CN114875040A - 花生AhDef2.2基因及其鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种花生抗病基因，命名为AhDef2.2基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。所述的AhDef2.2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述的花生抗病基因的制备方法，通过Illumina RNA序列和比较转录组分析，分离并鉴定了AhDef2.2基因，相对于现有技术，本发明的优点和有益效果是：（1）本发明筛选并鉴定了12个AhDef基因，并且在烟草和花生叶片中过表达蛋白融合AhDef2.2‑YFP增加了对青枯菌的抗性。（2）本发明确定了花生防御素AhDef2.2可以作为抗花生青枯病育种的重要基因。

Description

花生AhDef2.2基因及其鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于战略性新兴产业目录之 “4生物产业中的4.3生物农业产业重点方向下4.3.1生物育种方向的农业生物重要功能基因发掘”技术领域，具体涉及花生AhDef2.2基因及其鉴定方法和应用。

背景技术

花生（Arachis hypogaea L.）是世界上最重要的油料和粮食作物之一，95%以上的种植面积分布在亚洲和非洲[1]。然而，花生在其生长、发育和贮藏过程中会受到各种细菌、真菌和病毒等病害的影响。其中，青枯病是影响世界花生生产的最具破坏性的土传病害之一[2,3]。花生青枯病是由革兰氏阴性细菌（Ralstonia solanacerum）引起的，它会导致植株枯萎，严重影响产量和品质[4,5]。土壤中一旦携带病菌，很难彻底根除，对中国和世界其它地区的花生产业构成严重威胁[6]。

种植具有持久广谱抗性的品种是防治病害最为经济有效的策略。一些研究表明，数量性状（QTL）主要定位于花生B02染色体上的富含亮氨酸重复序列（NBS-LRR）核苷酸结合位点的抗病基因（R基因）区域[2,7]。迄今为止，在拟南芥中仅克隆了两个青枯病 R基因，即ERETA[8]和RRS1-R[9]，它们分别编码受体样蛋白激酶（RLK）和NBS-LRR蛋白。在花生中分别克隆了RRS1-R和ERETA的同源物AHRRS5[3]和AHRLK1[5]，结果表明，过表达AHRLK1和AHRRS5的转基因烟草对青枯病的抗病性增强。研究表明，花生青枯病抗病基因可能是典型的R基因，如编码RLK和NBS-LRR蛋白的基因。然而，R基因通常表现出特异性小种抗性，抗性谱较窄[10]。

防御素是一类具有广谱抗菌活性的短肽，广泛存在于动植物中，是免疫系统的重要组成部分[10]。植物防御素最早是从小麦、大麦和胡萝卜中分离出来[11,12]，经鉴定可抑制真菌的生长。此后，从各种单子叶植物和双子叶植物中克隆出了许多防御素基因（表S1），并被确定在植物对各种真菌和细菌病原体的防御反应中发挥重要作用[54]。大多数防御素对于真菌病原体的生长具有较强的抑制作用，如灰霉病菌、镰刀菌、炭疽菌和球孢炭疽菌[10]。也有部分防御素能够抑制细菌生长，尽管抑制效果不如抗真菌生长的效果强[55]。以菠菜(Spinacia oleracea) 的防御素基因So-D2和So-D7为例，它们对茄科雷尔式青枯菌(R. solanacearum)等细菌病原具有高抗性[27]。此外，防御素还通过抑制斜纹夜蛾(Spodoptera liturata)等昆虫肠道α-淀粉酶和胰蛋白酶的活性，提高植物对昆虫的抗性；这些防御素基因已用于植物抗虫基因工程[56-58]。此外，防御素还能阻断离子通道，参与植物对干旱[59]、锌酸[60]、重金属镉等逆境的适应过程。具有光谱抗病性的防御素已成功应用于分子育种，以增强各种作物的抗病性，包括水稻[62]、小麦[63]、大豆[64]、和棉花[65]。然而，目前对于花生防御素的分离和功能鉴定的研究较少。

–花生防御素与其它植物防御素的相关信息

。

发明内容

花生（Arachis hypogea L.）青枯病是一种由茄科雷尔式菌侵染引起的毁灭性病害，严重影响花生的产量和品质。植物防御素是具有抗菌活性的富含半胱氨酸的短肽。然而，防御素基因（AhDef）在花生中的作用尚不清楚。因此，我们对AhDef基因进行了全基因组研究，将鉴定的12个AhDef基因分为两组，其中包含由Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7 四对基因组成的γ -硫蛋白结构域。氨基酸结构分析表明，AhDef基因高度保守，并含有与植物激素信号和防御反应相关的各种顺式元件。随后，对高抗青枯病花生H108（R）和高感青枯病H107（S）进行了接种鉴定。与H107（S）相比，H108（R）通过抑制根和茎的维管束中的细菌定殖和扩散，没有出现发病症状。转录组分析表明，在青枯菌侵染和植物激素处理下，与H107（S）相比，H108（R）中的AhDef基因，尤其是AhDef1.6和AhDef2.2，显著上调（P < 0.05）。亚细胞定位分析表明，AhDef1.6和AhDef2.2蛋白均在细胞膜上特异表达。在烟草和花生叶片中过表达融合蛋白AhDef2.2-YFP可增加对青枯病的抗性，表明其在抗青枯病反应中具有重要作用。因此，AhDef2.2可以作为花生抗青枯病育种的重要基因。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种花生抗病基因，命名为AhDef2.2基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的AhDef2.2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的花生抗病基因的制备方法，通过Illumina RNA序列和比较转录组分析，分离并鉴定了AhDef2.2基因，步骤如下：

（1）青枯菌的接种

准备花生 H108（R）和花生H107（S）幼苗和烟草幼苗，

培养青枯菌病原体并制备青枯菌接种物，

采用改进的伤根法对花生幼苗进行青枯菌接种，

采用渗透法对烟草和花生叶接种青枯菌；

（2）病理切片分析

制备H108（R）和H107（S）花生幼苗纵根切片，

用显微镜对样品进行观察和拍照，

使用甲苯胺蓝（TB）染色法 对根尖细胞壁中木质素积累进行组织学分析，

分离并鉴定引起花生青枯病的细菌病原体；

（3）Illumina RNA序列和比较转录组分析

在0、1和7dpi下采集空白对照和接种青枯菌的花生幼苗，

提取总RNA，用分光光度计定量根、茎和叶的RNA，并等量混合，

对空白对照和接种青枯菌的花生幼苗构建RNA seq文库，

使用Illumina Hi-Seq X ten RNA测序系统进行转录组分析，

通过分析PeanutBase中可用的花生转录组学数据，确定AhDef基因在不同组织中的表达模式，

通过分析叶、根、花、花瓣、雄蕊和果实的RNA-seq原始数据，确定这些AhDef基因的组织特异性表达谱，

使用R^-4.0.2软件绘制标准化数据，并使用TBtools将结果可视化；

（4）花生AhDef基因的全基因组鉴定

从PeanutBase下载花生蛋白质数据集，

使用HMMER3.2.1软件中的HMM，使用防御素结构域（PF00304）的隐马尔可夫模型（HMM）图谱来识别花生防御素蛋白，

通过保守防御素结构域的数据库识别AhDef基因的预测氨基酸（aa）序列，去除没有保守防御素结构域的蛋白，

使用ExPASy在线软件进一步分析确认AhDef基因家族成员的蛋白特性，

从花生基因组注释文件中提取AhDef基因家族成员的染色体位置信息，并用MG2C软件绘制AhDef基因的染色体位置图，

使用MEME网站对AhDef蛋白进行基序分析，

利用推导的AhDef蛋白全长aa序列及其同源物对AhDef基因进行系统发育分析和序列比对，使用在线PlantCARE数据库预测可能的顺式作用元件并使用TBtools进行可视化；

（5）qRT-PCR

收集模拟接种和感染青枯菌的H108（R）和H107（S）幼苗的根、茎和叶组织，

使用3叶期的H108（R）和H107（S）幼苗进行水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）处理，

按照上述第（3）步所述提取总RNA，并使用PrimeScript进行反转录，

对产生的第一链cDNA进行定量实时PCR（qRT-PCR），

使用引物BLAST软件从AhDef基因的转录序列设计基因特异性引物，

选择扩增单个产物（约150 ~ 250 bp）的引物进行qRT-PCR，

通过qRT-PCR检测AhDef基因的表达谱；

（6）亚细胞定位分析

通过在花椰菜花叶病毒35S启动子和载体pCambia1300-YFP的黄色荧光蛋白（YFP）基因之间插入无终止密码子的基因全长编码序列（CDS），获得重组植物表达载体，

使用Premier 5.0软件根据基因全长CDS设计同源重组的特异性引物，

借助cDNA和特异性引物，使用Primer STARTM Max DNA聚合酶扩增AhDef基因片段，

使用无缝克隆试剂盒纯化PCR产物，然后将其克隆到线性化pCambia1300 YFP载体中，

将载体转化为大肠杆菌DH5α活性细胞，

挑取大肠杆菌单菌落，并将其接种于含有50 ng/mL卡那霉素的50 mL LuriaBertani培养基；

用无内切质粒Maxi试剂盒提取质粒DNA并浓缩质粒DNA（2.0 μg/μL），进行原生质体转染和亚细胞定位分析，

将3周龄拟南芥叶片切成0.5 ~ 1.0 mm的细条，并转移到新制备的酶溶液中，

将释放的原生质体在28°C的黑暗中以30 rpm的转速培养5-6 小时后，纯化并调整至合适的浓度，

采用PEG-CaCl₂介导的方法将质粒DNA转染到原生质体中，

在23°C的黑暗中培养12 ~ 24 小时后，在LSM710共焦激光扫描显微镜下观察YFP或YFP蛋白融合的荧光，

用红色叶绿素荧光指示叶绿体的细胞内位置，然后进行亚细胞定位分析；

（7）烟草和花生叶片中AhDef基因的瞬时过表达

将重组载体和空载体pCambia1300-YFP分别转染到根癌农杆菌菌株EHA105中，

培养根癌杆菌并将其用于叶片渗透，

采用叶盘渗透法对烟草和花生叶片进行渗透，

进行烟草和花生叶片中AhDef基因的瞬时过表达；

（8）二氨基联苯胺（DAB）和台盼蓝染色

将接种的烟叶浸泡在DAB染色液中进行染色，

将叶片置于28°C的黑暗中过夜，随后在90%乙醇中煮沸10分钟，直到叶片完全褪绿，

使用Stemi508体式显微镜观察褪色，并拍照和记录，

将叶片浸入台盼蓝染色溶液中，在沸水浴中染色，

将染色叶片置于水合氯醛溶液（1.25 g/mL）中，在25°C下放置并在50 rpm下摇动，脱色溶液每3小时更换一次，直到叶片完全褪绿，

用Stemi508体式显微镜观察细胞死亡并拍照；

（9）花生抗青枯病的病理学分析

对接种青枯菌后的抗性H108（R）和感病H107（S）花生品种进行病理学分析，

对感病植物根中的病原菌进行分离和鉴定；

（10）花生抗青枯病相关AhDef基因的鉴定

研究青枯菌侵染后产生的高通量转录组RNA序列，

对所有预测的AhDef蛋白的理化性质和基序分布进行分析，

对花生抗青枯病相关AhDef基因进行鉴定；

（11）AhDef基因家族成员的电子特征

在TBtools上分析染色体分布、基因结构和结构域预测，

比较AhDef基因的相应基因组DNA序列，并获得这些基因的外显子和内含子结构，

用Phyre预测相应的花生防御素基因三维结构，并用PyMOL对其结构进行绘制，

对AhDef基因的2000 bp上游启动子序列进行植物顺式元件分析；

（12）AhDef基因的表达谱分析

分析花生植株遭受青枯菌侵染后的RNA-seq数据，绘制AhDef基因的表达谱，

对AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2四个候选基因进行功能鉴定，

通过qRT-PCR验证上述四个候选基因遭受青枯菌侵染后的表达谱，

对H108（R）和H107（S）幼苗的根、茎和叶中的上述四个候选基因的相对表达进行检测，全面研究它们的表达模式；

（13）AhDef1.6和AhDef2.2的亚细胞定位分析

根据对AhDef基因的表达分析，初步将AhDef1.6和AhDef2.2作为候选基因，进行下一步功能分析，

AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP的融合蛋白在花生和烟草中瞬时过表达；

（14）确定防御素AhDef 2.2增加了对青枯病菌的抗性

瞬时过表达AhDef1.6和AhDef2.2接种青枯菌，培养24-36 小时后，在共焦显微镜下观察，

对AhDef1.6和AhDef2.2基因进行功能分析，

用台盼蓝染色观察叶肉细胞死亡情况，

用DAB染色法测定叶片中H₂O₂的积累，

分析融合蛋白AhDef2.2-YFP在花生叶片中瞬时过表达，

对AhDef1.6和AhDef2.2的进行功能分析，

预测的花生防御素基因AhDef2.2的2000 bp启动子包含两个MeJA响应元件、两个SA响应元件和三个ABA响应元件。

所述的花生抗病基因在花生及烟草抗青枯病基因工程中的应用。

相对于现有技术，本发明的优点和有益效果是：

（1）本发明筛选并鉴定了12个AhDef基因，并且在烟草和花生叶片中过表达蛋白融合AhDef2.2-YFP增加了对青枯菌的抗性。

（2）本发明确定了花生防御素AhDef2.2可以作为抗花生青枯病育种的重要基因。

本发明可以为花生广谱抗病分子育种提供宝贵的基因资源，因此具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1是花生对青枯病抗性的病理学分析。其中（A）H108（R）和H107（S）接种21 天及对照的表现症状；（B）接种21天，H108（R）和H107（S）根和茎横切面观察；（C）接种3天，对H108（R）和H107（S）主根横切面的甲苯胺蓝染色观察；（D）从病根中分离的青枯菌在TTC琼脂培养基上形态；（E） TTC琼脂培养基上的青枯菌单菌落形态；（F） 利用扫描电子显微镜观察青枯菌的形态。

图2是花生遭受青枯菌侵染后的转录组测序。 (A) H108 (R)和H107 (S)遭受青枯菌侵染后不同时期差异基因比较； (B)花生遭受青枯菌侵染后的GO富集分析。

图3是花生防御素与其它植物防御素系统进化树分析。利用AhDef同源物的预测的氨基酸序列，采用邻接法构建系统发育树，显示1000个bootstrap值。

图4是花生防御素基因的全基因组家族成员鉴定。其中(A) AhDef基因家族成员在染色体位置信息； (B) 根据从PeanutBase获得的转录组数据，防御素基因的的结构； (C)通过MEME预测的防御素保守基序。

图5是花生防御素基因家族成员的蛋白特征。其中（A）花生与其它植物的防御素系统进化和氨基酸比对分析；（B）采用SWISS-MODEL构建花生防御素的结构模型；（C）用PlantCARE预测花生防御素基因上游2000 bp的启动子元件；（D）遭受青枯菌侵染的花生防御素基因表达；（E）花生的组织或器官；（F）从PeanutBase获得花生防御素基因的组织或器官特异性表达分析。

图6 通过qRT-PCR对花生防御素基因进行表达分析。其中（A）花生防御素基因在0.5、1.0和 7.0天时对青枯菌侵染的表达分析；（B）花生防御素基因在SA（3 mmol/L）、MeJA（100 mmol/L）和 ABA（10 μg/mL）(10 μg/mL)下的表达分析。Y轴表示相对表达；通过Mann-Whitney U检验评估显著差异，并用星号表示；单星号(*)表示 P < 0.05，双星号(**)表示P < 0.01。数据表示为三个生物重复的平均值，误差线表示SD。

图7是AhDef1.6和AhDef2.2在烟叶中的亚细胞定位。AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP融合蛋白在烟叶中瞬时过表达；融合蛋白AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP主要在细胞膜上表达。将叶片在1 mol/L NaCl溶液中浸泡10分钟，进行细胞质和细胞膜分离，并使用共聚焦显微镜观察。

图8是抗青枯病菌过程中AhDef基因的瞬时过表达和功能分析。其中（A） 通过将全长CDS克隆到载体pCambia1300 YFP中获得用于瞬时表达的载体；（B） 拟南芥原生质体中AhDef1.6和AhDef2.2的亚细胞定位分析；（C）瞬时过表达AhDef1.6-YFP、AhDef2.2-YFP和YFP的烟草叶片接种青枯菌后的症状；（D）瞬时过表达YFP、AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP的烟草叶片后接种青枯菌的叶片细胞形态；（E）台盼蓝染色用检测青枯菌侵染引起的发病叶肉细胞死亡；（F）用DAB染色法测定烟叶中H₂O₂的积累；（G）YFP和AhDef2.2-YFP在花生叶片中的瞬时过表达；（H）瞬时过表达YFP和AhDef2.2-YFP的花生叶片接种青枯菌后的台盼蓝染色。

图9是花生遭受青枯菌侵染后推测的AhDef2.2介导的调控途径。AhDef2.2启动子序列中的顺式作用元件用矩形表示。带箭头的线条代表转录调控，带箭头的曲线代表AhDef2.2的转录、翻译和转运。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

本发明实验中所用到的栽培品种高抗青枯病花生“H108（R）”和高感青枯病花生“H107（S）”由河南农业大学殷冬梅教授培育；所用到的强致致病力的青枯菌由河南省农业科学院植物保护研究所花生病害课题组所赠予。

实施例：

1. 青枯菌的接种

在温室中，将花生 H108（R）和花生H107（S）种植在塑料盒（40×60cm）中。烟草（Nicotiana benthamiana）幼苗在温度24°C，60%的湿度，16 小时光照（15000 lx）/8 h黑暗光照培养箱中生长。将青枯菌在含有0.5 g/L2,3,5-三苯基四氮唑氯化物、5.0 g/L蛋白胨、0.1 g/L酪朊水合物、2.0 g/L D-葡萄糖和15.0 g/L琼脂的三苯基四氮唑氯化物（TTC）琼脂培养基上，划线培养[66]。用无菌牙签挑取单菌落，然后接种在TTC液体培养基中，放置在温度为28°C，转速为200 rpm/min摇床中培养2 d。通过使用Nanodrop 2000c分光光度计将重悬后的细菌调节至OD₆₀₀ 为0.5左右，其浓度约10⁸ CFU/mL。

采用前人研究的伤根法对花生幼苗进行青枯菌接种，并略有改进[67]。待花生长出3片真叶时剪掉主根根尖，使用浓度为10⁸ CFU/mL青枯菌菌液进行接种，然后放置于温度为28°C，湿度为60%，16 小时光照/8 h的光照培养箱中。对过表达基因的烟草和花生叶片，使用渗透法进行青枯菌接种[3]。对于每片叶子，使用不带针头的注射器渗透100 μL不同细菌浓度（10⁸、10⁷和10⁶ CFU/mL）的接种物，同时，以TTC液体培养基接种作为对照。

2. 病理切片分析

以H108（R）和H107（S）为材料，探讨花生对青枯病抗性研究。接种21天后，对花生幼苗的主根和主茎横切面进行病理切片观察分析。利用Stemi-305立体显微镜（卡尔蔡司，德国）对主根横切面进行观察拍照。使用甲苯胺蓝（TB）染色法对主根横切面的菌量积累进行组织学分析[68]。具体为，在28°C下固定和脱水后，将根尖切割成适当大小（1 ~ 3 mm）并嵌入丙酮和树脂烯。使用徕卡半薄切片机将树脂块切割成1.5μm大小的薄片（徕卡，德国），切片用甲苯胺蓝溶液（0.1%，重量/体积[w/v]）染色。在树脂和乙醇脱水后，将组织密封并放置在显微镜载玻片上。使用Stemi-305显微镜（蔡司，德国）对样品进行观察和拍照。此外，如前所述，用丙酮和包埋试剂处理感染青枯菌的根组织进行超薄切片[69]。在透射电子显微镜下对样品进行观察和拍照。

按照前人的研究方法分离并鉴定花生青枯菌[70]。首先，对发病植株的根部进行观察，以检查在水中是否有白色“菌脓”释放。此外，收集根切片，用75%（体积/体积[v/v]）的乙醇对其表面消毒20 s，用无菌水反复冲洗3次，并在2 mL Tris缓冲液（pH=7.0）中研磨每个样品。研磨后，上清液稀释100倍后取50 μL，均匀涂在在TTC琼脂培养基上。在28°C下培养2 d后，在Stemi-305显微镜下观察并拍摄细菌菌落（卡尔蔡司，德国）。同时，将TTC固体培养基上的青枯菌菌落作为阳性对照。

3. Illumina RNA序列和比较转录组分析

对H108（R）和H107（S）遭受青枯菌侵染后的转录组进行比较分析。在0、1和7 dpi下采集空白对照和接种的花生幼苗。每个样品都是独立收集的，有三个生物重复，液氮冷冻后立即放入-80°C。使用RNA试剂盒（北京天根，中国）提取每个样本的总RNA。用Nanodrop2000c分光光度计定量根、茎和叶的RNA，并将其等量混合在一起。使用用于Illumina（中国北京新英格兰生物实验室）的NEB Next UltraTM RNA测序，使用3 µg的RNA混合物构建RNAseq文库。文库达标后，使用Illumina Novaseq™ 6000平台，进行转录组测序。RNA-seq数据处理、基因注释、差异基因表达、GO和KEGG富集分析，按照前人研究方法进行处理 [71]。通过分析PeanutBase中可用的花生转录组学数据，确定AhDef基因在不同组织中的表达模式(https://peanutbase.org/)。 通过分析叶、根、花、花瓣、雄蕊和果实的RNA-seq原始数据，确定这些AhDef基因的组织特异性表达谱。对表达数据执行Log10（TPM+1）标准化。使用R^-4.0.2软件绘制标准化数据，并使用TBtools将结果可视化。

4. 花生AhDef基因的全基因组鉴定

从PeanutBase检索花生蛋白质数据集，使用HMMER3.2.1软件（http://hmmer.org/）中的HMM和默认参数，使用结构域的隐马尔可夫模型（HMM）轮廓来识别花生蛋白，在NCBI-CDD数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）中对候选基因进行结构域验证。通过提交 PFAM（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）对花生基因的推测氨基酸序列进行验证，以确定E值阈值为0.01的保守结构域，删除不保守结构域的花生蛋白。

用ExPASy在线软件（http://cn.expasy.org/tools）对确认的花生基因家族成员的生物物理特性做进一步的描述：氨基酸长度、分子量（Molecular weight，MW）和蛋白质等电点（Protein isoelectric，pI）。基因家族成员的染色体位置信息是从花生基因组注释文件（https://www.peanutbase.org/）中提取，使用MG2C软件（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制染色体位置图，使用MEME（https://meme-suite.org/meme/index.html）对进行蛋白结构域分析。

根据序列比对的结果，使用MEGA7.0（https://www.mega.com/），构建系统发育树。在系统发育树的基础上，使用Genius Prime软件（BioMatters，Ltd.，Auckland，NewZealand）对显示系统发育关系密切的其他物种中的同源物进行比对（表S1），并分析蛋白质的相似性。通过建模方法SWISS-MODEL服务器（https://swissmodel.expasy.org）构建家族成员的三维结构。

基因启动子序列（2000 bp）是从PeanutBase检索获得的。使用PlantCARE，预测所选基因启动子的顺式作用元件，并用TBtools绘制成图。

5. qRT-PCR

通过qRT-PCR测定花生基因对青枯菌侵染和植物激素诱导的表达情况。在0、0.5、1.0和7.0天时收集模拟接种（用双蒸水）和青枯菌侵染的H108和H107幼苗的根、茎和叶。对H108和H107的三周龄幼苗进行水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）喷施处理。植物激素的最佳浓度是根据用于其他植物的植物激素确定的[3]。花生幼苗喷洒3 mmol/LSA、100 mmol/L MeJA和10 μg/mL ABA，以及用双蒸水作为对照。在0、0.5、1.0和7.0天收集经处理的花生幼苗的叶子。每个样品都是独立收集的，有三个生物重复，液氮冷冻后立即放入-80°C。

提取总RNA后，按照Prime Script RT试剂盒和gDNA Eraser（Takara，中国）使用说明进行反转录。参照Ren等[72]方法对所得第一链cDNA进行实时定量PCR（qRT-PCR）。使用Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）从花生基因的转录序列中设计基因特异性引物（表S2）。AhActin7（XM_025826875）作内参基因，使每个反应中的cDNA总量正常化。只选择能扩增单一产物（约150 ~ 250 bp）的引物进行qRT-PCR。总反应体系在20 μL，包括2.0 μL的5倍稀释的第一链cDNA（约20 ng），0.8 μL的正向和反向引物（10.0 μmol/L），10.0 μL的2×SYBR Green I Master Mix（Takara）和6.4 μL的无菌蒸馏水。使用Bio-Rad CFX-96实时PCR系统（Bio-Rad，加拿大），有三个技术重复。PCR反应条件：95°C 3分钟，95°C 15 s、58°C 30 s和72°C 30 s，进行40个循环，然后68°C 5分钟。候选基因的表达用相对定量（2^−ΔΔCT）方法进行量化[73]。

–本研究中所需的引物序列

6. 亚细胞定位分析

通过在载体pCambia1300-YFP的花椰菜花叶病毒35S启动子和黄色荧光蛋白（YFP）基因之间插入无终止密码子的花生候选基因的全长编码序列（CDS）获得重组植物表达载体。使用Primer Premier 5.0软件从候选基因的全长CDS设计具有重叠末端的特异性引物。然后使用 PrimerSTAR Max DNA 聚合酶用cDNA和特异性引物扩增候选基因的片段。纯化PCR产物，然后按照制造商的说明使用无缝组装克隆试剂盒将其克隆到线性化的pCambia1300-YFP载体中。根据制造商的说明，将载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将单菌落挑进50 mL LB液体培养基中（1.0%的蛋白胨，0.5%的酵母粉和1.0% NaCl，pH =7.0），其中含有50 ng/mL卡那霉素。细菌细胞在37°C下培养12 ~ 16小时后，以3,000×g离心10分钟，摇动200 r/min，收集菌体。在细菌大量繁殖后，使用质粒提取试剂盒Endo-FreePlasmid Maxi Kit提取质粒DNA。浓缩质粒DNA（2.0 ug/μL）用于原生质体转染和亚细胞定位。

拟南芥原生质体的分离和转染是按照Yoo等[74,75]的方法进行，并稍加修改。将生长3周的拟南芥叶子切成0.5 ~ 1.0 mm的细条，并转移到新鲜制备的酶溶液中[1.0%（重量/体积，w/v）纤维素酶R10，0.5%（w/v）Macerozyme R10（Yakult，日本），500 mmol/L D-mannitol，20 mmol/L KCl，20 mmol/L 2-Morpholinoethanesulfonic Acid（Solarbio，中国）（pH = 5.7），10 mmol/L CaCl₂，0.1%（w/v）Albumin Bovine V]。在28°C黑暗中培养5 ~6小时，旋转30 r/min，释放的原生质体被纯化并调整到合适的密度。通过PEG介导的方法将质粒DNA转染到原生质体。在23°C黑暗中培养12 ~ 24小时后，在LSM710共聚焦激光扫描显微镜下观察YFP或YFP-蛋白融合体的荧光。

7. 烟草和花生叶片中AhDef基因的瞬时过表达

通过农杆菌介导的方法，将花生抗病基因在烟草和花生叶片中进行瞬时过表达。简单地说，将重组载体和空载体pCambia1300-YFP分别转染到农杆菌菌株EHA105中。将连接成功的农杆菌在YEP平板（添加卡那霉素和利福平抗生素）生长16 ~ 18小时，将单菌落接种到1 mL YEP液体培养基中（浓度为50 ng/mL Kana），并在28°C下进一步生长18小时。细菌细胞在37°C和200 r/min的摇动下培养12 ~ 16 小时后，以3,000×g离心10分钟，收集青枯菌菌体。在农杆菌浓度达到OD₆₀₀ = 0.5 ~ 0.7时，以2500×g离心5分钟，收集菌体。用含100mmol/L MgCl₂、200 mmol/L MES和100 μmol/L AS的液体培养基重新悬浮农杆菌，将其调整到OD600 = 0.7 ~ 1.0范围。

使用不带针头的注射器对健康的烟草叶片进行注射。注射后的烟草28°C黑暗保湿培养12小时，之后28°C光照培养2天。在LSM710共聚焦激光扫描显微镜下观察YFP或YFP-蛋白融合体的荧光。对于亚细胞定位，红色荧光表示叶绿体的细胞内位置。将叶片浸泡在NaCl（浓度为1 mol/L）中10分钟后，立即在共聚焦激光扫描显微镜下，观察烟草叶片细胞的质壁分离。

8. 二氨基联苯胺（DAB）和台盼蓝染色

DAB染色（3，3-二氢基联苯胺）方法：将接种过表达的烟草叶片浸泡在DAB染色液，每100 mL添加50 mg DAB粉末，90 mL无菌水，10 mL的10×磷酸缓冲液，25 μL吐温20，pH =3.0，在压强为0.8 MPa抽真空2 分钟，放置室温避光过夜，将叶片放入90%的无水乙醇煮沸10分钟，直至叶片完全褪绿，体视显微镜观察褪色情况并拍照记录。

台盼蓝染色方法：将叶片完全浸泡在台盼蓝（Trypan blue，TB）染色液中，煮沸2分钟，自然冷却，正常室温染色过夜，随后将叶片放于水合氯醛溶液（浓度为250 g / 200 mL蒸馏水），放于温度为25°C，转速为每分钟50转的摇床上，每隔3小时更换脱色液，直至叶片完全褪绿。体视显微镜观察细胞死亡情况并拍照记录。

9. 花生抗青枯病的病理学分析

H108（R）和H107（S）遭受青枯菌侵染后，最终都会导致植株矮化。H108（R）与H107（S）相比，症状较少。接种21天时，大多数H107（S）枯萎死亡，而所有H108（R）植株存活（图1A）。病理切片分析表明，H107（S）的根和茎中中有大量细菌堵塞维管束，而H108（R）的维管束几乎健康，仅受到轻微影响（图1B）。接种3天时，通过甲苯胺蓝染色进一步证实， H107（S）维管束堵塞程度比H108（R）更严重（图1C）。这些结果表明，花生对青枯病菌的抗性可能是由于抑制了根和茎的维管束中细菌的定殖和扩展。

为了确定花生青枯病是否由青枯菌引起，对发病植株的根进行了病原菌的分离和鉴定。病根研磨稀释后涂于TTC琼脂培养基，培养2 d后观察到粉红色菌落（图1D）。所有菌落呈现圆形，中心为粉红色，边缘为乳白色（图1E）。使用扫描电子显微镜，观察到青枯菌呈现短杆状（图1F），这些结果表明，花生所表现的症状确定是由青枯菌所引起的。

10. 花生抗青枯病相关AhDef基因的鉴定

为了明确花生遭受青枯菌侵染的分子机制，本研究对遭受青枯菌侵染后不同时期的抗感花生进行了转录组测序（图2A）。RNA-seq结果显示，差异基因主要富集在参与ABA、SA、JA和乙烯（Eth）信号通路，以及对热、创伤、氧化物和防御反应等途径上（图2B）。其中，多个AhDef基因在H108（R）和H107（S）受青枯菌侵染时显著上调（P < 0.05）。这表明，AhDef基因可能与花生对青枯病的抗性有关。接着，本研究从全基因组水平上对花生防御素进行基因家族分析。结果表明，有12个基因被确定为花生防御素基因（表S3）。这些基因所编码的氨基酸数量在66 ~ 88之间。花生防御素蛋白的等电点（pI）和分子量（Mw）分别为6.03 ~ 9.77和7.41 ~ 9.96 kDa。12个花生防御素蛋白与其它83个防御素蛋白被划分到两个不同的组（A和B）（图3，表S1）。这些花生防御素蛋白被命名为AhDef1.1-AhDef1.6和AhDef2.1-AhDef2.6。A组由两个亚组（I和II）组成，B组由四个亚组（III、IV、V和VI）组成。AhDef1.1被划分到I组，与HsAFP1[53]、CtAMP1[77]、DmAMP1[77]和AtPDF1.4[13]关系最为密切，具有优异的抗真菌活性。AhDef1.2、AhDef1.3、AhDef1.4、AhDef1.5和AhDef1.6与ZMERS6[31]、MsDef1[66]和CaDef1[18]一起归入“亚组II”，它们具有抗真菌活性。防御素蛋白AhDef2.1、AhDef2.2、AhDef2.3、AhDef2.4和AhDef2.5均被归类为具有各种抗菌肽（AMPs）的“第六亚类”，包括OsDEF8[32]、NaD2[14]、CaDef2[18]、Ec-AMP-D1[39]、AtPDF2.1[78]、MtDef4.2[79]和Tad1[36]。AhDef2.6与AMPs VuDEF2[80]和ZmES1[30]、金属耐受蛋白AtPDF2.4、AtPDF2.5和AtPDF2.6[58,78]以及α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制剂的蛋白（例如VuDEF1[58]、ZmES1[30]和 SbDEF 同系物[42]）聚集在“亚组V”中。所有这些结果表明，花生防御素蛋白参与了花生的抗逆性和对青枯菌和其它病原体的抵抗。

–花生防御素基因家族成员信息

Name	Gene_ID	Chromosome	ORF	Exon	AA	Mw (kDa)	pI
								<i>AhDef1.1</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.81M2S6	16	243	2	80	8.79	8.8
<i>AhDef1.2</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DML5UT	8	219	2	72	8.30	7.5
								<i>AhDef1.3</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.2P4AZJ	18	225	2	74	8.30	7.5
<i>AhDef1.4</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.IQ5AU2	8	225	2	74	8.30	7.5
								<i>AhDef1.5</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.JLL9S1	18	201	2	66	7.41	7.5
<i>AhDef1.6</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.L4FE7K	8	228	2	75	8.38	6.0
								<i>AhDef2.1</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.IS2QLD	1	261	3	86	9.56	9.2
<i>AhDef2.2</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.IDU4K1	11	240	2	79	8.58	8.7
								<i>AhDef2.3</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.4H5G59	8	222	2	73	8.46	9.7
<i>AhDef2.4</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.UPL4LC	18	222	2	73	8.53	9.5
								<i>AhDef2.5</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.6VXG05	3	267	3	88	9.96	6.8
<i>AhDef2.6</i>	arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.X2H08Z	8	231	2	76	8.62	9.4

11. AhDef基因家族成员的电子特征

为了更好地了解AhDef基因的特征，本研究对花生12个防御素基因成员的染色体分布、基因结构分析和结构域进行了定位和预测。结果表明，12个AhDef基因不均等地分布在6条染色体上（Chr.1、3、8、11、16和18）（图4A）。具体为AhDef1.2、AhDef1.4、AhDef1.6、AhDef2.3和AhDef2.6在Chr.8末端聚集在一起；AhDef1.3、AhDef1.5和AhDef2.4位于Chr.18上； AhDef 2.1、AhDef 2.5、AhDef2.2和AhDef1.1分别被确定为位于Chr.1、Chr.3、Chr.11和Chr.16上。此外，本研究比较了AhDef基因的相应基因组DNA序列，并获得了这些基因的外显子和内含子结构（图4B）。结果表明，在AhDef2.1和AhDef2.5的开放阅读框中存在两个内含子，而其余的AhDef基因仅包含一个内含子。此外，共鉴定出11个保守基序，分布相当均匀，所有家族成员均含有γ-硫蛋白结构域（图4C）。花生中12个防御素基因的氨基酸为Cys3-Cys6和Cys4-Cys7，其中两个二硫键对Cys1-Cys8、Cys2-Cys5是植物防御素中最保守的（图5A）[37]。借助于四对二硫键，形成了非常稳定的βαβ结构。根据前人研究的氨基酸结构，从第一组和第二组中选择了相应的花生防御素基因，用Phyre预测其三维结构，并用PyMOL对其结构进行绘制。很明显，这两组防御素基因的整体结构是保守的，但仍存在一些差异（图5B）。

对花生防御素基因的上游2000 bp启动子序列进行植物顺式元素的预测。各种顺式元件不均匀地分布在启动子序列上（图5C）。这些顺式元件主要与激素信号传导有关，包括对JA有响应的CGTCA元件、对SA有响应的TCA元件、对赤霉素（Gibberellins，GAs）有响应的TATC-box件和P-box、参与ABA反应和胁迫反应ABRE元件，包括防御和胁迫反应的TC元件、伤口反应的WUN元件和黄酮类生物合成的MYB结合位点。这些结果表明，花生防御素基因在花生对各种激素和胁迫响应中发挥作用。

12. AhDef基因的表达谱分析

为了探究花生防御素基因的表达情况，本研究分析受青枯菌侵染的花生转录组数据（图5D）。其中AhDef1.3、AhDef1.4、AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2的表达高于其它家族成员。特别是AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2在H108和H107遭受青枯菌后的表达上调（P < 0.05）。然而，AhDef1.1在两个品种中的表达在所有时间点上都相对较低。从RNA-seq数据中确定花生防御素基因的组织特异性表达模式（图5E）。花生防御素基因的表达显示在不同组织之间表达有所差异（图5F）。AhDef2.1和AhDef2.2在所有组织中的表达相对较高，而AhDef1.1的表达较低。两个基因AhDef1.5和AhDef1.6表现出类似的表达模式，在叶片、花被、雌蕊和种子中表达较高。AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2在遭受青枯菌侵染和不同组织中的表达明显上调，表明它们在花生对青枯病防御中起作用。

本研究通过qRT-PCR对AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2在青枯菌侵染0、0.5、1.0和7.0天时，分别检测它们在H108和H107幼苗的根、茎和叶中的相对表达（图6A）。AhDef1.6和AhDef2.2在H108的根、茎和叶中都被上调1.5 ~ 5.0倍，而它们在H107中的表达相对没有变化。虽然AhDef1.5在根部的相对表达上调，但接种后H108和H107之间没有差异（P < 0.05）。AhDef2.1在H108中的表达被抑制，而在H107中的表达几乎没有变化。植物激素（P < 0.05）信号通路在植物对病原体的抗性中起着重要作用[81,82]，通过qRT-PCR同时检测AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2在喷施外源激素后的诱导表达情况。正如预期的那样，在应用外源激素后，这四个基因都显著上调或下调（图6B）。其中只有AhDef2.2在H108中被SA、MeJA和ABA上调达6 ~ 20倍；AhDef1.5和AhDef1.6都被MeJA和ABA上调，而AhDef2.1在H108中被MeJA和ABA上调。综上所述，AhDef1.6和AhDef2.2在H108（R）而不是H107（S）中对青枯病菌感染和多种外源激素有显著的反应（P < 0.05）。

13. AhDef1.6和AhDef2.2的亚细胞定位分析

根据对AhDef基因的表达分析，进一步选择基因AhDef1.6和AhDef2.2进行下一步分析。培养12-24 小时后，在转化后的原生质体中观察到亮绿色荧光。融合蛋白AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP均在细胞膜上被特异性检测到，而YFP分布于整个细胞（A，B）。

此外，AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP的融合蛋白在烟草中瞬时过表达。结果表明，未融合的YFP在整个细胞中表达，而融合蛋白AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP主要在细胞膜上表达（图7）。两种亚细胞定位分析结果一致，表明AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP在细胞膜上特异表达。

14. 花生防御素基因AhDef 2.2增加了对青枯菌的抗性

为了确定AhDef1.6和AhDef2.2的功能，将瞬时过表达这两个基因的烟草叶片进行青枯菌接种。培养24 ~ 36小时后，整个叶片都可以观察到亮绿色荧光，这表明YFP、AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP在烟草叶片中成功地瞬时过表达。过表达空载（pCambia1300-YFP）YFP的叶片在接种3天时出现病症和叶肉细胞破坏，但在用TTC液体培养基接种后没有病症出现（空白对照）（图8C）。这一发现表明，基于烟草叶片的瞬时表达体系可用于鉴定青枯病抗性基因。

在接种3天时，瞬时过表达AhDef1.6-YFP的烟草叶片表现出与空载对照相似的病症，过表达AhDef2.2-YFP的叶片与空白对照没有明显区别（图8D）。台盼蓝染色显示，烟草叶片中AhDef2.2-YFP的过表达减少了细胞死亡（图8E），与过表达AhDef2.2-YFP的叶片和空载对照相比，过表达AhDef1.6-YFP的叶片中积累的H₂O₂很少（图8F）。这一发现表明，在烟草叶片中过表达AhDef2.2-YFP可能会直接抑制青枯菌的繁殖和扩展，而不是通过烟草免疫系统激起抗性。为了证实AhDef2.2对青枯菌的抵抗作用，将融合蛋白AhDef2.2-YFP在花生叶片中瞬时过表达（图8G），过表达AhDef2.2-YFP减少了细胞的死亡，也通过台盼蓝染色在花生叶片中得到证实（图8H）。这些瞬时表达实验表明，AhDef2.2增加了烟草和花生对青枯菌的抗性。青枯菌能够侵染450多种植物，常见的如番茄、马铃薯、辣椒、茄子和花生等[6]。虽然已有包括轮作、土壤改良和熏蒸在内的不同方法来控制青枯病，但对于大多数寄主作物，仍然缺乏有效和可持续的措施[83]。培育具有持久广谱抗性的品种被认为是最环保防治措施[84]。然而，植物对青枯病的抗性机制尚未确定，迄今为止在拟南芥中仅克隆了两个青枯病 R基因。与花生青枯病抗性相关的主要QTL已定位在B02染色体上富含R基因的区域[2,7]，并通过分子标记辅助育种培育了一些抗性花生品种[4,85]。

本研究通过长期育种获得了高抗青枯病的花生品种H108。病理分析表明，高感青枯病品种H107（S）的根和茎中的维管束被粘性青枯菌堵塞，而H108（R）的维管束相对健康，仅受到青枯菌侵染的轻微影响（图1）。先前研究表明，番茄和烟草对青枯病菌的抗性主要是通过抑制细菌在根和茎的定殖以及在维管束中扩展 [86]。在这项研究中，借助于电子显微镜首次在花生维管束中观察到短杆状青枯菌（图1F）。

抗感花生接种青枯菌后的根的组织病理学分析与前人研究[87,88]基本一致，在H107下胚轴维管组织中发现大量细菌，最终导致维管束堵塞。在植物和病原体之间相互作用过程中，病原体相关分子模式（PAMP）在植物中触发自然免疫反应（病原体触发免疫；PTI），导致信号分子如过氧化物、内源激素水平的变化，以及限制病原菌传播的植物信号。在本研究中，转录组学分析表明，与ABA、氧化应激反应和水杨酸相关的信号通路都参与了花生对青枯菌的抗病机制。此外，本研究中鉴定的花生抗病基因AhDef2.2的上游2000 bp启动子包含两个MeJA响应元件、两个SA响应元件和三个ABA响应元件。通过MeJA激素反应，H108（R）中AhDef2.2基因的表达显著（P < 0.05）高于H107（S）。上述结果表明，调节植物应激反应的多种植物激素和过氧化物参与了花生防御素基因AhDef2.2介导的青枯病抗性（图9）。

防御素作为一种对病原菌生长具有较强抑制抑制的短肽[10]，可以抑制或杀死微生物，如细菌和真菌，以及一些昆虫和动植物细胞。然而，目前尚不清楚防御素是否也能进入细菌细胞，激活下游信号通路，并通过识别细胞内特异性受体诱导细胞凋亡。本研究鉴定了12个AhDef基因，并且在烟草和花生叶片中过表达蛋白融合AhDef2.2-YFP增加了对青枯菌的抗性。本研究结果为花生广谱抗病分子育种提供了宝贵的遗传资源。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以做出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

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SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 花生AhDef2.2基因及其鉴定方法和应用

<130> 22050491

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea

<400> 1

atggctcgct ctcttccttt gctttccacc atttttgtcc tccttttgct tctagtggcc 60

actgagatgg gaccaataat ggtggctgaa ggtagaactt gtgcgtctca aagccatcgc 120

ttcaaaggag tgtgtttgag tgacacaaat tgcgcctccg tttgcaaaac ggagggcttc 180

ccttccgggg attgccacgg ctttcgccgc cgatgcttct gcacgaagca ttgtgcttaa 240

<210> 2

<211> 79

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea

<400> 2

Met Ala Arg Ser Leu Pro Leu Leu Ser Thr Ile Phe Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Ala Thr Glu Met Gly Pro Ile Met Val Ala Glu Gly Arg

20 25 30

Thr Cys Ala Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Val Cys Leu Ser Asp

35 40 45

Thr Asn Cys Ala Ser Val Cys Lys Thr Glu Gly Phe Pro Ser Gly Asp

50 55 60

Cys His Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Lys His Cys Ala

65 70 75

Claims (4)

1.一种花生抗病基因，命名为AhDef2.2基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的花生抗病基因，其特征在于：所述的AhDef2.2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的花生抗病基因的制备方法，其特征在于：通过Illumina RNA序列和比较转录组分析，分离并鉴定了AhDef2.2基因，步骤如下：

（1）青枯菌的接种

准备花生 H108（R）和花生H107（S）幼苗和烟草幼苗，

培养青枯菌病原体并制备青枯菌接种物，

采用改进的伤根法对花生幼苗进行青枯菌接种，

采用渗透法对烟草和花生叶接种青枯菌；

（2）病理切片分析

制备H108（R）和H107（S）花生幼苗纵根切片，

用显微镜对样品进行观察和拍照，

使用甲苯胺蓝（TB）染色法 对根尖细胞壁中木质素积累进行组织学分析，

分离并鉴定引起花生青枯病的细菌病原体；

（3）Illumina RNA序列和比较转录组分析

在0、1和7dpi下采集空白对照和接种青枯菌的花生幼苗，

提取总RNA，用分光光度计定量根、茎和叶的RNA，并等量混合，

对空白对照和接种青枯菌的花生幼苗构建RNA seq文库，

使用Illumina Hi-Seq X ten RNA测序系统进行转录组分析，

通过分析PeanutBase中可用的花生转录组学数据，确定AhDef基因在不同组织中的表达模式，

通过分析叶、根、花、花瓣、雄蕊和果实的RNA-seq原始数据，确定这些AhDef基因的组织特异性表达谱，

使用R^-4.0.2软件绘制标准化数据，并使用TBtools将结果可视化；

（4）花生AhDef基因的全基因组鉴定

从PeanutBase下载花生蛋白质数据集，

使用HMMER3.2.1软件中的HMM，使用防御素结构域（PF00304）的隐马尔可夫模型（HMM）图谱来识别花生防御素蛋白，

通过保守防御素结构域的数据库识别AhDef基因的预测氨基酸（aa）序列，去除没有保守防御素结构域的蛋白，

使用ExPASy在线软件进一步分析确认AhDef基因家族成员的蛋白特性，

从花生基因组注释文件中提取AhDef基因家族成员的染色体位置信息，并用MG2C软件绘制AhDef基因的染色体位置图，

使用MEME网站对AhDef蛋白进行基序分析，

利用推导的AhDef蛋白全长aa序列及其同源物对AhDef基因进行系统发育分析和序列比对，使用在线PlantCARE数据库预测可能的顺式作用元件并使用TBtools进行可视化；

（5）qRT-PCR

收集模拟接种和感染青枯菌的H108（R）和H107（S）幼苗的根、茎和叶组织，

使用3叶期的H108（R）和H107（S）幼苗进行水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）处理，

按照上述第（3）步所述提取总RNA，并使用PrimeScript进行反转录，

对产生的第一链cDNA进行定量实时PCR（qRT-PCR），

使用引物BLAST软件从AhDef基因的转录序列设计基因特异性引物，

选择扩增单个产物（约150 ~ 250 bp）的引物进行qRT-PCR，

通过qRT-PCR检测AhDef基因的表达谱；

（6）亚细胞定位分析

通过在花椰菜花叶病毒35S启动子和载体pCambia1300-YFP的黄色荧光蛋白（YFP）基因之间插入无终止密码子的基因全长编码序列（CDS），获得重组植物表达载体，

使用Premier 5.0软件根据基因全长CDS设计同源重组的特异性引物，

借助cDNA和特异性引物，使用Primer STARTM Max DNA聚合酶扩增AhDef基因片段，

使用无缝克隆试剂盒纯化PCR产物，然后将其克隆到线性化pCambia1300 YFP载体中，

将载体转化为大肠杆菌DH5α活性细胞，

挑取大肠杆菌单菌落，并将其接种于含有50 ng/mL卡那霉素的50 mL Luria Bertani培养基；

用无内切质粒Maxi试剂盒提取质粒DNA并浓缩质粒DNA（2.0 μg/μL），进行原生质体转染和亚细胞定位分析，

将3周龄拟南芥叶片切成0.5 ~ 1.0 mm的细条，并转移到新制备的酶溶液中，

将释放的原生质体在28°C的黑暗中以30 rpm的转速培养5-6 小时后，纯化并调整至合适的浓度，

采用PEG-CaCl₂介导的方法将质粒DNA转染到原生质体中，

在23°C的黑暗中培养12 ~ 24 小时后，在LSM710共焦激光扫描显微镜下观察YFP或YFP蛋白融合的荧光，

用红色叶绿素荧光指示叶绿体的细胞内位置，然后进行亚细胞定位分析；

（7）烟草和花生叶片中AhDef基因的瞬时过表达

将重组载体和空载体pCambia1300-YFP分别转染到根癌农杆菌菌株EHA105中，

培养根癌杆菌并将其用于叶片渗透，

采用叶盘渗透法对烟草和花生叶片进行渗透，

进行烟草和花生叶片中AhDef基因的瞬时过表达；

（8）二氨基联苯胺（DAB）和台盼蓝染色

将接种的烟叶浸泡在DAB染色液中进行染色，

将叶片置于28°C的黑暗中过夜，随后在90%乙醇中煮沸10分钟，直到叶片完全褪绿，

使用Stemi508体式显微镜观察褪色，并拍照和记录，

将叶片浸入台盼蓝染色溶液中，在沸水浴中染色，

将染色叶片置于水合氯醛溶液（1.25 g/mL）中，在25°C下放置并在50 rpm下摇动，脱色溶液每3小时更换一次，直到叶片完全褪绿，

用Stemi508体式显微镜观察细胞死亡并拍照；

（9）花生抗青枯病的病理学分析

对接种青枯菌后的抗性H108（R）和感病H107（S）花生品种进行病理学分析，

对感病植物根中的病原菌进行分离和鉴定；

（10）花生抗青枯病相关AhDef基因的鉴定

研究青枯菌侵染后产生的高通量转录组RNA序列，

对所有预测的AhDef蛋白的理化性质和基序分布进行分析，

对花生抗青枯病相关AhDef基因进行鉴定；

（11）AhDef基因家族成员的电子特征

在TBtools上分析染色体分布、基因结构和结构域预测，

比较AhDef基因的相应基因组DNA序列，并获得这些基因的外显子和内含子结构，

用Phyre预测相应的花生防御素基因三维结构，并用PyMOL对其结构进行绘制，

对AhDef基因的2000 bp上游启动子序列进行植物顺式元件分析；

（12）AhDef基因的表达谱分析

分析花生植株遭受青枯菌侵染后的RNA-seq数据，绘制AhDef基因的表达谱，

对AhDef1.5、AhDef1.6、AhDef2.1和AhDef2.2四个候选基因进行功能鉴定，

通过qRT-PCR验证上述四个候选基因遭受青枯菌侵染后的表达谱，

对H108（R）和H107（S）幼苗的根、茎和叶中的上述四个候选基因的相对表达进行检测，全面研究它们的表达模式；

（13）AhDef1.6和AhDef2.2的亚细胞定位分析

根据对AhDef基因的表达分析，初步将AhDef1.6和AhDef2.2作为候选基因，进行下一步功能分析，AhDef1.6-YFP和AhDef2.2-YFP的融合蛋白在花生和烟草中瞬时过表达；

（14）确定防御素AhDef 2.2增加了对青枯病菌的抗性

瞬时过表达AhDef1.6和AhDef2.2接种青枯菌，培养24-36 小时后，在共焦显微镜下观察，

对AhDef1.6和AhDef2.2基因进行功能分析，

用台盼蓝染色观察叶肉细胞死亡情况，

用DAB染色法测定叶片中H₂O₂的积累，

分析融合蛋白AhDef2.2-YFP在花生叶片中瞬时过表达，

对AhDef1.6和AhDef2.2的进行功能分析，

预测的花生防御素基因AhDef2.2的2000 bp启动子包含两个MeJA响应元件、两个SA响应元件和三个ABA响应元件。

4.一种权利要求1所述的花生抗病基因在花生及烟草抗青枯病基因工程中的应用。

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