificação destas sequências, que confira expressão específica das raízes.

De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona genes quiméricos que incorporam elementos do CRM da heliantinina que conferem expressão temporalmente alterada, fundidos segundo uma orientação directa ou inversa com pelo menos parte de um promotor que funciona nas plantas e também ligados ã região de codificação de um gene heterõlogo. De acordo com um aspecto preferencial, os elementos do CRM são os nucleotidos 1 a 851 ou 1639 a 2303 do HaG3-A, conforme se mostra na Sequência ID η-. 1. A presente invenção contempla qualquer modificação destas sequências que confira expressão temporalmente alterada do gene.

Proporcionam-se. genes quiméricos que incorporam elementos do CRM de uma heliantinina que conferem expressão responsiva ao ABA facultativamente fundidos segundo uma orientação directa ou inversa com pelo menos parte de um promotor que funciona nas plantas e fundidos também com um gene heterõlogo. De acordo com um aspecto preferencial, o elemento do CRM ê constituído pelos nucleotidos 851 a 1639 ou 1639 a 2303 do HaG3-A conforme se mostra na Sequência ID η-. 1 ou pelos nucleotidos 1 a 404 do HaG3-0, conforme se mostra na Sequência ID n-, 3. Considera-se de particular importância a utilização de estruturas que conferem expressão responsiva ao ABA para proporcionar plantas com melhor tolerância ã carência de água.

Os genes quiméricos da presente invenção são construídos fundindo uma sequência que flanqueia a região 5’ de um ADN genómico da heliantinina à sequência codificadora de um gene heterõlogo. A

justaposição destas sequências pode ser conseguida por diversos processos. De acordo com um aspecto preferencial, a ordem das sequências de 5' para 3' é uma região reguladora a montante da heliantinina, uma região promotora, uma sequência codificadora e um local de poliadenilação.

As técnicas normalizadas para a construção desses genes quiméricos são bem conhecidas dos especialistas na matéria e encontram-se descritas, por exemplo, nos trabalhos publicados por Sambrook e colaboradores (1989). Existe uma multiplicidade de estratégias para ligar fragmentos de ADN cuja escolha depende da natureza dos terminais dos fragmentos de ADN. Qualquer especialista na matéria sabe que para que o gene heterólogo seja expressado é necessário que a estrutura disponha de elementos promotores e de sinais para uma poliadenilação eficaz do produto de transcrição. Em consequência, as regiões 5' do CRM da heliantinina que contem as sequências promotoras conhecidas como blocos CAAT e TATA podem ser fundidas directamente com uma sequência codificadora heterõloga sem promotor. Em alternativa, as regiões do CRM da heliantinina que não contêm os blocos CAAT e TATA podem ser unidas a um fragmento de ADN que codifica um promotor que funciona nas plantas. Os promotores de origem vegetal podem ser obtidos comercialmente ou podem ser sintetizados por via química tomando como base as suas sequências conhecidas. Como exemplo de um tal tipo de fragmento refere-se o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor truncado o qual retém os seus blocos CAAT e TATA. Ainda como outros exemplos de promotores representativos refere-se os promotores da nopalina-sintase e da ribulose-1,5-bisfosfato-carboxilase. 0 fragmento promotor é ainda ligado ã sequência de codificação heterõloga. Funde-se a extremidade 3' da sequência codificadora com um local de poliadenilação exemplificado pelo sítio de poliadenilação da nopalina-sintase, sem que isto constitua qualquer limitação. Por outro lado, existem vectores intermediários para a transformação de plantas os quais contêm um ou vários destes sítios de poliadenilação marginados pelas sequências necessárias para a transformação das plantas. Os elementos do CRM da heliantininae as sequências de codificação heterõlogas da presente invenção podem ser subclonados no interior do local poliligador de um vector de transformação de uma planta para proporcionar os genes quiméricos.

Os elementos que flanqueiam a região 5' da presente invenção podem derivar da digestão de um clone genómico da heliantinina com exonuclease ou endonuclease de restrição. Os fragmentos de restrição que contêm os blocos CAAT e TATA da heliantinina são ligados segundo uma orientação directa a um gene heterõlogo tal como a se quência de codificação curonidase (GUS). Qualquer especialis ta na matéria sabe que as sequências 5' reguladoras da heliantinina podem ser proporcionadas por outros meios, por exemplo por síntese química ou enzimática. 0 produto heterõlogo pode ser a sequência codificadora de qualquer gene que possa ser expressado nesse tipo de estrutura. A presente invenção engloba todas estas variantes com os seus diversos aspectos. A extremidade 3' da sequência codificadora é facultativamente fundida com um local de poliadenilação, exemplificado pelo local de poliadenilação da nopalina-sintase ou pelo local de poliadenilação do gene 7 do ADN-T da octopina, mas sem que isto constitua'qualquer limitação. Em alternativa, o local de poliadenilação pode ser proporcionado pelo gene heterõlogo.

Os elementos da região 5¹ reguladores da heliantinina que não contêm o bloco TATA podem ser ligados segundo uma orientação directa ou inversa a pelo menos parte de uma sequência promotora de uma planta, isto é, uma sequência promotora de uma planta que contenha

- 2Q

pelo menos as sequências CAAT e TATA. De acordo com um aspecto preferencial, este promotor é um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor truncado (VMCa). 0 complexo quimérico resultante pode ser ligado a uma sequeência codificadora heteróloga e a uma sequência de poliadenilação.

Para proporcionar a expressão regulada dos genes heterólogos procede-se à transformação das plantas com as estruturas dos genes quiméricos da presente invenção. Ά transferência de genes é um procedimento bem conhecido na especialidade como método para expressar genes heterõlogos em plantas transgénicas. A planta do tabaco é a mais frequentemente utilizada como hospedeira uma vez que é facilmente regenerada, proporciona um grande número de sementes germináveis por planta e pode ser transformada com uma elevada frequência utilizando vectores plasmídicos Ti derivados de Aqrobacterium Z*Klee e colaboradores (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467 7- As plantas dicotiledóneas incluindo o algodoeiro, a planta da colza e as plantas da soja constituem hospedeiros transgénicos preferenciais. Todavia, qualquer especialista na matéria sabe que é possível utilizar como hospedeiros transgénicos na presente invenção quaisquer plantas que possam ser eficientemente transformadas e regeneradas.

São conhecidos múltiplos métodos de transformação. Os genes quiméricos podem ser introduzidos nas plantas segundo um procedimento de transformação/regeneração suportado por um disco de uma folha £ conforme descrito por Horsch e colaboradores (1985) Science 227, 1229J. Também é possível utilizar, considerando-se englobados no âmbito da presente invenção, outros métodos de transformação tais como a cultura de protoplastos Z”Horsch e colaboradores, (1984)

Science 223, 496; DeBlock e colaboradores (1984) EMBO J. 2, 2143;

Barton e colaboradores (1983) Cell 32, 1033 z ou a transformação de caules ou explantes de raízes in vitro_7~Zambryski e colaboradores (1983) EMBO J. 2, 2143; Barton e colaboradores (1983) Cell 32, 1033 . De acordo com uma variante preferencial efectua-se a transformação das plantas com vectores derivados de Agrobacterium. Todavia, existem outros métodos para inserção dos genes quiméricos da presente invenção nas células das plantas. Esses métodos alternativos englobam as abordagens biologísticas £2 Klein e colaboradores (1987) Nature 327 , 7 0 7 > a electroporação, a incorporação de ADN induzida quimicamente e a utilização de vírus ou de pólen como vectores .

Sempre que necessário para o método de transformação, os genes quiméricos da presente invenção podem ser inseridos num vector de transformação de uma planta, por exemplo o vector binário descrito por Bevan (1984). Os vectores de transformação de plantas podem ser derivados modificando o sistema de transferência do gene natural de

Agroacterium tumefaciens. O sistema natural é constituído por plasmidos Ti grandes (indutores de tumores) que contêm um segmento grande conhecido por ADN-T o qual ê transferido para as plantas transformadas. Um outro segmento do plasmido Ti, a região vir, é responsável pela transferência do ADN-T. A região do ADN-T ê confinada por unidades repetitivas terminais. Nos vectores binários modificados os genes indutores de tumores foram suprimidos e as funções da região vir são utilizadas para transferir ADN estranho confinado pelas sequências de confinamento do ADN-T. A região T contêm também um marcador seleccionável para conferir resistência aos antibióticos e um sítio de clonagem múltiplo para inserção de sequências para a transferência. Estas estirpes assim concebidas são conhecidas por estirpes A. tumefaciens desarmadas e permitem a transformação eficiente

de sequências confinadas pela região T no interior dos genomas nucleares das plantas.

Os discos das folhas de superfície esterilizada são inoculados com A. tumefaciens contendo o ADN estranho desarmado, cultivados durante 2 dias e depois transferidos para um meio contendo antibiótico. Procede-se ã selecção dos rebentos transformados após o enraizamento no meio que contém o antibiótico adequado e efectua-se a sua transferência para o solo. As plantas transgénicas são auto-polinizadas e as suas sementes são recolhidas e germinadas em meio contendo o antibiótico.

A expressão de um gene heterõlogo ou repórter nas sementes em desenvolvimento, nos rebentos jovens e nas plantas maduras pode ser verificada segundo ensaios imunolõgicos, histoquímicos ou de actividade.

De acordo com a presente invenção, a escolha de um ensaio para a expressão de um gene quimérico depende da natureza da região de codificação heterõloga. Por exemplo, é possível utilizar a análise de Northern para avaliar a transcrição no caso de se dispor de sondas nucleotídicas adequadas. No caso de se dispor de anticorpos para o polipeptido codificado pelo gene heterõlogo é possível utilizar a análise de Western e a localização imuno-histoquímica para avaliar a produção e a localização do polipeptido. Consoante o gene heterólogo, assim se poderá recorrer a ensaios bioquímicos adequados. Por exemplo, as acil-transferases são detectadas medindo a acetilação de um substrato normalizado. A expressão de um gene que confira resistência aos herbicidas pode ser detectada determinando a resistência da planta transgénica ao herbicida.

De acorco com um outro dos seus aspectos a presente invenção proporciona plantas transgénicas ou uma progenia dessas plantas

contendo os genes quiméricos da presente invenção. Consideram-se contempladas tanto as plantas monocotiledóneas como as plantas dicotiledóneas. As células das plantas são transformadas com os genes quiméricos segundo qualquer dos métodos de transformação de plantas descritos antes. A célula da planta transformada, normalmente numa cultura de tecido caloso ou num disco de uma folha, é regenera da numa planta transgênica completa por métodos bem conhecidos dos especialistas na matéria £ por exemplo, Horsch e colaboradores (1985) Science'227, 1129 J. De acordo com uma variante preferencial, a planta transgênica é uma planta do algodão, da colza, do milho, do tabaco ou da soja. Uma vez que a progenia das plantas transformadas herda os genes quiméricos, utilizam-se as sementes ou as estacas das plantas transformadas para se manter a linha de plantas transgénicas.

A presente invenção proporciona também um método para produzir uma planta com sementes de melhor qualidade lipídica. Este método consiste em transformar uma célula de uma planta com um vector que contém um gene quimérico constituído por um elemento regulador específico da semente ligado ã sequência de codificação de uma enzima do metabolismo dos lípidos, tal como uma dessaturase, e em seleccionar uma planta com as características desejadas. De acordo com uma variante preferencial, o elemento regulador ê proporcionado pelos nucleotidos 1 a 2401 ou 851 a 2401 dó CRM do. HaG3A conforme se irostra na Sequência ID η-. 1. As células das plantas transformadas são regeneradas em plantas com sementes de melhor qualidade lipídica.

De acordo com um outro dos seus aspectos a presente invenção proporciona um método para produzir uma planta com sementes de melhor qualidade proteica. Este método consiste em transformar uma célula de uma planta com um vector que contenha um gene quimérico constituído por um elemento regulador específico das sementes

ligado ã sequência de codificação de uma proteína de armazenamento das sementes com um elevado teor em resíduos lisina e/ou metionina e em seleccionar uma planta com as características desejadas. De acordo com uma variante preferencial, o elemento regulador ê proporcionado pelos nucleotidos 1 a 2401 ou 851 a 2401 do CRM do HaG3-A conforme se mostra na Sequência ID η-. 1. As células das plantas transformadas são regeneradas em plantas com sementes de melhor qua lidade proteica.

De acordo com um outro dos seus aspectos a presente invenção proporciona um método para produzir uma planta resistente aos herbicidas. As células das plantas são transformadas com um vector que contêm um gene quimérico constituído por um elemento regulador específico das raízes ligado ã sequência de codificação de um gene que confere resistência aos herbicidas tal como o gene que confere resistência ao glifosato e em seleccionar depois plantas com a desejada resistência aos herbicidas. As plantas seleccionadas são aquelas que sobrevivem a um tratamento com um herbicida que aniquila as plantas não transformadas da mesma espécie sob as mesmas condições. De acordo com um aspecto preferencial, o elemento regulador é proporcionado pelos nucleotidos 1 a 1639 ou 851 a 1639 do CRM do HaG3-A conforme se mostra na Sequência ID η-. 1 e a sequência heteróloga é proporcionada por um gene que codifica as EPSP-sintase, acetolactase-sintase ou aceto-hidroxi-sintase ácida. As células das plantas transformadas são regeneradas em plantas resistentes aos herbicidas. De acordo com uma variante preferencial as plantas são transformadas pelo vector pRPA-ML-803, o qual contém o elemento regulador específico das raízes constituído pelos nucleotidos 851 a 1639 do HaG3-A e pelo gene aroA que confere resistência aos herbicidas.

Os exemplos seguintes ilustram melhor a presente invenção.

EXEMPLO 1

Métodos Gerais

As sequências nucleotídicas referidas nos exemplos seguintes estão numeradas de acordo com as Figuras 1-3.

Estruturas do Gene Repórter GUS objectivo geral das cassetes do gene repórter GUS utilizadas nos diversos exemplos foi previamente descrito por Jefferson e colaboradores (1987) EMBO J. 6, 3901. Resumidamente a região codificadora do GUS foi ligada ã região 5' do local de poliadenilação da nopalina-sintase no local do poliligador do vector pBIN19 derivado de A. tumefaciens y/Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8711_7. O vector pBIN19 contém as margens esquerda e direita do ADN-T necessárias para a transformação da planta e um gene que confere resistência ã canamicina. A estrutura resultante pBHOl.l está representada na Figura 4. Os sítios de restrição únicos a montante do codão de iniciação AUG do GUS permitem a inserção dos fragmentos de ADN promotores .

O promotor 35S do VMCa foi ligado no interior dos sítios HindIII e BamHI do pBHOl.l para criar o pBI121.1 representado na Figura 4. Para se criar o pBI120 truncou-se o promotor 35S do VMCa num sítio EcoRV a -90 (excluindo os blocos CAAT e TATA) e efctuou-se a sua clonagem no interior do local do poliligador do pBHOl.l.

O Quadro 1 descreve os plasmidos prognitores e as estruturas derivadas. A estrutura HaG3-A-FL e as estrituras de controlo pBI121.1 e pBHOl.l encontram-se representadas na Figura 4. A Figura 5 representa os fragmentos de restrição dos clones genómicos HaG3-A e HaG3-D utilizados para a construção dos plasmidos prognitores. A

Figura 6 representa de modo esquemático as estruturas derivadas relativamente ã estrutura de comprimento completo.

As estruturas HaG3-A/GUS representam grandes fragmentos em sobreposição que abrangem a região reguladora de comprimento completo (-2377 até +24 da Figura 1). As extremidades 3' de diversas estruturas foram derivadas a partir de digestões com exonuclease III de um fragmento de HaG3-A de 2,8 kb em pBluescript (Stratagene) 27 _.pHaG3-A-2,8 (BamHI-PstI) , Quadro 1J7. Estas supressões estão representadas na parte superior da Figura 4. A primeira supressão, pHaG3-A-2,4, contém os blocos CAAT e TATA do HaG3-A com a sua extremidade 3' a -75. Os fragmentos que continham os blocos CAAT e TATA do HaG3-A foram ligados segundo uma orientação directa no interior do pBIlOl.l da cassete do Gus sem promotor. Os fragmentos que não continham o bloco TATA do HaG3-A foram ligados segundo ambas as orientações a montante do promotor 35S do VMCa truncado do pBI120. Estes fragmentos foram subclonados no interior da cassete adequada do GUS. Essas estruturas são designadas em conformidade com os seus sítios terminais seguindo-se a letra F indicadora de orientação directa e a letra R indicadora de orientação inversa. As setas indicam a orientação do fragmento relativamente ã região de codificação do GUS (Figura 4). As estruturas HaG3-D/GUS contêm um fragmento de 404 pb (Sall-Hpal) em ambas as orientações: Normal (N) e Inversa (I). A precisão e a orientação de cada estrutura foram confirmadas por sequenciação didesoxi de cordão duplo (Chen e Seeburg, 1985) utilizando iniciadores para as regiões nas cassetes do GUS (Advanced DNA Technologies Lab, Texas A&M University).

Utilizou-se as estruturas plasmídicas ã base de BIN-19

Transformação de Plantas para transformar plantas do tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) em conformidade com procedimentos normalizados (Horsch e colaboradores 1985) com a excepção de os transformantes iniciais terem sido seleccionados em canamicina na concentração de 50yjg/ml e depois terem sido transferidos para canamicina na concentração de lOO^g/ml· As plantas foram auto-polinizadas e as sementes germinaram em canamicina (400 g/ml) para identificação dos transformantes, uma vez que as estruturas ã base de BIN-19 contêm o gene da neomicina-fosfotransferase (NPTII) o qual confere resistência ã canamicina que é um antibiótico tóxico.

Avaliou-se o numero de cópia de cada estrutura do GUS integrada no genoma do tabaco para cada transformante atravês das frequências de segregação do gene NPTII. A maioria dos transformantes continha apenas um local de segregação da estrutura. Utilizou-se plantas homozigóticas da descendência sempre que indicado.

Foram obtidas plantas transgênicas que representam todas as estruturas de ensaio com excepção da estrutura inversa de H-2. As plantas transgênicas foram mantidas em compartimentos Conviron: 16 horas de luz: 8 horas de escuridão, 24°C, humidade relativa compreendida entre 70 e 80% todas as plantas foram regadas de acordo com um calendário rigoroso para evitar a dessecação antes dos ensaios.

QUADRO 1

Estrutura

Descrição

Plasmidos Progenitores pBHOl.l

Cassete do gene repórter GUS sem promotor derivado de BIN 19.

Estrutura

Plasiuidos Progenitores pBI121.1 pBI120 pHaG3-A-2,8 pHaG3-A-2,4 pHaG3—A—2,3

Estruturas Derivadas

HaG3—A—FL

HaG3-A-HS/F

-HS/R

Descrição

Promotor 35S do VMCa fundido com a cassete do GUS em pBIlOl.l.

Promotor 35S do VMCa truncado no local EcoRV com excepção dos blocos CAAT e TATA fundido com a região de codificação GUS.

Fragmento BamIH-PstI de 2,8 kb do HaG3-A em pBluescript; contém 2,4 kb a montante da região de coficiação HaG3-A e 0,38 kb a jusante do local do início da transcrição; utilizado para gerar supressões da exonuclease III.

Fragmento HaG3—A de 2,4 kb gerado a partir da região 3' por digestão de pHaG3-A-2,8 até +24 com exonuclease III; contém os blocos CAAT e TATA do HaG3-A.

Fragmento HaG3—A de 2,3 kb gerado a partir da região 3' por digestão de pHaG3—A-2,8 até -75 por digestão com exonuclease III; contém o bloco CAAT do HaG3—A.

Inserção de 2,4 kb do pHaG3A-2,4 fundido com o pHIlOl.l segundo a orientação directa.

Fragmento BamHl-SalI de 0,85 kb proveniente da pHaG3A,2,3 clonado segundo as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa trun29

cado do pBI120.

HAG3-A-HS/R

HaG3-A-HB/F

-HB/R

HaG3-A-S 2/F

-S 2/R

HaG3-A-S 2/R

-S 2/R

HaG3-A-B 2/F

-B 2/R

Porção de 0,85 kb excisada sob uma forma de um fragmento de Saci a partir de HaG3A-HS/F sendo a clonagem efectuada segundo uma orientação inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado do pBI120.

Fragmento BamHl-BalI de 1,6 kb a partir de pHaG3A-2,3 clonado segundo as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado do pBI120.

Fragmento Sall-Ball de 0,6 kb proveniente de HaG3-A clonado segundo as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado do pBI120; construído por supressão do fragmento SalI-BamHl a partir de HaG3-A-HB/F e HaG3-A-HB/R, respectivamente.

Fragmento Sall de 1,4 kb proveniente de pHaG3-A-2,3 clonado segundo as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado no pBI120.

Fragmento Bali Sall de 0,66 kb proveniente de pHaG3-A-2,3 clonado segundo

HaG3-A-H 2

HaG3-A-S 1

HaG3-D-404N

-4041 as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado no pBI120.

Inserção de 2,3 kb proveniente de pHaG3-A-2,3 clonado segundo a orientação directa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado do pBI120.

Fragmento Sall de 1,5 kb proveniente de pHaG3-A-2,4 clonado segundo a orientação directa relativamente ao ρΒΙΙΟΙ,Ι.

Fragmento Sall-Hpal de 0,4 kb proveniente de pHaG3-D clonado segundo as orientações directa e inversa relativamente ao promotor 35S do VMCa truncado no PBI120 .

EXEMPLO 2

Detecção Bioquímica da Actividade do GUS:

Expressão Específica das Sementes Específica das Raízes

......... ............Determinou-se a actividade.....do GUS em tecidos embriónicos e não embriónicos de plantas de tabaco transgênicas contendo cada uma das estruturas do Quadro 1. Procedeu-se em conformidade com os procedimentos normalizados de Jefferson colaboradores (1987).

Efectuou-se a trituração do tecido da planta em tampão de extracção (50 mM de NaPO^, 10 mM de EDTA, 0,1% de Sarkosyl, 0,1%

de Triton X-100 e 10 mM de |3-mercapto-etanol) . Após centrifugação do lisado removeu-se o sobrenadante para um tubo limpo e efectuou-se a distribuição em alíquotas de 100 . Adicionou-se igual volume de 4-metil-lumbeliferil- ^-D-glucuronido 2 mM em tampão de extracção e deixou-se incubar ã temperatura de 37°C durante 1 hora. As reacções foram interrompidas com 0,8 ml de Na₂CO₃ (0,2 M). Determinou-se a fluorescência do composto resultante 4-metilumbeliferona (4-MU) com um minifluorometro Hoeffer TKO-100 conforme descrito por Jefferson e colaboradores (1987). Exprime-se a actividade do GUS em picomoles de 4-MU por unidade de massa da amostra proteica total por minuto.

Avaliou-se a actividade no que diz respeito a cotilédones, hipocõtilos, folhas e raízes de rebentos transgénicos num período compreendido entre 18 e 20 dias pós-inibição (DPI), contendo diversos elementos sequenciais do HaG3-A (resumidos na Figura 4) orientadores da expressão do GUS. Os resultados estão indicados no Quadro 2. Todas as estruturas que continham alguma porção do CRM dos genes HaG3-A e HaG3-D da heliantinina conferiram actividade do GUS nas sementes das plantas de tabaco transgénicas. Tanto a região reguladora de comprimentos completo (FL) como os fragmentos derivados desta região e também as estruturas HaG3-D/GUS conferiram uma significativa actividade do GUS nas sementes maduras comparativamente com a expressão do GUS dirigida pelo complexo promotor 35S do VMCa intacto (pBI121). Todavia, a bem definida expressão específica das sementes apenas foi conseguida com estruturas que continham as regiões proximais a montante entre -75 e +24 (cf. FL e S -1). Estas duas estruturas contendo os nucleótidos -2377 a +24 ou -1527 a +24 demonstraram expressão do GUS específica dos tecidos sem qualquer actividade do GUS detectãvel em quaisquer tecidos dos rebentos transgénicos. Contudo, a estrutura FL foi expressada em sementes maduras segundo níveis seis vezes mais

L }

elevados comparativamente com S- 1. Incluiu-se a actividade do GUS em tecidos de rebentos contendo o complexo promotor 35S do VMCa intacto (pBI121) para comparação e também os controlos negativos contendo o promotor 35S do VMCa truncado (pBI120) ou sem promotor (pBIlOl) . Comparativamente com a expressão nas sementes verificou-se uma fraca expressão nas folhas contendo a mesma estrutura; por outro lado, muitas estruturas diferentes de F1 e S- 1 demonstraram uma significativa expressão nas raízes dos rebentos transgénicos.

A actividade global conferida pelo complexo promotor 35S do VMCa intacto' foi superior ã conferida por todas as outras estruturas em tecidos somáticos, excepto nas raízes. Em particular, as raízes dos rebentos que continham as estruturas HB/R (-2377 a -739) e SB/R (-1527 a -739) demonstraram níveis de actividade GUS correspondente a um valor 7 a 8 vezes superior ã observável nas raízes que expressam GUS sob controlo do promotor 35S do VMCa intacto.

QUADRO 2

Sumário da Expressão do GUS em Tecidos Embriónicos e não Embriónicos de Plantas do Tabaco Transgénicas

Estrutura	Perfil do Desenvolvimento	Actividade GUS (pmoles 4MU/pg/min)**	Resposta no ABA
Sementes	Folhas	Raízes
HaG3-A
FL	I	18,7+8,7	0	0	+
S- 1	I	3,4+1,1	0	: 0	ND
HS F	III	17,1+15	0,45+0,05	36,6+2,2	-
R	ND	6,2+1,0	0,23+0,05	8,9+1,8	-
F	II	14,8+5,2	0,95+0,13	29,9+2,2	+
HB
R	ND	13,1+6,9 ·	0,25+0,05	75 ,4 + 3	-
F	II	11,1+5,8	0	13,9+6,8	-
SB
R	ND	12,1+5,8	0,34+0,05	90,5+9,9	+
F	II	35,7+4,2	0	20,6+10,2	ND
S- 2 .
R	ND	21,0+15	0,45+0,08	38,8+1,2	+
F	III	11,2+3,9	2,03+0,08	8,0+0,62	+
B- 2
R	ND	7,2+2,3	4,05+0,10	3,9+0,3	+
H- 2 F	III	1,8+1,0	ND	1,8+0,3	ND
HaG3-D
N	III	9,2+2,9	0,0 7+0,01	6,8+0,5	+
404
I	ND	9,2+3,9	2,03+0,05	12,9+2,8	+
Controlos
pbl 101	ND	0	0	0	-
pBI 120	ND	0	0	0	-
pBI 121	ND	4,3+1,0	22,0+7,9	9,9+4,0	—

QUADRO 2 (continuação)

Avaliou-se a actividade do GUS em sementes maduras e tecidos de rebentos de plantas do tabaco transgénicas contendo as estruturas representadas na

Figura 1.

encontram representadas na (F) e Inverso (R), Normal (N)

As estruturas são as que se

Figura 1. Os termos Directo e Invertido (I) referem-se ã orientação de cada fragmento da heliantinina relativamente ao promotor 35S cado.

do VMCa trunAvaliou-se a actividade do GUS em sementes em to de plantas do tabaco transgénicas contendo directas representadas na Figura 1 em intervalos aproximados de 2 dias desenvolvimenas estruturas definidos a partir de 8-24 DPF. No Exemplo 3 encontram-se os perfis de Tipo I, II e III.

símbolo

ND significa nao determinado nesta série experimental.

Em todas as experiências os ensaios do lores médios obtidos a partir a quatro pendentemente transformadas para cluídos os desvios padrão.

cada

GUS representam vaa dez plantas indeestrutura. Estão inActividade do GUS em sementes das génicas maduras (30 DPF).

plantas de tabaco transOs rebentos das axenicamente em transgénicas cresceram

Procedeu-se ã (18-20 DPI) os quais foram plantas de tabaco meio sólido.

recolha de tecidos de rebentos saios para avaliação da actividade do GUS.

submetidos a endesenvolvimento

Responsivo ao ABA FL apenas em sementes em

12-18 DPF (ver o texto e o Quadro 3). Em todos os outros casos, ã resposta prevista ao ABA à partir dà expressão do GUS de folhas dessecadas e subsequente demonstração permitem concluir que os rebentos das plantas indicadas respondem directamente ao ABA exógeno. O sinal mais (+) indica uma indução da actividade do GUS acima do nível básico. 0 sinal menos (-) indica a ausência de qualquer indução detectável de actividade do GUS.

EXEMPLO 3

Detecção Bioquímica da Actividade do GUS:

Expressão Temporalmente Regulada

Determinou-se o perfil temporal conferido por cada estrutura directa e apresenta-se os resultados agrupados no Quadro 2. Deixou-se crescer e florir plantas homozigóticas da descendência e submeteu-se a ensaios sementes provenientes de vagens maduras, para determinação da expressão do GUS conforme descrito no Exemplo 2. Foram identificados três tipos de perfis de desenvolvimento tomando como base o momento do aparecimento inicial da actividade do GUS nos embriões em desenvolvimento e as características qualitativas e quantitativas dos padrões de expressão resultantes; os perfis de Tipo I demonstraram uma correcta regulação temporal em que a acumulação do GUS começa a 12 DPF. Nas plantas que exibem perfis de Tipo II, a actividade do GUS inicia também a sua acumulação por volta de 12 DPF mas atinge um pico por volta de 14 DPF seguindo-se um declínio significativo nos níveis da actividade do GUS. As plantas com perfis de Tipo III demonstraram a ocorrência de actividade antes de 10 DPF observando-se um pico de actividade por volta de 12 DPF. As estruturas que continham as regiões do CRM do HaG3-A constituídas pelos nucleotidos -2377 a -1527 ou -739 a -75 conferiram este perfil temporalmente mais precoce.

Exemplo 4

Localização Histoquímica da Actividade do GUS

Localizou-se por via histoquímica a actividade do GUS em rebentos contendo HaG3-A-SB/R e HaG3-D-404N. As amostram foram lavadas com NaPO₄ 50 mM e incubadas durante 24 horas ã temperatura de 37°C em

100 jil de tampão de reacção j^NaPO^ 50 mM, pH 7,0, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronido (X-Gluc) 2 mM e ferricianeto de potássio 0,1 mM_7. As amostras foram montadas sobre lamelas de microscópio com glicerol a 80%.

Os rebentos HaG3-D-404N (Figura 7A) e HaG3-A-SB/R (Figura

7B) desenvolvidos em meio basal contendo 1% de sacarose exibiram padrões de expressão ligeiramente diferentes. O HaG3-D-N de expressão orientada pelo GUS apareceu nos cotilédones em níveis fracos e apareceu na região distai das raízes em níveis significativamente superiores, sem qualquer actividade detectável no hipocótilo. O rebento HaG3-A-SB/R exibiu também uma significativa actividade do GUS na região distai das raízes sem qualquer actividade detectável no hipocótilo ou nos cotilédones. Localizou-se por via histoquímica a actividade do GUS a 14 DPI nos rebentos contendo o HaG3-D-404N que cresceram num ambiente deficiente em água sobre papel de filtro sub-saturado; a actividade do GUS foi observada principalmente nas folhas e nas raízes destes rebentos (Figura 7C).

Determinou-se os padrões de expressão do GUS de rebentos contendo HaG3-A-SB/R. O sítio principal da actividade do GUS no rebento SB/R localizou-se nas pontas das raízes em desenvolvimento (Figura 7B, C). Nos rebentos 6 DPI contendo HaG3-A-SB/R, o GUS foi expressado através do comprimento da raiz em elongação com niveis particularmente elevados na região meristemática da ponta da raiz (Figura 7D). A localização por via histoquímica dos rebentos HaG3-A-SB/R (14 DPI) demonstrou a existência de actividade nas raízes laterais recentemente formadas e bem assim a actividade continuada na região meristemãtica da raiz principal (Figura 7B). Os rebentos a partir de 16 DPI continuaram a exibir este padrão de expressão (Figura 7C); os filamen37

tos radiculares e as porçoes distais da raiz apresentaram também níveis elevados de actividade do GUS.

EXEMPLO 5

Expressão Responsiva ao ABA

Numa série de experiências efectuadas com plantas de tabaco transgénicas inteiras contendo as estruturas ilustradas na Figura 4 foram identificadas varias regiões dos CRM dos HaG3-A e HaG3-D que responderam a modificações no potencial aquoso das plantas (Quadro 2). Uma vez que o ABA é um conhecido mediador das respostas em situações de défice aquoso, determinou-se o efeito do ABA sobre a expressão do GUS accionada por estes elementos. Demonstrou-se que no interior do HaG3-A havia duas regiões (-1527 a -739 e -739 a -75) que conferiam expressão responsiva ao ABA nas folhas de plantas maduras de tabaco transgénicas e nos rebentos. Foi identificado outro elemento responsivo ao ABA no CRM do HaG3-D (-739 a -322).

A indução da actividade do GUS nas plantas de tabaco transgénicas contendo HaG3-D-404N (orientação directa) foi correlacionada com o potencial aquoso durante a dessecação processual e subsequente recuperação a partir do défice aquoso. Uma vez que o CRM do HaG3-A de comprimento completo não é expressado sob quaisquer condições excepto durante o desenvolvimento da semente, utilizou-se como controlos negativos plantas que continham esta estrutura quimérica de GUS. As plantas homozigõticas da descendência contendo cada uma delas uma dessas estruturas cresceram no solo. As plantas foram regadas normalmente (controlos) ou em alternativa foram mantidas em condições de restrição no fornecimento de água variando os graus de rega para um terço, do valor da quantidade fornecida ãs plantas de controlo ou even

tualmente nao lhes fornecendo mesmo agua nenhuma. Nas plantas com total carência de água contendo o HaG3-D-404N induziu-se rapidamente um pico de actividade do GUS decorridas cerca de 36 horas estando esta situação correlacionada com uma diminuição no potencial aquoso (Figura 8). As determinações subsequentes do GUS decorridas 24 horas revelaram uma diminuição reprodutível na actividade do GUS mesmo nos casos em que as plantas estiveram sob um rigoroso défice de água com um potencial aquoso de quase quatro bares. As plantas submetidas ã total falta de água foram recuperadas por rega depois de se ter completado a amostragem ao terceiro dia. Após a rega as plantas recuperaram rapidamente ã medida que o potencial aquoso regressava aos níveis anteriores ã falta de água e a actividade do GUS continuou a diminuir durante os dias restantes. A actividade do GUS nas plantas com um regime aquoso correspondente a um terço do normal contendo o HaG3-D-N aumentou mais moderadamente durante um intervalo de 3,5 dias ã medida que diminuía o potencial aquoso (Figura 8). Tal como se observou com as plantas sujeitas a uma rigorosa falta de água, a actividade do GUS diminuju a recuperação do défice de água. Em nenhum caso as plantas de FL exprimiram o GUS em tecidos não embriónicos.

Para se determinar se o fragmento de 404 pb do HaG3-D responde directamente ao ABA efectuou-se o tratamento de discos de folhas de plantas de tabaco transgénicas contendo o HaG3-D-404N com ABA durante intervalos de tempo crescentes e depois submeteu-se a ensaios para verificação da expressão do GUS. Após um intervalo de tempo de cerca de 3,5 horas, o tratamento com ABA 10 mM teve como consequência um aumento rápido na expressão do GUS; o GUS continuou a acumular-se durante mais 8 horas e decorrido esse intervalo de tempo a taxa de acumulação diminuiu significativamente (Figura 9). Não foi detectada qualquer actividade do GUS nos discos de folhas provenientes

da mesma planta mantida sob condições idênticas com exclusão do ABA.

De um modo idêntico, os discos de folhas provenientes de plantas que continham o CRM de comprimento completo do HaG3-A não demonstraram qualquer actividade no decurso da experiência. Uma vez que o gene quimérico incluindo o promotor 35S do VMCa e o gene repórter

-glucuronidase é transcricionalmente activo nas folhas (Quadro 1) , as plantas transgénicas contendo o pBI121 serviram como um importante controlo negativo. Os discos de folhas provenientes de plantas contendo o pBI121 não demonstraram qualquer acréscimo na actividade do GUS em resposta ao ABA exógeno durante toda a experiência (+ABA: <12,6 + 3,3 pmoles 4-MU/jig/min; -ABA: 13,5 + 3,6 pmoles 4-MU/jig/min) .

Efectuou-se uma série de experiências idênticas com rebentos de plantas de tabaco transgénicas contendo HaG3-D-404N e HaG3-A-FL (Figura 4). Transferiu-se dezoito rebentos DPI para um meio contendo ABA entre 0 e 10 mM e determinou-se a actividade do GUS decorridos um, dois e.três dias (Quadro 3). Os rebentos contendo HaG3-D-404N foram induzíveis pelo ABA no 1- dia para todos os valores de concentrações do ABA; não houve indução significativa do HaG3-A-FL em experiências paralelas. A indução dependeu da concentração e do tempo. A indução mãxima, superior a 200 vezes, ocorreu passados doise três dias fiara valores da concentração do ABA correspondentes a 10 mM (Quadro 3). Ocorreu uma indução significativa correspondente a 19 e a 70 vezes ao 3- dia, para valores de concentração do ABA de 0,1 mM e de 1,0 mM, respectivamente.

Testou-se o CRM do HaG3-A da heliantinina de comprimento completo (FL) (-2377 a +24) para determinação da sua indutibilidade pelo ABA em sementes em desenvolvimento. Procedeu-se a uma selecção de sementes contendo a região reguladora de comprimento completo (FL) que acciona a expressão do GUS (Figura 4) decorridos 11, 14, 18 e 24

dias após a floração e procedeu-se ao ensaio dessas sementes para a determinação da sua capacidade para responderem ao ABA. A indução pelo ABA foi demonstrada pelos níveis acrescidos de actividade do GUS acima dos níveis obtidos no meio basal.Os resultados encontram-se re sumidos no Quadro 3. A capacidade responsiva ao ABA variou de acordo com a fase de desenvolvimento. As sementes obtidas aos 11 DPF não responderam ao ABA no decurso da experiência ao passo que as sementes mais maduras responderam. As sementes obtidas aos 14 DPF responderam rapidamente com uma indução acima dos níveis basais começando logo por volta das 1,5 horas. Ocorreu um acréscimo monotónico na actividade do GUS com sementes obtidas aos 14 DPF tratadas com o ABA; decorridos três dias de tratamento, os níveis da actividade do GUS eram superiores aos níveis observados com sementes obtidas aos 18 e aos 24 DPF tratadas com ABA ou sem ABA. As sementes obtidas aos 18 DPF responderam mais lentamente ao ABA do qua as sementes obtidas aos 14 DPF mas por volta do 5- dia de tratamento com ABA foram observados nas sementes obtidas aos 18 DPF níveis de actividade do GUS comparáveis aos das sementes obtidas aos 14 DPF (+ABA). As sementes obtidas aos 24 DPF foram menos responsivas ao ABA durante cinco dias de tratamento com ABA. Os níveis da actividade do GUS variaram também com as sementes incubadas apenas em meio basal. A actividade do GUS das sementes obtidas aos 14 DPF em meio basal continuou a aumentar segundo um valor estimado em 4 pmoles 4-MU/semente/dia.

Os resultados anteriores demonstram uma expressão do gene da heliantinina controladora da hierarquia de tal modo que os elementos responsivos ao ABA contidos no interior das CRM do HaG3 são apenas funcionais no contexto do adequado programa de desenvolvimento, isto ê, de maturação das sementes. Considerando os elementos responsivos ao ABA fora do contexto dos CRM de HaG3-A ou HaG3-D, resulta a

perda do controlo hierárquico pelo que estes elementos são livres de responderem directamente ao ABA e indirectamente ã dessecação nas folhas e nos rebentos das plantas de tabaco transgénicas.

QUADRO 3

Indução pelo ABA In Vitro do HaG3-A-FL em Sementes de Plantas de Tabaco Transgénicas ,Actividade do GUS (pmoles 4-MU/pg/min)

DPF	Normal	11	DPF	14	DPF	18 ABA	DPF	24	DPF
		+	—	+	—	+	—	+	—
11	0	0	0		-	-	-
14	7+0,3	0	0	7,0	7,0	-	-	-	-
16	—	0	0	-	-	-	-	-	-
17	—	—		33	15	-	-	-	-
18	15+0,3	--		-	-	15	15	-	-
19	—	--		57	24	-	-	-	-
21	—	—		-	-	24	15	-	-
23	—	—		-	-	61	15	-	-
24	16+2,0	—		-	-	-	-	16	16
27	—	—		-	-	-	-	21	16
29	—	—		-	-	-	-	24	16

14+2,0

a)

As sementes das plantas do tabaco transgénicas contendo HaG3-A-FL foram colhidas nos dias indicados pós-floração (DPF) e foram incubadas em meio basal puro ou em meio basal contendo ABA l^iM.

Determinou-se a actividade do GUS decorridos

0, 3 e 5 dias de tratamento. A título de referência indica-se a expressão in vivo do GUS accionada pelo HaG3-A-FL nas sementes em desenvolvimento (Normal)

EXEMPLO 6

Introdução da Tolerância aos Herbicidas nas Plantas do Tabaco

Uniu-se o fragmento BAlI-SalI de 0,66 kb, obtido a partir do plasmido progenitor pHaG3-A-2,3 (Quadro 1) pela sua extremidade 5' a um sítio HindIII e pela sua extremidade 3' a um sítio EcoRI. Substituiu-se pela cassete resultante a região promotora do VMCa duplo na estrutura pRPA-BL-410 (descrita no pedido de patente de invenção francesa n-. 91 02872, depositado em 5 de Março de 1991) digerindo o pRPA-BL-410 com HindIII e EcoRI e subclonando a cassete no interior desse vector. A estrutura resultante, designada por pRPA-ML-803, contêm no quadro transcricional os elementos seguintes: o elemento regulador da heliantinina, o péptido de trânsito optimizado (PTO), o gene aroA e o terminador nos.

O plasmido pRPA-ML-803 foi transferido para o interior da estirpe EHA101 de Agrobacterium tumef aciens £ Hood e colaboradores (1986) J. Bacteriol., 168, 1291_/ por acoplamento triparental e utilizou-se o Agrobacterium resultante para a transformação dos discos das folhas de tabaco.

As plantas de tabaco regeneradas, com uma altura de cerca de 20 cm, foram aspergidas na estufa com glifosato formulado de acordo com o padrão ROUNDUP segundo uma dose de 0,6 kg de ingrediente activo/hectare. As plantas de controlo não transformadas foram aniquiladas quando aspergidas com esta dose de glifosato. As plantas transformadas,·saudáveis e viáveis, demonstraram possuir uma melhor tolerância ã exposição ao glifosato.

LISTAGEM SEQUENCIAL (1) INFORMAÇÃO GERAL.:

(i). REQUERENTE: Thomas, Terry Freyssinet, Georges

Lebrun, Michel

Bogue, Molly (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Genes de Plantas Quiméricas Tomando

Como Base os Elementos da Heliantinina

Reguladores a Montante (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) Endereço: Scully, Scott, Murphy & Presser (B) Rua: 400 Garden City Plaza (C) Cidade: Garden City (D) Estado: New York (E) País: USA (F) Código Postal: 11530 (v) SUPORTE DE LEITURA PARA COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disco Flexível (B) COMPUTADOR: PC IBM Compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) APLICAÇÃO LÓGICA: Patentln Release^ 1,0, Versão#1,25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DO REGISTO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE:

.(A) NOME: McNulty, William E.

.....................(B).....NÚMERO DE REGISTO: 22606 ----------(C)NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 8081 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES:

(A) TELEFONE: 516-742-4343 (B) TELEFAX: 516-742-4366 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N-. 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2401 partes de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: ambos (D) TOPOLOGIA: linear

(xi)	DESCRIÇÃO	DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:
GGATCCTCTA	CCTATATATA	TATATATATA	TGAATTTTTT	AAAAAAATCC	CGTACCCCTC	60
GAAAAAACGG	GCCTTATGCG	GAAGTCCTCC	TCGCACACCT	AAAGAGCCGC	CCATGCTTTT	120
TAATCAAATA	GATGTGCATC	ATGTAGTGAT	AGTTTTTACT	AAAATCCATT	AGTTTATAAA	180
TATTTTAAAT	GTTTTTTTTT	GTTTATATAA	AAAAAGAAAA	TTAAAAAACA	AAATGTCCAA	240
AATACTCCTG	TATCAACTAT	GCAAAAAGAC	AAAAAAACCC	TTTTGGTTAA	CAAAGTCTTT	300
AATTTAACTA	AGTTTGTCAT	TTGAAGGAAA	TTCAAACAAA	AACGAACGTG	GGGGCGCGGG	360
GGTGGGGTGT	TTGGTTACAA	AAAGTTTTAA	TTTTAGATTA	AAGTATAAAA	ATTGCCCAAA	420
CCTCAGGACA	ATTTTTACAT	TTATAACTCA	TTGTCTAAAT	ACTAAAATAC	ACCAAGTCAA	480
TGGGTGAAAG	TTACTATCTT	TTTTATTGCA	ATTTCACATT	ACCTTATTTA	CTTTTGAGAA	540
AGACGACATA	ACAATTAAGG	AGTTATAGTC	TGATCGGTTT	GCGCTATTTT	TCATACTTAA	600
GGTCCAGGTT	TGAATCTTTT	AAACATTTTT	TTTTAA.CTTG	ATCATAACAA	TATAACAATT	660
AAGGAGTTAT	GATCTGATGG	TTTGCGTTA.T	GTTTTCGTAC	TAATTAAGGT	CCCGGTTTGA	720
ATCTCTCAAA	CAATATATTA	TTTTTTCTTA	AAAACGAATG	AGACATGCTC	ACAATGGGAA	780
TTGAACCGAC	ACCTATTGGT	TTAAAATTAA	AGCTATAACA	AACTGAGCTA	CACATTTTTA	840
ATTTAAAAAT	GTCGACTATC	TTAGTTAA.TC	AAATAAATTT	ATTTTGATTT	GTTTTGTTAA	900
TGTATTTTCT	CCTAATTTAA	AGTCGATGTG	TATTTATATA	ATATTAGTAA	TATTTTATTA	960
ACATCAATAC	ATGCTTCAGG	TTTTGTGTTA	GTCTTCGTTT	TTTATATGGT	TTTATCAGTG	1020
GTGTGGTGTA	CGATGACGAT	TATTTAAATA	ATGACGAACT	TCTTGGTTGT	TACTTATTGA	1080
TGTACGAAGC	TGAGATGTAA	CGAACCGAAC	ACATATAAAT	AACATTTTGG	ATAAGATTAC	1140
GACTTTATTT	ATCGGTTGCC	ATGAAATTTA	GAAGATTTGG	GTTAAGACAC	AACCACATAT	1200
AATGTGATGG	TAAATAGCAT	TTACAACTAA	TGTTAATCTT	TTGTTACAAA	TGTTGTTAAC	1260
TAGGCTTGAT	ATGTAAAATT	TTTAAAGACT	ATCAGGTGTT	CTTACGGTTT	TACATCTAGT	1320
AAGAGATTAA	AAAAAAAAAA	GCAAGGAAAG	TAAGTGTAAA	GAGAGTAAAG	AGAATGTAGC	1380

CATGATATGG	CTGATTGTTC	ATCACCATCC	CATTTATACT	TATCATCTTG	ATGATGCATA	z / 1 1440
TAGACATGAT	GTGTGCTACG	TACCGAATTT	TAA.CAGCTTC	CCGGCGCAAC	ACACGTGTAT	1500
AAATACCATA	GATTATAAAC	CAAATACGCT	ACGTATAGGT	GGTTATATGA	TACCTATGAT	1560
GACTTGACCT	TTCGTTACAC	TTGAGCTGAA	AAAAATAAAA	AAATGTGGCT	ATAGGCGCAT	1620
GGTCACAGTT	TTTTTGTGTG	GCCATATACA	ATTTTTGACG	TAGCGTTAGT	TAATCAGATA	1680
AATTTATTTT	GATTTGTTTT	GTTAATGTAT	TTTCTCCTAA	TTTCAAGTAG	ACGTGTATTT	1740
ATATAATATT	AGTAATATTT	TATTAACATC	AATACATGCT	TCATGTTTTG	GGTTAGTCTT	1800
CGTTTTTTAT	ATGGTTTTAT	CAGTGGTGTA	CGATGACGAT	TATTTAAATA	ATGACGGACT	1860
TCTTGGTTGT	TACTTATTGA	TGTACGAAGC	TGAGATGTAA	CGAACCGAAC	ACATATAAAT	1920
AACATTTTGG	ATAAGATTAC	GACTTTATTT	ATCGGTTGCC	ATGAAATTTG	GAAGACTTGG	1980
GTTAAGACAC	AACCACATAT	AATGTGATGG	TAAATAGCAT	TTACAACTAA	TGTTAATCTT	2040
TTGTTACAAA	TGTTGTTAAC	TAGGCTTGAT	ATGTAAAATT	TTTAAAGACT	ATATGGTGTT	2100
CTTACGGTTT	TACATCTAGT	AAGAGATTAA	ΑΑΑΑΑΆΑΑΑΑ	AAAAGCAAGG	AAAGTAAGTG	2160
TAAAGAGAGT	AAAGAGAATG	TAGCCATGAT	ATGGCTGATT	GTTCATCACC	ATCCCATTTA	2220
TACTTATCAT	CTTGATGATG	CATATAGACA	AACACACTAC	TTATACAGAT	GTAGCATGTC	2280
TCAGCTCCAA	ATGGTGATCT	TCTCCTGGCA	TAACCTCTTA	GATGTCACTT	CCTCCTTGAT	2340
CTTCTTCCAC	TATAAAACCA	GCTAGTTCAC	AACACCTATT	CACCACATCA	CATCCCATTC	2400
C						2401

(2) INFORMAÇÃO PARA A

SEQUÊNCIA ID NO:2::

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1732 pares de bases (B). TIPO: ácido nucleico (C)“TIPO DE CORDÃO: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO

DA SEQUÊNCIA: SEQ IN NO:2:

GGATCCTGTA AGAAGTGCCC

AAAATGTGAG AAGTGTATTA TAACACTATA

TATAATACTA

TATAACACCA TATAAATACC

GTATAACACT ATGTAACACC ATATAACACA

ATATAACGCT

120

ATGTAACACT	ATATAACATT	ATATAACAAT	ATATAACACT	ATACATCTAT	CAGAGACATG	180
CTATCAGACA	ACCTATAGTG	TTATATTTGT	TATATAATGT	TATATAGTGT	TACATAGCGT	240
TATATGGTAT	TATATGGTGT	TACATATTGT	TATACGTGTT	TATATGGTGT	TATATAGTAT	300
TATATATAGT	GTTATAATAC	ACTTCTCACA	CTTTGGGCAC	TTTTTACAGG	ATCATCTACC	360
TATATATATA	TATATATATA	TAAAGGATTA	GGTTCAAACG	TGAACAAATT	CCCAAGAGTG	420
AACTGCGTGA	ACTGATCTCA	GCCCTTGATT	TTTATGATCT	TGAGATTAAA	GTGAGTGGCA	480
TGATGGTAAT	TATTTGGTTA	ATTTTTTTTC	ATTTAATTAA	ATACAAAAAG	GGTATATGTG	540
TAATTTCAAT	CTTAAATTGA	TTGCATAAAT	CTCTCACAAA	TCAAGTAATC	AATTATCTTC	600
TTAAACTGAT	TACATAAATC	TCTCACAAAT	CAAATCAAGG	ATTAGGAAAG	ATGTAACTTA	660
ATTCTAATTA	CTAAAATAAC	TATTTGTTTA	AATGCGATGT	ACACATGTGT	ATTCTGATTT	720
TGCCCTCTTT	TTAATGTGAT	GTACACATGT	GTATATCGTC	TGTTTTTATG	AGATCTCAGA	780
ATTTTTTTTG	TATTGAATGT	TGATGTACAC	CTGTGAATTA	CTGTACACAT	ATGTACGATG	840
CTGATGCTGA	GTACACATGT	GTACTGTTCT	ATTTATATCC	AAGTACACAT	GTGTAACCTT	900
GAAATATGAA	AGTTACGTGG	ATCTTAAAAA	TCAAAATTTG	AATTCTGGTG	ATGAAATCTG	960
AAATAAAAAT	TAAAATTGAA	ATCTGGTGAT	TTGTTGTTTG	TTTTGATAAT	TATCTTATTA	1020
ATAAATAAAC	ATAATGTGGA	TAATGAATTT	AAATTAGGAA	AGATGTAACT	TAATTCAATT	1080
ATTAAAATAA	TGATTTAAAT	CTAATTTTTT	ATATAATTAC	AATCCTACCC	TTAACAACTA	1140
AAAAGGAAAT	CAAGGGTTCA	TATCTGTTCA	CGCAGTTCAC	TCTTGGGAGG	TTGTTCACGC	1200
TGGAACCCTA	CCCTATATAT	ATATATATAT	ATATATCAAA	TTTTTTTAAA	AAATCCCGTA	1260
CCCCTCGAAA	AAACGGGCCT	TATGCGGAAG	TCCTCCTCGC	ACACCTAAAG	AGCCGCCCAT	1320
GCTTTTGATC	AAATAGTTGT	AAATACTAAA	ATACACCAAG	TCAATGGGTG	AAAGTTACTA	1380
TCTTTTTTAT	TGCAATTTCA	CATTACCTTA	TTTACTTTTG	AGAAAGACGA	CATAACAATT	1440
AAGGAGTTAT	AGTCTGATCG	TTTGCGCTAT	TTTTCATACT	TAAGGTCCAG	GTTTGAATAT	1500
TTTAAACATT	TTTTTTAACT	TGATCATAAC	AATATAACAA	TTAAGGAGTT	ATGGTCTGAT	1560
GGTTTGCGTT	ATGTTTTCGT	ACTAATTAAG	GTCCCGGTTT	GAATCTCTCA	AACAATATAT	1620
TATTTTTACC	TAAAAACGAA	TGAGGCATGC	TCACAATGGG	AATTGAACCG	ACACCTATTG	1680
GTTTAAAATT	AAAGCTATAA	CAAACTGAGC	TACACATTTT	TAATTTAAAA	AT	1732

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 404 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTTTGTTAA TGTATTTTCT60

CCTAGTTTAA AGTCGATGTG TATTTATATA ATATTAGTAA TATTTTATTA ACATCAATAC120

ATGCTTCAGG TTTTGTGTTA GTCTTCGTTT TTTATATGGT TTTATCAGCG GTGTGGTGTA180

CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGGACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACGAAGC240

TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATTTTGG ATAAGATTAC GACTTTATTT300

ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG360

TAAATAGCAT TTACAAC.TAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTT40 4 —O Agento Oficiol-da Propriedade Industrial--

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1 a 12, para a produção de plantas transgénicas

27.Utilização do acido nucleico de acordo com uma

1. - Ácido nucleico isolado a partir de um gene de heliantinina, caracterizado por possuir pelo menos um elemento regulador o qual dirige pelo menos uma expressão seleccionada entre a expressão do gene específico da semente, a expressão do gene específico da raiz, a expressão do gene responsivo ao ácido abcísico (ABA) e a expressão do gene alterado temporariamente.

2. - Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido gene da heliantinina ser seleccionado entre o grupo constituído por um gene Ha2, um gene HalO, um gene HaG3A e um gene HaG3D.

3. - Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido elemento regulador ser seleccionado entre ó'gmpo constituído por um gene Ha2, um gene HalO, um gene HaG3A ou um gene HaG3D.

-4-'

AAGAGATTAA AAAAAAJAAAA G C AAGG AAAG TAAGTGTAAA GAGAGiAAAG AGAATG x AG^- 1130 CATGATATGG CTGATTGTTC ATCACCATCC CATTTATACT TATCATCTTG ATGATGCATA 1440 TAGACATGAT GTGTGCTACG TACCGAATTT TAACAGCTTC CCGGCGCAAC ACACGTGTAT 1500 AAATACCATA GATTATAAAC CAAATACl>C l ACGTATAGGT GGTTATATGA TACCTATGAT 1550 GACTTGACCT TTCGTTACAC TTGAGCTGAA AAAAATAAAA AAATGTGGCT ATAGGCGCAT 1520 ggtcacagtt TTTTTGTGTG GCCATATACA ATTTTTGACG TAGCGTTAGT TAATCAGATA 1580 AATTTATTTT GATTTGTTTT GTTAATGTAT TTTCTCCTAA TTTCAAGTAG ACGTGTATTT 1740 ATATAATATT AGTAATATTT TATTAACATC AATACATGCT TCATGTTTTG GGTTAGTCTT 1800 CGTTTTTTAT ATGGTTTTAT CAGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGGACT 1860 TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT 1920 AACATTTTGG ATAAGATTAC GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG 1980 GTTAAGACAC AACCACATAT AATG lGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT 2040 TTGTTACAAA TGTTGTTAAC TAGGCTTGAT ATGTAAAATT TTTAAAGACT ATATGGTGTT 2100 CTTACGGTTT TACÀTCTAGT AAGAGATTAA AAAAAAAAAA AAAAGCAAGG AAAGTAAGTG 2160 TAAAGAGAGT AAAGAGAATG TAGCCATGAT ATGGCTGATT GTTCATCACC ATCCCATTTA 2220 TACTTATCAT CTTGATGATG CATATAGACA AACACACTAC TTATACAGAT GTAGCATGTC 2280 TCAGCTCCAA ATGGTGATCT TCTCCTGGCA TAACCTCTTA GATGTCACTT CCTCCTTGAT 2340 CTTCTTCCAC TATAAAACCA GCTAGTTCAC AACACCTATT CACCACATCA CATCCCATTC 2400 c 2 401

9.- Acido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 5, caracterizado pelo facto de o referido elemento regulador dirigir a expressão do gene específico da raiz e por incorporar os nucleotidos 1 a 1639 ou 851 a 1639 da SEQ ID NQ:1.

10.- Acido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 6, caracterizado pelo facto de o elemento regulador dirigir a expressão do gene responsivo ao ABA e por incorporar os nucleotidos 1 a 2401 da SEQ ID N°:l, os nucleotidos 851 a 1639 da SEQ ID NQ:1, os nucleotidos 1639 a 2303 da SEQ ID N2;l ou os nucleotidos 1 a 404 da SEQ ID NQ:3.

Informação para a SEQ ID N2:3 (i) Características da sequência (A) Comprimento: 404 pares de bases (B) Tipo: acido nucleico (C) Tipo de cordão: duplo (D) Topologia: linear

Descrição da sequência:

SEQ ID N°:3:

GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTTTGTTAA TGTATTTTCT 60 CCTAGTTTAA AGTCGATGTG T A¹! AT AT 7\ AT / \TT m G t. λ/x ACÀTCAATAC 120 1 A l l l L λ Π Λ ATGCTTCAGG TTTTGTGTTA GxCTTCGTTT TTTATzVTGGT TTTATCAGCfi GTGTCGTGTA iao CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGGACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGκACGAAGC 240 TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AA C AT T11* G G AT A A G ATT A C GACTTTATTT 300 ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG 360 TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTT 40 4

11.- Ácido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 7, caracterizado pelo facto de o referido elemento regulador dirigir a expressão do gene alterado temporariamente e incorporar os nucleotidos 1 a 851 ou 1639 a 2303 da SEQ ID N2:1....................... - ----......................

12.- Regulação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo facto de o referido elemento regulador estar funcionalmente acoplado ã sequência codificadora de um gene heterõlogo para efectuar a referida expressão de um produto génico a partir da referida sequência de codificação e para proporcionar um gene quimérico de uma planta.

13. - Gene quimérico de uma-planta de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de incorporar uma parte suficiente de um promotor susceptível de funcionar em plantas e funcionalmente acoplado ã referida sequência codificadora e ao referido elemento regulador para efectuar a expressão do referido gene heterõlogo.

14. - Gene quimérico de uma planta de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o referido promotor ser um promotor de um vírus da planta ou o promotor 35S do vírus do mosaico caulifloro (VMCa).

15. - Gene quimérico de uma planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o referido promotor ser o promotor 35S do VMCa que incorpora as sequências CAAT e TATA.

16.- Gene quimérico de'uma planta de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o referido gene heterólogo ser um gene que codifica uma enzima do metabolismo dos lípidos, uma dessaturase, um gene que confere resistência aos herbicidas, um gene que confere resistência ao glifosato ou um gene que codifica as enzimas ácido 5'-enolpiruvil-xiquímico-3-fosfato-sintase, acetolactase-sintase ou ácido aceto-hidroxi-

-sintase.

17. - Gene quimérico de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o referido gene que confere resistência ao glifosato ser o gene aroA.

18. - Gene quimérico de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de ser constituído pelo gene de pRPA-ML-803 quimérico de plantas.

19. - Vector para a transformação de plantas, caracterizado pelo facto de ser constituído pelo gene quimérico de plantas de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 18.

20. - Célula de uma planta, caracterizada pelo facto de incorporar o vector de transformaçao de acordo com a reivindicação 19.

21. - Planta ou uma progenia dessa planta, caracterizada pelo facto de ter sido regenerada a partir da célula da planta de acordo com a reivindicação 20.

22. - Planta de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo facto de ser uma planta de algodao, tabaco, colza, milho ou soja.

23.- Célula de planta de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de essa célula de planta ser uma célula de uma planta de algodão, tabaco, colza, milho ou soja.

24. - Método para produção de uma planta com uma qualidade lipídica acrescida das sementes, caracterizado pelo facto de:

a) se transformar uma célula de planta com o vector de transformaçao de acordo com a reivindicação 19 ; e

b) se regenerar a referida planta com qualidade lipídica acrescida das sementes a partir da referida célula de planta transformada.

25. - Método para a produção de uma planta que exibe re- sistência a um herbicida, caracterizado pelo facto de:

a) se transformar uma célula da planta com o vector de trannformação de acordo com a reivindicação 19; e

b) se regenerar a referida planta a partir da re

26.qualquer das ferida célula de planta

Utilização do reivindicações transformada.

elemento regulador de acordo com uma

4. - Ácido nucleico de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o elemento regulador que dirige a expressão do gene específico da semente ser tal que a expressão de um gene sob o seu controlo é detectável nas sementes.

5.- Acido nucleico de acordo com qualquer das reivin- dicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o elemento re- guiador que dirige a expressão do gene específico da raiz ser

tal que a expressão de um gene sob o seu controlo é detectável nas raízes das plantas.

6.- Ácido nucleico de acordo com qualquer das reivin- dicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o elemento re- guiador que dirige a expressão do gene responsivo ao ABA ser

tal que a expressão de um gene sob o seu controlo e detectável em resposta ao tratamento com o ABA ou em condições que induzam a biossíntese do ABA.

7. - Acido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o elemento regulador que dirige a expressão do gene alterado temporariamente ser tal que a expressão de um gene sob o seu controlo é detectável nas sementes da planta a partir dos quatro dias após a floraçao.

8. - Ácido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de o referido elemento regulador dirigir a expressão do gene específico das sementes e por incorporar os nucleotidos 1 a 2401 ou 851 a 2401 da

SEQ ID N2:l.

Informação para a SEQ ID N2:l (i) Características da sequência (A) Comprimento: 2401 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cordão: duplo (D) Topologia: linear

Descrição da sequência:

SEQ ID N2:1:

GGATCCTCTA CCTATATATA TATATATATÀ TGAATTTTTT AAAAAAATCC CGTACCCCTC ó 0 GAAAAAACGG GCCTTATGCG GAAGTCCTCC TCGCACACCT AAAGAGCCGC CCATGCTTTT 120 TAATCAAATA GATGTGCATC ATGTAGTGAT AGTTTTTACT AAAATCCATT AGTTTATAAA 180 TATTTTAAAT GTTTTTTTTT gtttatataa AÀÀAAGA Am A TTAAAAAACA AAATGTCCAA 240 AATACTCCTG TATCAACTAT GCAAAAAGAC AAAAAAACCC TTTTGGTTÃA CAAAGTCTTT 300 AATTTAACTA AGTTTGTCAT TTGAAGGAAA TTCAAACAAA AACGAACGTG GGGGCGCGGG 360 GGTGGGGTGT TTGGTTACAA AAAGTTTTAA TTTTAGATTA AAGTATAAAA ATTGCCCAAA 420 CCTCAGGACA ΑΤΪΤΠΑΟΑΤ TTATAACTCA TTGTCTAAAT ACTAAAATAC ACCAAGTCAA. 480 TGGGTGAAAG TTACTATCTT TTTTATTGCA ATTTCACATT ACCxTATTTA CTTTTGAGAA 540 AGACGACATA ACÀATTAAGG AGTTATAGTC TGATCGGTTT GCGCTATm TCATACTTAA 600 GGTCCAGGTT TGAATCTTTT AAACATTTTT TTTTAACTTG ATCATAACAA TATAACAATT Ó60 AAGGAGTTAT GATCTGATGG TTTGCGTTAT GTTTTCGTAC TAATTAAGGT CCCGGTTTGA 720 ATCTCTCAAA CAATATATTA ttttttctta AAAACGAATG AGACATGCTC ACAATGGGAA 780 TTGAACCGAC ACCTATTGGT TTAAAATTAA AGCTATAACA A AC x.GAGl- x A CACATTTTTA 840 ΑΤΓΤΑΑΑΑΑΤ GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTTTGTTAA 900 TGTATTTTCT CCTAATTTAA AGTCGATGTG ΤΑΊΤΤΑΤΑΤΑ ATATTAGTAA TATTTTATTA 960 ACATCAATAC ATGCTTCAGG ΤΓΠΟΐϋΠλ GTCTTCGTTT TTTATATGGT TTTATC.AG xG 1020 GTGTGGTGTA CGATGACG A T ΤΑΤΤΓΑΑΑΤΑ ATGACGAACT TCTTGG ÍTGT TACTlATTGA 1080 TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATTTTGG ATAAGATTAC 1140 GACTrrATTr ATCGGTTGCC ATGAAATITA GAAGA1 — iLjG GTTAAGACAC AACCACATAT 1200 AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTTGTTAAC 1260 TAGGCTTGAT ATGT A A A ΑΊ i? TTTAAAGACT ATCAGGTGTT CTTACGGTTT TACATCTAGT 1320

7' qualquer das reivindicações 1 a 11 para a produção de plantas transgénicas.